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MANUAL TÉCNICO DE ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS DE ALIMENTOS - MONITORIA -

GEISEANNY FERNANDES DO AMARANTE MELO JOSSANA PEREIRA DE SOUSA KARLA KALIGIA DA SILVA MARIA LÚCIA DA CONCEIÇÃO Orientadora

Geiseanny Fernandes do Amarante Melo1 (Voluntária) Jossana Pereira de Sousa1 (Voluntária) Karla Kaligia da Silva1 (Bolsista) Maria Lucia da Conceição² Orientadora

MANUAL TÉCNICO DE ANÁLISES EM MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

1 2

Discentes do Curso de Graduação em Nutrição, do Centro de Ciências da Saúde/UFPB Professora Adjunta do Departamento de Nutrição, do Centro de Ciências da Saúde/UFPB

Agradecimentos

Primeiramente, agradeço a Deus, pois sem ele nada seria possível, por guiar meus caminhos, dando sabedoria para conduzi-lo. Aos meus pais, por todo apoio, compreensão e respeito. À Professora Maria Lúcia da Conceição, pela oportunidade de crescimento na formação acadêmica, além de servir como exemplo de profissional pelo seu incentivo, dedicação e confiança. Ao Programa de Monitoria, por permitir e incentivar o desenvolvimento pedagógico na carreira acadêmica. Às companheiras de Monitoria, Jossana Pereira de Sousa e Karla Kaligia da Silva, que colaboraram na divisão dos trabalhos, relatórios, preparação de aulas, pelo apoio, compreensão e força nos desafios.

Geiseanny Fernandes

A Deus, por estar sempre presente na minha vida, e tornar tudo possível. Agradeço à Professora Maria Lúcia da Conceição pelos ensinamentos, conselhos e incentivos, pela orientação, compreensão, credibilidade, amizade e oportunidade de, junto à Karla e Geiseanny, realizar este trabalho. Às amigas Karla e Geiseanny pelo convívio durante esse período.

Jossana Sousa

Agradeço primeiramente a Deus, o mais fiel companheiro que me concedeu o dom da vida e me abençoou com saúde me proporcionando a capacidade de buscar meus ideais. Aos meus pais e irmãs que com amor sempre me incentivaram; ao meu noivo que com paciência e carinho abdicou da minha presença e me deu força a todo o momento; a professora Maria Lúcia da Conceição, e às amigas Jossana e Geisy, pois sem elas não seria possível à realização deste trabalho.

Karla Kaligia da Silva

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Área de produção.............................................................................................12 Figura 2 – Autoclave à 121 ºC ...........................................................................................13 Figura 3 – Estufa a 180 ºC ................................................................................................13 Figura 4 – Câmara asséptica .............................................................................................13 Figura 5 – Estufas bacteriológicas..................................................................................14 Figura 6 – Banho-maria ......................................................................................................14 Figura 7 – Autoclave a 121 ºC...........................................................................................15 Figura 8 – Área de lavagem e higienização ...................................................................15 Figura 9 – Refrigeradores ................................................................................................16 Figura 10 – Armários..........................................................................................................16 Figura 11 – Almoxarifado .................................................................................................17 Figura 12 – Layout do laboratório de microbiologia dos alimentos/DN/CCS/UFPB ..................................................................................................................................................18 Figura 13 – Equipamentos utilizados em laboratórios de Microbiologia de Alimentos................................................................................................................................19 Figura 14 – Banho-maria ....................................................................................................20 Figura 15 – Balança semi-analítica ..................................................................................21 Figura 16 – Contador de colônias.....................................................................................22 Figura 17 – B.O.D ................................................................................................................23 Figura 18 – Agitador de tubos .........................................................................................23 Figura 19 – Estufa bacteriológica ...................................................................................25 Figura 20 – Stomacher.......................................................................................................26 Figura 21 – Câmara de fluxo laminar..............................................................................26 Figura 22 – Microscópio.....................................................................................................27 Figura 23 – Balões de fundo chato..................................................................................28 Figura 24 – Proveta, becker, Erlenmeyer e tubo de ensaio ......................................29

Figura 25 – Placas de Petri, pipetas sorológicas, pipetas tipo Pasteur e bastão de vidro.........................................................................................................................................30 Figura 26 – Estante de suporte, espátula metálica.....................................................31 Figura 27 – Frasco lavador, Bicos de Bunsen ...............................................................31 Figura 28 – Telas de amianto, tripé de ferro, frascos. .............................................32 Figura 29 – Pipetadores automáticos, alças de Drigalski,manta aquecedora .......32 Figura 30 – Escorredor de vidrarias, agulhas de platina, alça de platina ..............33 Figura 31 – Pinça metálica, escova ..................................................................................33 Figura 32 – Pinça de Mohor, pinças de Hofmann, Jarra de Gaspar.........................34 Figura 33 – Pinça e cronômetro .......................................................................................34 Figura 34 – Jaleco branco para uso em laboratório ....................................................36 Figura 35 – Luva cirúrgica, óculos de proteção, máscara, e touca descartável....37 Figura 36 – Guarda-volumes..............................................................................................37 Figura 37 – Tubos de ensaio na estante de suporte ...................................................38 Figura 38 – Lavar as mãos.................................................................................................39 Figura 39 – Extintores de incêndio.................................................................................39 Figura 40 – Método para preparo de Placas de Petri.................................................42 Figura 41 – Método para preparo de pipetas ...............................................................42 Figura 42 – Método para preparo de frasco de homogeneização ............................43 Figura 43 – Método para preparo de balões e Erlenmeyeres ...................................44 Figura 44 – Método de preparo de Becker.................................................................. 44 Figura 45 – Estufa a 180ºC aberta e fechada..............................................................45 Figura 46 – Autoclave vertical .........................................................................................46 Figura 47 – Coleta de água ................................................................................................52 Figura 48 – Leitura do rotulo do meio de cultura ........................................................60 Figura 49 – Pesagem do meio de cultura........................................................................60 Figura 50 – Esquema da metodologia para contagem de bactérias aeróbias mesófilas.................................................................................................................................65

Figura 51 – Esquema da metodologia para contagem de bolores e leveduras.......71 Figura 52 – Esquema da metodologia dos testes presuntivo e confirmativo para enumeração de coliformes totais......................................................................................77 Figura

53

– Esquema da metodologia para enumeração de coliformes

termotolerantes....................................................................................................................78 Figura 54 - Tubos contendo Caldo Lactose bile Verde Brilhante (CLBVB) positivos..................................................................................................................................79 Figura 55 – Esquema da metodologia para contagem, isolamento e identificação de Estafilococos coagulase positiva .................................................................................83 Figura 56 – Esquema da metodologia para contagem e isolamento de Bacillus

cereus ......................................................................................................................................89 Figura 57 – Metodologia da coloração de Gram...........................................................95 Figura 58 – (1) Cocos gram-positivos, (2) Bacilos gram-negativos...........................96

SUMÁRIO PREFÁCIO APRESENTAÇÃO CAPÍTULO 1 – ESTRUTURA DO LABRATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS........................................................................................................................11 1.1 APRESENTAÇÃO DO LABORATÓRIO ................................................................11 1.2 DESCRIÇÃO DA ÁREA FÍSICA............................................................................11 1.3 EQUIPAMENTOS.....................................................................................................18 1.4 VIDRARIAS ...............................................................................................................28 1.5 ACESSÓRIOS ...........................................................................................................30 Exercícios..........................................................................................................................35 CAPÍTULO 2 – A IMPORTÂNCIA DA APLICAÇÃO DAS NORMAS DE SEGURANÇA ........................................................................................................................36 2.1 SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA ............................36 2.2 RECOMENDAÇÕES SOBRE AS NORMAS DE SEGURANÇA ........................36 Exercícios..........................................................................................................................40 CAPÍTULO 3 - PREPARO E ESTERELIZAÇÃO DE MATERIAIS PARA USO EM ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS..........................................................................41 3.1 PREPARO DE MATERIAIS.....................................................................................41 3.2 ESTERILIZAÇÃO ....................................................................................................45 3.3 DESCONTAMINAÇÃO E DESCARTE DE RESÍDUOS ...................................47 3.4 LAVAGEM...................................................................................................................47 Exercícios..........................................................................................................................49 CAPÍTULO 4 - COLETA DE AMOSTRAS..................................................................50 4.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS E CONDIÇÕES DA COLETA.........................50 4.2 TIPOS DE AMOSTRAS ..........................................................................................52

Exercícios..........................................................................................................................56 CAPÍTULO 5 – MEIOS DE CULTURA .........................................................................57 5.1 DESCRIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA...............................................................57 5.2 CLASSIFICAÇÃO FUNCIONAL DOS MEIOS DE CULTURA.......................58 5.3 CARACTERÍSTICAS DE ALGUNS INGREDIENTES COMPLEXOS............59 5.4 METODOLOGIA.......................................................................................................60 5.5 EXEMPLOS DE FÓRMULAS DE UM MEIO DE CULTURA.............................61 Exercícios..........................................................................................................................62 CAPÍTULO

6

–

CONTAGEM

PADRÃO

DE

BACTÉRIAS

AERÓBIAS

MESÓFILAS.........................................................................................................................63 6.1 CONTAGEM PADRÃO EM PLACAS ......................................................................63 6.2 MATERIAL NECESSÁRIO ....................................................................................64 6.3 METODOLOGIA.......................................................................................................64 6.4 LEITURA ....................................................................................................................66 6.5 RESULTADOS...........................................................................................................66 Exercícios..........................................................................................................................67 CAPÍTULO 7 – CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS..................................68 7.1 BOLORES E LEVEDURAS .......................................................................................68 7.2 MATERIAL NECESSÁRIO ....................................................................................70 7.3 METODOLOGIA.......................................................................................................70 7.4 LEITURA ....................................................................................................................72 7.5 RESULTADOS...........................................................................................................73 Exercícios..........................................................................................................................74 CAPÍTULO

8

–

ENUMERAÇÃO

DE

COLIFORMES

TOTAIS

E

TERMOTOLERANTES .......................................................................................................75 8.1 CARACTERIZAÇÃO DO GRUPO COLIFORME ..................................................75 8.2 MATERIAL NECESSÁRIO ....................................................................................76 8.3 METODOLOGIA.......................................................................................................76

8.4 LEITURA ....................................................................................................................79 8.5 RESULTADOS...........................................................................................................79 Exercícios..........................................................................................................................80 CAPÍTULO

9

–

CONTAGEM,

ISOLAMENTO

E

IDENTIFICAÇÃO

DE

ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA .............................................................81 9.1 CARACTERIZAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA .......81 9.2 MATERIAL NECESSÁRIO ....................................................................................82 9.3 METODOLOGIA.......................................................................................................83 9.4 LEITURA ....................................................................................................................85 9.5 RESULTADOS...........................................................................................................85 Exercícios..........................................................................................................................86 CAPÍTULO 10 – CONTAGEM EM PLACAS DE BACILLUS CEREUS..................87 10.1 CARACTERIZAÇÃO DO GÊNERO BACILLUS CEREUS ................................87 10.2 MATERIAL NECESSÁRIO...................................................................................88 10.3 METODOLOGIA .....................................................................................................88 10.4 LEITURA ..................................................................................................................90 10.5 RESULTADOS.........................................................................................................91 Exercícios..........................................................................................................................92 CAPÍTULO 11 – COLORAÇÃO DE GRAM...................................................................93 11.1 MÉTODO COLORAÇÃO DE GRAM......................................................................93 11.2 MATERIAL NECESSÁRIO ...................................................................................94 11.3 METODOLOGIA......................................................................................................94 11.4 LEITURA ...................................................................................................................95 Exercícios..........................................................................................................................97 Bibliografia consultada

PREFÁCIO A disciplina Microbiologia dos Alimentos tem um papel fundamental em firmar conceitos importantes, bem como demonstrar na prática aos estudantes do curso de nutrição sobre a importância do controle-higiênico sanitário dos alimentos. Os

conteúdos

apresentados

na

presente

disciplina

fornecem

os

conhecimentos básicos no que se refere ao entendimento sobre bactérias e fontes de contaminação mais propícias de acordo com as características específicas de cada grupo de alimentos. Coloca ainda sobre os riscos e conseqüências de uma proliferação bacteriana indevida que por sua vez podem implicar deterioração do alimento ou contaminação por bactérias patogênicas causadoras de doenças. Neste sentido, constatou-se a necessidade da elaboração da primeira edição de um manual de técnicas de análises no laboratório de Microbiologia dos Alimentos que auxilia a inserção do alunado de nutrição no ambiente do laboratório de Microbiologia dos Alimentos. Este trabalho explana sobre as metodologias de análises microbiológicas desenvolvidas para a detecção de microrganismos presentes em alimentos bem como no ambiente em que é produzido, nos equipamentos e utensílios utilizados a fim de avaliar se a segurança do alimento está sendo preservada. Dessa forma, o manual de técnicas contribuirá no acompanhamento da disciplina ministrada proporcionando aos estudantes uma formação mais completa, tendo em vista o acompanhamento dessa área da nutrição que engloba questões atuais como o avanço pesquisas e desenvolvimento de projetos.

APRESENTAÇÃO

O presente manual foi elaborado pela equipe de monitoria da disciplina de Microbiologia dos Alimentos como uma proposta de material didático para uso do alunado nas aulas práticas da disciplina subsidiando também os monitores ao ministrar cada aula. O manual reúne os principais assuntos ministrados durante o curso de Microbiologia dos Alimentos reunindo os conteúdos disponíveis na literatura, facilitando o acesso aos conteúdos e funcionando como guia para o trabalho no laboratório de forma objetiva e ilustrada para ser utilizado por profissionais, estudantes de nutrição e pessoas interessadas nesta área. Este trabalho inclui a cada capítulo apresentado uma breve introdução que explana sobre cada assunto de forma descritiva, à metodologia que é explanada passo a passo e com a apresentação de esquemas e exercícios que auxiliam na fixação dos conteúdos. Almejamos que este manual sirva como material útil para o entendimento e realização das atividades no laboratório, de forma a contribuir para a agregação de novos conhecimentos e formação acadêmica.

Os autores

Manual Técnico de Análises Microbiológicas/Monitoria//DN/UFPB

11

ESRUTURA DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS Capítulo 1 1.1 APRESENTAÇÃO DO LABORATÓRIO_________________________

O Laboratório de Microbiologia dos Alimentos está dividido em áreas devidamente equipadas e providas de materiais que favorecem uma melhor organização e utilização dos meios necessários para a execução das análises nele desenvolvidas. Para que os trabalhos realizados no laboratório tenham resultados garantidos e que sejam desempenhados com segurança é imprescindível que tais recursos sejam mantidos em boas condições de uso e que os usuários estejam bem instruídos sobre como manuseá-los, bem como ter o domínio dos métodos de conservação e higienização de materiais e o conhecimento das técnicas microbiológicas. O laboratório constitui-se basicamente pelos setores de produção, esterilização e descontaminação, higienização de materiais, almoxarifado, incubação e câmara asséptica e ainda vestiários, sanitários e administração. É de suma importância que estas áreas estejam dispostas em ordem satisfatória a facilitar as atividades desenvolvidas, seguindo um fluxo que otimize o mínimo de probabilidade de contaminações. 1.2 DESCRIÇÃO DA ÁREA FÍSICA________________________________

1.2.1 Setor de produção

É o local destinado ao preparo de meios de cultura, soluções e materiais necessários para a execução das análises. É importante que neste ambiente as

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12

bancadas estejam sempre organizadas e higienizadas e que sejam dotadas de gavetas e portas para o acondicionamento devido de vidrarias e acessórios.

Figura 1 – área de produção

1.2.2 Setor de esterilização

Destina-se a promover a isenção de microrganismos em meios de cultura e materiais que serão utilizados nas análises microbiológicos. Os materiais destinados à esterilização devem ser previamente preparados como descrito no capítulo 3. A esterilização pode ser realizada por meio do emprego do calor seco em estufa à 180 ºC por 2 h a pressão 1 atm (mais utilizada para vidrarias) ou por calor úmido em autoclave operando à 121 ºC por 15 minutos e 1 atm (utilizadas para meios de cultura, suspensões bacterianas, etc.).

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Figura 2 – Autoclave à 121 °C

13

Figura 3 – Estufa à 180 °C

(Cortesia do Laboratório de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrição/CCS/UFPB)

1.2.3 Câmara asséptica

Neste local são realizadas exclusivamente as análises microbiológicas, inoculações e/ou semeadura de colônias, bem como a contagem de placas. É de suma importância que as superfícies das bancadas estejam sempre desinfetadas, para isso é necessário o uso de lâmpada ultravioleta. O ambiente deve ser dotado de contador de colônias, agitador de tubos e balança semi-analítica.

Figura 4 – Câmara asséptica

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1.2.4 Setor de incubação

Este espaço destina-se à incubação de placas e tubos inoculados e para isso é preciso que este seja dotado de estufas, banho-maria e demanda bioquímica de oxigênio (B.O.D.). Tais equipamentos devem ser regulados quanto à sua temperatura de acordo com os microrganismos estudados, visando à manutenção de ambientes propícios para o desenvolvimento bacteriano.

Figura 5 – Estufas bacteriológicas

Figura 6 – Banho-maria

(Cortesia do Laboratório de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrição/CCS/UFPB)

1.2.5 Setor de descontaminação

Após a leitura de todo o material incubado e também após as análises, os materiais que estiveram em contato com os microrganismos estão altamente contaminados, então, para serem descontaminados devem ser nesta área, submetidos a uma autoclavação de 30 minutos a uma temperatura de 121 ºC e 1 atm.

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Figura 7 – Autoclave à 121 °C

(Cortesia do Laboratório de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrição/CCS/UFPB)

1.2.6 Área de lavagem e higienização de materiais Nesta área são desenvolvidas as atividades de pré-lavagem com o descarte do material descontaminado e a retirada do excesso de matéria orgânica, a lavagem propriamente dita material em solução detergente e deixando de molho por 2 horas ou um pouco mais, dependendo do grau de aderência do material. Devem-se também nesta fase, com o auxílio de escovas e esponjas, esfregar os frascos e demais utensílio e remover também as anotações de lápis e canetas. Em seguida é feito o enxágüe de todo o material em água corrente, por dez vezes sucessivas, depois é feito um novo enxágüe com água destilada, pelo menos uma vez e o material é exposto à secagem ambiente.

Figura 8 – Área de lavagem e higienização

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1.2.7 Setores de materiais Tem por finalidade armazenar material preparado, não preparado, meios de cultura desidratados e prontos, como também material contaminado. Este setor é dotado de armários onde são guardadas as vidrarias e duas geladeiras, uma para acondicionamento de materiais estéreis, como meios de cultura prontos, e outra para os materiais contaminados.

Figura 9 – Refrigeradores

Figura 10 – Armários

(Cortesia do Laboratório de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrição/CCS/UFPB)

1.2.8 Almoxarifado Este local deve ser dividido em setores com diferentes finalidades para atender as necessidades, ou seja, para a guarda de equipamentos obsoletos e em desuso, conservação do estoque de meios de cultura, reagentes e solventes, além de materiais de limpeza que devem ser mantidos separados e identificados. Neste ambiente é preciso que os materiais, meios de cultura, reagentes, solventes e materiais de limpeza sejam guardados separadamente e devidamente identificados. É importante que este local esteja sempre limpo, que haja ventilação e seja livre de iluminação excessiva.

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O profissional responsável por esse setor deve manter o controle dos materiais atualizados, com data de entrada, saída e o nome do pessoal que os solicita.

Figura 11 – Almoxarifado

1.2.9 Vestiários e sanitários Os vestiários são locais destinados à guarda de volumes e troca de vestimentas. Os sanitários devem ser para uso exclusivo do pessoal do laboratório e de preferência que seja separado o feminino do masculino. Devem ser externos às dependências laboratoriais e estarem sempre com toalhas de papel de sabonete de preferência líquido disponíveis. 1.2.10 Recepção e Administração A recepção é o local destinado a receber os visitantes, bem como à execução da fração teórica da aula prática. A administração é o local destinado à permanência do pessoal da coordenação, professores e técnicos. A figura 12 é uma

representação

do

Laboratório

de

Microbiologia

Departamento de Nutrição, Centro de Ciências da Saúde, UFPB.

dos

Alimentos,

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18

Figura 12 – Layout do Laboratório de Microbiologia dos Alimentos/DN/CCS/UFPB

1.3 EQUIPAMENTOS___________________________________________ Os

equipamentos

necessários

para

um

laboratório

são

recursos

indispensáveis para a execução e andamento das atividades desenvolvidas. Cada material apresenta uma operacionalização individualizada, que requer do pessoal envolvido conhecimento sobre o funcionamento, limpeza e manutenção de cada um. Os equipamentos podem ser divididos em: estático e móvel. Os estáticos são representados por estufas bacteriológicas, autoclaves e como móveis tem-se agitador de tubos ou vortex, lavador automático de pipetas e contador de colônias. Cada equipamento requer a descrição de suas funções, evitando assim equívocos à execução de atividades diárias que deve ser disponibilizado para todos aqueles que trabalham no laboratório.

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Figura 13 – Equipamentos utilizados em laboratório de microbiologia de alimentos. 1. Geladeiras; 2. Estufa à 180 °C; 3. Banho-maria; 4. Depósito de água; 5. Microondas; 6. Autoclave vertical à 121 °C; 7. Agitador de tubos; 8. Microscópio; 9. Estufas bacteriológicas; 10. Lavador de pipetas; 11. Contador de colônias; 12. Autoclave vertical à 121°C; 13. Balança semi-analítica. (Cortesia do Laboratório de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrição/CCS/UFPB)

1.3.1 DESCRIÇÃO DOS EQUIPAMENTOS_________________________ 1.3.1.1 Autoclaves Quais as funções? Esses equipamentos são amplamente utilizados em laboratórios de microbiologia, que tem por finalidade propiciar a esterilização e descontaminação de materiais e meios de cultura por calor úmido, sob pressão ou vapor fluente. Podem

ser

encontradas

comercialmente

sob

diferentes

volumétricas, variando de 18 L a 150 L, munidas de um ou dois cestos.

capacidades

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Como manusear? •

Verificar a higienização do equipamento;

•

Adicionar água até o nível do suporte do cesto;

•

Colocar os cestos;

•

Ligar o equipamento;

•

Baixar a tampa e deixar aquecer a água;

•

Colocar o material para esterilizar nos cestos;

•

Fechar completamente a tampa;

•

Fechar a válvula de escape de vapor, se não sob vapor fluente;

•

Esperar a temperatura alcançar 121 oC;

•

Marcar o tempo necessário para a esterilização (15 ou 30 min.);

•

Transcorrido o tempo de esterilização, desligar o equipamento;

•

Deixar baixar a temperatura;

•

Abrir a válvula e em seguida a tampa;

•

Retirar o material esterilizado.

1.3.1.2 Banho-Maria

Figura 14 – Banho-maria

Quais as funções? Empregado para aquecimentos a baixas temperaturas.. Como manusear? •

Verificar se o equipamento está ligado corretamente;

20

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21

•

Verificar se o reservatório de água está limpo;

•

Adicionar água corrente no reservatório até o nível;

•

Instalar no orifício localizado na parte superior do instrumento o termômetro;

•

Acionar o dispositivo liga/desliga;

•

Esperar que a temperatura atinja a desejada;

•

Caso não esteja estabilizada, ajustar a temperatura movendo para a direita ou esquerda o t

•

ermostato;

•

Quando a temperatura desejada for alcançada, verificar que esta permanece estável por aproximadamente 1 hora.

1.3.1.3 Balança Semi-Analítica

Figura 15 – Balança semi-analítica

Quais as funções? Indispensável no laboratório. Amplamente utilizada para pesagens de meios desidratados. Como manusear? •

Antes de iniciar os trabalhos de pesagem, verificar se a balança está bem instalada, nivelada, zerada e limpa;

•

Colocar o becker, Erlenmeyer ou balão no prato da balança;

•

Ligar a balança;

•

Tarar o peso do recipiente;

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•

Adicionar cuidadosamente a quantidade necessária do material à pesar;

•

Ajustar o peso;

•

Ao término da pesagem, retirar o recipiente da balança;

•

Zerar e desligar a balança.

22

1.3.1.4 Contador de Colônias

Figura 16 – Contador de colônias (Cortesia do Laboratório de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrição/CCS/UFPB)

Quais as funções? Utilizado para a realização da contagem de colônias em placas de Petri. Como manusear? •

Verificar se o contador está ligado corretamente, acionando o dispositivo liga/desliga;

•

Colocar a placa inoculada no suporte do instrumento, com o fundo voltado para a lente;

•

Ligar o instrumento;

•

Retirar a placa do suporte;

•

Fazer a contagem das colônias por quadrante com o auxílio de lápis hidrocor;

•

Desligar o instrumento e mantê-lo sempre protegido, para evitar impregnação de poeira.

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1.3.1.5 B.O.D (Demanda Bioquímica de Oxigênio)

Figura 17 – B.O.D.

Quais as funções? É um equipamento cuja estrutura assemelha-se a de um refrigerador, entretanto, na para superior encontra-se instalada uma estufa munida de controles para ajustar a temperatura. Quando da incubação de bolores e leveduras, a temperatura ótima exigida para crescimento é 25 0C (Figura 20). O processo de higienização deste equipamento deve ser realizado periodicamente, com a finalidade de evitar contaminações capazes de comprometer os resultados. 1.3.1.6 Agitador de tubos

Figura 18 – Agitador de tubos

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Quais as funções? Empregado para agitação mecânica de reativos e tubos com diluição. Como manusear? •

Verificar se o contador está ligado corretamente, acionando o dispositivo liga/desliga;

•

Manter o agitador ligado;

•

Colocar o tubo na cavidade do instrumento, segurando-o com cuidado por um tempo para promover a agitação;

•

Retirar o tubo e repetir a operação quanto necessário;

•

Desligar o instrumento;

•

Fazer a limpeza se for o caso e mantê-lo protegido.

1.3.1.7 Estufa para Esterilização e Secagem Quais as funções? Empregada para esterilização e secagem através do calor seco, de frascos, Erlenmeyer, balões, pipetas, placas de Petri e outros materiais de laboratório.

Como manusear? •

Verificar se a estufa está ligada corretamente, acionando o dispositivo liga/desliga;

•

Instalar o termômetro na parte superior da estufa;

•

Verificar a temperatura inicial;

•

Estabilizar a estufa para a temperatura de trabalho girando o termostato para a direita ou para a esquerda de acordo com a temperatura desejada (180 0C);

•

Quando a temperatura desejada for alcançada, verificar que esta permanece estável por aproximadamente 1 hora.

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•

25

Iniciar a esterilização. A contagem do tempo será realizada após a estufa atingir a temperatura ideal e deixar os sob aquecimento por 1 ½ a 2 horas.

1.3.1.8

Estufa Bacteriológica

Figura 19 - Estufa bacteriológica

Quais as funções? Empregada para incubação de placas, tubos ou frascos inoculados com cultura bacteriana. Como manusear? •

Verificar se a estufa está ligada corretamente, acionando o

dispositivo

liga/desliga; •

Instalar o termômetro na parte superior da estufa;

•

Verificar a temperatura inicial;

•

Estabilizar a estufa para a temperatura de trabalho girando o termostado para a direita ou para a esquerda, de acordo com a temperatura desejada (35 0C ,37 0C, 45 0C ou 55 0C);

•

Quando a temperatura desejada for alcançada, verificar se permanece estável por aproximadamente 1/2 hora.

•

Manter a estufa sempre ligada para evitar desestabilização.

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1.3.1.9 Stomacher (Homogeneizador de amostra)

Figura 20 – Stomacher

Quais as funções? Empregado para homogeneizar amostras com o diluente. Como manusear? •

É um instrumento constituído de uma câmara contendo duas pás que batem em movimento de vai-e-vem.

•

Inicialmente, realiza-se a abertura da porta da câmara e o saco estéril contendo a amostra e o diluente é introduzido no seu interior.

•

Fecha-se a porta mantendo o saco preso.

•

Ligar e deixar sob agitação por aproximadamente 3-5 min. O batimento das pás desmancha a amostra, permitindo que os microrganismos nela presentes se transfiram para a fase aquosa.

1.3.1.10

Câmara de fluxo laminar

Figura 21 – Câmara de fluxo laminar

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Quais as funções? Esse equipamento é indispensável em um laboratório de microbiologia, principalmente no momento de execução de atividades que requerem alto grau de assepsia. Como manusear? É de manuseio simples, apresenta bancada na qual deve-se dispor todo o material a ser utilizados durantes uma determinada atividade. Deve ser instalado bico de Bunsen e lâmpadas germicidas; a porta móvel permite manter o ambiente interno isento de contaminações. 1.3.1.11

Microscopia

Figura 22 – Microscópio

Quais as funções? Amplamente utilizado para leitura de lâminas, com capacidade de aumento ótico, definindo as formas morfológicas de microrganismos. Como manusear? •

Ligar o microscópio;

•

Fixar a lâmina no suporte e escolher a objetiva para observação;

•

A objetiva de 40 é utilizada para a observação de fungos e a de 100 para as bactérias.

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1.4 VIDRARIAS____________________________________________ As vidrarias são materiais presentes no laboratório utilizadas na realização das análises microbiológicas; possuem grande diversidade de formas e tamanhos que se adequam as diferentes atividades requeridas durante os trabalhos. São objetos frágeis, que necessitam de cuidado especial quanto ao seu manuseio, limpeza e armazenamento.

1.4.1 DESCRIÇÃO DAS VIDRARIAS_____________________________ 1.4.1.1 Balões sem esmerilhação Os balões sem a esmerilhação são os mais utilizados em microbiologia, úteis no preparo meios. Fundo chato sem boca esmerilhada

Figura 23 – Balões de fundo chato

1.4.1.2 Beckeres, provetas graduadas e tubos de ensaio. Os beckeres são úteis para dissolução e pesagem de meio de cultura. Comercialmente, podem ser adquiridos sob as formas vidro e plástico e variados volumes.

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As provetas graduadas ou cilindro de vidro são empregados para a medição de líquidos. Estão à venda em plástico com base hexagonal também em plástico, em vidro com base hexagonal em plástico, em diferentes volumetrias. O cilindro de vidro também designadas como provetas, destinam-se a medições de líquidos, no caso de preparo de meios é útil na medição do volume de água necessário para a sua dissolução. Os tubos de ensaio empregados na microbiologia para teste bioquímico, análises microbiológicas, inoculação e para conservação de cepas. Em geral, são preparados e esterilizados antes de seu uso.

Figura 24 – Proveta, becker, Erlenmeyer e tubo de ensaio

1.4.1.3 Placas de Petri, bastões de vidro, pipetas sorológicas ou graduadas. As placas de Petri são utilizadas durante as análises para semeadura. São comercializadas em vidro e em plástico designadas como descartáveis em diferentes diâmetros. Os bastões em vidros são empregados para homogeneizar e auxiliar na transferência de líquidos. As pipetas sorológicas ou graduadas são cilindros com uma das extremidades afiladas utilizadas para medição de líquidos com escoamento de volumes fracionados. Comercialmente podem ser encontradas em diferentes volumetrias, ou seja, de 0,1 a 50 mL e divisões decimais de 1/10 ou 1/100.

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Figura 25 – Placas de Petri, pipetas sorológicas, pipeta tipo Pasteur e bastão de vidro

1.5 ACESSÓRIOS___________________________________________ Os acessórios são recursos importantes dentro do laboratório visto que eles auxiliam nas atividades desenvolvidas antes, durante e após as análises microbiológicas proporcionando maior facilidade para o manuseio das vidrarias, dando um suporte para uma melhor segurança, diminuindo o risco de possíveis acidentes.

1.5.1 DESCRIÇÃO DOS ACESSÓRIOS____________________________ 1.5.1.1 Espátulas, estantes de suporte. As espátulas se apresentam comercialmente sob as formas de colher e meia-calha metálica e com o cabo em madeira. São necessárias na pesagem e homogeneização de substâncias sólidas, além de auxiliar na transferência de material sólido. As estantes ou suporte para tubos são amplamente utilizados na microbiologia durantes análise pela técnica dos tubos múltiplos, para diluições decimais e para reações bioquímicas.

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Figura 26 – Estante de suporte, espátula metálica

1.5.1.2 Frasco lavador ou pincetas, Bico de Bunsen.

O frasco lavador ou pincetas são utilizados para acondicionar água destilada ou solução alcoólica, necessários em laboratório de microbiologia. O bico de Bunsen é uma boa fonte de calor seco, usado para gerar ou manter aquecimento, na dissolução de meios de cultura e flambagem.

Figura 27 – Frasco lavador, Bicos de Bunsen

1.5.1.3 Tela de amianto, tripé de ferro, frascos.

A tela de amianto é um acessório indispensável para o processo de aquecimento, pois dá sustentação para o recipiente que vai ser aquecido. As telas podem ser encontradas no comércio sob diferentes tamanho, sendo adquiridas expressando a área da mesma.

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O tripé de ferro atua como suporte para a tela de amianto e o recipiente e é adquirido comercialmente em diversificados tamanhos e diâmetros. Os frascos em plástico ou vidro são utilizados para o acondicionamento e conservação de soluções.

Figura 28 – Telas de Amianto, tripé de ferro, e frascos.

1.5.1.4.Pipetadores automáticos, alça de DrigalsK, manta aquecedora. Os pipetadores automáticos são utilizados para pipetar utilizando ponteiras descartáveis que são acopladas na ponta afilada do instrumento. Para manipular o pipetador, coloca-se a ponteira na extremidade, pressionar a parte superior com vigor e procede a imersão no líquido, despressionando o dedo. A alça de DrigalsK é pregada para promover o espalhamento de inóculo; já a manta aquecedora para aquecimento, em particular de balões contendo meio de cultura para dissolver ou outro líquido. A manta aquecedora, comercialmente pode ser encontrada em diversas formas e modelos, cujo calor é gerado por resistência elétrica. As mantas de forma cônica são utilizadas para aquecimento de balões ou dissolução de meios de cultura.

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Figura 29 – Pipetadores automáticos, alças de Drigalski, manta aquecedora.

1.5.1.5 Escorredor de vidrarias, alças e agulhas de platina, pinça metálica, escovas. O escorredor de vidrarias auxilia na secagem das mesmas. As alças e as agulhas de platina ficarão dispostas no suporte que por sua vez deve ser de fácil acesso, todas elas devem ficar com o cabo de Kole para baixo. A pinça metálica é empregada para auxiliar no manuseio de beckeres. As escovas são indispensáveis na lavagem de vidrarias, como tubos, beckeres, Erlenmeyer e balões, elas são comercializadas em diferentes tamanhos.

Figura 30 – Escorredor de vidrarias, agulhas de platina e alças de platina.

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Figura 31 – Pinça metálica, escovas.

1.5.1.6 Pinça de Mohor, pinça Hofmann, jarra de Gaspar, pinças. A pinça de Mohor é empregada prender a mangueira, auxiliando na distribuição de meio de cultura líquido. A pinça Hofman possui a finalidade de impedir ou reduzir a operação de fluxo de líquidos ou gases através de tubos flexíveis. A jarra de anaerobiose ou jarra de Gaspar é o instrumento mais importante para o isolamento de microrganismos anaeróbios. As pinças são usadas para pegar material sólido, com diversificados tipos e aplicações.

Figura 32 – Pinça de Mohor, pinças Hofmann, Jarra de Gaspar

Figura 33 – Pinça e cronômetro

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EXERCÍCIOS Exercício n0 _______

Assunto: ____________________

1. Explane sobre a importância de um laboratório bem organizado com relação à divisão de suas áreas, e como isso contribui no andamento das atividades desenvolvidas.

2. Crie uma situação de atividade no laboratório em que você precisará utilizar pelo menos um equipamento, uma vidraria e um acessório conjuntamente para a realização desta atividade.

3. Selecionar os equipamentos que considerar importante e descrever suas funções e aplicações.

4. Qual a aplicação para a jarra de Gaspar?

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A IMPORTÂNCIA DA APLICAÇÃO DAS NORMAS DE SEGURANÇA Capítulo 2 2.1. SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA____________ Nos Laboratórios de Microbiologia onde amostras biológicas e culturas com agentes infectantes são manipulados, é de grande importância que sejam priorizados os cuidados de segurança já que tais amostras significam riscos ao pessoal desse setor. Nas aulas práticas serão estudados vários microrganismos, inclusive alguns patogênicos ao homem. Dessa forma, é essencial observar normas de segurança no laboratório para evitar contaminação de estudantes, de técnicas e de professores. 2.2 RECOMENDAÇÕES SOBRE AS NORMAS DE SEGURANÇA__________ •

O uso do avental branco, comprido e abotoado, deve obrigatoriamente ser utilizado no laboratório de Microbiologia, pois o mesmo protege a roupa de contaminação;

Figura 34 – Jaleco branco para uso em laboratório

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•

37

deve-se usar luvas cirúrgicas estéreis antideslizantes e individuais, sapato fechado, óculos de proteção, máscara e touca descartáveis;

Figura 35 – Luvas cirúrgicas, óculos de proteção, máscara e touca descartáveis.

•

bolsas, pacotes, livros, etc. devem ser guardados em local apropriado, como mostra a Figura .

Figura 36 – Guarda-volumes

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•

não fumar, comer ou beber água das torneiras;

•

manter as mãos, canetas e quaisquer outros

38

objetos longe da boca ou face; •

em caso de qualquer acidente (derramamentos de culturas, ferimentos etc.) comunicar imediatamente ao professor ou ao pessoal técnico do laboratório;

•

o avental deve ser mantido limpo;

•

todo material contaminado deverá ser colocado em recipientes adequados para serem esterilizados posteriormente, nunca deixá-los sobre a mesa de trabalho ou pia;

•

os tubos de cultura deverão ser colocados nas estantes ou suportes adequados, nunca nos bolsos do avental ou deitados sobre as bancadas;

Figura 37 –Tubos de ensaio na estante de suporte.

•

cuidado ao acender o bico de gás (Bico de Bunsen). Observar se não existe produtos inflamáveis (álcool, éter, acetona etc.) nas proximidades da chama;

•

a alça de platina deve ser flambada até o rubro, tanto antes do uso como depois dele. Antes de tocar o material de cultura, deve-se deixar a alça esfriar, mantendo-a próxima da chama;

•

os tubos de ensaio e placas de Petri com meios de cultura só poderão ser abertos nas proximidades da chama. Não tocar no meio de cultura com

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dedos ou quaisquer objetos e manter as placas e tubos abertos o mínimo tempo possível; •

os tubos de ensaio contendo culturas bacterianas deverão ser flambados após sua abertura e antes de recolocar a tampa (tampão de algodão). Nunca coloque o tampão de algodão sobre a bancada;

•

identificar o material que será utilizado;

•

o aluno é responsável por todo o material com que trabalha. Qualquer acidente, dano ou defeito em equipamentos deve ser imediatamente comunicado ao professor;

•

lavar sempre as mãos, usando sempre sabão líquido e assepsia com álcool a 70 %, antes e após o trabalho com material biológico e, ou sempre que houver suspeita de contaminação;

Figura 38 – Lavar as mãos

•

o aluno deve deixar o laboratório apenas ao término do trabalho, sem dúvidas nas técnicas realizadas e ao final da aula deve limpar a bancada, desligar e cobrir os microscópios, fechar o bico de Bunsen e a válvula de segurança, descartar as luvas e lavar as mãos antes de deixar o laboratório.

•

manter extintores devidamente posicionados e com dentro do prazo validade ao alcance do pessoal, que por sua vez deve ser instruído para o uso em caso de acidentes.

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.

Figura 39 – Extintores de incêndio

40

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EXERCÍCIOS Exercício n0 ____

Assunto: __________________

1. Identifique cinco possíveis riscos em um laboratório e sugestione medidas para combatê-los.

2. Qual a importância da flambagem na prevenção de riscos biológicos?

3. Justifique a instalação de extintores em laboratório e especificar os tipos adequados para laboratório.

4. Discernir sobre a segurança do trabalho em laboratório

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PREPARO E ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS PARA O USO NAS ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS Capítulo 3 3.1 PREPARO DE MATERIAIS____________________________________

A preparação do material de laboratório para utilização em análises microbiológicas envolve todas as atividades necessárias para garantir que os frascos, utensílios, instrumentos e vidrarias, destinados ao contato com as amostras de alimentos, encontrem-se totalmente limpos, estéreis e isentos de resíduos químicos e orgânicos, no momento das análises. Esse trabalho envolve as atividades de descontaminação, descarte de resíduos contaminados, lavagem, acondicionamento e esterilização.

3.1.1. ACONDICIONAMENTO DO MATERIAL PARA ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO OU ÚMIDO O procedimento de esterilização de materiais pode ser feito em autoclave por meio do calor úmido ou em estufa por calor seco; mas antes disso é preciso preparar o material acondicionando-os devidamente para que depois de esterilizados não sofram contaminações subseqüentes. 3.1.1.1 Métodos a) Placas de Petri - Acondicioná-las em estojos porta-placas de alumínio ou aço inoxidável, ou embrulhadas em papel kraft, em grupos de até quatro placas.

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Figura 40 – Método de preparo de placas de Petri (Ilustração elaborada pela Monitoria)

b) Pipetas - Preencher o bocal com algodão e acondicionar em estojos portapipetas com as pontas para baixo. É importante que o fundo dos estojos seja protegido com um chumaço de gaze ou algodão para evitar danos às pontas das pipetas. As pipetas devem podem ainda ser embrulhadas uma a uma manualmente como representado na figura 41 abaixo.

Figura 41 – Método de preparo de pipetas (Ilustração elaborada pela monitoria)

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c)

43

Tubos de ensaio - Tampar com tampão de algodão ou com as respectivas

tampas rosqueáveis deixando-as frouxas, acondicioná-las em grupos e cobrir a parte superior dos tubos com papel Kraft e amarrar com barbante. d)

Frascos de homogeneização tampados com algodão - cobrir a tampa ou o

tampão com papel Kraft e amarrar com barbante individualmente, cuja seqüência está representada na Figura 3.

Figura 42 – Preparo de frascos de homogeneização (Ilustração elaborada pela Monitoria)

e)

Balões ou Erlenmeyeres - Estender a gaze na boca do Erlenmeyer,

preencher com algodão e amarrar, formando o tampão, em seguida cobrir com papel Kraft envolvendo o tampão e amarrá-lo firme.

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Figura 43 – Método de preparo de balões ou Erlenmeyeres (Ilustração elaborada pela monitoria)

f) Becker – Tampar o becker com papel alumínio e em seguida sobrepor o papel kraft amarramdo-o.

Figura 44 – Método de preparo de Becker (Ilustração elaborada pela monitoria)

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g) Espátulas, pinças, tesouras e demais utensílios – Embrulhar individualmente em papel de kraft, identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise. 3.2 ESTERILIZAÇÃO________________________________________ Nos laboratórios de microbiologia é preferível a utilização de estufas (calor seco) para a esterilização de vidrarias porque ao final do processo as vidrarias estão secas e prontas para serem utilizadas. Os meios de cultura são exemplos de material destinado a análises microbiológicas que devem ser submetidos à esterilização por calor úmido, tendo em vista a eficaz ação a água aquecida que gera grande pressão capaz de destruir células vegetativas. 3.2.1 Esterilização por calor seco a) Acondicionar os materiais devidamente. b) Organizar os materiais dentro da estufa com o cuidado de não deixa-las muito cheias para que a circulação do calor não seja comprometida. c) Submeter os materiais à esterilização em estufa a uma temperatura de 180ºC por 2 horas. d) Guardar os materiais em seus respectivos locais.

Figura 45 – Estufa à 180 °C fechada e aberta

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3.2.2

46

Esterilização por calor úmido

a) Averiguar o nível da água da autoclave retirando o cesto, que deve estar a 1 cm da cruzeta. b) Completar com água se necessário e repor o cesto. c) Colocar todo o material a ser esterilizado. d) Fechar a tampa da autoclave e fechar os manípulos em crus. e) Ligar a autoclave na potencia máxima e esperar ate que se atinja 121ºC. f) Ao atingir 121ºC, colocar a chave para potencia média. g) Marcar 15 minutos para que a autoclave seja desligada. h) Esperar que o ponteiro do monômetro atinja a posição zero.

i) Abrir o registro aos poucos e esperar a saída do vapor por completo. j) Abrir os manípulos em cruz e retirar os materiais estéreis.

Figura 46 – Autoclave vertical (Cortesia do Laboratório de Microbiologia de Alimentos /Departamento de Nutrição/CCS/UFPB)

3.3 DESCONTAMINAÇÃO E DESCARTE DE RESÍDUOS________________ Após as análises microbiológicas os meios de cultura e toda a vidraria envolvida encontram-se altamente contaminados devido ao favorecimento dos métodos analíticos à proliferação bacteriana. Para descontaminar o material deve-se:

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a) Preparar todo o material, embalando as placas de Petri com papel de embrulho e acomodando os tubos e vidrarias menores em recipientes adequados e cobertos com o papel de embrulho; b) Identificar o material colocando o nome do responsável e a data; c) Submeter o material à esterilização em autoclave, a 121ºC por 30 minutos. Após a descontaminação deve-se aguardar a saída de todo o vapor, abrir a tampa da autoclave e esperar que o material esfrie, em seguida, descartar os resíduos sólidos no lixo com o auxílio de espátulas e os líquidos na pia, proceder com a lavagem.

3.4 LAVAGEM O processo de lavagem deve ser feito mediante a escolha correta do tipo de detergente, bem como o método de enxágüe mais apropriado para a remoção dos resíduos. Os detergentes aniônicos são os mais utilizados, mas se for necessário à aplicação de um agente mais forte é utilizado, por exemplo, a solução sulfocrômica constituída de ácido sulfúrico e dicromato de potássio. A lavagem deve ser eficaz retirando ao máximo compostos orgânicos aderidos às vidrarias e também etiquetas com anotações de identificaçã 3.4.1 Métodos

a)

Descartar o material descontaminado retirando o excesso de matéria

orgânica. O material não deverá ser misturado com o resíduo seco, mas deve ser coletado e acondicionado separadamente; b)

Mergulhar o material em solução detergente neutro e deixar imerso por 2

horas, dependendo do grau de aderência do material. c)

Com o auxílio de escovas e esponjas, esfregar os frascos e demais

utensílios, remover também as anotações de lápis e canetas.

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d)

Enxaguar todo o material em água corrente, por dez vezes sucessivas.

e)

Enxaguar com água destilada, pelo menos uma vez.

f)

Dispor o material sobre bancada limpa para secagem ambiente.

48

Ressalta-se ainda, que as escovas e esponjas devem ser conservadas em recipiente apropriado. Não recomendado o uso desses materiais por longos períodos, em vista das possibilidades de aderência de material resíduo com formação de biofilme. Manter o controle microbiológico e físico-químico da água de torneira e destilada atualizadas, com periodicidade de um mês. Na ausência de cuba de inox, empregar no processo de higienização recipiente metálico ou em plástico, tendo o cuidado de higienizá-los diariamente antes e após as atividades.

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EXERCÍCIOS

Exercício n0 ____

Assunto: __________________

1. Qual a importância do preparo e esterilização de vidraria para a qualidade das análise?

2. Explicar as diferenças de temperatura nos tratamento por calor seco e úmido.

3. Qual a diferença existente entre os processos de esterilização pelo calor úmido e pelo calor seco?

4. Investigar outros métodos de esterilização pelo calor seco e relacioná-los.

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COLETA DE AMOSTRAS Capítulo 4 4.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS E CONDIÇÕES DA COLETA__________ A obtenção correta das amostras, seu transporte para o laboratório e sua preparação para análise são etapas fundamentais para o sucesso de uma análise microbiológica. Da execução correta dessas três etapas depende a exatidão dos resultados obtidos. A amostra deve ser a representação do produto como um todo, logo, é de suma importância que todas as precauções sejam tomadas. A ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária adota para a avaliação de lotes os planos de duas e três classes estabelecido pela International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF, 2002). Seja qual for a finalidade das análises microbiológicas dos alimentos, é muito importante respeitar rigorosamente as seguintes condições para coleta de amostras: •

Evitar a contaminação durante a coleta

•

•

•

•

Deve-se higienizar bem as mãos lavando-as com água e sabão e fazer anti-septicemia com álcool a 70% ou similar; faz-se necessário também o uso de luvas e máscara descartáveis e da utilização de frascos de vidro esterilizados e/ou sacos esterilizados. Os utensílios utilizados pelos para coleta (garfos, facas, pinças, etc) devem ser lavados com água e sabão e esterilizados. O local utilizado para realizar a coleta das amostras de alimentos deve ficar fora de circulação das pessoas e sem corrente de ar, sendo que a coleta deverá ser feita com rapidez e assepsia. Não falar, tossir ou espirrar durante a coleta. Abrir a embalagem de maneira a garantir que eventuais contaminações presentes na superfície

externa não contaminem o produto.

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•

As amostras coletadas devem ser refrigeradas a uma temperatura entre 0ºC e 4ºC, em 1 hora. As amostras podem ser armazenadas abaixo de 4ºC ou congeladas entre 10ºC e -15ºC por, no máximo, 72 horas, sendo o ideal até 48 horas.

•

As amostras devem ser transportadas para o laboratório em embalagens isotérmicas (isopor) com gelo para manter o ambiente de refrigeração (abaixo de 10º). As amostras devem ser identificadas no rótulo de embalagem, com todas as informações que facilitem a interpretação dos resultados, como a temperatura do alimento no ato da coleta, hora da coleta, etc. e observar se os frascos e sacos de plásticos estão bem fechados para evitar a contaminação no transporte ou pela água proveniente do gelo. A quantidade de alimentos em cada amostra deve ser no mínimo de 100 g de produto viável para análise microbiológica e 200 g quando se destina a análise bromatológica completa. Para diagnóstico de surto, como para análise fiscal, uma amostra apenas não é suficiente, havendo necessidade de coleta de amostras em número compatível com o lote ou quantidade de alimentos embalados. Devem ser coletadas amostras na superfície e no centro geométrico de alguns lotes de alimentos industrializados que sejam compatíveis com a produção do produto em teste.

Evitar a multiplicação dos microrganismos durante o armazenamento

Evitar a multiplicação dos microrganismos durante o transporte

51

•

•

Coletar um número representativo de amostras

•

4.2 TIPOS DE AMOSTRAS______________________________________ Amostras Líquidas Água potável da torneira As coletas de água são geralmente realizadas em frascos com volume de 100 ml, que por sua vez devem ser limpos esterilizados e tampados. Previamente

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deve ser averiguado se a água foi adicionada de cloro, pois nesse caso, o frasco além de esterilizado, deve conter em seu interior 1 ml de tiossulfato de sódio para promover a eliminação da influência do cloro.

Figura 47 – Coleta de água

Metodologia É necessário frasco estéril (ou sacos estéreis), lamparina, álcool a 70 % ou álcool-gel, algodão, pinça metálica, caixa isotérmica e gelo. •

Passar um chumaço de algodão umedecido com álcool a 70% ou álcool-gel em

torno da abertura da torneira; •

Esperar alguns minutos para o álcool evaporar;

•

Flambar o tubo ou frasco, empregando a lamparina;

•

Abrir a torneira e deixar a água fluir por 2-3 minutos;

•

Coletar aproximadamente 200ml;

•

Flambar novamente o frasco e repor a tampa ou tampão;

•

Colocar a caixa isotérmica com gelo e transportar para o laboratório;

•

Se a análise não for realizada no mesmo dia, a amostra deve ser mantida sob

refrigeração; •

Quando sob refrigeração, a amostra deve ficar em repouso até atingir a

temperatura ambiente.

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CUIDADOS ESSENCIAIS Em caso de torneira ou bomba, deixar correr as primeiras águas; Flambar a torneira com chama de álcool; Não tocar com os dedos na parte da rolha que fica no interior do vidro; O exame bacteriológico deve ser feito o mais rápido possível. As amostras devem ser conservadas à temperatura de 6 a 10º (refrigerador) para evitar o crescimento da quantidade de micróbios. O tempo máximo permitido entre a coleta da amostra e o exame no laboratório é de 06 (seis) horas, isto para água pouco poluída.

Sucos e bebidas envasados

Quando o produto é industrializado e encontra-se exposto em prateleira, proceder à amostragem de duplicata, de um mesmo lote. Identificar cada amostra com a hora da coleta, data, procedência, número do lote e nome do responsável pela coleta. Transportar as amostras ao laboratório, uma amostra será analisada e a outra servirá de contraprova. Sucos preparados e prontos para beber, caldo de cana similares. Coletar a amostra utilizando frasco estéril, encher o frasco até 2/3 do volume total. Flambar o frasco e fechar. Acondicionar em caixa isotérmica com gelo e transportar ao laboratório. Identificar as amostras com o dia, hora da coleta, local onde foi coletada, e nome de quem realizou a coleta.

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Amostras Sólidas

Porções de alimentos prontos para consumo Coletar as amostras em separado de cada componente, no setor de distribuição. Acondicionar o alimento em saco plástico estéril e transportar para o laboratório sob refrigeração em caixa isotérmica com gelo. Identificar a amostra com o nome do estabelecimento, hora da coleta, data e nome do responsável.

Salgados e Similares Os produtos como coxinhas, pastéis e similares devem ser expostos à comercialização em estufa e sob temperatura controlada. Deve-se recolher o salgado em aleatoriamente com luvas e acondicioná-lo em saco plástico, transportando-o para o laboratório sob refrigeração em caixa isotérmica com gelo.

Peças de carne

Neste caso, retiram-se pequenas porções de vários pontos da peça de carne, de modo a perfazer 200g do produto. Acondicioná-la em saco plástico e transportar sob refrigeração em caixa isotérmica com gelo.

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Superfícies de contato

Bancadas, superfícies de equipamentos Metodologia Empregar a técnica de superfície, utilizando-se dos seguintes materiais: molde, swab e diluente água peptonada. •

Preparar tubos de ensaio contendo 10ml de diluente – água peptonada;

•

Tamponar;

•

Esterilizar em autoclave a 121ºC por 15 minutos;

•

Esterilizar o molde em estufa a 180º C por 1 a 2 horas;

•

Fixar o molde sobre a superfície;

•

Umedecer o swab no tubo com diluente a transportar ao laboratório o mais rápido possível;

•

Colocar o swab no tubo com diluente e transportar ao laboratório o mais rápido possível, sob refrigeração;

Utensílios (garfos, faca, colher, etc) Metodologia • Em um saco plástico estéril, adicionar 100ml de diluente – água peptonada; • Colocar o utensílio dentro do saco;

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• Fechar o saco e acondicionar em caixa isotérmica com gelo; • Transportar ao laboratório; • Friccionar o material e preparar as diluições decimais.

EXERCÍCIOS

Exercício n0 ____

Assunto: __________________

1. Relate sobre a coleta de amostras, sobre a sua importância para os resultados da análise.

2. Na coleta de água, representada na figura ___ identifique possíveis erros durante a técnica que pode levar a contaminação da mesma.

3. O que há em comum nas técnicas de coleta de bancadas, superfícies de equipamentos e utensílios?

4. Suponha que você fará análises microbiológicas a fim de avaliar as condições higiênicas de um determinado alimento. Escolha um alimento e descreva os passos para coletá-lo com segurança identificando os riscos de contaminação e os cuidados para combatê-los.

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MEIOS DE CULTURA Capítulo 5 5.1 DESCRIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA____________________________ Os meios de cultura são preparações sólidas, líquidas ou semi-sólidas que contêm todos os nutrientes necessários para o crescimento de microrganismos, são utilizados com a finalidade de cultivar e manter microrganismos viáveis no laboratório, sob a forma de culturas puras. Os meios de cultura devem ter na sua composição, os nutrientes indispensáveis ao crescimento do organismo em questão, sob forma assimilável e em concentração não inibitória do crescimento. Além disso, após a sua preparação, cada meio de cultura deve ser submetido a esterilização, por forma a eliminar qualquer organismo vivo contaminante. Por outro lado, para manter uma cultura pura, é necessário que o meio de cultura que se pretende utilizar seja mantido desprovido de qualquer organismo vivo contaminante. Para a prevenção de contaminações durante a manipulação de culturas puras recorre-se a técnicas de assepsia. De um ponto de vista geral, os meios de cultura podem ser classificados tendo em conta o seu estado físico, a sua composição química e os objetivos funcionais a que se destinam. A especificidade dos meios de cultura é muito importante, nomeadamente no isolamento e identificação de certos microrganismos (por exemplo, no isolamento de microrganismos do solo) ou em testes de sensibilidade a antibióticos ou na análise microbiológica de águas, de alimentos, etc.

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5.2 CLASSIFICAÇÃO FUNCIONAL DOS MEIOS DE CULTURA_____________ Os meios de cultura podem ser usados na seleção e crescimento de um determinado microrganismo ou na identificação de uma espécie em particular. Desta forma, a função de um dado meio depende da sua composição. O isolamento de uma determinada estirpe microbiana pode ser feito por meio do recurso e/ou combinação dos seguintes tipos de meios: Meios

seletivos:

suprimem

o

crescimento

de

determinados

microrganismos em benefício de outros. Exemplo: meio seletivo para pesquisa de coliformes, utilizado na análise microbiológica de águas: os meios complexos que permitem o isolamento de coliformes (enterobactérias Gram negativas) são suplementados com sais biliares ou com o sal lauril-sulfato de sódio, que atuam como agentes inibidores do crescimento de bactérias Gram positivas. Meios diferenciais: permitem a distinção entre diferentes grupos de microrganismos com base na capacidade de metabolizar componentes específicas do meio de cultura ou na morfologia (aparência) das colônias. Permitem, por vezes, a identificação de microrganismos com base nas suas características biológicas. Exemplo: meio Agar de sangue, que permite a distinção entre bactérias hemolíticas e não hemolíticas. O padrão de hemólise (dos glóbulos vermelhos de sangue) no meio agar de sangue permite distinguir bactérias, tais como

Streptococcus pyogenes (causadora de faringite) que causa a lise completa dos glóbulos ermelhos do sangue produzindo halos transparentes à volta das colônias,

Streptococcus mutans (causa cárie dentária), que não é hemolítica, e Streptococcus pneumoniae (causadora de pneumonia bacteriana) que lisa parcialmente os glóbulos vermelhos do sangue.

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59

5.3 CARACTERÍSTICAS DE ALGUNS INGREDIENTES COMPLEXOS________ a) Extrato de carne Características: Extrato aquoso de tecido muscular, concentrado sob a forma de pasta ou pó. Valor nutritivo: Contêm substâncias solúveis dos tecidos animais, incluindo carboidratos, compostos orgânicos de nitrogênio, vitaminas hidrossolúveis e sais. b) Peptona Características: Produto que resulta da digestão de materiais protéicos como carne, caseína e gelatina: a digestão protéica é feita por meio de ácidos ou enzimas. Valor nutritivo: Principal fonte de nitrogênio orgânico: pode conter vitaminas e, às vezes carboidratos. c) Ágar Características: Carboidrato complexo, obtido de certas algas marinhas e tratado para a remoção de substâncias estranhas. Usado como agente solidificante dos meios, ele gelifica quando a temperatura é reduzida a menos de 45 oC. Valor nutritivo: Não é fonte nutritiva. d) Extrato de leveduras Características: Extrato aquoso de leveduras. Valor nutritivo: Rico em vitamina B. e) Extrato de malte Características: Extrato aquoso de cevada mateada. Valor nutritivo: Rica em carboidratos, contém material nitrogenado, vitaminas e sais minerais.

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5.4. METODOLOGIA_________________________________________ Em geral, para os meios de cultura comercializados na forma de pó, devese: o Ler o rótulo do meio de cultura que será utilizado.

Figura 48 – Leitura do rótulo do meio de cultura

o Calcular a proporção de pó para quantidade de água destilada conveniente. o Pesar o meio desidratado em balão ou Erlenmeyer mantendo-o sempre tampado.

Figura 49 – Pesagem do meio de cultura

o Acrescentar a água destilada em quantidade adequada. o Tamponar e esterilizar conforme a indicação do rótulo.

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Obs: Os meios de cultura que contém agar devem ser dissolvidos em banhomaria ou bico de Bunsen antes de ser esterilizados. Já os caldos antes de ser esterilizados devem ser distribuídos nos tubos, assim como os diluentes em seus frascos. Alguns meios de cultura precisam ainda ser adicionados de algumas substâncias, nestes casos, proceder conforme indicação no rótulo. 5.5 EXEMPLOS DE FÓRMULAS DE UM MEIO DE CULTURA_______________ a) Ágar Padrão para Contagem (PCA = Plate Count Agar) Tiptona .........................................5g Extrato de leveduras ................2,5g Glicose ...........................................1,0g Ágar .............................................15,0g Água destilada .............................1000 mL

Suspender os componentes na água destilada. Ferver até a dissolução do material. Ajustar o pH em 7,0. Distribuir em frascos apropriados e autoclavar por 15 min a 121oC. b) Caldo Simples ou caldo nutriente Extrato de carne ....................3,0g Peptona ......................................5,0g Água destilada .........................1,0 L

Suspender os componentes na água destilada. Ferver até a dissolução do material. Ajustar o pH em 7,0. Distribuir em frascos apropriados e autoclavar por 15 min a 121oC.

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EXERCÍCIOS

Exercício n0 ____

Assunto: __________________

1. Qual a importância da escolha do meio de cultura a ser utilizado conforme o tipo de análise microbiológica desenvolvida?

2. Pesquise três meios de cultura diferentes descrevendo sobre os principais componentes de sua fórmula e a finalidade do uso.

3. Relate as etapas do preparo de um meio de cultura que contém agar.

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CONTAGEM PADRÃO DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS Capítulo 6 6.1 CONTAGEM PADRÃO EM PLACAS_______________________________ PLACAS A contagem padrão em placas é utilizada tanto para a quantificação de grandes

grupos

microbianos,

como

os

aeróbios

mesófilos,

os

aeróbios

pscicrotróficos, os bolores e leveduras, entre outros. O procedimento básico é a inoculação da amostra homogeneizada (de suas diluições) em um meio sólido (com agar), contido em placas de Petri, seguida da incubação das placas até o crescimento visível. A contagem Total de Aeróbios Mesófilos em placas, também denominada Contagem Padrão em Placas, é o método mais utilizado como indicador geral de populações bacterianas em alimentos. Não diferencia tipos de bactérias, sendo utilizada para se obter informações gerais sobre a qualidade de produtos, práticas

de

manufaturas,

matérias-primas

utilizadas,

condições

de

processamento, manipulação e vida de prateleira. Não é um indicador de segurança, pois não está diretamente relacionado à presença de patógenos ou toxinas. Dependendo da situação, pode ser útil na avaliação da qualidade, porque populações altas de bactérias podem indicar deficiências na sanitização ou falha no controle do processo ou dos ingredientes. Os produtos fermentados, ao contrário, apresentam populações naturalmente altas de mesófilos, sem qualquer relação com a qualidade. A contagem pode ser feita utilizando-se os métodos de plaqueamento em profundidade (pour plate), superfície (spread plate) e filtração em membrana.

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6.2 MATERIAL NECESSÁRIO____________________________________ { Vidraria { Equipamentos: 1 Erlenmeyer;

balança semi-analítica;

3 frascos de diluição;

estufa bacteriológica;

3 placas de petri.

autoclave;

{

Acessórios

pipetador automático;

contador de colônias. o Meio de cultura:

ponteiras descartáveis;

Agar Nutrient, Plate Count

alça de Drigalski;

Agar ou Agar Muller Hinton.

tesoura e pinça; etiquetas; bico de Bunsen. 6.3 METODOLOGIA_____________________________________________ A quantificação de bactérias aeróbias mesófilas em alimentos é feita pelo método de contagem padrão em placas, determinando-se o número de unidades formadoras de colônias (UFC). Para procedimento da análise deve-se higienizar a bancada e dispor o material, codificar as placas e os frascos de diluição e realizar diluições, para então transferir com o pipetador automático 1ml de cada um dos fracos de diluição para as respectivas placas de Petri codificadas.

Em seguida deve-se

verter em cada placa 15-20 mL do meio de cultura, homogeneizar com movimentos em forma de oito ou circular e deixar as placas sobre a bancada até completa solidificação do meio. Após realização da análise, deve-se incubar a 3537°C por 48 horas. Após esse período, realizar a contagem com auxílio do contador de colônias. A metodologia descrita abaixo é utilizada para amostra sólida, mas se for líquida o que diferenciará é que a primeira diluição será a 100

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que será a própria amostra, as demais diluições proceder como no esquema abaixo: Contagem em Placas de bactérias aeróbias mesófilas 1mL

1 mL

1 mL

1 mL

10-1

+ 25 g 25 gr

225 mL água de peptona 10-2

1mL

1 mL

10-3

10-4

1 mL

10-5

1 mL

1 mL

Duplicata

Meio de cultura: Agar Nutrient, Plate Count Agar ou Agar Muller Hinton Incubação: a 35-37 ºC por 48 horas

Após o período de incubação

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Após incubação Contagem de placas com 30-300 UFC Figura 50 – Esquema da metodologia para contagem de bactérias aeróbias mesófilas (Imagens cedidas por Carlos Eduardo/Nutricionista/DN/UFPB)

6.4 LEITURA _________________________________________________ Selecionar as placas com 30 a 300 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias. Calcular o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por grama ou mililitro da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada. Caso tenham sido utilizadas duas placas por diluição (duplicata) considerar como número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata. 6.5 RESULTADO ______________________________________________ Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula, na apresentação dos resultados. Para calcular o número de UFC/g ou ml de bactérias, multiplicar o número de colônias por dez e pelo inverso da diluição. Para a interpretação dos resultados deve-se pesquisar nas normas existentes para o alimento avaliado quanto aos valores de referência.

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EXERCÍCIOS

1 O que a contagem de bactérias aeróbias mesófilas avalia?

2 Quais métodos utilizados para análise desse microrganismo?

3 Qual o período e temperatura de incubação para crescimento desse microrganismo?

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CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS Capítulo 7 7.1 BOLORES E LEVEDURAS ____________________________________ Os bolores e leveduras constituem um grande grupo de microrganismos, a maioria originária do solo ou do ar. Os bolores são extremamente versáteis, a maioria das espécies capaz de assimilar qualquer fonte de nitrogênio, podendo utilizar nitrato, os íons de amônia e o nitrogênio orgânico. Entretanto, se for necessário utilizar proteínas ou aminoácidos como fonte de nitrogênio ou de carbono, várias espécies vão apresentar um crescimento limitado. As leveduras, de maneira geral, são mais exigentes do que os bolores. Muitas são incapazes de assimilar nitrato e carboidratos complexos, algumas exigem vitaminas e outras, como Zygosaccharomyces bailli, por exemplo, não conseguem utilizar a sacarose como única fonte de carbono. Esses fatores, de certa forma, limitam a gama de alimentos susceptíveis à deterioração por leveduras. Os bolores e leveduras são também bastante resistentes às condições adversas, como pH ácido e atividade de água baixa. A maioria das leveduras apresenta atividade de água mínima de crescimento na faixa de 0,88 e a maioria dos bolores na faixa de 0,80. Os bolores e leveduras capazes de crescer em atividades de água abaixo do limite de 0,85 são chamados de xerofílicos, e aqueles que crescem em altas concentrações de sal são chamados halofílicos. Com relação ao pH, os fungos são muito pouco afetados pela variação na faixa de 3,0 a 8,0. Vários bolores crescem abaixo de 2,0 e diversas leveduras abaixo de 1,5. Entretanto, quando o pH afasta-se do ótimo (geralmente próximo de 5,0) a velocidade de crescimento diminui e, se houver outros fatores de inibição (atividade de água, temperatura, etc.), seu efeito restritivo sobre a velocidade de crescimento torna-se mais acentuado.

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A temperatura ótima de crescimento da maioria dos fungos encontra-se na faixa de 25 a 28 ºC, não crescendo bem nas temperaturas mesófilas (35-37 ºC) e raramente nas temperaturas de bactérias termotolerantes (45 ºC). Seu crescimento não é incomum sob condições de refrigeração (5 ºC), porém, abaixo de 10 ºC negativos os alimentos podem ser considerados microbiologicamente estáveis. Os bolores deteriorantes de alimentos, com quase todos os outros fungos filamentosos, exigem oxigênio para crescimento, podendo ser considerados aeróbios estritos. No entanto, várias espécies, são eficientes em utilizar pequenas quantidades de oxigênio, de forma que o efeito do O2 é dependente da quantidade absoluta dissolvida no substrato, e não da concentração presente na atmosfera. Ao contrário dos bolores, muitas espécies de leveduras são capazes de crescer na completa ausência de O2 e em diferentes concentrações de CO2. Isso as torna os deteriorantes mais comuns de alimentos líquidos engarrafados, nos quais o crescimento dos bolores é limitado pela disponibilidade de oxigênio. A consistência do alimento, assim como a atmosfera de armazenamento, exerce uma considerável influência sobre os tipos de fungos que irão provocar a deterioração do produto. Em linhas gerais, as leveduras predominam em alimentos líquidos, porque são unicelulares e se dispersam mais facilmente em líquidos. Além disso, substratos líquidos oferecem maior oportunidade para desenvolvimento

de

condições

anaeróbias,

ideais

para

as

leveduras

fermentativas. Os bolores, ao contrário, são favorecidos por substratos sólidos firmes, em cuja superfície há fácil acesso ao oxigênio. Por outro lado, essa afirmação não dever ser entendida como absoluta, sugerindo que leveduras não possam deteriorar alimentos sólidos ou bolores alimentos líquidos. Simplesmente, as leveduras são mais competitivas em líquidos, provocando alterações percebidas mais fácil ou rapidamente.

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7.2 MATERIAL NECESSÁRIO___________________________________ { Vidraria { Equipamentos: 1 erlenmeyer; balança semi-analítica; 3 frascos de diluição; estufa bacteriológica a 25ºC; 3 placas de petri. autoclave; {

Acessórios

contador de colônias.

pipetador automático; ponteiras descartáveis; alça de Drigalski; tesoura e pinça;

{

Meio de cultura:

Potato Dextrose Agar ou Sabouraud; Diluente: água peptonada 0,1 %

etiquetas; bico de Bunsen. 7.3 METODOLOGIA____________________________________________ A quantificação de bolores e leveduras em alimentos é feita pelo método de contagem padrão em placas, determinando-se o número de unidades formadoras de colônias (UFC). A técnica mais recomendada é o plaqueamento em superfície (spread plate), pois aumenta a exposição ao oxigênio, evita o “stress” causado pelo meio de cultura quente, permite uma visualização morfológica e diferencial, além de facilitar a transferência de colônias. Para procedimento da análise deve-se higienizar a bancada e dispor o material, codificar as placas e os frascos de diluição e realizar diluições. Em seguida, deve-se verter em cada placa 15-20 mL do meio de cultura e aguardar para a solidificação deste, para então transferir com o pipetador automático 0,1 mL de cada um dos fracos de diluição para as respectivas placas de Petri codificadas. Após realização da análise, deve-se incubar a 25°C por 3 a 5 dias no

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escuro e sem inverter. Após esse período, realizar a contagem com auxilio do contador de colônia. Contagem em Placas de bolores e leveduras Amostra sólida 1mL

1 mL

1 mL

1 mL

10-1

+

25g 10-2

225 mL água de peptona

1mL

10-3

1 mL

10-4

1 mL

10-5

1 mL

Duplicata

Meio de cultura: Potato Dextrose Agar ou Sabouraud Incubação: 25 ºC por 3 a 5 dias

Após o período de incubação

1 mL

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Figura 51 – Esquema da metodologia para contagem de bolores e leveduras (Fotos cedidas por Carlos Eduardo/Nutricionista/CCS/UFPB)

7.4 LEITURA ________________________________________________ O meio de cultura utilizado para promover o crescimento desse tipo de microrganismo pode conter o cloranfenicol que inibe bactérias, a dicloran e rosa de bengala para restringir o espalhamento da colônia e o glicerol que reduz a atividade de água do meio. Para a contagem de colônias e cálculo dos resultados, selecionar as placas com 25 a 250 UFC/g ou mL com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias. Na placa selecionada, contar separadamente as colônias com aspecto filamentoso, cotonoso ou pulverulento, características de bolores, anotando o resultado. Na mesma placa, contar as demais colônias, que podem ser de leveduras ou de bactérias, eventualmente capazes de crescer. Selecionar pelo menos cinco dessas colônias e verificar a morfologia das células ao microscópio, observando se a cultura é de leveduras, bactérias ou mistura de ambas. Para isso, pode ser feita uma montagem úmida ou uma coloração de Gram, conforme procedimento descrito no Capítulo 5. Considerar como confirmadas todas as colônias que

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apresentarem levedura ou mistura de leveduras e bactérias. Determinar o numero de colônias de leveduras na placa em função da porcentagem confirmada. 7.5 RESULTADO ______________________________________________ O cálculo dos resultados deve ser feito pelo número de UFC/g ou ml de bolores, multiplicar o número de colônias típicas de bolores por dez e pelo inverso da diluição. Para calcular o número de UFC/g ou ml de leveduras, multiplicar o número de colônias confirmadas como leveduras por dez e pelo inverso da diluição. Para calcular o número total de bolores e leveduras, somar o número de colônias bolores e o número de colônias confirmadas como leveduras e multiplicar por dez e pelo inverso da diluição. Exemplo: -Diluição 10-2 (inoculados 0,1 mL) -Total de colônias típicas de bolores na placa = 30 - Colônias presuntivas de levedura na placa = 40, cinco submetidas à confirmação, quatro confirmadas (80 %) -Total de colônias de levedura na placa = 40x0,8 = 32 -UFC/g ou mL de bolores = 30x102x10 = 3,0x104 - UFC/g ou mL de leveduras = 32x102x10 = 3,2x104 -UFC/g ou mL de bolores e leveduras = (30 + 32)x102x10 = 6,2x104

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EXERCÍCIOS

1

Em que condições adversas os bolores e leveduras são considerados resistentes?

2 Qual a consistência do alimento em que predomina bolores e leveduras? Justifique.

3 Qual a técnica mais recomendada para análise desses microrganismos? Justifique sua resposta

4 O que a contagem de bolores e leveduras avalia?

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ENUMERAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES

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Capítulo 8

8.1 CARACTERIZAÇÃO DO GRUPO COLIFORMES_____________________ No grupo dos coliformes totais estão apenas as enterobactérias capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas a 35 ºC. Mais de 20 espécies se encaixam nessa definição, dentre as quais encontrando-se tanto bactérias originárias do trato gastrintestinal de humanos e outros animais de sangue quente (Escherichia coli), com também bactérias não entéricas (espécies de Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella e Serratia, dentre outras). A capacidade de fermentar a lactose pode ser verificada pela formação de gás e/ou ácido, nos meios de cultivo contendo lactose. Essas características são utilizadas nos métodos tradicionais de contagem de coliformes totais. Os métodos mais modernos detectam diretamente a atividade da enzima βgalactosidase, envolvida no metabolismo fermentativo da lactose, incorporando substratos para a enzima nos meios de cultivo. O grupo dos coliformes termotolerantes, comumente chamados de coliformes fecais, é um subgrupo dos coliformes totais, restrito aos membros capazes de fermentar a lactose em 24 horas a 44,5-45,5 ºC, com produção de gás. Essa definição objetivou, em princípio, selecionar apenas as enterobactérias originárias do trato gastrintestinal (E. coli), porém, atualmente sabe-se que o grupo inclui membros de origem não fecal. Em função dissoo termo fecal tem sido gradativamente, substituído por coliformes termotolerantes. As principais aplicações das enterobactérias e coliformes são como indicadores das condições de higiene dos processos de fabricação, porque são facilmente inativados pelos sanitizantes e capazes de colonizar vários nichos das plantas de processamento, quando a sanitização é falha. Os coliformes são

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indicadores de falha de processo onde contaminação pós-processo em alimentos pasteurizados, porque são facilmente destruídos pelo calor e não devem sobreviver no tratamento térmico. E. coli é indicador de contaminação fecal em alimentos “in natura” (mas não em alimentos processados).

8.2 MATERIAL NECESSÁRIO____________________________________ {

Vidraria

{

Equipamentos:

9 tubos de ensaio;

estufa bacteriológica;

9 tubos de Durham.

autoclave.

{

Meio de cultura:

{

Acessórios

Caldo Lactose Bile Verde Brilhante

pipetador automático;

(CLBVB)

ponteiras descartáveis; estante para tubos; alça de platina; etiquetas; bico de Bunsen

8.3 METODOLOGIA____________________________________________ Para procedimento da detecção de coliformes totais a 35 º C faz-se os testes presuntivo e confirmativo. Para a realização das análises deve-se higienizar a bancada e dispor o material, codificar os tubos e os frascos de diluição e realizar diluições, para então transferir com o pipetador automático 1ml de cada um dos fracos de diluição para os respectivos tubos de ensaio codificados (série de três tubos para cada diluição) e homogenizar os tubos de ensaio após inoculação. Em seguida, incubar os tubos a 35 ou 37 °C por 48 h. Após esse período, realizar a leitura observando a produção de gás retido no tubo de Durhan.

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Enumeração dos Coliformes a 35 0C: Amostra Líquida I Teste Presuntivo

1 mL

1 mL

100

Líquido

10-1 1 mL

100

1 mL

10-1

10-2 1 mL

10-2

Meio de cultura: Caldo Lactose ou Lauryl Sulfato Incubação a 35-37 0C por 48 horas 1 mL

100

II teste confirmativo 1 mL

10-1

1 mL

10-2

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Meio de cultura: Caldo Lactose Bile Verde Brilhante 2% Incubação: 35 – 37 ºC por 48 horas Figura 52 – Esquema da metodologia dos testes presuntivo e confirmativo para enumeração de coliformes totais

Enumeração dos Coliformes Termotolerantes (a 45 0C)

Tranferir uma alçada do CLBVB positivo para Caldo EC

Meio de cultura: Caldo Escherichia coli (EC) Incubação a 45 0C por 24 horas Figura 53 – Esquema da metodologia para enumeração de coliformes termotolerantes (Fotos cedidas por Carlos Eduardo/Nutricionista/CCS/UFPB)

Obs.: No caso de amostras sólidas proceder com a primeira diluição sendo a 10-¹

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8.4 LEITURA _________________________________________________ As características a serem consideradas como indicação da presença dos microrganismos alvo são: crescimento e produção de gás. O crescimento é verificado pela turvação do meio de cultura, desde que não provocada pela própria amostra. Nesse segundo caso, pode ser necessário um procedimento alternativo para confirmar o crescimento. Portanto, transfere-se uma alçada o caldo suspeito para um novo tubo do mesmo meio e verifica-se a turvação confirma-se o crescimento do primeiro. A produção de gás pode ser verificada pela formação de bolhas em turvos invertidos (tubos de Durhan), colocados nos tubos de caldo antes da esterilização.

Figura 54 – Tubos contendo Caldo Lactose Bile Verde Brilhante (CLBVB) positivos

8.5 RESULTADO ______________________________________________ A contagem de coliformes totais e termotolerantes é realizada respectivamente, a partir da contagem de tubos de CLBVB e EC, com crescimento e produção de gás, confirmativos da presença de coliformes totais e termotolerantes. Determinar o NMP/g ou mL usando uma das tabelas de NMP.

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EXERCÍCIOS

1 Cite gêneros de bactérias do grupo coliformes totais:

2 O que indica a contaminação por coliformes totais e termotolerantes?

3 Qual característica encontrada na contagem de coliformes totais?

80

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CONTAGEM, ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA. Capítulo 9

9.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA____

As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram-positivos anaeróbios

facultativos.

Este

gênero

é

formado

por

32

espécies

e

Staphylococcus aureus é a mais relacionada a surtos de intoxicação alimentar, devido à capacidade de produzir enterotoxina. Os estafilococos são bactérias mesófilas apresentando temperatura de crescimento na faixa de 7 a 47,8 °C e as enterotoxinas são produzidas entre 10 e 46 °C, contudo a temperatura ótima está entre 40 e 45 °C. As bactérias desse gênero são tolerantes a concentrações de 7 a 20 % de sal e a nitratos. Em relação ao pH, S. aureus cresce na faixa de 4 e 9,8 e em atividade de água mínima de 0,86. Os Estafilococos são amplamente difundidos na natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves. O principal reservatório, no homem, são as fossas nasais. A incidência nesta área é tamanha, que parece ser impossível sua eliminação. Ele é um microrganismo oportunista encontrado como microbiota das membranas mucosas (bucal, nasal e oral) em seres humanos. Porém, cerca 50 % das pessoas sadias são portadoras de S.

aureus nas fossas nasais e garganta. Os fatores que mais predispõem à contaminação vêm da inadequada manipulação dos produtos, resultando em contaminação cruzada na exposição dos mesmos a temperaturas adequadas ao crescimento bacteriano. Cepas de S.

aureus enterotoxigênicas podem ser encontradas nos alimentos a partir de sua obtenção primária, especialmente alimentos de origem animal. O alimento é contaminado também durante o processamento, a partir de manipuladores e a

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82

manipulação inadequada dos alimentos por portadores da bactéria ou por pessoas com ulcerações nos braços e nas mãos, constitui-se na principal fonte de contaminação dos alimentos por estafilococos. As doenças causadas por toxinas apresentam amplo espectro de manifestações clínicas, como celulite, síndrome da pele escaldada, síndrome do choque tóxico e intoxicação alimentar. Staphylococcus aureus é uma bactéria patogênica que, freqüentemente, acomete pacientes hospitalizados, associandose a morbidades e mortes. Os sintomas da intoxicação estafilocócica aparecem geralmente dentro de quatro horas após a ingestão dos alimentos contaminados. Os sintomas (náusea, cãibras abdominais, diarréia, dor de cabeça, sudorese, prostração, e, algumas vezes, uma queda na temperatura corporal) geralmente têm duração de 24 a 48 horas, e a taxa de mortalidade é bastante baixa ou nula. O tratamento usual para pessoas saudáveis consiste em repouso e manutenção do balanço de fluidos.

9.2 MATERIAL NECESSÁRIO____________________________________ o Vidraria 3 placas de petri.

o Equipamentos: balança semi-analítica; estufa bacteriológica;

o Acessórios pipetador automático;

autoclave; contador de colônias.

ponteiras descartáveis; alça de Drigalski;

o Meio de cultura:

tesoura e pinça;

Agar Vogel Johnson ou

etiquetas;

Agar Baird Parker

bico de Bunsen. o Reagentes Telurito de Potássio a 20%;

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9.3 METODOLOGIA____________________________________________ Diluir 25 g da amostra em 225 mL de água de peptona tamponada 0,1 % e homogeneizar por três minutos, correspondendo a diluição 10-1. A partir desta suspensão, transferir 1 mL para um frasco contendo 9 mL de água de peptona tamponada 0,1% obtendo a diluição 10-2, e assim sucessivamente até a diluição 10-5. Em seguida, transferir com o auxílio de um pipetador automático e ponteiras descartáveis 0,1 mL de cada diluição para placas de Petri contendo Agar Vogel Johnson adicionado solução de telurito de potássio. Realizar espalhamento com alça de Drigalsky e incubar a 35 °C por 48 h. Isolar as colônias as colônias típicas em Agar Nutriente inclinado a 35 °C por 24 h, em seguida inocular uma alçada da cepa em caldo BHI e incubar a 35 °C por 24 h. Após esse período realizar o teste da coagulase. Transferir 0,2 mL da cultura do BHI e 0,5 mL de plasma para um tubo estéril, homogeneizar e incubar no banho-maria por 4-12 h por 37 °C.

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Contagem de Estafilococos coagulase positiva 1mL

1 mL

1 mL

1 mL

10-1

+ 25 g

225 ml de água de peptona 0,1mL

10-2

10-3

0,1 mL

0,1 mL

10-4

10-5

0,1mL

Duplicata

Agar Vogel-Johnson adicionado de Solução de telurito de potássio Incubar a 35-37 0C por 48 h Após o período de incubação

1 2 3 1=2 Colônias típica de Staphylococcus aureus 3= S. epidermidis

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Isolamento das colônias suspeitas

Colônias típicas Agar Nutrient inclinado (35 °C/24 h) Caldo BHI (35 °C/24 h)

Teste da Coagulase

Caldo BHI

Coagulase

Teste da coagulase positivo - Nível ++++ Figura 55 – Esquema da metodologia para contagem, isolamento e identificação de Estafilococos coagulase positiva (Fotos cedidas por Carlos Eduardo/Nutricionista/CCS/UFPB)

9.4 LEITURA ________________________________________________ {

Contagem em placas Após o período de incubação, observar o aspecto das colônias.

Staphylococcus aureus (coagulase positiva) apresenta colônias de coloração negra em função da redução do telurito de potássio e halo amarelo, às vezes até a placa inteira, devido à utilização do manitol pelo microrganismo. Ao identificar as colônias típicas, realizar a contagem das colônias nas placas que apresentarem número de colônias entre 25 e 250, a raiz quadrada do número obtido deve ser a quantidade de colônias a ser submetida ao teste da coagulase.

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{

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Teste da coagulase

Após 4 horas da realização do teste da coagulase observar se houve a formação dos coágulos, se não houver a formação do coágulo, aguardar 12 horas para fazer a leitura novamente. Por fim observar o número de colônias coagulase positivas e seus níveis. 9.5 RESULTADO ______________________________________________

UFC/g = n° de colônias típicas x D x % de colônias coagulase positiva x F D = diluição F = fator

10 se o inóculo foi de 0,1 mL 05 se o inóculo foi de 0,2 mL

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EXERCÍCIOS Exercício n0 ____ 1

Estafilococos

Assunto: __________________ coagulase

positiva

é

considerado

um

microrganismo

toxigênico ou infeccioso?

2

Quais os alimentos mais envolvidos em surtos de doenças de origem

alimentar causadas por este enteropatógeno?

3 Qual a importância de sua detecção em alimentos?

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CONTAGEM EM PLACAS DE BACILLUS CEREUS Capítulo 10 10.1 CARACTERIZAÇÃO DO GÊNERO BACILLUS CEREUS______________

As bactérias pertencentes ao gênero Bacillus compreendem um grande número de espécies, estando relatadas, até o momento 48 espécies diferentes. Dentro do gênero Bacillus sp., a espécie Bacillus cereus tem grande importância em saúde pública em virtude do potencial perigo devido à produção de toxinas durante o armazenamento do produto após envasado. O Bacillus cereus é um microrganismo Gram-positivo, aeróbio, mesófilo, produtor de esporos, amplamente distribuído na natureza, sendo o solo seu reservatório natural. Multiplica-se bem entre 10 e 48 °C, apresentando um ótimo de temperatura entre 28 e 35 °C. A atividade de água necessária para seu crescimento é 0,95, sendo seu crescimento bastante reduzido quando a concentração de Na Cl do meio é 7,5 %. A faixa de pH em que ocorre multiplicação varia de 4,9 a 9,3.

Bacillus cereus são geralmente isolados a partir de produtos crus e processados, como arroz, condimentos, vegetais, preparações cárneas e laticínios. A presença desse patógeno ou de seus esporos em alimentos é relativamente freqüente e a indústria de alimentos encontra dificuldades para eliminar o microrganismo do ambiente industrial. O Bacillus cereus pode causar duas formas distintas de gastrenterites: a síndrome diarréica e a síndrome emética.

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10.2 MATERIAL NECESSÁRIO___________________________________ {

{

Vidraria 3 placas de petri.

estufa bacteriológica; autoclave; contador de colônias.

Acessórios pipetador automático;

{

ponteiras descartáveis;

Meio de cultura: Agar Manitol gema de ovo

alça de Drigalski;

polimixina

tesoura e pinça; etiquetas; bico de Bunsen {

{

Reagentes Gema de ovo a 50 %.

Equipamentos: balança semi-analítica;

10.3 METODOLOGIA___________________________________________

Diluir 25 g da amostra em 225 m de água de peptona tamponada 1 % e homogeneizar por três minutos, correspondendo a diluição 10-1. A partir desta suspensão, transferir 1 ml para um frasco contendo 9 ml de água de peptona tamponada 1% obtendo a diluição 10-2, e assim sucessivamente até a diluição 10-5. Em seguida, transferir com o auxílio de um pipetador automático e ponteiras descartáveis 0,1 ml de cada diluição para placas de Petri contendo Agar Manitol gema de ovo polimixina adicionado de gema de ovo 50 %. Realizar espalhamento com alça de Drigalsky e incubar a 30 °C por 18 h. Isolar as colônias as colônias típicas em Agar Nutrient inclinado a 35 °C/24 h, em seguida submeter as cepas aos testes bioquímicos:

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o Teste de utilização anaeróbia da glicose; o Teste de decomposição da tirosina; o Teste de Voges-Proskauer; o Teste de redução do nitrato; o Teste de hidrólise da gelatina; o Teste de resistência a lisozima; o Teste de coloração de cristais de toxina intracelulares; o Teste de motilidade; o Teste de crescimento rizóide; o Teste da atividade hemolítica. 1mL

1 mL

1 mL

1 mL

10-1

+ 25 g

225 ml de água de peptona

0,1mL

10-2

10-3

0,1 mL

10-4

0,1 mL

Duplicata

Agar Manitol Gema de Ovos- Polimixina Incubação a 30 0 C por 18-24 horas

10-5

0,1mL

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Contagem de colônias 20 a 200 UFC/g

Colônias típicas de Bacillus cereus

Isolamento em agar inclinado

Figura 56 – Esquema da metodologia para contagem e isolamento de Bacillus cereus (Fotos cedidas por Carlos Eduardo/Nutricionista/CCS/UFPB)

10.4 LEITURA ________________________________________________ As colônias de Bacillus cereus são enrugadas, com um substrato róseo variando até púrpura, rodeadas por um espesso halo de precipitado branco.

Bacillus cereus são manitol negativo e por isso não há uma viragem a amarelo do indicador de pH vermelho de fenol presente no meio de cultura, ou seja, o meio permanece vermelho. Estes microrganismos apresentam também a lecitinase que degrada a lecitina da gema de ovo e provoca a acumulação de produtos de degradação em torno das colônias formando o precipitado branco. Ao identificar as colônias típicas, realizar a contagem das colônias nas placas que apresentarem número de colônias entre 20 e 200.

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10.5 RESULTADO _____________________________________________

UFC/g = n° de colônias típicas isoladas x D x % de colônias confirmadas x F

D = diluição F = fator

10 se o inóculo foi de 0,1 ml 05 se o inóculo foi de 0,2 ml

EXERCÍCIOS

1 Descreva a morfologia das colônias de Bacillus cereus no meio Agar manitol gema de ovo polimixina e explique as reações responsáveis pelo aspecto das colônias.

2 Quais os alimentos mais envolvidos em surtos de doenças de origem alimentar causadas por este enteropatógeno?

3 Caracteriza o gênero Bacillus Cereus.

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COLORAÇÃO DE GRAM Capítulo

11

11.1 MÉTODO COLORAÇÃO DE GRAM_____________________________

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias de reterem ou não o corante cristal violeta no citoplasma durante

um

tratamento

com

etanol-acetona,

classificando

as

bactérias

basicamente em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas. No que diz respeito às características tintoriais, as bactérias Gram-positivas coram-se de roxo e as bactérias Gram-negativas coram-se de vermelho. Durante a coloração das bactérias do esfregaço o cristal violeta e o lugol formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere coloração roxa tanto pelas bactérias Gram-positivas, quanto pelas Gram-negativas. Com a adição de etanol-acetona, as bactérias Gram-negativas liberam o complexo formado, pois a camada de peptidoglicana é de pequena espessura , enquanto que as Gram-positivas retêm o comlexo, permanecendo roxas. A adição da fuccina não altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada as bactérias Gram-negativas, que foram descoradas pelo álcool-acetona.

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11.2 MATERIAL NECESSÁRIO___________________________________

Os materiais necessários à realização da coloração de Gram incluem: o Alça de platina; o Bico de Bunsen; o Lâmina; o Água estéril; o Cultura bacteriana sólida; o Corantes e fixadores: cristal violeta, lugol, álcool-cetona e fucsina;

11.3 METODOLOGIA___________________________________________

{

Esfregaço da cultura bacteriana sólida:

Flambar a alça, deixar esfriar, mantendo-a próximo a chama e em seguida retirar uma gota da água estéril e depositar sobre a lâmina. Flambar novamente a alça, esperar esfriar, e retirar uma amostra da cultura sólida, e leva-la até a gota de água depositada sobre a lâmina, e homogeneizar com movimentos circulares, para obter um esfregaço uniforme e fino. Por fim fixar o esfregaço, passando a lâmina algumas vezes na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama.

{

Adição de corantes:

Colocar a lâmina com o esfregaço sobre o suporte e cubrr com cristal violeta e deixar agir por um minuto, depois retirar o excesso. Em seguida cobrir a lâmina com lugol, deixar agir por um minuto e depois lavar novamente. Cobrir a lâmina com a solução de álcool-cetona rapidamente e em seguida lavar a lâmina. Por fim cobrir a lâmina com fucsina, deixar agir por trinta minutos, e

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novamente lavar, deixar secar por alguns instantes e depois passar no bico de Bunsen para retirar o resto da água. Ao término da adição dos corantes observar a lâmina no microscópico com a objetiva de 100x colocando o óleo de imersão.

Figura 57 – Metodologia da coloração de Gram

11.4 LEITURA ________________________________________________

A identificação das bactérias, após o processo de coloração de Gram, é possível em conseqüência da coloração que adquirem de acordo com a presença ou não da parede celular. As bactérias Gram-positivas possuem parede celular e apresentam coloração roxa, entretanto, as bactérias Gram-negativas não possuem parede celular e aparecem com uma coloração vermelha quando as lâminas são observadas no microscópio ótico.

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(1) (2) Figura 58 – (1) Cocos Gam-positivos, (2) Bacilos Gram-negativos

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EXERCÍCIOS Exercício n0 _____ 1

Assunto: __________________

Porque a presença ou ausência da parede celular interfere na coloração

apresentada pelas bactérias após a coloração de Gram?

2 Qual o corante ou fixador que tem ligação direta com o resultado final da coloração das bactérias?

3 Quais microrganismos importantes em alimentos são gram-positivos e quais são gram-negativos?

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BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ALBINI, C. A.; SOUZA, H. A. P. H. M.; PEREIRA, S. M. Manual Newprow de Microbiologia. Curitiba: Microscience, 2002. 152 p. BERNADO, W. L. C.; BORIOLLO, M. F. G.; GONÇALVES, R. B. HÖFLING, J. F. Staphylococcus aureus ampicilling-resistant from the odontological clinic environment. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, São Paulo, v. 1, p. 19-24, 2005. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 2005. 182 p. INSTITUTO SUPERIOR TÉCNICO. Observação microscópica de bactérias – coloração de Gram. 2007. Disponível em: . Acesso em: 25 de mar. de 2009. JAY, J. M. Microbiologia moderna de los alimentos, 3ª ed., Ed. Acribia S.A. Zaragoza, p. 279-513, 1992. JORGE, Antonio O. Cardoso. Microbiologia Atividades Práticas. 1ªedição. Santos: São Paulo, 1997. KOTIRANTA, A. et al. Epidemiology and pathogenesis of Bacillus cereus infections. Microbes and Infection, v.2, n.2, p.189-198, 2000. KRAMER, J.M.; GILBERT, R.J. Bacillus cereus and other Bacillus species. In: DOYLE, M.P. Food borne bacteria pathogens. New York: Marcel Dekker, 1989. p.21-69. MENDONÇA, R. C. S. Patógenos na indústria de carnes e derivados. In: MENDONÇA, R. C. S; BRABES, K. C. S; OLIVEIRA, K. A. M.; VIEIRA, E. N. R. Qualidade e segurança na produção e consumo. Viçosa: Gráfica Universitária, 2003. p. 21-48. MORETTI, P. E. Microbiologia, Fundamentos & Aplicações - Métodos em Microbiologia – Coloração de Gram, 2007. Disponível em: . Acesso em: 25 de mar. de 2009.

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OKURA, Mônica Hitomi, RENDE, José Calos. Microbiologia: roteiros de aulas práticas. Tecmedd: Ribeirão Preto, SP, 2008 OLIVEIRA, S. J. Microbiologia Veterinária. 2.ed. Canoas: Ulbra, 2000. 237 p. POIATTI, M.L. Características microbiológicas de diferentes leites caprinos. 2005. 62f. Tese (Doutorado em Zootecnia) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal. ROSSI, F.; ANDREAZZI, D. B.C. D. Bacterioscopias: métodos de exame direto. São Paulo: MD Millennium Diagnósticos. SILVA, C. H. P. M. Bacteriologia: um texto ilustrado. Teresópolis (RJ): Eventos, 1999. 531 p. SILVA, Neusely da, et al. Manual de Métodos de Análise Microbiológico de Alimentos. 3ª edição. Varela: São Paulo, 2007. SILVIA, W. P.; GANDRA, E. A. Estafilococos coagulase positiva: patógenos de importância em alimentos. Revista de Higiene Alimentar, São Paulo, v. 18, n. 122, p. 32-40, 2004. SPIANDORELLO, W. P.; MORSH, F.; SEBBEN, S.; SPIANDORELLO, F. S. A. A resistência do Staphylococcus aureus à oxacilina em hospital de Caxias do Sul. Revista AMRIGS, Porto Alegre, v. 44, n. 3-4, p. 120-125, 2000. TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 6.ed. Porto Alegre: Artmed, 2000. 827 p. VANZO, S.P. & AZEVEDO, R.V.P. Detecção de S. aureus em manipuladores de alimentos: perfil de resistência a antibióticos e quimioterápicos. Higiene Alimentar, v. 17, n. 104/105, p. 144-122, jan.-fev. 2003.