Western Blot

LAPORAN PRAKTIKUM IMMUNOBLOTTING 

 DAN DOT BLOT  WESTERN BLOT  DAN

Oleh : Putri Primawardani Primawardani

PROGRAM MAGISTER ILMU KEDOKTERAN BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIERSITAS BRA!I"A#A MALANG $%&'

BAB I PENDA(ULUAN &)& Latar Bela*an+ Immunoblotting   atau protein blotting  merupakan teknik utama dalam biologi molekuler  dan biologi sel. Pada dasarnya, teknik ini digunakan untuk mendeteksi keberadaan suatu protein spesifik dalam campuran kompleks yang diekstraksi dari sel. Sampel protein yang belum mengalami purifikasi terdiri dari beberapa jenis protein yang berbeda. Protein tersebut bila diseparasi pada gel poliakrilamid akan menghasilkan beberapa band sehingga tidak memungkinkan melakukan chemical assay untuk protein tertentu. Sifat enzimatik dan pengikatan dari suatu protein juga tidak dapat terukur karena interferensi substansi lain pada sampel. Sementara itu, pewarnaan dengan Coomasie blue  atau perak nitrat tidak dapat secara spesifik mendeteksi protein tertentu. Untuk itulah diperlukan imunodeteksi guna mengetahui keberadaan protein tertentu dalam gel dengan menggunakan antibodi. Teknik western blot , atau juga disebut sebagai imunoblot telah sering digunakan untuk menganalisis protein spesifik pada sampel. Western blot  menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida. Protein tersebut akan ditransfer ke nitroselulosa atau PV! " polyvinylidene difluoride# dan diberi antibody spesifik untuk identifikasi protein target "$urnette, %&'%#. Saat ini, telah banyak reagen antibody baik poliklonal maupun monoklonal untuk %(.((( jenis protein. Sehingga western blot   sangat bermanfaat untuk digunakan bersama antibody tersebut "Towbin et al.,%&)&#. ot $lot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis, dan mengidentifikasi protein. Teknik ini menyerupai Western Blot   namun perbedaannya adalah protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan tetapi ditandai dengan template sirkuler secara langsung pada substrat kertas. *onsentrasi protein dalam preparasi mentah atau kasar  "misalnya

kultur

supernatan#

dapat

diperkirakan

secara

semikuantitatif

dengan

menggunakan teknik ini jika dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi untuk protein tersebut. ot blot dapat digunakan untuk perhitungan kualitaif pada rapid screening   dari  jumlah sampel yang besar atau sebagai tehnik kuantitatif, dan terutama berguna untuk menguji kesesuaian parameter desain eksperimental "Smith +, et al., (%#. &)$ Tu,uan -engetahui prosedur immunoblotting  yaitu estern $lot dan ot $lot serta memiliki kompetensi untuk melakukannya

BAB II TIN"AUAN PUSTAKA $)& !e-tern Bl.t Western Blot "$# merupakan suatu teknik untuk menandai suatu protein pada membran nitroselulosa, nilon, atau membran transfer lain setelah protein tersebut terpisahkan melalui elektroforesis "/ttwood et al., ((0#. -etode ini awalnya ditemukan oleh 1eorge stark pada Uni2ersitas Stanford. 3ama western blot diberikan pada teknik tersebut oleh 3eal $urnette and Sushant $hat, merupakan nama yang dimiripkan dengan teknik deteksi 3/ southern blot yang ditemukan 4dwin southern dan 3orthern blot yang digunakan deteksi 53/ "Towbin et al.,%&)&#. Western Blot  dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama, elektroforesis. Tahap kedua, elektrotransfer. Tahap ketiga, deteksi "1ambar %# "*indt et al ., (()#.

Gam/ar &. "%# elektrophoresis, "# electrotransfer, "6# deteksi Pada tahap pertama, protein yang diinginkan dipisahkan dari sampel secara elektroforesis. 4lektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dalam suatu tegangan listrik tertentu. alam elektroforesis, sampel yang mengandung protein dicampur dengan SS. SS merupakan suatu detergen yang memiliki muatan negatif. -uatan negatif SS tersebut mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi. Suatu protein multimer juga akan terurai menjadi monomer  penyusunnya. /kibatnya, protein7protein yang ada dalam sampel membentuk suatu rantai polipeptida lurus. Semakin besar berat molekul suatu protein, maka rantai polipeptida tersebut semakin panjang. Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus dimasukkan dalam suatu membran poliakrilamid yang dialiri arus listrik. Protein yang telah bermuatan

negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif. 8aju pergerakan protein dalam membran poliakrilamid tersebut berbeda7beda tergantung pada daya hambat antara protein dan membran. Protein yang berukuran lebih besar akan memiliki daya hambat lebih besar  sehingga pergerakannya menjadi lebih lambat dibandingkan dengan pergerakan protein yang berukuran lebih kecil. Setelah dialiri arus listrik selama beberapa waktu, masing7 masing protein akan terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. Protein yang lebih kecil atau memiliki berat molekul rendah akan bergerak lebih jauh dibanding protein yang lebih besar. alam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita7pita yang merupakan protein7protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul "1ambar # "*oolman dan 5oehm, ((9#. Tahap kedua dalam $ yaitu pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer. Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong transfer protein. :leh karena itu, proses pemindahan tersebut disebut juga elektrotransfer. 4lektrotransfer dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu "$ollag et al., %&&0#; %. $lotting semikering $lotting semikering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan buffer  transfer. *ertas saring tersebut diletakkan di antara gel poliakrilamid dan gel transfer. Transfer seperti ini dapat dilakukan selama %(76( menit dengan arus lstrik tertentu. . $lotting basah $lotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel transfer, tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer. Susunan lapisan7lapisan pada blotting basah diperlihatkan pada 1ambar 6 "enk dan !ernandis, (()#. Transfer dengan blotting basah dapat dilakukan memiliki sensiti2itas relatif rendah yaitu %(7( pg,

%(79( pg, dan 9(7%(( pg "$ollag et al., %&&0#. $)$ D.t Bl.t ot $lot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis, dan mengidentifikasi protein. Teknik ini menyerupai Western Blot   namun perbedaannya adalah protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan tetapi ditandai dengan template sirkuler secara langsung pada substrat kertas. *onsentrasi protein dalam preparasi mentah atau kasar  "misalnya

kultur

supernatan#

dapat

diperkirakan

secara

semikuantitatif

dengan

menggunakan teknik ini jika dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi untuk protein tersebut. ot blot dapat digunakan untuk perhitungan kualitaif pada rapid screening   dari  jumlah sampel yang besar atau sebagai tehnik kuantitatif, dan terutama berguna untuk menguji kesesuaian parameter dalam desain eksperimental "Smith +, et al., (%#.

Gam/ar 0) Protokol ot $lot. Setelah pengikatan protein, dilakukan blocking  untuk mengurangi ikatan nonspesifik /b pada setiap wilayah membran yang kosong, untuk langkah pencucian dilakukan melalui filtrasi 2akum "Smith +, et al., (%#. Teknik Dot blot   memiliki efisiensi waktu yang signifikan, dimana prosedur blotting yang kompleks untuk transfer gel tidak diperlukan. 3amun, kekurangan metode dot blot adalah tidak dapat digunakan untuk mengetahui ukuran molekul target. Selain itu, jika dua molekul yang berbeda ukuran terdeteksi, mereka akan tetap muncul sebagai satu titik. :leh karena hal tersebut, dot blot hanya dapat digunakan untuk mengkonfirmasi ada atau tidak adanya molekul "yang dapat dideteksi oleh probe 3/ atau antibodi#.

Gam/ar 1. =asil akhir Dot Blot 

$eberapa langkah yang harus dikerjakan dalam proses ot $lot adalah menyiapkan membran, dan menandainya dengan grid menggunakan pensil untuk mengindikasikan daerah yang akan di blot. Sampel yang akan diuji diteteskan pada membran nitroselulosa pada bagian tengah kisi "grid# yang telah digambar pada membran tersebut dan dibiarkan kering. Situs yang tidak spesifik kemudian diblok dengan merendam membran dalam Bovine Serum lbumin "$S/# dan diinkubasi dalam antibodi primer selama 6( menit suhu ruang. 8angkah berikutnya adalah pencucian dengan P$S7T selama kurang lebih 6 kali masing7masing 9 menit dan dinkubasi pada antobodi sekunder yang terkonjugasi dengan =5P. Pencucian dilakukan kembali setelah proses tersebut selesai dan dipaparkan pada film ?7ray pada ruang gelap

Gam/ar '. ot $lot pparatus

BAB III MATERI DAN METODE 0)&)

L.*a-i dan !a*tu Pra*ti*um Praktikum

ini

dilaksanakan di 8aboratorium $iomedik !akultas *edokteran

Uni2ersitas $rawijaya -alang pada Selasa, % /pril (%9. 0)$) !e-tern Bl.t &) Tran-2er Pr.tein •

Pita protein dari gel SS7P/14 ditransfer ke membran !itrocellulose   dengan menggunakan Semi Dry "rans Blot #$uipment   dengan susunan dari bawah ke atas sebagai berikut ; a. kertas saring yang telah dibasahi larutan transfer buffer  b. membran !itrocellulose  yang telah direndam dalam larutan transfer buffer  selama 6( menit. c. gel SS7P/14 yang telah direndam dalam larutan transfer buffer  d. kertas saring yang telah dibasahi larutan transfer buffer di7runing   selama 

 jam, ( V, 6(( m/ $) Bl.3*in+ N.n S4e-i2i3 Area • • •

 /ngkat membran dan cuci dengan a@uadest "6A# -arker dipotong iinkubasi dalam larutan T$S7skim milkBblotto 9C pada suhu < D, overnight  ᵒ

0) In*u/a-i Anti/.di Primer  •

-embran segera dikeluarkan dan diadaptasikan pada suhu ruang $uang larutan skim, cuci dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C, 6A9 menit

•

sambil digoyang7goyang hingga skim bersih >nkubasi antibodi primer "dengan rasio pengenceran %;(( E %;9((# dalam

•

pelarut T$S >nkubasi  jam "5T# atau < D "overnight #

•

ᵒ

1) In*u/a-i Anti/.di Se*under  •

Washing  membran 6A9 menit dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C sambil

•

dishaker pelan >nkubasi antibodi sekunder "dengan rasio pengenceran %;%((( E %;9((# dalam

•

pelarut T$S >nkubasi  jam dalam suhu ruangan

') In*u/a-i En5im SA6(RP 7Stre4a8idin6(.r-e Radi-h Per.9ida-e ; AP 7Al*aline Ph.-4ata-e •

Washing  membran 6A9 menit dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C sambil

•

dishaker pelan >nkubasi enzim "dengan rasio pengenceran %;%(((# dalam pelarut T$S >nkubasi nkubasi overnight  pada suhu < D ᵒ

nkubasi antibodi primer "dengan rasio pengenceran %;(( E %;9((# dalam

•

pelarut T$S7$S/ %C "9( F8Bwell# >nkubasi  jam "5T# atau < D overnight  ᵒ

nkubasi  jam dalam suhu ruangan

). In*u/a-i En5im SA6(RP 7Stre4a8idin6(.r-e Radi-h Per.9ida-e ; AP 7Al*aline Ph.-4ata-e

•

Washing  membran 6A6 menit dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C "9( F8Bwell#,

•

kemudian ditapping dengan tissue hingga tidak ada larutan yang tersisa >nkubasi enzim "dengan rasio pengenceran %;%(((# dalam pelarut T$S >nkubasi . /g6' dengan antibodi sali2a "G# T$ pada Western Blot  apat diamati pada gambar ) dan ' adanya band yang terbentuk. $and yang yang terlihat pada membran nitroselulose mengidentifikasikan bahwa terdapat protein /g6' yang mampu untuk berikatan dengan antibody spesifik yang diberikan yakni antibodi /nti/g6' monoclonal pada gambar ) dan antibodi sali2a "G# T$ pada gambar '. Sali2a pada pasien T$ "tuberculosis# mengandung antibodi secretory >g/ "s>g/# yang berperan sebagai pertahanan pertama pada daerah mukosa. 1ambar ' menunjukkan bahwa protein /g6' bereaksi spesifik dengan s>g/ T$, hal ini berarti bahwa protein /g6' merupakan manifestasi

protein dari infeksi tuberculosis. $ila diamati lebih rinci, pada bagian kiri dari gambar ) dan ' yang merupakan tempat marker menunjukkan warna band yang berbeda, hal ini mungkin disebabkan karena adanya perbedaan perlakuan, dimana membran pada kolom kiri dipotong dan tidak dilakukan pencucian sehingga terjadi perbedaan elastisitas membran. Praktikum yang dilakukan hanya untuk mengetahui adanya reaksi antigen terhadap antibodi yang diberikan pada gel. 3amun, analisis western blot secara umum yakni dapat mendeteksi protein yang diinginkan dari campuran protein dalam jumlah besar, memberikan informasi tentang ukuran dari protein "dengan perbandingan ukuran marker dalam satuan kilodalton# dan juga memberi informasi tentang ekspresi protein "dengan perbandingan dengan kontrol# seperti pada sampel yang tidak diberi perlakuan atau sel atau jaringan tipe lain. ot $lot merupakan metode immunoblotting   dengan cara memaparkan langsung protein pada suatu membran. Praktikum dot blot yang dilakukan hanya sebatas membahas prosedur dan mengetahui hasil yang diperoleh, tanpa menginterpretasikan hasil tersebut. Tahap awal yang harus dilakukan adalah mempetakan sampel yang akan dimasukkan pada dot blot apparatus, misalkan pada baris pertama dimasukan antigen saja dengan konsentrasi semakin meningkat "dari kiri ke kanan#, dan pada kolom pertama dimasukkan antibodi saja dengan dosis yang semakin meningkat "dari atas ke bawah#, pada kolom dan baris lainya dimasukkan sampel sesuai dengan konsentrasi /g dan /b yang telah ditentukan di kolom dan baris pertama, untuk kemudian diamati hasilnya. Sampel yang terlarut, ditarik melalui membran dengan cara membuat suatu keadaan 2akum, protein kemudian akan berikatan dengan membran sedangkan komponen sampel yang lain melewati membran. Protein yang berada pada membran yang kemudian dapat dianalisis. =asil dot blot dapat dilihat pada gambar &.

Gam/ar ?. /g6' dengan antibodi /nti/g6' monoclonal pada Dot Blot 

BAB  KESIMPULAN

Teknik western blot dan dot blot dapat digunakan untuk menganalisis protein spesifik pada sampel.

BAB I DAFTAR PUSTAKA $urnette 3. %&'%. HIestern blottingI; electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfateJpolyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein /H.  nalytical Biochemistry  %% "#; %&9E(6. Towbin =, Staehelin T, 1ordon +. %&)&. H4lectrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets; procedure and some applicationsH.%roceedings of the !ational cademy of Sciences &S )0 "&#;