Yenny Vega

VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA DE PETRIFILMTM PARA LA DETECCIÓN DE Listeria spp. EN CARCASAS DE POLLO. QUIZ SEMINARIO. ELABORACIÓN ANTEPROYECTO. Entregar el 31 de mayo en medio físico e impreso. ¡”MR=Mauricio rodriguez” y esta escrito es por me toca a mi, esta en rojo para resaltar, esta en azul para que vea que es lo que toca hacer!! 1. El Título es correcto o que le adicionaría o quitaría DG 2. Con el texto entregado formule una introducción y justificación DG 3. Formule el objetivo general y los objetivos específicos (revisar la metodología para organizarlos). DG 4. Haga un marco teórico de dos hojas e donde relacione la temática con títulos, subtítulos y numeración. MR subtítulos, cambiar sinónimos 5. Formule los resultados esperados MR 6. Formule un cronograma de actividades. DG 7. Elabore una bibliografía de acuerdo a la información o párrafos tomados para elaborar este anteproyecto. MR NOTA: Deben referenciar los párrafos citados dentro del texto. TABLA DE CONTENIDO.

1. INTRODUCCION

3

2. JUSTIFICACION

6

3. OBJETIVOS

9

3.1. OBJETIVO GENERAL

9

3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

9

4. MARCO TEÓRICO

10

4.1. GENERALIDADES DEL GÉNERO DE Listeria spp.

10

4.1.1. Clasificación taxonómica

11

4.1.2. Requerimientos nutricionales

12

4.1.2.1. Temperatura

14

4.1.2.2. pH

15

4.1.2.3. Sales

15

4.1.2.4. Actividad de agua (aw)

16

4.1.3. Actividad bioquímica

16

4.1.4. Constitución antigénica

17

4.1.5. Hábitat donde puede aislarse L. monocytogenes

19

4.1.5.1 Fuentes ambientales

19

4.1.5.2. Plantas de producción y procesadoras de alimentos

22

4.1.5.3. Carne de pollo

26

4.2. LISTERIOSIS HUMANA

29

4.2.1. Listeriosis invasiva

30

4.2.2. Listeriosis no invasiva (Gastroenteritis Listerial)

33

4.2.3. Epidemiología de la listeriosis

33

4.3. INCIDENCIA DE L. monocytogenes EN CARNE DE POLLO

35

4.4. PREVENCION Y CONTROL

36

4.5. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE Listeria spp.

42

4.5.1. Métodos tradicionales para la identificación de Listeria spp.

42

4.5.2. Métodos alternativos (rápidos) para la identificación de Listeria spp.

44

4.5.2.1. Métodos fenotípicos

44

4.5.2.2. Métodos genotípicos

45

4.6. MÉTODOS PARA EL MUESTREO MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES

46

4.7. PLACAS PETRIFILMTM PARA MONITOREO DE Listeria EN AMBIENTES

48

4.8. VALIDACIÓN DEL PETRIFILMTM

49

4. 8.1. Protocolo de validación

54

4.8.2. Métodos cualitativos – protocolo técnico para valoración

54

4.8.3. Protocolo de medición

55

4.8.4. Cálculos e interpretación

56

5. MATERIALES Y MÉTODOS

58

5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

58

5.2. MÉTODOS

58

5.2.1. Contaminación artificial de las carcasas de pollo

58

5.2.2. Análisis microbiológico tradicional

59

5.2.3. Análisis rápido (PETRIFILMTM)

59

6.

RESULTADOS ESPERADOS

61

7.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

62

8.

PRESUPUESTO

63

9.

REFERENCIAS

64

ESTA PARTE LES PUEDE SERVIR PARA ELABORAR ALGUNAS PREGUNTAS

L. monocytogenes es un microorganismo que se considera un problema de salud pública, porque a pesar de ser patógeno para un pequeño grupo de la población es un microorganismo zoo notico, que puede causar listeriosis en humanos a partir de animales que presenten la enfermedad. Una de las fuentes principales de trasmisión son los alimentos contaminados por este microorganismo (Moreno, 1976).

L. monocytogenes es un microorganismo reconocido como patógeno emergente en alimentos de consumo regular, difiere en muchos aspectos de los demás patógenos trasmitidos por alimentos: es propagado, es resistente a condiciones ambientales diversas tales como pH bajo y las concentraciones elevadas de NaCl, siendo además microaerofìlico (Doyle et al. 2001).

Los distintos modos a través de los cuales la bacteria es capaz de entrar a las plantas de tratamiento de alimentos, la capacidad de sobrevivir durante períodos prolongados en el ambiente (tierra plantas, y agua), la capacidad para crecer a temperaturas muy bajas (de 2 a 4ºC) y sobrevivir en el interior o en la superficie de los alimentos durante períodos prolongados en condiciones adversas, la habilidad de adherirse a las superficies formando biopelículas, y la resistencia que tiene a los procesos de limpieza y a los desinfectantes, han

hecho que L. monocytogenes se convierta en una preocupación para la industria agroalimentaria en la última década (Doyle et al. 2000; Membré et al. 2004).

Esta bacteria en las personas, afecta con mayor frecuencia el útero grávido, el Sistema Nervioso Central (SNC) y el torrente sanguíneo; las manifestaciones de listeriosis incluyen bacteremia, meningitis, encefalitis, endocarditis, meningoencefalitis, aborto espontáneo, enfermedad neonatal, nacimiento prematuro, enfermedad prodrómica en mujeres embarazadas, septicemia y muerte prenatal (Basser et al. 1995; Alpas et al. 1999). En el año 2000 en Colombia la producción de pollo fue de 502.459 toneladas, de las cuales Santander produjo 93.099 toneladas, equivalentes al 18.53% de la producción nacional, ubicándose como el segundo productor después de Cundinamarca (Fonavi y Fenavi, 2000). En Colombia, la carne de pollo es un alimento de consumo masivo, de importancia económica que puede vehiculizar a Listeria. Durante las cadenas de matanza, procesado y empacado, las carcasas de pollo pueden contaminarse con materia fecal, con los contenidos estomacales y la piel. Fuentes adicionales de contaminación microbiana son los utensilios y equipos, contacto humano y contacto entre carcasa y carcasa (Capita et al. 2004). El mantenimiento estricto de buenas prácticas higiénicas en mataderos y expendios en la producción de carne de pollo es de importancia crucial en la prevención de la contaminación microbiana de las carcasas, en el interés de asegurar la calidad de la carne y la protección de la salud (Zweifel y Stephan, 2003).

La implementación del Sistema de Análisis de Riesgos y los Puntos Críticos de Control (HACCP) en los mataderos no llegó sino hasta el año 2002 en Estados Unidos (Rivas y Sevilla, 2004). Adicionalmente, aunque existe una política de cero tolerancia para L. monocytogenes en carnes crudas de pollo, el control de este microorganismo sólo se logra con la cocción adecuada, manipulación, refrigeración y almacenamiento (Chen 2003).

et al.

Uno de los problemas que contribuyen con la escasa investigación de L. monocytogenes en alimentos es el largo tiempo que se requiere para realizar la identificación microbiológica de este patógeno. Por este motivo en la actualidad se buscan técnicas rápidas y sensibles que permitan detectar el microorganismo en materiales crudos, para llevar un control eficiente del proceso de elaboración, monitorear las prácticas de limpieza e higiene y tomar decisiones a corto plazo (Gray y Killinger, 1966). Recientemente en Colombia se validó la técnica de PCR para la detección rápida sensible y confiable de L. monocytogenes en leches crudas, quesos frescos, carne de res y carne de pollo, basada en la especificidad de los “primers” LI1 y U1 que reconocen el género Listeria amplificando un fragmento de 938pb correspondiente una secuencia del rDNA 16S y a los “primers” LF y LR que reconocen el gen hlyA de L. monocytogenes, amplificando un fragmento de 750pb (Zamora et al. 2000; Burbano et al. 2003; Sierra et al, 2004a; Sierra, 2004b Torres et al, 2004b; Torres, 2004c). Por tal motivo, es necesario validar otros métodos rápidos, específicos y sensibles para la detección de Listeria spp., en este caso en superficies de pollo.

La listeriosis es una enfermedad ocasionada por Listeria monocytogenes y forma parte de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs), los cuales actúan solamente como vehículo en la penetración del microorganismo en el organismo (Allman et al. 1995; Da Silva y Tibana 1995; Boerlin et al. 1997).

La listeriosis es una enfermedad de origen alimentario atípica, de gran interés para la salud pública a causa de la gravedad y el carácter no entérico de la enfermedad (meningitis, septicemia, aborto), la proporción elevada de muerte (20-30%), el tiempo de incubación frecuentemente largo, y la predilección por individuos con enfermedades subyacentes que conducen al deterioro de la inmunidad mediada por las células T (Doyle et al. 2001).

Desde 1926, se ha sabido de la existencia de L. monocytogenes, este microorganismo fue aislado a causa de una epidemia que afectó a conejos y cobayos. Sin embargo sólo en la década de 1980 cobra real importancia al ser el agente causal de brotes epidémicos en

Nueva Escocia, Canadá, Estados Unidos y Europa. Estos brotes fueron ocasionados por el consumo de leche pasteurizada, quesos y vegetales (Cormac et al, 1996; Blais et al. 1997).

Dentro de los grupos de mayor riesgo figuran los niños recién nacidos (10 casos por 100,000 habitantes) y personas mayores de 60 años (1.4 casos por 100.000 habitantes) con mayor predominancia en hombres (Schlech y Walter, 2000). Otro grupo corresponde a mujeres embarazadas, pacientes inmunodeprimidos, con cáncer, y pacientes con SIDA (FDA, 2003), así como las personas sometidas a transplantes de órganos y malignidades hematológicas, hemacromatosis, diabetes mellitus, cirrosis y falla renal que han sido tratadas con hemodiálisis o diálisis peritoneal (Schlech y Walter, 2000).

Los reportes de listeriosis en mujeres embarazadas en Estados Unidos indicaron 12 a 17% de casos, mientras que en Europa se reportó una incidencia de 0.5 a 3% (Escarcega, 1999). En Colombia, no existen estadísticas oficiales, sólo hay reportes aislados como los ocurridos en 1992 por el Hospital Central de la Policía de Bogotá (2 casos de listeriosis meníngea aguda supurativa y romboencefálica) (Sánchez et al. 1992); en 1994 por el Hospital Universitario del Valle (3 casos de listeriosis neonatal) (Payán y Astudillo, 1994); en 1999 por la Fundación Clínica Valle del Lili (19 casos: 10 en adultos inmunosuprimidos, 2 en mujeres embarazadas, 6 en neonatos y un adolescente, la mayoría con septicemia) (Crespo et al. 1999); y en el 2001 por el Hospital Central de la Policía de Bogotá (1 caso de listeriosis perinatal) (Sánchez et al. 2001).

En los últimos años el número de casos de Listeriosis reportados mundialmente ha aumentado, debido al perfeccionamiento de las técnicas microbiológicas, al incremento de número de personas con el riesgo de adquirir esta enfermedad y a la tendencia de ingerir alimentos como leches crudas y sus derivados, carnes, pollo, pescados y vegetales, que por sus características se prestan con más facilidad para ser los vehículos de trasmisión (Crandall y Montville, 1988; Blais y Phillippe, 1993). L. monocytogenes es una bacteria patógena humana que ha sido asociada con productos crudos de pollo (posible vector en la transmisión de la listeriosis). Mientras su morbilidad es baja, este microorganismo puede causar alta mortalidad en comparación con

Salmonelosis o Campylobacteriosis. Listeria puede estar presente dentro de la planta procesadora y puede en algún momento llegar a contaminar las superficies de contacto con los alimentos, y al producto mismo. Franco et al, 1995 encontraron que el 96% de muestras evaluadas fueron positivas para Listeria spp. Genigeorgis et al, 1989 reportaron que el 36.7% de las pieles de pollo muestreadas fueron positivas y Cox et al. 1997, recuperaron cerca de 26% de carcasas crudas. Sin embargo en Colombia no se han realizado estudios de la presencia de este microorganismo sobre carcasas de pollo, de ahí la importancia de implementar un método rápido y fiable para la detección de Listeria spp. en superficies (Berrang et al. 2004).

4. MARCO TEORICO.

4.1. GENERALIDADES DEL GÉNERO DE Listeria spp.

Listeria spp. es un microorganismo que está distribuido ampliamente en la naturaleza, y tiene características que le permiten sobrevivir y crecer en un rango amplio de condiciones ambientales (Doyle et al. 2001).

En general, Listeria spp., corresponde a un grupo de bacilos Grampositivos o coco bacilos Grampositivos (0.5µ de diámetro y 1-2µ de longitud), con bordes redondeados. Las células se pueden encontrar aisladas o en parejas, formando cadenas cortas o agrupadas en formas de V o Y. En cultivos viejos las células pierden la habilidad de retener la tinción de Gram y puede que se confundan con otros géneros. Células largas, delgadas y filamentosas pueden aparecer en los cultivos viejos. Listeria spp. no produce esporas y no forma cápsulas (Farber y Peterkin, 1991; Ryser y Marth, 1999). Listeria spp. forma colonias brillantes observadas a iluminación normal, y con una transmisión de luz oblicua se observan de color verde-azul (Seeliger et al. 1986). Listeria spp. posee flagelos perítricos, presentando motilidad a un rango de temperatura de 20 a 25ºC, pero no a 37ºC, debido a que la producción de flagelina se reduce a esta temperatura. En medio semisólido produce una forma típica de sombrilla (pino invertido), creciendo cerca de un centímetro y medio de la superficie porque es un organismo microaerofílico (Farber y Peterkin, 1991).

Es facultativo en cuanto a temperatura, sus límites de crecimiento están entre 1 y 45ºC, con temperatura óptima entre 30 y 37ºC, es psicrófilo, crece y sobrevive a temperaturas de refrigeración (Hough et al. 2002).

4.1.1. Clasificación taxonómica.

Anteriormente, el género Listeria estaba incluido dentro de la familia Corynebacteriaceae. Actualmente el Manual de Bergey incorpora el género Listeria en el grupo de bacilos no esporulados Grampositivos. El género Listeria incluye siete especies que son: L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii, L. grayi, L. denitrificans; pero solamente son aceptadas seis especies, ya que se considera a L. denitrificans morfológica, bioquímica y serológicamente diferente. Estudios de ácidos nucleicos indican que L. denitrificans no corresponde al género Listeria y por lo tanto ha sido considerada dentro del nuevo género Jonesia (Seeliger y Jones, 1986; Bell y Kyriakides, 2000), (Tabla 1). Taxonómicamente la posición de la especie L. grayi, es controversial, ya que fenotípicamente es similar a L. monocytogenes y a las demás especies del género Listeria, pero diferente en la habilidad de fermentar el manitol (Seeliger y Jones, 1986; Bell y Kyriakides, 2000). Resultados de hibridización del ADN y secuenciación en el ARNr 16S y 23S, muestran que las especies del género Listeria han sido divididas en dos líneas de descendencia: (I) L. monocytogenes (patógena para hombre y animales) y las especies cercanamente relacionadas L. inocua (no patógena), L. ivanovii (patógena en animales), L seeligeri (patógena, responsable de abortos en ovejas) y L. welshimeri (no patógena); (II) L. grayi (Collins et al. 1991; Sallen et al. 1996; Vázquez-Boland et al. 1996; Allerberger, 2003). El género Listeria pertenece a la sub-rama Clostridium, junto con Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus y Bronchothris. Esta posición filogenética de Listeria es

consistente con su contenido de G + C (36 al 42%). Se han identificado 2853 genes (35.3% de éstos no se les conoce función), (Allerberger, 2003).

Tabla 1. Miembros del género Listeria. Especies de Listeria monocytogenes innocua welshimeri

Nombre anterior Bacterium monocytogenes

seeligeri

Grayi

L. murrayi

ivanovii L. ivanovii spp. ivanovii L. monocytogenes spp. londoniensis Serovariedad 5 Tomado de: (Bell y Kyriakides, 2000).

Origen del hombre Alta producción de monocitos Inocua/inofensiva En honor a H.J. Welshimer, bacteriólogo norteamericano En honor a H.P.R. Seeliger, bacteriólogo alemán En honor a M.L. Gray, bacteriólogo norteamericano En honor a I. Ivanov, bacteriólogo búlgaro

El análisis de la secuencia de los genomas de L. monocytogenes y L. innocua revelan una relación filogenético con Bacillus subtilis, lo que sugiere un origen común para las tres especies. Por otra parte L. innocua posee un único cromosoma circular de 3.011.209pb con un contenido de G + C del 37%. Dentro del género Listeria, éstas dos especies presentan un alto grado de homología en la secuencia del ARNr 16S, siendo los de mayor cercanía taxonómica (Collins et al. 1991; Sallen et al. 1996; Rocourt, 1999; Glaser et al. 2001), (Figura 1).

4.1.2. Requerimientos nutricionales.

Las necesidades nutricionales de Listeria son similares a las de otras especies de bacterias Grampositivas. Crecen en medio simples tales como infusión cerebro-corazón (BHI) y en caldo tripticasa. En sus requerimientos nutricionales, necesita por lo menos de cuatro

vitaminas del grupo B, biotina, rioflavina, tiamina y ácido teicoico y de algunos aminoácidos como, cisterna (Cys), glutamina (Glu), isoleucina (Ile), leucina (Leu) y valina (Val), así como carbohidratos (glucosa). El crecimiento óptimo se produce en una atmósfera constituida por 5% (v/v) de oxígeno y entre 5-7% (v/v) de CO2 (Pinner et al. 1992; O´Driscoll et al. 1996; García et al. 2000; Hill et al. 2001; Jay, 2002). Ancestro de Género Listeria

Incorporación de LIPI-I

Listeria grayi Listeria seeligeri

Listeria monocytogenes

Listeria ivanovii

Listeria innocua Listeria welshimeri

Figura 1. Parentesco taxonómico de las especies de Listeria con base en los datos de la secuencia del RNAr 16S. LIPI-I (isla 1 de patogenicidad de Listeria). Adaptado de: (Vázquez-Boland et al. 2001a). El crecimiento de Listeria spp. es estimulado por el hierro (Fe+3) y fenilalanina (Phe). La glucosa y Glutamina son requeridas como fuentes primarias de carbono y nitrógeno (Seeliger y Jones, 1986; Ryser, y Marth, 1999).

4.1.2.1. Temperatura.

En relación a la temperatura, Listeria spp. sobrevive y se multiplica a temperaturas de -2 hasta 42C (Moltz y Martin, 2005; Ribeiro et al. 2005). Es psicrótrofo, aunque entre 4°C y 5°C el crecimiento es más lento; crece y sobrevive a temperaturas de refrigeración. Es microaerofílico, con crecimiento óptimo en presencia de 5% (v/v) de oxígeno y 5-10% (v/v) de CO2 (Taormina y Beuchat, 2001; Hough et al. 2002). Este organismo resiste durante varias semanas a -18ºC en varios sustratos. En condiciones ácidas y en los medios de laboratorio, la supervivencia es más corta (ICMSF, 1996a).

La resistencia al calor de Listeria monocytogenes ha sido estudiada a raíz de un brote de listeriosis ocurrido en Estados Unidos por el consumo de leche pasteurizada; lo que originó diversas opiniones referentes a que la pasteurización clásica puede o no destruir el microorganismo (Doyle et al. 1987; Santiago et al. 1999).

Algunas de las teorías principales son las siguientes: 

Barber, 1939 afirma que Listeria monocytogenes es destruída a 55C durante 60 minutos.



Potel, 1955, sostiene que la bacteria puede resistir a temperatura de pasteurización.



Barza, 1985, considera la teoría no comprobada de la supervivencia de Listeria monocytogenes en la leche pasteurizada y propone que se debe a que la bacteria es englobada por los leucocitos.



Bradshaw, 1985, informa que el tratamiento térmico de la leche a 71.7C y que 9 segundos de tiempo es suficiente para que la leche esté libre de Listeria monocytogenes.



Doyle, 1987, manifiesta que Listeria monocytogenes sobrevive a temperatura de pasteurización HTST utilizando 71.7C por 15.4 segundos (Doyle et al, 1987).

Algunos investigadores dicen que la termoresistencia de Listeria monocytogenes no resulta afectada por su ubicación intracelular. La Organización Mundial de la Salud (WHO) en 1988, concluye que la pasteurización es un proceso seguro el cual reduce el número de

Listeria spp.en la leche cruda a niveles en los cuales no representa un riesgo para la salud humana, sin embargo se recomienda realizar más estudios al respecto (Hayes et al. 1986; García et al. 2000). 4.1.2.2. pH.

Todas las cepas de Listeria crecen a pH neutro o ligeramente alcalino y tienen una escala amplia de pHs para el crecimiento, siendo el límite superior aproximadamente 9.2 y el inferior 4.6-5.0, pasado estos límites se inhibe el crecimiento, pero puede sobrevivir (ICMSF, 1996; Nuñez de González et al. 2004). El pH óptimo para Listeria spp. es 7.5 ± 0.2 (Johansen et al. 1996; Hough et al. 2002; Taormina y Beuchat, 2001).

Experimentalmente, la presencia de 0.1% (v/v) de los ácidos acético, cítrico y láctico en caldo triptosa, inhiben el crecimiento de Listeria spp., aumentando la inhibición a medida que la temperatura de incubación disminuye. La actividad de estos ácidos contra Listeria está relacionada con su grado de disociación, siendo el ácido cítrico y láctico menos perjudiciales que el ácido acético a un pH equivalente (Doyle et al. 2001). 4.1.2.3. Sales. L. monocytogenes es capaz de sobrevivir a concentraciones de 25% (p/v) de NaCl, puede desarrollarse a concentraciones de 10% (p/v) e incluso hasta un 20% (p/v) de NaCl. La concentración óptima de NaCl para el crecimiento de L. monocytogenes a 10ºC es de 2 a 2.5% (p/v). En la preservación de los alimentos la sal y los nitritos por separado no son buenos inhibidores del microorganismo, pero sí lo son, cuando se utilizan en combinación en cantidades permitidas para nitratos y concentraciones de sal al 3% (p/v) (Buchanan et al. 1989; Cole et al. 1990; Nolan et al. 1992; Smith, 1996; Duche y Tremoulet, 2002).

4.1.2.4. Actividad de agua (aw). El límite de valores de actividad de agua que afectan el crecimiento de las bacterias del género Listeria es de aproximadamente 0.90 a 30ºC cuando se utiliza el glicerol para

controlarla. Las actividades de agua bajas con temperaturas de 4ºC aumentan el efecto bacteriostático (Tapia de Daza et al. 1991; Farber et al. 1992). 4.1.3. Actividad bioquímica.

Listeria spp. es homofermentativa y posee actividad glucosa oxidasa (E.C. 1.1.3.4.) y NADH+H oxidasa (E.C. 1.6.99.3.). Todas las cepas crecen en glucosa formando lactato, acetato y acetoina como productos finales bajo condiciones aeróbicas. Anaeróbicamente, sólo las hexosas y las pentosas soportan el crecimiento. Todas las especies de Listeria producen ácidos a partir de celobiosa, fructosa, manosa, maltosa, glicerol, dextrinas, entre otras. El catabolismo de la glucosa procede de la vía de Embden-Meyerhof en ambos casos aeróbico y anaeróbico (Muñoz y Díaz, 1998; Ryser y Marth, 1999), (Tabla 2).

Todas las especies de Listeria spp. son fenotípicamente similares pero pueden ser distinguidas por pruebas como la hemólisis. L. monocytogenes es β-hemolítica en agar sangre formando zonas claras alrededor de la colonia, la reacción de CAMP es positiva frente a Staphylococcus aureus en forma de sombrilla, pero negativa frente a Rhodococcus equi. En paralelo se produce un fenómeno lítico en el cual hay interacción de al menos 2 factores con la membrana del eritrocito. En tal caso ocurre un primer paso en el que la esfingomielinasa (primer factor del eritrocito) de Staphyloccoccus fragiliza la membrana del glóbulo dejándola vulnerable a la acción del segundo factor, la listeriolisina O (LLO), resultando en la ruptura de la célula. La hemólisis es la característica clave para la especiación de aislamientos y también la más complicada de detectar (Junttila et al. 1998; Ryser y Marth, 1999), no obstante hay cepas que no producen hemólisis ni son patógenas para el hombre, como es el caso de L. innocua (Allman et al. 1995). 4.1.4. Constitución antigénica.

La

composición

lipídica

de

L.

monocytogenes

comprende

fosfatidiglicerol,

difosfatidiglicerol, galactosiglucisildiaglicerol. Los ácidos grasos principales son el 14 metil hexadecanóico (anteiso C17:O) y el 12 metil tetradecanóico (anteiso C15:O). La célula está compuesta aproximadamente por 35% de peptidoglicano formado por enlaces de

ácido meso-diaminopimélico. Los carbohidratos restantes consisten en ácidos teicoicos con polímeros covalentes enlazados en sitios específicos en el peptidoglicano, compuestos por glicerol o ribitol, azúcares neutros, N-acetilamina y fosfatos (Kaneda, 1991; Edgcomb, 2000). Basados en los antígenos somáticos (O) y flagelar (H), se han identificado hasta el momento 13 serovariedades (½a, ½b, ½c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7), siendo las más frecuentes, las de tipo ½a, ½b y 4b, las cuales han sido aisladas en más del 95% de los casos de listeriosis humana (Farber y Peterkin, 1991; Schuchat et al. 1991; Low et al. 1993; Brosch et al. 1994). Además, la mayoría de los brotes han involucrado un pequeño número de cepas relacionadas genéticamente del serotipo 4b. Otras serovariedades como la ½c, son relativamente raras en aislamientos clínicos humanos, pero son encontradas frecuentemente como contaminantes de alimentos. Algunas de estas serovariedades son compartidas por L. innocua y por L seelegeri. L. innocua está representada por sólo 3 serovariedades y se considera una variante no patógena de L monocytogenes (MacGowan et al. 1993; Swaminathan et al, 1995). Las especies no patógenas a excepción de L. welshimeri, muestran uno o más antígenos somáticos comunes (Menudier et al. 1991; Gray y Killinger, 1966), (Tabla 3). Tabla 2. Pruebas bioquímicas entre especies del género Listeria. Pruebas Iluminación Henry Movilidad en fresco Catalasa Oxidasa Bacilos Grampositivos Hemólisis Hidrólisis Urea Reducción Nitratos Movilidad SIM Voges - Proskauer TSI Ácido SH2

Especies del género Listeria monocytogenes

innocua

ivanovii

seeligeri

welshimeri

grayi

murrayi

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

Β

y

y

y

+ +

β Débil + +

y

+ +

β fuerte + +

+ +

+ +

+ +

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

Rojo metilo Fermentación de: Dextrosa Esculina Maltosa Ramnosa Manitol Xilosa

+

+

+

+

+

+

+

+ + + + -

+ + + v -

+ + + +

+ + + +

+ + + v +

+ + + + -

+ + + v + -

+= positivo. - = negativo. v = variable. y = no hemolítico. Tomado de: (Pascual y Calderón, 1999). Entre las serovariedades asociadas a listeriosis, las cepas 4b causan entre el 50% y el 70% de los casos en todo el mundo, pero las cepas de grupo antigénico ½a, ½b y ½c predominan en los aislamientos de alimentos (Boerlin y Piffaretti, 1991); esto sugiere que las cepas serotipo 4b están más adaptadas a tejidos de hospederos mamíferos que las cepas del serogrupo ½ (Schonberg et al. 1989; Kathariou, S. 2002). Tabla 3. Serotipos de las diferentes especies de Listeria spp. Microorganismo

Serotipo

L. monocytogenes

½a, ½b, ½c, 3a,3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d,4e, “7”

L. ivanovii

5

L. innocua

4ab, 6a, 6b

L. weishimeri

6a, 6b

L. seeligeri

2b, 4c, 4d, 6b

Tomado de: (Swaminathan et al. 1995).

Los serotipos ½a, ½b, ½c, 3a, 3b y 3c de L. monocytogenes necesitan identificación de ambos antígenos O y H; mientras los serotipos 4a, 4ab, 4c, 4d, 4e y 7 tienen los mismos antígenos H, sólo necesitan la identificación de antígenos O (Lukinmaa, S. 2003), (Tabla 4).

La combinación de patrones de ribotipificación y genes alelos de virulencia, separaron a L. monocytogenes en tres linajes distintos que parecen tener diferentes potenciales patogénicos. El linaje I (serotipos ½b, 4b, 3b y 3c) es común entre casos de listeriosis

humanas y brotes, que entre casos animales. El linaje II (½a, ½c y 3a) contiene aislamientos humanos y animales pero aparentemente no hay aislamientos asociados con brotes esporádicos. El linaje III (serotipos 4a y 4c) es más común entre casos de listeriosis animal que entre casos humanos (Weidmann et al. 1997; Jeffers et al. 2001; Kathariou, 2002; De Jesús y Whiting, 2003; Doumith et al. 2004; Gray et al. 2004; Bruhn et al. 2005; Jeffers et al. 2001; Kathariou, 2002; Weidmann et al. 1997). 4.1.5. Hábitat donde puede aislarse L. monocytogenes Dos propiedades de L. monocytogenes contribuyen en su distribución amplia: a) a pesar de no formar esporas, es capaz de sobrevivir durante períodos prolongados en diferentes medios y b) es un microorganismo psicrótrofo. Por tal motivo, el alimento se puede contaminar en cualquier eslabón de la cadena alimentaria, y el almacenamiento en frío no inhibe el crecimiento de Listeria (Doyle et al. 2001). Tabla 4. Serotipos de L. monocytogenes y sus antigenos O:H. Serotipo

Antigenos O

½a I, II (III) ½b I, II (III) ½c I, II (III) 3a II, (III), IV 3b II, (III), IV, (XII), (XIII) 3c II, (III), IV, (XII), (XIII) 4a (III), (V),VII, IX 4ab (III), (V),VI, VII, IX, X 4b (III), V, VI 4c (III), V, VII 4d (III), V, VI, VIII 4e (III), V, VI, (VIII), (IX) 7 (III), XII, XIII Tomado de: (Lukinmaa, S. 2003).

Antigenos H AB ABC BD AB ABC BD ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC

4.1.5.1 Fuentes ambientales. Las maneras diversas en que L. monocytogenes puede contaminar el medio ambiente y sobrevivir en condiciones extremas y el hecho de ser una entidad infecciosa que involucra

peces, aves, bovinos y cerdos además, de humanos, incrementa considerablemente las posibilidades de diseminación y contaminación de los alimentos (Gallego et al. 2003). Esta bacteria es capaz de sobrevivir y crecer en agua dulce, agua salada, aguas de desecho crudas o tratadas, suelos, polvo ambiental, silos, fertilizantes y vegetación en descomposición (Watkins y Sleath, 1981; MacGowan et al. 1994); ha sido aislada de heces fecales de humanos y de animales sanos y asintomáticos (Weis y Seeliger, 1975; Schuchat et al. 1993; Grif et al. 2001; Grif et al. 2003), de alimentos para animales, alimentos crudos de origen animal, incluídos aves frescas y congeladas, carnes rojas y productos cárnicos; pescado; productos lácteos crudos como leche, quesos y helados; frutas y vegetales crudos (MacGowan et al. 1994; Leclerc et al. 2002).

L. monocytogenes se encuentra con más frecuencia en suelos no cultivados que en los cultivados, aunque se le ha encontrado en tierra de jardín. Las plantas son reconocidas como un reservorio importante del microorganismo y se han propuesto como fuente de infección. Este microorganismo se ha aislado a partir de maíz, fríjol de soya, hierbas silvestres, hojas de arbustos (MacGowan et al. 1994).

Aún no se ha resuelto el punto básico acerca de si L. monocytogenes surge primero del suelo o se origina en los animales que excretan las bacterias en sus heces. Sin embargo en la actualidad se considera que el hábitat primario de L. monocytogenes es el suelo y los vegetales en descomposición, en los que se puede desarrollar en forma saprófita (McCarthy, 1990; Fenlon, 1999).

La contaminación de los vegetales con L. monocytogenes, se produce directamente del suelo o por contacto con fertilizantes orgánicos. El almacenamiento prolongado de los vegetales en frío y la cocción deficiente hace que la ingestión de los productos contaminados favorezca la colonización del tracto gastrointestinal de las personas más susceptibles. La práctica habitual de conservar en frío, durante cierto tiempo después de su distribución por los mayoristas, permite que un inóculo inicial pequeño de L. monocytogenes prolifere, o bien que el frío cause la muerte de los microorganismos competitivos (Torres et al. 2004a).

Este microorganismo se ha aislado en más de 40 especies de mamíferos, incluyendo ganado bovino y ovino, así como en 17 especies de aves domésticas y silvestres, y ha sido recuperado de anfibios, peces, pulgas, garrapatas y crustáceos (Weis y Seeliger, 1975; Kampelmacher y Van Noorle Jansen; 1980; Mead, 1982; Fenlon, 1989; Carosella, 1990; Fthenakis et al. 1998). Los animales de granja, principalmente las aves, son reconocidos como reservorios de este patógeno. Las aves silvestres son una fuente de contaminación de Listeria para el ensilaje, representando una fuente indirecta de listeriosis en animales de granja y humanos (Bracket, 1988; Hubálek, 2003).

Entre los productos alimenticios más importantes, causantes de la presentación de la enfermedad en seres humanos, se encuentra la leche y subproductos lácteos, los cuales pueden contaminarse por todo tipo de suciedad medio ambiental portadora del microorganismo y más en vacas con mastitis, las cuales pueden excretar hasta 103 UFC/ml (Gallego et al. 2003).

Así mismo es importante mencionar se indican algunos modos mediante los cuales se disemina L. monocytogenes, junto con las diversas procedencias del organismo para las personas (Figura 2).

4.1.5.2. Plantas de producción y procesadoras de alimentos.

Por sus características psicotróficas, es posible encontrarla en muestras ambientales de fábricas de alimentos particularmente en depósitos de aguas a temperaturas relativamente bajas, incluyendo sistemas de enfriamiento, canales de drenaje y el agua acumulada en las bandejas de refrigeración (Pascual y Calderón, 1999).

Además se encuentra en suelos, aire acondicionado, en las proximidades de pasteurizadores y enfriadores de leche, gotas de condensación, piensos de mala calidad microbiológica, industrias de carne y mataderos (Pascual y Calderón, 1999).

Las superficies de los utensilios y los equipos en contacto con el producto en las fases finales del proceso del desposte de las reses, tienen una gran importancia como fuentes de contaminación por Listeria durante todo el proceso de transformación de los productos (Franco et al. 1995; Fenlon et al. 1996; Chasseignaux et al. 2001; Lundén et al. 2002). SECRECIÓN Y EXCRECIÓN DE LOS ANIMALES Heces, secreciones de útero y vagina, placenta, membranas

Contaminación aérea ANIMAL Enfer./colonización intestinal

MEDIO AMBIENTE

Contaminación aérea

TIERRA – AGUA Cieno y agua

Hortalizas (col, plantas, ensilado)

Aguas Residuales, río

HOMBRE Enfer. Colonización intestinal

PRODUCTOS ANIMALES Leche, carne, canales, productos lácteos

Figura 2. Modos mediante los cuales L. monocytogenes se disemina en el ambiente, en los animales y en las personas. Las principales fuentes de contaminación de L. monocytogenes dentro de las plantas procesadoras de alimentos son: 

Empleados (A través de su ropa, batas; por el contacto directo del producto con la piel o por el polvo en los zapatos).



Animales que excretan la bacteria o presentan contaminación cutánea, por medio de vegetales crudos.



Limpieza y desinfección inadecuados del equipo.



En el medio ambiente (a través de bacterias que flotan en la humedad generada en las áreas de trabajo, y que pueden ser transportadas por el aire y el rocío).



Falla en la cadena de frío de los productos.



Contaminación cruzada del alimento durante el procesamiento y empaque (Hudson y Mead, 1989; Schofield , 1992; Nesbakken et al. 1996; Unnerstad et al. 1996; Johansson, 1998; Johansson et al. 1999).

L. monocytogenes puede crecer en ambientes húmedos y fríos, como los que se encuentran en cualquier área de procesamiento, en los refrigeradores o en los pisos de los cuartos donde se efectúa el sacrificio de animales (contaminación por materia fecal). Entre el 11 % al 52% de animales son portadores fecales sanos. Se ha aislado L. monocytogenes de ganglios retrofaríngeos de ganado vacuno. En los mataderos este microorganismos ha sido recuperado en las zonas donde desuellan las reses y en las maquinas desplumadoras de aves (Buncié, 1991).

L. monocytogenes sobrevive a diversas tecnologías de procesamiento de alimentos, por ejemplo, es halotolerante, resiste pH relativamente bajos y es capaz de multiplicarse a temperatura de refrigeración (Lou y Yousef, 1999). Este microorganismo puede sobrevivir en ambientes adversos gracias a la capacidad de respuesta a cambios ambientales, habilidad que es regulada transcripcionalmente. En L. monocytogenes se ha identificado el factor sigma β (δβ) involucrado en la resistencia a pH bajos, criotolerancia, limitación de carbono y resistencia al estrés oxidativo (Gardan et al. 2003).

L. monocytogenes acumula intracelularmente solutos osmoprotectores (carnitina y betaína) bajo peso molecular y alta solubilidad, los cuales regulan las diferencias de presiones osmóticas con el medio exterior. La síntesis y el control de estas sustancias están reguladas por el factor el factor δβ (Gardan et al. 2003). El crecimiento de Listeria a bajas temperaturas es mediado por la lipoproteína OppA bacteriana que favorece el transporte de oligopéptidos en dichas condiciones de refrigeración (Borezee, 2000).

El saneamiento inadecuado y/o la eliminación incompleta de la carne o grasa del equipo de procesamiento, pueden permitir el desarrollo de biopelículas (biofilms). Los biofilms son comunidades microbianas que existen sobre superficies biótica y algunas veces abióticas. Estas biopelículas brindan nutrientes y un lugar de acceso para el crecimiento de diversas bacterias incluida L. monocytogenes (Poulsen, 1999; Djordjevic et al. 2002; Hassan et al. 2004).

Cuando la bacteria coloniza las superficies cambia el fenotipo, desarrolla resistencia a desinfectantes e incrementa la producción de exopolisacáridos para la formación de biofilms. La cantidad de microorganismos transferidos de una superficie inerte a un alimento depende de las propiedades del “biofilm”: densidad de la superficie de la población microbiana, estructura, capacidad para producir exopolisacáridos, y la potencia del ataque de las células microbianas (Midelet y Carpentier, 2002).

La adherencia de L. monocytogenes a las superficies de materiales inertes es el resultado de reacciones fisicoquímicas entre las superficies y el microorganismo (Meylheuc et al. 2002). Estas interacciones, principalmente de van der Waals, Lewis y de tipo electrostático, son dependientes de las propiedades hidrofóbicas o hidrofílicas (Magnusson, 1982; Rosenberg y Kjellerberg, 1987), de las características donador-receptor de electrones (VanOss, 1993), del potencial de superficie del sustrato receptor (VanLoosdrecht et al. 1987) y de la célula bacteriana (Absolom et al. 1983).

L. monocytogenes se adapta fácilmente en los ambientes de producción y procesamiento de alimentos por la adquisición de resistencia a sanitizantes. Esta resistencia puede ser una propiedad natural intrínseca del microorganismo o adquirida a través de plásmidos o transposones, integrones y/o secuencias de insersión. Como una adaptación a ambientes adversos, la bacteria puede usar una bomba de flujo multimedicamento (“multidrug) que fuerza la salida de protones para eliminar y evitar los efectos de la acumulación de químicos en el interior (Frank y Koffi, 1995; Romanova et al. 2002).

Para garantizar que el crecimiento de L. monocytogenes no suceda, un producto debe tener al menos una de las siguientes características: 

Una actividad del agua de 0.85 o menos.



Un pH de 4.6 o menor cuando este valor es tomado a 9.6ºC.



Que haya sido empacado en un recipiente sellado, que el sello no muestre violaciones y que sea comercialmente estéril a temperatura ambiente.



Que la composición natural del producto no permita el crecimiento de los microorganismos (USDA-FSIS, 2001)

4.1.5.3. Carne de pollo.

La carne de pollo como alimento es una excelente fuente de aminoácidos esenciales, respecto al contenido vitamínico, destaca la presencia del ácido fólico y la Vitamina B3 o niacina. Entre los minerales, el nivel de hierro y de zinc es menor que en el caso de la carne roja, aunque supone una fuente más importante de fósforo y potasio (Hall, 1993).

Una característica especialmente de la carne de pollo es la escasa concentración de grasa, especialmente en las partes magras, como la pechuga, donde la proporción de lípidos es inferior al 1%. Si a esto sumamos que las aves son susceptibles de modificar la composición de su grasa con la dieta recibida, se podría conseguir que esta grasa no fuese excesivamente saturada, mejorando su calidad. Estas características convierten al producto en un concentrado proteíco de elevada eficacia nutricional, ya que las proteínas son fácilmente digeribles y de alta calidad biológica (Fonavi y Fenavi, 2000), (Tabla 5).

Las aves de corral (pollo tipo broiler, listo para comer, precocido, refrigerado o congelado) también son contaminadas frecuentemente (Berrang et al. 2002). Durante el transporte de las aves desde las granjas a los mataderos tiene lugar la contaminación directa y la cruzada. La aglomeración de animales y las malas condiciones climáticas durante el transporte generan estrés en los animales dando lugar a excreciones más frecuentes de materia fecal. Al colgar y degollar a las aves puede tener lugar una contaminación cruzada adicional; las sacudidas de las alas dan origen a polvo y aerosoles que se transfieren a las canales de transporte más próximas dentro del matadero (Siliker et al. 1980).

Tabla 5. Composición nutricional (c/100g de porción comestible de carne de pollo). Alimento

Pollo con piel

Agua

Kcal

Proteína

Grasas

Zinc

Sodio

Vit.

Vit.

N

AGSM

AGM

AGP

C

(ml)

(n)

(g)

(g)

(mg)

(mg)

B1

B2

(mg)

(g)

(g)

(g)

(g)

(mg)

(mg)

0.10

0.15

10.4

3.2

4.4

1.5

110.0

70.3

167.0

20.0

9.7

1.0

64.0

Pollo

en

75.4

112.0

21.8

2.8

0.7

81.0

0.10

0.15

14.0

0.9

1.3

0.4

filetes

AGS: grasas saturadas, AGM: grasas monoinsaturadas, AGP: grasas poliinsaturadas.

Tomado de: (Fonavi y Fenavi, 2000).

Existen diversas fuentes de contaminación que pueden promover el crecimiento y desarrollo de éste microorganismo en la carne de pollo, es probable que estas fuentes estén presentes desde la fase de producción primaria (cuando el animal vivo es contaminado intestinalmente, o por fatiga del animal, el estrés, el ayuno prolongado e inclusive la ingestión de alimentos); sin embargo los mayores riesgos se presentan durante las operaciones en que la carne de pollo es manipulada y no se tienen los cuidados relacionados con el acondicionamiento de la atmósfera alrededor de ella. Otras fuentes de contaminación pueden provenir de las malas prácticas de higiene y desinfección y al diseño inadecuado, deficiencia de limpieza y desinfección de los equipos utensilios y de instalaciones (Fonavi y Fenavi, 2000).

La contaminación de carnes, de embutidos y de productos animales es exógena, es decir se produce en cadenas de sacrificio, procesado, empacado y almacenamiento, entre otros (Cox et al, 1999).

El pollo crudo, precocido, refrigerado o congelado también es contaminado frecuentemente (Carpenter y Harrison, 1989; Cantoni et al. 1990; Rijpens et al. 1997; Berrang et al. 2002). Dentro de la cadena agroalimentaria de carne de pollo se pueden identificar diversas fuentes de contaminación (Thomas y McMeekin, 1980; Hudson y Mead, 1989; Ramírez, 1999; Berrang et al 2002; Chasseignaux et al 2002): 

Pollo en pie: desinfección deficiente de galpones, bebederos y comederos antes de la llegada del lote de pollos y acumulación de gallinaza en las camas de las aves.



Transporte de las aves desde las granjas a los mataderos: contaminación directa y cruzada. La aglomeración de animales y las malas condiciones climáticas durante el transporte generan “stress” en los animales dando lugar a excreciones más frecuentes de materia fecal y de contenido cecal.

69.0



Recepción y colgado: contaminación de equipos y utensilios. Al colgar y degollar a las aves puede tener lugar una contaminación cruzada adicional.



Insensibilización y sangría: exposición a exudados intestinales contaminados.



Escaldado: escaldado a medias o contaminación por la entrada del pollo vivo inhalando el agua del escaldado



Desplume: contaminación de equipos y utensilios, caída de pollo al suelo



Escaldado de patas: presencia del patógeno en las patas, equipos y utensilios contaminados por el microorganismo.



Pelado y corte de patas: La caída de la canal del gancho o por el inadecuado manejo del operario.



Revirado: caída del ave al suelo y mala manipulación del operario.



Eviscerado: presencia de heces que presentan el patógeno en la superficie del ave, contaminación cruzada por ruptura del intestino.



Lavado final y pre-enfriamiento (Pre-chiller): presencia del microorganismo en el agua-hielo.



Enfriamiento (Chiller): presencia del microorganismo en el agua-hielo y monitoreo incorrecto de la temperatura.



Escurrimiento y clasificación: ambiente en malas condiciones (entrada de polvo, goteras de tubería sobre el producto, poca circulación de aire, temperatura ambiental elevada, mal colgado de la canal, entre otros), contacto de la canal con el manipulador y contaminación de canastillas o mesas de escurrido.



Desposte: utilización de equipos y utensilios contaminados, manipulación incorrecta del operario.



Empaque: contaminación del embudo de empaque, manipulación incorrecta del operario.



Almacenamiento refrigerado: la presencia constante en el cuarto de personas o animales como vectores o del aire, pérdida de la cadena de frío, monitoreo incorrecto de la temperatura y desinfección incorrecta de los cuartos de almacenamiento.



Transporte refrigerado: mal almacenamiento durante el transporte y deficiencia en la desinfección de los furgones.



Exhibición y venta: manejo inadecuado de temperatura de almacenamiento, contacto con cortes contaminados de diferentes carnes, frutas y verduras utilizadas para decoración.

4.2. LISTERIOSIS HUMANA.

Se ha dado el nombre de listeriosis al grupo general de desórdenes causados por L. monocytogenes, y se define clínicamente cuando el microorganismo es aislado de sangre, LCR (líquido cefalorraquídeo) o de otros sitios que normalmente son estériles como la placenta (Low y Donachie, 1997).

L. monocytogenes es un organismo intracelular que afecta típicamente pacientes donde la inmunidad celular ha disminuido. Listeria causa las más severas enfermedades en pacientes con VIH, cáncer, diabetes melitus, falla renal, alcoholismo y embarazadas (DiMaio, 2000).

Se pueden distinguir dos formas básicas de sintomatología presentada por la Listeriosis, según el riesgo que represente para la salud: la listeriosis invasiva, y la no invasiva. La primera se caracteriza por la diseminación severa de la infección o una infección local en el SNC, pudiendo causar la muerte. Dentro de éste género se encuentran la listeriosis prenatal y la listeriosis en pacientes adultos. Por el contrario, en la no invasiva o listeriosis gastrointestinal existe la infección pero no representa un alto riesgo para la salud (DiMaio, 2000).

La infección usualmente ocurre después de la ingestión de comidas contaminadas. El periodo de incubación está entre 2 y 6 semanas. Las manifestaciones clínicas incluyen sepsis, meningitis, cerebritis, meningoencefalitis, cerebritis, granulomatosis infantoséptica y una variedad de infecciones focales (DiMaio, 2000).

4.2.1. Listeriosis Invasiva.

La listeriosis invasiva puede tener un largo período de incubación (hasta tres meses) y una amplia gama de síntomas. Entre las manifestaciones severas causadas por L. monocytogenes se incluye: bacteriemia, meningitis bacteriana, conjuntivitis, infección del SNC, infección cutánea, encefalitis, endocarditis, meningoencefalitis, aborto, enfermedad neonatal, osteomielitis, peritonitis, infección pleural, pulmonía, nacimiento prematuro, septicemia, y pérdida del feto (Gellin, 1989; Amstrong, 1995; DiMaio, 2000). 

Infección en el embarazo.

La infección por L. monocytogenes puede ocurrir en cualquier trimestre del embarazo, pero es más frecuente durante el tercer trimestre. Listeria puede proliferar en la placenta y puede escaparse de los mecanismos usuales de defensa (Ray, 1964; Klatt et al. 1986).

Los pacientes suelen presentar: fiebre, escalofrío, dolor dorsal. Dos tercios de las embarazadas presentan un síndrome prodrómico similar a la gripe que coincide con la bacteriemia, momento óptimo para realizar hemocultivos (Ray, 1964; Klatt et al. 1986).

La listeriosis materna puede precipitar el trabajo de parto y esto puede provocar un aborto fetal o un parto pretérmino de un feto infectado. Dado que los cultivos bacterianos no son rutinariamente obtenidos en los abortos espontáneos o en los óbitos es difícil obtener una estimación de la proporción de pérdida fetal atribuible a la infección por L. monocytogenes (Ray, 1964; Klatt et al. 1986). 

Sepsis.

La sepsis sin una infección localizada es la más común en pacientes con deficiencias en el sistema inmune, ocurriendo en el 21-43% de los casos. El paciente tiene nauseas, vómito. La sepsis puede progresar diseminando la coagulación intravascular. Las características clínicas de la sepsis listerial son similares a otros tipos de sepsis bacterial y su diagnóstico se basa en un cultivo de sangre positivo (DiMaio, 2000). 

Granulomatosis infantiséptica.

La transmisión transplacentaria es responsable de este cuadro, el lactante presenta abcesos o granulomas diseminados en múltiples órganos (hígado, bazo, pulmones, riñones y encéfalo). Puede haber evidencia de amnionitis o líquido amniótico teñido de meconio. Es posible el desarrollo de insuficiencia respiratoria y circulatoria, en estas circunstancias se debe cultivar el meconio, el líquido amniótico, hemocultivos del lactante y de la madre y los loquios maternos. La mortalidad en este síndrome ha sido cercana al 100% en algunas series (Southwick y Purich, 1996; Koneman et al. 1999; DiMaio, 2000; Nardone et al. 2003). 

Meningoencefalitis.

Al igual que la sepsis, se presenta en el período neonatal tardío y en adultos con comorbilidad. La enfermedad en el adulto es con mayor frecuencia subaguda. Los pacientes son meningitis sin abceso encefálico han mostrado signos neurológicos focales, con compromiso de pares craneanos y/o hemiplejia (Koneman et al. 1999; Nardone et al. 2003).

El líquido cefalorraquídeo (LCR) se caracteriza por la presencia de más de 1000 células/mm3 pudiendo encontrarse según la evolución del cuadro polimorfonucelares; la proteinorraquia baja en la mitad de los casos. El aspecto del LCR rara vez es purulento. El microorganismo puede observarse o no al Gram, pero habitualmente desarrolla en los cultivos (Koneman et al. 1999; Nardone et al. 2003). 

Cerebritis.

Se reconoce e informa con mayor frecuencia. El paciente puede presentar sólo cefalea y fiebre, o presentarse con grados variables de parálisis que simulan un ataque cerebrovascular. Se han comunicado casos de romboencefalitis que comienzan con fiebre, cefalea, náuseas, vómitos seguidos de varios días después por parálisis progresiva simétrica de los pares craneanos, depresión de conciencia y signos cerebeloso, en ocasiones convulsiones y hemiparesia. La mayoría de los pacientes son inmunodeprimidos y la mortalidad es alta (Laciar et al. 2000).

El (LCR) puede tener escasa celularidad, proteinorraquia y glucorraquia normal, gram y cultivo negativos. El diagnóstico se efectúa cuando el hemocultivo es positivo. Requiere como mínimo 6 semanas de tratamiento (Laciar et al. 2000).



Infecciones focales.

Las lesiones cutáneas se observan en asociación con granulomatosis infantiséptica, en veterinarios como resultado del contacto directo con animales infectados, y trabajadores de laboratorio, como resultado de inoculación directa accidental. No existe nada característico en las lesiones ulcerosas y es necesario el examen directo y cultivo para establecer el diagnóstico (DiMaio, 2000). 4.2.2. Listeriosis no invasiva (Gastroenteritis Listerial).

Ocurre en hospederos normales que consumen alimentos contaminados con L monocytogenes. Una evidencia de este hecho surge de un brote en IIlinois (USA) en 1994 donde pacientes manifestaron diarrea y fiebre luego de la ingesta de leche chocolatada que se encontraba contaminada con L. monocytogenes (con un inóculo de 109 UFC/ml), encontrándose el agente etiológico tanto en la leche como en las heces de los pacientes (Dalton et al. 1997).

La frecuencia de la gastroenteritis causada por L. monocytogenes es indeterminada así como la dosis infectante y las características del huésped que se asocia con esta enfermedad (Dalton et al. 1997).

Los síntomas típicos de la infección gastrointestinal están relacionados con: escalofríos, diarrea, dolor de cabeza, dolor y calambres abdominales, náuseas, vómito, fatiga, y mialgia. Debido a que los síntomas no se presentan como severos, existe un gran potencial de que no se reporten los casos de Listeria gastrointestinal (Dalton et al. 1997).

4.2.3. Epidemiología de la listeriosis.

El descubrimiento oficial de L. monocytogenes data de 1926 cuando Murray y colaboradores aislaron este microorganismo como el agente etiológico de una enfermedad sistémica en conejos y cobayos en Cambridge (Murray et al, 1926). Posteriormente, se aisló de ovejas, cabras, cerdos, ratas y moscas. Los primeros casos de listeriosis humana fueron

reportados en 1936 por Burn, quién aisló el microorganismo de cadáveres de neonatos e implicó la bacteria como causa de meningitis en adultos (Burn, 1936), y por Nyfeldt en Dinamarca en 1937, quién aisló la bacteria a partir de sangre de pacientes que sufrían una enfermedad parecida a la mononucleosis infecciosa (Nyfeldt, 1937). Sin embargo el primer cultivo de L. monocytogenes data de 1921, cuando la bacteria fue aislada en Francia por Dumont y Cotoni de un paciente con meningitis (Dumont y Cotoni, 1921).

Durante muchos años, los aislamientos clínicos de Listeria fueron esporádicos, y la epidemiología de la enfermedad no era conocida. El primer brote epidemiológico de listeriosis reconocido ocurrió en 1981 en Canadá y el agente etiológico asociado fue una ensalada. Otros brotes de listeriosis humana han sido asociados con leche, queso fresco, paté, carne de cerdo y otros alimentos de origen animal o vegetal (Cormac et al.1996; Blais et al. 1997).

El mayor brote epidémico de listeriosis en humanos descrito en Alemania entre los años 1949 y 1951 se relacionó directamente con el consumo de leche cruda (Gray y Killinger, 1966). Hasta 1960 sólo se habían comunicado 500 casos de listeriosis en todo el mundo, alcanzando en 1981 la cifra de 10.100 (Ralovich, 1984; Bryan, 1988). L. monocytogenes cobra importancia en la década de los ochenta al estar implicada como agente causal de una serie de brotes epidémicos ocurridos por el consumo de alimentos en América del Norte y Europa (Schlech et al. 1983; Bean y Griffin, 1990; Jones, 1990; O' Driscoll et al. 1996; Torres et al. 2004a).

Entre los años 2000 y 2002 se presentaron en los Estados Unidos y Francia brotes. El primero relacionado con el consumo de carnes de pollo y pavo contaminadas y queso casero “estilo mexicano” contaminado (CDC, 2001; Hof, 2003) y el segundo relacionado con el consumo de gelatina de lengua de cerdo (Goulet et al. 2000). En el transcurso del año 2004 se han presentado casos esporádicos en Estados Unidos (Bera, 2004). Los reportes de listeriosis en mujeres embarazadas en Estados Unidos indican 12 a 17% de casos, mientras que en Europa se reporta una incidencia de 0.5 a 3%. En Colombia, hay

disponibles algunos datos con respecto a la epidemiología de la listeriosis, debido posiblemente al subregistro clínico e industrial (Escarcega et al. 1999). En sentido general, el porcentaje de mortalidad por listeriosis es del 30% (Lorber, 1997) y puede llegar a ser el 50% de la población neonatal (MacGowan et al. 1991). La mayoría de los casos se concentran en la población inmunosuprimida, menores de un mes y mayores de 60 años (Lorber, 1997). En situaciones epidémicas, la incidencia en la población de riesgo se incrementó en factor de 3 a 10 (Schwartz et al. 1989). El aumento mundial de los casos de listeriosis se puede deber a varios factores: 

Adaptación microbiana



Cambios demográficos, aumento de la población susceptible (entre ellos los pacientes con SIDA) y la población de ancianos.



Cambios en la producción y distribución de alimentos: aumento de alimentos procesados listos para usar y que se pueden almacenar por tiempo prolongado.



Carencia de recursos e infraestructura en las entidades de Salud Pública.



Aumento de oportunidades de viaje y actividades comerciales que favorecen la diseminación de esta enfermedad a nivel local, regional y mundial (Rocourt y Cossart, 1997).

4.3. INCIDENCIA DE L. monocytogenes EN CARNES DE POLLO. Las toxiinfecciones alimentarias producidas por L. monocytogenes en los años anteriores a 1989 se asociaban a alimentos como vegetales crudos, ensaladas de col, leche cruda o queso fresco “estilo mexicano”, pero fue en 1989 cuando por primera vez se describió un caso de L. monocytogenes asociado a productos de aves de corral contaminados (Johnson et al. 1990). Los primeros brotes alimenticios fueron descritos en Canadá en 1981, Estados Unidos 1983, Suiza 1983-1987, Estados Unidos 1988, Reino Unido 1989-1994, y Francia 1993-1995 (Roberts, 1994; Kozak et al. 1996). Los alimentos involucrados fueron aquellos que venían listos para comer y que eran conservados en refrigeración durante un tiempo prolongado, contaminados con más de 100UFC de L. monocytogenes por gramo (Kozak et al. 1996; McLauchlin, 1996; Rocourt y Cossart, 1997), (Tabla 5).

El pollo ha sido implicado como vector de trasmisión de Listeriosis humana. Bailey et al. 1989 recuperaron L. monocytogenes del 23% de carcasas de pollo, siendo el serotipo ½ es más frecuente. Pollo cocinado frío y pavo, han sido confirmados como vehículos de infección de Listeria en Inglaterra y Estados Unidos, durante 1988 y 1999. Genigeorgis, C. et al. 1989 reportaron que un 36.7 % de pieles de pollo fueron positivas para Listeria spp. , Lawrence, et al, 1994 encontraron una prevalencia del 15% de L. monocytogenes en muestras de pollo crudo, MacGowan et al, 1994, aislaron 66% y 38% de L. monocytogenes a partir de carne de pollo y res respectivamente, Franco, et al, 1995 encontraron que el 96% de muestras evaluadas fueron positivas para Listeria spp., y Cox, et al, 1997, encontraron una prevalencia del 26% de L. monocytogenes en carcasas de crudas de pollo.

En Colombia, aunque se ha comprobado casos de listeriosis humana, los estudios no han demostrado la relación directa de dicha enfermedad con la ingestión de L. monocytogenes en carne de pollo (Ramirez y Urquijo, 2002).

4.4. PREVENCION Y CONTROL.

La tendencia actual es controlar los alimentos y el agua que consumen los animales, debido a que cada vez más, patógenos como L. monocytogenes tienen un reservorio animal y son verdaderas zoonosis que se diseminan rápidamente (Foster, 1997; Chin, 2000). Tabla 5. Predominio de L. monocytogenes en carnes de pollo Muestras Alimento

+/ Muestras

País

Año

Ref.

Totales Gallina

7/22

Pollo fresco

23/50

Estados Unidos Reino Unido

1988

(McClain y Lee, 1988) (Pini y Gilbert, 1988)

Pollo congelado Pollo

27/50

precocido

almacenado en frío

5/21

Cuero de pollo crudo

8/17

Pollo en presas

12/25

Gallina

14/56

Pollo asado

13/60

Pollo

precocido

listo

para comer

Alas, perniles e hígados frescos de pollo Pollo congelado

17/100

Morgen,

(Lowry y Tiong, 1988)

Zelanda Suiza

(Breer y Breer, 1988) (Lawrence

y

Gilmour,

1994)

63/527

21/90

y

1988)

Nueva

(Gilbert et al. 1989) Canadá

17/100

Cuero de pollo asado

(Skovgaard

Dinamarca

Reino Unido

9/16

Pernil de pollo

(Kerr et al. 1988)

1989 Estados

(Farber et al. 1989) (Genigeorgis et al. 1989) (Bailey et al. 1989)

Unidos (Genigeorgis et al. 1989)

12/80

Australia

(Varabioff, 1990)

27/102

Reino Unido

(Kerr et al. 1990)

Cuero de pollo

8/16

Taiwan

(Wong et al. 1990)

Pollo

1/21

China

Pollo

precocido

almacenado en frío

Costillas

de

pollo

asadas Cuellos de pollo asados

Gallina precocida

1990

(Wang et al. 1992) National

448/2072

Advisory

Committee

on

280/1730 Estados

Microbiology Criteria for

Unidos

Foods, L. monocytogenes in

22/1580

Meat,

Poultry

and

Fishery Products. Pollo en canal

32/100

Bélgica

y 1992

27/100

Francia

1993

(Uyttendaele et al. 1997)

Presas de pollo

42/67

Malasia

Pollo crudo

34/58

Reino Unido

Pollo

19/120

Presas de pollo

8/24

Pollo

16/324

Colombia

(Arumugaswamy

et al.

1994) 1994

(Lawrence

y

Gilmour

1994)

1996

(Moreno y Pulido, 1996)

1997

(Bernal, 1997) (De Simón, M., Ferrer,

España 1999

2002)

Pollo picado

17/46

Japón

(Satoshi et al. 2000)

Gallina

32/100

España

Pollo crudo

16/65

Portugal

2000

(Guerra, 2001)

Pollo procesado

36/255

Colombia

2004

Fonseca y Correa, 2004

(Capita et al. 2001)

Tomado y modificado: (Torres et al. 2004a).

Debido a que Listeria se encuentra ampliamente distribuida en el medio ambiente, es indispensable que en las operaciones de procesamiento de alimentos se evite contaminar los alimentos crudos o sin procesar, y evitar la recontaminación de los productos precocidos (Broome, 1993; Ministere de la Sante, 1995; Ministere de la Sante, 1996; Tauxe, 1997).

El Servicio de Seguridad e Inspección de los Alimentos del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (FSIS) es el responsable de inspeccionar los mataderos y/o plantas de procesamiento de carnes de res y aves. Ninguna de las agencias permite L. monocytogenes en alimentos cocidos listos para comer. Esto se llama "Tolerancia Cero". Por lo tanto, las agencias federales están trabajando con la industria para identificar y corregir las áreas con problemas potenciales (Tompkin, 2002).

Además, el FSIS requiere ahora que los mataderos y las plantas de procesamiento de carne y aves, utilicen el sistema HACCP para reducir bacterias peligrosas en los alimentos. El sistema requiere que la industria de producción de alimentos identifique los puntos críticos en donde los alimentos puedan contaminarse y seguir los pasos necesarios para prevenir la contaminación (Tompkin, 2002).

El FSIS juega un papel activo en las investigaciones con los “Control Desease Center” (CDC) y la “Food and Drug Administration” (FDA) si se identifica un problema de producción de alimentos o una epidemia que están relacionados con carnes. Si es necesario, la agencia evitará que estos productos alimenticios vayan a los almacenes, restaurantes, y otras operaciones de servicios alimentarios; puede parar la operación de una planta; y trabajar con los productores para retirar alimentos que se hayan enviado a los estantes de almacenes o a las casas (Tompkin, 2002).

Nuevos aditivos alimentarios que inhiben L. monocytogenes deberán ser introducidos y llegar a ser ampliamente usados en alimentos. Las políticas actuales de USDA-FIS proveen pocas opciones para inhibir el crecimiento de Listeria en pollo y carne res. Los aditivos más empleados son el lactato de sodio, diacetato de sodio, y combinaciones de los dos (Tompkin, 2002). Las siguientes estrategias pueden ayudar a prevenir o reducir el riesgo de listeriosis transmitida por alimentos (Rados, 2004). 

A nivel doméstico.

1. Lavar las manos con agua caliente y jabón después de manipular estos tipos de alimentos listos para comer. (Lávarse las manos por lo menos 20 segundos.) Además, lavar las tablas de cortar, platos y utensilios. Lavar meticulosamente ayuda a eliminar cualquier bacteria de los alimentos que pudiese haber llegado a sus manos u otras superficies antes de ser recalentados. 2. Evitar la contaminación cruzada. Los alimentos listos para comer y las carnes, aves y mariscos crudos pueden contener bacterias peligrosas. Por lo tanto, se deben mantener estos alimentos separados de vegetales, frutas, panes, y otros alimentos que ya se encuentran listos para comer. 3. No comprar carnes cocidas que estén refrigeradas junto con las carnes crudas. 4. Cocinar cuidadosamente los alimentos de origen animal 5. Calentar los platos precocinados antes de consumirlos. 6. Comprar productos cuyos envases no se encuentren rotos y deformados.

7. Descartar cajas hinchadas, enmohecidas o dañadas. 8. Colocar las carnes separadas en recipientes plásticos para prevenir la contaminación. 9. Chequear y controlar la fecha de vencimiento indicada en los envases de carnes, huevos, entre otros. 10. No dejar comida en vehículos expuestos a altas temperaturas o directamente a la luz solar. 11. Las carnes descongeladas en el microondas deben cocinarse inmediatamente, las que se descongelaron en refrigeración deben cocinarse en máximo 24 horas. Los refrigeradores deben mantenerse a una temperatura de 4ºC y los congeladores a -18ºC y limpiarlos regularmente. 12. Permitir la circulación correcta de aire en el refrigerador, estableciendo espacios entre los alimentos (Rados, 2004). 

Alimentos cárnicos a evitar.

1. Paté comercial 2. Carnes frías industrialmente preparadas y no empacadas al vacío, rebanadas distribuidas en salsamentarias, pollo desmechado y producido en volumen para emparedados. 3. Comidas de mar crudas o ahumadas. Los ejemplos de pescados ahumados incluyen: salmón, trucha, coregono, bacalao, atún y caballa que con frecuencia se rotulan como ahumado, ahumado en frío y “nova-style” entre otros. Estos pescados se encuentran en la sección refrigerada o se venden en los mostradores de las tiendas de comestibles. Los productos enlatados como los salmones y el atún pueden consumirse con seguridad. 4. Perros calientes, o carnes en el almuerzo, a menos que se hiervan hasta que la temperatura interna alcance los 165ºF. La administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos no recomienda que se cocinen los perros calientes en los hornos microondas (Rados, 2004). 

A nivel industrial.

Es de vital importancia que las empresas productoras de alimentos adopten los principios del sistema de control de calidad preventivo HACCP, como medidas para prevenir la contaminación post-proceso a través del traslado, almacenamiento, servicios de comida y almacenes; pues por medio de este se detectan errores en la manipulación y en los procedimientos de elaboración de los alimentos que sirven de vehículos de transmisión para

L. monocytogenes y otros microorganismos indeseados, se efectúa una pronta corrección de estos y se definen las estrategias preventivas (USDA-FSIS, 1996). Cuando no se cuenta con evidencia epidemiológica sobre un riesgo microbiológico, se debe obtener información técnica sobre todos los aspectos relativos a la producción, procesamiento, almacenamiento, distribución y empleo de un determinado alimento que pudieran constituir un riesgo. Independientemente del sistema de control utilizado, cada elemento involucrado de la cadena alimentaria como el productor de las materias primas, el fabricante del los productos, el distribuidor de los productos, el comprador minorista, el manipulador y el consumidor juegan un rol y una responsabilidad en el control de la calidad y de la seguridad o inocuidad (Tompkin, 2002).

Efectuando pruebas microbiológicas del medio ambiente y de las superficies de contacto (Listeria genérica o especies de Listeria (spp.) o las pruebas de bioluminiscencia de ATP), se pueden conocer la efectividad de un plan de saneamiento y ubicar los sitios que se pueden convertir en fuentes potenciales de contaminación (Tompkin, 2002). 

A nivel de mataderos y expendios de carne.

En los mataderos está reglamentado el decomiso total de la canal y de las vísceras, después de haber sido inspeccionado y dictaminado como inadecuado para el consumo humano, así como la adopción de precauciones especiales para impedir que se infecten los manipuladores de la carne. En caso de sospechar listeriosis, se debe realizar la retención de la canal y las vísceras hasta tanto se obtenga el resultado de laboratorio (MNS, 1982).

4.5. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE Listeria spp.

4.5.1. Métodos tradicionales para la identificación de Listeria spp.

Los métodos para la detección e identificación de Listeria spp. fueron desarrollados por primera vez para su uso en laboratorios clínicos desde mediados de los años 80, cuando L. monocytogenes fue reconocido como patógeno importante para el hombre, vehiculizado a través de los alimentos, en todo el mundo se han desarrollado gran cantidad de métodos

para determinar la manera más efectiva de aislar al microorganismo a partir de muestras clínicas y de alimentos y su consiguiente identificación (McBride y Girard, 1960).

Las industrias alimentarias utilizan normalmente métodos convencionales para la detección e identificación de L. monocytogenes. Las pruebas de ausencia /presencia en 25g son los más comúnmente utilizados, pero también se realizan recuentos por gramo, cuando es necesaria una investigación sobre un riesgo concreto para la salud pública. Con muestras del entorno normalmente se aplican las pruebas de presencia/ausencia mediante el hisopaje en superficies (Frazier y Westhoff, 1993).

Los medios de selección utilizados para Listeria spp. están constituidos por caldos de enriquecimiento selectivo como: Caldo de enriquecimiento para listeria de la FDA, caldo LBE sin taponar o taponado BLBE, caldo de enriquecimiento primario y secundario de la universidad de Vermont, caldo fraser y half fraser, seguido por el aislamiento en agares selectivos como: agar LPM, agar Oxford, agar PALCAM (Bell y Kyriakides, 2000).

La técnica de los caldos y medios sólidos de enriquecimiento se desarrolla mediante la integración de sustancias que como los antibióticos, suprimen o inhiben el crecimiento de la mayor parte de la microbiota competitiva sin impedir el desarrollo de Listeria. Como sustancias integradoras de los distintos medios se pueden citar el feniletanol (inhibe la población Gram-negativa); el cloruro de litio (LiCl2) (inhibe la microbiota Gram-negativa y Gram-positiva distinta de L. monocytogenes), glicina (Gly) (Tiene un efecto similar al LiCl2). Adicionalmente dichas sustancias integradoras pueden estar conformadas por antibióticos tales como el moxalactam, ácido nalidixico, basitracina y otros, los cuales son selectivos para Listeria y suprimen la mayoría de los géneros bacterianos de origen alimenticio (Pascual y Calderón, 1999).

Las colonias que crecen en los agares selectivos y muestran morfología típica de Listeria spp., en ese medio son designadas como presuntas (sospechosas) Listeria spp., y se realiza una posterior identificación a nivel de especie mediante el análisis de las características bioquímicas y hemolíticas (Curtis y Lee, 1995; Bayles et al. 1996).

Los métodos tradicionales para la identificación de Listeria suelen ser dispendiosos y laboriosos, arrojando frecuentemente resultados de carácter negativo en períodos de tres a cuatro días. Por ejemplo si las colonias en agar selectivo muestran características morfológicas típicas de Listeria se necesitarán de dos a siete días adicionales para confirmarlas e identificar subsecuentemente que especie está presente (Klein et al. 1997).

4.5.2. Métodos alternativos (rápidos) para la identificación de Listeria spp.

4.5.2.1. Métodos fenotípicos. Los métodos fenotípicos detectan la presencia o ausencia de actividades metabólicas o biológicas expresadas por los microorganismos. Muchos de estos métodos son disponibles, y relativamente baratos (Lukinmaa, 2003). 

Biotipificación: La biotipificación incluye actividades metabólicas expresadas por un aislamiento y pueden incluir reacciones bioquímicas específicas, morfología de las colonias y tolerancias al medio ambiente. La biotipificación tiene solo una habilidad limitada para diferenciar cepas dentro de especies, y tiene relativamente pobre poder de discriminación en estudios epidemiológicos (Lukinmaa, 2003).



Serotipificación: La tipificación serológica está basada en diferentes variaciones de determinantes antigénicos expresados sobre la superficie celular, incluyendo lipopolisacáridos (LPS), polisacáridos capsulares, proteínas de membrana y organelos extracelulares (fimbrias y flagelos). La serotipificación ha sido una herramienta clásica para estudios de caso epidemiológicos y esporádicos (Graves et al, 1999; Lukinmaa, 2003).



Tipificación de fagos: La tipificación de fagos está basada en la capacidad de un grupo estándar de virus que lisan e infectan células bacterianas. La tipificación de fagos es usualmente disponible en laboratorios de referencia. Este es un método rápido y económico (Graves et al, 1999; Lukinmaa, 2003).

4.5.2.2. Métodos Genotípicos. Los métodos genotípicos cuentan con análisis basados en el ADN de elementos genéticos cromosomales o extracromosomales. 

Ribotipificación: La ribotipificación utiliza las similitudes y diferencias encontradas en los genes ribosomales. Estos genes son altamente conservados y varían en número y posición dentro del genoma de la bacteria. El ADN cromosomal es aislado y digerido con enzimas de restricción, luego los fragmentos de ADN llevan genes ARNr, son separados de otros fragmentos por electroforesis sobre genes de agarosa y detectados por hibridización (Lukinmaa, 2003).



Amplificación del ADN: Esta técnica es aplicable a la identificación de microorganismos transmitidos por alimentos, que en la actualidad no pueden ser detectados por procedimientos más rápidos. La PCR ha sido utilizada para detectar cepas de L. monocytogenes en países de Europa y Norteamérica. La PCR ha probado ser un método rápido sensible y específico para la detección de patógenos en alimentos, sus diversas modificaciones han ampliado su aplicación, tanto para la industria alimentaria como la clínica diagnóstica y epidemiológica, reduciendo así su tiempo de análisis y el costo de prueba (Brakstad y Meland, 1995; Blais et al. 1997; Govan et al. 1999; Jersek et al. 1999; Klein et al. 1999; Norton, 1999; Nogva et al. 2000).

El objetivo de esta técnica es la amplificación directa de un gen o un fragmento de ADN, presentes en mezclas de diversas fuentes (a partir de homogenatos, extractos crudos de tejido, sangre completa, mezcla de fragmentos de ADN producidos con enzimas de restricción, muestras resultantes de la extracción y aislamiento del ADN), en muchos casos sin la necesidad de una purificación previa de la muestra original. Por esta capacidad de amplificación, la PCR es un método adecuado para amplificar ácidos nucleicos (Luque y Herráez, 2001).

4.6. MÉTODOS PARA EL MUESTREO MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES.

Sobre un período de 100 años muchas técnicas han sido desarrolladas para enumerar microorganismos sobre las superficies de carcasas de carne y pollo. Las ventajas y las limitaciones de los principales métodos de muestreo son varias (Capita et al. 2004) (Tabla 6).

Los métodos de excisión y arrastre por escobillón son de amplia aceptación porque son fáciles de usar y requieren solo de pequeñas cantidades de material especializado y porque los datos son generalmente más reproducibles. La excisión es considerado el método más exacto, y el escobillón uno de los más prácticos (Reid et al. 2002).

Debido a que la técnica de excisión es costosa y no muy práctica para monitoreo de HACCP, técnicas no destructivas han sido usadas generalmente en EU para colección de datos de superficies de carcasas (Fliss et al. 1991).

Correlaciones entre los resultados de métodos destructivos y no destructivos (arrastre por escobillón) deberán ser establecidos para cada planta de carne y pollo y para varias circunstancias, por ejemplo: técnica de muestreo, especie de carcasa, grupo microbiano, estado y tiempo de muestreo, tipo de tejido, y localización del área a muestrear (Capita et al. 2004). Tabla 6. Ventajas y limitaciones de los principales métodos de muestreo para enumerar superficies de carcasas. Tipo de ensayo Ventajas Limitaciones Destructivo Provee la más fiable y Naturaleza destructiva, área de Excisión menor variabilidad en muestreo limitada, tiempo y habilidad los conteos, porque (No es propio para muestreos recupera casi rutinarios de carcasas). completamente la bacteria fuertemente adherida. Destructivo Provee la más fiable y Naturaleza destructiva, área de *Escobillón menor variabilidad en muestreo limitada, tiempo y habilidad los conteos, porque (No es propio para muestreos recupera casi rutinarios de carcasas).

completamente la bacteria fuertemente adherida. *Métodos de contacto (platos No hay daño de RODAC, cintas superficies, posibilidad adhesivas) de examen directa en el microscopio. Simple y rápida, requiere pocos materiales.

*Mezclar agitar diluyentes

Inaplicable cuando los conteos bacterianos son mayores a 100UFC/cm2, porque la superficie de contacto está muy cubierta; los conteos no son precisos y frecuentemente menor a 1% de aquellos obtenidos con excisión o mezcla. Impropio para superficies regulares (excepción: Métodos de cinta adhesiva); porque grandes áreas no pueden ser muestreadas, un suficiente número de sitios debe ser muestreado para obtener datos representativos.

y en Poco o ningún daño de las superficies, se Solo es conveniente para carcasas de remueve 10 veces más pollo y pequeños cortes de carne. que con el escobillón.

Tomado de: (Capita et al. 2004).

4.7. PLACAS PETRIFILMTM PARA MONITOREO DE Listeria EN AMBIENTES. Las Placas PetrifilmTM para monitoreo de Listeria en ambientes son un medio de cultivo listo para usarse que contiene agentes selectivos, nutrientes, un agente gelificante soluble en agua fría y un indicador cromogénico que facilita la detección de las colonias. Las placas pueden ser utilizadas para la identificación o conteo de Listeria en muestras de ambientes y/o superficies (3M, 2004). Las Placas de PetrifilmTM detectan las siguientes especies de Listeria: L. monocytogenes, L. innocua, L murrayi y L. welshimeri, sin embargo no diferencian estos organismos entre sí. Las condiciones ambientales o los sanitizantes pueden atravesar y/o dañar a los microorganismos. El agua de peptona tamponada (BPW) se utiliza como caldo de

reparación en conjunto con la Placa Petrifilm. Dicho paso de reparación en agua de peptona tamponada no es un paso de enriquecimiento (3M, 2004). El método de Placa PetrifilmTM puede ser utilizado como una prueba cualitativa, semicuatitativa o cuantitativa. 

Interpretación cualitativa: Se ha detectado Listeria en esta placa.



Interpretación semi-cuantitativa: el nivel de Listeria debe registrarse con categorías que tengan un significado para las áreas de muestreo y los estándares individuales de su planta (por ejemplo: grado bajo, mediano, alto; aceptable o inaceptable).



Interpretaciones cuantitativas: Número de colonias de Listeria en esta placa.



Se debe utilizar un procedimiento consistente cada vez que se tome la muestra (usar el mismo tipo de dispositivo de toma de muestra, área de plantilla, técnico y técnicas de muestreo.



El tamaño del área de muestreo deberá basarse en regulaciones, estándares internos, y/o ubicación de la toma de la muestra. Por ejemplo, se puede muestrear un área más grande en un a línea de producto terminado, debido a que número de bacterias que se espera encontrar es bajo (3M, 2004).

Son diversas las ventajas y beneficios que presenta la Placa Petrifilm con respecto al Método Tradicional (Tablas 7 y 8).

4.8. VALIDACIÓN.

Los protocolos de validación alternos incluyen la definición clara del sistema a validar, la identificación de las variables operativas y los probables parámetros de control. En ellos se deben describir: el proceso a validar, los objetivos de la validación, los métodos y el personal responsable, al igual que indicar el número de replicaciones que se consideran

adecuadas para la evaluación de un determinado parámetro, haciendo que los resultados sean estadísticamente confiables (ICONTEC, 2001).

La validación de dichos métodos alternos precisa un protocolo confiable que sea común a los proveedores/productores de los métodos mismos a la industria alimentaría, a las autoridades de servicios de la salud pública y otras autoridades. Los datos generados pueden también ser la base para que una organización independiente certifique un método (ICONTEC, 2001).

Un método alterno es un método de análisis que demuestra la presencia o estima la concentración, para una categoría dada de productos, el mismo analito que se mide en el correspondiente método de referencia “Gold Stándard” (método internacionalmente reconocido y de amplia aceptación). 

Validación: Es la consecución de evidencia suficiente y su respectiva documentación para proporcionar una seguridad razonable que el proceso considerado produce o producirá lo que pretende o se espera (ICONTEC, 2003).

La validación de un método para el análisis de una muestra o para el seguimiento de un proceso en particular, no garantiza que el método pueda utilizarse indiscriminadamente para cualquier clase de muestra o proceso. Su aplicación permite obtener información estadísticamente confiable, lo cual constituye una evidencia para tomar decisiones, respecto a la adecuación de una operación o procedimiento dentro del proceso que se está validando (ICONTEC, 2001).

El método de análisis validado es un factor crítico en la validación de un proceso. Los atributos del método que configuran el proceso de validación y que le confieren las características que lo califican generalmente son: especificidad o selectividad, la cantidad mínima detectable o límite de detección, la cantidad mínima cuantificable o límite de cuantificación, la sensibilidad, la precisión, la exactitud, linealidad, y la robustez o solidez de un método (OMS, 2000; Hernández y Vásquez, 2002).

Tabla 7. Ventajas y beneficios de las Placas PetrifilmTM. Características

Agente gelificante soluble en frío

Ventajas

No es necesario esterilizar ni fundir agares

No somete la muestra a choque de temperatura

Medios cultivo películas laminadas

de Compactas en

Beneficios

Lo que significa... Para el usuario Para la organización Reducción de Tiempo Incremento en tiempo de disponible para productividad preparación de otras actividades cultivos No requiere uso Ahorro en de baños de Mayor seguridad gastos de agua En el laboratorio operación y necesidades Disminución de del laboratorio uso de autoclaves Facilidad de Ahorro en No requiere manejo tiempo y trabajo personal pre-laboratorio altamente calificado Reducción en Exactitud., Mayor calidad variación de precisión y de análisis resultados consistencia de Reducción de resultados rechazos de producto Mejor Recuentos recuperación precisos y Incremento de productividad bacteriana confiables Requiere menor Mayor espacio Ahorro de espacio de en laboratorio, espacio y incubación y mayor capacidad costos de almacenaje para aumentar el energía, número de limpieza y análisis mantenimiento Ideales para Incremento en la realizar análisis eficiencia del microbiológicos análisis con mínima inversión e infraestructura Menor volumen Mayor capacidad Disminución de desperdicio para al en los gastos eliminación de de eliminación desechos de desperdicios

Lista colocar muestra

Calidad estandarizada

para la

Mayor capacidad de análisis con mismos recursos Garantía de Disminuye la funcionamiento variabilidad del en un mismo técnico lote y entre lotes

Optimización de Aumento en la los recursos de eficiencia y laboratorio productividad del laboratorio Reproducibilidad Adecuadas y y repetibilidad confiables para programas de certificación (HACCP, entre otros)

Tomado de: (3M, 2004).

Tabla 8. Placas Petrifilm vs. Método Tradicional Placas petrifilm Medio de cultivo

Deshidratado,

listo

Método tradicional para Es necesario preparar los

usarse

medios y la mayoría deben esterilizarse

Reproducibilidad resultados

de Reproducibilidad al 100%. Riesgo de variabilidad entre Sólo variabilidad del técnica

analista para la preparación de los medios. Riesgo de contaminación

Tiempo

invertido

preparación de muestras

en 50% de ahorro en tiempo de El

correspondiente

a

su

reparación contra el método preparación. tradicional

Espacio

Son

películas

laminadas Cada caja petri tiene 1.5 cm

compactas Componentes gelificantes

Se

de alto y 15 cm de diámetro

disuelven

en

frío,

a Agar, que necesita calentarse

temperatura ambiente y evita para disolverse y agregarse a el choque térmico Indicadores químicos

la placa en caliente (45-50°C)

Contenido en todas las placas. No Algunas indicador

placas de

se

cuenta

con

contienen indicadores.

pH.

Mayor Riesgo constante de errores

facilidad para identificación y en los conteos

conteo de colonias Desechos

Mínimos

Lo correspondiente a cada caja de petri, además el medio de cultivo que se utilizó

Necesidades de capacitación

No

requiere

de

personal Requiere

altamente calificado Aplicaciones

Materia

prima,

terminado,

de

personal

calificado producto Materia

monitoreo

ambientes y superficies

de terminado,

prima,

producto

monitoreo

de

ambientes

Tomado de: (3M, 2004)

Se pueden aplicar varios criterios y formas para evaluar cada uno de los atributos que permiten validar el método, cualquiera que sea la modalidad debe ser “exigente y rigurosa” y deberá definir de manera clara y precisa el procedimiento a seguir, el tratamiento estadístico y los criterios de aceptación. Debido a la variabilidad de las respuestas que se pueden obtener en cada uno de los procedimientos seguidos para la validación del método, es necesario hacer una validación estadística de los resultados obtenidos, la cual dependerá del diseño experimental utilizado (Hernández y Vásquez, 2002). 

Método alterno: Es un método de análisis que demuestra o estima, para una categoría dada de productos el mismo analito que se mide con el correspondiente método de referencia. El método puede ser patentado o no comercial y no se necesita que cubra un procedimiento completo de análisis, es decir, desde la preparación de muestras hasta el informe de ensayo.

El método alterno muestra atributos adecuados a las necesidades de los usuarios, por ejemplo: * Velocidad de análisis y/o respuesta * Facilidad de ejecución y/o automatización * Propiedades analíticas (precisión, exactitud, límite de detección entre otros) * Miniaturización * Reducción de costos



Método de referencia: Es un método internacionalmente conocido y de amplia aceptación. Para Listeria se toman procedimientos Ausencia/ Presencia dadas por la USDA (Departamento de Agricultura de los Estados unidos) y La FDA (Schlegelova et al. 2002).



Validación de un método alterno: Es la demostración con un adecuado grado de confianza, que los resultados obtenidos por el método alterno son comparables a los obtenidos por el método de referencia.



Analito: Es el componente medido por el método de análisis, puede ser el microorganismo.



Método cualitativo: Es un método de análisis cuya respuesta indica la presencia o ausencia del analito detectado directa o indirectamente en cierta cantidad de muestras.



Estudio de comparación de Métodos: Es el estudio llevado a cabo por el laboratorio organizador, del método alterno contra el método de referencia (ICONTEC, 2001).

4. 8.1. Protocolo de validación.

El protocolo de validación comprende dos fases: *Un estudio de comparación del método alterno contra el método de referencia. *Un estudio ínter laboratorios de los dos métodos. Si el método alterno ya ha sido validado y cumple con los requerimientos establecidos por otra organización, se estipulan reglas específicas para tomar en cuenta los resultados de esta validación previa. (ICONTEC, 2001). 4.8.2. Métodos cualitativos – protocolo técnico para valoración.



Exactitud relativa: se define como el grado de concordancia entre la respuesta obtenida por el método de referencia y la respuesta obtenida por el método alterno con muestras idénticas. (ICONTEC, 2002).



Desviación positiva (PD): El método alterno se convierte en un falso positivo cuando presenta una desviación positiva, si suministra un resultado positivo cuando el método de referencia da un resultado negativo.

La desviación positiva se convierte en un falso positivo cuando se puede demostrar que el resultado verdadero es negativo. La desviación positiva se considera como un verdadero positivo cuando se puede demostrar que el resultado verdadero es positivo (Hernández y Vásquez, 2002). 

Desviación negativa (ND): El método alterno presenta una desviación negativa si suministra un resultado negativo cuando el método de referencia da un resultado positivo. La desviación negativa se convierte en un falso negativo cuando se puede demostrar que el resultado verdadero es positivo. (ICONTEC, 2001).



Sensibilidad relativa (SE): La sensibilidad relativa es la capacidad del método alterno para detectar el analito cuando se detecta por medio del método de referencia (ICONTEC, 2001).



Especificidad relativa (SP): La especificidad relativa es la capacidad del método alterno para no detectar el analito cuando el método de referencia no lo detecta (Hernández y Vásquez, 2002).

4.8.3. Protocolo de medición.

Es conveniente que las muestras de alimentos provengan de la más amplia variedad de fuentes, para así reducir cualquier sesgo derivado de especialidades locales alimentarias y ampliar el rango de validación (ICONTEC, 2001).

Cuando se analicen muestras contaminadas naturalmente el rango y distribución de la contaminación debe ser representativa de los niveles usualmente encontrados en los productos, pero con énfasis en recuentos bajos. Debe ser imposible adquirir un número suficiente de alimentos contaminados naturalmente para cada una de las categorías, es permisible la contaminación artificial de las muestras de alimentos (ICONTEC, 2001).

El método y los niveles de contaminación deben generar muestras de características similares al de muestras contaminadas naturalmente. La fracción recobrada se consigue cuando algún número pero no todos de las muestras de ensayo determinadas son positivas por uno o ambos métodos alterno o de referencia, pero es deseable producir aproximadamente el 50% de los resultados como positivos y 50% como negativos. Esto es sin embargo una recomendación, no un porcentaje absoluto, con tal que algún número de las muestras ensayadas sean positivas o negativas de algún tipo de alimento (ICONTEC, 2001) 4.8.4. Cálculos e interpretación. Tratamiento de datos: se tabulan los datos de los pares de resultados obtenidos con los métodos de referencia y alternos, para luego calcular los parámetros en cada categoría de alimentos (Tabla 10).

Los resultados se deben efectuar con un número de resultados negativos obtenidos con el método de referencia, que para los resultados de la tabla 1 no pueden ser mas del doble del número de resultados positivos, de ser necesario, se seleccionan los resultados negativos inmediatamente después de un resultado positivo en el orden de análisis de las muestras (ICONTEC, 2002).

Los tres criterios se expresan de la siguiente manera:

Exactitud relativa:

AC 

( PA  NA) *100% N

(1)

Especificidad relativa:

SP 

NA *100% N

(2)

Sensibilidad relativa:

SE 

PA *100% N

(3)

Tabla 10. Pares de resultados obtenidos con el método de referencia y con el método alterno. Respuestas Método de referencia positivo Método de referencia negativo (R+) Método

alterno +/+ concordancia positiva (PA)

positivo (A+) Método

(R-) -/+ desviación positiva (PD) (R/A+)

alterno +/- desviación negativa (ND) (A- -/- concordancia negativa (NA)

negativo (A-)

/R+)

A: Método alterno; R: método referencia; PA: concordancia positiva; PD: desviación positiva; ND: desviación negativa; NA: concordancia negativa. Tomado de (ICONTEC, 2001).

5. MATERIALES Y MÉTODOS. 5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÒN. 

Tipo y lugar de estudio.

Este es un estudio estadístico y será realizado en el laboratorio de Microbiología de Alimentos del Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial del Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá D.C. 

Población de estudio y muestra.

Se hará en carcasas de pollo traídas de expendios de pollo procesados ubicado en un municipio de la Sabana de Bogotá. El número de carcasas de pollo a muestrear se determinará según la fórmula de kappa ponderada donde: Error tipo I: 5% Error tipo II: 20% Probabilidad de clasificación correcta: 60% Kappa de Ho: 0.85 Kappa de H1: 0.75. De acuerdo con estos datos el tamaño de la muestra es 179.

Para el cálculo de las características operativas se calculará especificidad, sensibilidad y valores predictivos.

5.2. MÉTODOS. 5.2.1. Contaminación artificial de las carcasas de pollo.

La carcasa se contaminará por inmersión, a través de un ensayo a ciego (empleando una baja concentración). Las cepas a utilizar incluirá: Salmonella, L. monocytogenes y L. innocua, para ello se preparará una suspensión de cada microorganismo con una concentración de 102 UFC/ml; la inmersión se hará durante una hora y posteriormente las muestras se refrigerarán durante 24 horas antes de su procesamiento (Sánchez, 2005).

5.2.2. Análisis microbiológico tradicional.

La carcasa de pollo se removerá asépticamente y se colocará en bolsas de plástico estériles, luego se adicionará 300 ml de agua peptonada tamponada a la bolsa y se agitará unas cincuenta veces.

Alícuotas de 25 ml de agua peptonada tamponada se adicionarán a 225ml de caldo de enriquecimiento Listeria - LEB (Oxoid, UK). Las muestras se incubarán por 4 horas a 30°C, se adicionarán suplementos selectivos (SR 140E, Oxoid) y las muestras se incubarán por 20h. Posteriormente 0.1 ml de LEB será transferido a 10 ml de caldo Fraser (FB) y se incubará a 30°C por 24 a 30 horas. Una asada del caldo será estriada en agar Palcam e incubada a 35°C por 48h.

Tres colonias aisladas típicas serán estriadas en Agar TSAYE (Agar triptona de soya extracto de levadura), se incubarán a 35°C por 24 horas, y se someterán a identificación bioquímica (Prueba de Iluminación de Henry, Catalasa y Gram). 5.2.3. Análisis rápido (PETRIFILMTM). Se tomará la muestra de la carcasa del pollo (100cm2), utilizando hisopos con 10ml de agente diluyente. Se adicionará asépticamente 5ml de agua peptonada tamponada estéril (20-30°C) a la muestra. Se homogenizará la muestra durante 1 minuto. Se dejará que la muestra permanezca a temperatura ambiente (20-30°C) durante 1 hora, máximo 1.5 horas. Se colocará la placa PETRIFILMTM en una superficie plana y nivelada y se levantará la película superior. Con la pipeta, perpendicular a la placa de PETRIFILM TM, se colocará 3 ml de la muestra en el centro de la película. Se dejará caer la película superior sobre la muestra. Se colocará suavemente el dispensador plástico sobre la lámina superior, cubriendo el inóculo. Se levantará el dispersor y se esperará al menos 10 minutos para

permitir que el gel se forme. Se incubará las placas durante 28h +/-2 a 35°C +/- 1°C o a 37°C +/-1°C. Las interpretaciones del PETRIFILMTM podrán ser: cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa.

Para calcular el número de unidades formadoras de colonias se tiene: UFC/área: (número de colonias*ml solución de hidratación + ml agua peptonada tamponada 3ml) área muestreada.

(4)

Como control negativo se emplearán carcasas de pollo (unas enriquecidas en caldo Palcam y otras enriquecidas en agua peptonada tamponada), para la posterior detección de Listeria spp. según el método tradicional (Gold Stándard) y el método rápido (PetrifilmTM).

9. REFERENCIAS. Absolom, D.R., Lamberti, F.V., Policova, Z., Zingg, W., Van Oss, C.J., Neumann, A.W. 1983. Surface Thermodynamics of Bacterial Adhesion. Applied and Environmental Microbiology. 46: 90-97. Allerberger, Franz. 2003. Listeria: Growth, Phenotypic Diferentiation and Molecular Microbiology. FEMS Inmunology and Medical Microbiology. 35: 183-189. Allmann, M., Hofelein, C., Koppel, E., Luthy, J., Meyer, R., Niederhauser, C., Wegmuller, B., Candrian, U. 1995. Polymerase Chain Reaction (PCR) for Detection of Pathogenic Microorganisms in Bacteriological Monitoring of Dairy Products. Research Microbiology. 146: 85-97. Alpas, H., Kalchayanand, N., Bozoglu, F., Sikes, A., Dunne, C.P., Ray, B., Variation in Resistance to Hydrostatic Pressure Among Strains of Food-borne Pathogens. Applied and Environmental Microbiology, 1999. 65 (9): 4248 - 4251. Amstrong, D. 1995. Listeria monocytogenes, in Principles and Practice of Infectious Diseases. 1995, Churchill Livingstone: New York. p. 1880-1885. Arumugaswamy, R.K., Ali, G.R.R., Hamid, S.N.N. 1994. Prevalence of Listeria monocytogenes in Foods in Malaysia. International Journal of Food Microbiology, 1994. 23: 117-121. Bailey, J.S., Fletcher, D.L., Cox, N.A. 1989. Recovery and Serotype Distribution of Listeria monocytogenes from Broiler Chickens in the Southeastern United States. Journal of Food Protection, 1989. 52: 148-150. Bayles, D., Bassam, A., B, J.W. 1996. Cold Stress Proteins Induced in Listeria monocytogenes in Response to Temperature Downshock and Growth at Low Temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 62 (3): 1116-1119. Basser, H.A., Flood, S., J.A., Livak, Kenneth, J., Marmaro, J., Knorr, R., Batt, C. 1995. Use of a Fluorogenic Probe in a PCR Based for the Detection of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 61 (10): 3724-3728. Batt, C.A. 1999. Rapid Methods for Detection of Listeria, in Listeria, Listeriosis and Food Safety, E.T. Ryser, Marth, E.H., Editor. Marcel Dékker: New York. p. 261-278.

Bean, N.H., Griffin, P.M. 1990. Foodborne Disease Ourbreaks in the United States, 19731987: Pathogens, Vehicles and Trends. Journal of Food Protection. 53: 804-817. Bell, C., Kyriakides, A. 2000. Listeria: Una Aproximación Práctica al Microorganismo y su Control, Zaragoza, España: Editorial Acribia S.A. p. 1-230. Bernal, L. 1997. Incidencia de Listeria monocytogenes en Carne de Res, Cerdo y Pollo en Santiago de Cali, in Departamento de Microbiología. Carrera de Bacteriología. Pontificia Universidad Javeriana: Bogotá, D.C. p. 93. Berrang, M.E., Meinerdsmann, R.J. Northcutt, J.K. y Smith, D.P. 2002. Molecular Characterization of Listeria monocytogenes Isolate from a Poultry Further Processing Facility and from Fully Cooked Product. Journal of Food Protection. 65(10): 1574-1579. Blais, W., Phillippe, M. 1993. A Simple RNA Probe System for Analysis of L. monocytogenes Polymerase Chain Reaction Products. Applied and Environmental Microbiology. 59 (9): 2795 - 2800. Blais, W., Turner, G., Sooknanan, R., Malek, T. 1997. A Nucleic Acid Sequence Based Amplification System for Detection of L. monocytogenes hlyA Sequences. Applied and Environmental Microbiology. 63 (1): 310-313. Boerlin, P., Piffaretti, J.C. 1991. Typing of Human, Animal, Food and Environmental Isolates of Listeria monocytogenes by Multilocus Enzyme Electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology. 57: p. 1624-1629. Boerlin, P., Bannerman, E., Bille, J., Jemmi, T. 1997. Typing Listeria monocytogenes Isolates from Fish Products and Human Listeriosis Cases. Applied and Environmental Microbiology. 63(4): 1338-1343. Borezee, E. 2000. OppA de Listeria monocytogenes, an Oligopeptide Binding Protein required for Bacterial Growth at Low Temperatura and Envolved in Intracelular Survival. Infection and Inmunity. 68: 7069-7077. Bracket, R.E. 1988. Listeria monocytogenes. Food Technology. 42 (4): 162. Brakstad, O., Meland, J., 1995. Direct Identification the Staphylococcus aureus in Blood Cultures by Detection of the Gene Encoding the Thermostables Nuclease or the Gene Product. Journal of Clinical Microbiology. 26: 1907-1909. Breer, C., Breer, G. 1988. The Isolation of Listeria spp. in Meat and Meat Products. in Proceedings 34th International Congress Meat Science and Technology. Pt. B, Australia. Broome, C.V. 1993. Can We Prevent it? American Society of Microbiology News. 59: 444-446.

Brosch, R., Chen, J., Luchansky, J.B. 1994. Pulsed-field Fingerprinting of Listeriae: Identification of Genomic Divisions for Listeria monocytogenes and Their Correlation with Serovar. Applied and Environmental Microbiology. 60: 2584-2592. Bruhn, J., Vogel, B., Gram, L. 2005. Bias in the Listeria monocytogenes Enrichmnet Procedure: Lineage 2 Strains Outcompete Lineage 1 Strains in University of Vermont Selective Enrichments. Applied and Environmental Microbiology. 71 (2): 961-967. Bryan, F.L. 1988. Risk Associated with Vehicles of Foodborne Pathogens and Toxins. Journal of Food Protection. 51: 498-508. Buchanan, R.L., Stahl, H.G., Whiting, R.C. 1989. Effects and Interactions of Temperature, pH, Atmosphere, Sodium Chloride, and Sodium Nitrate on the Growth of Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection. 52: 844-851. Bubert, A., Sokolovic, Z., Chun, S.K., Papatheodorou, L., Simm, A., Goebel, W. 1999. Differential Expression of Listeria monocytogenes Virulence Genes in Mammalian Host Cells. Molecular Gen Genetics. 261: p. 323-336. Buncié, S. 1991. The incidence of Listeria monocytogenes Slaughtered Animals, in Meat, and in Meat products in Yugoslavia. International Journal of Food Microbiology. 12: 173180. Burn, C.G. 1936. Clinical and Pathological Features of an Infection Caused by a New Pathogen of the Genus Listerella. American Journal of Pathology. 12: 341-348. Capita, R., Calleja, C.A., Moreno, B., Garcia-Fernandez, M.C. 2001. Occurrence of Listeria Species in Retail Poultry Meat and Comparison of a Cultural Immunoassay for Their Detection. International Journal of Food Microbiology. 65: 75-82. Capita, R., Prieto, M., Alonso-Calleja, C. 2004. Sampling Methods for Microbiological Analysis of Red Meat and Poultry Carcasses. Journal of Food Protection. 67 (6): 13031308. Cantoni, C., Valenti, M. 1990. Listeria spp. in Prodotti Avicoli. Industries Alimentaries. 29: 1109-1110. Carpenter, S.L., Harrison, M.A. 1989. Survival of Listeria monocytogenes on Processed Poultry. Journal of Food Science. 54 (3): 556-558. CDC. 2001. Outbreak of Listeriosis Associated with Homemade Mexican-style Cheese. Morbidity Mortality Weekly Reports. 50 (26): 560-562.

Chasseignaux, E., Toquin, M.T., Ragimbeau, C., Salvat, G., Colin, P., Ermel, G. 2001. Molecular Epidemiology of Listeria monocytogenes Isolates Collected from the

Environment, Raw meat and Raw Products in Two Poultry and Pork Processing Plants. Journal of Applied Microbiology. 91(5): 888-899. Chasseignaux, E., Gérault, P., Toquin, M.T., Salvat, G., Colin, P., Ermel, G. 2002. Ecology of Listeria monocytogenes in the Environment of Raw Poultry Meat and Raw Pork Meat Processing Plants. FEMS Microbiology Letter. 210: 271-275. Chen, Y., Ross, W.H., Scott, V.N., Gombas, D.E. 2003. Listeria monocytogenes: of Low Levels Equal Low Risk. Journal Food Protection. 66 (4): p. 570-577. Cole, M.B., Jones, M.V., Holyoak, C. 1990. The Effect of pH, Salt Concentration and Temperature on the Survival and Growth of Listeria monocytogenes. Journal of Applied Bacteriology. 69: 63-72. Chin, J. 2000. Control of Communicable Diseases Manual. Washington, D.C.: American Public Health Association. P. 297. Collins, M.D., Wallbanks, S., Lane, D.J. 1991. Phylogenetic Analysis of the Genus Listeria Based on Reverse Transcriptase Sequencing of 16S rRNA. International Journal of Systematic Bacteriology. 41: 240-246. Comi, G., Frigerio, R., Cantoni, C. 1992. Listeria monocytogenes Serotypes in Italian Meat Products. Letter Applied Microbiology. 15: 168-171. Cormac, G., Gahan, B., Hill, C. 1996. Acid Adaptation of Listeria monocytogenes Can Enhance Survival in Acidic Foods and During Milk Fermentation. Applied and Environmental Microbiology. 62 (9): 3128-3132. Cox, L., Kleiss, T., Cordier, J., Cordellana, C., Konkel, P., Pedrazzini, C., Beumer, R., Siebenga, A. 1989. Listeria spp. In Food Processing, Non-food and Domestic Environments. Food Microbiology. 6: p. 286-290. Cox, N.A., Bailey, J.S., Berrang, M.E. 1997. The Presence of Listeria monocytogenes in the Integrated Poultry Industry. Journal of Applied Poultry Research. 6: 116-119. Crandall, D., Montville, J. 1998. Nisin Resistance in L. monocytogenes ATCC 700302 is a Complex Phenotype. Applied and Environmental Microbiology. 64 (1): 231 - 237 Curtis, G.D., Lee, W.H. 1995. Culture Media and Methods for the Isolation of Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology. 26: 1-13. Da Silva, M.C., Tibana, A. 1995. Listeria monocytogenes em Alimentos: Seu Significado Nos Dias Atuais. Higiene Alimentar. 9: 7-10. Dalton, C.B., Austin, C., Sobel, J., Hayes, P., Bibb, W., Graves, L., Swaminathan, B., Proctor, M., Griffin, P.M. 1997. An Outbreak of Gastroenteritis and Fever Due to L. monocytogenes in Milk. New England Journal of Medicine. 336 (2): 100-105.

De Jesús, A., Whiting, R. 2003. Termal Inactivation, Growth, and Survival Studies of Listeria monocytogenes Strains Belonging to Three Distinct Genotypic Lineages. Journal of Food Protection. 66 (9): 1611-1617. De Simón, M., Ferrer, M.D. 1988. Initial Numbers, Serovars and Phagevars of Listeria monocytogenes Isolated in Prepared Foods in the City of Barcelona (Spain). International Journal of Food Microbiology. 44: 141-144. DiMaio, H. 2000. Listeria Infection in Women. Obstetric and Ginecology. 7: 40-45. Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L.A. 2002. Microtiter Plate Assay Assessment of Listeria monocytogenes Biofilm formation. Applied and Environmental Microbiology. 68 (6): 2950-2958 Doumith, M., Cazalet, Christel, C., Simoes, N., Frangeul, L., Jacquet, C., Kunst, F., Martin, P., Cossart, P., Glaser, P., Buchrieser, C. 2004. New Aspects Regarding Evolution and Virulence of Listeria monocytogenes Revealed by Comparative Genomics and DNA Arrays. Infection and Inmunity. 72 (2): 1072-1083. Doyle, M.P., Glass, K.A., Beery, J.T., García, G.A., Pollard, D.J., Schultz, R.D. 1987. Survival of Listeria monocytogenes in Milk During High-temperature, Short-time Pasteurization. Applied and Environmental Microbiology. 53: 1433-1438. Doyle, M., Beuchot, L., Montville, J. 2001. Microbiología de los alimentos. Zaragoza, España: Editorial Acribia S.A. p. 87-161, 355-370. Duche, O., Tremoulet. F. 2002. Salt stress proteins induced in Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 68: 1491-1498. Dumont, J., Cotoni, L. 1921. Bacille Semblable à Celui du Rouget du Pore Rencontré Dans le L.C.R. D'un Méningitique. Annual of Institute Pasteur. 35: 625-633 Edgcomb, M., Sirimanne, S., Wilkinson, B., Drouin, P, Morse, R. 2000. Electron Paramagnetic Resonance Studies of the Membrane Fluidity of the Foodborne Pathogenic Psychrotroph Listeria monocytogenes. Biochimica et Biophysica Acta. 1463: 31-42. Escarcega, H., Peñaloza, R., Montes, O., Peña, R., Godoy, H., Negrin, M., Rodríguez, R., Anaya, P. 1999. Listeriosis Materno-Fetal: Reporte de Tres Casos. Revista Mexicana de Puericultura y Pediatría. 6 (3): 290-296. Farber, J.M., Peterkin, P.Y. 1991. Listeria monocytogenes, a Foodborne Pathogen. Microbiological Reviews. 55 (3): 476-511. Farber, J.M., Coates, F., Daley, E. 1992. Minimum Water Activity Requeriments for the Growth of Listeria monocytogenes. Letter in Applied Microbiology. 15: 103-105.

FDA. 2003. Listeria monocytogenes Risk Assessment. Questions and Answers. FDA News. p. 4. Fenlon, D.R. 1989. The Incidence of Listeria monocytogenes in Raw Milk from Farm Bulk Tanks in North-East Scotland. Journal of Applied Bacteriology. 66 (6): 191-196. Fenlon, D.R., Wilson, J., Donachie, W. 1996. The Incidence and Level of Listeria monocytogenes Contamination of Food Sources at Primary Production and Initial Processing. Journal of Applied Bacteriology. 81: 641-650. Fenlon, D.R. 1999. Listeria monocytogenes in the Natural Environment, in Listeria, Listeriosis and Food Safety. E.T. Ryser, Marth, E.H., Editor. Márcel Dekker Inc: New York. p. 21-37. Fliss, I., Simard, R y Ettriki. 1991. Comparison of Three Sampling Techniques for Microbiological Analysis of Meat Surfaces. Journal of Food Sciences. 56: 249-251. Fonavi., Fenavi. 2000. Plan Genérico para la Implementación del Sistema HACCP en la Industria Avícola. Fonseca, Y., Correa, C. 2004. Prevalencia de Listeria monocytogenes en Expendios de Pollo Procesado en la Zona Suroccidental de Bogotá, D.C., in Departamento de Microbiología. Carrera de Microbiología Industrial. Pontificia Universidad Javeriana: Bogotá, D.C. p. 126. Foster, E.M. 1997. Historical Overview of Key Issues in Food Safety. Emerging Infectious Diseases. 3(4): 481-482. Frazier, W.C., Westhoff, D. C. 1993. Microbiología de los Alimentos, Zaragoza: Acribia S.A. p. 3-319. Franco, C.M., Quinto, E.J., Fente, C., Rodriguez, J.L., Dominguez, L., Cepeda, A. 1995. Determination of the Principal Sources of Listeria spp. Contamination in Poultry Meat and a Poultry Processing Plant. Journal of Food Protection. 58 (12): 1320-1325. Frank, J.F., Koffi, R.A. 1995. Surface Adherent Growth of Listeria monocytogenes is Associated with Increased Resistance to Surfactant Sanitizers and Heat. Journal of Food Protection. 53: 550-554. Franco, C.M., Quinto, E.J., Fente, C., Rodriguez, J.L., Dominguez, L., Cepeda, A. 1995. Determination of the Principal Sources of Listeria spp. Contamination in Poultry Meat and a Poultry Processing Plant. Journal of Food Protection. 58 (12): 1320-1325. Frazier, W.C., Westhoff, D. C. 1993. Microbiología de los Alimentos, Zaragoza: Acribia S.A. p. 3-319.

Fthenakis, G.C., Saratsis, Ph., Tzora, A., Linde, K. 1998. Naturally Occurring Subclinical Ovine Mastitis Associated with Listeria monocytogenes. Small Ruminant Research. 31: 2327. Gallego, M., Torres, O., Soto, Y., Duque, D., Benitez, C. 2003. Determinación de Portadores de Listeria spp. en un Conglomerado Lechero de la Vereda Puente de Piedra del Municipio de Madrid (Cundinamarca, Colombia). UDCA Actualidad & Divulgación Científica. 6 (1): 49-56. Gallego, M., Torres, O., Soto, Y., Duque, D., Benitez, C. 2003. Determinación de Portadores de Listeria spp. en un Conglomerado Lechero de la Vereda Puente de Piedra del Municipio de Madrid (Cundinamarca, Colombia). UDCA Actualidad & Divulgación Científica. 6 (1): 49-56. García, G.C., Valcky, C., Michiels, C. W. 2000. Inactivation of Escherichia coli and Listeria innocua in milk by combined treatment with high hydrostatic pressure and the lactoperoxidase system. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10): 4173-4179. Gardan, R., Cossar, E., Labadie, J. 2003. Identification of Listeria monocytogenes Genes Involved in Salt and Alkaline pH Tolerance. Applied and environmental Microbiology. 69: 3173-3143. Gellin, B.G.a.C.V.B. 1989. Listeriosis. Journal of the American Medical Association. 261: 1313-1320. Genigeorgis, C.A., Dutulescu, D., Garayzabal, J.F. 1989. Prevalence of Listeria spp. in Poultry Meat at the Supermarket and Slaughterhouse Level. Journal of Food Protection. 52: 618-624. Gilbert, R.J., Miller, K.L., Roberts, D. 1989. Listeria monocytogenes and Chilled Foods. The Lancet: 383-384. Glaser, P., Frangeul, L., Buchrieser, C., Rusniok, C., Amend, A., Baquero, F., Berche, P., Bloecker, H., Brandt, P., Chakraborty, T., Charbit, A., Chetouani, F., Couvé, E., De Daruvar, A., Dehoux, P., Domann, E., Domínguez-Bernal, G., Duchaud, E., Durant, L., Dussurget, O., D. Entian, K., Fsihi, H., García del Portillo, F., Garrido, P., Gautier, L., Goebel, W., Gómez-López, N., Hain, T., Hauf, J., Jackson, D., Jones, L-M., Kaerst, U., Kreft, J., Kuhn,M., Kunst, F., Kurapkat, G., Madueño, E., Maitournam, A., Mata, J., Ng, E., Nedjari, H., Nordsiek, G., Novella, D., De Pablos, B., Pérez-Díaz, J., Purcell, R., Remmel, B., Rose, M., Schlueter, T., Simoes, N., Tierrez, A., Vásquez-Boland, J., Voss, H., Wehland, P., Cossart, P. 2001. Comparative Genomics of Listeria Species. Science. 294: 849-852. Goulet, V., Rocourt, J., Jacquet, Ch., Vaillant, V., Laurent, E., De Valk, H. 2000. Surveillance de la Listériose en 2000, in Surveillance Nationale des Maladies Infectieuses 1998-2000. Institut de Veille Sanitaire: París. p. 137-140.

Govan, V., Allsopp, M. and Davison, S. 1999. A PCR Detection Method for Rapid Identification of Paenibacillus larvae. Applied and Environmental Microbiology. 65 (5): 2243-2245. Graves, L., Swaminathan, B., Hunter, S. 1999. Subtyping Listeria monocytogenes, in Listeria, Listeriosis and Food Safety, ed. Ryser, E.T., Marth, E.H. New York: Marcel Dekker Inc. p. 299-358. Gray, M., Zadoks, R., Fortes, E., Dogan, B, Xai, S., Chen, y., Scout, V, Gombas, D. Boor, K., Wiedmann, M. 2004. Listeria monocytogenes Isolates from Foods and Humans Form Distint but Overlapping Populations. Applied and Environmental Microbiology. 79 (10): 5833-5841. Grif, K., Hein, I., Wagner, M., Brandl, E., Mpamuga, O., McLauchlin, J., Dierich, M.P., Allerberger, F. 2001. Prevalence and Characterization of Listeria monocytogenes in Faeces of Healthy Austrians. Wiener Klinische Wochenschrift. 113: 737-742. Grif, K., Patscheider, G., Dierich, M.P., Allerberger, F. 2003. Incidence of Fecal Carriage of Listeria monocytogenes in Three Healthy Volunteers: A One-Year Prospective Stool Survey. European Journal Clinical Microbiology Infection Disease. 22: 16-20. Guerra, M.M., McLauchlin, J., Bernardo, F.A. 2001. Listeria in Ready-to-eat and Unprocessed Foods Produced in Portugal. Food Microbiology. 18: 423-429. Hall, R. 1993. Notifiable Disease Surveillance. Communicable Diseases Inteligence. 17: 226-236. Hayes, P., Feeley, S., James, C., Graves, L. M., Ajello, G. W. Fleming D. W. 1986. Isolation of L. monocytogenes From Raw Milk. Applied and Environmental Microbiology. 51 (2): 438 - 440. Hassan, A., Birt, D.M., Frank, J.F. 2004. Behavior of Listeria monocytogenes in a Pseudomonas putida Biofilm on a Condensate Forming Surface. Journal of Food Protection. 67 (2): 322-327. Hernández, L., Vásquez, D. 2002. Estudio preliminar para la validación de técnicas en el análisis microbiológico de insumos, aguas, y productos terminados no estériles en una industria farmacéutica, en Departamento de Microbiología., Pontificia Universidad Javeriana: Bogota, D.C. p. 85. Hill, C., Sleator, R., Cormac, G. 2001. Identification and Disruption of the proBA Locus in Listeria monocytogenes: Role of Proline Biosynthesis in Salt Tolerance and Murine Infection. Applied and Environmental Microbiology. 67 (6): 2571 - 2577. Hof, H. 2003. History and Epidemiology of Listeriosis. FEMS Inmunology and Medical Microbiology. 35: 199-202.

Hough, A., Harbison, S., Savill, M., Melton, L., Fletcher, G. 2002. Rapid Enumeration of Listeria monocytogenes in Artificially Contaminated Cabbage Using Real Time Polymerase Chain. Journal of Food Protection. 65 (8): 1329 –1332. Hubálek, Z. 2003. Emerging Human Infectious Diseases: Anthroponoses, Zoonoses, and Sapronoses. Emerging Infectious Diseases. 9 (3): 403-404. Hudson, W.R., Mead, G.C. 1989. Listeria Contamination at a Poultry Processing Plant. Letter Applied Microbiology. 9: 211-214. ICONTEC. 1999. Microbiología de Alimentos y Alimentos para Animales. Método Horizontal para la Detección de Listeria monocytogenes, in Norma Técnica Colombiana 4666. Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación: Bogotá. p. 1-25. ICONTEC, 2001. Microbiología de Alimentos y Alimentos para Animales. Protocolo para la Validación de Métodos Alternos, in Norma Técnica Colombiana de 066, Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación: Bogotá. p. 1-87. ICONTEC, 2002. Productos de la Pesca, Pescado Entero, Medallones y Trozos, Refrigerados o Congelados, in Norma Técnica Colombiana 1443, Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación: Bogotá. p. 11. ICONTEC, 2003. Microbiología de Alimentos y Alimentos para Animales. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la Detección de Patógenos de Alimentos. Requerimientos Específicos para el Método General, in Norma Técnica Colombiana 5158, Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación: Bogotá. p. 1-87. Internacional Comisión on Microbial Specifications for Foods of the Internacional Union of Biological Societies (ICMSF). 1996. Microorganismos de los alimentos: Características de los patógenos microbianos, Zaragoza: Acribia S.A. p. 165-175. Internacional Comisión on Microbial Specifications for Foods of the Internacional Union of Biological Societes (ICMSF). 1996a. Microorganismos de los alimentos: Ecología Microbiana de los Productos Alimentarios, Zaragoza: Acribia S.A. p. 460-461. Jaradat, Z.W., Wampler, J.L., Bhunia, A.K. 2003. A Listeria Adhesion Protein Deficient Listeria monocytogenes Strain Shows Reduced Adhesion Primarily to Intestinal Cell Lines. Medical Microbiology and Inmunology. 192: 85-91. Jay, J. 2002. Microbiología Moderna de los Alimentos, Zaragoza: Acribia S.A. p. 457-465. Jeffers, G., Bruce, J., McDonough, P., Scarlett, J, Boor, K., Wiedmann, M. 2001. Comparative Genetic Characterization of Listeria monocytogenes Isolates From Human and Animal Listeriosis cases. Microbiology. 147: 1095-1104. Jersek, P., Gilot, G., Klun, J., Mehle, E., Tcherneva, N., Herman, L., 1999. Typing of Listeria monocytogenes strains by repetitive element sequence-based PCR. Applied and Enviromental Microbiology. 37 (1): 103-109.

Johansen, C., Gill, T., Gram, L. 1996. Changes in Cell Morphology of Listeria monocytogenes and Shewanella putrefaciens Resulting from the Action of Protamine. Applied and Environmental Microbiology. 62 (3): 1058-1064. Johansson, T. 1998. Enhanced Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes from Foodstuffs and Food-processing Environments. International Journal of Food Microbiology. 40: 77-85. Johansson, T., Rantala, L., Palmu, L., Honkanen-Buzalski, T. 1999. Ocurrence and Typing of Listeria monocytogenes Strains in Retail Vacuum-packed Fish Products and in a Production Plant. International Journal of Food Microbiology. 47: 111-119. Johnson, J.L., Doyle, M.P., Cassens, R.G. 1990. Listeria monocytogenes and Other Listeria Species in Meat and Meat Products: A Review. Journal of Food Protection. 53: p. 81. Jones, D. 1990. Foodborne Illness- Fooborne Listeriosis. The Lancet. 336: 1171-1174. Junttila, J.R., Niemela, S. I., Hirn, J. 1988. Minimun Growth Temperatures of Listeria monocytogenes and Non-haemolytic Listeria spp. Journal Applied of Bacterioloy. 65: p. 321-327. Kampelmacher, E.H., Van Noorle Jansen, L. 1980. Listeriosis in Humans and Animals in the Netherlands (1958-1977). Zentbl Baktenol Hyg I Abt Orig A. 246: 211-227. Kaneda, T. 1991. Iso-and Anteiso-Fatty Acids in Bacteria: Biosynthesis, Function and Taxonomic Significance. Microbiological Review. 55: 288-302. Kathariou, S. 2002. Listeria monocytogenes Virulence and Pathogenicity, a Food Safety Perspective. Journal of Food Protection. 65 (11): 1811-1829. Kerr, K.G., Rotowa, N.A., Hawkey, P.M., Lacey, R.W. 1990. Incidence of Listeria spp. in Pre-cooked, Chilled Chicken Products as Determinated by Culture and Enzyme-linked Inmunoassay (ELISA). Journal of Food Protection. 53: 606-607. Kerr, K.G., Dealler, S.F., Lacey, R.W. 1988. Materno-fetal Listeriosis from Cook-chill and Refrigerated Food. The Lancet: 1133. Klein, G., Kuneja, P., Vikay, K. 1997. Sensitive Detection of Viable L. monocytogenes by Reverse Transcription PCR. Applied and Environmental Microbiology. 63 (11): 44414448. Koneman, E., Allen, S., Janda, W., Schreckenberger, P., Winn, W. 1999. Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas Color. 5nd ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana. p. 171-754.

Kozak, J., Balmer, T., Byrne, R., Prevalence of Listeria monocytogenes in Foods: Incidence in Dairy Products. Food Control, 1996. 7(4): p. 215-221. Laciar, A.L., Hasuoka, R.P., Correa, S.M., Miranda, A.M., Centorbi, O.N.P. 2000. Symptomatic Hydrocephalus in a Newborn Infected with Listeria monocytogenes. Brazilian Journal of Microbiology. 31: 9-11. Lawrence, L.M., Gilmour, A. 1994. Incidence of Listeria spp. and Listeria monocytogenes in a Poultry Processing Environment and in Poultry Products and Their Rapid Confirmation by Multiplex PCR. Applied and Environmental Microbiology. 60: 4600-4604. Leclerc, V., Bufour, B., Lombard, B., Gauchard, F., Garin-Bastuji, B., Salvat, G., Brisabois, A., Poumeyrol, M., De Buyser, M.L., Gnanou-Besse, N., Lahellec, C. 2002. Pathogens in Meat and Milk Products : Surveillance and Impact on Human Health in France. Livestock Production Science. 76: 195-202. Lorber, B. 1996. Listeriosis. Clinical Infection Disease. 24: 1-11. Lou, Y.,Yousef, A.1999. Characteristics of Listeria monocytogenes Important to Food Processors. Listeria, Listeriois and Food Safety. E.T. Ryser, Marth, E.H. New York, Marcel Dekker Inc. p. 131-224. Low, J.C., Donachie, W. 1997. A Review of Listeria monocytogenes and Listeriosis. Veterinary Journal. 153: 9-29. Low, J.C., Wright, F., McLauchlin, J., Donachie, W. 1993. Serotyping and Distribution of Listeria Isolates From Cases of Ovine Listeriosis. Veterinary Record, 1993. 133: 165-166. Luque, J., Herráez, A. 2001. Biología Molecular e Ingeniería Genética, Madrid: Harcourt. p. 187-197. Lukinmaa, S. 2003. Salmonella enterica, Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens: Diversity of Human Isolates studied by Phenotypic and Molecular Methods. Publications of the National Public Health Institute. p. 98: Lundén, J.M., Autio, T.J., Korkeala, H.J. 2002. Transfer of Persistent Listeria monocytogenes Contamination Between Food Processing Plants Associated with a Dicing Machine. Journal of Food Protection 7: 1129-1133. MacGowan, A.P., Bowker, K., McLauchlin, J. 1994. The ocurrence and Seasonal Changes in the Isolation of Listeria spp. in Shop-bought Foodstuffs, Human Faeces, Sewage and Soil from Urban Sources. International Journal of Food Microbiology. 21: 325-334. MacGowan, A.P., O'Donaghue, K., Nicholls, S., McLauchlin, J., Bennett, P.M., Reeves, D.S. 1993. Typing of Listeria spp. by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Analysis. Journal of Medical Microbiology. 38: 322-327.

MacGowan, A.P., Bowker, K., McLauchlin, J. 1994. The ocurrence and Seasonal Changes in the Isolation of Listeria spp. in Shop-bought Foodstuffs, Human Faeces, Sewage and Soil from Urban Sources. International Journal of Food Microbiology. 21: 325-334. Magnusson, K.E. 1982. Hydrophobic Interaction, a Mechanism of Bacterial Binding. Scandinavian Journal Infectious Diseases. 33: 32-36. McBride, M.E., Girard, K.F. 1960. A Selective Method for the Isolation of Listeria monocytogenes from Mixed Bacterial Populations. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 55: 153-157. McCarthy, S.A. 1990. Listeria in the Environment, in Foodborne Listeriosis, A.J. Miller, Smith, J.L., Somkuti, G.A, Editor. Elsevier: New York. p. 25-29. McLauchlin, J. 1996. The Relationship Between Listeria and Listeriosis. Food Control. 7(4): p. 187-193. Mead, G.C. 1982. Microbiology of the Poultry and Game Birds, in Meat Microbiology, M.H. Brown, Editor. Applied Science Publications: London. p. 67-101. Menudier, A., Basiraud, C., Jean - Albert, N. 1991. Virulence of L. monocytogenes Serovars and Listeria spp. in Experimental Infection of Mice. Journal of Food Protection. 54 (12): 917-921. MNS 1982. Enfermedades y Estados Patológicos Causados por Agentes Bacterianos o Afines. Decreto 2278. Artículo 295, in Manual de Normas y Procedimientos Reglamentarios de la Industria de Alimentos. Ministerio Nacional de Salud: Bogotá. p. 270. Moltz, A., Martin, S. 2005. Formation of Biofilms by Listeria monocytogenes Under Various Growth Conditions. Journal of Food Protection. 68 (1): 92-97. Moreno, L. 1976. Las Zoonosis. Primera edición. Editorial Aedos Barcelona. p. 166-172. Membré, J., Kubaczka, M., Dubois, J. y Chèné. 2004. Temperature Effect on Listeria monocytogenes Growth in the Event of Contamination of Cooked Pork Products. Journal of Food Protection. 67 (3): 463-469. Meylheuc, T., Giovannacci, I., Briandet, R., Bellon-Fontaine, M.N. 2002. Comparison of the Cell Surface Properties and Growth Characteristics of Listeria monocytogenes and Listeria innocua. Journal of Food Protection. 65 (5): 786-793. Midelet, G., Carpentier, B. 2002. Transfer of Microorganisms, Including Listeria monocytogenes, From Various Materials to Beef. Applied and Environmental Microbiology. 68 (8): 4015-4024. Ministere de la Sante. 1995. Prévention de la Listériose Chez les Femmes Enceintes, les Patients Inmunodéprimés et les Personnes àgées. Bulletin Epidémiologie Hebdomadaire. 23: p. 10.

Ministere de la Sante. 1996. Plan de Surveillance de la Contamination for Listeria monocytogenes des Aliments Distribúes. Résultats des Plans 1993 et 1994. Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire. 45: p. 4. Moreno, C. 2003. Tecnologías de Control de Listeria spp. Boletin Informativo. Dirección de Salud Pública. 5 (13): 3-4. Moreno, M., Pulido, Y. 1996. Determinación de Listeria monocytogenes en Carne de Pollo y Huevos de Gallina Comercializados en Santafé de Bogotá, in Departamento de Bacteriología. Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca: Bgotá, D.C. p. 38. Muñoz, A. I., Díaz, G. 1998. Listeriosis, monografía. República de Colombia, Ministerios de Salud, Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos. Santafé de Bogotá D.C. Colombia. p. 64. Murray, E.G.D., Webb, R.A., Swann, M.B.R. 1926. A Disease of Rabbits Characterised by a Large Mononuclear Leucocytosis, Caused by a Hitherto Undescribed Bacillus Bacterium monocytogenes (n.s.p.). Journal of Pathology and Bacteriology. 29: 407-439. Nardone, R., Alessandrini, F., Tezzon, F. 2003. Syringomyelia Following Listeria Meningoencephalitis: Report of a Case. Neurology Sciences. 24: 40-43. National Advisory Committee on Microbiology Criteria for Foods. 1991. Listeria monocytogenes in Meat, Poultry and Fishery Products. International Journal of Food Microbiology. 14: 226-231. Nesbakken, T., Kapperud, G., Caugant, D. 1996. Pathways of Listeria monocytogenes Contamination in the Meat Processing Industry. International Journal of Food Microbiology. 31: 161-171. Nightingale, K, Schukken, Y., Nightingale, C, Fortes, E., Ho, A., Her, Z., Grohn, Y., McDonough. 2004. Ecology and Transmission of Listeria monocytogenes Infecting Rumiants and in the Farm Environment. Applied and Environmental Microbiology. 70 (8): 4458-4467. Nivia, S., Zipf, A., Bhunia, A. 1999. Influence of Temperature and Growth Phase on Expression of a 104- Kilodalton Listeria Adhesion Protein in Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 65: 2765-2769. Nogva, H., Knut, K., Holck, A. y Lillehaug, D. 2000. Application of 5'-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk. Appied and Environmental Microbiology. 66 (10): 4266-4271. Nolan, D.A., Chamblin, D.C., Troller, J.A. 1992. Minimal Water Activity Levels for Growth and Survival of Listeria monocytogenes and Listeria innocua. International Journal of Food Microbiology. 16: 323-335.

Norton, D.a.B., C. 1999. Detection of Viable L.monocytogenes with a 5' Nuclease PCR Assay. Applied and Environmental Microbiology. 65 (5): 2122-2127 Nuñez de González, M., Keeton, J., Acuff, G., Ringer, L., Lucia, L. 2004. Effectiveness of Acidic Calcium Sulfate with Propionic and Lactic Acid and Lactates as Postprocessing Dipping Solutions To Control Listeria monocytogenes on Frankfurters with or without Potassium Lactate and Stores Vacuum Packaged at 4.5ºC. Journal of Food Protection. 67 (5): 915-921. Nyfeldt, A. 1937. Etiologie de la Mononucléose Infectieuse. C.R. Soc. Biol 101: 590-591. O' Driscoll, B., Cormac, G.M., Collin, H. 1996. Adaptive Acid Tolerance Response in L. monocytogenes: Isolation of an Acid Tolerant Mutant Which Demostrates Increased Virulence. Applied and Environmental Microbiology. 62 (5): 1693-1698. Panduro, A. 2000. Biología molecular en la clínica. Mc Graw Hill Interamericana. Health care group. p. 348. Pascual, M., Calderón, V., 1999. Microbiología Alimentaria, Madrid: Díaz de Santos. p. 171-208. Payán, A., Astudillo, M. 1994. Listeriosis Neonatal: ¿Enfermedad Poco Frecuente o no Diagnosticada ?. Enfoque Microbiológico. Colombia Médica. 25: 69-72. Peliser,M., Mendez, S., Sutherland, A. 2001. Detection of Listeria Species in Refrigerated Chicken Carcasses using Cleaview and a Modified Conventional Culture Method. Brazilian Journal of Microbiology. 32: 113-116. Pini, P.N., Gilbert, R.J. 1988. The Ocurrence in the UK of Listeria Species in Raw Chickens and Cheeses. International Journal of Food Microbiology. 6: 317-326. Pinner, R., Schudat, A., Swaminathan, B. 1992. The Role of Foods in Listeriosis: a Microbiologic and Epidemiologic Investigation. Journal of the American Medical Association. 267: 2041-2045. Rados, C. 2004. Preventing Listeria Contamination in Foods. FDA Consumer. 38 (1): 1011. Ralovich, B. 1984. Listeriosis Research. Present Situation and Perspective. Budapest: Akadémiai Kiadó. p. 64. Ramage, C.P., Low, J.C., McLauchlin, J., Donachie, W. 1999. Characterisation of Listeria ivanovii Isolates from the UK Using Pulsed-Field Gel Electrophoresis. FEMS Microbiology Letter. 15: 349-353. Ramírez, M.F. 1999. Guía de Peligros y Controles en la Cadena Agroalimentaria de Carne de Pollo. 1nd ed. Corporación Colombiana Internacional.

Ray, C.G., Wedgewood, R.J. 1964. Neonatal Listeriosis. Pediatrics. 34: 378-392. Reid, C., Avery, S, Hutchison, M., Buncic. 2002. Evaluation of Sampling Methods to Assess the Microbial Status of Cattle Hides. Food Control. 13: 405-410. Rijpens, N.P., Jannes, G., Herman, L.M.F. 1997. Incidence of Listeria spp. and Listeria monocytogenes in Ready-to-eat Chicken and Turkey Products Determined by Polymerase Chain Reaction and Line Probe Assay Hybridization. Journal of Food Protection. 60 (5): 548-550. Rivas Pala, T., Sevilla, A. 2004. Microbial Contamination of Carcasses, Meat, and equipment from an Iberian Pork Cutting Plant. Journal of Food Protection. 67 (8): 16241629. Ribeiro, M., Ralazamahaleo, M, Cappelier, J., Besnar, V., Federighi, M., Leri, F. 2005. Effect of Salting and Cold-Smoking Process on the Culturability, Viability, and Virulence of Listeria monocytogenes Strain Scott A. Journal of Food Protection. 68 (1): 85-91. Roberts, D. 1994. Listeria monocytogenes and Food: the U.K. Approach. Dairy Food and Environmental Sanitation. 14: p. 198-204. Roche. 2003. Inserto Kit Detection Listeria monocytogenes LightCycler. p. 1-34. Rocourt, J., Cossart, P. 1997. Listeria monocytogenes, in Food Microbiology Fundamental and Frontiers. American Society for Microbiology Press: New York. p. 337-349. Rocourt, J. 1999. The Genus Listeria and Listeria monocytogenes: Phylogenetic Position, Taxonomy, and Identification, in Listeria, Listeriosis and Food Safety, E.T. Ryser, Marth, E.H. Editor. Márcel Dekker Inc: New York. p. 1-20. Romanova, N., Favrin, S., W. Griffiths, M. 2002. Sensitivity of Listeria monocytogenes to Sanitizers used in the Meat Processing Industry. Applied and Environmental Microbiology. 68 (12): 6405-6409. Rosenberg, M., Kjellerberg, S. 1987. Hydrophobic Interactions: Role in Bacterial Adhesion, in Advances in Microbial Ecology, K.C. Marshall, Editor. Plenum Publishing Corporation: New York. p. 353-393. Ryser, E., Marth, E. 1999. Listeria, Listeriosis and Food Safety. Second edition. Ed. Marcel Dekker Inc. p. 738. Sallen, B., Rajoharison, S., Desverenne, S., Quinn, F., Mabilat, C. 1996. Comparative Analysis of 16S and 23S rRNA Sequences of Listeria Species. International Journal Systematic Bacteriology. 46: 669-674.

Sánchez, E., Pardo, R., Duque, A., Palomino, S., Reyes, E. 1992. Listeriosis del Sistema Nervioso Central: Formas Meníngea Aguda Supurativa y Romboencefálica. Acta Neurológica Colombiana. 8 (3): 165-168. Sánchez, E., Castillo, A., Ortega, C. 2001. Infección Perinatal por Listeria. Reporte de un Caso. Revista Colombiana de Obstetricia y Ginecología. 52 (2): 199-202. Santiago, N., Zipf, A., Bhunia, A. 1999. Influence of temperature and growth phase on expression of a 104- kilodalton Listeria adhesion protein in L. monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 66 (6): 2765 - 2769. Schlech, I., Walter, F. 2000. Foodborne Listeriosis. Clinical Infections Diseases. 31: 770775. Schlech, W.F., Lavigne, P.M., Bortolussi, R.A., Allen, A.C., Haldane, E.V., Wort, A.J., Hightower, A.W., Johnson, S.E., King, S.H., Nicholls, E.S., Broome, C.V. 1983. Epidemic Listeriosis. Evidence for Transmission by Food. The New England Journal of Medicine. 308 (4): 203-206. Schlegelova, J., Bavak, V., Klimova, E., Lukasova, J., Navratilova, P., Sustackova, A., Sediva, I. and Rysanek, D. 2002. Prevalence of and Resistance to Antimicrobial Drugs in Selecte Microbial Species Isolated from Bulk Milk Samples. Journal Vet B. Infect. Dis. Vet. Public. Health. 49 (5): 216-225. Schofield, G.M. 1992. Emerging Food-borne Pathogens and their Significance in Chilled Foods. Journal of Applied Bacteriology. 72: 267-273. Schonberg, A., Teufel, P., Weise, E. 1989. Serovars of Listeria monocytogenes and Listeria innocua From Food. Acta Microbiologica Hungarica. 36: 249-253. Schuchat, A., Swaminathan, B., Broome, C.V. 1991. Epidemiology of Human Listeriosis. Clinical Microbiology Review. 4: 169-183. Schuchat, A., Deaver, K., Hayer, P.S., Graves, L., Mascola, L., Wenger, J.D. 1993. Gastrointestinal Carriage of Listeria monocytogenes in Household Contacts of Patients with Listeriosis. Journal of Infection Disease. 167: 1261-1263. Schwartz, B., Hexter, D., Broome, C.V., Hightower, A.W., Hirschhorn, R.B., Porter, J.D., Hayes, P.S., Bibb, W.F., Lorber, B., Faris, D.G. 1989. Investigation of an Outbreak of Listeriosis: New Hypothesis for the Etiology of Epidemic Listeria monocytogenes Infections. Journal of Infection Disease. 159: 680-685. Seeliger, H.P.R. 1986. Jones, D. Genus Listeria Pirie. in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, P.H.A. Sncath, Mair, N.S., Sharpe, M.E., Holt, J.G., Editor. Williams and Wilkins: Baltimore. p. 1235-1245.

Seeliger, H., Jones, D. 1986. Listeria. En Sneath P.H.A., editors. Bergeys manual of determinative bacteriology. Ed. Baltimore. p. 1235-2563. Sierra, S.C., Poutou, R.A., Carrascal, A.K., Torres, K.J., Mercado, M. 2004a. Validación de PCR para Detección de Listeria monocytogenes en Quesos Frescos. Revista UDCA Actualidad y Divulgación Científica 7(2): 53-66. Sierra, S. 2004b. Validación de la técnica de PCR para la detección de la L. monocytogenes en quesos. Tesis de Maestría en Microbiología. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. p. 149. Smith, L. 1996. Role of Osmolytes in Adaptation of Osmotically Stressed and Chill stressed L. monocytogenes Grown in Liquid Media and on Processed Meat Surfaces. Applied and Environmental Microbiology. 62 (9): 3088-3093. Southwick, F., Purich, 1996. Intracellular Pathogenesisis of Listeriosis. The New England Journal of Medicine. 334 (12): 770-776. Swaminathan, B., Rocourt, J., Bille, J. 1995. Listeria, in Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology Press: Washington. p. 341-348. Taormina, P.J., Beuchat, L. R. 2001. Survival and Heat Resistance of Listeria monocytogenes After Exposure to Alkali and Chlorine. Applied and Environmental Microbiology. 67 (6): 2555 - 2563. Tapia de Daza, M.S., Villegas, Y., Martinez, A. 1991. Minimal Water Activity for Growth of Listeria monocytogenes as Affected by Solute and Temperature. International Journal of Food Microbiology. 14: 333-337. Tauxe, R.V., Emerging Foodborne Diseases: An Evolving Public Health Challenge. Emerging Infectious Diseases, 1997. 3 (4): 425-434. Thomas, C.J., McMeekin, T.A. 1980. Contamination of Broiler Carcass Skin During Commercial Processing Procedures: An Electron Microscopic Study. Applied and Environmental Microbiology. 40: 133-144. Tompkin, R. B. 2002. Control of Listeria monocytogenes in the Food-Processing Environment. Journal of Food Protection. 65 (4): 709-725. Torres, K.J., Sierra, S.C., Poutou, R.A., Vera, H., Carrascal, A.K., Mercado, M. 2004a. Incidencia y Diagnóstico de Listeria monocytogenes; Microorganismo Zoonótico Emergente en la Industria de Alimentos. UDCA Actualidad & Divulgación Científica. 7 (1): 25-57. Torres, K.J., Poutou, R.A., Carrascal, A.K., Sierra, S.C., Mercado, M. 2004b. Validación de PCR para Detección de Listeria monocytogenes en Carnes Crudas de Res y Pollo. MVZ Córdoba 9 (2): 414-427.

Torres, K. 2004c. Validación de la técnica de PCR para la detección de L. monocytogenes en carnes crudas de res y pollo. Tesis de Maestría en Microbiología. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. p. 234. 3M. 2004. Placas PetrifilmTM. Para Monitoreo de Listeria en Ambientes. Guía de Interpretación. p. 1-8. Unnerstad, H., Bannerman, E., Bille, J., Danielsson-Tahm, M.L., Waak, E., Tham, W. 1996. Prolonged Contamination of a Dairy with Listeria monocytogenes. Neth Milk Dairy. 50: 493-499. USDA-FSIS. 1996. Pathogen Reduction, Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP) System, Final Rule. Federal Register. 61: 38806-38944. USDA-FSIS, 2001. Controlling Listeria monocytogenes in Small and very Small Meat and Poultry Plants.Washington. p: 1-11. USDA-FSIS. 2002. Isolation and Identification of Listeria monocytogenes from Red Meat, Poultry, Egg and Environmental Samples. MLG 8.03, in USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook. United States Department of Agriculture. Food Safety and Inspection Service: Washington, D.C. p. 21. USDA-FSIS. 2002. FSIS Procedure for the Use of Listeria monocytogenes BAXR Screening Test. Microbiology Laboratory Guidebook. Notice of Change. United States Department of Agriculture. Office of Public Health and Science: Washington, D.C. p. 1-4. Uyttendaele, M.R., Neyts, K.D., Lips, R.M., Debevere, J.M. 1997. Incidence of Listeria monocytogenes in Poultry and Poultry Products Obtained from Belgian and French Abbatoirs. Food Microbiology. 14: 339-345. Van Loosdrecht, M.C.M., Lyklema, J., Norde, W., Schraa, G., Zehnder, A.J.B. 1987. Electrophoretic Mobility and Hydrophobicity as a Measure to Predict the Initial Steps of Bacterial Adhesion. Applied and Environmental Microbiology. 53: 1898-1901. Van Oss, C.J. 1993. Acid-base Interfacial Interactions in Aqueous Media. Colloids Surface. 78: 1-49. Varabioff, Y. 1990. Incidence and Recovery of Listeria from Chicken with a Preenrichment Technique. Journal of Food Protection. 53: 555-557. Vera, H. 2003. Laboratorio de Salud Pública. Secretaría Distrital de Salud. Comunicación personal. Wan, J., King, K., Forsyth, S., Coventry, M.J. 2003. Detection of Listeria monocytogenes in Salmon Using the Probelia Polymerase Chain Reaction System. Journal of Food Protection. 66 (3): 436-440.

Watkins, J., Sleath, K.P. 1981. Isolation and Enumeration of Listeria monocytogenes from Sewage, Sewage Sludge and River Water. Journal of Applied Bacteriology. 50: 1-9. Weidmann, M., Bruce, C., Keating, A., Johnson, A., McDonough, P., Batt A. 1997. Ribotypes and Virulence Gene Polymorphisms Suggest Three Distinct Listeria monocytogenes Lineages with Differences in Pathogenic Potential. Infection and Inmunity. 65: 2707-2716. Weis, J., Seeliger, H.P.R. 1975. Incidence of Listeria monocytogenes in Nature. Applied Microbiology. 30: 29-32. Zamora, A., Ossa, H., Carrascal, A., Poutou, R., Jiménez, D. 2000. Identificación Preliminar de Listeria monocytogenes por PCR. Laboratorio Actual. 17 (33): 38-41. Zweifel, C., Stephan, R. 2003. Microbial Monitoring of Sheep Carcass Contamination in Three Swiss Abattoirs. Journal of Food Protection. 66 (6): 946-952.

Recientemente, han aparecido nuevas tendencias en la conservación de alimentos, que incluyen el uso de bioconservadores, el envasado al vacío y las atmósferas modificadas (Doyle et al. 2001). Se ha demostrado el efecto antagonista de la nisina (bacteriocina) sobre L. monocytogenes. La actividad antimicrobiana de la nisina depende de factores como el tipo y número de microorganismos presentes, la cantidad de nisina, el nivel de pH, condiciones de aplicación y composición de los componentes de los alimentos (Franklin et al. 2004).

Las pediocinas (bacteriocinas similares a la nisina) inhiben el crecimiento de L. monocytogenes (Franklin et al. 2004). Las pediocinas de Lactobacillus bavaricus afectan a L. monocytogenes en carnes, especialmente a temperaturas bajas. Sin embargo un inconveniente del uso de las bacteriocinas es la aparición de mutantes resistentes, como se ha observado con el uso de la bavaricina A y la nisina (Doyle et al. 2001). VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA DE PETRIFILMTM PARA LA DETECCIÓN DE Listeria spp. EN CARCASAS DE POLLO.