Vi sinh vật thực phẩm Kỹ thuật kiểm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm - Nguyễn Phùng Tiến

Ể M ìm ĩẴ iS m

ISIS

i.vÍTẴ %*?>: V

tllsillllll

______

v;- • •

§|l|§f»|8Ị| ■■'• -v: ■

sSSfcislSeR. S B S ; I

1

' - Ì0> :■ +

it Mấ

PISPiPlllS .. t e ỉ ỉ M % sứẵ ỀÊ ẩẵ Êẫ Êẫ ÊS :ÊS ÊỂ Ịề': ỆM Ệ Miề A

Mi

Ễ ễ S 'ỉìỉM

mm mm

■ịvMxỉ

I‘

(W ir\7 W j i

I H

v v V * { C ^ J i V í

iiiS I s

ỵỊẩỀ È Ể È Ể Ê M ềấ Ê ẫ ề â È Ề ầ ** Ề :ế : ' -

PGS. TS. NGUYỄN PHÙNG TIÊN GS. TS. BÙI MINH ĐỨC GS. TS. NGUYỄN VẢN DỊP

VI SINH VẬT THỰC PHAM ■ m KỸ THUẬT KIẾM TRA VÀ CH Ỉ T IÊ U ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG AN TOÀN T H ự C PH A M

NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC HÀ NỘI -2 0 0 3

LỜI GIỚI T H IỆ U

Đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm đang là môi quan tâm hàng đầu của y tế cộng đồng nước ta. Làm tốt được công việc này sẽ tránh dược rất nhiều những tác hại lớn trước m ắt và lâu dài. Vì vậy, đầu tư mạnh dạn vào công tác này là có ý nghĩa kinh tế - hiệu quả rõ rệt và cấp thiết. Để đóng góp cho vấn đề quan trọng này, một tập thể chuyên gia giàu kinh nghiệm đã biên soạn công phu và cho ra m ắt kịp thời quyển sách "Vi sinh thực phẩm Kỹ thuật kiềm tra và chỉ tièu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm". Mong rằng quyển sách này sẽ là một tài liệu hữu ích cho tấ t cả các đồng nghiệp đang làm công tác đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm ỗ nước ta.

Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2001 ĐẶNG ĐỨC TRẠCH VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

3

LỜI NÓ! Đ Ầ U

Theo dõi tổng kết trong nhiều năm các nhà khoa học trên th ế giới đều thống nhất xác định nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm (NĐTP) trong ãn uống là do nhiễm vi khuẩn qua đường thực phẩm, kể cả vi khuẩn gây bệnh lao, sốt thương hàn và dịch tả. ở Canada hàng năm có khoảng trên 2 triệu người bị ngộ do thức ăn, nếu tính theo dân ẩố cứ 11 người có 1 người mắc. Ớ Hoa Kỳ có khoảng 13 triệu người ngộ độc thức ăn trong năm và cứ 18 người có 1 người mắc bệnh do thực phẩm, trong đó 85% sô ca ngộ độc thức ăn là do nguyên nhân vi sinh. Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vẫn ngày càng tăng ở nhiều nước. Để làm giảm tỷ lệ ngộ độc thức ăn, cần sử đụng nhiều biện pháp phôi hợp đồng bộ: Từ trang bị kiến thức cho cộng đồng dân cư, người tiêu dùng tới những người sản xuất, dịch vụ chế biến hiểu rõ dược đặc tính phát sinh truyền bệnh của vi khuẩn và virus, chủ động làm sạch môi trường, thực hiện nghiêm qui trình vệ sinh đê phòng sự ô nhiễm và đặc biệt là cần thường xuyên kiểm tra phát hiện mức độ ô nhiễm vi sinh và vi khuẩn gây bệnh tại tấ t cả các cơ sở chế biến thực phẩm công nghiệp và qui mô gia đình, dịch vụ ăn đường phố V . V .. Trong thực tế cuộc sống, theo dõi khảo sát đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm để hạn chế sự ô nhiễm và tác hại của vi sinh gây bệnh trong và sau quá trình thu hoạch các sản phẩm nông nghiệp, chăn nuôi, đánh bắt hải sản đến quá trình bảo quản chế biến và nấu nướng tới tay người tiêu dùng thường rất phức tạp và gặp rất nhiều khó khăn. Nếu đánh giá sai lệch hoặc thiếu nguồn thông tin và sửdụng biện pháp không đồng bộ trong kiểm tra phát hiện, đặc biệt là các chỉ tiêu chỉ điểm vệ sinh xác định có sự 6 nhiễm vi sinh vật gây thực phẩm hư hỏng biến chất, ngộ độc ăn uống sẽ xẩy ra và bệnh dịch phát sinh, dẫn đến nhiều hậu quả không lường hết được. Do đó xương sông và cốt lõi trong nhiệm vụ đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) làm giảm tỷ lệ ngộ độc và bệnh tậ t do vi sinh vật gây nên là phải thường xuyên và chủ động khảo sát theo dõi, kiểm tra đánh giá các số liệu dịch tễ học: Xác định được loại thực phẩm, yếu tố nguyên nhân truyền bệnh, phát sinh ngộ độc, hoặc khu vực và điểm dịch vụ nào đã là nguồn lây lan... Tại Hoa Kỳ năm 1988 theo dõi các số liệu kiểm tra vi sinh trong các vụ ngộ độc thực phẩm, Doryan và c s đã xác định được nguyên nhân chính là Salmonella, St.aureưs rồi đến Cl.perfringens và B.cereus. Một sô' thực phẩm chính bị ô nhiễm vi sinh gây bệnh là thịt bò nướng, chả th ịt lợn, cừu, thịt sấy hun, patê, tôm cưa, tiếp đến các món ân hỗn hợp như cơm thập cẩm có khoai thịt, nộm rau trứng V . V ..

Từ những kết quả theo dõi, kiểm tra đặc điểm dịch tễ học trong ngộ độc thức ăn, tại nhiều nước đã ban hành các quyết định của ngành y tế trong biện pháp hạn chế và giảm tỷ lệ ngộ độc thức ăn như bắt buộc phải xử lý sữa tươi trước khi tới tay người tiêu dùng, phải chiếu xạ thịt gia cầm trước khi bảo quản lạnh hoặc sau khi bao gói nem chua để diệt Salmonella, Campylobacter hoặc có sự phôi hợp giữa các labô vi sinh chuyên ngành để kiểm tra phát hiện dịch tễ học ngộ thức ăn do kẹo sôcôla nhập từ Y, pa,tê gan từ Pháp và Bỉ, bột sữa, giá đậu từ Tây Đức dã gây nhiều v ụ ngộ độc thực phẩm tại khu vực V .V .. Nhu cầu của bạn đọc, đặc biệt là các cán bộ chuyên ngành về vệ sinh an toàn thực phẩm luôn đòi hỏi các thông tin kịp thời, kiến thức hiện đại về các vấn đề thời sự có liên quan tới chuyên ngành kiểm tra vi sinh thực phẩm. Được sự động viên của GS. TSKH. Hoàng Thuỷ Nguyên, GS. TSKH. Đặng Đức Trạch, GS. TSKH. Hoàng Thuỷ Long - Viện vệ sinh dịch tễ; GS. Từ G iấy,G S. TSKH. Hà Huy Khôi - Viện Dinh dưỡng,' PGS. TS. Phan Thị Kim - Cục Quản lý chất lượng VSATTP cùng nhiều đồng nghiệp, chúng tôi mạnh dạn biên soạn cuôn sách với một số nội dung đang là vấn đề thời sự của chuyên ngành kiểm tra vệ sinh an tọàn vi sinh thực phẩm. Sách được biên soạn kế thừa có bổ sung nâng cao phần kỹ thuật xét nghiệm vi khuẩn học trong sách "Kiểm nghiệm chất lượng và thanh tra vệ sinh an toàn thực phẩm" quyển II - Nhà xuất bản Y học năm 1991 của các tác giả Bùi Thị Nhu Thuận, Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức chắc chắn còn nhiều thiếu sót. Các tác giả mong được sự góp ý của các đồng nghiệp và bạn đọc. Xịn được chân thánh cảm ơn sự góp ý bổ sung của các bạn. Các tác giả xin đặc biệt cám ơn tới GS. TSKH. Hoàng Thuỷ Nguyên, GS. TSKH. Đặng Đức Trạch, GS. TSKH. Hoàng Thuỷ Long, GS. Từ Giấy, GS. TSKH Hà Huy Khôi, PGS. TS Phan Thị Kim cùng nhiều đồng nghiệp, các chuyên viên kỹ thụật Nguyễn Vĩnh Mụi, Lê Thị Lệ Chi, Chu Xuân Dục, Quách MinỊi Hoáa, Trương Khánh Minh, Hoàng Thị Minh, Đặng Ngọc Quảng, Phạm Thị Thức, BS. Phạm Thanh Yên, Cử nhân VI sinh Tô Bích Phượng đã động viên và cung cấp cho tặc giả nhiều thông tin và tư liệu qui. Hà Nội năm 2001 .

6

Các tác giả

''

1. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NGÀNH VI SINH VẬT TRONG THựC PHẨM

Cho tới nay đã có khá nhiều các nhà khoa học liên ngành khi nghiên cứu tìm hiểu về bước ngoặt lịch sử cửa sự phát triển ngành khoa học sinh học và vi sinh nhưng dã không thành công trong việc xác định chính xác mốc thời gian về sự hiểu biết của loài người trong quá trình xuất hiện và vai trò tác động của hệ vi sinh vật đối với thực phẩm và đời sông. Một số nhà khoa học cho rằng cách đây khoảng 8000-1 triệu năm con người đã sử dụng thực phẩm nguồn gốc động vật hoặc thực vật chỉ dưới dạng tươi và sau đó ở dạng nấu chín thực phẩm khi phát hiện và tạo được ngọn lửa. Trong quá trình nấu chín thực phẩm, loài người đã nhận thấy có một sô" bệnh phát sinh do nguyên nhân thực phẩm bị ô nhiễm biến chất trong quá trình bảo quản. Thời gian đó người dân Hy Lạp và Trung Hoa đã biết sử dụng các kỷ thuật lên men thực phẩm để chế biến bơ, pho m át từ sữa, làm các loại bánh từ bột mỳ, nấu rượu từ quả và ngũ cốc, ướp muối th ịt cá để dự trữ, dùng tuyết để bảo quản tôm, rau quả V . V .. Vào khoảng 1500-3500 năm trước công nguyên (1) thời gian này con người đã biết có thể bảo quản thực phẩm bằng dầu olive, dầu vừng và có thể dẫn đến ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus) (1). Sau công nguyên 1100, xuất hiện ngộ độc do loại nấm mốc cựa gà Claviceps purpurea gây ô nhiễm trên lúa mạch đã làm chết nhiều người, đặc biệt tại Pháp đã ghi được sô' người chết là trên 40.000 người. Thời kỳ đó người ta chưa được biết đến nguyên nhân gây tử vong là dỡ độc tố sản sinh từ nấm mốc. Tiếp theo bắt đầu thế kỷ thứ 13 các nhà khoa học dâ nhận thấy giữa chất lượng củầ th ịt sau khi giết tại lò mổ có liến quan, đến vi sinh vật. Lần đầu tiên, ngừời phát hiện vái trò và tắc động của vi sinh vật đến sự biến chất thực phẩm là A.Kircher một thầy tu khi khảo sát 1658 mẫu thịt, sữa và thực phẩm bị thôi vữa đã giả thiết là do có những con sâu, ấu trùng rấ t nhỏ, bằng mắt thường không nhìn thấy được gây hư hỏng thực phẩm. Sự mô tả phỏng đoán của A.Kircher không được chấp nhận rộng rãi do chưa được minh chứng chính xác. Tiếp theo tới năm 1765, L. Spallanzani đả chứng minh nước luộc thịt bò, nếu được tiệt khuẩn và bao gói kín sẽ không bị hư hỏng; và tới thế kỷ thứ 18, D.Papin và G.Leibniz đã đề ra khái niệm sử dụng phương pháp bảo quản thực phẩm bằng nhiệt. Năm 1809, Chính phủ Pháp đã tặng giải thưởng 12.000 francs cho F.Appert người trực tiếp chế biến bánh kẹo ở Paris dã bảo quản thành công thịt trong lọ thuỷ tinh đóng kín và tiệt khuẩn. Năm 1810 F. Appert nhận được bằng phát minh bdi công '■7

trình nghiên cứu thử nghiệm này. Tiếp theo năm 1854 L.Pasteur bắt đầu nghiên cứu sâu về tác động vai trò của vi sinh vật trong quá trình làm hỏng rượu vang Pháp và năm 1857 Pasteur đã chỉ rõ quá trình làm chua sữa cũng do vi sinh. Năm 1860 Pasteur lần đầu tiên đã sử dụng nhiệt để tiêu diệt vi sinh vật không mong muôn trong quá trìn h chế biến rượu vang và bia. Quá trình đó được đặt tên là thanh trùng Pasteur. Tóm tắ t quá trình phát triển kỹ thuật trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm, biến chất gây hư hỏng thực phẩm, ngộ độc thực phẩm và pháp chế thực phẩm có liên quan đến lĩnh vực vi sinh được ghi lại từ th ế kỷ 16 (1,2) như sau: 1. BẢO QUẢN THỰC PHẨM

1782 - Nhà hoá học Thuỵ Điển bảo quản dấm dạng đóng hộp. 1810 - F.Appert nhận được bằng phát minh bảo quản thực phẩm của Chính phủ Pháp về thực phẩm đóng hộp kín. - Peter Durand nhận được bằng phát minh của Chính phủ Anh trong bảo quản thực phẩm dạng đóng hộp kín bằng thuỷ tinh, sứ và kim loại. 1813 - Dorkin, Hall và Gamble thực hành ủ nóng đồ hộp thực phẩm - Sử dụng SƠ2 để dự trữ bảo quản thịt. 1825 - T.Kensetl và E.Daggett được tặng thưởng do nhận bằng phát minh của Hoa Kỳ về bảo quản thực phẩm trong hộp thiếc. 1835 - Newton nhận được bằng về sữa đặc đóng hộp tại Anh. 1839 - Đồ hộp thực phẩm bằng hộp thiếc được sử dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ. ' 1840 - Lần đầu tiên đóng hộp hoa quả và cá. 1842 - H.Benjamin nhận bằng phát minh ở Anh về kỹ thuật đông lạnh thực phẩm do bảo quản fthực phẩm trong đá và dung dịch muôi. 1843 - I.Winslow sử dụng kỹ thuật diệt khuẩn bằng hơi nước. 1845 - S.Elliott tiến hành dóng-hộp thực phẩm tại úc. ' 1853 - R.Chevallièr và F.Appert đạt được bằíig phát minh về kỹ thuật điệrt 'khuẩn thực phẩm bàng thiết bị sử dụng nhiệt áp suất (autoclaving). ‘ 1854 - Pasteur bắt đầu khảo sát sầu quá trình lên men rượu vang. 1855 - Grimwade lần đầu tiên sản xuất sữa bột tại Anh. , Í8Ộ6 - Bằng sầng chẽ* cho Gail Borden về' sản xuất sữa đặc không có đường. \

*

1865 - Đông lạnh cá ở qui mô thương mại tại Ý 1874 - Sử dụng rộng rãi nước dá bảo quản vận chuyển thịt. 1878 - Sử dụng côngtennơ bảo quản và đông lạnh th ịt từ ú c sang Anh và từ Tân Tây Lan sang Anh (1882). 1880 Bắt đầu thực hiện điệt khuẩn sữa bằng phương pháp Pasteur ở Đức. 1882 Krukowitsch là người đầu tiên ghi nhận tác động huỷ diệt vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm của ozon. 1886 - A.F.Spawn sử dụng quá trình công nghệ sấy khô rau quả. 1890 - Bắt đầu sử dụng phương pháp diệt khuẩn Pasteur trong quá trình lưu thông cung cấp sữa tại Hoa Kỳ. Bắt đầu sử dụng quá trình công nghiệp bảo quản lạnh quả tại Chicago. 1895 - Russel bắt đầu khảo cứu tác động của vi sinh vật tới đồ hộp 1970 - E.Metchnikoff và cộng sự đã tách phân loại và đặt tên cho vi sinh vật lên men sữa chua là Lactobacillus bulgaricus. B.T.P.Barker ghi nhận vai trò tác động của vi khuẩn lên men dấm (acid acetic) trong rượu táp. 1908 - Natri benzoat được chính thức cho phép sử dụng trong bảo quản th ịt tại Hoa Kỳ. 1916 - Kỹ thuật đông lạnh nhanh thực phẩm được thực hiện có kết quả tại Đức dọ tác giả R.Plank, E.Ehrenbaum và K.Reuter. 1917 - Clareuce Birdseye bắt đầu thực hiện kỹ thuật bảo quản lạnh thực phẩm cho mạng lưới bán lẻ. Franks nhận được bằng phát minh bảo quản rau và quả bằng CƠ2. Bigelow và Esty công bố kết quả thử nghiệm xác định khả 1920 năng chịu nhiệt của bào tử ;ở nhiệt độ 212°F. 1928 - Tại châu Âu lần đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật bảo quản táo bằng kiểm tra khí quyển (controlled atmosphere) trên qui mô thương nghiệp. Năm 1940 lần đầu tiên dược thực hiện tại New York. 1929 - Tại Pháp sử dụng năng lượng cao của bức xạ để bảo quản thực phẩm và được cấp băng phát minh. 1943 - Tại Hoa Kỳ B.E.Proctor lần đầu tiên sử dụng ion bức xạ dể bảo quản thịt hămbơgơ (bánh mềm cặp th ịt bò băm chiên). 1954 - Chất kháng sinh. Nisin được nhận bằng phát minh tại Anh do được sử dụng trong quá trình sản xuất pho m át để không chế nhóm vi khụẩn Clostridium. -

-

9

1954 - Acid sorbic được công nhận là chất bảo quản thực phẩm. Kháng sinh chlortetracyclin và tiếp theo oxytetracyclìn (1966) được công nhận là chất bảo quản thịt gia cầm. 1967 - Chiếu xạ thực phẩm lần dầu tiên được chỉ định sử dụng trong lưu thông thương mại tạ i Hoa Kỳ. 2. BIẾN CHẤT GÂY HƯ HỎNG THỰC PHAM

1659 - Kircher chứng minh sự hiện diện của một số vi khuẩn trong sữa. Năm 1847 Bondeau đã lặp lại, sự chứng minh trên. 1680 “ Leeuwenhoek lần đầu tiên quan sát tế bào nấm men. 1780 - Scheele xác định acid lactic là acid chírih trong sữa chua. 1836 - Làtour phát hiện sự hiện diện cỏ £t nấm men. 1836 - Kircher khảo sát nước ẻp củ cải và nhận thấy vi sinh vật tạo thành chất nhầy khi phát triển trong dung dịch đường sucrose. 1857 - Pasteur chứng minh sữa chua được hình th àn h do có sự phát triển của vi sinh vật trong sữa. ; : ;i 1866 - Công trình nghiên cứu rượu vaíig của Pasteúr đước xuất bản. 1867 - Martin đưa ra giả thuyết về quá trình lên men chín của pho m át tương tự như quá trình lên men tíìhh thành cồn, acid lactic và acid butyric. I 1873 - Gayon lần đầu tiêii khảo sát xác'định vi khuẩn gây hư hỏng trứng ■■ ■ ■ ■ Lần đầu tiên tách được Lactic lactococcus ở dạng nuôi cấy tinh khiết. ' ^ 1876 - Tyndall khảo sát và ritiận thấy vi khuẩn khi phân huỷ chất hữu cơ luồn để lại dấư vết ở vật chứa, difiig, không khí hoặc chất hữu cơ. 1878 - Cienkowski lần đầu tiên khảo sát ví sinh vặt tác động trên dịch nhầy của đường (sugar slimes) và tách được Leuconostoc mesenteroides). ‘r-ĩ 1887 - Forster lần đầu tiên chứtìg itìihH khả nărig chủng vi khuẩn ở ■' dạng thuần khiết có thể phát triển ở- nhiệt độ 0°c. 1888 - Miqủèl ĩà người đầu tiên nghiên cứu vi khuẩn ưa nhiệt. 1895 - Vóri Gèủns -tại Amsterdam lân đầu-tiên đếm được lửợng vi ” khuẩn trorig éữa. !S.C.Prescott và w.Underwood lần đầu iíên theo dõi ghi nhận được sự biến chất hư hỏng của ngô đống hộp do quá trình xử lý nhiệt không đảm bảo. IX)

1902 - Schmidt ” Nielssen lần đầu tiên xác định và đặt tên vi sinh vật mọc ở nhiệt độ 0°c là vi sinh vật ưa lạnh. 1912 - Richter mô tả nấm men có thể mọc phát triển tốt ở môi trường có áp suất thẩm thấu cao và đặt tên là vi sinh vật ưa thẩm thẩu. 1915 - B.w.Hammer tách chọn lọc từ sữa vón cục được chủng Bacillus coagulans. 1917 - P.J.Donk lần đầu tiên tách được chủng Bacillus stearothermophiỊus từ dạng kem đường của ngô (cream - style corn). 1933 - Olliver và Smith (Anh) khảo sát vi khuẩn Byssochlamys fulva gây hư hỏng thực phẩm. Tại Hoa Kỳ lần đầu tiên D.Ma,under khảo sát phát hiện loại vi khuẩn này vào năm 1964. 3. NGỘ ĐỘC THỰC PHAM

1820 - Nhà thơ Đức Justinus Kemer mô tả "hiện tượng ngộ dộc xúc xích" (sausage poisoning), tấ t cả là do vi khuẩn Clostridium botulinum gây tỷ lệ tử vong cao. 1857 - W.Taylor (Anh) buộc tội sữa là vật truyền bệnh sốt thương hàn. 1870 - Francesco Selmi đưa ra giả thuyết ngộ độc ptomaine (ptomaine poisoning) khi ăn một số thực phẩm. 1888 - Gaertner lần đầu tiên phân lập dược Salmonella enteritidis trong 57 trường hợp bị ngộ dộc thực phẩm. 1894 - T.Denys là người đầu tiên phát hiện tác động của chủng Staphylococci với ngộ độc thực phẩm. 1896 - Van Ermengem là người đầu tiên phát hiện chủng Clostridium botulinum. 1904 - G.Landman xác định týp A của chủng c.botulinum. 1906 - Ngộ độc thực phẩm do Bácillus cereus đã được công nhận. Trường hợp nhiễm bệnh sán-Diphyllobothrium đã được công nhận (diphyllobothriasis). 1926 - Linden Turner và Thom là những người đầu tiên thông báo ngộ độc thực phẩm do Streptococci 1937 - L.Bier và E.Hazen xác định phân biệt týp E của chủng c.botulinúm. 1937 - Loại nhuyễn thể gây ngộ độc liệt (paralytic shellfish poisoning) được công nhận. 1938 - Ngộ độc do Campylobacter enteritis được phát hiện do sữa tại bang Illinois.

1939 - Schleifsten và Coleman lần đầu tiên xác định bệnh viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) do Yersinia enterocolitica gây nhiễm độc. 1945 - Me Clung là người đầu tiên chứng minh Clostridium perfringens (welchii) gây ngộ độc thực phẩm. 1951 - T.Fujino người Nhật, xác định Vibrio parahaemòlyticus là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm. 1955 - S.Thompsoii ghi nhận sự giông nhau giữa bệnh dịch tả (cholera) và Escherichia coli gãy bệnh viêm dạ đày ruột trên trẻ em. - Ngộ độc do Scombroid (tác dộng của histamin) đã được công nhận. I960 - Lần đầu tiên Móller và Scheibel xác định typ F của chủng c.botulinum. 1965 - Ngộ độc gây bệnh giardiasis do giardia đã được công nhận. 1969 - D.H.Strong và C.L.Duncan xác định độc tố ruột . non (enterotoxin) của c.perfringens. Gimenez và Ciccarelli người Achentina xác định typ G chủng * c.botulinum. 1971 - Ngộ độc phát hiệií lần đầu tiên tậi Hòa Kỳ do Vibrio parahaemolyticuồ gây bệnh viêm dạ dày ruột ở Maryland. Ngộ độc đầu tiên gây bệnh viêm dạ dày ruột do E.coli được ghi nhận tại Hoa Kỳ; : ; 1975 - L.R.Koupal và E-H.Deibel: phát ' hiện độc tố ruột 'non (enterotoxin) do Salmonella sản sỉnỊi. • 1976 r Ngộ độc thực p h ẩ m ;phát hiện lầĩií đầu tiên tại Hoa Kỳ gây bệnh viêm dạ dày ruột do Yersinia enterocolitica Il i ’ , > ! Ngộ độc do Botulinum trốn trẻ em lần đầu tiên được ghi nhận tại California. í iỉ : 1978 - Ngộ độc thực phẩm gây bệnh viêm dạ dày ruột do ồíêu vi khuẩn Norỵyalk được;gjạ.i nhận tại úcu, ; . < •, ’ 1 9 7 9 Ngộ độc thực iphẩm gây bệnh viêm dạ dày ruột do vi khuẩn Vibrio cholerae không-01 (non-OlííVibrio bholerae) được ghi , ,M : ; nhận ậ Ịbang :Flạriđạ.,,Trước đó năiụ ỊỘ65 ngộ, 4ộc do yị .khuẩn trên đã xảy ra $ Tiệp, năm 4:965 và, Uc năm 1,973. i 1981 - Ngộ độc gây bệoJa Lịstẹriosịs (bệnh .nhiễm Listeria). 4ược ghi nhận tại Hoa Kỳ. ; I ; r >vỊ.983 - ^ỉgộníĩộp thực pkgm đầu ịịện gậy yâệựịịị.gụột $4% chậy^ piáư (hemorrhagic colitis) xảy ị ra ỉtại ,Hoa Ẹỳ, r; , ; j Ị9.8.3 iRụiz * P^laciọp và GS, phát hịện 4ộc. tô" ruột non ’^ enterptoxin) của Campylobacter jejuni. ,, ;ji ■í iồ

4. PHÁP CHẾ THỰC PHẨM

1890 - Lần đầu tiên Luật thanh tra nhà nước về th ịt được ban hành tại Hoa Kỳ chỉ thực hiện trong kiểm tra th ịt xuất khẩu. 1895 - Lụật về thanh tra thịt được bổ sung thêm một sô" điều khoản. 1906 - Luật Liên bang của Hoa Kỳ về thực phẩm và thuốc được Quốc hội thông qua. 1910 - Cơ quan y tế thành phô" New York ban hành quyết định sử dụng phương pháp khử khuẩn Pasteur với sữa. 1939 - Ban hành luật sửa đổi về thực phẩm, thuốc và mỹ phẩhi tại í loa Kỳ. 1954 - Ban hành qui định bổ súng về hơá chất bảo vệ thực vật "trong luật về thực phẩm, thuốc và mỹ phẩm đừợc Quốc hội Hoa Kỳ thông qua. 1957 - Ban hành Luật về gia cầm và sản phẩm gia cầm tại Hoa Kỳ 1958 - Ban hành qui định bổ sung về phụ gia thực phẩm trong luật về thành phần thuốc và mỹ phẩm. 1962 - Luật Talmadge - Aiken (cho phép thanh tra th ịt tại các bang) bắt đầu có hiệu lực. 1963 - Cơ quan FDA (Quản lý thực phẩm và thuốc toàn liên bang) phê chuẩn việc sử dụng chiếu xạ thực phẩm để bảo quản th ịt xông khói. 1967 - Luật của Hoa Kỳ về tính lành và an toàn của thịt được Quốc hội thông qua có hiệu lực từ 15 tháng 12 1968 - FDA thu hồi quyết định cho phép sủ dựng chiếu xạ thực phẩm được phê chuẩn năm 1963. - Dự luật về thanh tra gia cầm (Poultry inspection Bill) được ban hành thành luật. 1969 - FDA phê chuẩn giới hạn mức độc tố vi nấm Aflatoxin thấp nhất trong ngũ cốc và h ạt có dầu là 20ppb. 1973 - Bang Oregon Hoa Kỳ ban hành qui định tiêu chuẩn về vệ sinh trong lưu thông bán lẻ thịt tươi và thịt chế biến. Qui định này bị bãi bỏ. năm 1977. 1984 - Dự luật khôi phục lại quá trình chiếu xạ thực phẩm để bảo quản thực phẩm trong đó nhấn mạnh biện pháp chiếu xạ có thuận lợi hữn biện pháp sử dụng phụ gia thực phẩm.

I

TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

X. James M.Jay. Modem food Microbiology Fourth Edition. Chapman & Hall. 1992. p. 3-12 2, Ailsa D.Hocking et. al. Food borne microorganisms of public health significance. Fifth ed. AIFST Australia p.,.71-138,

u

2. PHÂN LOẠI NGUỒN Gốc, CHỦNG LOẠI, s ự NGUY HlỂM ồ NHIỄM VÀ KỸ THUÂT MỚI TRONG PHÂN TÍCH KlỂM t r a VI SINH VẬT THựC PHẨM

Sự hiểu biết của con người trong quá trình sống, lao động, phát triển đã nhận biết nguồn thức ãn thiên nhiên rấ t phong phú từ thực vật, độtìg vật luôn có sự cộng sinh cụa vi sinh vật đã tàn phá và phân huỷ một khôi lượng khổng lồ vật chất hữu eơ để tạo thành năng lượng và các thành phần vô cơ như nitrat, sulfat V . V .. (sơ đồ 2.1). Nhận biết tiếp theo là khi theo dõi khảo sảt trong các phòng thí nghiệm với các nguồn thức ăn thiôn nhiên iiếu không có biện pháp xử lỷ bảo quản chủ động đã nhận thấy có sự tác động củạ. vi sinh vật (VSV) không giống nhau vá được các nhà khoa hộc phân loại thành 3 nhóm: Vi khuẩn (bacteria), nấm mốc (molds) và nấm men (yeasts). Quá trình phân loại vi sinh vật đã có nhiều thay đổi do sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật sử dụng các kết quả phân tích theo phương pháp xác định phân tử gen (molecular genetics) đơn độc hoặc kết hợp với một số phương pháp truyền thống như xác định: - Tính tương ứng của DNẶ và mole (phân tử gam) G + thành phần c của DNA. - 23S, 16S và 5S rRNA chuỗi kế tiếp tương tự. Lập hồ sơ Oligonucleotid. - Phân tích đánh sô phân loại tểng protein hoà tan hoặc xác định đặc tính hình thái học và sinh hoá học. - Phân tích thành tê' bào (cell wall). - Đặc tính huyết thanh học. - Đặc tính thành phần acid béo của tế bào. Một số loại vi khuẩn, nấm mốc, nếm men và động vật đơn bào theo thứ tự bảng chữ cái được giới thiệu ỗ Bảng 2.1. Mỗi loại vi sinh vật thường có yêu cầu về th àn h phần chất dinh dưỡng và môi trường sông đặc thù. Có tám nguồn đốì tường quan trọng có thể gây ô nhiễm thực phẩm, 36 chủng loại vi khuẩn và 4 động vật nguyên sinh được giới thiệu ở Bảng 2.2.

T2-HCĐTUT

15

1. TÁM NGUỒN ĐỐI TƯỢNG GÂY Ô NHIEM

1.1. Đất và nước: Hai môi trường đất và nước được xếp chung dở cố nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc đều cư trú ở cả đất và nước. Các vi sinh vật cư trú ở đât có thể theo khí quyển sẽ phát tán khắp bốn phương do tác động của gió và nước mưa. Một sô" vi khuẩn sống trong nước có thể không sông được ở trong đất, đặc biệt lặ vi khuẩn sống ở nước mặn như chủng Alteromonas spp. ưa sống trong nước mặn. 1.2. Cày ngũ cốc và sả n phẩm rau quả: Các chủng vi sinh vật cư ịtrú tro n g ,Ị1ƯỚC và đất thường gây ô nhiễm cho các cây thực phẩm và sản phẩm, chủ yếu là vi khụận, nấm mốc, nấm men trong đó có , nhiều chủng gây bệnh như Comybacterium, Curtobacterium, Pseudomonas và Xanthomonas. 1.3. Vật chứa đựng thực phẩm: Khi th u ; hoạch sản phẩm nông nghiệp trong quá trình chế biến, thực phẩm được chứa đựng trong các lóại bao bi hoậc vật chứa đựng hay qua các dụng cụ chế biến như dao, thớt, máy iỉay :nghiền, nồi nấu rất đễ bị ô nhiễm bởi các chủng vi sinh vật.

16

Sơ đố 2.1. Tác động của vi sinh vật tới vòng chu kỳ nitơ Ni tơ (khí quyển)

Khử nitd

CỐ định nitơ

Khử nitrat thành khí nitơ do vi khuẩn Pseudomonad '

Nitơ trong khí quyển được cố định bởi nhiều chủng vi sinh như Rhizobium, Clostridium , A zotobacter v.v...

Nitral được sử đụng Hình thành nitrat (Nitơ hóa) Oxy hóa nitrit thảnh nttrat do vi khuẩn Nitrobăcter'

Hình thành nitrit oxy hóa amoniac thành n itritd o vi khuẩn Nitrosomonas

với cây thực phẩm

Hình thành nitơ hữu cơ

C ây sử dụng nitd cố định để Rất nhiều chủng dị tổng hợp thành protein thực vật dưỡng (H e te ro trop ic; và chuyển thành protein động _ species) khử nitrat vật qua gia súc, gia cầm v.v... thành amoniac qua nitrit

Vi sinh vật sử dụng amoniac là nguồn nitơ tổng hợp protein tế bào

Nitờ hữu cơ trong đất bao gổm chất thải phân động vật, súc vật chết và c ả ỷ bị mục thối trõng đất

Hình thànl^ am onìac! (Amoni hóa)Acid amin bị khử amin do nhiểu loại vi sinh vật, amoniac là m ột trong những sản phẩm cuối cùng của quá trình amoni hóa

Phân hủy nitơ hữu cơ protein, acid nucleic V .V .. bị các chủng vi sinh vật tấn công phân hủy sinh hỗn hợp acid amin

ìĩỉ

Bảng 2.1. Mộĩ số chủng loại vi sinh vật thường gây ô nhiêm thực phẩm

A. Vi Acinetobacter Aeromonas Alcaligenes Alteromonas B&cilUás Brochothrix CạmpylọbacteT, Carnobacterium Citrobacter Clostridium Corynebacteíium EíitẹrọcQÊỌuặ

k h u ẩn

(B acteria)

Enterobacter Erwnia Escherichia Flavobacterium Hafnia Lactococcus Lactobacillus Leuconostoc Listeria M ìc t o c o c c u s

Moraxella Pantoea

Pediococcsu Proteus Pseudomonas Psychrobacter Salmonella Serratia Shewanella Shigẹliạ Staphvlococcus Vagococcus Vibrio Yersinia

B. N ấm m ấc (Molds) A ltem aria Aêp.ẹVsQlụ§ Aureobasidium Botrytis Byssochỉaiùys

Cladosporium Colletotrichum Fusarium Geotrichum Monilia

Mucro Pgniqillium Ehizpjjus Thanidium Trichothecium Wallemia Xeromyces

c . N ấm m en (Yeasts) Brettanomyces Candida Cryptococcus Debaryomyces Hanseniaspora

Issatchenkia Kluyveromycès Pichia Rhodotorula SaccharomvrifiSf

Schizosaccharomyce Torulaspora Triehospordn Zygosaccharomyces

D. Đ ộng v ậ t n g u y ên siiỀỈì (Protozoa) Cryptosporidium paryum Entamoeba histolytica

Giardia lamblia Toxoplasma gondii

* Tên vỉ khuẩn được gạch chân là loại thường gặp.

18

Bảng 2.2. Tám nguồn ô nhiêm quan trọng thường gặp của vi khuẩn và động vật nguyên sinh vào thực phẩm Đ ất và nưóc

C ây ngũ cốc rau quả

Vật chứa đựng

XX

X

X

A e ro m o n a s

xxa

X

A lc a lig e n e s

X

X

X

X

X

XX

X

T ên vi sình v ậ l (O rg an ism s)

Đường tiêu hoa

T ay người dịch vụ

Thứ c ăn gia sú c

cơ th ể dộng vật

Bụi không kh í

Vi kh u ẩ n (B a cte ria ) Acinetobacter

A lte ro m o n a s

XXĐ

B a c illu s

xxb

B ro c h o th rix

X

X

XX X

X

X

C itro b a c te r

X

XX

X

XX

C lo s trid iu m

xxb

X

X

X

C o ry n e b a c te riu m

xxb

X

X

E n te ro c o c c u s

X

X

X

E n te ro b a c te r

X

XX

X

E rw in ia

X

XX

X

E s c h e ric h ia

X

X

F la v o b a c te riu m

X

XX

H a fn ia

X

X

M o ra x e lia

X

X

P a n to c a

X

X

P e d io c o c c u s P ro te u s

,

X

P seudom onas

XX

P s y c h ro b a c te r

XX >

,

X

X

X

X

X

X

-■

X -

X

X

X

X

X

X

X X '■

i V

XX

1

X X

X

X

X

X

X

X X

XX

X.

X

X

XX,

X

X

X

XX

X • ■

X

XX

X

XX

'

X

X

*

Lactọ,baọjllu$

M ic ro c o c c u s

X

XX X

X

X

\

X

XX

Listeria

XX

XX

X

X

X

XX

L a c to c o c c u s

ị. ■

X

■

C a rn o b a c te riu m

L e u c o n o s to c

X

X

C a m D V lo b a cte r

X

-

X X

X X

X X

X

X

• .

1S

Tiếp bảng 2.2 Tên vi sinh vật (Organisms)

Đất và nước

Cây ngũ cốc rau quả

Vật chứa đựng

Salmonella Serratia

X

X

Shewanella

X

X

Shiaella

X

Đường tiêu hoa

Tay người dịch vụ

Thức ăn gia súc

XX

XX

X

X

Cơ thể động vật

Bụi không khí

X

XX

Staphvlococcus

X

Vagococcus

XX

XX

Vibrio

xxa

X

Yersinia

X

X

XX

X

X

Động vật nguyên sinh (Protozoa) c.paryum

X

X

X

E. histolytica

xxa

X

X

G.lamblia

xxa

X

X

T.gondii

X

G hi chú:

XX

Nguồn

XX

g â y ô n h i ễ m cao th ư ờ n g g ặ p .

a. Tác dụng trong nước b. Tác dụng trong đất Vi khuẩn được gạch chăn là loại thìỉòng gặp

1.4. Đường tiêu hoá của người và động vật: Hệ vi khuẩn đường ruột dễ gây ô nhiễm thực phẩm từ phân người và động vật trong đó có vi khuẩn gây bệnh như Salmonella và cả 4 loái động vật nguyên sinh, được giới thiệu ố bảng 2.2. Các loại vi khuẩn này thường gây ô nhiễm nguồn nước và lan rộng đo sử dụng các nguồn nước không sạch để rửa thực phẩm. 1.5. Tay người c h ế bỉến dịch vụ thực phẩm: Nguồn ô nhiễm từ tay người dịch vụ ăn uông và trang phục nhà bếp, nhà ăn tại các xí nghiệp thực phẩm thường phản ánh điều kiện vệ sinh của môi trường và dễ bị ô nhiễm vi khuẩn gây bệnh từ đất, nước bụi trong không khí và còn thêm cả lỗ mũi, miệng, tay và da của người qua quá trình thực hành thiêu vệ sinh của cá nhân trong cộng đồng. 20

1.6. Thức ăn gia Stic: Thức ăn là nguồn ô nhiễm Salmonella phổ biến cho gia súc và gia cầm. Nếu là cỏ rơm khô có thể là nguồn gây nhiễm Listeria monocytogenes cho sản phẩm sữa và thịt. Vi sinh vật trong thức ăn gia súc dược chế biến ở dạng khô, dễ dàng phát tán lan rộng qua cơ thể gia súc, gia cầm. 1.7. Cơ th ể động vật: Trong trường hợp là sữa bò các chủng vi sinh đã được phát hiện thường phản ảnh từ môi trường chăn nuôi, nguồn thức ăn gia súc và cơ thể động vật. Mặc khác các vi sinh vật từ cơ thể động vật sẽ gây ô nhiễm trở lại môi trường, vật chứa đựng, sữa và người chăn nuôi, thu gom, vắt sữa v.v... 1.8. Không khí và bụi: Phần lớn các chủng vi sinh vật được ghi trong Bảng 2.2 đều có thể gặp trong bụi và không khí sẽ gây ô nhiễm trong quá trình chế biến thực phẩm, chủ yếu là các vi khuẩn gram dương, nhưng không phải là nguồn gây ô nhiễm quan trọng. 2. NHÓM VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHAM (bảng 2.3)

2.1. Acinetobactèr (Akinetos: Có nghĩa là không có khả năng di chuyển): Vi khuẩn hình que (rods) gram âm, gần với họ Neisseriaceae, ưa hiếu khí mạnh, không khử nitrat. Tế bào còn non dạng hình que, nhưng tế bào già có dạng cầu khuẩn (coccoid shaped shells). Acinetobacter có mặt rộng khắp trong đât, nước và có thể gặp trong thực phẩm, đặc biệt các thực phẩm được bảo quản lạnh. Mole (phân tử gam) % G + c thành phần DNA của chủng là 39-47. Đã có sự dề xuất dựa trên các số liệu về lai giông, các chủng Acinetobacter, Moraxella và Psychrobacter có thể được xếp vào họ mới Moracellaceae, nhưng đề xuất trên chưa được chấp nhận. 2.2. Aéromonàs (sản xuất khí): Chủng hình que gram âm týp ưa nước thuộc họ Vibrionaceae, ‘nhứng hiện là họ aeromonadáceae. Vi khuẩn sản xuất một khối lượng lởn khí từ đường bị lên men; cư trú phổ biến trong ruột cá. Mole% G + c thành phần DNA là 57-65.

2.3. Alcaligenes (sản xuất alkali): Vi khuẩn hình que, tuy là gram âm nhưng đôi khi chủng vi sinh này có gram dương, lên men đường và có phản ứng kiềm, thường gặp phổ biến trong sữa nguyên liệu và sản phẩm gia cầm. Mole% G + G thành phần DNA từ 58-70, giống có đặc tính dị nguyên. Bảng 2.3. Mộ ỉ số chủng vi khuẩn thường gặp trong thịt gia cầm và hải sản. Chủng loại vi khuẩn

Gram

Acinetobacter

_

Aeromonas

-

Gan tựơì

XX

X

X

Thịt

XX

-

Alcaligenes

tư ớ i

Thịt chế biến

Bacillus ' +

Thịt hun sấy

Thịt gia cẩm

Gá và hải sản

X

X

XX

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

Brochothrix

Thịt bao gói chân không

1X

X

X

XX

Campylobacter

XX

Carnobacterium

+

Citrobacter

-

C lo s trid iu m

+

Corynebacterium

+

Enterobacter

-

Enterrococcus

..J.. _ ...

Escherichia

Hafnia Kurtbỉa 7

,

it.

Lactococcus L ầ c tò b a tó in u ?

'

Leuconostoc

Micrococcus fy lo ra x e lla

22

,

X

X

X

X

X

X X

XX

.

X

X

X

X

X

XX

i:

X

X

X

X

X

X

X

•+ :

X

+

X

XX .

X »

X

X

X

X

X

X

XX

X

X '

1

XX

XX

X

X

X

X

X

+

X

X

X

+

X

XX

X

X

XX

X

—

X

X

, i..’ +;

Listeria M icrobacterium

X

,.. H ’ ■ ...

!i ■ X

F la v o b a c te riu m

XX

X

X

XX

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

;

Tiếp bảng 2.3 Chủng loại vi khuẩn

Gram

P a n to c a

-

P e d io c o c c u s

+ -

P ro te u s

Thịt

Gan

tươi

tươi

-

Pseudom onas

-

P s y c h ro b a c te r

-

S a lm o n e lla

-

S e rra tia

-

S h e w a n e lla S ta p h y lo c o c c u s

+

Vagococcus

+ -

V ib rio

-

Y e rs in ia

Ghi chú:

Thịt chế biến

Thịt bao gói chân không

Thịt hun sấy

Thịt gia cẩm

Cá và hải sản

X

X X

X

X

X .

X

XX

XX

XX

X

X

X

X

XX

X

X

X

X

X XX

X X

X

X

X

X

X XX

X

X

X

X

X đã gặp;

XX

gặp nhiều lần

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Kiến thức mới về vi sinh vật thực phẩm tr. 201 (1) 2.4. Alteromonas (Another monad - tế bào đơn lẻ khác): Vi khuẩn (Alteromonas) thường gặp trong nựớc biển và hải sản, chỉ phát triển trong nước có độ mặp. Vi khuẩn gram âm, hình que di động và ưa hiếu khí. Mole% G + c của DNA từ 43,2-48. 2.5. Bacillus (Trực khuẩn):

1

Vi khuẩn hình que gram dương có bào tử hiếu khí, trái ngược với Clostridium là kỵ khí. Phần lớn trực khuẩn đều ưa nhiệt độ trung bình, ưa 'lạnh (Psychrotrophs) và chịu được nhiệt (thermophiles). Có hai chủng gây bệnh là B.anthracis (gây bệnh anthrax) và B. cereus. Cờn phần lớn chủng' không gây bệnh nhưng có thể gây ngộ độc dạ dày ruột. Mole% G + c của DNA từ 32-62 không đồng nhất (heterogeneity). r 22

2.6. Brochothrix (Brochos, ỉhrix, thread - sợi chỉ xâu chuỗi...): Vi khuẩn hình que, gram dửơng không hình thành bào tử, có liên quan chặt chẽ với vi khuẩn Lactobacillus và Listeria. Mole% G + c của DNA là 36. 2.7. Campylobacter (Campylo, curved - đường cong): Vi khuẩn gram âm hình que Mole% G + c của DNA từ 30-35.

xoắn cong, có thể ưa khí và kỵ khí.

2.8. Carnobacterìum (L.carnis - vi khuẩn của thịt): Thuộc giống vi khuẩn gram dương, hình que, catalase âm được hình thành thích nghi với một số vi sinh, trước đó đã xếp vào vi khuẩn Lactobacilli. Chúng gầa với nhóm Enterococci và Vagococci hơn là Lactobacillus. Có 4 loài (species) đã được cộng nhận là: - c.divergens (Lactobacillus divergens) C.piscicola (Lactobacillus piscicola) c.gallinarum c.mo bile Vi khuẩn lên men và mọc ở nhiệt độ 0°c và 45°c, sản xuấtkhí từ glucose do một sô" loài và moìe% G + c của Carnobacterrium là 33,0 37,2. Chủng khác Lactobacilli đo khôhg thể mọc ở môi trường có acetat và tổng hợp acid oleic. Vi khuẩn được phát hiện trong th ịt bao gói chân không và các sản phẩm tương tự như cá, thịt gia cầm. 2.9. Citrobacter: Vi khuẩn hình que, thường gặp ở ruột, lên men lactose chậm, gram âm, có thể' sử dụng citrat là nguồn gốc carbon độc nhất. c. freundii là loài có lAi th ế trong thực phẩm. Mole% G + c của DNA từ 50-52. 2.10. Clostridium (Cìoster, a spindle - con thoi, suối trục): Vi khuẩn hình que kỵ khí, hình thành bào tử phổ biến trong thiên Ithiên giông hệt với vi khuẩn ưu khíi. C á. nhiều: loại g ây . bệnh, cho người, tiế t độc tố ruột týp ABCD và E ỉ !(Clostridium perfringens welchii); c.botulinum và Bacillus cereua). -Vi. khuẩn ưa n h iệt độ trung bình 24-25° (Mesotrophie), chịu được; nhiệt độ. lạÁh (psyohrotrophic) và nhiệt, độ .cáo (thermophylic). . ị,'iu •>: .,' ■.•, , / í :. 24

2.11. Corynebacterium ịCoryne, club): Giống vi khuẩn hình que, gram dương thường gây hư hỏng các sản phẩm thực phẩm nguồn thực vật và thịt. Phần lớn vi khuẩn ưa nhiệt độ trung bình, tuy nhiên loại chịu nhiệt độ lạnh c . diphtheriae gây bệnh bạch hầu trên người. Mole% G + c của DNA từ 51-63. 2.12. Enterobacter:

Vi khuẩn đường ruột gram âm cùng với týp Entérobacteriaceae khồng chỉ thích nghi ồ đường ruột dạ dày. Đặc biệt E. agglomerous đã được biến đổi (transferred) sang giống Pantoea. 2.13. Enterococcus:

Vi khuẩn thích nghi với nhóm vi khuẩn D.cocci theo xếp loại Streptococcus (Lancefield classification), được phân bô" rộng tới 16 gram dương, tế bào hình trứng (ovoid cells) đơn độc cặp đôi hoặc chuỗi hgắn. Trước đây thuộc giống Streptococcus. ít nhất đã có 3 không tác động với nhóm D kháng huyết thanh (group D. antisera).

của loài kết loài

2.14. Erwinia:

Vi khuẩn gram âm đường ruột, hình que, đặc biệt đã phối hợp tác động gây mục n át cây (bacteria soft rot). Moỉe% G + c của DNA từ 53,6-54,1. 2.15. Escherichia:

Thuộc giông vi khuẩn được nghiên cứu chuyên sâu nhất, thường gây ngộ độc viêm dạ dày ruột. E.coỊi được xem là vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh an toàn thực phẩm. 2.16. Flavobacterium: Vi khuẩn gram âm, hình que có đặc tính phát sinh chuyển các h ạt sắc tô từ .màu vàng sang màu đỏ trên môi trường thạch, thường phát triển trên nguồn thực phẩm thực vật. Một số ưạ nhiệt độ trung bình, một sô' ưa lạnh .và có thể gây hư hỏng..thực phạm khi bảo quản thịt rau quả ờ nhiệt độ lanh.

25

2.17. Hafnia:

VỊ khụẩn đường ruột gram âm thường gây hư hỏng th ịt và rau quả trong bảo quản lạnh. H.alvei là loài di động và dương tính với lysin và ornthin. Mole% G + c của DNẠ từ 48-49. 2.18. Lactobacillus: Vi khuẩn gram dương, hình que, catalase âm, đôi khi có chuỗi dài. Trong thực phẩm phần lớn vi khuẩn ưa khí nhưng có loại kỵ khí, đặc biệt ký sinh trong dạ cỏ của động vật và phân người. Vi khuẩn phát triển phổ biến trong sữa, nhưng L.suebicus đă phát hiện thấy trong bột nhuyễn quả táo và lê. Vi khuẩn có thể mọc trong điều kiện pH acid 2,8 trong 12-16% cồn ethanol. 2.19. Lactococcus: Vi khuẩn gram dương, không di động, cataỉase âm, tế bào hình trứng hay hình cầu đơn độc cặp thành đôị hoặc chuỗi. Vi khuẩn mọc phát triển ở nhiệt độ 10°c, không mọc ở 45°c. Phấn lớn nòi (strains) Lactococcus tác dộng với nhóm N kháng huyết thanh acid L-lactic là sản phẩm chính của quá trình lên men. Có 4 loài (species) và 3 phân loài đã được công1nhận. Xếp loạt hiện tại L.lactis subsp.lactis L.ìactis subsp.cremoris L.lactis subsp.hordniae L.garvieae L.plantarum L.raffinolactis

Xếp loại củ Strep.lactís subsp lactis và Lactobacillus xylosus Strep.lactis subsp.cremoris Lactobacillus hordniae Strep.garvieae Strep.plantarum Strep.raffi nolacti 3

2.20. Leuconostoc (Colorless nostoc): Lèuconostoc cung với Lactobacilli đây là một giống khác với vi khuẩn acid lactic. Vi khuẩn gram dương, catalase âtn tính hình 'Cầu (catalase negative cocci) và lôn men khác loại (heteroferinòntãtivte). Phân tích bằng 16S rRNA một sô nhóm Lactobacilli’ cùng với LeuconoStos hình 'thành nhánh Leuconostoc (Leuconostoc branch) của Lactobacilli với L.óenos maíig một số đặc tính khác nhiều so với Leuconostocs. L.oenos là giông ưa acid và quan trọng đối với rượu vang. 26

2.21. Listeria:

Vi khuẩn có 7 loài, gram dương, hình que không quan tới vi khuẩn Brochothrix. Vi khuẩn có thành tế thành phần acid béo và thành phần cytochrom đã nhiều sản phẩm thực phẩm, cá, sữa, gây ngộ độc nguy monocytogenes).

có bào tử, có liên bào đồng nhất với gây ô nhiễm trên hiểm cho người (L.

2.22. Micrococcus:

Là cầu khuẩn gram dương, catalase dương, một sô' vi khuẩn sản xuất màu từ đỏ vàng da cam sang đỏ h ạt (red pigments) trong khi một số vi khuẩn khác không màu. Phần lớn vi khuẩn có thể mọc khi gặp môi trường có lượng NaCl cao. Vi khuẩn ưa nhiệt trung bình, tuy nhiên có loài chịu nhiệt độ lạnh. Đây là một giông rộng, có phổ biến trong thiên nhiên trong quá trình chế biến thực phẩm và ô nhiễm tay người dịch vụ. Mole% G + c DNA là 66-75. 2.23. Moraxeỉla:

Vi khuẩn gram âm hình que đã được xếp vào giông Acinetobacter, chúng khác với Moraxella do đặc tính dễ cảm ứng với penicillin và oxidase dượng tính. Mọle% G + c của DNA từ 40-46. 2.24. Pantoea:

Vi khuẩn gram âm, không nang (noncapsulated) hình que thẳng không nha bào (nonsporing straigth rodỊs). Phần lớn vi khuẩn di động bằng các lông roi (peritrichous ữagelỉa). Một số có hạt sắc tố màu vàng (yellow pigmented) và tấ t cả đều có oxidase âm. Vi khuẩn thường gặp trong cây, hạt, đất, nước và vật phẩm của người (human specimens). Mole% G + c cua DNA. từ 55,1-60,6. Giống Pantoea có hai loài, phần lớn là p.agglomerans baò gồm (Enterobacter agglomerans, erwinia herbicola, E.mílletíaẽ) và F. dispersa. Vi khuẩn không mọc ở nhiệt độ 44°c. 2.25. Pediocoóctìs (Cầu khuẩn mọc trên một mặt phẳng): Vi khuẩn dạng cầu khuẩn lên men đồng nhất (homofermentative cốcci) acid lactic, cặp đội và căp bốn là kết quả của việc phân chia tế bào trên hai m ặt ptiẳng, ĩ \ ạcịcụiactici, loài đã gây nhiễm khuẩn huyết (septicemia) trên một bệnh nhân Ậam 53 tuổi. Moĩẹ% G + c cua DNA ìà 34-44. ..

27

2.26. Proteus ;

Vi khuẩn đường một hình que, gram âm, hiếu khí, đa hình (pleomorphism). Tất cả đều di động được và phát triển trên bề mặt đĩa thạch ẩm. Là vi khuẩn đường ruột phổ biến trong ruột của người và động vật, trong các sản phẩm th ịt và rau qụả, đặc biệt bị hư hỏng ở nhiệt độ trung bình. 2.27. Pseudom onas (False monad - động vật đơn bào giả): Vi khuẩn hình qúe, gram âm thuộc loại vi khuẩn phổ bịến trong thực phẩm tứơL Mỏle% G + c của, DNA là 58-70, đã xác định vi khuẩn thuộc nhóm dị nguyên (heteroginous). Vi khuẩn có mặt rộng rãi trong đất và nước, thường gặp trong các loại thực phẩm, đặc biệt là rau quả, thịt gia súc, gia cầm và hải sản. Có một sô" loại thuộc Pseudomonas chịu được nhiệt độ lạnh (psychrothrophic) nên đã gây hư hỏng cả thực phẩm bảo quản lặnh, trong dó có loài đã sản xuất các h ạt sắc tố có màu xanh và xanh lá cây (blue green pigments) hoà tan trong nưức, trong khi một số' loài khác lại không sản xuất hạt màu. 2.28. Psychrobacter:

Vi khuẩn hlnh que, gram âm, di động, trước đây đằ được xếp vào giống Acinetobacter vá Moraxella, có hìĩih cầu tròn trình (plump coccobacilli) cặp đôì, ưa khí, không dí động, catalase và oxidase dương tính và không lên men glucose. Vi khuẩn mọc trong môi trường có nồng độ 6,5% NaCl ở l° c , không mọc ở nhiệt độ 35°c hoặc 37°c. Thường gặp phổ biến trong nưởc, thịt gia súc, gia cầm và cá. Đã có trường hợp được phát hiện tại bệnh viện, vi khuẩn đã gây nhiễm khuẩn m ắt trên bệnh nhân trẻ em 12 tuổi. 2.29. Salmonella:

Vi khuẩn. dường ruột, gram âm, không nha bào, hình que, dễ dàng phân biệt với E.coli đưới kính ỉũển vi ở môi trường bình thường. Mole% G + c của DNA từ 50-53. Trứng thịt gà và sản phẩm th ịt gía súc đều là thực phẩm trung gian truyền vi. khuẩn gây bệnh cho người. 2.30. Serratỉa:

Vi khuẩn hình quie, gram ám, thuộc họ Rĩìterobẩcteriaceke hiếu khí và là tác nhân thuỷ phân 'píoteiii, ốần xuất các h ật lủàu đỏ trêủ lAôi trườrig nuôi cấy và thực phẩm. s.liquefacieiiẩ là loại gây rígộ độc thực phẩm phổ biến và gây hư hỏng đối với thực phẩm thịt, rau quả bảo quản lạnh. Mole% G + c của DNA là 53-59. 28

2.31. Shewanella:

Vi khuẩn đã được xếp phân loại vào giống Pseudomonas putrefaciens và gần đây lại xếp vào nhóm mới S.putrefaciens cùng với nhóm Alteromonas putrefaciens. Vi khuẩn gram âm, hình que thẳng hoặc cong, không sản xuất h ạt màu và cử động bởi lông roi ở cực (polar Ílagella), có oxidase dương tính và có mole% G + c của DNA là 44-47. Giông vi khuẩn có 3 loài khác là s.hamedai, s.benthica và s.colwelliana. Tất cả đều gắn với nơi cư trú hoặc nước ngọt hay mặn và sự phát triển của s.benthica đã thúc đẩy lực thuỷ tĩnh (hydrostatic pressure). 2.32. Shigella:

Các vi khuẩn của giông này đã gây bệnh đường ruột cho cơ thể. 2.33. Staphylococcus (Grapelike coccus - cầu khuẩn hình chùm nho): Vi khuẩn cầu khuẩn giống quả bưởi, gram dương, catalase dương tính, bao gồm cả s.aureus, gây bệnh ngộ độc cho người, bao gồm cả viêm đường dạ dày ruột. 2.34. Vagococcus (Wandering coccus - cầu khuẩn lang thang không ổn định): Giống vi khuẩn được hình thành thích nghi với nhóm N.lactococci dựa trên số liệu kế tiếp 16S. Vi khuẩn cử động bởi lông roi, gram dương, catalase âm và phát triển ỗ nhiệt độ 10°c, không mọc 45°c. Vi khuẩn mọc trong môi trường có 4% NaCl, không mọc 6,5% và cũng không mọc khi pH là 9,6. Mole% G + c của DNA là 33,6%. ít nhất đã có một loài sản xuất H2 S. Vi khuẩn được phát hiện trong cả nước, phân người và ô nhiễm trong nhiều loại thực phẩm khác. 2.35. Vibrio:

Vi khuẩn gram , âm, hình que thẳng hoặc cong đều thuộc họ Vibrionaceae. Có một số loài đã được biến đổi (transferred) thành giống Listonella. Một sô' loại vi khuẩn thuộc Vibrio đã gây viêm dạ dày ruột và bệnh khác trển cơ thể người. Mole% G + c của DNA là 38-51. 2.36. Yersinia:

Vi khuẩn bao gồm cả tác nhân gây bệnh dịch hạch cho người. Y.pestis và có ít nhất một loài đã gây ngộ độc thực phẩm viêm ruột dạ dày [food borne gastroenteritis (Y.enterocolitiea)]. Mole% G + c của DNA là 45,8-46,8. , 2Ờ

3. NẤM MỐC GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHAM

Nấm mốc (molds) là những sợi nấm mọc thành khôi lộn xộn lan toả rấ t nhanh có thể bao phủ m ột diện tích lớn trong khoảng 2,3 ngày, thường được gọi là thể sợi nấm, (mycelium) bao gồm các sợi nấm (hyphae) và phát triển trong thực phẩm dưới dạng bào tử túi, bào tử nang (ascospores), hợp bào tử (zygospores) hoặc bào tử dính, h ạt dỉnh (conidia). Bào tử túi của m ặt số giống nấm có thể chịu được nhiệt. Việc phân loại giông nấm dã xác định có một số giông thường gây ngộ độc thực phẩm, gây bệnh thối rữa có đốm vết màu xám đen hoặc trắng trên quả, rau (hành củ). Bảng 2.4 và Hình 2.1 đến 2.15. a. N gành (Division): Zygomycota Lớp (Class): Zygomycetes Bộ (Order): Mucorales Họ (Family): Mucoraceae Giống (Genus): Mucor Rhizopus Thamnidium b. N g à n h Ascomycota Lớp: Plectomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Triéhocomạceae Giống: Byssochlamys, Eupenicillium Emerieella Eurotium c. Ngành: Deuteromycota Lớp: Coelomycetes Colletotrichum Lớp: Hypomycetes (sợí nấm (hyphae) phát triển thành, h ạt dính (conidia)’ Bộ: Hyphomycetales . Họ: Moniliaceae Ạltemarịa Ạspergilịus

Aureobasidium (Pullularià) ! 30

Botrytis Cladosporium Fusarium Geotrichum Helminthosporium Monilia Penicillium Stachybotrys Trichothecium Các giông nấm mốc dưới đây được xếp theo thứ tự chữ cái 3.1. Aỉternaria: Thể sợi nấm ngăn vách' (‘septate mycelia) với các cuống bào tử dính (cohidiophores) rộng có màu nâu. Các bào tử dính có vách đi qua theo chiều dọc của vách và có hình khác nhau (Hình 2.1). Nấm mốc Altemaria gây thối rữa có màu đen và nâu với các loại quả có h ạt như quả táo, vả, kể cả cuông thân cây và quả. Nấm mốc mọc cả trên lúa mỳ, trong sản phẩm thịt có màu đỏ. Một số loài tiết độc tô vi nấm như A.citri, A. alternata, A.solani, A.tenuissima khi mọc trên táo, cà chua. A.altemata còn tiết độc tô" Stemphyltoxin III đã gây đột biến khi thử test Ames (Ames assay).

Hình 2.1

3.2. Aspergillus:

Nấm mốc có dạng chuỗi bào tử dính (Hình 2.2) ở đó có nhiều bào tử túi phát triển. Nấm mốc được phát hiện trong thực phẩm là Emericella, Eurotium hoặc Neosartorya eurotium (nguyên thuộc nhóm glaucus) sản sinh "cleistothecia" có màu vàng sáng (brightyellow clếistothecia). ,E. herbariorum đã được phát hiện trong các loại mứt nho bị hự hỏng biến chất. Aspergillus thường xuất hiện với màu vàng, xanh lá cây vậ 4jãn trên, nhiều loại thực phẩm, gây thôi rữa có màu đen trên quả đào, chanh, vả hoặc trên th ịt sấy hun. Một số loài gây biến chất dầu cọ, dầu lạc vă dầu ngô. Aoryzae và A.soyae thường có m ặt trong quá trình lên men đậu tương. A. glaucus trong lên men cá A.niger trong sản xuất p TJ.HOB1UT

Hình 2.2

SI

galactosidase, glucoamylase, invertase, lipase và pectinase. A.oryzae sản xuất a amylase. CÓ 2 loài A.flavus. A.parasiticus sản xuất Aflatoxin, còn các loài khác sản xuất Ochratoxin A và Sterigmatocystin như A.Ochraceus, A.alliaceus... 3.3. Aureobasidium (Pullularia): Giống như lchóm nấm men (yeastlike colonies) nấm mốc A.pullulans (Pullularia pullulans) có vết đốm niàu đen gặp phổ biến trong thựcphẩm, thường phát hiện trong tôm với các vết chấm màu đen hoặctrên thịt bò bảo quản với thời gian dài, trong rau quả... 3.4. Botrytis: Nấm mô'c có cuông bào tử dính (conidiophores) dài, mảnh mai và có h ạt màu. Thể sợi nấm có vách (septate), bào tử dính (conidia) được hình thành từ tế bào đỉnh chóp (apical cells) có màu xám đen. B.cinerea thường gặp phổ biên trong thực phẩm (Hình 2.3) gây bệnh thối rữa có đốm vết xám trên quả táo, lê, mâm xôi, dâu tây, nho, chanh và một sô" loại quả có h ạt khác.

Hình 2.3 I

3.5. Byssochlamys:

Nấm túi (ascomycete) Byssochlamys thường mọc thành cụm mở (open clusters) (Hình 2.4). Mỗi cụm có 8 bào tử túi (ascospore). Một số giông được sử dụng trong sản xuất pectinase. B.fulva, B.nivea có thể gây hư hỏng các loại quả đóng hộp. 3.5. Cladosporíum:

Hình 2 4

Nấm .mốc mọc có sợi nếm màu đen, có bào tử dính trông, giống cành cây (Hình 2.5), mượt như nhung (valvety). Một số bào tử dính hình qúả chanh. Nấm mốc c.herbarum sản sinh các vết chấm đen trên thịt bò, cừu, bơ, h ạt lúa mỳ, mạch và gây thối rữa có vết đen với một số quả có hạt như nho. c.herbarum và C.cladosppriodes là hai giống phổ biến gây nhiễm trên raụ quả.

AJ, • \\ ^ ■% *1 I '

,, 32

Hĩnh 2.5

3.7. Colletotrichum: Nấm mốc thuộc .lớp Coelorriycetes dạng bào tử dính (Hình 2.6) có cuống (conidiophores) kéo dài hình chữ nhật có màu tốỉ. c. gloeosporioides ỉà loại gặp ^ phổ biến trong thực phẩm gây các vết đốm nâu đen trong một số quả vùng nhiệt đới như xoài, đu đủ. 3.8. Fusarium:

Thể sợi nấm mở rộng (extensive mycelium) dạng sợi bông (cottony) với các vết màu đỏ nâu tía. Vách hình thoi, thon dài hai đầu (fusiform) sản sinh bào tử dính hình cái liềm (bào tử dính to) (Hình 2.7). Nấm mốc gây thối rữa có màu nâu trên quả chanh, dứa, quả vả... Nấm mốc còn mọc trêri hạt lúa mỳ mạch. Một sô loài còn tiết độc tố vi nấm zearalenone và trichothecenes.

Hình 2.6

3.9 Geotrichum:

Geotrichun trước đầy còn gọi là Oi di um lactis và Oospora lactỉs. Nấm giống men (yeastlike) có màu trắng. Các sợi nấm (hyphae) là các vách và sự sinh sản được hình thành với cầc khớp bào tử dínli (arthroconidia) từ sợi nấm sinh trưỏĩig (vegetative hyphae). Khớp bào tử dính có hình bẹt ở cuối G.candidum thể tiệm biến (anamorph) tiến hoà dần của Dipodascus geotrichum là loài nấm quan trọng gây nhiễm thực phẩm, trong sữa pho mát gây mùi vị khác thường hoặc nhiễm trên thiết bị chế biến thực phẩm tại xưởng sản xuất cà chua đóng hộp. Hỉnh 2.8 G.albidum (Hình 2.8) gây thôi rữa chua (sour rot) quả chanh, lê và làm hỏng kem sữa. Nấm mốc còn gây ô nhiễm rộng trong sản phẩm thịt rau. 3.10. Monilia:

Nấm m ô C sinh sản bào tử dính màu hồng xám, hâu vàng (tan). M.sitophila là giai đoạn (stage) bào tử dính của Neurospora intermedia và còn là trạng thái (state) bào tử dính của Monilinia fmcticola. M. americana (Hình 2.9) gây thối rữa màu nâu với các loại quả có hạt như đào. Loài nấm mốc Monilina sp. gây hoại tử khô (mummification) quả dâu tím (blue - berries). 83

3.11. M ucor:

Là những sợi nấm không vách (nonseptatẹ (Sporangfu^ Cuống bào tử túi sinh s ả n thành cuống t ú i bào t ử (Sporangiospores) (sporangiophores) có lõi trụ ở giữa (columella) với các bào tử bọc (sporangium) ở đỉnh, (hình 2.10). Không IỊ n ịị cửir t có rễ (rhizoids) hoặc đọt mọc ngẩm (stolon). Có ít Ỉ Ị __ a JJ jg-(Columella) nhất một loài M.michei sản sính lipase. Thường gặp Cuống túi bào tử (Sporangiophores) trong các thực phẩm lên men, thịt sấy hun và nhiều loại sản phẩm rau quả. Có một loài lên men dung Hình 2.10 dịch sữa đậu nành (soybean whey curd).

hyphae)

3.12. Penicìllium:

Khi mà nấm mốc chỉ sản sinh bào tử dính hoặc cuống bào tữ dính thì giống nấm mốc dó được xếp vào Deuteromycota. Nấm mốc còn được xếp vào giống Talaromyces hoặc Eupenicillium khi hình thành túi nấm (ascomycetes) với bào tử túi Cuống dính {Sterìgma) (ascospores). Một trong hai giống "tận cùng" (teleomorphic) là Talaromyces dược xem là rất quan Cuồng bào tử dính í (Conidiophore) trọng dối với thực phẩm T.ílavus là giống tận cùng của p.đangeardii và chúng đã gây hư hỏng nước ép, Hình 2.11 đậm đặc các loại quả. Chúng còn sinh sản các bào_ tử có sức đề kháng nhiệt. Khi các bàọ tử dính đựợc , hình thành trên giông nấm mốc penìcillus (hình 2.11) và mọc trên thực phẩm chúng có màu xanh da trời, xanh lá cây và ỷìột số loài đã gây thối nĩa táo, lê, nho, còn loài p roqueforti thường pKat triển trên pho mát. Một số loài dã tiết độc tố như citrinin, độc tố vàng ở lúa. gạo, ochratoxin A rubratoxin và một số độc tố vi nấm khác. 3.13. Rhlzopus:

Sợi nấm không vách phát triển thành các đọt mọc ngầm dưới đất. Cuống túi bằo

tử p h á t tr i ể n

th à n h k hóm

Bàòtửnang Cụống bàotửtúi v à t ậ n (Sporangium) ., (Sporangíospores)

cùng bằng đọt mọc ngầm thành rễ rát ...jg&l (rhizoids) (hình 2.12) R.stolonifer thuộc (CrosTsecWon) loại thường gặp phổ biến trong thực .Cột íõi trụ giữa phẩm được gọi là nam mốc của bánh mỳ, Nhàn hạch ■ (Columella) (Nuclei) gây hư hỗng thối rữa các loại quả' táo, lê, r _ Pupng túi bàọ tử nho, vả... và gây các vết đốm đen trên I ^ s p o r a ngiophorés) thịt bò và cừy, bảo quản lạnh, thịt sấy hun. Một số loàisản sinh men pectinase " và R. oligosporus còn là nếm mốc quan tTọng trong sản xuất lên men sản phẩm Hìtih 2.12 đậu tương .(tempeh). >•.34

3.14. Thamnidium:

Nấm mốc sinh sản các bào tử nang nhỏ (Hình 2.13) T. elegans là loài mọc phổ biến trên thịt bò bảo quản lạnh và gây hư hỏng trứng.

Bào tử nang (Sporangium)

Cuống bào tử túi (Sporangiospores) Cuống tũí bào tử (Sporangiophores) Báo tử nang Bào tử nang mỡ rộng (Enlarged sporangiote)

3.15. Trichothecium: Sợi nấm có vách, thanh mảnh, cuông bào tử dính đơn giản (hình 2.14). T.roseum là loài gây các vết thối rữa có màu trên quả, ngô, lúa mỳ, mạch và cây hồ đào (pecans). Một số loài sinh độc tố vi nấm.

Hình 2.13

3.16. Các nấm mổc khác:

Có hai loại nấm mốc (categories) được chú ý đã gây hư hỏng thực phẩm, trước hết là loại Cephalosporium, Diplodia, Neurospora. Cephalosporium là nấm thứ sinh (đeuteromycấte) thường gặp trong các thực phẩm bảo qưản đông lạnh (Hình 2.15). Loại tiếp theo là Basipetospora, Hình 2.15 Chysosporixim, Eremascus, Polypaecilum, Wallemia và Xeromyces có đặc tính ưa khô (xerophiles) phát triển trong điều kiện hoạt tính của nước dưới aw 0,85. Wallemia thường gặp trong cá muối khô và Xeromyces đã gây hư hỏng thảo dược, cam thảo, mận khô ngay cả với điều kiện hoạt tính của nước trong thực phẩm aw cao C,D,E(F và G nhưng có 4 loại đã gây ngộ độc chết người là A,B,E,F. Thời gian ủ bệnh thường từ 12-36 giờ, nhưng cũng có thể sau 2 giờ vá kéo dài tới 8 ngày. 2. NGỘ ĐỘC DO ĐỘC Tố CỦA NẤM Mốc

Độc tố do nấm mốc hoặc độc tố vi nấm sản sinh do một số loại nấm mốc độc sẩn sinh rất khác nhảu về bản chất và hòạt tính sinh học, ồ nhiễm chủ yếu đối với các sản phẩm ngũ cốc 'đậu lặc và thức ăn gia súc V .V .. Aílátoxin là độc tồ vi nâra ' đó nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm chủ yếu trên một sô h ạt có dầu đặc biệt là lạc. : Phản ứng gây độc chủ yếu là gây độc trong gan rấ t n h iều : loại gia cầm và giá súc. Aflatoxin đã gây gộc và làm chết hàng trăm, hàng nghìn loại gia cầm gia súc. m

Nếu mức độ ô nhiêm thấp sẽ tích luỹ dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật và lâu dài sẽ gây ung thư. Đề phòng ô nhiễm và làm giảm mức ô nhiễm aflatoxin cần chú ý trong thu hoạch ngũ cốc, đậu, đỗ lạc, hạt có đầu, phải đảm bảo thu hoạch tốt nhất là lúc thời tiết khô ráo và bảo quản dự trữ trong điều kiện chông ẩm tốt, kho thông thoáng điều hoà được nhiệt độ và độ ẩm. Tại Việt Nam những điều kiện trên hiện đang là khó khări. Và khó khăn hơn cả không chỉ riêng ở Việt Nam nhiều người ít biết và quan tâm đến khả năng tích luỹ dần và tính độc chịu nhiệt cao, tồn tại lâu dài trong thực phẩm và môi trường của độc tố aílatoxin đã gây nguy hiểm ung thư cho người sử dụng các sản phẩm dễ bị ô nhiễm độc tố này. Rất khó loại trừ aílatoxin trong thực phẩm. Biện pháp rang nấu chín tại nhiệt độ cao có thêm độ kiềm thấp chỉ giảm được chút ít lượng Alfatoxin trong thực phẩm. Một sô' độc tô vi nấm ngoài alfatoxin thường gặp là ochratoxin do chủng Penicillium tiết và cả Aspergillus, độc tố zearalenon và tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết, độc tố patulìn lại do nấm Penicillium tiết và Fiimonisin. 3. NGỘ ĐỘC DO ĐỘC TỐ BIỂN (HÀI SẢN). Ngộ độc do ăn hải sản thường gặp là cá, nhuyễn thể đã bị nhiễm độc. Bản thân thịt cá và nhuyễn thể không độc nhưng đã bị ô nhiễm độc tố do một số chủng vi sinh gây bệnh ô nhiễm hay cá ăn phải rong tảo, hạt mã tiền có chất độc hoặc độc tố trong cơ thể hải sản tiết ra. Tetrodotoxin thường gặp trong các loại cá có bụng phồng to. Độc tố có thể gây chết người, nhất là khi loài cá đó được coi là món ăn quí tại Nhật Ngộ độc cá thường gặp là do độc tố ciguateratoxin, độc tố gây tê liệt do nhuyễn thể (PSP-Paralytic Shellfish Poisons) và độc tố nhuyễn thể gây ỉa chảy (DSP-Diarrhoeic Shellfish Poisons), và hìstamin V.V.. 3.1. Ngộ độc độc tố Ciguateratoxin:

Đã gặp trên khoảng 300 loại cá và nhuyễn thể. Nguyên nhân chírih do vi khuẩn ký sinh tiết độc tố tích luỹ cao trên cá và nhuyễn thể. Độc tố do vi khuẩn ký sinh và tiết ra trên cá chỉ độc đối với người, chứ không độc đối với cá và nhuyễn thể. Triệu chứng ngộ độc rõ nhất là khi ăn fcá có độc tố trên sẽ bị buồn nôn và đáu bụng đi ỉâ, có kèm theo các dấu hiệu và gây độc trên hệ thần kinh. • ' ■■■ 66

Để phục hồi bệnh nhân bị ngộ độc nhẹ hoặc nặng khi ăn cá có độc tô ciguateratoxin nhất là bị liệt tay và chân phải cần hàng tháng có khi tới 1/2 năm. Với trường hợp ngộ độc nặng thường bị co giật mạnh và chết. 3.2. Độc tố nhuyễn thể gây ỉa chảy (DSP):

Bao gồm một nhóm độc tố được sản sinh bởi một loại tảo (algae) có tên là Dinoflagellat. Khi nhuyễn thể án tảo Dinoflagellat đã sản sinh độc tô DSP và kết quả là độc tố DSP đã tích luỹ trong thịt cá và nhuyễn thể. Triệu chứng ngộ độc DSP thường gặp sau khi ăn độ 1 giờ và thường kéo dài tới 12 giờ gây nôn, đi ỉa và đau vùng bụng. Trên th ế giới đã thống kê được trên 1.300 trường hợp tại Nhật Bản, châu Âu và Nam Mỹ bị ngộ độc do DSP. 3.3. Độc tố nhuyễn thể gây tê liệt (PSP):

Thuộc nhóm độc tố do 3 chủng khác nhau của tảo sản sinh. Trong nhóm độc tô' này có độc tố do tảo sản sinh và tích luỹtrong thịt cá và nhuyễn thể, có loại do tự bản thân cá và nhuyễn thể sản sinh do chuyển hoá chất độc từ tảo. PSP thuộc nhóm gây độc thần kinh làm tệ liệt tay và chân của người bị ngộ độc, làm hoa mắt, chảy nước bọt và mù tạm thời. Trong trường hợp ngộ độc nặng có thể tê liệt bộ máy hô hấp và có thể chết. 4.

NGỘ ĐỘC THỰC PHAM

do

VI KHUAN GÂY BỆNH

4.1. Salmonella: Bệnh do Salmonella (Salmonellosis) là một bệnh cấp tính đường ruột do chủng vi khuẩn salmonella gây nên. Bệnh thường gặp ở người lớn, những rấ t nguy hiểm và trầm : trọng khi trẻ em bị nhiễm khuẩn Salmonella và càng ít tuổi cơ thể càng yếu, mức độ nhiễm bệnh và nguy hiểm sẽ cao hơn. Bệnh nhân bị nhiễm Salmonella thường mang v ik h u ẩ n tr o n g người khá lâu và bài tiết ra ngoài theo đường phan có khi hàng tuần hoặc lâu hơn nữa sau khi đã lành bệnh. Khi những người dịch vụ thực phẩm bị mắc bệnh do Salmonella cần cách ly yà không nên bô trí làm việc trong thời gian cồn mang khuẩn Salmonella. , •Và như vậy COĨ1 agười thường là nơi trú ngụ ổ phứa vi khuẩọ. gây bệnh, cáe động vật nuôi trong; nhà' inhư gia cấm, gia; sue ,là nguồn truyền lây nhiễm Salmonella cho người như thịt, trứng và gia cầm. 66

Một số thực phẩm khác cùng được liệt kê vào loại dễ bị ô nhiễm Salmonella bao gồm sữa tươi vừa mới vắt, sữa vắt đểlâu không qua thành trùng, cá bị nhiễm hoặc nuôi từ nguồn nước thải có phân, tôm, cua, nhuyễn thể, chân ếch tươi, sản phẩm từ trứng, sữa khô, thức ăn gia súc, thức ăn trẻ em, dừa khô, gelatin, bột sôcôla V .V .. Salmonella rất dễ bị huỷ diệt tại nhiệt độ thanh trùng Pasteur và không sống nổi sau khi thanh trùng tại nhiệt độ 75° trong 10 phút. Nhưng nếu bảo quản lạnh hoặc khô khi dưa trở về nhiệt độ thuận lợi Salmonella sẽ phát triển rất nhanh và có thể gây bệnh. Đề phòng bệnh do Salmonella cần thực hiện các biện pháp sau: Tất cả các thực phẩm có nguồn gốc dộng vật đều phải được đun nấu chín Sữa và sản phẩm sữa phải được thanh trùng Pasteur ngay sau khi thu hoạch chế biến. Tránh ãn trứng sống, trứng cổ vỏ bẩn hoặc rạn nứt. - Kiểm tra thanh tra vệ sinh nghiêm lò md và nơi giết mổ gia cầm gia súc. - Thức ăn cho gia súc cũng cần xử lý nhiệt. - Đảm bảo vệ sinh tốt trong quá trình sơ chế, chế biến thực phẩm. - Bảo quản tốt yà vệ sinh các thực phẩm đã nấu chín. Bảo vệ thực phẩm phòng sự ô nhiễm phá hoại của côntrùng. 4.2. Clostridium perfrigens:

Clostridium perfringens thựờng cư trú tròng hệ thống tiêu hoá của người và động vật. Khoảrig 25% quần thể dân cư hàng ngày thải Clostridium perfringens theo phân và sống rấ t lâu ngoài môi trường thiên nhiên trong đất và bụi, kết thành bào tử, gây ô nhiễm chủ yếu trong thịt gia cầm và ô nhiễm chéo tại khu vực chế biến sơ chế thực phẩm. Phần lởn các vụ ngộ độc thực phẩm do Clostridium perfringens gây nên là do ăn các thực phẩm nấu xong để nguội, trong các bữa cỗ tiệc như th ịt sấy hun, th ịt viên V.V.. Bào tử của Clostridium perfringens có khả năng chịu nhiệt và sẽ phát triển rấ t nhanh nếu sau khi nấu lại giữ thực phẩm trong điều kiện có độ ẩm và nhiệt độ thích hợp. Để đê phòng ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn có bào tử chịu được nhiệt khiđun nấu cần phải chú ý thực hiện một số biện pháp cần thiết sau: - Tất cả các thực phẩm chế biến để lạnh trước khi ăn cần nấu lại i. .. phục vu ăn nóng. - Thức ăn nấu chín để nguội nhanh và bảo quản lạnh cho tới khi án. 67

Khi ăn phải hâm nóng nhanh tới nhiệt độ diệt khuẩn và ăn ngay. Không ăn th ịt có miếng to, cần phải thái mỏng để dễ nấu chín đều và dễ dàng làm lạnh nhanh. 4.3. Shigella: Bệnh lỵ do con người mang trực khuẩn Shigella, truyền bệnh chủ yếu do nước và thực phẩm. Bệnh thường xảy ra tại các nước khu vực nhỉệt đới, có dân cưđông đúc, vệ sinh, thực phẩm kém và điều kiện suy dinh dưỡng cao. Bệnh lây truyền qua đường ruột, qua conngười vàsúc vật do nguồn nước và thực phẩm bị ồ nhiễm Shigella. Bệnh dễ lây từ người này qua người khác, sống đông đúc, quá chật chội, điều kiện vệ sinh kém rất dễ lây truyền bệnh có khi thành dịch đã trở thành nguyên nhân chính của một số vụ ngộ độc thực phẩm. Để đề phòng biện pháp tốt nhất là xử lý tốt vệ sinh nguồn phân nước thải, bảo vệ hệ thống cung cấp nước sạch, đảm bảo dịch vụ vệ sinh ăn uống trong tấ t cả các quá trình mua nguyên liệu sơ chế và chế biến, nấu nướng phân phối và dịch vụ án uống. Cũng như các bệnh do nguyên nhân thực phẩm khác phải rửa sạch tay sau khi đại tiện và trước khi chế biến thực phẩm, bảo vệ thực phẩm không để ruồi bâu và loài gậm nhấm côn trùng phá hoại. 4.4. Vibrio cholerae:

Cũng giống như các bệnh do Salmonella, Shigella, và sốt thương hàn, còn người là nơi trú ngụ ổ chứa nhiễm bệnh tả. Khi bị nhiễm Vibrio cholerae (phẩy khuẩn tả) con người sẽ bài tiết một lượng lớn Vibrio cholerae qua phân và gây ô nhiễm rất nhanh qua con đường thựo phẩm, nước và sữa. Nguồn nước bị ộ nhiễm Vibrio choìerae Tất dễ lây truyền sang các loại rau quả nếu sử dụng nguồn nưđc để rửa làm tươi hoạ quả và rấ t đễ dàng truyền bệnh khi người sử dụng các hoa quả đó. Cũng có thể truyền bệnh do ruồi và từ ngựời qua người Đề phòng có hiệu quả bằng các biện pháp clor hoá ĩỊguồn nước sinh hoạt, vệ sinh tốt nguồn phân nước thải và giáp dục vê sinh nhnng thục phẩm, người (lịch vụ thức ăn thực phẩm. 4.5. Salmonella typhỉ:

Sốt thương hàn là bệnh lây do nhiễm Salmonella; typhi, lẫý truyền do vật trung gian, cũng có thể do s.paratyphi A và c. ., I 68

Thực phẩm là nguồn gây bệnh dễ dàng và nhanh nhất do vi khuẩn có thể phát triển nhanh trong thực phẩm, nhất là thực phẩm chưa nấu chín, rau tươi, quả, rau sálát, bánh nhân kẹp, bánh bao, bánh rán, sữa chưa thanh trùng, nhuyễn thể, tôm, cua sống trong khu vực có nguồn nước thải ô nhiễm cao do nguồn phân người và động vật. 0 nhiễm thực phẩm còn do con người mang bệnh, nhưng chủ yếu là từ phân. 4.6. Campylobacter ịeịuni: Là vi khuẩn dược phát hiện cách đây khoảng 10 năm và là nguồn gây bệnh do thực phẩm khí sử dụng nguồn sữa không được thanh trùng cẩn thận, nước không được clor hoá đúng nồng độ qui định và thịt gia cầm không được nếu chín. Campylobacter jejuni dễ bị suy yếu và ngừng hoạt dộiig khi nhiệt độ cao như sấy, có m ặt của oxy bảo quản dưới nhiệt độ 25°c và có nồng độ NaCl thích hợp. Biện pháp đề phòng cầri chú ý vệ sinh tốt nơi giết mổ súc vật, nơi chế biến thực phẩm và không ăn thực phẩm chưa nấu chín đặc biệt là thịt sữa. 4.7. Listeria monocytogenes:

Listeria monocytogenes phân bố rộng rãi trong môi trường, đất, cát, nước. Có thể truyền bệnh qua đường miệng và phân, và đã phân lập được từ thịt nấu chưa chín, gia cầm, sữa tươi chưa thanh trùng, phomát và hải sản. Listeria có thể phát triển tốt tại nhiệt độ lạnh, do đó thực phẩm bảo quản tròng tủ lạnh có thể vẫn gây nguy hiểm. 4.8. Aeromonas hydrophlla:

Thuộc loại vi khuẩn sống phổ biến trong môi trường cả ở nước ngọt và mặn, đã ,gây bệnh cho người và dược cấy phận lập từ phân của người bị ỉa chảy, Cũng đã phân lập được từ cá, rắn, ếch, baba và hải sản, thịt ga vịt trâu bò và sữa tươi. Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ l-42°c chịu đựng và cạnh tranh tốt với nhiều loại vi khuẩn trong thực phẩm và sinh sản tốt trong điều kiện không có oxy. 4.9. Yersinia enterọcoỀitica: Thuộc họ Enterobacteriaceae ô nhiễm tròng thực phẩm sẽ gây ỉa chảy và nặrig íSẽ đau vùng bụng, Trong những năm gần đây vi khuẩn Yersinia đã đượe phát hiện gây nhiều vụ ngộ độc thực phẩm quan trọng,;

122

2.1.2. Thí nghiệm sinh hoá:

Lấy khuẩn lạc mọc trên môi trường TSI cấy vào môi trường urê, theo dõi sau 2-4 h nếu phân giải urê thì lại cấy vào môi trứờng glucose, maltose, saccharose, xylose, mannit, salixin, phản ứng v .p (Voges Proskauer), indol, H2 S, Simmons citrat và gelatin, ủ 37°c, theo dõi tính chất lên men các loại đường và phản ứng sinh hoá.

Urea

-

Gelatin

©

-1

Simmons' Citrate

©

e/.

Indol

-

~

Phản ứng

©

v.p

. -

Salixin

Mannitol

Xylose

Pr.mirobilis

S a c c h a ro s l

©

Lactose

©

Maltose

Glucose Pr.vulgaris

roX W

+

+2

-/+

+

+

-

+

+/-

+

+

Pr.morgani

©

-

-

-3

-

-

-

-

+

-

-

-

+

Pr.rettgeri

+4

-

-

+4

V

+

+/-

-

+

~

+

-

+

1 Chứ thích: + Sinh acid hoặc dương tính

ỉ. Đôi khi thấy vỉ khuẩn già trong phòng xét nghiệm thì dương tính, còn vi khuẩn mới phân lập được thì âm tính

© Sinh acid, sinh hơi - Ảm tính +/— Thông thường là dương tính - / + Thông thường là âm tính

V Phản ứng không nhất định

2. Rất ít âm tính 3. Đôi khi là dương tính 4. Thỉnh thoảng có nổi bọt

128

2.1.3. Nhận định kết quả:

Nếu trong th ịt muôi tìm thấy P r o t e u s , đồng thời về cảm quan thịt có thay đổi (ví dụ: mùi vị khác thường, thay đổi màu sắc...) thì thịt đó chỉ dùng trong công nghiệp hoặc huỷ bỏ. - Nếu tìm thấy Proteus trong th ịt muôi, nhưng về m ặt cảm quan vẫn bình thường thì thịt này có thể sử dụng trong thời gian ngắn. - Nhận định về vệ sinh thịt ướp: + Thịt lợn dùng để làm th ịt ướp muôi (gồm cả giăm bông) cần phải được thú y khám và kiểm tra giun sán. + Thịt muôi mà hàm lượng muôi ăn ở phần sâu trong th ịt dưới 7% thì cần phải kiểm tra cỵsticercus. + Trong th ịt muối không có Salmonella và các vi khuẩn gây bệnh khác. - Trường hợp lạp xường. Về m ặt vi sinh đổi với lạp xường người ta kiểm tra Salmonella và Proteus theo trình tự sơ đồ dưới đây. Còn về tính chất sinh vật hoá học và phản ứng huyết thanh của 2 loại này xin xem ở phần thịt tươi. Sơ đồ kiểm tra Salm onella và Proteus -

Môi trường dê theo dõi kết quả ?-4h

{-) Huyết thanh Salmonella --------- ►da giá

Báo cáo kết quả

124

Pròteus ị Thí nghiệm sính vật hóa học

3. KIỂM TRA CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Trực khuẩn độc thịt là một loại trực khuẩn kỵ khí có nha bào, sinh trưởng ở ngoài cơ thể, trong trường hợp kỵ khí với nhiệt độ 20°c thì mọc rất tốt v à sinh ra ngoại dộc tố có độc lực mạnh. Người ta căn cứ vào tính chất độc khác nhau mà chia thành 5 týp: A, B, c, D, E, trong đó týp A và B gây bệnh cho người.

Sơ đồ kiểm tra Clostridium, botuỉinum Mậu

1 Môi trường thịt băm

X Đur)

80°c 20 phút

3 7 °c 5-7 ngàỵ _________

r

ì_

________

~ Tỉnh D . hình .

Nhuộm Gram

t_ _ “

sinh trưởng

771— 7

Đía thạch máu {kỵ

37°c 3 ngày

r

T

Tiêm truyền I

,1

1

Thí nghiệm Chuẩn trung hồa

L

-

Đĩa thạch máu (hiếu khí) 37°c 48 h

S

1 Phản ứng

Hình thái khuẩn lạc

37°c 3 ngày

J Nhuộm và soi

J

I

T Ẹáo cáo kết quẳ

Người bị ngộ độc chủ yếu là do trực khuẩn đỘQ th ịt týp A và týp B gây nên (rất ít do týp E). Ngộ độc này là do độc tố vi khuẩn chứ không phải do truyền nhiễm, nên sau khi người ăn phải độc tố thì sẽ bị bệnh. Thịt bị nhiễm trực khuẩn độc thịt dùng làm lạp xường với tỷ lệ muối 8% thì vi khuẩn đó có thể sinh sản và sinh ra độc tố. Có nhiều trường hợp ăn phải lạp xường có độc tố trực khuẩn nên bị ngộ độc, bởi thế người ta gọi ngộ độc vi khuẩn thịt là ngộ độc lạp xường. 125

N h ậ n đ ịn h k ế t quà Thịt dùng để làm lạp xường phải là loại tô't, không được dùng lại có ký sinh trùng giun xoắn (Trichinella spiralis) và vi khuẩn gây bệnh Trong lạp xường có vi khuẩn dường ruột hoặc trực khuẩn kỵ khí có nha bào, không gây bệnh mà về cảm quan bình thường thì lạp xường đó được bán không hạn. chế. Những lạp xường có trực khuẩn Proteus nhung kiểm tra cảm quan bình thường thì phải sử dụng trong thời gian ngắn (dùng ngay) sau khi xử lý vệ sinh. Những lạp xường có trực khuẩn Proteus và kiểm tra cảm quan phát hiện mùi vị khác thường, màu sắc thay đổi, những lạp xường phát hiện được trực khuẩn độc th ịt và độc tô" của nó thì chỉ được dùng trong công nghiệp. c. KIỂM TRA KÝ SINH TRÙNG TRONG THỊT GIA s ứ c CÓ THỂ TRUYỀN BỆNH SANG NGƯỜI

Giun sán thường thấy trong thịt gia súc gồm có: Giun xoắn, sán dây bò, sán dây lợn, sán bào tử thịt. Giun xoắn, sán dây bò, sán dây lợn đều qua th ịt mà truyền sang người, còn sán bào tử th ịt tuy thấy ở người nhưng không phải do thịt truyền sang (Hình 8.10) 1. KIỂM TRA GIUN XOAN (TRiCHINELLA SPIRALIS)

Giun xoắn trưởng thành ký sinh ở ruột non lợn. Còn ấu trùng thì ký sinh ở bắp th ịt lợn. Giun đực (trưởng thành) rất nhỏ, dài 1,4-1,6 mm, rộng 0,04 mm; giun cái to hơngiun đực, dài 3-4 mm, rộng 0,04 mm có thể lên tới 0,06 mm. Nếu người ăn phải thịt lợn có giun xoắn thì ấu trùng vào ruột rồi tự tách vỏ ra, đôi khi 40 h sau đã phát triển thành giun trưởng thành. Sau khi giun đực, giun cái giao cấu, giun cái bám vào niêm mạc, ruột và trong một tuần sinh ra ấu trùng làm cho người bị bệnh giưn xoắn. Người bị bệnh thoạt dầu nôn mửa, ỉa chảỵ hoặc đôi khi bí đại tiện. Trường hợp bị nặng thì nhức đầu, lợm giọng và sôt, 9-10 ngày âu trùng xâm nhập vào bắp thịt, khi đó bắp thịt đau buốt (cơ nhai, cơ nuốt* cơ hô hấp) bệnh nhân bị khản tiếng, nhãn cầu có cảm giác bị bỏng và mắt bị sưng. Nếu ấu trùng xâm nhập vào nãò Ịtuỷ có thể gây viêm màng óc.

! -t

126

■ ■ -

Hình 8.10. Vòng đời cửa giun xoắn 1. Lợn nhiễm giun xoắn từ chuột 2. Giun xoắn đực, cái trưởng thành ở ruột

non

3,4.Âu trùng sống ở trong cơ bắp của lợn

1.1. Cảch làm: Lấy m ẫù'thịt ở phần dưới chân cơ hoành hoặc ở bộ phận xương chậu. Xé màng bắp thịt xem bằng mắt, sau đó lấy kéotheo thớ th ịt cắt lấy 24 mẫu th ịt ; to bằng' hạt/thóc nếp, đặt lên phiến kính, đậy lá kính và soi với bội số thấp. Thường kén giun xoán nằm trong thớ thịt, hình quả trám, chiều dàị của kén nằĩĩi song song với thớ thịt, trong kén có thể thấy dược giụn hình sợi cong Có khi tìm thấy kén giun xoắn ậẫ vôi hoá, đó là . những đốm trắng nhự đầu mũi kim nằm trong thịt. Nếu soi kính thì thấy tổ chức chung quanh kén tăng sinh, trong kén có chất vồ ĩ lắng xuông màu đen sẫm. r Đối với những tiều" bản'vôi hoá chỉ cần giỏ 15-20 giọt acid chlorhydriđ 10% để yên 2-3 giờ sau đó soi kính sê thấy hình giun xoắn hoậc mảnh vụn giun xoắn đã vôi hoá. , ■. T9-HCĐTUT

127

Sán giun soắn bình thường

H a i đáu kén vởi lắng

Vôi hoà chưa hoàn toàn

Vôi hoá hoàn toàn

Hình 8.11. Các giai đoạn kén giun xoận vôi hóa 1.2. Nhận định kết qụả: Trong 24 tiêụ bản được soi kính, số tiêu bản tìm thấy kén giun xoắn thường hoặc đã vôi hoá dưới 5 tiêu bản, thì thịt nạc và tim phải xử lý bằng nhiệt rồi mới được bán. Nếu trên 5 tiêu bản có kén thì thịt nạc và tim chỉ được dùng trong công nghiệp hoặc huỷ bd. Mỡ phần (lớp mỡ ở giữa da và thịt) phải đem rán thành mỡ nước, mỡ lá dược bán không phải xử lý, ruột phơi khô có thể cùĩlg làm ấo lạp xường, những phủ tạng khác đều dược dùng không hạn chế. 2. KIỂM TRA SÁN DÂY BÒ, SÁN DÂY LỢN

- Ấu trùng sán dây bò (Cysticercus bovis): Ký sinh trong cơ bắp thịt bò, sán dây bò (Taenia rhynchus saginatus) ký sinh trong ruột non của người. Người ăn phải thịt bò có ấu trùng sán dây bò, vào tới, ruột nhờ ông giác ấu trùng sán bám vào niêm mạc dần dần phát triển thành sán. Sán dây bò dài khoảng 10 m, có trên 1000 đôt. Sán có thể. sống lâu trong ruột làm cho người gậy mòn suy nhựợc (Hình 8.12). - Au trủng sán dây lợn (Cysticercus cellulosae): Ký sinh trong cơ bắp thịt lợn, sán dây lợn ký sinh trong ruột non của người. Người ăn phải thịt lợn có ấu trùiig sán dây lợn, tời ruột n h ờ ’bốn ống giác trêìi đầu và hai hàng móc nhỏ ấu trùng, bám vào niêm mạc ruột non và phát triển dầri thành sán dây lợn và có thể dài tới 2-4 m và ẹp 800-1000 đốt (Hình 8.13) ở ruột người đốt sán rụng ra khi gặp nhu động nghịch, (nôn mửa) vào dạ dày, sau khi màng trứng bị tiêu hoá, ấu trùng từ trứng .tách ra vào máu, rải rác khắp nới yà phát triển. Trựờng hợp nguy hiểm nhất đối với người là ấu trùng xâm nhập hệ thần kinh trung ương và mắt. Khi ký sinh 128

ở óc có thể làm cho người nhức đầu, mất trí nhớ, nôn mửa, thèm ngủ,.. trường hợp ký sinh ở mắt có thể gây thay đổi vị trí nhãn cầu, làm mờ mắt có thể mù. 2.1. Cách làm: Ấu trùng sán thường nằm trong cơ lưỡi, cơ nhai, cơ cổ, cơ lưng, cơ sườn và cơ tim của động vật bị bệnh, nên khi kiểm tra cần cắt lấy những bộ phận này để theo dõi. Âu trùng sán màu trắng, hình bầu dục, kén màu đục, to bằng hạt đậu tương. Trong kén có dịch thể, trên thành nang có một h ạt cứng, rắn, màu trắng, to bằng h ạt vừng, lấy hạt đó kẹp vào giữa hai phiến kính đã giỏ sẵn glycerin (1:30), soi kính với bội số thấp, có thể thấy rõ cấu tạo của đầu sán. Sán bò có 4 ống giác, sán lợn ngoài 4 ống giác còn có hai hàng móc nhỏ (Hình 8.14). Sán đã vôi hoá không có dịch thể yầ cũng không thấy đầu, chỉ thấy những đốm nhỏ màu vàng nhạt, to Iihỏ khác nhau.

2 Hình 8.12. Vòng đời sán dây bò 1.

S á n tr ư ở n g t h à n h s ố n g tr o n g r u ộ t

2.

Người bài tiết đốt sán

3,4. Bò nhiễm sán dây 5.

Ấ u t r ù n g s á n d â y bò vào n g ư ờ i

129

2.2. Nhận định kết quả

Về m ặt vệ sinh trên mẫu thịt lợn diện tích 40 cm2 được kiểm nghiệm (cơ nhai, cơ lưng, cơ hoành) nếu tìm thấy 3 ấu trùng sán chưa hoặc đă vôi hoá thì thịt đó phải ướp lanh hoặc ướp muối để xử lý rồi mới được đem bán. Nếu trên 4 ấu trùng sán phải cắt bỏ các bộ phận khác (cơ tim, phía ngoài cơ vai, phía trong cơ đùi) kiểrh tra cẩn thận, cằn cứ vào các bộ phận sán ký sinh và số lượng mà xử lý. Trên diện tích 40 cm2 nếu có 4-5 ấu trùng, sau khi xử lý bằng nhiệt độ mới được bán, nếu có 6-10 kén, thịt đó chỉ được sử dụng trong cống nghiệp hoặc huỷ bỏ.

Hỉnh 8.13.. Vòng đội sán dầy lợn 1.

Sán

dây ký

sình

ở r u ộ t lợn

2. Đốt s á n vào dạ dày gây nên hiện tượng nhiễm sán toàn thân 3,4,5. V ò n g gây nhiễm ngoài cơ thể

Thịt bò sau khi kiểm tra các bộ phận đã qui định (cơ nhai, cơ lưng, cơ hoành) cũng xử lý theo tiêu chuẩn của t h ị t lợn , >■ ĩ

130

Dạ dày, ruột, da của khác cần phải kiểm tra cứ tình huống nào cũng đối với mỡ lá không, có

động vật được bán không hạn chế, còn phủ tạng không có ấu trùng mới được bán.Mỡ phân, bât phải rán thành mỡ nước rồi mớiđược bán, còn sán có thể được bán tươi.

Trứng

Đầu

Đất sán

Hình 8.14. Sán dây lợn, sán dây bò

Hình 8.15., Sán bào tử thịt 1 .B àq tử sứa ả trong thịt*2. . đại

Thể .

b ào t ử r iê n g rẽ .

‘

phóng ;

3. B à o t ử s á n ở tr o n g th ớ t h ị t

Hình 8.15

m

3.

KIỂM TRA SÁN BAO TỬ THỊT

Sán bao tử th ịt ký sinh trong bắp thịt của động vật (Acnidosporidia). Hiện nay người ta chưa biết vòng đời của nó. Tuy sán không qua thịt truyền sang người nhưng khi kiểm nghiệm th ịt lại thường thấy ấu trùng sán và xen lẫn với các sán khác nhất là giun xoắn (Hình 8.15) 3.1. Cậch làm: Đôi với thịt lợn thì lây mẫu kiểm nghiệm giông như khi kiểm tra giun xoắn (chủ yếu là cơ hoành) đối với bò thì cữ bụng, c ơ lưng, còn đối với trâu thì cơ bụng và cơ thực quản. Sán bao tử màu trắng sữa, hoặc màu vàng xám, hình thoi, còn kích thước tuỳ động vật ký sinh có khác nhau: Sán bao tử bò (Sarcocystis hirsưtà) và sán bào tử trâu {S.blanchardi) to khoảng 5-20 mm, còn sán bao tử lợn (Sarcocỵstis mịescheriạna) thì khoảng; 2-3x0,1-0,3 min. Sán này không co bao nang, ngoài có một màng day, cắt mảnh, nhuộm bằng thuốc nhuộm Loeffler, soi bằng vật kính dầu.GÓ nhiều bao tử hình lưỡi liềm, dài tới 10 -16 ^1, có một nhân và đầu nhọn, cố một không bào. Phân biệt sán bao tử với giun xoắn trong thịt lợn Giun xoắn

S â n b a o tử

1. Khó thấy bằng mắt thường đôí khi chỉ th ấ y đ ố m trắ n g to b ằ n g đ ầ u kim (ỵôi ho á)

1. Thấy bằng m ắ t thường, có thể tháy trong b ắ p thịt, hịỉih sợi, m à u trắng, nằm song sona với thớ thit

2. Soi bằng bội s ố thấp th ấ y giun x ó ắ n n a n g hình trám , ở trong có d ịch th ể trong s u ố t

2. Soi bằng bội số thấp thấy có hình thoi m à u x ám đ ụ c , é p ra, n h u ộ m s ẽ th ấy nhiều b à o tử hình lưỡi liểm

3. Vôi hóa phần nhiểu từ hai đậu, phát triển d ầ n vào giữa

3. Vôi h ó a từ giữa, p h á t triển d ẩ n ra naoải

4. N hỏ ac id chlorhydric 1 0% th ấ y giun h o ă c v ế t giun

4. Nhỏ acid chíorhydric 10% vôi tan, s á n cũ n a m ất

5. Q u a n h chỗ giựn ký sinh, c ơ th ay dổt rõ rệt, m ất đường vần ngarig .

5. Đường vân ngang của cơ, nơi có giun bị m ấ t rất ít

3.2. Nhận định kết quả:

Nêu trong thịt có sán bao tử với sô lượng ít thì bán không hạn chế Nếu có nhiều và bắp thịt có biến đổi bệnh lý thì thịt đó chỉ được dùng trong công nghiệp hoặc huỷ bỏ, nếu không có biến đổỉ thì sau khi xử lý bằng nhiệt độ cao có thể cho bán. Nếu đường thực quản của trâu có nhiều sán bao tử thì bộ phận đó chỉ được dùng trong công nghiệp hoặc huỷ bỏ. V 132

PHỤ LỤC: Thịt và những test xét nghiệm (3) Thịt chế TT

Đếm vi khuẩn hiểu khí Đếm trước ủ ấm Đỗm B.cereus và

1

2 3

B a cillu s

biến không nấu nướng

Thịt ướp muối xông khói

Thịt nhân bánh

0

0

0 0

T h ịt chỉn

o

0

0 ®

©

spp

Cam pyJobacter spp

4

T h ịt tưdi gia súc gia cẩm , xúc xfch

Clostridia 5 . .. 0 6 , Coliforms © 7 Enterobacteriateae -' Enlerococci 8 9 Esch. co li ® i 0 10 Lactobacilli và ví khuẩn

0 o

© o

o 0

© o 0

o 0 © o 0'

■O 0 0 o 0

■

0 © © o 0 o 0

0

0 0

sinh acid lactic

11 12 13 14 15 16 17

© 0 e ® 0

Listeria m onocytogens Pseudom onas spp Salm onella spp Staphylococcus aureus

Nấm men và nấm mốc Y ersin ia spp

© 0 0 0 o

0 0 © 0 0

o

pH

Chú thích: @ Test khuyến cáo o Test bổ sung

;

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Vu Tiềm (dịch), Cao Ngọc Lăng (hiệu đírih) Thực phẩm vi sinh vật học kiểm tra pháp.' Nga văn dịch sarig Trung văn Kiev 1952. Nhân riân vệ sinh xuất bản xã - 1955. Bắc Kinh 2. Ngô Quang Tỉên. Thực phẩm vệ sinh-Ịdểm nghiệm thủ sách. Nhân dân vệ sinh xuất bản xã 1965. Bắc Kinh (Trung văn). 3. Refai MK. Microbiological analysis - Food Nutrition paper 14/4. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Rome 1979. 4. Pratical food Microbiology - Methods for examination of food for . microorganism of public health significance. Public Health Laboratory Service * London 1992, 60-65.

m

8 .2 . CÁ, TÔM, CUA, SÒ, ố c , HẾN 1. TÝP Vi SINH VẬT GÂY NHIỄM

Trên m ặt da cá và tôm cua sống có khoảng 102-103/cm2 vi khuẩn ưa lạnh, Gram âm là chủ yếu. Trong thực đạo có thể tìm thấy 10 vi khuẩn/g thuộc giống Pseudomonas, Acinetobactér, Moraxella, Achromobacter, Flavobacterium và Vibrio. Còn Micrococcus, Bacillus và Clostridium thì với sổ" rất nhỏ. Sự tăng sô' vi khuẩn trên là kết quả của những vi khuẩn làm hư hỏng. Conforms có thể không có hoặc có, thì chỉ với số rất thấp, không có Salmonella, Shigella và những vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác. Sự có mặt của chúng chứng tỏ sự ô nhiễm, mặt khác cá đánh bắt ở cửa sông hoặc hồ có thể mang vi khuẩn gây bệnh như Clostridium botulinum týp A,B,E và F cũng như Vibrio parahaemolyticus. Lúc đánh bắt có thể đưa vi khuẩn Coloforms hoặc trực khuẩn Gram dương, nhất là Staphylococci. Cá và sò phẩm chất tốt chỉ có dưới 105/cm2 (hoặc mỗi gam tổ chức) ở 20°c, Faecal coliforms, Staphylococci không vượt quá 10/g và 100/g. Không đuỢc có Salmonella và v.parahaemoỉyticus không quá 100/g. Qui trình đun nấu lần đầu bết hoạt phần lổn những vi khuẩn ưa lạnh thường có mặt tự nhiên. Hệ vi sinh vật trên sản phẩm sau này do nhiễm lại sau khi nấu nướng. Các vi khụẩn Gram dương như Pseudomonas phát triển có thể gây nên tự phân huỷ, vi sinh vật hiện có gây nguy hiểm cho con người là Staphylococci và v.parahaemoỉytỉcus. Vi sinh vật người ta tìm thấy sau khi chế biến do những gia vị cho thêm. Vi sinh vật quan trọng hơn cả là Salmonella và Staphylococci cũng như Faecal coliforms gây nguy hiểm cho người tiêu dừng. Khi không có những vi khuẩn trên số lượng vi khuẩn tăng lên ở 35°c (trên 500.000/g) được xem là báo hiệu tình trạng ngụy hiểm, Nếu số lượng tăng lên trong sản phẩm cuối cùng thì phai tính đến do quy trình sản xuất Trên cá hun khói người ta thường tìm thấy một số lớn vi khuẩn chủ đạo là vi sinh Gram dương: Micrococcus, Bacillus và n ấm men cũng còn có vi khuẩn Gram âm. Bào tử nấm mốc nhiều ở trên cá hụn khói, Staphylococcus aureus, Salmonella và CLbotulỉnum, chủ yếu là týp E có thể gây nguy hiểm, đối với cá hun khói, số vi khuẩn ,phẳỉ dưứi 105/g, Staphylococcus phải dưới 102/g và Faecal coliforms là 40/g. Tổng số 106/g là nghĩ tới tự tan (autolyse), Staphylococcus, vượt quá 1.0^/ậ và trên 40/g đối với Faecal coliforms là nghĩ tới nhiễm 4ọ thao tá a 1 Protein cá cô không có E.coli và vi sinh vật gây bệnh, -trong đó Salmonella và vi khuẩn hiếu khí khống 'được ỉvượt quá 10.000/g. 134

2. LẤY MẪU 2.1. Số mẫu:

Vì lý do kinh tế, số đơn vị mẫu để phân tích n được giới hạn là 5. Trong tấ t cả các trường hợp cá biệt khồng kể Salmonella, kế hoạch 3 lớp được xem như thuận lợi cao. 2.2. Tập hợp mẩu: Đối với các xét nghiệm thông thường thì lấy 5 mẫu hiện trường từ mỗi một lô và mỗi một hộp lấy 200 g. ớ nơi nào, toàn bộ cá đều đưa thẳng vào chợ bán lẻ, lấy mẫu hiện trường một con trong hộp đựng cá to và hai con trong một hộp đựng cá nhỏ, cá nhỏ thì lấy hai ba con. Lấy cả khúc cá to cho mỗi mẫu hiện trường, đôi với cá to quá cỡ thì lấy phần đại diện (thí dụ ba khu vực, từ các phần khác nhau của con cá); đối với sò ướp đá, thu thập một mẫu hiện trường trong 5 thùng chứa. Cách này cũng áp dụng cho tôm hùm và thịt cua. / 2.3. Chuẩn bị mẫu: Trường hợp cá tươi nguyên con, người ta tìm hệ vi khuẩn. Trên da cá dùng tăm bông quệt trẽn một diện tích (khoảng 200 cm2). Tăm bông quệt trên da cá hoặc phần rạch đều được cho vào;1Ọ ml nước peptone đệm. Trong trường hợp cá khúc, tôm, đuôi tôm hùm hoặc thịt cua thì cân 25 g mỗi mẫu thường cho vào 225 ml nước peptone đệm. Yêu cầu kiểm tra

1. 2. 3. Ạ. 5.

Đếm Đếm Đếm Phật Đếm

vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình Faecal conforms Staphylococcus aureus hiện Salmonella Vibrio parakaemoỉyticus

m

s ố m ẫ u k ỉể m tr a và giới h ạ n vi k h u ẩ n Test

M âu C ố tươi, c á lạn h , tô m đ ô n g lạnh

đông tươi

Vi k h u ẩ n hiếu nh iệt trung binh

khí

ưa

F a e c a l co n fo rm s S ta p h y lo c o c c u s a u re u s S a lm o n e lla

C á h u n khói, tôm luôc trước khi đông lạnh, tô m hùm , cua, sò

1

Vi k h u ẩ n hiếu nhiệt trung binh

khi

Ưa

F a e c a l co n fo rm s S ta p h y lo c o c c u s a u re u s

■Salmonella v .p a ra h a e m ơ ly tic u s

n

c

m

M

5

3

10®

1o 7

5 5 5

3 3 0

4 103 0

4x1 o 2 5x1 o 3

5

2

105

10®

5 5 5 5

2 2 0 2

4 to 2 0 1 o2

102 5x1 o 3

A. KIỂM TRA VI KHUẨN Ở CÁ TƯƠI Cá ươn là do tác dụng vi sinh vật gây nênf do đó kiểm tra số lượng vi khuẩn trong th ịt cá có thể xác định được mức độ tươi của cá. Kiểm tra vi khuẩn gây bệhh truyền nhiễm ỗ cá ít có tác dụng đôi với vệ sinh dịch tễ, vì theo các tài liệu gần đây vỉ khuẩn truyền nhiễm cho cá đều không tác hại đôi vói người. Trường hợp nguồn nước bị nhiễm Salmonella thì trong ruột cá sẽ có Salmonella. Trong ruột cá cũng có thể có Cl.botulinụm dó là những trường hợp gây ngộ độc thức ăn do cá cho nhân dân các vùng có tập quán ăn cá tươi hoặc cá muôi không qua nấu nướng. Việc kiểm tra vi khuẩn trong cá tươi chỉ có tác dụng trong điều tra nghiên cứu. Phương pháp kiểm tra sô' lượng vi khuẩn trong th ịt cá là phương pháp trực tiếp dưới kính hiển vi. C ách làm _1. Sau khi dừng kẹp cặp bông cồn đốt dí vào mặt thịt cá để tiệt khuẩn, đùng dao mổ vô khuẩn cắt một mẩu thịt cá ở phần nong và mọt mẩu ở phần sâu, to bằng hạt đỗ tương. 2. Dùng kẹp cặp mẫu thịt cá đó dí m ặt cắt vào phiến kính, phết thành vệt. Hơ lửa cho khô, cố định, nhuộm Gram và soi kính 3. Cá chưa ươn thì không có vi khuẩn hoặc chĩ có rất ít cầu khuẩn hoặc trực khuẩn

m

4. Cá mới bị ươn thì mỗi khoảng nhòm eủa th ịt ở phần nông khi phết kính có độ 30-60 cầu khuẩn và trực khuẩn, còn thịt ở phần sâu thì mỗi khoảng nhòm có độ 20-40 vi khuẩn. 5. Cá ươn có số lượng vi khuẩn trong mỗi khoảng nhòm nhiều hơn và có trực khuẩn có nha bào, trực khuẩn Gram (-) họ trực khuẩn đại tràng. 1. KIỂM TRA CL.BOTUUNUM

Cl.botulinum ở đường ruột các loại cá nhiều hơn so ỵối đường ruột động vật máu nóng. Thường khi ướp cá thì hàm lượng muôi trong cá ướp trên 10%, dôi khi tới 16-18%, mà chỉ-10% muôi cũng đủ ngãn ngừa Cl.botulinum phát triển và sinh ra dộc tck Theo thí nghiệm của Komkoba thì cá chiên ướp 8,2%, sodium chloride, sau khi cho nhiễm nhân tạo nha bào Cl.botulinum, bảo quán tfong 120 ngày vẫn không thây sinh sản độc tố, nhưng muối ăn không có tác dụng phá huỷ độc tô" đã hình thành. Nếu trước khí ướp cá không lấy h ết phủ tạng thì vi khuẩn xâm nhập vào tổ chức tế bào thịt, rồi sinh sản trong phần sâu th ịt và sinh ra độc tô'. Người ăn phải cá mặn này sẽ bị ngộ độc do độc tô" của Cl.botulinum gây nên. Kiểm tra Cl.botuỉinum trong cá mặn giống như kiểm tra vi khuẩn kỵ khí trong thịt (xem phần chi tiết trong mục kiểm nghiệm thịt). 2. KIỂM TRA TRỰC KHUAN s a l m o n e l l a

Rất ít thấy Salmonella trong cơ thế' cá và chỉ thấy khi cá sông trong nước bị nhiễm bẩn, thí dụ bởi phân vịt, ngan... Khi phân tích các loại cá sống trong nước bị nhiễm bẩn thấy tỷ lệ 1,64 đến 5,55% cá bị nhiễm Salmonella thương hàn chuột (Typhimurìum) và Salmonella viêm ruột. Năm 1928, Kaxaeva và c s (1) đã kiểm tra đường ruột 700 cá tươi sống trong nước sạch đều không thấy Salmonella- kiểm tra phủ tạng (ruột, gan, máu) 210 cá sông nước sạch cũng không tìm thấy Salmonella. Cách kiểm tra Salmonella trong cá mặn cũng giống như kiểm tra Salmonella trong thịt (xem phần chi tiết trong mục kiểm nghiệm thịt).

B. KIỂM TRA KÝ SINH TRÙNG Ở CÁ CÓ THỂ LÂY BỆNH SANG NGƯỜI Những kỷ sinh trùng mà túc chủ bổ sung (túc chủ trung gian thứ hai) là cá, túc chủ cuối cùng- lằ người thì đều có thể lây bệnh từ cá sang người. Những ký sinh trùng lây bệnh từ cá sang người thường thấy nhất là: - Sán khía đầu (Diphyllobothrium latụm) ,.J. - Sán hạt hêiíg (Cloĩiorchis sinensis) 187

Sán h ạ t mèo (Opisthorchis felineus) Sán dị hình (Heterophyes heterophyes) Sán Yokogawai (Metagonimus Yokogaivaỉ) 1. KIỂM TRA SỐ LƯỢNG SÁN KHÍA ĐẨU (PLEROCERCOID)

Ấu trùng Plerocercoid sán khía đầu (Diphyỉỉobothrium latum) ký sinh trong th ịt và trong phủ tạng của cá nước ngọt và ấu trùng đời thứ ba của sán này ký sinh trong ruột non của người và gia súc.

Hình 8.16. Vòng đời sán khía đẩu

Âu trùng đời thứ. nhất là ấu trùng móc câu từ trứng nở ra sau kfũ bị bọ nước ăn thì phát triển trong cợ thể bọ thành ấu trùng nguyên vĩ (procercoid), đó là ấụ trùng đời thứ hai, Bọ nước mang ấu trùng này saụ khi bị cá ăjỊ, phát triền trong cơ, gan, và buồng trứng cá thành ấu trùng đSri thứ' ba (pleròcercoid) ấu trùng này vào ruột người và bám vào thành ruột phát triển thành sán đài độ 10 Ih. Sán sống tròng ruột non người rấ t lâu năm và thải ra độc tố gây bệnh thiếu máu (Hình 8:16). 136

Cách làm: Khi phát hiện trong thịt cá có tổ chức hình tròn màu trắng sữa, dài độ 1-1,5 cm, rộng độ 2-3 mm thì lấy tổ chức này ép vào giữa hai phiến kính có dung dịch glycerin 1/3. Soi bằng kính .lúp hoặc soi kính hiển vi với bội sô" thấp sẽ thấy cấu tạo của sán, đầu sán có rãnh to, mình sán có vân ngang đó là ấu trùng Plerocercoid. 2. KIỂM TRA ẤU TRÙNG SÁN LÁ HẠT HỒNG

Sán lá hạt hồng (Clonorchis sinensis) và sán lá h ạt mèo (Opithorchis felineus) đều thuộc họ sán lá gan Opisthorchidae và ký sinh trong ông mật người (Hình 8.17 và 8.18). Túc chủ trung gian của sán này là ốc; cá nước ngọt là túc chủ bổ sung. Sau khi túc chủ trung gian ãn phải trứng, sán này vào cơ thể thì ấu trùng lông (Miracidium) từ màng trứng tách ra, phát triển thành kén bào tử (Sporocyst) rồi thành kén ấu trùng (ređia) và ấu trùng có đuôi (cercaria). Sau đó ấu trùng có đuôi tách khỏi túc chủ trung gian vào nước. Khi gặp túc chủ bổ sung thì vào tổ chức, đứt phần đuôi thành kén rồi thành hậu ấu trùng có đuôi (Metacercaria). Hậu ấư trùng có đuôi này thường thấy trong chân vây, chân vẩy, mỡ dưới da cá và nhất là trong thịt cá. Khi người ta ăn phải cá bị nhiễm sán, ấu trùng vào tá tràng phá vỡ kén chui ra, xuyên qua bóng Va-te (ampulla of Vater) vào ông mật chính, rồi ký sinh ở ông mật nhỏ trong gan. Khi bị nhiễm ít sán thì bệnh'nhân không thấy có triệu chứng rõ rệt, hoặc chỉ thấy ări không tiêu và ấn ở phía trên bụng thì thấy đau. Trườhg hợp bị nhiễm vừa thì thấy nôri mửa, ỉa chảy, gan to . Trường hợp bị nhiễm nặng thì thấy xơ gari hoàng đản, gan có khối u... có thể chết.

Í39

Mao ế u trù n g

Trưng

Hình 8.17. Vòng đời sán lá hạt hồng (Clonorchis sinesis) C ách làm : Lấy thịt ở dưới da cá (không nên lấy sâu quá), cắt thật vụn, cân lấy 20 gam cho vào bình nón với 20 ml dịch tiêu hoá (dung địch chứa 1% acid chlorhydric và 1% pepsin) ấm 37°c và cứ cách 2-3 h lấy ra lắc 1 lần. Sau 24 h thịt cá tiêu hoá, lấy ra chắt bỏ lớp nước trên, ly tâm 5 phút. Lấy cặn phết kính và soi. Có thể phát hiện trực tiếp bào nang màu trắng nhạt, to bằng dầu mũi kim ở thịt cá. Lấy h ạt này cho vào giữa hai phiến kính đã có sẵn 1 giọt dung dịch glycerin 1/3 đem soi và theo dõi. Hậu ấu trùng có đuôi của hai loại sán này có hình bầụ dục, phía trên và phía dưới có hai ống giác bằng nhau, đôi khi thấy sán ở trong kén di động lắc lư, hậu ấu trùng đuôi sán hạt mèo tương đôi to, dài độ 0,24-0,34 mm, rộng độ 0,19-0,24 mm; còn hậu ấu trùng đuôi sán h ạt hồng nhỏ hơn, dài độ 0,135-0,145 mm, rộng độ 0,09-0,10 mm.

140

Hình 8.18. Âu trùng sản lá trong thít \cá

Hình 8.19. Hậu ấu trùng đuôi sán hạt mơ trong cá

3. KIỂM TRA HẬU ẤU TRÙNG ĐUÔI SÁN Hộ DỊ HÌNH

Sán dị hình và sán Metagonimus Yokogawai là sán thuộc họ dị hình (Heterophyidae) ký sinh trong ruột người, túc chủ trung gian là ốc, túc chủ bổ sung là cá nước ngọt, Sau khi Ốc ăn phải trứng sán này vào cơ thể thì mao ấu trùng từ màng trứng tách ra thành bao ấu trùng, lôi ấu trùng, rồi th àn h ấu trùng đuôi và rời khỏi ô'c vào nước gặp cá phát triển th àn h hậu ấu trùng đuôi. Hậu ấu trùng đuôi phần nhiều ký sinh ở vẩy cá, th ịt cá, tế bào dưới da và ở vây đuôi cá. Khi người ta ăn phái cá có sán này ấu trùng sẽ phá vỡ kén chui ra nhờ ô'ng giác bám vào th àn h ruột non phát triển thành sán. Nếụ sán thuộc họ dị hình này ký sinh trong ruột non người thì; thường không có triệu chứng rõ rệt, dôi khi chỉ thây ăn không! tiêu, đau bụng ỉa chảy và khi đại tiện thì trọng phân có niêm dịch... . Cách, lủm: Nhử cách kiểm tra hậu ấu trùng cỏ đuôi sán hạt hồng, soi kính hiển vi nếu thấy có kén hình tròn, âu trùng ở trong kén này có hai ống giác hình tròn không đều nhau, ống giác ở bụng to gấp đôi ống giác ở miệng, đôi khi sán d trong kén di động lắc lư, hậu ấu trùng đuôi sán dị hình hơi to hơn, khoảng 0,16-0,19 mm, còn hậu ấu trùng đuôi sán Metagonimus Yokogawai nhỏ hơn, khoảng 0,12-0,16 mm. 141

c . NHẬN ĐỊNH VÀI LOẠI CÁ ĐỘC Có một vài loại cá có độc tô tự nhiên, độc tính mạnh có thể gây chết người, ở nước ta thường thấy những loại cá độc như: Cá nóc, cá mặt quỉ, cá m ặt ngựa.

1. CÁ Nồc Cá nớc là một loại cá không có vảy, thuộc họ Tetrodontoidae gồm: Cá nóc vân hổ (Spheròỉdes rubripés hình 8.20), cá nóc vân nhỏ (Spheroides vermvcularis Ịlình 8.21), cá ĨÍÓC giải (Spheroides xanthopterus), cá nóc sao (Spheroides niphoblesỷ và cá nóc vân cung (Spheroìdes oceỉlatus).

Hình 8.20. Cá nóc vân hổ (Spheroides rubrípes) Độc tố của cá ĩíóc ở trứng cá, buồng trứng và tinh hoàn nhiều nhất, rồi đến gan, còn ở máu, nhãn cầu và da rấ t ít. Độc tô" cá nóc là tetrodonĩhe và acid tetrodonic rất mạnh chịu được nhiệt

■ ' 1’ĩ, - ' ■ ■*: i. ■; ' : . ■, ■ - ' : - . ., ;, ;; ; ■^ , , :; Hình 8.21. Cá nóc vân nhỏ (S.vermicularis). 142

r■ ' •

Đun sôi độc tô" cá nóc trong 6 giờ, độc tô" chỉ giảm một nửa, và chỉ đun ở nhiệt độ 115°c trong 9 giờ, dộc tô" mới hoàn toàn bị phá huỷ. Độc tố cá nóc có thế gây tê liệt thần kinh trung ương, làm chết người, thường sau khi ăn phải cá nóc từ 30 phút đến 3-4 giờ bắt đầu thấy cảm giác khó chịu ở bụng, rồi nôn mửa hoặc tê liệt, lưỡi cứng sau cùng là tê liệt trung tâm hô hấp, rồi chết. Thường thường bệnh nhân chết sau khi bị ngộ độc 5 'giờ, rất ít trường hợp sau' một ngày. Chú ý: Cá nóc tuy độc, nhưng chất độc tập trung ở một số bộ phận nhất định, cho nên nếu moi hết ruột, rửa sạch máu, ướp muối và phơi khô độc tố bị huỷ hoại, vẫn có thể dùng để nấu ăn. Thịt cá này rất thơm ngon. Do đó cá nóc chỉ được bán để ăn sau khi đã xử lý đúng qui định. Để dề phòng ngộ dộc do cá nóc, cần nghiêm cấm bán cá nóc tươi, cá nóc có thân trước tròn thô, đuôi nhỏ dần, miệng nhỏ, giữa hàm răng trên và hàm răng dưới có một vết rách chia đôi, có bốn răng to. Vây ở sống lưng và vây ở bụng đối xứng với nhau và bằng nhau, không có gai và mọc ở gần đuôi, khí nang rất phát triển. Khi gặp kẻ thù thì phềnh bụng như quả trứng, lưng đen, có cọn có vân hoa, bụng to và hai bên phía dưới bụng màu trắng. >1 . ! I 2. CẢ MẶT NGỰA

Cá mặt ngựa (Cantherines modestus) (Hình 8.22) còn gọi là cá lợn, cá dao thợ giày, cá bánh mỳ, là m ột1loại cá tạp, sống ở lớp cát gần đáy biển, sinh sông bằng thực vật là chính. Thịt cá này có vị đắng và có chất độc không ăn được. Đặc điểm của cá này là hai bên thân hơi dẹt, bề dài gấp đôi bề ngang, đuôi to, đầu ngắn hai bên mặt thành hình tam giác. Mắt nhỏ hơi cao nằm ở cuối đầu, miệng, nhỏ, hàm trên có ràng. Vẩy rất nhỏ và mặt vẩy thành hình nhung tơ. Vầyr trên có gai,'gai thứ nhất dài và to, nằm ở phía trên mắt, gai thứ hai rígẩnvà nhổ nằm ở phía sau gai thứ nhất. Vây thứ hai phát triển nằm ở phía trên hậu môn. Vây ở dưới bụng thoái hoá thành một gai ngắn, gắn liền với mình cá, không cử động được.

T10-HCĐTUT

143

Hình 8.22. Cá mặt ngựa (Cantherines modestus) 3. CÁ MẶT QUỈ

Cá m ặt quỉ (Immỉcus japonicus) còn gọi là cá nhện biển, là một loại cá tạp ăn thịt, sông ồ gần đáy biển, ở chân gai vây có tuyến độc và độc lực rấ t mạnh. Đặc điểm của cá này là thân dài, đầu to đuôi nhọn, hai bên hơi dẹt, không có vẩy, đầu cá hình dạng không đồng đều, lưng lõm và có gai, miệng hơi to, trễ xuống. Có một vây lưng rất dài nằm ở phía sau đầu, gai to ở phía dưới mới có màng dính liền, khoảng cách ,gai thứ ba và thứ tư hơi xa. Vây ngực to và tròn, vấy ở đuôi dài và tròn.

Hình 8.23. Cá mặt quỷ (Inimicus japonicus)

144

PHỤ LỰC 1. KIỂM TRA VI SINH VẬT TRÊN CÁ, TÔM, CUA, SÒ, ốc, HỂN

Đ ế m dĩa

(ví

khu ẩn hiếu khí)

Tôm cá dự trữ

Sò luộc

0

0

Sừ tươi

Tôm cua luộc

Tôm cua

tươi

•

Aeromonas spp

©

tươi

0 0

0 •

Coliforms E s c h e ric h ia c o li

Cá

0

B.cereus và Bacillus spp. Clostridia

Cá đã nấu chín

®

o

•

©

•

0

L iste ria m on ocytog en es

Pseudomonas

0

Salmonella spp.

©

S ta p h y lo co ccu s a u re u s

Vibrio spp.

©

Nấm men nấm mốc

0

pH

0

Độc tố ciguatera toxin

0

Đ ộ c tô' dinoflagellate (P S P , D S P )

o

S com brotoxin

0

0 •

©

• 0

0

0

o

©

©

•

©

© ©

© ©

©

©

Chú thích • - Test bắt buộc © - Test khuyến cáo o - Test bổ sung PSP paralytic shellfish poison DSP diarrhetic shellffish poison

145

2. TIÊU CHUẨN VI SINH VẬT VÉ TÔM CUA, TÔM CUA LUỘC VÀ SÒ ố c HẾN

Q u y ế t đ ỉn h c ủ a H ội d ồ n g 93/51/EEC n h ư sau: Vi khuẩn gây bệnh

Không có trong 25g

• Salm onella spp.

;

n = 5, c = o

Vi sinh vật chỉ điểm vệ sinh kém (sản phẩm sò ốc hến) • S taphylococcus aureus • Conforms chịu nhiệt hoặc

m = 102, M = n = 5, c = 2 Escherichia coli

103

m = 10, M = 102 n = 5, c = 2

• Vi sinh chỉ điểm (chỉ đạo) dếm đĩa (30°C)

m = 104, M « n = 5, c = 2

105

• Toàn bộ sản phẩm sò hến (trừ thịt cua)

m = 5x1 o4, M= 5x1 o 5 n = 5, c = 2

• Thịt cua

m m == 105, 105, M M == 106

n = 5, c = 2 3. TIỀU CHUẨN VI SINH VẬT VỀ s ò (Molluscan Shell fish)

Điều lệ an toàn thực phẩm (1992) về sò tươi và các lọại chỉ đạo của EEC 91/492/EEC như sau: S ò tươi và các loại sò khác ăn ngay • Faecal conforms hoặc < 300 mỗi 100 Escherichia coli < 230 mỗi 100 Salmonella spp. không có trong 25 • Chất độc gây tê liệtcủa sò (PSP: paralytic shellfish poison) • Chất độc gây ỉa chảy của sò (DSP: diarrhetic shellfish poison)

146

sò khác, theo

g g g

< 80 |ig mỗi lOOg. Âm tính với phương pháp test sinh học

TÀ I LIỆU THAM KHÀO

1. Vụ Tiệm - Thực phẩm vi sinh vật học kiểm tra pháp (Nguyên văn Tiếng Nga). Nhân dân vệ sinh xuất bản xã - 1955 - Bắc Kinh 30-33. 2. Ngô Quang Tiên - Thực phẩm vệ sinh kiểm nghiệm thủ sách Nhân dân vệ sinh xuất bản xã - 1965 - Bắc Kinh, 120-135. 3. Refai MK. Manualsof food qualitycontrol-4. Microbiological analysis - FAO Nutrition paper 14/4. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Rome 1979. 4. Pratical food Microbiology - Public Health Laboratory Service London 1995, 51-56.

8.3. TRỨNG VÀ SẢN PHẨM t r ứ n g 1. TÝP VI SINH VẬT GÂY Ô NHIEM

Vỏ trứng lúc đẻ thì vô khuẩn hoặc có rất ít vi sinh vật. vỏ trứng bị nhiễm khuẩn sau khi đẻ do vật liệu làm ổ, bụi bặm và phân. Hệ vi sinh vật ở vỏ trứng chủ yếu là cầu khuẩn Gram dương, trực khuẩn Gram âm rất ít, chúng thâm nhập dễ dàng qua màng vỏ trứng và nhãn lên dễ dàng hưn là cầu khuẩn Gram dương. Số lượng vi khuẩn trong sản phẩm trứng còn phụ thuộc vào việc loại bỏ vỏ trứng, xưởng chế biến và điều kiện bảo quản trứng ở dạng lỏng. Giống vi khuẩn thường gặp nhất trong trứng ở dạng lỏng là Pseudomonas, Alcaligenes,!Proteụs và Escherichia, những vi sinh vật này là nguỹên nhân gây hư hỏng về màu sắc và mùi. Vi khuẩn sông sót sau khi diệt khuẩn bằng phương pháp Pạsteur của trứng dạng lỏng thông thường là Bacillus có sức đề khảng đối với nhiệt, Enterococcus và Micrococcus. Sản phẩm trứng diệt khuẩn bằng phương pháp Pasteụr hoặc bột trứng thì tổng số vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt trung bình thay đổi từ một trăm tới vài nghìn mỗi một gam. Vi khuẩn gây bệnh chủ yếu kết hợp với trứng và sản phẩm trứng là Salmonella. Số lượng Salmonella phân lập từ trứng lỏng không diệt khuẩn bằng phương pháp Pasteur dưới 100 cho một gam và thông thường là dưới 1 cho một gam. Hầu hết chúng bị tiêu diệt trong khi diệt khuẩn, nếu có mặt Salmonella trong sản phẩm trứng đã diệt khuẩn bằng phương pháp Pasteur thì chắc chắn do nhiễm lại. 2. LẤY MẪU

2.1. Số mẫu:

Lấy 10 mẫu ở hiện trường, tấ t cả đều được dùng để phát hiện Salmonella, 5 mẫu trong số đó để đếm vi khuẩn hiếu khí và Coliforms. 2.2. Tập hợp mẫu:

a. Trứng ỉỏng Quấy thật đều trứng đựng trong thùng, dùng ống nghiệm lấy mẫu vô khuẩn hoặc muôi, múc khoảng 400 ml mẫu, giữ mẫu ở khoảng 5 c nhưng tránh đông lạnh, quan sát và ghi chép mùi của từng mẫu như bình thường, bất thường hoặc có mùi mốc. b. Trứng đông lạnh Cạy lớp trên bàng rìu hoặc đục vô khuẩn, khoan ba lỗ từ đỉnh tới đáy thùng. Lỗ đầu ở chính giữa, lỗ thứ hai ở giữa tâm và ngoại vi và lỗ thứ ba ở gần rìa thùng. Dùng thìa vô khuẩn múc những vụn khoan cho vào thùng đựng mâu, giữ mẫu hiện trường băng cách làm lạnh khá thích hợp cho tới khi phân tích. 148

c. Bột trứng: Đối với bột trứng đóng gói nhỏ thì lấy cả gói hoặc vài gói để làm mẫu, đôi với bột trứng đựng trong hộp hoặc trong bình thì dùng thìa nậy lớp trên cùng, rồi dùng khoan khoét 3 lỗ như trong trường hợp trứng đông lạnh. Dùng thìa vô khuẩn lấy mẫu cho vào bình đựng mẫu, bảo quản mẫu ở lạnh hoặc chỗ mát. 2.3. Chuẩn bị mầu: a. Trứng lỏng: Trộn mẫu trong bình bằng thìa vô khuẩn, phái cẩn thận tránh tạo thành-bọt. b. Trứng đông lạnh (frozen eggs): Giữ bình mẫu đó nè' kín, để 2/3 đuôi bình ngập trong dòiig nước vòi mát, quay bình liên tục, cho đến khi mẫu tan giá, mở bình một cách vô khuẩn ,yà khuấy bằng thìa vô khuẩn c. Bột trùng: Mở bình đựng mẫu ở điều kiện vồ khuẩri và trộn bột trứng bằng thìa vô khuẩn, nếu mẫu bột trứng to thì dùng cối' chàỷ vô khuẩn dể nghiền. 3. Yêu CẦU KIỂM TBA

1. Đếm 2. Đếm 3. Phát Sô' mẫu

vỉ khuẩn hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình Coliforms. hiện Salmonella kiểm tra và giới hạn vi khuẩn

M au

Test

n

c

Trứng bỏ vỏ, trúng đông lạnh, bột trứng

Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình Conforms Salm onella

5

2

5 10

2 0

, ,

m 5 x1 o4 " 10 10

M

to6 1Ữ3

149

PHỤ LỤC 1. TRỨNG VÀ SẢN PHẨM TRỨNG(*) Bảo quản bằng các phưtíng pháp Khác nhau

Bột trứng

Lòng trứng dông cứng

Trứng tưdi lỏng diệt khuẩn phưting pháp Pasteur

Lòng trứng lỏng

Đếm đĩa (vi khuẩn hiếu khí)

•

•

•

•

B a c illu s

0

0

©

e

c e re u s

Trứng tươi lỏng

Vỏ trứng

0

và bacillus SPD.

o

Conforms Enterobacteria ceae

•

•

•

E s c h e ric h ia c o li

0

o

0

•

•

•

•

•

•

S alm onella spp.

•

Staphylococcus a u re u s

Alpha a m y la s e

I

• 0 •

.

.

©

• •

Chú thich: • Test bắt buộc © Test khuyến cáo ‘ 0 Test bổ sung (*) Pratical food microbiological - Public Health Laboratory Service London - 1995 - 47 - 50. 2. TIÊU CHUẨN VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SÀN PHAM TRỬNG

của

EEC (1993).

- Trứng tươi lỏng diệt khuẩn phương pháp Pasteur: + Vi khuẩn hiếu khí M = 105 mỗi g hoặc ml + Enterobacteriaceae M = 102 mỗi g hoặc ml + Staphylococci Không có trong 1 g hoặc 1 ml Salmonella spp Không có trong 25 g hoặc 25 ml $50

Tiêu chuẩn vi sinh vật đối với các sản phẩm trứng sau cũng giống như trên. + Lòng trứng lỏng (liquid egg albumen) + Lòng trứng đông cứng (crystalline egg albumin) + Bột trứng (powdered egg) TÀI LIỆU THAM KHÀO

1. Great Britain. The Zoonoses Order 1989. Statutory Instrument No. 285. London: HMSO 1989. 2. Great Britain. The Egg Products Regulations 1993. Statutory Instrument No. 1620. London: HMSO 1993 3. Hobbs B.c (1974), Food Poisoning and food hygiene. 3rd Ed. Edward Arnold, London 4. Internationa] Commission on microbiological specifications for foods (1974). Microorganisms in food II. Sampling for Microbiological analysis: principles and specific applications. University of Toronto Press. Toronto. Canada 5. Moasel, D.A.A (1977). Microbiology of foods. Occurrence, prevention and monitoring of hazards and deterioration. The University of Utrecht. Faculty of Veterinary Medicin 6. WHO Technical Report Series No.543 (1974) (Food borne disease: methods of sampling and examination in surveillance programmes: report of a WHO study Group). WHO, Geneva.

151

8.4. SỬA VÀ SẢN PHẨM SỮA 1. TÝP VI SINH VẬT GÂY Ô NHIỄM

Sữa có chứa một ít vi khuẩn khi vắt từ vú bò khoẻ mạnh. Tiêp đó sữa bị ô nhiễm từ ngoài con vật, khí quyển ở trại, xô, thùng đựng sữa, tay của những người vắt hoặc người chế biến sữa. Tuy nhiên những bệnh nghiêm trọng có thể bị lan truyền qua sữa từ con bò bị bệnh, trong sô' đó có Streptococcus, Brucella, Staphylococcus vi khuẩn lao và nấm men. Sự nhiễm khuẩn của sữa với vi sinh vật gây bệnh từ người là đặc biệt nguy hiểm sau khi sữa đă diệt khuẩn bằng phương pháp Pasteur. Sữa đặc hoặc sữa bột nếu thực hiện đứng qui trình sân xuất thì sản phẩm hoặc vô khuẩn, hoặc vi khuẩn ở tình trạng ổn định như sản phẩm bán trên thị trường; Vi khuẩn trong sữa có thể do đỗ chứa bị nhiễm những nha bào vi khuẩn chịu nhiệt cáo còn " sông sót, qui trình kỹ thuật không hoàn thiện, hoặc nhiễm trong và sau khi mở thùng chứa/ Nếu canh khuẩn thuần khiết là do sự có mặt của những nha bào vi khuẩn chịu nhiệt độ cao. Còn nhiễm vi khuẩn hỗn hợp chứng tỏ nhiễm sau khi tiến hành qui trình. Vi khuẩn Coliforms phải không có hoặc có m ặt thì chỉ là sô ít ỏi trong sữa bột. Staphylococci có men đông huỵết tương có khả năng có ở trong sữa bột, nhưng điều kiện sử dụng nhự thường lệ không tăng nguy hiểm. Nếu sữa bột đã pha, để lầu ỗ nhiệt độ thích hợp có thể cho phép Staphylococci phát triển, nguy hiểm có thể tàng vì sự sản sinh ra độc tô" ruột. Trong trường hợp sữa bột dùng cho trẻ em, hoặc bẩt cứ ai, đều phải xét nghiệm Salmonella. Sô lượng vi khuẩn ở trong pho m át tự nhiên hoặc chế biến theo qui trình nói chung không liên quan tới sức khoẻ hoặc sự an toàn của người tiêu dùng. Tuy nhiên pho mát làm từ sữa không diệt khuẩn bằng phương pháp Pasteur có thể chứa chấp Staphylococcus aureus. Nấm men, mấm mốc và Coliforms không sông sót khi sữa được diệt khuẩn theo phương pháp Pasteur và ít khi tìm thấy ở trong bơ khi chế biến theo sự chỉ đạo tô't. Nếu có thì chứng tỏ thiếu sót về vệ sinh. Sự đánh giá vi khuẩn này ở trong kem hoặc bơ lấy ồ bất kỳ giai đoạn nào của qui trình đều có ích trong việc phát hiện nguồn gốc ô nhiễm. Vi khuẩn ưa giá lạnh là nguyên nhân đáng chú ý trong sự hư hỏng của bơ. Sản phẩn sữa đông lạnh được thừa nhận là nguồn gây dịch do thực phẩm và các hình thái khác của bệnh. Bất kỳ thứ gì cho them vào sản phẩm sữa đông lạnh như quả, lạc, ca cao, trứng... đều có thể là nguồn nhiễm vi khuẩn Salmonella, Staphylococcus aureus. 152

2. LẤY MẪU 2.1. Số mẫu:

a. b. c. d.

Sữa tươivà sữa đặc: Sữa bộtvàkem: 10 Phomát: 5 Bơ: 5

5mẫu mẫu hiện mẫu hiện mẫu hiện

hiện trường trường trường trường

2.2. Thu thập mẩu:

2.2.1. Sữa nước: Ngay trước khi lấy mẫu đại diện từ kho hoặc thùng chở hàng dưới tằư nhừ thùng từ trang trại, kho nhà máy thực phẩm và thung chứa di động phải đảm bảo sữa ở trong thùng đã được trộn đồng nhất. Chuyển vô khuẩn một số lượng sữa thích hợp sang dụng cụ chứa mẫu (ít nhất 30 ml). Dùng mỗi ống đựng mẫu riêng cho từng mẫu, làm mát mầu ngay tức thời tới 0-4,4°C và duy trì nhiệt độ đó và gửi mẫu tới phòng thí nghiệm. Trường hợp sản phẩm đã được dóng gói xong lấy mẫu lễ đã ngủội và chuyển các mẫu đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt tới mức mà Việc thử nghiệm được khởi sự trong vòng 36 h sau khi thu thập mẫu. 2.2.2. Sữa đã làm bay hơi, cô và sữa đặc: Lây mẫu gốc, đóng kín, thùng chứa sữa hàn kỉn. Trường hợp thùng chứa sữa lớn, người ta lắc cho sữa ở trong thùng trộn đều hoàn toàn và lấy mẫu đại diện bằng thủ pháp vô khuẩn (lượng mẫu không dưới 30 g) cho vào dụng cụ chứa vô khuẩn. 2.2.3. Sữa bột: Để lấy mẫu, lấy mẫu gốc ở dụng cụ chứa đóng kín hoặc đóng gói như mẫu hiện trường. Khi thùng đựng mẫu lớn thì lấy mẫu ở gần trung tâm của thùng, dùng dụng cụ vô khuẩn gạt lớp sữa bột trên bề mặt, rồi lấy mẫu ì bằng' thìa hoặc cái thông (lượng mẫu không dưới 30 g). 2.2.4. Pho mát: Lấy mẫu thùng đóng kín gốc (Original), nếu không thì chuyển phần dại diện từ thùng đã mở, dùng dụng cụ lấy mẫu pho mát: dao vô khuẩn dể lấy mẫu, luôn luôn đề phòng mẫu có khả năng bị ô nhiễm, làm mát tức khắc tới 0-4°C và chuyển hoặc gửi tớiphòng thí nghiệm đệ kiểm tra. Vho mát cứng hoặc hơi cứng thì lấy ít nhất năm mẫu, mỗị mẫu phải trên 5 g từ các phần khác nhau của bánh pho mát. Pho mát các nhà riêng cũng phầi tuần theo việc kiểm tra và gửi' tởi phòng thí nghiệm thùng chứa gốc, trừ khi thùng to chuyển dịch bất tiện. 2.2.5. Kem nưỏc đá: Nếu cần thiết thì thu thập m |u trong thùng chứa gốc, gặp trường hợp mẫu nhiều kem nước đá và món tráng miệng đông lạnh, chuyển vô khuẩn phần mẫu. đại diện, trôn 50 g vào thùng vô khuẩn. Nếu thùng đã mỏ sẵn thì loại bỏ khoảng 2,5 cm phần trên trước khi lấỹ mẫu, Mẫu phải ướp lạnh ngay cho tới lúc phân tích. ,

m

2.2.6. Bơ: Chuyển ba phần bơ dã làm xong bằng dụng cụ lấy mẫu vô khuẩn, mỗi phần khoảng 10 g khu trú ở trung tâm và cuôi mẻ. Trường hợp bơ đựng trong các hộp hoặc đóng gói to thì lấy ít nhất 15 g bằng dụng cụ lấy mẫu từ hai phần khác nhau của thùng. 2.3. Chuẩn bị mẫu: 2.3.1. Sữa nước: Chuyển 25 ml sữa nước vào chai pha loãng đựng 225 ml nước đệm vô khuẩn. Trộn đều và pha loãng các đậm độ cần thiết. 2.3.2. Sữa đã qua bay hơi, cô và làm đặc: Chuyển 25 ml hoặc 25 g vào chai đựng 225 ml nước đệm vô khuẩn. Nếu màu mặt khác thường thì dùng nước cất đệm phosphat thêm 1,25% sodium citrate blank để pha mẫu sữa. 2.3.3. Sữa bột: Hầu h ết sữa bột có thể hoà tan trong nước cất đệm phosphat. Hoậ tan mẫu khó tan (more insoluble) (acid cao) ở 1,25% dưng dịch citrate. Đôi với những độ pha loãng ban đầu điều chỉnh nhiệt độ của dung dịch pha loãng tới 45°c và thêm 225 ml vào 25 g sữa bột. Lắc bằng máy lắc nhẹ để chờ cho mẫu tan hoàn toàn, rồi lắc đều và chuẩn bị pha các đậm độ thích hợp. 2 3.4. Pho mát: Chuyển một cách vô khuẩn 25 g pho mát và dụng cụ pha trộn (blender) đã làm ấm vô khuẩn 40-45°C có chứa 225ml dung dịch sodium citrate đã sưởi ấm cho 25 g sữa bột vào. Trộn trong 2 phút thành huyền dịch hoàn toàn (emulsify properly) (dung dịch: 1:10) và pha loãng tiếp những độ loãng thích hợp. 2.3.5. Sữa chua: Cân 25 g sản phẩm cho vào bình rộng miệng, cho thêm 225 mi nước cất đệm vô khuẩn, lắc cho đến lúc được đồng nhất. Tiếp tục pha loãng những đậm độ cần thiết. 2.3.6. Kem nước đá: Từ mẫu không tan pha loãng 1:10 bằng cách, cân 25 g sản phẩm đông lạnh trực tiếp trong 225 ml dung dịch pha mẫu. Nếu mẩu chỉ hơi đông lạnh nhưng còn hoàn toàn lầy nhầy (vicid) để ở nhiệt độ phồng thí 154

nghiệm khoảng 15 phút. Khi kem đã tan hết, trộn đều. Khi lấy ra pha loảng tiếp, cân vô khuẩn 25 g mẫu trộn đều cho vào chai đựng 225 ml nước cất đệm, lắc mạnh cho sủi bọt, rồi pha loãng bằng pipét. 2.3.7. Bơ: Làm ấm dịch pha loăng và pipét tới 40°c, rót 50% bơ vào để ở chậu nước dưới 45°c (thường để 15 phút) cho bơ lỏng để hút được là vừa. Thấm ướt pipét bằng cách hút thổi dung dịch nước ấm, chuyển ngay 25 ml trộn thật đều, mẫu tan trong 225 ml dung dịch pha loãng (40°C), lắc dung dịch pha loãng ở trong chai, pha tiếp đậm độ cần thiết. 3.

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA

3.1. Sữa lỏng và sữa đặc: a. Đếm vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình b. Đếm Coliforms 3.2. Sữa bật và kem nước đá: a. b. c. d.

Đếm Đếm Đếm Phát

vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình Coliforms Staphylococcus aureus hiện Salmonella

3.3. Pho mát: Đếin Staphylococcus aurẹus 3.4. Bơ: a. Đếm Coliforms. b. Đếm nấm men và nấm mốc

155

4. SỐ MẪU VÀ GIỚI HẠN VI KHUAN Mấu

n

Test

- Sữa tươi

- Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình (VKHK)

* Sữa diệt khuẩn bằng phương pháp Pasteur

- VKHK ưa nhiệt độ trung bình

c

m

M 2x1 o6

5x1 o4

- Coliform không được quá 5/ml - Faecal coliíorm 0

- Sữa bột

- Kem có phụ gia

- Pho mát

- VKHK Ưa nhiệt độ trưng bỉnh

5

2

5x1 o4

5x1 o5

- Conforms

5

2

2

102

- S. aureus

5

1

10

102

- Salm onella

10

0

0

- VKHK Ưa nhiệt độ trung bình

5

2

2,5x1 o4

2,5x1 o5

- Conforms

5

2

102

103

- S. aureus

5

1

10

102

- Salm onella

10

0

0

- s, aureus

5

1

103

104

PHỤ LỤC 1. TIÊU CHUẨN VI SINH VẬT Đốl VỚI PHO MÁT

(Điều lệ (vệ sinh) sản phẩm sữa S ả n phẩm

Sinh vật

Tièu c h u ẩ n Không có trong 25 g, n = 5, c = 0

Pho mát cứng

Listeria m onocytogenes

Tất cả các sả n phẩm

Salm onella spp

Không có trong 25 g, n = 5, c = 0

Pho mát mềm các loại

Pho mát làm từ sữa tươi hoặc sữa đã xử lý nhiệỉ Pho mát mém (soil) làm từ sữa xử lý bằng nhiệt

m = 103, M = 104, n = 5, c = 2 Staphylococcus aureus

Pho mát tươi Pho mát làm lừ sữa tươi hoặc sữa xử lý bằng nhiệt

.>

m = 102, M = 103, n=5, c=5 m = 10, M = 102, n=5, c=2 m = 104, M = 105, n=5, c=2

E sch erich ia colt

Pho mát mềm (làm từ sữa xử lý bằng nhiệt). Sinh vật chỉ điểm - đường lối chỉ đạo pho mát mềm {làm từ sữa đã xử lý nhiệt)

Không có trong 1 g, n = 5, c = 0

m = 102, M = 103, n=5, c=2 m = 104, M = 105, n=5, c=3 Conform s (3CfC)

Đường lối chỉ đạo vi sinh vật đối với pho mát mềm và pho mát tươi Không phát hiện vi khuẩn gày bệnh Listeria spp, trong 15x25 g mâu mỗi lô sả n phẩm cuối cùng

156

2. TIÊU CHUẨN Vỉ SINH VẬT ĐỐI VỚI KEM Điểu lệ (vệ sinh) sàn phẩm sữa

- Kem xử lý bằng phương pháp Pasteur (sản phẩm cơ bản là sữa tươi) Salm onella spp

Không có trong 25 g, n=5, c=0

Lisie ria m onocytogenes

Không có trong 1 g, n=5, c=0

Coliforms (30°C)

m=0, M=5, n=5, c=0

- Kem khử khuẩn UHT Đếm vi khuẩn hiếu khí (30°C)*

Chú thích:

*

Sau khi ủ ấm

Không quá 10 cfu mỗi 0,1 ml

ở

30°c trong 15 ngày

cfu: Khuẩn lạc trên đĩa môi trường (colony forming units) Điểu lệ 1983 sữa và sản phẩm

(kem xử lý bằng nhiệt)

- Kem xử lý bằng phuơng pháp Pasteur Test Coliforms (30°C)

Test ba ống Sau khi nuôi cấy và ủ ấm lại, không sinh hơi thì không phải Coliforms

Test phosphatase

Không quá 10ịug p.nitrophenol mỗi ml

- Kem diệt khuẩn/UHT Đếm đĩa ủ ấm ỏ 37°c trong 24h

Không quá 10 cfu mỗí 0,1 ml

3. TIÊU CHUẨN VI SÍNH VẬT Đốl VỚI KEM NƯỚC ĐÁ

Điểu lệ (vệ sinh) sản phẩm sữa. Tiêu chuẩn dối vãi sản phẩm có nguồn gốc sữa dông lạnh Listeria m onocytogenes

Không có trong 1g, n=5, c=0

Salm onella spp

Không có tròng 25g, n=5, c=0

Conforms (30°C)

m=10, M=10, n=5, c=2

Staphylococcus aureus

m=10, M=1ũ2, n=5, c=2

Đếm đĩa (30°C)

m=105, M=5

X

105, n=5, c=2

157

4. TIÊU CHỤẨN VI SINH Đ ố l VỚI SỮA KHÔNG x ử LÝ DÙNG LÀM THỨC UỐNG Điểu lệ 1989 (sữa bò) sản phẩm sữa Điéu lệ cho tất cả các thú^sữa

Đếm đĩa ủ ở Conforms

30°c

< 2 X 104 mỗi ml - Tan máu mạnh V++ PHƯƠNG PHÁP 2: LÀM GIÀU AERQMONAS DI ĐỘNG

1. Chuẩn bị mẫu đồng nhất trong nước peptone kiềm; 25g mẫu trong 225 ml 2. ủ ấm hiếu khí ở 30°c trong 18 h 3. Rỉa từ canh thang làm giàu lên hai dĩa thạch ampicillin để có khuẩn lạc biệt lập 4. ủ ấm hiếu khí ỗ 28°c trong 24 h 5. Lần cấy lại trên môi trường chọn lọc được những khuẩn lạc màu vàng mật ong bao quanh vùng mây đục của môi trường tinh bột thuỷ phân thạch tryptic soya. 6. Ghi tất cả những khuẩn lạc biệt lập màu mật ong baoquanh vùng tinh bột bị thuỷ phân nghi là Aeromonas spp. 7. Xác nhận khuẩn bằng các test: Nhuộm Gram Oxidase Catalase Di dộng

Trực khuẩn G ram âm

+ + +

Lên men m annitol O rnithine decarboxylase Sinh H 2 S Indole Kháng 0/129

+(-)* +(-) +

* Một số ít có phản ứng

229

TÀ I LIỆU THAM KHÀO

1. Furniss AL, Lee IV, Donovan TJ. The Vibrios. Public Health Laboratory Servica Monograph Series. No 11. London: HMSO, 1978 2. Lee JV. Vibrio. Aeromonas and Plesiomonas. In: Parker MT. Duerden BI (editors).: Principles of bacteriology, virology and immunity, 8th ed., vol 2: Systema bacteriology. London: Edward Arnold, 1990: 513-30 3. Wilcox MH, Cook AM. Thickett KJ, Eley A, Spencer RCị Phenotypic methods for speciating clinical Aeromonas isolates. J Clin Path 1992; 45: 1079-83 ,. , ; 4. Avery S.M (1991). Evaluation of enrichment methods and comparision of six selective culture media for isolating Aeromonas species from meat. Meat Ind. Res. Inst. N.z. Publ No 874 ' ' 5. Palumbo S.A., Maxino, F., Williairt.. (1985) Starch - Ampicillin agar for the quantiative detection of Aeromonas hydrốphila Appl. Environ Microbiol 50.1027-1Ơ300.

230

9.5. Đ ẾM BACILLUS S P P .

Bacillus spp. mọc dễ trến môi trường không chọn lọc nhưng'để đạt mục đích nhận diện cần phải sử đụng môi trường chọn lọc VI KHUẨN KIỂM CHỨNG

1. Bacillus cereus

- dương, mọc nhiều

2. Bacillus subtilis - dương, mọc vừa phải 3. Escherichia coli - âm, bị ức chế MÔI TRƯỜNG

1. Thạch PEIVỊBA (polymyxin pyruvate egg yolk mannitol bromothymol blue agar) hoặc 2. Thạch MYP hay PREP (Phenol red egg yolk polymyxin agar). Ca hai môi trường đều có mannitol 1%, lòng đỏ trứng dạng sữa 5%, polymyxin 100 IU mỗi ml. CÁCH LÀM

1. Chuẩn khuẩn mẫu đồng nhất 10'1 và mẫu thực phẩm pha loãng thập phân, 2. Dùng thạch PEMBA hoặc thạch MYP (mt 96) 3. ủ ấm hiếu khí ở 37°0 trong 24 h, tiếp theo là 24 h ở nhiệt độ phòng thí nghiệm đối vối thạch PEMBA, nếu đặc trưng khuẩn lạc chưa rõ ràng, còn ở thạch MYP thì ở 30°c thời gian 48 h, 4. Kiểm tra đĩa thạch1 khuẩn lạc dặc trưng ‘ - Khuẩn lạc tỏ (đường' kính 3-7 mm) màu xám xịt - Khuẩn. lạc vừa B.cereus màu ngọc lam (turquoise), màu biếc cánh trả (peacock blue) khi mọc trên thạch PEMBA và màu hồng thạch MYP do thiêu sự lên men mannitol và thường có vung đục bao quanh do sản sính lểcithinase. - Hầu hết Bacillus khác mannítol dương, xuất hiện khuẩn lạc màu xanh lá cây hay màu vàng, và không sản sinh lecithĩnase. NHẬN DIỆN

1. Xác nhận sự giổng hệt của B.cereus và Bacillus khác dựa vào test sinh hoá. Bảng dưới đây là những chủng thường gặp, quan trọng trong ngộ độc thức ãn.

2âl

Một s ố chủng bacillus spp. gây ngộ độc thực phẩm thường gặp B .cereus Ị G luc o s e (AS S ) Ị A ra b in o s e (A SS)

j ___

Ị

B .p u m ilu s

ĩ” ! B .s u b tilis

B.lichenlformis Í1 --------------------- —

.

-b

+

+ +

±

I____

+ + +

M annitqL (A S S )___ X ylose (AS S ) ____ K h ủ n il r a t ___

-ị—-..... +

"1 .... z_

+ t

M ọ c k ỵ k h í ______

Chủ thích: A SS: (ammonium salt sugar)

2. Tính toán: B.cereus hoặc Bacillus spp. mỗỉ gam thực phẩm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Holbrook R, Anderson JM. Aĩĩ improved selective and diagnostic medium for the isolation and enumeration of Bacillus cereus in foods. Can J Microbiol 1980: 26:753-59 2. Mossel DAA, Koopman MJ, Jongerius E.Enumeration of Bacillus cereus in foods. Appl Microbiol 1967: 15:650-3 3. Kramer JM, Turnbull PCB, Munshi G, Gilbert RJ. Identification and characterisation of Bacillus cereus and other Bacillus species associated with foods and food poisoning. In: Corry JEL, Roberts D and Skinner FA (editors). Isolation and identification methods for food poisoning organisms. London: Academic Press, 1982:261-86 4. British Standards Institution. BS 5763. Microbiological of food and animal feeding stuffs. Part 11. Enumeration of Bacillus cereus. London: BSĨ, 1994.

232

9.6.

Đ ẾM BACILLUS C ER EU S

NGUYÊN LÝ

Phương pháp này dựa vào kỹ thuật sử dụng đĩa môi trường có lòng đỏ trứng đế nhận biết Bacillus cereus bằng cách tìm vùng đục bao quanh khuẩn lạc. VI KHUẨN KIỂM CHỨNG

1. Bacillus cereus - dương mọc nhiều 2. Bacillus subtilis - dương mọc vừa phải 3. Escherichia coli - â m b ị ức c h ế

MÕI TRƯỜNG THUỐC NHUỘM

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Nước peptone đệm (mt58) Thạch KG (mt 75) hoặc MYP (mt 96) Môi trường nitrate di động (mt 47) Thạch dinh dưỡng (mt 68) Gelatine dinh dưỡng (mt 35) Mòi trường VP (mt 54) Thuốc nhuộm Gram (mt 102)

CÁCH LÀM 1. Chuẩn bị đồng nhất thực phẩm (xem đếm VKHK).

2. Pha loãng. 3. Nuôi cấy: Lấy 0,25 ml dung dịch mẫu pha loãng đồng nhất cho đã kho mặt và trang bằng que thuỷ tinh uốn vuông góc. 4. ủ ấm: Để dĩa ở nhiệt độ

30°c từ

lênđĩa thạch KG

20-24 h

Đếm khuẩn lạc (khả nghi B.cereus): Chỉ đếm những khuẩn lạc xung quanh có quầng tủa đục và tính tổng số mỗi 1 gam mẫu bằng cách nhân với 4 và độ pha loãng.

233

Xác nhận: 1. Từ những khuẩn lạc điển hình phết kính nhuộm Grain và soi kính hiển vi. 2. Đồng thời chuyển một sô" khuẩn lạc điển hình sang mặt thạch dinh dưỡng ủ ấm 30°c trong 24 h và từ khuẩn lạc mới cấy tiếp. Ong gelatine: Xét nghiệm về tính làm lỏng gelatine sau 24 h ở 20°c

Ông canh thang nitrate: Sau 24 h ủ ấm 35°c cho thêm 2 giọt alpha-napthol. Màu đỏ da cam chứng tỏ rằng nitrate đã bị đổi thành nitrite. Môi trường VP: Xem phần vi khuẩn đường ruột ở trên 3. Đặc điểm của Bacillus cereus: + Làm hỏng gelatine + + Hoàn nguyên nitrate + + Phản ứng lòng đỏ trứng + + Phản ứng VP + Gram + TÍNH TOÁN

Khi khuẩn lạc có quầng được xác nhận về hình thái dưới kính hiển vi và sinh vật hoá học, chúng được tính là B.cereus. ■■■■■■'■

1234

Ú-.

. ..

.. .

í

1 ml

1ml

1ml

'V

i

1m l

1ml

Phasing

. 9ml nước p ep to n e '

1:100

1:1000

1:10000

1:100000

1;tOCOOOO

một q u ầng tủa d ày đ ãc

5. Test sinh hoá f: Mnnnilof sinh acíd

&. Nii’ al đò + i .

f ■íỉ ;

(»..VP+

' n

r ‘^ ưalitm uskếtiủạ.độngạic

, ■. t>.;7iíih bật .yuựỊ phán ± c. Gelatlfi long +

H

’ ij

. r: .

' rì; .1?..

ị í Lí

i ‘-< ' i i i i

; ; ■■■

y. Òl đóng .*

hình 9.4. Đếm Bacillus cereus ■■■:■: I •

.-v ;ỉ! ■ ; !

,H K f

Vi-'V- (j'-b i*'-" 'yr3"1 < '!(

?:-.}■ ' í í ỉ * j

V:

^

—

: r-

:r

‘ .

' '

-.ì

■>>

> í-

V '- ý . ;

■

-

■

l'-í

Ỵ -;7 i> ''ỉ

'i ' ‘

I;'!•

2ỐỔ

9.7.

PH Á T H IỆ N BRUCELLA S P P .

Brucella spp là vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm nhóm ba. Mẫu canh khuẩn phải hết sức lưu ý để đề phòng lây bệnh. Thường không dùng phương pháp đếm vi khuẩn, cái chính là phát hiện Brucella trong thực phẩm. Các phương pháp được mô tả đều để phát hiện Brucella ở trong sữa, nhưng có thể thích nghi đối với kem, phomát mềm và các sản phẩm làm bằng sữa khác. PHƯƠNG PHÁP 1: NUÔI CAY TRựC TlẾP

Môi trường:

Môi trường thạch chọn lọc đối với Brucella là môi trường thạch cơ bản có chứa dextrose hoậc thạch máu hay thậch Columbia; có thêm 1% (w/v) dextrose vô khuẩn. Những môi trường này đều thích nghi khi cho dùng thêm 5% huyết thanh ngựa bất hoạt (nghĩa Ịà huyết thạnh đă đun tới 56°c và duy trì ở nhiệt đọ đó trong 30 phút) và cốc tai chứạ 5000 UI polymyxin, bacitracin 25.000 UI, cyclohẹximide lOOmg acid nalidixic 5 mg, nystatin 100.000 UI và vancomycin 20mg/Iít. Cảch làm:

1. Chuyền mẫu sữa vào ống nghiệm (1,80 mm x; 25 m ậ ỉ vô khuẩn và bảo quản qua đêm ồ 4°c. 2. Nhúng tăm bông lên lớp kem và ria lên mặt thạch chọn lọc 3. ử ấm đĩa thạch ở 37pc trong khí quyển có chứa 10% CƠ2 4. Theo dõi đĩa đâ cấy hai ngày một lần cho tới ngày thứ 10. Sau khi ủ ấm bô'n tới năm ngày thì thường thấy dược khuẩn lạc, đường kính 1-2 mm, lồi, bờ tròn, dều. Nhận diện:

Có thể nhận diện Brucella spp. bằng cách sử dụng kháng thể để ngưng kết trên phiến kính, Brucella spp. có thể được phân biệt tiếp theo bằng phương pháp nhuộm giải. Cách làm như sau: 1. Thấm đẫm giải giấy lọc vào fuchsin kiềm 1/200 hoặc thionin 1/600 rồi phơi khô. 2. Đặt dải giấy song song với đĩa thạch dextrose huyết thanh, trên phủ một lớp môi trường mỏng, để cho môi trường đông lại. 3. Cây chủng Brucella thẳng góc với dải giấy. 4. ủ ấm ở tủ 10% CO2 trong 3 ngày ở 37°c. 5. Kiểm tra chủng có sức đề kháng mọc ngay lên dải giấy, nhưng chủng nhậy cảm thì biểu lộ sự phát triển bị ức chế tới 10 mm. 236

,

;

’i

''

'

Các kiểu điển hình Brucella spp trên test dải thuốc nhuộm

Ị

Fuchsin kiểm 1/200

B. a b o r t u s __

phát triển

Ị

B .m e lite n s is

ỉ phát triển

Ị

B .s u is

j không phát triển

T h lo n ỉn 1/600

không phát triển phật triển____ L I

p h á t triển

PHƯƠNG PHÁP 2: NUÔI CẤY LÀM GIÀU VI KHUAN

Môi trường:

Canh thang cơ bản là canh thang hoặc môi trường thích hợp nuôi cấy sinh vật khó tính như canh thang nước hăm tim óc hoặc canh thang tryptone soya, bổ sung 5% huyết thanh ngựa vô khuẩn và kháng sinh như đã mô tả ở phương phập 1: Amphotericin B (4 mg/1) và cycloserịn (12,5 mg/1). Cách làm:

1. Ly tâm 100 ml sữa trong 30 phút ỗ tốc độ 1500 vòng/phút 2. Chuyển lớp kem và chất lỏng trong ồng ly tâm vào canh thang làm giàu vi khuẩn đựng trotìg ống nghiệm có nút xoáy với tỷ lệ 1/10. 3. ủ ấm ông canh thang nút xoáy lỏng trớng tủ ấm 37°c có 10% CƠ2 trong nãm ngày. 4. Cấy chuyển từ canh thang sang thạch lựa chọn với cách Ịàm như đã mô tả ở bước 1.2.3 của phương pháp 1.

TÀ I l i ệ u t h a m k h ả o

1. Brođie Sinton GP. Fluid and soliđ ríièdia for the isolation of Brucella abortus. J Hyg 1975: 74:359-67 2. FạrrelỊ ID, Rotinson L.A comparison of various selective including a new selective medium, for the isolation of brucella from milk. J Appl Bacteriol 1972: 35:625-30 3. Robertson L, Farrell ID, Hinchliffe PM, Quaife RA. Benchbook on Brucella. Public Health Laboratory Service Monograph Series, No. 1 4 ; Londbn: HMSO, 1980. :

237

9.8.

P H Á T H IỆ N C A M PY LO B A CTER J E J U N I, C.CO LI VÀ C.LA RI

Nuôi cấy trực tiếp ở thịt tươi gia cam là chủ yếu để phẩt híẹn Campylobacter spp. Có vi khuẩn thì phải xử lý bằng nhiệt, làm đông lạnh ướp lạnh. Ngưài ta không đếm Campylobacter. VI KHUẨN KIỂM CHỨNG

1. Campylobacter jejuni - dương phát triển nhiều 2. Escherichia r o ll. H,âm bị ức .chế; "V*-- .v

^lC: ■u

"

ị".:

V • 'K*..

PHƯƠNG PHÁP 1 NUÔI CẤY TRỰC TIẾP

: Qui trìn h riày có giá tri rihâV cho các mẫũ da gà', v ịt; 1

'

Môi trường thạch chọn Ịọc Exeter (xem trang 241). Cách làm: , t

n

■

'■ '

•,.

-

1. Lậy tăm bông lau mậu .thịt rồi c,ấy trên mặt thạch chọn lọc 2. ủ ấm đĩa ứ 37°c 4 h rồi ớ nhiệt (lộ 42°c troiịg 44-68 h ở bình khí quyển hydrogen (hoặc ^i.trọgen) ,cóh 1-15% khí CƠ2 và 1Q% oxy. Khuẩn lạc điển hình ,như sau; c Jejuni (và c.lari) phẳng (flat) bóng láng, (glossy), (effuse) toả ra và

CÓ

k h u y n h hựớng lan dạc tjheo)đường cấy .,M ộ t k h u ẩ n lạc chính

tề thì giống như g ịọ t;nước. Trên thạch ẩm ựớt làm thành màng mỏng. Nêu tiếp tục ủ ấm khuẩn lạc trở nên thấp và lồi, màu xám xịt, ánh kim loại. C.coli kém toả ra, khuẩn lạc thường lồi hình nấm, bề mặt luôn sáng bóng ■*'" • ■ • ■••••■■' ■ Nhận diện vế giống bằng các test sau:

1. Test oxidase dương

‘

'r ‘

' :

- V.

2. Phát triển trôn thạch máu ủ âm or 42°c trong 24-28 Ỉ1' ở điêu kiện vi ái khí (micro-aorobiờ) ‘ 1 \ '!ií 3. Gram âm, di động nhiều, hình chi? S hoặc xoắn, phanh chóng thoái hoá thành hình cầu ár nơi nhiếu oxy! - ' ' : ! ^ í c.jejuni, c ’coli và c.lari khắc nhau về tẹs.t sinh- hoặ (ỊỊỊíịb. 9-5)

238

Bảng phân biệt Campylobacter $pp. Thủy phân hippurate Campylobacter ịeịuni

+ '

C.coli

_

c.lari

Chú thích:

Nhậy cảm cephalotin

s s

R R

R

R

Nhậy cảm R Tự tiêu (resorbant)

s

■,

T17-HCBUIT

Nhậy cảm nalidixic acid

•• V

289

Đống nhất mẳu thực phẩm Dung dịch (0.1% peptone vá 0.85% NaCI)

Canh thang làm giàu Preslon

28W24 c

Thạch chọn lọc vi hiếu khl

48h/24*c

Gram

Di động

Oxidasa

Hippurate

Hình 9.5. Phát hiện Campylobacter P hư ơng p h á p đếm

240

Test kháng sinh

PHƯƠNG PHÁP 2 OANH KHUẨN LÀM GIÀU .(ẸNRICHEMENT CULTURE)

Canh thang ;thích hợp chứa đựng FBP (ferrous sulphate, sodium metabisulphite và sodium pyruvate, mỗi thứ đậm đệ 0,025%) để eải thiện {aero tolerance) sức chịu đựng thộng thoáng, ch,0 phép ủ thông thoáng. Kháng sinh cũng cần có để đề phòng vị sinh vật cạnh tranh mọc tràn lan đã có ở trong canh thang của Preston và Exeter. Canh thang Preston dựa trên nền tảng công thức thạch Preston. Canh thang Exeter cũng tương tự, nhưng gồm có cefoperazone cho- tính lựa chọn lớn hơn. Canh thang Exeter đã được chứng minh tỷ lệ phân lập cao so với canh thang Preston. Tính nhậy cảm, một vài thành phần đã chứng minh Campylobacter bị tổn thương gần chết có thể vượt qua bằng cách ủ ấm canh thang ò 37°c. : Môi trường: 1. Thành phần môi trủờng chọn ìọc Exeter như saư: . Nutrient broth (Oxoid N°2) 1000 ml Lysed blood 50 ml Trimethoprim 10 mg Rifampicip . 10 mg Cefoperazone , ,' 15 mg Polymyxin ,1 4 mg Amphotericin 2 rag ; Sodium pyruvate • i ! 250 mg Sodium metabisulphite FBP 250 mg Ferrous sulphate 250 mg Để đỗ đĩa thì thôm J 15g thạch 2. FBP (ferrous sulphate, sodium metabisulphate, sodium pyruvate) CÓ thể pha thành dung dịch 2,5%, một lít môi trường thêm 10 ml. Dung dịch này chỉ dùng trong một tuần, quá hạn phải bỏ đi. Kháng sinh cũng có thể pha thành dung dịch, mỗi thứ để riêng. Cách làm: 1. Đồng nhất 25 g mẫu thực phẩm trong 225 ml canh thang làm giàu Exeter. Canh thang phải để ở nhiệt độ phòng khi nuôi cấy, chuyển mẫu đồng nhất vào bình có nút xoáy, vặn chặt nút khi ủ 37°c từ 18-48 h. Điều chĩnh thời gian ủ theo mức .độ nhiễm của mẫu. Thí dụ như mẫu da gà thì ủ ấm 37°c trong 18 h; đối với mẫu nước, nơi đây tế bào vi khuẩn bị tổn thương nghiêm trọng nên phải ủ ấm tới 48 h. 241

2. Cấy lại trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp 3. ủ ấm đĩa thạch ở 42°c trong 24-48 h trong bình khí quyển có điều chỉnh (xem phần trên). 4. Các bước tiến hành tiếp theo giống như đã tả ở các bước 2 và 3 của phương pháp nuôi cấy trực tiếp. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. iSkirrow MB. Campylobacter, Helicobacter and other motile, curved gram-negative rods. In: Parker MT, Collier LH (editors). Principles of bacteriology, virology and immunity 8th ed., vol. 2: Systematic bacteriology. London: Edward Arnold, 1990: 531-49 2. Humphrey TJ. Techniques for 4;he optinum recovery of cold injured campylobacter jejuni from milk and water. J Appl Bacteriol 1986: 61:125-32 3. Hutchinson DN, Bolton FJ. Improved blood-free selective medium for the isolation of caựipỵlobacter jejuni from faecal specimens. J Clin Pathol 1983: 37:956-7 4. Bolton FJ, Robertson L.A selective medium for isolating Campylobacter jejuni / coli. J Clin Pathol 1982: 35:462-7 5. Skirrow MB. Campylobacter enteritis-, a "new" disease. Br Med J 1977: 2: 9-11. 6. Humphrey TJ, Muscat I. Incubation temperature and the isolation of Campylobacter jejuni from food, mil,k and water. Lett Appl Microbiol 1989; 9:137-9 7. Microbiological methods for the meat industry - 2nd 199Ị. Edited by R.L. Cook, 7.2.1-7 2.7

:

::

242

,.-i

r

-

I'

i

I

' i

9.9.

PH Á T H IỆ N CL.BOTUUNƯM VÀ ĐỘC T ố BOTULINƯS TRONG T H ự C P ĨỈẨ M

NGUYÊN LÝ i ■•

i

:

Phương pháp này dựa vào sự phát hiện 'trực khuẩn Gram dương điển hình, gần cuối có bào tử hình trái xoan, mọc trên môi trường thịt bàm, lắm đục môi trường, sinh hơi và tiêu hoá tí chút thịt. Vì Clostridium botulinum rất giống Clostridium không gây độc tố thông thường khác nên việc phát hiện miễn dịch dộc tố đặc hiệú vẫn là cẳch làĩri chủ yêu'. Việc phát, hiện độc tố trong nước lọc môi trường hoặc, trên mẫu thực phẩm dựa vào sự bảo vệ chuột bằng kháng độc tố đặc, hiệu týp (type^speciíĩc antitoxin) kỊii tiêm vào màng bụng chuột nưọtẹ nổi của canh khuẩn hoặc chiết xuất thực phẩm. , ( THIẾT BỊ VÀ DỤNG c ụ THUỶ TINH

1. 2. 3. 4. 5. Ị 6. ,7.

Pipet ■ ; :N'Kim tiêm 'dưới da để tiêm chuột nhắt ong ly tâm phù hợp .Máy nghiền cơ học có thể đồng nhất mẫu thực phẩm lượng nhỏ Máy ly tấm Tú ấm 30°c j ì. : ... Chậu nước 50°c, 80°c

MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ

1. Môi trường thịt băm (Cooked meat medium) (mt 51) 2. Dung dịch nước muối vô khuẩn (mt 34) 3. Kháng độc tô' da và đơn giá ;

.

CÁCH LAM

1. Phải hiện Cỉ.botuỉinum Sống sỏi:

■

1. Nuôi cấy: Khoảng" 5 g mẫu thực phẩm đã đồng nhất vào ba ống môi trường thịt-băm đun sôi và để nguội. Bún nóng mộtống tới 60°c trong 15 phút, một ống khác ìên 80°c trong 30 phút trong chậu nước, còn ống, thớ ba thì không đun. 2.. ỊỬ:ấĩty,jủ. ấJjì tất cả. 3. ống ỗ 30°c trong 5-15 ngày và xem độ vấn ì, đụe.ìíốinh: hợi yịi tịêu boẶ mẩu th ịt.: , 1

243

3. Xét nghiệm: + Sau 5 ngày theo dõi về vẩn dục, sinh hơi, tiêu hoá các mẩu thịt và mùi. Phết kính, nhuộm Gram và soi kính, quan sát về hình thái của vi khuẩn và ghi tê bào vi khuẩn Clostridium điển hình có sự xuất hiện nha bào và vị trí của nha bào trong tê bào vi khuẩn. + Nếụ 5 ngày sau không mọc, ủ ấm lại theo dõi tiếp sau ngày thứ 10 2. Phát hiện độc tố botulinus trong thực phẩm:

1. Đồng nhất mẫu thực phẩm với lượng nước vô khuẩn tưcmg đứơng bằng cách đùng máy trộn 2. Ly tâm mẫu đồng nỉiẩt ở tốc độ cao 1 h trong ly tâm lạnh hbặc tiến hành trong phòng lạnh 3. Đun sôi 2 ml nước nổi trong 10 phút để phá huỷđộc tố nếu có 4. Tiêm cho 2 chuột nhắt mỗi con 0,5 ml nước nổi ăẩ đun sổi. Đấy là test kiểm chứng đôi với độc tô' không chịu nhiệt, chuột sẽ không chết bởi độc tô' botulinus, nếu có thì trước khi đun sôi. 5. Pha nước nổi không đun theo tỷ lệ 1:2, .1:10 và 1:100 với nước muối vô khuẩn. 6. Tiêm nước nổi không pha loãng và pha loãng, cứ mỗi đậm độ tiêm cho 2 chuột nhắt, mỗi con 0,5ml. 7. Quan sát chuột trong 72 h, triệu chứng có độc tố botìilìnus thường bắt đầu trong 24 h - xù lông, tiếp theo là khò thở, chân yếu, Cuối cùng liệt hoàn toàn và chết. 3. Xác nhận và định týp độc tố: 1. Pha loãng kháng độc tô'; đơn giá A,B»E và p với nước muối vô khuẩn tới độ đậm 1 đơn vị quốc tế/0,'5 ml , 2. Chuẩn bị những độ pha loãng của nước nổi độc tố 10, 100, 1000 liều chết tối thiểu ^ ...ú 3. Tiêm vào màng bụng nhiều nhóm chuột, mỗi con 0,5 ml kháng độc tố đã pha loãng. ; ' ' ' 4. Thách thức chuột sau 30-60 phút với nước nổi có độ pha lọậng khác nhau. Đồng thời tiêm cho 2 chuột không được bảo, vệ với mỗi độ pha loãng để đốì chứng. 5. Quan sát chuột trong 72 h về triệu chứng của botulism 6. Tất cả các nhóm đều chết ‘trừ nhóm được bảỏ 'Vệ’ bằrig kháng độc tố. Điều đó xác nhận sự có'm ặt của độc tố teotulinưs thuộc týp độc tố đã thử 244

4. Phát hiện độc tố botulinus trong nước lọc canh khuẩn:

Các bước giông như phát hiện độc tố botulinus trong thực phẩm đã nói ở trên 4.2 và 4.3. TÀI LIỆU THAM KHÀO

1. Ngô Quang Tiên - Thực phẩm vệ sinh kiểm nghiệm thủ sách Nhân dân vệ sinh xuất bản xã - 1965 - Bắc Kinh, 105-107 2. Thatcher, FS. and Clark, D.s. ed (1968). Microorganisms in foods. Their significance and methods of enumeration. Toronto, University of Toronto press.

245

9.10. Đ ẾM C LO ST R ID IU M P E R F R IN G E N S NGUYÊN LÝ

Phương pháp này dựa vào đếm Clostridium perfringens sử dụrìg kỵ thuật đổ đĩa và môi trường chọn lọc SPS (sulphite polymixin sulphadiazin). Clostridium perfringens khử sulphite thành sulphide, chất này phản ứng với sắt trong mâi trường hình thành tủa sắt đen làm cho khuẩn lạc Clostridium xuất hiện màu đen. Những khuẩn lạc này dược làm test xác nhận. Kháng sinh ức chế tạp khuẩn kỵ khí và kỵ khí tuỳ tiện. THIẾT BỊ VÀ DỤNG c ụ THỤỶ TINH

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Đũa Petri Ống nghiệm Vại kỵ khí Tủ ấm 35°c Chậu nước 45°c Dụng cụ đếm khuẩn lạc

MỐỈ TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Môi trường làm giàu, thịt băm (mt 45)^* Môi trường thioglycolate lỏng (mt 50) Môi trường nitrate di động (mt 47) Nước peptone để pha loãng (0,1%) (mt 61) Canh thang sinh nha bào (mt 21) Thạch SPS (sulphite polymyxin sulfadiazin agar) (mt 88) Thuôc nhuộm Gram (mt 102)

CÁCH LÀM

1. Chuẩn bị đổng nhất mẫu thực phẩm (xem đếm VKHK). 2. Pha loãng (xem đếm VKHK).

3. Nuôi cấy: ĩ. Lấy dấu, 2. Rót mẫu 246

1 ml thực phẩm đồng nhất pha loãng chovàođĩa Petriđánh mỗi độ pha loãng dùng hai đĩa. 15-20 ml thạch SPS vào mỗi đĩa, đảo đĩa chothạch trộnđềuvới thực phẩm rồi để cho môi trường đông lại.

4. ủ ẩm: Lật úp đĩa và để trong bình kỵ khí. ủ

ấm bình ở35-37°C trong 24 h

5. Đếm khuẩn lạc (nghi Clostridium perfringens):

Chọn những đĩa có 30-300 khuẩn lạc, đếm số khuẩn lượng trong mỗi 1 gam thực phẩm.

lạc vàtính số

6. Xác nhận: 1. Chọn 10 khuẩn lạc diển hình trên đĩa môi trường SPS cấy mồi khuẩn lạc vào trong một ông canh thang thiogỉycoỉỉaie vừa làm thoát khí và làm nguội 2. ủ ấm 35°c trong 18-24 h 3. Xét nghiệm từng ống bằng nhuộm Gram và chọn canh khuẩn thuần khiết. Trực khuẩn Gram dương, mập, hai đầụ tù 4. Nếụ canh !khuẩn đều thuận khiết cấy :vào các ống môi trường nitrate di động, canh thang'; sinh nha bào và thịt băm. ú ấm 35°c trong 24 h 5. Môi trường nitrat di động vi khuẩn mọc dọc theo đường cấy (Cl. perfringens không di động) và khử nitrate bằng cách cho thêm 0,5 ml dungdịch a-naphthylamiiỊe và một lượng tương tự acid sulphanìlic (Cl. perfringens hoàn nguyên nitrate, nghĩa là xuất hiện màu da caứi trong vòng 15 phút). - Xét nghiệm canh thang nha bào: Lấy cặn phết kính để khô, hơ lửa để cố\ định., Nhuộni malachite green 10 phút Rửa nước, rồi nhuộm safranin trong 15 giây, rửa, thấm, để khô và soi kính. Nha bào nhuộm mẵu xanh lá cây, tê bào sinh dưỡng bắt màu đỏ. TÍNH TOÁN ì

!■

;

i:

'•

A

Tính sô' Cl.perfringens trong mẫu dựa vào tỷ lệ phần trăm những khuẩn lạc được làm test, xác nhận là Cl.perfringens. Thí đụ: Số khuẩn lạc đếm được của 10'4 độ pha loắng, = 85 g trong 10 khuẩn lạc được xác nhận là CLperfringens. Số Cl. perfringens mỗi 1 gam thực phẩm = 85 X 0,8 X 10.000 = 680.000 = 6,8 X 10® (Hình 9.6).

247

1, Đãn'9 nhất m ầu thực phẩm

1-;110 1 ml

1m|

Iml

Itnl

1ml

2. Pha loãng

9m( nuửc peptone

1:100

1:1000

1:10000

1:100000

a. Cấy chuyển Thiogỉycollate 35‘C 24h b. Klẩm tra độ tinh khiết và nhuộm Gram c. ủ 5. Tinh to á n Số khuẩn lạc closlndium dưọe x ác nhận ■*

Ttìiòglycollal 'i mt citrat dl động 1 (khôngdi động, nỉlral ' can h ihartg sính n ha bào

Hình 9.6. Đêm Cl.perfringens

1:1000000

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Official methods of analysis association of official analytical chemists 12th ed, 1975 2. Harmon SM, Kautter DA, Peeler JT. Improved medium for enumeration of Clostridium perfringens. Appl Microbiol 1971; 22:688-92 3. Hauschild AHW, Hilsheimer R.Enumeration of food-borne Clostridium perfringens in egg-yolk free tryptose sulphite cycloserine agar. Appl Microbiol 1974; 27:521-6 4. Mead GC, Adams BW, Roberts TA, Smart JL. Isolation and enumeration of Clostridium perfringens. In: Corry JEL, Roberts D, Skinner FA (edirors). Isolation and identification methods for food poisoing organisms. London: Academic press, 1982: 99-110 5. British Standards Inâtitution. BS 5763. Microbiological examination of food and animal feeding stuffs. Part 9, Enumeration of Clostridium perfringens London: BSI, 1986

249

9.11. ĐẾM ENTEROBACTERIACEAE Các test coliforms chỉ phát hiện vi sinh vật có khả năng lên men dường lactose. Một sô' lớn trực khuẩn lactose âm cùng có mặt. Thêm vào đó nhiều vi khuẩn gây bệnh ở trong thực phẩm không lên men đường lactose. Vậy kiểm tra sự có mặt của thà‘nh viên họ Enterobacteriaceae có thể cung cấp thông tin đúng đắn hơn về sự ô nhiễm trong bảo qiián thực phẩm. Phương pháp đổ đĩa giúp cho vi khuẩn không lên men đường lactose phát triển. Phương pháp bề mặt cũng thích hợp cho phát triển tốt hơn trực khuẩn không lên men lactose SINH VẬT KIỂM CHỨNG

ĩ. Escherichia coli ị; - dương, 5phát triển nhiều 2. Scdmọneỉỉa typhimurium - (Ịương, phát triển nhiều í 3. Staphylococcus aureus ~ âm, bị ứe chế . . ’■ ■ MÔI TRƯỜNG

1. Thạch VRBGA (Violet red bile glucose agar) (mt 97) 2. Thạch glucose đóng ông (mt 79) 3. Môi trường không lựa chọn như: Thạch dinh dương (mt 68) CÁCH LÀM (Hình 9.7)

1. Chuẩn bị mẫu thực phẩm đồng nhất 10'1 và một loạt mẫu pha loãng (xem ĐVKHK) 2. Chuyển 1 ml, mỗi độ pha loãng vào đĩa Petri riêng, cho 15ml môi trường VRBGA, trộn đều và để thạch đông. 3. Lật ngược hộp, ủ ấm ở 37°c trong 20-24 h 4. Đếm khuẩn lạc hồng tới đỏ tía, 0,5 mm hay hơn có quầng tủa hoặc không 5. Xác nhận: Cấy lại 5 khuẩn lạc lên môi trường không lựa chọnvà ủ ấm qua đêm ở 37°c 6. Làm test oxidase với từng chủng.Chủng oxidase âm được cấy lên thạch glucose, ủ ấm 37°c trong 24 h. Nếu môi trường thay đổi màu toàn ống, vi khuẩn được coi là họ Enterobacteriaceae 7. Dùng tỷ lệ năm khuẩn lạc đã xác nhận là Enterobacteriaceae để tính sô' Enterobacteriaceae trong mẫu phần tích TÀ I LIỆU THAM KHẢO

1. British Standards Institution. BS 5763. Microbiological examination of food and animal feeding stuffs. Part 10. Enumeration of Enterobacteriaceae. London; BSI, 198Ơ 250

Đồng nhất mẳu thực phẩm : Dung dịch (0.1% peptone và 0.85% NaCI)

24h/37°c

Đếm khuẩn lạc đỏ từ 0.5mm trỏ lên

’r Xác nhận.

T é t OF

Hình 9.7. Đếm Enterobacteãaceae ,

,

P h ư ớ n g

p h á p

, đ ổ

đ ĩa

251

9.12.

P H Á T H IỆ N E .C O LI GÂY BỆN H ĐƯỜNG R U Ộ T (ENTERO PA TH O G E N IC ESC H E R IC H IA COLI (EEC)

NGUYÊN LÝ

Phương pháp này dựa vào làm giàu vi khuẩn trước trong canhthang dinh dưỡng và MacConkey, rồi làm giàu trong canh thang LST vàEE sau đó ria lên thạch L-EMB. Những khuẩn lạc khả nghi được kiểm tra về đặc tính sinh hoá và huyết thanh ciía EEC THIẾT BỊ VÀ ĐỔ THUỶ TINH

1. 2. 3. 4.

Chậu nước 44°c và 41,5°c Tủ ấm 35°c Máy pha trộn Ồng nghiệm, pipet, đĩa Petri

3. MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

Môi trường lên men, (carbohydrate fermentation medium) (mt 46) Thạch L-EMB (Levine's methylene blue agar) (mt 76) Canh thang EE (Enteric enrichement broth) (mt 14) Môi trường indole và thuốc thử (mt 44, mt 98) Canh thang LST (Lauryl sulphate tryptose broth) (mt 28) Thạch MacConkey (mt 80) Canh thang MacConkdy (mt 17) Canh thang nitrate (Nitrate broth) (mt 19) Canh thang dinh dưỡng (Nutrient broth) (mt 6) Canh thang KCN (Potassium cyanide broth) (mt 3) Thạch TSI (Triple sugar iron agar) (mt 86) Canh thang urê (cầc iịhành phần là thạch urê nhưng không có agar) (mt 93) ■ i 13. Môi trường v .p (Ỵo^es Proskauer medium) (mt 54) 14. Kháng huyết thanh Ẹ.còỉi CÁCH LÀM

1. Chuẩn bị mẩu: Cân hai lần 25 g mẫu bằng tháo tác vố khuẩn rỗi cho vào 225 ml canh thang MacConkey và 226 ml canh thafig dinh dưỡng trong blender vô khuẩn và làm đồng nhất trong 30 giây (1:10) m

1 mf

1ml

1mt

9ml nước peptone

2. P h a lo ỉn g

1:10

/

.1130 -

V

3. T »st n g h i n g ở C anh thang LTS 24r48h

à

'

1:1000

A\

/ -ị \ "

ầm

im

37"C

Ếm 4. T e st x á c n h ận 48h à 37“C

5. c ẩ y E.Coli

ịm

.

ổ ổ ổ

ổ

ổ

—P ’ Thạch L - EMB

6. P h ả n ú n g IMVIC: INDOLE +/-, MR +. VP-, C-

Hình 9.8 Phát hiện Escherichia coti

253

2. Ria thẳng: Ria từ canh thang dinh dưỡng dồng nhất lên thạch L-EMB, thạch MacConkey. ủ ấm 35°c trong 24 h. 3. Làm giàu vi khuẩn: ử ấm canh thang MacConkey ở 35°c trong 20 h, chuyển một quai cấy sang 30 ml canh thang LST. ú ấm 44°c trong 20 h. ứ ấm canh thang dinh dường 35°c trong 6 h. Chuyển một quai c ấ y sang 30 ml canh thang EE. ử ấm 41,5°c trong 18h. 4. Xét nghiệm sơ bộ về huyết thanh: Trung hoà canh thang LST và EE với 10% NaHC 0 3 , nhỏ một giọt canh thang của mỗi thứ lên trên phiến kính sạch và cho thêm một giọt huyết thanh đa giá OB và một giọt nước muối 0,5%. Trộn các giọt trên và xem ngưng kết. 5. Xác nhận tính chất sinh vật hoà học:

Ria từ canh thang LST dương tính lên thạch L-EMB và EE dương tính lên thạch MacConkey và thạch L-EMB. ủ ấm ở 35°c trong 24 h. 1. Chọn những khuẩn lạc điển hình và cấy vào môi trường TSI, VP, indole, urease, KCN, citrate và adonitol. Đồng thời cấy lên mặt thạch nghiêng PCA cùng một khuẩii lạc dùng để kiểm tra huyết thanh. Đặc tính sinh vật hoá học cụa E.coli TSI (H2S) V.P. Indole V urease KCN * : Adonitol Cytochrome oxidase 2. Nhận diện huyết thạnh Ẹ.coli gây

+ acid í.

r; ỷ -. * k -

;

bệnh đườ.nẹ ruột

Cấy vi khuẩn trên PCA hoà vào nước muôi, kiểm tra tính đồng nhất thể sữa - Test thể sữa trong huyết thanh OK đa giá, sử dựng những giọt thể sữa, kháng huyết thanh và nước muối. - Nếư huyết thanh đa giá âm, đun thể sữa tới 100°c trong 15 phút và kiểm tra huyết thanh đa giá. 254

-

Nếu dương, kiểrti tra huyết thanh OK đơn giá của nhóm đa giá dương. Xác nhận sự,hiện diện bằng ngưng ụết trong ống huyết thanh pha loãng (llình 9.8) j TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. M.K. Refai. Manuals of food quality control 4 microbiological analysis - Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Rome 1979-Di7-Di9 2. Dr w. Andrews. Manuals of food quality control 4 Revíl:MicròbiơlogicaI analysis - Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Rome 1992, 13-25.

T18-HCĐTUT

255

9.13. P H Á T H IỆ N R IÊ N G B IỆ T E S C H E R IC H IA C O LI 0157: H7

Gốc giống E.coli 0157:H7 sinh vero cytotoxin. Khi ăn phải thức ăn có độc tô" nàý thì bệnh nhân có hội chứng đi ỉa cháy nhẹ tới viêm ruột chảy máu (haemorrhagic colitis - HC) và hội chứng urê tan huyết (haemolytic uraemic syndrome - HƯS). Hầu hết bệnh xảy ra đo ăn th ịt bò nấu chưa chín hoặc sản phẩm sữa, bao gồm sữa tươi serotyp của E.coỉi này bất thường nó mọc kém ở 44°c và không có enzym p-glucoronidase NUÔI CẤY LÀM GIÀU VI KHUAN (1)

Môi trường:

1. Thạch TC-SMAC (Tellurite cefixime sorbitol MacCoịnkey agar). Thạch MacConkey sorbitol có 2,5 mg/1 potassium; tellurite yà 0,05 mg/1 cefixime. 2. Thạch MacConkey Cách làm:

1. Chuẩn bị mẫu đồng nhất 10"1 trong nước peptone đệm 1% (BPW 25 g trong 225 ml) cho thêm kháng sinh để đậm độ CUỐI cùng của ceílxime là 0,05 mg/1; cefsulodin 10 mg/I và vancomycin 8 mg/1. 2. ử ấm 37°c trong 20-24 h 3. Cấy sang TC-SMAC sau 6 h và 20-24 h ủ ấm kéo dài đem lại kết quả E.coli 0157: H7 mọc nhiều 4. ủ ấm 37°c trong 20-24 h 5. Kiểm tra trên đĩa những khuẩn lạc không lên men, nếu có thì cấy chuyền 5 khuẩn lạc (hoặc tất cả nếu số’ khuẩn lạc dưới nãm) lên thạch MacConkey và ủ ấm qua đêm ở 37°c. 6. Test lên men lactose - trực khuẩn Gram âm, ngưng kết với kháng huyết thanh 0157:H7 hoặc Kít latex thích hợp. 7. Xác nhận gốc giống có kết quả ngưng kết về phản ứng sinh hoá như E. coli NUÔI CẤY LÀM GIÀU VI KHUAN (2)

Môi trưồng:

1. Thạch chọn lọc TC.SMAC hoặc thạch MacConkey sorbitol (xem phần trên)

256

2. C anh thang chọn lọc (tryptone soya) có chứa:

Bile salt No 3 1,5 g Dipotassium hydrogen orthophosphate 1,5 g Novobiocin 20 mg mỗi lit 3. Để kiểm trạ sản phẩm sữa thì sử dụng 1,35 g Potassium dihydrogen orthophosphate Disodium hydrogen orthophosphate 12 g môi lít ■ Có thể thay thế đipotassium hydrogen orthophosphate + Novobiocin bằng 10 g casmirio acid và 10 mg acriflavine hydrochloride. Gỉảm đậm độ muối m ật (bile salt) tới 1,12 g mỗi lít Cách làm: 1. Chuẩn bị mẫu thực phẩm đồng nhất 10'1 (25 g trong 225 ml) canh thang tiyptone soya. 2. ủ ấm ở 37°c trong 16-18 h, tốt nhất là máy lắc (150 vòng/min) 3. Cấy truyền sang thạch chọn lọc TC-SMAC, ủ ấm 37°c trong 20-24 h, tìm khuẩn lạc không lên men làm test thử phản ứng sinh vật hoá học, ngưng kết huyết thanh như phương pháp 1 từ bước ba cho đến tận cùng. ĐẾM VI KHUẨN

Cách làm: 1. Chuẩn bị mẫu thực phẩm đồng nhất 10"1 và loạt mẫu pha loãng hoặc sử dụng mẫu đã đồng nhất để nuôi cấy làm giàu vi khuẩn 2. Thạch chọn lọc là TC-SMAC hoặc thạch MacConkey sorbitol 3. Đếm những khuẩn lạc không lên men 4. Tiếp tục các bước sau nuôi cấy để nhận diện khuẩn lạc không lên men, ngưng kết kháng huyết thanh 0157. 5. Tính toán số khuẩn lạc E.coli: 0157.H7 trong mỗi gam thực phẩm

m

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Zadik PM, Chapman PA, Siddons CA. Use of tellurite for the selection of vero cytotoxigenic Escherichia coli 0157 J Med Microbiol 1993; 39: 155-8 2. Chapman PA, Siddons CA, Wright DJ, Norman P.Fox J, Crick E. Cattle as a possible source of vero cytotoxin produring Escherichia coli 0157 infections in man Epidemiol Infect 1993; 111: 439-47 3. Padhye NV, Doyle MP. Rapid procedure for : detecting enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 in food. Appl: Environ Microbiol 1991; 57: 2693-8.

268

9.14. ĐẾM FAECAL STREPTOCOCCI NGUYÊN LÝ

Phương pháp này dựa vào việc đếm đoán chừng (presumptive enumeration) liên cầu phân (Lancefield nhóm D Streptococci) bằng cách sử dụng thạch máu azide tím tinh thể Packer và kỹ thuật đổ đĩa, tiếp theo là xác nhận và xác định khuẩn lạc khả nghi. ' THIẾT BỊ VÀ ĐỖ THUỶ TINH

1. 2. 3. 4. 5.

Đĩa Petri Pipet Chậu nước 45° - 60°c Tủ ấm; 35° - 37°c[ ; Dụng cụ đếm khuân lạc ị i .

Ị'

; ' j . ; . :'

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THUỐC THỬ

Ị

.

1. Nước pèptồne đệm Cmt 58) i 2. Thạch Packer (Packer’s crystal-violet azideblood agar) (mt 82) 3. Canh thang sorbitol phenol red (mt 22) 4. Thạch thallous acetate tetrazolium glucose (mt 73) 5. Canh thang trypíose 3 ^ muoi pH 9,6 và pH 7,2 (mt 24) 6. Thạch tryptose (mt 91) . ■: ; 7. Canh thang Tryptosc mật (bile) 40% (mt‘27) 8. Canh thang Tryptose muối (mt 25) 9. Canh thang Tryptose tellurite (mt 29) 10. Thạch TTC (Tfryptose Triphenyl tetrazolium..chloride) (mt 92)

2Ỗ9

■Ị

m[

1ml

Iml

1ml

1ml

2. P h a lo ã n g

9ml nước peptone

1:100

1:1000

1:10000

1:100000

s. X ác n h ậ n

A. Mọc ở 45“c b, Mọc c. đ. B. g.

ở

pH 9.6

Mọc à mõì trường có 4 0% m ật Mọc à môi trường c 6 6.5% NaCI Chịu đ ượ c n ó n g 6CTC trong 30 phút Chịu được tellurit, sortltol, TTC

Hình 9.9. Đếm Faecal streptococci

1:1000000

CÁCH LÀM

1. Chuẩn bị đồng nhất thực phẩm (xem ĐVKHK).

2. Pha ỉoãng. 3. Nuôi cấy: Lấy thực phẩm đồng nhất và pha loãng cho vào cặp hộp petri mỗi hộp lml. Rót ngay tức thì vào mỗi đĩa thạch Packer đã đun nóng chầy và giữ ở nhiệt độ 45°c. Trộn đều và để đông lại. 4. ủ ấm:

ủ các đĩa lật ngược ở nhiệt độ 35-37°C trong 72 h. 5. Đếm khuẩn lạc: Đếm tất cả các khuẩn lạc màu tím trên các đĩa có 30-300 và tính sô" liên cầu phân mỗi một gam trong mẫu thực phẩm. 6. Xác nhận Faecal Streptococci:

1. Cấy 3-5 khuẩn lạc màu tím lên các đĩa thạch Thalous acetate tetrazolium glucose 2. Lật sấp Petri ủ 35-37°C trong 18 h, khuẩn lạc có màu đỏ ở tâm có thể là Streptococcus faecalis, khuẩn lạc trắng rất có thể là Streptococcus faecium, khuẩn lạc đỏ sẫm có thể là Streptococcus lactis. 3. Chuyển hai khuẩn lạc trắng và hai khuẩn lạc đỏ ở tâm lên thạch nghiêng tryptose, ủ 35-37°C trong 24 h 4. Phết kính nhuộm Gram 5. Từ mặt thạch nghiêng (sau 24 h) -cấy tiếp - Trên m ặt thạch nghiêng tryptose, ủ 45°c trong 48 h (vi khuẩn mọc chứng tỏ test dương tính). - Canh thang tryptose mật 40% ủ 35-37°C trong 48 h (đục là phản ứng dương tính) + Trên thạch nghiêng tryptose, ,ủ âm 35r37°c, trong 48 h giỏ một giọt H 2O2 trôn chỗ vi khuẩn mọc. Nếu có bọt chứng tỏ catalase dượng tính. Ghi những ông canh thang mật 40% và những ống mọc ở 45°c mà cạtalase âm tính,

261

7. Định loài:

1. Cấy vào hai ống những môi trường sau từ canh khuẩn liên cầu đã cấy 24 h trước và ấm 3£>-37°C tròng 48 h Canh thang tryptose pH 9,6 Canh thang tryptose muôi Thạch nghiêng tryptose tellurite . ■ Thạch nghiêng tryptose TTỌ - Canh thang phenol red sorbitol Mọc trên 4 ống môi trường đầu là test dương tính, môi trường cuối cừng màu vàng chứng tỏ có lên men và test đương tính. 2. Cấy vào hai ống canh thang tryptose, pH 7,2 đun nóng sơ bộ (preheated) tới 60°c và duy trì ở nhiệt độ 60°c trong 30 phut d trong chậu nước. Làm mát ống đâ nuôi cấy và ủ ấm 48 h ở 35-37°C. Vi khuẩn phát triển là test dương tính. ' 3. Xếp loại theo hảng sau: Ị, : ' f

S.faecalis i s.faecium

Test

45°c 40% m at

H

+

+

+•

+

+

+

-

_

C a ta la s e

"=

'■ +

; ■ +

+

+

.

■

_

— .

r pH 9 ,6 ......_____...... 6,5 % NaCI

+ +

Ẹ0°c trong 30 phút

+

0,0 5 % telturite

+

Sorbitol

+

T h ạch TTC

+

* + -

S.equinus

S.durans 1 S.bovis

:

+

-

+

_ '

■ '1

-

-

-

-

• +

• ■. một thứ thuốc thử, và đọc kết quả trong vòng 15 phút. Màu hồng tđi đỏ tươi là phản ứng đương tính. Môi trường indole: Cấy một khuẩn lạc vào môi trường indole và ủ ấm 37°c trong 24 h. Cho thôm 1 ml thuôc thử indole. Vòng đỏ hình thành là phản ứng dương.

278

c. Khuẩn lạc Salmonella điển hình Thạch brilliant green: Khuẩn lạc không màu, màu hồng tới màu đỏ fuchsin trong suốt tới đục, chung quanh khuẩn lạc môi trường hồng tới đỏ. Một số Salmonella xuất hiện khuẩn lạc màu lục trong suốt nếu bao quanh là vi khuẩn lên men lactose hoặc glucose gây ra vùng đó màu vàng xanh hoặc xanh; dưới 1% Salmonella không điển hình, chúng lên men đường lactose và xuất hiện khuẩn lạc vàng lục hoặc lục. Thạch bismuth sulphite: Khuẩn lạc nâu, đen, đôi lúc ánh kim, chung quanh nâu chuyển sang đen khi tăng thời gian ủ ấm. Một số chủng sinh khuẩn lạc màu lục hơi sẫm màu hoặc không ở môi trường xung quanh d. Phản ứng sinh hoá của Salmonella Thạch TSI +(100%) Đáy + Vàng +(91,6%) + Đen +(91,9%) + Bóng hơi hoặc nứt thạch Mặt nghiêng -(99,2%) Đỏ hoặc không đổi -(100%) + Thạch urê không đổi màu +(94,6%) + Lysin decarboxylase màu đỏ tía + Phản ứng p-galactosidase không đổi màu -(98,5%) -(100%) + Phản ứng VP không đổi màu -(98,9%) + Test indole, nâu vàng 2. Xác định bằng phản ứng huyết thanh: Kiểm tra các khuẩn lạc không tự ngưng kết thuần khiết về sự hiện diện của kháng nguyên o và H bằng cách ngưng kết trên phiến kính với huyết thanh đơn giá và đa giá. Để xác định kháng nguyên H, cấy lên hộp lồng thạch dinh dưỡng mềm và kiểm tra với kháng nguyên H sau khi ủ ấm ở 37°±l°c trong 18-24 h.

279

TÀI U Ệ U THAM KHẢO

1. British Standards Institution. BS 5763. Microbiological examination of food and animal feeding stuffs. Part 4. Detection of Salmonella London: BSI, 1993 2. Harvey RWS, Price TH. Salmonella isolation and identification techniques alternative to the standard method. In: Corry JEL, Roberts D, Skinner FA (editors). Isolantion and identification methods for food poisoning organisms. London: Academic Press, 1982: 51-72 3. Poelma PL, Andrews WH, Silliker JH. Salmonella. In: speck ML (editor). Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 2nd ed. Washington, American Public Health Association, 1984: 286-326. 4. C.M. Reid, R.L. Cook - Salmonella Microbiological Methods for the Meat Industry 2nd edition 1991, 7.8.1 - 7.8.Í3.

290

9.19. ĐẾM SHIGELLA NGUYÊN LÝ

Phương pháp này dựa vào môi trường thạch XLD (thạch xylose lysine desoxy cholate agar). Môi trường chứa xylose là tác nhân phân biệt, vì hầu hết Shigella không lên men xylose, vi khuẩn xuất hiện những khuẩn lạc kiềm trên mặt đĩa thạch (khả nghi Shigella). Tất cả các test sinh hoá sử dụng cho Salmonella đều được tiến hành và những đặc tính điển hình của khuẩn lạc Shigella dều được tiến hành kiểm tra về huyết thanh học dể xác nhận. THIẾT BỊ VÀ ĐỔ THUỶ TINH

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Hộp Petri Pipet Chậu nước 45?c Tủ ấm 37°c Tủ sấy khô Bàn trang bằng thuỷ tinh

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THỤỐC THỬ

1. Nước peptone đệm (mt 58) 2. Môi trường lên men đường (carbohydrate fementation medium) (mt 46) 3. Môi trường indole (mt 44,98) 4. Canh thang Koser citrate (mt 2) 5. Môi trường làm test đi động (mt 48) 6. Canh thang KCN (mt 3) 7. Thạch TS1 (Triple sugar/iron agar) (mt 86) 8. Thạch Ưrê (mt 93) 9. Môi trường VP (mt 54) 10. Thạch XLD (Xylose lysine desoxy cholate agar) (mt 66) 11. Huyết thanh kháng Shigellà

281

1m I

1ml

1ml

1ml

1ml

2. Pha loãng

, 9ml nước peptone

1:100

1:1000

1:10000

1:100000

1:1000000

1. Hut 0,25 ml cho I6n thạch XLD Ỏ 37"C/24h

Ó

4. W m c i c k h u ẩ n Ifc màu dò d S n g dạng 5. X4c n h ặ n tinh c h í t lin h v ị t h o á h ạc a. TSI: m ạt nghiêng đò. màu vàng ò đáy, k h in g sinh hai. không H)S b. Lroase: ảm c. KCN: khống mọc d. Cltrale: không mọc B. Caibotiydratõ: kM ng c ố hot r. Indol: dứong h oặc âm Wnlì g. VP: ảm h. DI động: không di động i. Nhận dạng bằng ptiản úng huyết thanh

Hình 9.14< Đếm Shigella

cl)

CÁCH LÀM

2. 3.

4. 5.

6.

Chuẩn bị đồng nhất mẫu thực phẩm (xem đếm vi khuẩn hiếu khí) Pha loãng (xem đếm vi khuẩn hiếu khí) (Hình 9.14) Nuôi cấy: Lấy 0,25 ml thực phẩm đồng nhất pha loãng cho lên bề mặt của đĩa thạch XLD khô và trang bằng que thuỷ tinh vô khuẩn. ủ ấm: 37°c trong 24 h Đếm khuẩn lạc (nghi là Shigella)'. Chọn tấ t cả các đĩa có 30-300 khuẩn lạc và đếm những khuẩn lạc màu đỏ giống nhau. Những khuẩn lạc đó đều nghi là Shigella. Nhập dạng

Xác định tính chất sinh vật hoà học:

Như qui trình Salmonella với những test sau: TSI: mặt nghiêng đỏ, đáy vàng, không H2S Urê: âm tính (không đổi màu) Di động: không di động KCN: không mọc Indole: dương hoặc âm VP: âm tính Carbohydrate: không có hơi Citrate: không mọc

không sinh hơi,

Nhận dạng bằng phản ứng huyết thanh:

Xét nghiệm những khuẩn lạc thuần khiết không tự ngưng kết từ thạch dinh dưỡng hoặc thạch TSI trên mặt nghiêng bằng ngưng kết với huyết thanh Shỉgelỉa đa và đơn giá. Vi khuẩn thể hiện là Shigella dựa trên cơ sở phản ứng sinh hoá, nhưng ngưng kết kém hoặc không có ngưng kết, cần phải xử lý nhiệt bằng cách đun sôi vi khuẩn thể sữa 15-30 phút. Sau khi xử lý như vậy thì vi khuẩn thể sữa phải được để nguội rồi làm phản ứng ngưng kết lại

283

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Thacher F.s and Clarkl, D...S ed (1968). Microorganisms in Foods. Their significance and methods of enumeration. Toronto. University of Toronto Press, and compendium of Methods for the Microbiological. Examination of Foods 1976. APHA. 2. Dr w. Andrews, Shigella Manual of food quality control. 4. Rev.l, Microbiologycal analysis Food and Agriculture Orgamization of the United Nation - Rome 1992 - 49 - 53.

284

9.20. ĐẾM STAPHYLOCOCCUS AUREUS NGUYÊN LÝ

Phương pháp đếm Staphylococcus aureus dựa vào việc trang rộng 0,25 ml mẫu thực phẩm đồng nhât và các mẫu đã pha loãng lên mặt thạch Baird-Parker. Môi trường này có chứa nhiều chất ức chế khác nhau, mà không gây trở ngại cho sự phát triển của s.aureus. Khả năng của S.aureus khử potassium tellurite và thuỷ phân lòng đỏ trứng gà trong môi trường đưa tới vùngtrong trẻo điển hình chung quanh khuẩn lạc đen đặc trưng cho s.aureus. Để xác nhận s. aureus ta dùng test làm coagulase. Coagulase là chất do s.aureus sinh ra làm đông'cục huyết tương người và động vật. Có nhiều yếu tố tác động đến sự đáng tiĩị cậy của sự phát hiện và cách đếm S.aureus. Trong số những yếu tố quan trọng đó có trạng thái sinh lý của sinh v ật,'th ế cạnh tranii cua 5 .ạureus trong dung môi mẫu và giới hạn môi trường dùng để phần lập.' Cần lưù ý răng sinh lý của S.aureus thay dổi khác nhàu.! Thí dụ: Không phải tấ t cả các chủng đều có khả năng thuỷ phân lòng đỏ trứng hoặc sinh men làm đông huyết tương. Cũng có sự khác nhau đáng kể đã được chứng minh trong sự đáp lại của chủng khác nhau đối với chất độc sử dụng trong môi trường phân lập. VI KHUẨN KIỂM CHỨNG

1. Staphylococcus aureus - dương tính phát triển nhiều 2. Staphylococcus epidermidis - âm tính, phát triển bị ức chế 3. Bacillus cereưs - âm tính, phát triển bị ức chế MÔI TRƯỜNG

1. 2. 3. 4.

Thạch Baird Parker (mt 63) Canh thang óc tim hãm (mt 20) Nước peptone đệm (mt 58) Huyết tương thỏ (huyết tương khô ,có chứa 0,1% EDTA)

285

. 1:10 1ml

1ml

1ml

1ml

tm l

2. P h a loãng

9ml nưởc peptone

1:100

1:1000

1:10000

1:100000

1:1000000

Khuẩn lạc nghi ngờ

5. T est c o a g u la s e Kiểm tra cục huyết tưdng sau 4,6 và 24h

r ';' ốc lim hãm ủ 37"C/24h

■à

B. Tinh tq á n tổn a »6i c o a g u la » e + 0.3 ml huyết tưong thỏ ù ò 37‘C

Hình 9.15. Đếm Staphylococcus aureus

CÁCH LÀM

1. Chuẩn bị mẫu thực phẩm đồng nhất (xem đếm vi khuẩn hiếu khí (234) 2. Pha loãng (xem đếm VKHK 235) 3. Nuôi cấy: Hút 0,25 ml dung dịch thực phẩm đồng nhất đã pha , loãng cho lên đĩa thạch Bairđ-Parker đã làm khô m ặt và trang bằng que thuỷ tinh uốn cong vô khuẩn. Mỗi đậm độ pha loãng phải cấy hai đĩa. 4. ủ ấm: Đĩa đã lật ngược được ủ 37°c trong 24 h và 48 h 5. Đếm khuẩn lạc: (nghi là s.aureus) Sau 24 h chọn những đĩa có từ 30-300 khuẩn lạc, màu đen và bóng, rìa trắng hẹp và bao quanh bằng một vùng trong lan vào trong mồi trường. Những khuẩn lạc này đều nghi là Staphylococcus aureus. Đánh dấu vị trí những khuẩn lạc này và ủ lại các đĩa thêm 24h nữa Đếm tế t cả các khuẩn lạc xuất hiện d trên đã phát triển trong thời gian ủ ấm kéo dài 24 h nữa. Khuẩn lạc của một số chủng của S.aureus có thể bao quanh một vùng đục mờ sau 24 h. Một số lớn các chủng có thể biểu hiện sau 48 h. Mặt khác Staphylococci không có coagulase có thể biểu hiện sự trong ở quanh khuẩn lạc sau 48 h. Cho nên test đông huyết tương phải được tiến hành đôi với những khuẩn lạc khả nghi. Tất cả các khuẩn lạc xuất hiện vùng trong sau 24 h và sau 48 h ủ ấm đều phải làm test coagulase. XÁC ĐỊNH

Test coagulase

1. Chuyển khuẩn lạc khả nghi s.aureus sang ống nghiệm có chứa 5 ml canh thang tim óc hãm và ủ ấm 35-37°C trong 20-24 h. 2. Cho 0,1 ml vi khuẩn đã mọc sang 0,3 ml huyết tương thỏ đựng trong ông nghiệm nhỏ và ủ ấm 35-37°C. 3. Theo dõihiện tượng đông sau 6 h. Đông rõ (+3) dốc ngược ống mà cục đông không đổi vị trí là (+4) được coi như phản ứng dương của Staphylococcus aureus. TÍNH TOÁN KHUẨN LẠC

SỐ S.aureus phải tính từ tỷ lệ % của những khuẩn lạc được xác nhận với tổng số khuẩn lạc nghi ngờ rồi nhân số đó với 4 (0,25 ml trang lên mặt) và độ pha loãng. T20-HCĐTƯT

287

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. British Standards Institution. BS 5763. Microbiological examinatin of food and animal feeding stuffs. Part 7. Enumeration of Staphylococcus aureus by colony count method London: BSI. 1983. 2. S.M. Avery Staphylococcus aureus. Microbiological for the Meat Industry 2nd edition 1991 - 7.9.1 - 7.9.7

., r

288

* i 'V

i :

9.21. PHÁT HIỆN VIBRIO SPP. Thành viên mà giống vibrio thường tìm thấy trong môi trường nước là Vibrio parahaemoỉyticus đã được thừá nhận (well recognised) là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm ở cá tôm vùng nước biển ấm. V i b r i o c h o ỉ e r a e 01 thường ơ trổng nước và gây nên bệnK cho người do vệ sinh tồi. Vibrio spp. khác cũng gây bệnh cho người. Sự có xnặt Vibrio spp. trong thức ăn đã đun nấụ có ý nghĩa, vì vi khuẩn dễ bịnhiệt huỷ diệt. Phươngpháp đầu tiên được mô tả dưới đây sẽ phát hiện tấ t cả Vibrio spp. VI KHUẨN KIỂM CHỨNG

1. Vibrio fumissii - dương, phát triển 2. Vibrio parahaemọlyticus - dương, phát triển 3.Escherichia coịi - âm, phát triển bị

nhiều nhiều ức chê

PHƯƠNG PHÁP 1: MÔI TRƯỜNG LÀM GIÀU VIBRIO SPP

Môi trường:

1.

Nước peptone vởichất điện phân bổ sung pH 8,6 (APW with electrolyte supplement) peptone (10 g) sodium chloride(10 g) magnesium chloride hexahydrate (4 g) potassium chloride 4 g, nước cất (1 1). 2. Thạch TCBS (thiosulphate citrate bile salt sucrose) (mt 87) Đối với v.cholerae 01 có thể có cả thạch PMT (polimyxin mannose tellurite agar). Cách làm:

1. Mẫu đổng n h ấ t 25g trong 225 ml APW với'các chất bổ sung . 2. .ủ ấm ử 37?c trọng 20-24 h ,(25 30°c dpi với Vibrio trong nước). Cạy, lại sáụ 6 h ủ ấm có thể giúp cho phân Ịập V. Cholerae 01. . -3. Cấy lại trên thạch TCBS (mt 98) và ủ ấm 37HC (hoặc 25-3Ị)°q) 24 • : ’ h, k e’ cả thạch PMT V.Cholerae Qĩ thì ủ ấrn ở 37°c trong 18-24 h. . , ' Nếu v.alginoỉyticus xuất hiện, lặp lại bằng cách sử; dụng mẫu thực phẩm đồng nhất trong nước peptone kiềm không bổ sung chất điện phân. Thạch PMT để phân biệt các chủng v.cholerae 01 từ những v.choỉerae không phải là 01. Tuy nhiên những chủng này đều nhạy cảm đối với polymyxin như việc sắp xếp sinh týp (classical biotyp) có thể nhầm cholerae 01 và một số chủng không 01. 289

4. Kiểm tra từng đĩa môi trường lấy ra từ tủ ấm. Trên TCBS và PMT, bề ngoài Vibrio thông thường như đã mô tả dưới đây. Biểu hiện của Vibrio spp trên môi trường TCBS và PMT PMT

TCBS v .c h o le ra e 01

Vàng1

(2-3 m m )

V ànq3

{2-3 mm)

v . c h o l e r á e k h ô n q là 01*

V à n g /lu c

(2 -3 m m )

Tỉm s ẫ m 4 (2-3 mm)

v .p a ra h a e m o ly tic u s

Lục2

(2-5 mm)

Vànq

(3-4 mm) (1-3 mm)

V. v u ln iíic u s

Luc

(2-3 mm)

Vàng

V .a ìợ in o lv tic u s

Vànq

(2-5 mm)

Tím s ẫ m + (1-2 mm)

V .m e ts c h n ik o v ii

V ànq

(2-4 mm)

K hônq p h á t triển

v .m im ic u s

Lục

(2-3 mm)

Vàng

{2-3 mm)

v .fu m is s ii

V àn q

{2-5 mm)

Vànq+

(3-4 mm)

V .flu via lis

Vàng

(2-5 mm)

Vàng

(3-4 mm)

A e ro m o n a s sp p

Vàng, Kích thước th a y đổi

,

. :

__

T h a y đổi t h e o s ự lên m e n m annose*

Chú thích * Chủng v.cholerae không là 01 mannose dương và khuẩn lạc bề ngoài giống hệt

Vibrrio choỉerae 01 +: ức chế tững phẩn 1: Sucrose dương; 2: Sucrose âm; 3: Mannose dương; 4: Mannose âm

Các vi sinh vật khác có thể mọc trên môi trường TCBS khuẩn lac có kích thước 1 mm hoặc nhỏ hơn. 5. Nuôi cấy lại năm khuẩn lạc khả nghi (hoặc tấ t cậ nếu dựới năm) bao gồm các týp khuẩn lạc khác nhau lên môi trường không chọn lọc hoặc môi trường thạch đếm đĩa, ủ ấm qua đêm ở 3Ơ-37ÓC. Nếu phát triển kém thi tăng đậm độ muối môi trường lển i% 6. Xác nhận diện của chủng bằng test sinh hoá học như đã chỉ định ốẽ giúp nhận điển hầu hết các chủng Vibrio Spp. Khuẩn íạc nhỏ, Gram âm, hình dấu phẩy di động xem bảng các đặc tính của Vibrio spp.

290

Các đặc tính của Vibrio spp. S ucrose ! (T C B S ) ị O xidase

10m9

s

I ỵ.ch ọle ra ệ* (tất cả các serotyp) y-parahaernolyticus________ __ I V. v u ln ificu s

Đ ĩa 0129

s

__________

V .m e tsch n ik o v ii

v.mimicus ___

________

......... .........

! v .fu m is s ii ____ _____ ’ _______ V.fỊuvịạlis_

150|.ig

R

Ị

1 V.alQ Ìnolyticu s _____________ _ ____

ị

3% N a C I ị

r ; v

_+

+

____

s s R R __ R

A e r o m o n a s spp.

"i--.. s ___s ___ s s R

V +

V V

V

Chú thích * T ấ t cả những vi khuẩn v.choỉerae được p h â n ỉập cần p h ải làm p l i ả i r ứng ng-ưng k ế t vớí k h án g huyết th a n h 01 đế’ n h ậ n d iện Vibrio cholerae với

v .c h o ie r a e

01.

s = nhậy cảm, R = d ề .kháng, V = th ạ y đổi

Một số ít chủng v.cholerae, Sèrotypé 0139 biểu hiện đề kháng với 0129. Những chủng này eó thể phân biệt với Aeroírionas trên ccf sở- test khử carboxylase (decarboxylase) V:fumissi sinh hcfi ở đường glucose, v.flui>iaỉis thì không 0129 có nghĩa là 2.4-diamino 6-7-di-isopropyl - pteridine phosphate. 7. Xác nhận diện tạm thời (confirm provisional identification) thì sử đụng 0,85% sodium chloride hoặc chất'điện phân bổ sung (sodium chloride lg; magnesium chloride 0,4g; potassium chloride 0,4g; nước cất 100 ml) nuôi vi khuẩn. PHƯƠNG PHÁP 2: MỒI TRƯỜNG LÀM GIÀU V.PARAHAEMOLYTICUS Mô) trưởng

. ,t

1 1. Thạch TCBS (Thiosulphate citrate bile-salt sucrose agar) (nit 98) 2. Thạch TSẤT (Tryphenyl tetrazolium chloride soya tryptone agar). Môi trường này đòi hoi 48 h ủ ấm, khuẩn lạc v.parahaemolyticus màu dỏ sẫm (dark red) và đường kính 2-3 mm. 3. Môi trường lỏng nếu tìm riêng v.parahaemolyticus làm giàu mầu thực phẩm ở canh thang SPB (salt polymixin broth) chứa 2% 291

sodium chloride và 100.000 IƯ polymyxin B mỗi lít và với nước peptone chứa chất điện phân bổ sung (APW) (xem phương pháp I) hoặc môi trường nuôi cây glucose chứa sodium dođecyl sulphate (GST) như là môi trường làm giàu thứ hai. Cách làm

1. Chuẩn bị mẫu đồng nhất tách riêng 10'1 với 25 g mẫu thực phẩm và 225 ml môi trường SPB và APW hoặc GST 2. ủ ấm mẫu dồng nhất ở 27°c trong 20-24 h 3. Cấy lại sang thạch TCBS và ủ ấm mẫu ỗ 27°c trong 20-24 h 4. Kiểm tra trên đĩa TCBS những khuẩn lạc màu lục, đường kính trên 2 mm 5. Xác nhận diện (confirm the identify) khuẩn lạc khả nghi như đã mô tả trong phương pháp I. PHƯƠNG PHÁP 3: ĐẾM TRựC TIẾP VIBRIO SPP.

Cách lảm:

1. Chuẩn bị mẫu đồng nhất như đã mô tả ở bước một của phương pháp I và pha loãng tiếp bằng nước peptone mặn để đếm trên thạch, TBS bằng cách phương pỊiáp đếm trên bề mặt. 2. ủ ấm đĩa TCBS ở 37°c hoặc 25-30°C nếu tìm Vibrio ở môi trường th ì theo dõi trong 24 h , 3. Xác nhận khuẩn lạc khả nghi như dã mô tả bước năm và sáu của phương pháp 1. PHƯƠNG PHÁP 4: ĐẾM VIBRIO SPP. BANG PHƯƠNG PHÁP NHIỀU ỐNG

Cách làm:

1. Chuẩn bị mẫu đồng nhât 10“1 và một loạt mẫu thực phẩm pha -loãng như đã4 mổ tầ' ■ ;C.V; . ■ÌQU’.'.~ 2. Chọn phương pháp nhiều ống đã được mô tả. Sử dụng nựớc peptone kiềm có chứa chất điện phân bổ sung (bước một của phương pháp I) .như môi trường làm giàu. Nếu V.parahaemolyticus thì phải dùng môi trường SPB. Qui trình như đã mô tầ ở bước 1 đến bước 5 phương pháp I.

292

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Furniss AL, lee JV, Donovan TJ. The Vibrio. Public Health Laboratory Service Monograph Series, No. 11.London: HMSO, 1978 2. International Commission on Microbiological Specfications for Foods. Microorganisms in foods 1. Their significance and methods of enumeration 2nd ed. Toronto: University of Toronto Press, 1988; 201-7 3. Shimala T, Sakazaki R, Fujimura s, Niwano K, Mishima M, Takizawa K. A new selective, differential agar medium for isolation of Vibrio cholerae 01: PMT (polymyxin-mannose-tellurite) agar. Jpn J Med Sci Biol 1990; 43: 37*41 4. British Standards Institution ,BS 5763. Microbiological examination of food and animal feeding stuffs. Part 14. Detedtion of Vibrio parahaemolyticus. London: BSI, 1991

293

9.22.

PH Ư Ơ N G P H Á P LÀM GIÀU VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS NGAY K H I ĐỒNG NHẤT m a u

VI SINH VẬT KIỂM CHỨNG

Vibrio parahaemolyticús làm kiểm chứng dương M ôi TRƯỜNG

1. Ganh thang SPB (Salt Polymixìn Bróth) (mt 101) 2. Thạch TCBS (Thiosulphate C itrate Bile salt Sucrose) (int 98) CÁCH LÀM

?

1. Chuẩn bị đồng nhâ't' ban đầu trong canh thang muối polymixin thường là 25 g trong 225 m ĩ (Hình 9.16). 2. ủ ấm mẫu đồng nhất ban đầu ở 35-37°C trong 7-8 h. Đối'với sản phẩm lạnh thì ủ ấm 35-37°C trong 18 h. 1 3. Ria từ canh thang làm giàu lèn đĩa mối trường TCBS và ủ 35-37°C trong 18 h 4. Kiểm tra trên đĩa môi trường về những đặc tính: Khuẩn lạc tròn, 2-3 mm đường kính, màu xanh tới màu lục (blue to green) ở trung tâm thì sẫm mầu. Ghi những khuẩn lạc điển hình khả nghi là v.parahaemoỉyticus. 5. Thực hiện các test sinh hoá tiếp theo để xác nhận những khuẩn lạc điển hình, c ầ n lưu ý: Môi trường dùng cho các test phải có 3% NaCl. Các test đối với Vibrio parahaemolyticus: Oxidase

+

Di động

+

Indole

+

Phát triển hiếu khí và ky khí

+ cả

Phản ứng trên thạch

kiềm,

TSI

Khử carboxy lysine

+

p-galactosidase

+

hai không sinh hơi, không H2S

Báo cáo về sự cổ m ặt hay không Vibrio parahaemolyticus (Hình 9.16)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. S.M.Avery (1991). Vibrio parahaemolyticus. Microbiological methods for the meat industry - 2nd edition 7.12 234

Mấu dỗng nhất canh thang SPB 7-8h/35‘ tới 37 c

Đĩa chọn lọc 18h/35tớl 3rc Thạch TCBS

dXác nhận ,

1 ’ Oxidase

Test dí dộng ; >i Indoí, Mọc hiếu khí ỵà /; -• ■■■ ' ky khi

TSI

L /J L

Lysine : : Lysine decartoxylase

p-galactosidase

Hình 9.16. Vibrio parahaemolyticus P h ư ơ n g p h á p làm g iàu

'ĨỈ\Í-’.Ầ [V

£95

9.23.

Đ Ế M V IB R IO PA RA H A EM O LY TICU S

NGUYÊN LÝ

Phương pháp này dựa vào sự bổ sung 3% NaCl vào trong tất cả các môi trường dùng để phân lập và nhận diện v.parahaemolyticus THIẾT BỊ VÀ DỤNG cụ THUỶ TINH

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Ong nghiệm Ống đong Pipet Đĩa Petri Tủ ấm Chậu nước

3. MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ

1. Nước peptone kiềm (mt 59) 2. Môi trường carbohydrate (mt 38) 3. Môi trường arginine decarboxylase 3% muôi (mt39) 4. Môi trường Lysine decarboxylase (mt 40) 5. Canh thang muối GSTB (glucose salt, teepol broth) (mt 10) 6. Môi trường Indole và thuốc thử (mt 44, mt 98) 7. Môi trường test di động (mt 48) 8. Gelatine dinh dưỡng (mt 35) 9. Canh thang HLGB (Hugh-Liefson glucose broth) (mt 9) 10. Canh thang STB (salt-trypticạse broth) (mt 23) 11. Nước muôi 3% (mt 56) 12. Thạch TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar) (mt 87) 13. Thạch TSI (Triple sugar iron agar) (rht 86) 14. Thạch TSA 3% muôi (Trypticase soya agar 3% muôi) (mt 70) 15. Canh thang TSB với 3% NaCl (Trypticase soy broth 3% muối) (mt 7) 16. Môi trường VP (Voges-Proskauer) (mt 54) 17. Dầu paraffin 18. Thuôc nhuộm Gram (mt 102) . CÁCH LÀM

(

'

1. Chuẩn bị mẫu thực phẩm đồng nhất (xem đếm vi khuẩn hiếu khí) 2. Pha loãng (xem đếm vi khuẩn hiếu khí) 296

3. Nuôi cấy: Ở đậm độ 1:10 cấy vào 3 ống môi trường GSTB (mt 10) đậm đặc mỗi ống cấy 10 ml. Đậm độ 1:10, 1:100,1:1000.1:10000, cũng cấy 3 ống, mỗi ống 1 ml. 4. ủ ấm: ủ ấm những canh thang qua đêm ở 35°c 5. Xác nhận: - Hình thái khuẩn lạc: + Sau khi ử ấm, lấy một quai cấy của ống nuôi eấy từ 3 độ pha loãng cao nhất của GSTB xem vi khuẩn mọc trên thạch đĩa TCBS (mt 87). + ử ấm các đĩa 18 h ở 35°c + Các khuẩn lạc xuất hiện ở TCBS hình trồn, dường kính 2-3 mm, ở tâĩĩi xanh lá cây hoặc xanh lơ là khuẩn lạc của V. parahaemoỉyticus, V. alginolyticus khuẩn lạc to và vàng; Conforms, Proteus và cầu khuẩn đường ruột khuẩn lạc nhỏ và trong mờ (Translucent). Tính chất sinh hoá học: + TSI (mt 86): ria trên mặt và cấy chọc sâu, ủ ấm qua đêm ở 35°c, V. parahaemoỉyticus sinh kiềm trên m ặt acid ở phần đáy, không sinh hơi và không sinh H2S (phản ứng giông nhừ Shigella điển hình) + Tính di động: cấy chọc sâu vào 4 ống thạch mềm (mt 48), vi khuẩn mọc toả ra quanh vết cấy sau khi ủ ấm 35°c trong 24 h. + Nhuộm Gram: Lấy vi sinh mọc trên TSA để nhuộm + Bản tính ưa muối: (Halophilic nature) ; Cấy vào 4 ống STB (mt 23) có 0,6,8 và 10% NaCl, ủ ấm, V. parahaemoỉyticus sẽ mọc tốt ô trong 6 và 8% NaCl, nhưng không mọc ở 0 và 10% NaCỈ. + Test MR-VP: Xem phẫn Coliforms và Salmonella + Test indole: Xem phần Salmonella + Lên men carbohydrate: cấy vào mỗi ống có glucose, lactose, sucrose, maltose, mannitol, vi khuẩn đã cấy trên thặch TSA, sau khi ủ ấm kiểm tra sinh acid. + Lên men glucose: Cấy cho thẳng 2 ống môi trường HLGB (mt 9) cho dầu paraffin vô khuẩn lên một ống nghiệm và ủ ấm 2 ngày ở nhiệt độ 35°c. Màu vàng ở canh thang chứng tỏ sự lên men trong ống nghiệm không có paraffin chỉ có sự oxy hoá. v.parahaenuilyticus lên men không sinh hơi. + Test Cytochrom oxidase: Nhỏ 2-3 giọt dung dịch alphanaphthol lên khuẩn lạc V. parahaemoỉyticus trên ông hoặc trên đĩa thạch rồi tiếp theo bằng một dung dịch phenylene - diamin trong vòng 2 phút có màu xanh sẫm là dương tính. 297

+ LDC (mt 40): Xem phần kiểm tra Salmonella + Mọc ở 42°C: ủ ấm ông môi trường TSB (mt 7) đã cấy vi khuẩn trong chậu nước ấm 42°c trong 24 h. - Mô tả những nét đặc tính nổi bật của v.parahaemolyticus + Vi khuẩn hình que cong, Gram âm + Cytochrom oxidase dương + Lên men, oxy hoá glucose (0/F). không sinh hơi + Khuẩn lạc trên TCGB màu xanh lá cây điển hình + TSI mặt nghiêng kiềm, đáy acid không sinh hơi, không sinh H2S + Mọc được ở 42°c + Mọc được ở môi trường có 8% NaCl nhưng không mọc ở 10% NaCl + LDC dương tính + VP âm tính + Sucrose âm tính TÍNH TOÁN

Khi những khuẩn lạc xanh lục (blue geen) trên mõi trường TCBS đã được nhận dạng về tính chết sinh vật hoá học là v.parahaemolyticus xem độ pha loãng dương tính gốc trên môi trường GSTB và áp dụng bằng MPN ba, ô-ng để xác định sô vi sinh v ật trong mẩu (đếm coliforms) (hình 9.17)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bacteriological analytical for foods 1976.4th ed. Food and Drug Administration, USA.

298

2. P h a lo ãn g

3. c ỉ y ống GSTB ù 35“C/18h

G ãp đõl

Đon canh thang GSTB

GTSB khuẩn lạc 2-3mm tròn xanh hoặc xanh lá cây ả lâm

4. C ấy c h u y ê n th ạ c h TCBS 35 c/18h

5. Đ ấm d ũ n g b ỉ n g MPN

6. T«»t sinh hòi

TSI: Kiêm, không hờl, khỗng H,s. NaCI: 0%-, 6%+. B%+. 10%' HLGB: f+. 9 -'. mọc à4?*C : +ìndol: +VP: -LDC: -oxidase + dl động: 1

Hình 9.17. Đếm v.parahaemolyticus

9.24. PHÁT HIỆN YERSINIA SPP Yersinia enterocolitica và các loài (species) có liên quan phân bô rộng rãi trong môi trường và cũng tìm thấy rộng khắp trên thực phẩm. Những chủng gày bệnh phôi hợp riêng biệt với lợn, nhưng các chung khác thì tìm thấy trong qui trình, thực phẩm xử lý nhiệt có ý nghĩa là chỉ điểm vệ sinh kém hoặc lây nhiễm chéo. Đêm thì không cần thiết, phân lập thì thực hiện làm giàu vi khuẩn. Phương pháp mô tả dưới đây có thể phát hiện tấ t cả biotyp từ các hàng (range) sữa, thực phẩm và các nguồn môi trường. VI KHUẨN KIỂM CHỨNG

1. Yersinia enterocolitica - dương mọc nhiều 2. Escherichia coli - âm mọc bị ức chế MÔI TRƯỜNG LÀM GIÀU VI KHỤAN 1. Thạch CIN (cefsulodin-irgasan-rtovobiocin). 2. Nưởc peptone đệm ba (tris buffered peptone water):

1. 2. 3. 4. 5.

Peptone 10g Sodium chloride 5 g Tris (hydroxymethyl) methylamine 12,1 g Nước cất 1 lít Điều chỉnh pH 8,0

CÁCH LÀM

1. Đồng nhất 25 g mẫu thực phẩm trong 225 ml pepton đệm ba 2. ủ ấm mẫu dồng nhất ở 9°c trong 2 tư^n (hoặc 21-25°C) ủ ấm 2Ĩ'25°C thì thoả mãn sự 'lựa chọn tie QPC cho tất cả các khoản mục thực phẩm, trừ sữa tiệt khuẩn bằng phương pháp Pasteur. Để thu được kết quả (recovery) tối đa phải cấy lại sau một và hai tuần, ủ ấm sữa tiệt khuẩn bằng phương pháp Pasteur ở 4°c trong 3 tuần và cấy lại cuối thời kỳ ủ ấm. 3. Cây lại sau hai tuần ở 9°c (hoặc sau một và hai tuần ở 21-25°C) như sau: Cho 1 ml mẫu đồng nhất đã ủ âm vào 9 ml dung dịch potassium hydroxýdé 0,5%, dung dịch sodium chĩữnde 0,5% va trộn đều sau 15-30 giây, cấy một quai hỗn hợp sang thạch CIN. 4. ử ấm đĩa CIN ỗ 30°c trong 24 h

3Ó0

5. Kiểm tra khuẩn lạc trên đĩa CIN. Khuẩn lạc điển hình có một điểm giữa khuẩn lạ J (bull’sege) tâm dỏ, bờ trong suốt bao quanh, và thường nhỏ hơn khuẩn lạc của các coliforms khác có thể phát triển trên thạch CIN. Khuẩn lạc cũng có thể xuất hiện rất nhỏ và khô, hoặc to hơn, bờ không đều, chung quanh không màu, ở tâm thì đỏ. 6. Xác nhận diện khuẩn lạc khả nghi. Yersinia spp. đều đương tính với môi trường urease (có trường hợp âm) sinh acid ở đáy ông không sinh hơi hoặc hydrogen sulphide (H2S) trên môi trường TSI, không di động ở 37°c nhưtig di động ỗ dưới 28°c. Một số chủng có thể sinh acid từ đường lactose. Y.enterocoỉitica có thể decarboxylate ornithine nhưng không đôi với lysine chủng Y. pseudotuberculosis không có hoạt tính decarboxylase 7. Khuẩn lạc có thể biểu thị thêm bằng sử dụng phản ứng sinh hoá học dể chứng minh đặc tính yersinia spp. Đặc tính của Y ersinia spp.___

; Sucrose Rhamnose Melibiose

Xylose

In d o le

I

Lipase i

_____

Y .e n te ro co liíica

1 ... ....... 2

.. +, +

ỉ: ■

+ +

(+)

+ + +

+ t +

~t

± _ ..

Biotýp 3

+ !_ Y .íre ơ e rik s e n ii + Y.intermedia_______ ;... ± . Ỵ.Kristensenii _ _!__ , y.pseudotuberculosis >seudotuberculo$is __ I ’:__ -t-.....-ỉ___ + Biotýp 4

V. y_ V

■ỉ

Chú thích: V: thay đổi; (+) phản ứng yếu

301

Nước muối đệm phosphat (pH 7.6) 48h/25’ C

xừ lý kiểm một tỷ

lượng Nưtic muối kiểm

Thạch CIN (Cofsulodln-lrgasan-Novobiocin) 48h/2S°C

ị ........... Nhận diện phảng chừng như Yersinia

B

n

1Urê 4Bh/25°C

.KIA .

Xác nhặn là Yersinia enteracolitica

\ Sucrose

Rhamnosa

Test sinh hoá 3 ngày/25°c

Raffmose

Melibiose I

Alptìa-melhyl glucosid

C ịtrat:

Hoậc Kid test

Xác nhận tinh gảy bộnh

^

0

Phàn ứng huyát thanh

Hình 9.18. Yersinia enterocolitica Phương p h á p làm g iàu

302

TÀI LIỆU THAM KHẢO

’

' 1. Aulisio CGG, Mehlman IJ, Sanders AC. Alkali method for rapid recovery of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl Environ Microbiol 1980; 39: 135-40 2. Schiemann DA. Development of a two-step enrichment procedure for recovery of Yersinia etiterocolitica from food. Appl Environ Microbiol 1982; 43; 14-27. -

t S ’ -HCDTUT

303

9.25. ĐẾM NẤM MEN, NẤM M ố c Nấm men, nấm mốc đóng vai trò quan trọng trong việc làm hư hỏng thực phẩm. Thêm vào đó, một số mốc có thể sản sinh độc tô' nấm (mycotoxin) gây nguy hiểm. Những vi sinh vật này có thể mọc trên nhiều loại môi trường thạch nhưng đòi hỏi thời gian ủ ấm kéo dài ở nhiệt độ thấp hơn hầu hết các vi khuẩn sử dụng phương pháp đếm trên bề mặt kết hợp với môi trường nêu dưới đây cho phép ta có thể đếm tấ t cả các loại nấm mốc ở trên tấ t cả các loại thực phẩm. VI SINH VẬT KíỂM CHỨNG

ĩ. 2. 3. 4.

Zygosciccharomyces roussii Aspergillus niger Saccharomyces cerevisiae Bacillus cereus

- dương, phát triển - dương, phát triển - dương, phát triển - âm, phát triển bị

tốt tốt tốt. ức chế

PHƯƠNG PHÁP 1: ĐẾM TRỰC TIẾP

Phương pháp này cũng giông như phương pháp đếm vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt trung bình nhưng dùng môi trường thích hợp cho sự phát triển nấm men, nấm mốc rồi kiểm tra khóm nấm phát triển. Môi trường:

1. Nước peptone đệm (mt 58) 2. Thạch malt với kháng sinh (mt 81) 3. Thạch nấm mốc (mt 84) Cách làm:

1. Chuẩn bị mẫu thực phẩm đồng nhất (như đếm VKHK) 2. Pha loãng 3. Đỗ đĩa - Mỗi đậm độ pha loãng lấy 1 ml cho vào một đĩa đã đánh dấu, mỗi độ pha loãng cần 2 đĩa. - Rót vào mỗi đĩa 15-20 ml thạch mycophil hoặc malt nhiệt độ 45°c, trộn đều và để cho đông lại. 4. u âm: Lật sấp đĩa, ủ ấm 20'25°c trong 5 ngày. Nếu nâm phát triển quá nhanh, thì đếm lần thứ nhât sau 3 ngày rồi 5 ngày đếm lại, có một số phải cần tới 2 tuần. 5. Đọc kêt quả: Báo cáo kêt quả về nấm men hoặc nấm mốc trong mỗi g thực phẩm 304

PHƯƠNG PHÁP 2 PHÃN LẬP NẤM MEN NẤM M ốc ƯA KHÔ

Phân lập nấm men, nârn mốc chịu sự thẩm thâu (osmophilic) có thể phát triển ở đậm độ đường Cào. Để có được những gốc giống iiày cần phải điều chỉnh hoạt tính nước (aw) của việc pha loãng (diluent) và môi trường phân lập nước pha loãng có 50% (W/w) glucose. Môi trường thạch chứa 35-60% glucose sẽ cho phép tìm lại được gốc giống chịu khô hanh (xerotolerant strains) không xảy ra phát triển dưới những điều kiện như thê này loại trừ gốc giống gây hư hỏng tiềm tàng ihật hàng có lượng đường cao như mứt kẹo, aw của môi trường giảm có thể đòi hỏi ủ ấm kéo dài nhiều tuần. Cách làm 1. Chuẩn bị mẫu đồng nhất 10'1 và một loạt mẫu thực phẩm pha loãng ở dung dịch glucose 50% (W/W) 2. Một ước sô" phù hợp của mẫu đồng nhất và pha loãng trải trên bề mặt cao nấm men, mạch nha 40% (WAV) thạch glucose 3. Ú ấm đĩa nuôi nấm mốc ở 20-25°C và đĩa nuôi nấm mẹn ở 25-30°C, đối với nấm men phải tới ba tuẳn. 4. Đếm khóm nấm men và nấm mốc, và tính toán sô" lượng trong mỗi gam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Comipedium of methods for the microbiological examination of foods, 1976 APHA 2 Pivĩiick H, Gabis DẤ. Confectionery products. In: Speck ML (editor). Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 2nd ed, Washington: American Public Health Association, 1984: 700-718 3. Vương Minh Kỳ, Vãn Vĩnh Xương. Lương thực vi sinh vật thủ sách - Thượng hải khoa học kỹ thuật xuất bản xã - 1965.

305

9.26. K IỂ M T R A V I K H UẨ N t r o n g n ư ớ c v e c h ấ t l ư ợ n g VỆ SIN H ĐẾM VI KHUẨN HIẾU KHÍ ƯA NHIỆT TRUNG BÌNH (ĐẾM ĐĨA CHUAN)

Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh:

1. 2. 3. 4. 5.

Đĩa Petri 90-100 mm Pipet 1, 5, ỊO ml (thổi hết) Chậu nước ấm 45°c Tủ ấm 35°c hoặc 20°c Dụng cụ đếm khuẩn lạc

Môi trường:

1. Nước peptone đệm (mt 58) 2. Thạch PCA (Plate count agar) (mt 71) Cách làm:

1. Chuẩn bị và pha loãng Lắc mạnh chai nước mẫu 25 lận, dùng dung dịch nước phosphate đệm hoặc nước peptone 10% như đã mồ tả ố phần đếm vi khuẩn hiếu khí. 2. Đổ đĩa Cho vào các đĩa Petri 1,0 ml mẫu nước đã pha loãng, rót vào mỗi một đĩa 15 ml thạch đã làm nóng chảy ở nhiệt độ 43-45°C, xoay đảo đĩa để mẫu trộn đều rồi để yên cho môi trường đông lại. 3. ủ ấm L ật sấp đĩa, ủ ấm 35°c trong 24 h hoặc để ở 20°c trong 48 h 4. Đếm ,;■■■■ Chĩ đếm những đĩa có sô' khuẩn lạc tờ 30 đến 300. Phải ghi rõ nhiệt độ đĩa đếm 35°c hoặc ở 20°c. .Ị ; ĐẾM COLIFORMS

Kỹ thuật lên men nhỉều ống

Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh 1. Pipet và ống đong có vạch 2. Chai hoặc ông pha loãng 3. Đĩa Petri 100 min và 60 mm để màng lọc

306

4. Ong nghiệm lên men và ống Durham 5. Tủ ấm 35°c và 44,5°c 6. pH mét Môi trường và thuốc thử: 1. Canh thang BGLB (Brilliant-green lactose bile broth) (mt 18) 2. Nước peptone đệm (mt 58) 3. Canh thang EC (Escherichia coli) (mt 8) 4. Thạch Endo (mt 72) 5. Canh thang lactose (mt 11) 6. Thạch L-EMB (L-EMB agar) (mt76) 7. Canh thang LST (Lauryl sulphate tryptose broth) (mt 28) 8. Canh thang dinh dưỡng (mt 6) Cách làm:

ĩ. Test đoán chừng (presumptive test) Trường hợp nước không xử lý bằng Clor: Cấy 5 ống môi trường đoán chừng (canh thang lactose hoặc canh thang LST) 10 ml (đậm độ gấp đôi) 5 ml, mỗi ống với 10 ml nước, năm ống môi trường (đậm độ dơn) 5 ml, mỗi ông cấy 1 ml và loạt khác 5 ông 5 ml, mỗi Ống cấy 0,1 ml nước. - Trường hợp nước xử lý bằng Clor hoặc bằng lọc thì không cần thiết xét nghiệm thể tích 0,1 ml. Thay thế vào đó ta cho 50 ml nước vào chai chứa 50 ml môi trường (double strength) đậm độ gấp đôi. - ử ấm ống nghiệm và chai ở 35°c trong 24 h và 48 h và ghi ống nghiệm có hơi hoặc không. 2. Test xác nhận (confirmed test) - Lắc nhẹ hoặcxoay ống nghiệm có hơi và chuyển một tới ba quai cây môi trường vào canh thang BGLB (mt 18) 3. Test bổ sung (completed test) Từ mỗi ông mồi trường BGLB ria lên một hoặc hai đĩa Endo hoặc L-EMB và ủ ấm 35°c trong 24 h. Tìm một hoặchai khuẩn lạc coliforms điển hình biệt lập và chuyển mỗi một khuẩn lạc vào canh thang lactose hoăc LST và thạch dinh dưỡng. Ghi ống có hơi và nhuộm Gram từ khuẩn lạc trên mặt nghiêng ống thạch.

307

Trong ống canh thang lactose có hơi và nhuộm Gram thì vi khuẩn Gram âm, không nha bào, hình que. Vậy test bổ sung xem như đã thoả mãn, chứng minh sự có mặt nhóm coliforms trong thể tích mẫu nước đă kiểm tra. Việc tính toán số lượng theo bảng MNP. Chú thích: Test đoán chừng không có test xác nhận có thể áp dụng cho mẫu nứớc thải, nước công bất kỳ hoặc nước biết rằng nhiễm bẩn nặng. Test bể sung chỉ áp dụng một tỷ lệ mẫu khi còn righi ngờ về test xác nhận tình trạng vệ sinh của một mẫu. Test xác nhận cần phải áp dụng trong xét nghiệm mẫu nước uống, nước trong quá trình xử lý và nước bể tắm (hình 9.19) 4. Faecal Conforms (MPN): Tiếp theo test xác nhận bằng cách sử dụng canh thang BGLB là chuyển tấ t cả những ông nghi ngờ đương tính sang môi trường EC (mt 8) - Những ông đựng môi trường EC đều được ủ ấm à 44,5°c trong 24 h và được ghi chép sự hình thành hơi. Mật độ vi khuẩn dược đảnh giá theo bảng dưới đây - Phản ứng IMViC phân biệt coliforms

308

—

á m Ú n

2

1

'ề íị

3

s

4

6

7

8

9

10

Làm giàu cú lựa c h ọ n lẩn dẩu 24+24h/35°C Ỉ0.5aC

CantI thang Tiyptose đặc gắp đỗi

m

\J 1

\J 2

\J

V

4 B 9 L ìm giàu c ó lựa ch ọ n lln th ứ hai 4 8 * 3W 44.5* 0.5"C

\ y1

M B WMẾ w tạ m tặ

2

\y

\ y4

\ y8

\ y9

Làm giảu c á lụa c h ọ n lẩn th ứ hai 2 4 Ỉ 2W 44.5* 0.2”c

.1 1 1 1

Xam b ỉn g MNP 10 õ n g

Xâm b ả n g MNP lữ o n g

~ X J 1

X ác m inh l ì F a»cal co n fo rm s

X á t m inh conform to à n bộ

A G ram

Gram C anh (h an g T ry p to sê lauryl

C anh th a n g T r y p to x lauryl

C an h th a n g EC

Hình 9.19. Conforms và Faecal conforms Phương pháp MPN nhiều ống (NƯỐC uống được)

309

Chỉ số MPN đối với sự kết hợp kết quả dương và âm khác nhau.

P hần bên trái bảng là MPN ml với số ống 50,10 và 1 ml. Phần bên phải bảng là MPN ml với số ông 10,1 và 0,1 ml:

10

1

0,1 ml

MPN moi ml

13

0

0

0

1

17

0

0

4

2

22

0

1

4

3

28

2

1

4

4

2

3

1

4

2

0

2

1

0

2

1

3

0

2

2

0

3

0

MPN Số ống dương MPN 1rrt mỗi 50 1mi moi 10 ml ml

Sô' ống dương

SỐ ống dương

S ố ống dương

MPN mồi ml

10

-

0,1 ml

4 6 0 0 E .c o ii) (< 6 0 .0 0 0 fa e c a l conform s)

9500

12000 7500

11000 14000

3

17500

4_ 0_

21000 _

1 3 0 00 17000

2

22ỌỌỌ.

3_

2 8 0 00

4

_ 34500_

0

___2 40 00___

,

35000

L._

2_ 3

5 4000

4

1600 00

91000

Hạng D (> 6 0.0 00 faecal conforms)

> 18 0 0 0 0

323

Bảng 9.3. Bảng MPN của vi sinh vật bằng phương pháp nhiều ông 5x0,001 g; 5x0,001 gj 5x0,001 g K ết quả diễn đ ạ t MPN mỗi 100 g

324

Tiếp bảng 9.3 I 0,001 g

0,0001g

5

1

0

3 100 0

5

1

1

43000

5

1

2

60000

1

3

85000

5

2

0

50000

5

2

1

70 000

5

2

2

95 000

5

2

3

120 000

5

3

5

H-

-Ọ

.................. -

. 5 .. ...... - ......3 -------- 1------ 1_ ...... 5 ..... ....... L -

3

5

I

Hạng D (> 6 0 .0 0 0 faecal coliforms)

1 1 0 0 0 0 __

5

2100 00

4

0

1300 00

4

1

170000

5

4

2

220000

5

4

3

2800 00

5

4

4

3450 00

5

5

0

240 000

5

5

1

350000

5

5

2

540000

5

5 5

3

910 000

,

■

.......

—

175000

3

5

I

;

7 5 0 0 0 ___

3...... 4

5

_____ __________

140000

5 ...

MPN

0,01 g

4

_1600000_

325

10. CÁC TEST KIỂM CHỨNG VI SINH VẬT

1. TEST CAMP (CHRISTIC, ALKINS, MUNCH, PETERSEN) CHO LISTERIA

Test này chứng minh sự tan máu của một số giống Listeria spp. bằng Staphylococcus aureus và Rhodococcus equi (1,2,3). Vi sinh vật kiểm chứng 1. 2. 3. 4.

Listeria monocytogens - CAMP test Listeria ỉưanovíi - CAMP test Listeria ivanovii - CAMP test Listeria monocytogens - CAMP test

(S.aureus) (S.aureus) (R.equi) (R.equi)

dương âm dương âm

Cách làm 1. Chuẩn bị 2 hộp thạch 5% máú cừu mỏng 2. Vạch ngang qua hộp thạch máu hai vạch: MộtStaphylococcus aureus chuẩn, và vạch kia là Rhodocòccus equi 3. Cấy sinh vật test lên mỗi hộp bằng cáchvạch đườngthẳng góc cách đường cấy vi sinh vật chuẩn 1-2 mm 4. ủ ấm các hộp' ở 37°c trong 18 h 5. Kiểm tra hiện tượng tan máu nưi hai đường cây gặp nhau Vùng tan máu do các chủng Listeriạ spp. có sự khác nhau và đọc kết quả các phản ứng dương đòi hỏi phải có kinh nghiệm. Thạch vừa mới chuẩn bị cho kết quả tốt nhất và cần phải có vi sinh vật kiểm chứng cho từng đĩa môi trường. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Christie R, Atkins NE, Munch-Petersen E.A note on a lytic phenomenon shown by group B streptococci. Aust J Exp Biol Med Sci 1944: 22: 197-200 2. Kerr KG, Lacey RW. Isolation and identification of Listeria monocytogenes. J Clin Pathol 1991: 44; 624-7 3. McLauchlin J. The identification of Listeria species. DMRQC Newsletter 1983: 3: 1-3. Internal publication of the Public Health Laboratory Service.

326

2. TETS CATALASE

Test phát hiện vi khuẩn sinh ra enzym cataỉase. Enzym này sẽ tách nước oxy già ra từng phần và sinh ra bóng hơi. Vi sinh vật kiểm chứng: ĩ. Staphylococcus epidermidis - dương 2. Enterococcus faecalis - âm Đế tránh dương tính gia, cần phải nắm vừng những yêu cầu sau: Phiến kính cần phải sạch sẽ Vi khuẩn nuôi trên thạch máu không được dùng để làm test Phản ứng catalase có thể xuất hiện khi có mặt glucose ở đậm độ thấp (như trong thạch đếm khuẩn lạc) những phản ứng giả này có thể’ tránh dược khi môi trường chứa 1% glucose. Cách làm: 1. Cấy sinh vật làm test trên mặt nghiêng thạch dinh dưỡng và ủ ấm 37 c trong 24 h 2. Dùng pipet Pasteur cho chảy nhẹ nhàng 2-3 giọt nước oxy già 3% lên m ặt nghiêng môi trường để phủ khắp phạm vi vi khuẩn phát triển. 3. Kiểm tra ngay tức khắc vả quan sát bọt hơi sinh ra, hiện tượng lịầy chứụg tỏ phản ứng dương, Kiểm tra lại 5 phút sau. Hoặc; 4. Cho một giọt nước oxy già lên phiến kính 5. Dùng quai cấy nhẹ nhàng nạo một Khuẩn lạc sinh vật cho vào nước oxy già. 6. Quan sát sự sinh bóng hơi. Hay là: 7. Cấy vi khuẩn vào một ống canh thang dinh dưỡng, ủ ấm 37°c qua đêm 8. Cho thêm 1 ml nước oxy già 3% vào canh khuẩn và kiểm tra ngay lập tức sự có mặt các bóng hơi, rồi 5 phút sau kiểm tra lại. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dacre JC Sharpe ME. Catalase production of lactobacílli. Nature (London) 1956; 178:700. Seeliger HPR. Listeriosis Basel: Karger, 1961 2. Whitenbury R. Hydrogen peroxide formation and catalase activity in the lactic acid bacteria 'Ĩ gen Microbiol 1964; 35: 13-26

327

3. TEST COAGULASE

Test coagulase chứng minh khả năng sản sinh ra chất làm đông huyết tương của giông vi khuẩn Staphylococcus aureus Huyết tương, trước khi làm test đưa huyết tương để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Huyết tương người, thõ, ngựa và lợn đều dùng làm test coagulase. Đôi với huyết tương người ở phòng truyền máu phải lưu ý không được dùng huyết tương có HIV và viêm gan. Máu có chứa citrate là chất chông đông duy nhất, vì vi khuẩn có khả năng năng sử dụng citrate. Phương pháp 1: Test ống nghiệm Ống nghiệm để làm test phải được kiểm tra về coagulase và phải qui định dùng riêng để phát hiện Staphylococcus aureus. Vi sinh kiểm chứng

1. Staphylococcus aureus 2. Staphylococcus aureus 3. Staphylococcus epidermidỉs

- dương tính yếu - dương tính - âm tính

Cách làm

1. Cho 0,5ml huyết tương pha loãng 1/10 trong nước muôi vào ông test 75 mm X 12 mm 2. Cho thêm 0,lml canh khuẩn 18-24 h trong canh thang dinh dưỡng, ủ ấm 37°c tốt nhất là chậu nước ấm. 3. Kiểm tra sau 3 và 6 h ủ âm về sự hình thành cục huyết tương 4. Để qua đêm ỗ nhiệt độ phòng thí nghiệm rồi lại kiểm tra sự hình thành cục huyết tương 5. Huyết tương thành cục là phản ứng dương Phương pháp 2: Test trên kính Test coagulase trên kính là test nhanh, nó phát hiện yếu tồ" làm đông huyết tương. Nấu kết quả đều âm thì cần phải xác định bằng test trong ô'ng. Vi sinh vật kiểm chứng

ĩ. Staphylococcus aureus 2. Staphylococcus epidermidis

328

- dương - âm

Cách làm

1. Từ một khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc chuyển vào 2 giọt nước muối trên một phiến kính hoà thành thể sữa. 2. Trộn một quai cấy huyết tương vào trong một trong hai giọt thể sữa và kiểm tra dưới kính hiển vi sự kết thành cục xuất hiện trong vòng 5-10 giây. Hiện tượng này chỉ rõ sự hiện diện coagulase; chậm trễ kết thành cục là âm tính. 3. Quan sát thể sữa thứ hai sẽ thấy không có sự tự ngưng kết TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Gillespie EH. The routine of the coagulase test for staphylococci. Mon Bull E merg PHLS 1943; 2: 19-22. 2. Cadness-Graves B, Williams R. Harpet GJ Miles AA. Slide test for coagulase positive staphylococci. Lancet 1943:736 4. TEST DI ĐỘNG

(Đối với Listeria và các sinh vật khác) Vi sinh vật kiểm chứng:

1. 2. 3. 4.

Listeria monocytogenes Edwardsiella tarda Shigella sonnet Klebsiella aerogenes

-

dương Ở 21°c dương Ở 37°c âm âm

Cách làm:

1. Chuẩn bị những ống nhỏ canh thang dinh dưỡng 2. Cấy sinh vật làm test và ủ ở nhiệt độ thích hợp.Đối với Listeria spp. thì phải ồ 21°c trong 4-6 h. 3. Nhỏ một giọt canh thang lên phiến kính và đậy lá kính. 4. Quan sát về di động dưới kính hiển vi quang học Listeria spp. biểu lộ sự di động đổ nhào điển hình (typical tumbling motility) ở 21°c và 37°c thì không. Làm giọt treo có thể kiểm tra dưới kính hiển vi. Nhỏ một giọt canh khuẩn lên iá kính và lật úp, rồi đặt lên phiến kính có vòng vaselin, vòng chát dẻo. 329

5. TEST DNASE (DESOXYRIBONUCLEASE)

Test này có thể sử dụng thêm vào test coagulase để xác nhận Staphylococcus aureus. Phân tử ADN bị thuỷ phân thành hôn hợp mono và polynucleotit bằng tác động của enzym (DNase) do vi sinh vật sinh ra. Thạch chứa ADN được sử dụng để chứng minh sự sản sinh DNase. Khuẩn lạc sinh DNase được bao quanh một vùng khi đĩa đã nuôi vi khuẩn tràn ngập acid hydrocloric. Gốc giống S. aureus sản sinh DNa ổn định khi đun nóng (heat-stable DNase) hoặc thermo nuclease. Còn Staphylococcus spp khác sản sinh DNase tuỳ cơ hội, không ổn định đối với nhiệt. Vi sinh vật kiểm chứng: 1. Vi khuẩn Gram dương 1. Staphylococcus aureus 2. Staphylococcus epidermidỉs '

- dương - ấm

2. Vi khuẩn Gram âm ĩ. Serratia marcescens 2. Edivardsielỉa tarda

- dương - âm

Cách làm: 1. Chuẩn bị dung dịch DNase đã biết đậm độ pha trong nước cất 2. Cho dung dịch này vào thạch dinh dưỡng ngay trước khi hấp ướt để đậm độ cuối cùng là 2 mg/1 (thạch DNase). Tiệt khuẩn môi trường ở 121°c trong 15 phút và rót ra đĩa khi môi trường nguội tới 50°c. 3. Chuẩn bị đĩa thạch 15-20 ml 4. Đặt một châm nhỏ hoặc đường sọc mỗi một khuẩn lạc dùng làm test lên m ặt đĩa thạch DNase và ủ ấm ở 18-24 h ở 37°c 5. Cho thêm 2-3ml acid hydrochloric IM (10%) hộịpniôi trường và láng cho đến khi mặt hộp được phủ khắp dùng địch acid. 6. Tách gạn bả phần aciđ thừa sau 30giây 7. Môi trường trở nên đục với nhừng vòng trong ỗ bất kỳ khuẩn lạc vi sinh vật nào sản sinh DNase. Cho thuốc nhuộm vào trong môi trường có thể phân biệt được ADN thuỷ phân và tránh được bước sử dụng acid. Toluidin blue và methyl

330

green hình thành phức hợp màu với ADN đa phân tử. Màu. sác, thay đổi là DNA thuỷ phân. Dung dịch toluidin blue 0,1% cũng có thể dùng để làm ngập bề mặt phát triển s. aureus đã baò quanh bằng vòng ihàu hồng (pink) trên nền màu xanh (blue background). TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Jeffries CD, Holtman DF, Guse DG. Rapid method for determining the activity of microorganism Salmonella on nucleic acids. J Bact 1957: 73: 590-91 2. Schreier JB. Modification of deoxyribronuclease test medium for rapid identification of Serratia rtiarcescens. Am J Clin Path 1969: 51:711-16. 6. TEST HYDROGEN SULPHIDE

■ ' V' (Đôi với Salmonella, Campylobacters và Yersinias) Sự tạo thành hydrogen sulphide là điểm đặc trưng tác đọng chuyển hoá bình thường của nhiều vi sinh vật. Thạch nghiêng TSI đằ được sử dụng để nhận dạng vi khuẩn gây bệnh đường rủột. Môi trường này chuyển thành màu đen nếu vi sinh vật làm test sinh hydrogen sụỊphide. Nhìn chung nhiều Salmonella spp dương tính về hydrogen sulphide. Trong khi đó Yersinia spp đều âm tính, ở Campylobacter Sfip vịệc sản sinh hydrogen sulphide có sự thay dổi giữa và trong các loáì (species). Vi sình vật kiểm chửng:

ỉ. 2. 3. 4.

Edwardsiella tarda Campylobacter jejuni Proteus rettgeri Campylobacter jejuni

-

dương dương âm âm

Cách làm:

1. Chuẩn bị các ống thạch TSI (mt 86) phần ở đáy nhiều, phần mặt nghiêng ít. 2. Cấy thẵng vào phần thạch ở đáy và ria ở trên mặt nghiêng ( 3. ủ ấm 18-24 h ở nhiệt độ 37°c đối với Salmonella và 30°c đối với ' Yersinias. Đối với Campylobacters ủ ấm ở khí quyển giảm oxy, tíăĩig khí carbon trong ba ngày. 1 ■ ";i 4 /JĩGểm ử â mồi trường'chuỷển‘sáng màu 4erl.

331

Test nhanh đối với Campylobacter:

1. Trẹo Ịở lửng một quai cấy rộng (5 mm) vi khuẩn phát triển 18-24 h trên thạch máu được ủ am ồ 37°c vào trong ống nghiệm nhỏ nút xoáy oxy không quá 7%, chứa 3-4 ml môi trường FBP (Feme bisulphite pyruvate). 2. ủ ấm kín (incubate closed) ở 37°c trong 2 h. 3. Quan sát sự hình thành màu đen của môi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Clark PH Hydrogen sulphide production by bacteria. J Gen Microbiol 1953: 8:397 407 2. Li or H. New extended biotyping scheme for "Campylobacter jejuni, Campylobacter coli and Campylobacter laridis" J Clin Microbiol 1984: 20: 636 40 3. Skirrow MB, Benjamin J. Differentation of enteropathogenic campylobacter. J Clin Path 1980: 33: 1122 4. Sulken SE. Willett JC. A triple sugar - ferrous sulphate medium for use in identification of enteric organisms J Lab Med 1940; 25:649-53. 7. TEST INDOLE

Một số vi sinh vật có khả năng làm gãy dây nối cỌa amino-acid tryptophan, sinh ra indole là đặc tính quan trọng được sử đụng để xếp loại và nhận dạng các vi khuẩn. Sự có mặt của ìnđole trong môi trường phát triển có thể phát hiện bằng cách thêm thuốc thử indole (dung dịch Kovac) thì thây màu hồng xuất hiện. Vi sinh vật kiểm chứng

ĩ. Escherichia coli 2. Serratia marcescens

- dương - âm

Thuốc thử :1

Thuốc thử. Kovac: Hoà tan 5 g p.dimethyl aminobenzaldehyde trong 75 ml cồn amyl. Thuốc thử sẽ tan nhanh hơn nếu tiến hành làm nóng chậu nước nóng 55°c. Làm nguội và cho thêm 25 ml acid hydrochloric đậm đặc, lắc nhẹ để trộn đều và bảo quản ỗ 4°c.

332

Cách làm:

1. Cây vào ống nước peptone, nước tryptone hoặc canh thang chứa 0,03% tryptophan canh khuẩn sinh vật thuần khiết dùng để làm test và ủ ấm ở 37°c trong 48 h. Một sô" test đòi hỏi phải để ở 30°c hoặc 44°c. 2. Cho thêm 5-10 giọt (0,2 ml) thuốc thử Kovac, lắc và để đứng ống nghiệm trong 10 phút. Màu hồng xuất hiện ở trên m ặt là có inặt indole.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Kovacs N. Eine vereinfachte Methode zum Nachweis der Indolbidung đurch Bakterien z ỉmmun Forsch Exp Ther 1928: 55: 311-15. 8. TEST LÊN MEN DƯỜNG

(Glucose salicin, manose, xylose và rhamnose) Vì sinh vệt kiểm chứng:

Sinh vật để kiểm chứng phản ứng có thể thay dổi tuỳ từng phòng thí nghiệm. Cần phải giữ giông sinh vật dã biết phản ứng dương và âm đối với từng thứ đường. Cách làm

1. Chuẩn bị dung dịch đường 10% theo yêu cầu và diệt khuẩn ở 115°c trong 10 phút. Dùng nồi hấp nhỏ để tránh thời gian đun nóng kéo dài vì nó làm biến chất carbohydrate. Nếu nồi hấp không thích hợp thì phải diệt khuẩn bằng cách lọc. 2. Lấy 90 ml nước peptone vô khuẩn cho thêm 10 ml dung dịch đường 10% và 1-2 ml dung dịch màu chỉ thị Andradè.' Nước peptone Andrade cơ bản sẽ được sử dụng làm phản ứng. 3. Bằng cách vô khuẩn chuyển 5 ml vào chai nhỏ vô khuẩn hoặc ống nghiệm. Một ống Durham lồng vào trong để thu khí sinh ra. ủ ấm qua đêm kiểm tra vô khuẩn. 4. Cấy vi sinh vật làm test vào bình hoặc ống nghiệm chứa nước đường peptone và ủ ậm ở 37°c (30°c đối với một số sinh vật như Yẹrsinia spp.) cho tới 7 ngày. 5. Quan sát sự xuất hiện màu hồng biểu thị sinh acid nếu có ống Durham thì có thể thấy hơi ồ trong ống hoặc không có hơi.

333

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.

Rocourt J, Schrettenbrunner Ạ, Seeligar HPR. Differentiation biochimique des groups genomiques de Listeria monocytogenes (sensu lato). Ann Microbiol (Inst Pasteur) 1983A; 134: 65-71.

9. TEST OXiDASE

Test này dùng để phát hiện vi sinh vật sản sinh cytochrome oxidase được sử dụng trong giai đoạn đầu nhận diện các nhóm vi khuẩn. Vi sinh vật kiểm chứng:

1. Pseudomonas aeruginosa 2. Escherichia colị

- dương - âm

Thuốc thử oxidase:

1. Thuốc thử mỗi ngày pha một lần: Hoà tan 0,1 g tếtramethyỉ p-phenylene diamine dihydrochloộde trong 10 ỊTil nước cất, cho thêm 1% acid ascorbic và bảo quản chỗ tôi, kéò dài thời gian tác dụng của thuốc thử được bôn đến năm ngày, khi thuốc có màu đỏ tía thì loại bỏ. 2 Pha chế từ dung địch gốc ổn định Dung dịch gốc: Ethylene diamine tetraacetic acid EDTA disodíum salt lg Sodium thiosulphate pentahydrate 0,5g r Nước cất 100ml Pha loãng 10 ml dung dịch gốc với nước cất cho tới 100 ml. Cho thêm 0,2 tetramèthyl p-phenylène diamine dihydrochloride. Để ở 4°c dùng được từ hai đến 4 tuần. Loại bỏ dung: dịch thử khi có .màu tíà, Cá ch lém

‘ị ,

Pha chế theo kỹ thuật sau, dung dịch gốc ổn định tới ố tháng 1. Làm ẩm mẩu giấy lọc trong đĩa Pêtri bằng hai hoặc ba giọt thuốc ’ thử oxidảsé -T 2. Dùng đũa gỗ, thuỷ tinh hoặc quaĩ cấy (không dùng loại quai cấy : bằng nicktfom) chuýển một khuẩn lạc làm test íên giấy lọc và cọ ■ lên ứiện tích giấy thấm thuốc thử oádase. 3. Quan sát sự xuất hiện màu tía đậm (dai*k purple *colóràtioii) đó là 1 biểu thị vi khuẩii sản sỉnh oxidase. ; j .

^34

TÀI L i ậ l / THAM KHÀO

1. Kovacs N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by thé oxidase reaction. Nature, London 1956, 178:703 2. Steed KJ. The oxidase reaction as a taxonomic tool. J Gen Microbiol 1961; 25: 297-306 3. Steel KJ. The oxidase activity of staphylococci. J Apply Bacteriol 1962; 25:'445-7 4. Daubner I, Mayer J Die Anwendung des Oxydase-Testes bile der hygienisch-bakteriologischen Wasseranalyse, Arch Hyg Bakt 1968; 152: 302-5. 10. TEST TAN MÁU

.

(Đối với Listeria và các sính vật khác) Khi mọc trên thạch máu, một số vi sinh vật có thể sản sinh chất tan máu khuếch tán vào trong môi trường và tác động đến tế bào hồng cầu. Tác dụng này có thể xuất hiện tan máu alpha là một vùng xanh lá cây với tế bào máu còn nguyên vẹn hoặc tan máu bêta là một vùng màu trong, nơi đây máu đã bị tan hoàn toàn. Tế bào máu ngựa thông dụng nhất để chứng minh hiệu lực này. Khi ghi kết quả test tan máu cần phải ghi rõ týp (giông động vật) tế bào máu đã sử dụng. ề

VỊ sinh vật kiểm chứng 1. Listeria monocytogenes 2. Listeria cinnocua

- dương - âm

Cách làm 1. Sử dụng một quai cấy thường, đảm bảo vi sinh vật đủ lan trên mặt thạch máu, tạo nên những khuẩn lạc riệng rẽ, ủ ấm qua đêm (18-24 s ở 37 c. 2. Kiểm tra những vùng tan máu quanh khuẩn lạc trên đĩạ thạch có thể thấy rõ. Điều chỉnh ánh sáng tương phản càng tốt.

123-V SV T P .

335

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Brown JH. The use of blood agar for the study of streptococci. Rockefeller institute of Medical Research Monograph no 9.1919. 2. Elek SD, Levy E. The nature of discrepancies between haemolysins in culture filtrates and plate haemolysin patterns of staphylococci. J Path Bact 1954; 68: 31-40 3. Orcull ML, Howe PE. Haemolytic action of a staphylococcus due to a fat-splitting enzyme. J Exp Med 1922; 35: 409-20. 11. TEST THUỶ PHÂN HIPPURAT (HIPPURATE HYDROLYSIS)

(Đối với Campylobacters) Campylobacter jejuni có thể thuỷ phân hippurate tạo th àn h glycine và benzoic acid. Việc tạo thành glycine có thể được phát hiện bằng cách cho thêm dung dịch ninhydrin để làm test môi trường. Vi sinh vật kiểm chứng

1. Campylobacter jejuni 2. Campylobacter coỉi

- dương - âm

Thuốc thử

1. Dung dịch ninhydrin 3,5% trong acetone và butanol phần nhau. Bảo quản trong bình màu ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. 2. Dung địch sodium hippurate 5%. Phân thành từng thể tích 0,5 ml, •bảo quản ở -20°c. Cách làm 1. Nuôi vi sinh vật làm test trên thạch máu, để ở khí quyển vi hiếu khí, ở 37°c từ 18-24 h. 2. Chuyển bằng quai cấy đường kính 2 mm khuẩn ỉạc phẩt triển trên đĩa vào 2 ml nưởc cất. Quấy cho vi sinh vật thành thể sữa và thêm 0,5 ml dung dịch hippurate. 3. ủ trong chậu nước 37°c trong 2 h. 4. Cho thêm 1 ml dung dịch ninhyđrin và để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 2 h (hoặc 10 phút ở 37°C). 5. Phản ứng dương thì màu đỏ tía (purple) xuất hiện. Nó chứng tỏ sự hình thành glucine.

336

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hwang MN, Ederer Gm. Rapid hippurate hydrolysis method for presumptive idenification of group B streptococci. J Clin Microbiol 1975; 1: 114-5 2. Lennette EH, Balows A, Hauster WJ, Shadomy HJ, editors, Manual of clinical microbiology 4th ed. Washington: American Society of Microbiology 1985: 302-8. 3. Colle JG, Duguid Jp, Fraser AG, Marmion BP, editors. Practical medical microbiology. 13th ed Edinburgh: Churchill Livingstone, 1989; 522. 12. TEST UREASE

Sự hoạt động của men urease được biểu hiện bằng sự sản sinh ammonia từ dùng dịch urê. Sự thay dổi pH có thể chứng minh bằng cách cho vào môi trường màu chỉ thị. Vi sinh vật kiểm chứng

1. Proteus rettgeri 2. Serratia marcescens

- dương - âm

Cách làm

1. Chuẩn bị các ống môi trường urê Christensen. Những môi trường này có thể là thạch nghiêng hoặc canh thang. 2. Cây lên mặt thạch hoặc canh thang sinh vật test và ủ ấm ở 30-37°C thường có thể đọc test sau 5-6 h ủ ấm ở chậu nước ấm. 3. Quan sát màu hồng của môi trường chứng tỏ có sản sinh urease. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Christensen WB. Urea decomposition as a means of differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shigella. J Bacteriol 1946; 52: 461-6. 2. Maslen LGC. Routine use of liquid urea medium for identifying Salmonella and Shigella organisms. Brit Med J 1952; 2: 545-6.

337

13. TEST VOGES PROSKAUER

(Clio Listerias và các sinh vật khác) Vi sinh vật kiểm chửng

1. 2. 3. 4.

Listreria monocytogenes Serratìa marcescens Escherichia coỉi Proteus rettgeri

-

dương dương âm âm

Thuốc thử 1. Dung dịch 5% a-naphtol trong ethanol. Màu của thuôc thử màu vàng rơm là được 2. Dung dịch 40% potassium hydroxyde

Cách làm 1. Chuẩn bị các ống chứa 5 ml canh thang glucose phosphate 2. Cây canh khuẩn làm test thuần khiết và ủ ấm 37pc trong 48 h.' 3. Cho thêm 0,6 ml dung dịch a-naphtol và 0,2 mỊ dung dịch potassium hydroxyde 4. Lắc mạnh và quan sát sự phát triển màu hồng/đỏ (pink/red) 5. Để nghiêng các ông ở nhiệt độ phòng 1 giờ, kiếm tra lại màụ hồng/đỏ trước khi kết luận test âm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. B arritt MM. The intensification of the Voges-Proskauer reaction by the addition of alpha-riaphtfrol. J Path B ad 1963: 42: 441-54 2. Hargen A, Norris D. The bacterial production of acetylmethylcarbinol and 2,3-butylene/ glycol from various substances. Proc R Sac B 1911-12; 84: 492-9.

338

PH Ụ LỤC 1

Thời kỳ ủ bệnh và triệu chứng thông thường về ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Sinh vặt ià nguyên nhản

ủ bệnh

Triệu ch ử n g

Nhiẻm khuẩn thực phẩm Salm onella spp.

12-36 h

Đi ỉa lỏng, nôn mửa, sốt, khó ở

Clostridium perừingens

8-22 h

Đau bụng, đi ỉa lỏng, buồn nôn, khi nõn : mửa hoặc sốt.

Cam pylobacter spp.

2-12 ngày 2-48 h

Vibrio parahaem olỵticus

Sốt vồ khó ở thường đến trước đau bụng, di ỉa lỏng nhiều (thưởng có máu) Ị I

Escherichia co li EPEC, EIEC và ị ETEC VTEC serotype OI57 I

4-36 h

I

1-7 ngày

1 Listeria monocytogenes

Aerom onas spp.

ì Đì ỉa lỏng, nôn mửa, sốt, khó ở, viêm ruột, chảy máu (haemorrhagic colitis), hội chứng I urê - huyết cao - tan huyết. Ị

24-36 h (có khi lâu hơn)

; Yersinia enterocolitica

Đi ỉa lỏng nhiều dẫn tới mất nước, nôn mửa và sốt

Đau bụng, sốt, nhức đầu, đi ỉa lỏng, khỏ ___ ____ ở va nốn mửa viêm màng não, sốt, nhiễm khuẩn huyết, sẩy thai, viêm nhiễm sơ sinh (neonatal ' infection)

8^36 h

Ị Đi ỉa lỏng, khó ở

2-6 h

1 Nôn mửa nặng (severe) Đau bụng, đi ỉa i : lỏng, có trường hợp mất nước nặng dần ị Ị tới sự xẹp (collapse). _

Trúng độc thực phẩm Staphylococcus aureus •

Bacillus cereus

Bacillus subíilis

' R.lichcnitormis ! Clostridium botulinum

I

I 1-5 h, 8-16 h

15-90 phút,

’ Nôn mửa cấp (acute), đi ỉa lỏng, cũng ị thông thường chủ yếu là đi ỉa lỏng, có khi nón mửa Thống thường nôn mửa

10 h 4-15 h 24-72 h

Chủ yếu là ỉa lỏng, có khi nôn mửa i Mệt mòi (fatigue) uể oải (lassitude), hoa mắt choáng váng (dizziness) nhìn mờ (blurred Vision), khó nói, khó thô.

339

PHỤ LỤC 2 Sơ đồ gợi ý kiểm nghiệm mẫu thức ăn gây ngộ độc

N h u ộ m G ra m , soi kính

C â n n h ắ c th ô n g tin thời gian ủ b ệ n h , triệu ch ứ n g , loại th ứ c ă n

C h ọ n te s t đ ể áp d ụ n g

Đ ế m vi k h u ẩ n

Làm g iàu vi k h u ẩ n

C ấ y đĩa môi trường I S a tm o n e lla s

BG,

(BSL MCB DCA XLD)

C a m p y lo b a c te r s

(CCDA h o ặ c P res)

c .p e r f r i n g e n s Listerias

(TSC)

t

1

1

Ái khí

Ky khí

(PCA/BA)

(BP) (BC)

Bacillus s p p k hác

(BA)

Vibrios

(TCBS)

Y ersin ias

(CIN)

E.coli

(TBA)

E.coli 0 1 5 7

(SMC)

Conform o rg s

(VRBA)

A e ro m o n a d s

(BBG)

Enterococci

(Ent) (DCRB)

{25g/225m l S a lm o n e lla s

ủ và c ấ y lại

Soi kinh, te s t sinh h ó a, môi trường lựa c h ọ n , môi

Định typ h u y ế t th an h , phagiơ, p h â n tích đ ộ c tố

340

môi trường) (B P W /R V +S C )

S t a p h .a u r e u s (TMG) (APW) Vibrios C a m p y l o b a c t e r s (C am p) Y ersin ia s Listerias E.coli 0 1 5 7

(LA)

S t a p h .a u r e u s B .c e re u s

M en /m ố c

1 ■■

(Tris) (BPW/LEB) (TSB)

Chú thích APW

Nước p e p to n e kiềm

LEB

C a n h th a n g lảm g iàu listeria

BA

T h ạ c h m áu

MLCB

T h ạ c h m annitol lysine crystal violet bile

BBG

Thạch bile g re e n a g a r

brilliant

PCA

Thạch agar)

BC

Thạch bacillus (PEMBA)

cereus

P re s

T h ạ c h P re s to n

BG

T h ạ c h brillliant g re en

RV

Canh th a n g Vassiliadis

BP

T h ạ c h Bair P arker

sc

C a n h t h a n g se le n ite cystine

BPW

N ước p e p to n đ ệ m

SMC

T h ạ c h sorbitol M ac C o n k e y

BS

T h ạ c h bism uth sulphite

TBA

T h ạ c h try p to n e biie

C am p

Canh th a n g c a m p y lo b a c te r

TCBS

T h ạ c h th ìo s u lp h a t citrate sail s u c r o s e

CỈN

T h ạc h cefsulodin-irgasan novobiocin

TMG

C a n h th a n g Tellurite m annitol glycine

CCD A

T h ạ c h c h ọ n lọc k h ô n g m á u c a m p y lo b a c te r ( c a m p y lo b a c te r blood ỉ r e e s e l e c t i v e ag a r)

Tris

N ước Tris buffer p e p t o n e

DCA

T h ạ c h d esox ych olatecitrate

TSB

C a n h th a n g t r y p c a s e soy

DCRB

T h ạ c h dichloran ro s e bengal

TSC

Thạch try p to se cy c lo se rin e

Ent

T h ạ c h liên c ẩ u KF

VRBA

T h ạ c h violet red blue

LA

T h ạ c h listeria (Oxford)

XLD

Thạch xyloe d e s o x y c h o la te

s a lts

lảm

giàu

đếm

đĩa

(plate

count

R appaport

bile

sulphite

lysin

341

11. MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ, THUỐC NHUỘM

1. CANH THANG ETHYL VIOLET AZIDE

20,0 g Tryptone 5,0 g Glucose 5,0 g Sodium chloride 2,7 g Dipotassium hydrogen phosphate 2,7 g Potassium hidrogen phosphate 0,4 g Sodium azide 0,00083 g Ethyl violet Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0 diệt khuẩn 15 phút Cí 1 2 1 °c 2. CANH THANG KOSER’S CITRATE

Sodium ammonium hydrogen phosphate 1,5 g Dipotassium hydrogen phosphate 1,0 g Magnesium sulphate 0,2 g Sodium citrate 3,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 6,8; chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml. Diệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 3. CANH THANG KCN (POTASSIUM CYANID BROTH)

Proteose peptone 30g Sodium chloride 50g Potassium dihydrogen phosphate 0,225 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,6. Diệt khuẩn 15 phút ở 121°c, đề nguội và cho vào tu lạnh 5-8°C. Bằng cách vô khuẩn và thận trọng, cho thêm 15 ml cyanid 0,5% lạnh (5-8°C) lắc nhẹ nhàng và phân ra ống nghiệm, mỗi ống 1 ml, đóng nút bằng nút bần thấm parafin và bảo quản ở 5-6°C.

342

4. CANH THANG SELENITE CYSTIN:

a. Tryptone 5,0 g Lactose 4,0 g Disodium hydrogenphosphate 10,0 g Sodium acid selenite 4,0 g Nước cất 1000,0 ml Hoà tan bằng cách đun sôi trong 5 phút b. L-Cystin 0,1 g N-sodium hydroxyde 15,0 mi Hoà tan trong 100 ml nước cất Cho b vào a ở tỷ lệ 0,1 tới 10 ml.Điồu chỉnh pỉltới 7;0; phân ra các bình 100 ml. Môi trường pha ngày nào thì dùng ngày đó. 5. CANH THANG DEXTROSE AZIDE

Beef extract 4,5 g Tryptone 15,0 g Glucose 7,5 g Sodium chloride 7,5 g Sodium azide 0,5 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh' ỊiH tới 7,2; phân vào các ống nghiệm, mỗi ống 7ml. Tiệt khuẩn 15 phút ồ 121°c. 6. CANH THANG DINH DƯỠNG

Beef extract 3,0 g Peptone ' . 5,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 7. CANH THẠNG TSB (TRYPTICASE SOY BROTH 3% SALT)

Trypticase peptone Phytone peptone Sodium chloride Đípotassium hydrogen phosphate

17,0 3,0 30,0 2,5

g g g g

343

Glucose 2,5 g Nước cất 1000,0 ml Điều chinh pH tới 7,3; phân ra các ống nghiệm. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121 C. 8. CANH THANG EC 20,0 g Trypticase hoặc tryptone 1,5 g Bile salt N°3 5,0 g Lactose 4,0 g Dipotassiurn hydrogen phosphate 1,5 g Potassium dihydrogen phosphate 5,0 g Sodium chloride Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 6,9; chia ra mỗi ống nghiệm 15 mi. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c 9. CANH THANG HLGB (HUGH-LIEFSON GLUCOSE BROTH)

Peptone 2,0 g Yeast extract 0,5 g Sodium chloride 30,0 g Glucose 10,0 g Bromocresol purple 0,015 g Thạch 3,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,4; phân ra các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 10. CANH THANG GSTB (GLUCOSE SALT TEEPOL BROTH)

Beef extract 10,0 g Peptone 3,0 g Sodium chloride 30,0 g Glucose 5,0 g Methyl violet 0,002 g Teepol 4,0 ml Nước cất 100 0,0 ml Điểu chỉnh pH tới 7,4; phân 10 ml vào ống nghiệm. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c.

344

11. CANH THANG LACTOSE

Beef extract Peptone Lactose Nước cất Điều chỉnh pH tới ở 121 °c.

3.0 g 5.0 g 5.0 g 1000,0 ml 6 ,8 ; phân vào các ống lên men. Tiệt khuẩn 15 phút

12. CANH THANG LÀM GIÀU LISTERIA (UVM-I)

Mối trường cơ bản 5.0 5.0 5.0 5.0

g g g g

20,0 g

1,35 g 12,0 g 1.0 g 1000,0 ml 7+0,2 Cho tất các chất trên vào nước cất, quấy cho tan. Tiệt khuẩn 121°c trong 15 phút, làm mát ngay sau khi sấy ướt. Bảo quản chỗ tối ở 4°c. C hất cho thêm a. Dung dịch nalidixic acid: 2 g trong 100 ml 0,1 M NaOH (0,4 g NaOH trong 100 ml nước cất) b. Dung dịch acrỉílavin: 1,2 g trong 100ml nước cất. Lọc tiệt khuẩn cả hai dung dịch trên và bảo quản ở4°c, hạn dùng trong 4 tuần. Trứớc khi nuôỉ cấy thì cho lm l dung dịch nalidixic acid (a) và 1,0 ml dung dịch acriflavin (b) vào 1000 ml môi trường cơ bản. 13. CANH THANG FRASER

Môi trường cơ bản Proteose peptone Tryptone Lab-Lemco powder Yeast extract

5,0 g 5,0 g 5,0 g 5,0 g

345

Sodium chloride 20,0 g Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 1,35 g Disodium hydrogen phosphate(Na2HP 0 4 ) 12,0 g Aesculin 1,0 g Nước cất 1000,0 ml pH 7,4+0,2 Trộn đều tấ t cả các chất trên vào trong nưó'c cât. Tiệt khuẩn 121°c trong 10 phút, làm nguội ngay sau khi tiệt khuẩn. Nếu quá lửa (over heated) môi trường đen hoặc sẫm màu thì phải loại bỏ. Cho thêm l,0ml dung dịch nalidixic (đã nói ở trên). Phản vào các ông nghiệm vô khuẩn 20xl50mm. Bảo quản ở chỗ tôi nhiệt độ 4°c. C hất cho thêm Ferric ammonium citrate: 5,0 g trong 100 ml nưức cất Lithium chloride: 30,0g trong 100 ml nước cất Acriílavin: 0,25 g trong 100 ml nước cất Tất cả các dung dịch này đều lọc tiệ t khuẩn và báo quản d 4°c Trước khi dùng, trộn 3 dung địch với thể tích tương đương. Khi trộn phải chú ý theo thứ tự để đề phòng acriílavin bị kết tủa. Cho vào mỗi ông môi trường cơ bản trên 0,3 mí dung dịch đã pha trộn ngay trước khi dùng. 14. C A N H T H A N G EE (E N T E R IC E N R IC H M E N T B R O T H )

Peptone 10,0 g Glucose 5,0 g Disodium hydrogen phosphate 8,0 g Potassium dihydrogen phosphate 2,0 g Ox bile 20,0 g Brilliant green 0,015 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,2; chia ra bình, cứ mỗi bình 30ml. Tiệt khuẩn 5 phút ở 121 °c. 1 5 .

C A N H

T H A N G

M - F C

Tryptose Proteose peptone No 3 hoặc polypeptone Yeast extract Sodium chloride 346

10,0 50 30 50

g g g g

Lactose 12,5 g Bile salts No3 hoặc bile salts mixtures 1,5 g Aniline blue 0,1 g Nước cất 1000,0 ml Cho ngậm nước lại trong nước cất có chứa 10 ml 1% rosalic acid trong 0,2 N NaOH. Đun môi trường tới đíêm sôi thì dưa ngay ra khỏi lửa và làm nguội tới 45(,c. Không tiệt khuẩn bằng nồi hấp. pH cuối cùng phải là 7,4. Môi trường làm xong phải bảo quần ở 2-10(,C. Môi trường quá 96 giờ phải loại bỏ. 16. CANH THANG MR-VP. 3% MUỐI

Peptone 7,0 g Glucose 5,0 g Sodium chloride 30,0 £ Dipotassium hydrogen phosphate 5,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chĩnh pH tới 6,9; phân vào các ống nghiệm, mỗi ông 10 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 1 7 .

C A N H

T H A N G

M A C C O N K E Y

Peptone 20,0 g Lactose 10,0 g Ox gall ' 5,0 ẹr Bromocresol purple 0-01 S' Nước cất 1000.0 ml Điều chỉnh pH tới 7,3; phân vào bình tam giác, mỗi bình 225 ml. Tiệt khuấn 15 phút ơ 121°c. 18. C A N H T H A N G BG LB (B R IL L IA N T -G R E E N L A C T O S E B IL E B R O T H 2 % )

Peptone 10)0 ể . ■ , Lactose 10,0 g Ox bile 20,0 g Brilliant-green . 0,0133 g Nước cất 1000,0 ml Hoà tan peptone và lactose trong 500ml nước cất, cho thêm mật bò đã dược hoà tan trong 200 ml nước, trộn đều và thêm nước tới 950 ml, sửa pH tới 7,4. Thêm 13,3 ml dung dịch brilliant - green 0,1%. Cho thêm nước cất cho đu 1 lít. Chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml, có ống Durham. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121uc. 347

19. CANH THANG NITRATE

Meat extract 3,0 g Peptone 5,0 g Potassium nitrate 1,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0; phân ra các ống nghiệm. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121 c 20. CANH THANG ÓC-TIM HÃM

Óc bê hãm 200,0 g Tim bò hãm 250,0 g Peptone 10,0 g Sodium chloride 5,0 g Di sodium hydrogen phosphate 2,5 g Glucose 2,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,4; phân vào các ống, mỗi ông 7 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c 21. CANH THANG SINH NHA BÀO (SPORULATION BROTH)

Trypticase 20,0 g Vitamin-free casamino acid 20,0 g Sodium thioglycollate 1,0 g Nước cất 1000,0 ml Phân ra các ông nghiệm có nút xoáy, mỗi ống 10 ml. T iệt khuẩn 15 phút ở 121°c. Ngay trước khi dùng cho thêm mỗi một ống môi trường 1 ml dung dịch lọc thiamine hydrochloride (10 mg/ml) 22. CANH THANG SORBITOL Đ ỏ PHENOL (PHENOL RED SORBITOL BROTH)

Peptone 10,0 g Sodium chloride 5,0 g Phenol red 0,025 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0; phân vào các ông, mỗi ông 4,5 ml; có ống D urham lộn ngược. T iệt khuẩn 15 p hút đ 121°c. Để nguội và cho thêm 0,5 ml dung dịch sorbitol 5% đã qua lọc Seitz

348

23. CANH THANG STB (SALT TRYPTICASE BROTH)

Trypticase 10,0 g Yeast extract 3,0 g Nước cất 1000,0 rpl Cho thêm 0, 60, 80 và100 g NaCl cho 1 lít để làm canh thang 0,6,8 và 10%. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 24. CANH THANG TRYPTONE, 3% MUỐl

Tryptone 10,0 g Sodium chloride 30,0 g Nước cất 1000,0 ml Phân ra các ông nghiệm mỗi ống 5 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c 25. CANH THANG TR1PTOSE MUỐI

Như canh thang tryptose (mt 26), nhưng chứa 65 g muối; pH 6,9-7,0 26. CANH THANG TRYPTOSE

Tryptose 10,0 g Glucose 1,0 g Sodium chloride 5,0 g Thiamine hydrochloride 0,005 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tởi 7,2. Phân ra các ông nghiệm, mỗi ông 5 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 27. CANH THANG TRYPTOSE Ox GALL 40%

Như canh thang tryptose (mt 26), nhưng chiếm tới 40g Ox gall cho một lít; pH 6,9-7,0 28. CANH THANG L-ST (LAURYL SULPHATE TRYPTOSE BROTH)

Tryptose, tryptone hoặc trypticase Lactose Dipotassium monohydrogen phosphate Potassium dihydrogeií phosphate Sodium chloride Sodium lauryl sulphate Nước cất

20,0 g . 5,0 g 2,75 g 2,75 g 5,0 g 0,1 g 1000,0 ml 349

Điều chỉnh pH tới 6,8. Phân ra các ống nghiệm, .môi ống 10 ml với ổng Durham lộn ngược. Tiệt khuẩn 10 phút ở 121°c. 29. CANH THANG TRYPTOSE TELLURITE

Như catih thang tryptose (mt 26), chỉ trừ có potassium tellurite 5,0 g thêm 15 g thạch là thạch tryptose tellurite cho một lít, pH 6,9-7,0. 30. CHÍ THỊ ANDRADE

Acid fuchsin 0,5 g Sođium hydroxide (IN) 16,0 ml Nước cất 100,0 ml Hoà tan fuchsin trong nước cất và cho thêm sodium hydroxide. Sau nhiều giờ phải mất màu, nếu không thì cho thêm mấy giọt kiềm. 31. CHÍ THỊ METHYL RED INDICATOR

Methyl red 0,1 g Cồn 95% 300,0 ml Hoà tan methyl red trong cồn và cho thêm nước cất vừa đủ 500 ml. 32. BROMOCRESOL PURPLE

Cân chính xác 0,1 g chỉ thị bromocresol purpỉe, cho vào 20 ml sodium hydroxide 0,05 N. Đun trên bếp nhỏ lửa. Cho thêm 5ml dung dịch sodium hydroxid 0,05 N (pha sẫn), Khi dùng thì pha loãng 1 ml dung địch pha sắn với 9 ml nước cất. 33. DUNG DỊCH NƯỚC MUỐI ĐỆM PHOSPHATE (PBS), PH 7,6

Dung dịch d ự trữ (stock solution) Di sodium hydrogen phosphate Sodium hydrogenphosphate Sodium chloride Nước cất D ung d ịch đ ể là m việc (w orking solution) Dung dịch dự trữ đậm đặc Nước cấtvừa đủ

12,35 g 1,80 g 85*0 g 1000,0 ml 100,0 mi 1000,0 ml

34. DUNG DỊCH NƯỚC MUỐI (SAL1N SOLUTION)

Sodium chloride 85 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0. Tiệt khuẩn 20 phút ở 121°c. 350

35. GELATIN DINH DƯỠNG, 3% MUỐI

Beef extraet 3.0 g Peptone 5.0 g Gelatin 120,0 g Sodium chloride ; „ 30,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0. Tiệt khuẩn 12 phut ở 121°c. 36. LÒNG Đỏ TRỨNG THỂ SỬA

Dùng trứng gà tươi, tách lòng đỏ khỏi lòng trắríg,’ cho thêm nước gấp bốn thể tích lòng đỏ và quấy thật đều. Đun nóng thể sữa trong chậu nước ấnji;146°c trọng 2 h và để thành tủa ở 0,5°c trong suốt 18-24 h. Gạn bỏ phan nước trong và tiệt khuẩn bằng cách lọc< Thể sữa được để ở 0-5°C và dùng trong vòng 72 h. 37. MÔI TRƯỜNG CHUỔl BÀO TỬ (ROPE SPORE MEDIUM)

Beef extract Peptone Sodium chloride Nước cất ' Điều chỉnh pH tới 7,2; phân ra các ông nghiệm, mỗi khuẩn 15 phút ở 121°c.

5,4 g 10,0 g 9,0 g 1000,0 ml " ống 5 ml. Tiệt

38. MÔI TRƯỜNG CARBOHYDRAT 3% MUỐI

I

Beef extract 1>0 g Pro too se peptone 3,0 g ! Sodium chloride 30,0 g Rromcresol purplo 0,04 g ' Nước cất : ' '' ■' ' 1000,0 ml Cách chuẩn bị giếng như môi' trường lên mèn carbohydrate (mt 46). 39. MÔI TRƯỜNG DECARBOXYLASE 3% MUỐI (ARGININE HYDRALASE BROTH)

•

:

Peptòne Yeast extract Sodilim chloride Glucose ’ ■ Bromcresol purple (1,6%) Nước cất

T24 - V SV ĨP.

3.0 g "5,0 g 30.0 g 1.0 ĩịil

1.0 g 1000,0 ml 351

Điều chỉnh pH từ 6,7-6,8. Chia canh thang cơ bản làm 3 phần. Cho thêm 0,5% L- arginine vào phần đầu; 0,5% L-lysine vào phần thứ hai, phần thứ ba dể làm chứng. Cho vào mỗi ông nghiệm có nút xoáy 3 ml. Tiệt khuẩn 10 phút ở 121°c. 40. MÔI TRƯỜNG LDC (LYSINE DECARBOXYLATION MEDIUM)

L-lysine monohydrochloride 3,0 g Glucose 1,0 g Yeast extract 5,0 g Bromocresol purple (1,6%) 0,015 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH 6,8; chia ra các ông nghiệm nhỏ (18x160 mm) môi ống 5 ml. Tiệt khuẩn 20 phút ở 12l°c. 41. MÔI TRƯỜNG OXFORD CẢ! TIÊN (MOX)

Mòi trư ờ ng cơ bản 39-44,0 g Columbia blood agar base Aesculin 1,0 g Ferric ammonium citrate 0,5 g 15,0 g Lithium chloride Agar 2,0 g 1000,0 ml Nước cất 7,2±0,2 pH Pha trộn tấ t cả các thành phần trên trong nước cất, trừ agar, bằng cách dùng thìa khuây từ tính (megnetic stirrer). Sau đó cho thêm agar vào. Điều chỉnh pH 7,2 nếu cần. Thêm 1,0 ml dung dịch colistin. Tiệt khuẩn ở 121°c trong 10 phút. Lắc trộn thật đều và làm nguội nhanh ở chậu nước 46°c. Cho thêm 2 ml dung dịch moxalactam. Lắc trộn đều và rót 12 ml cho mỗi đĩa Sô' lượng của Columbia blood agar phụ thuộc vào các hãng C hất cho thèm Dưng dịch colistin: cho 1 g colistin methane sulphonate vào 100 ml 0,1M potassium phosphate đệm. Bảo quản trong các lọ nhỏ (3-5 ml) ở -20°c Dung dịch moxalaetam: cho 1 g sodium hoặc ammonium-moxalactam vào 100 ml đệm potassium phosphate 0,1M. T iệt khuẩn bằng lọc, bảo quẩn trong ống từng th ể tích 2 ml ở -2 0 ° c hoặc thấp hơn.

352

42. MÔ! TRƯỜNG PHỦ MÁU NGựA (HORSE BLOOD OVERLAY AGAR)

Lớp đáy ịColumbia agar) Peptone Bitone Tryptic digest of beef heart Corn starch Sodium chloride Agar Nước cất pH

10,0 g 10,0 g 3,0 g 1,0 g 5,0 g 15,0 g 1000,0 ml 7,3+0,2

Pha trộn đều tất cả các thành phần trong nước cất. Đun nhỏ lửa và khuấy liên tục để cho thạch tan hết. Rồi đun sôi. Tiệt khuẩn 121°c trong 15 phút. Để nguội tới 50°c thì rót ra đĩa petri đường kính 100 mm mỗi đĩa 10 ml. Để đông lại. Lớp đỉnh Chuẩn bị thạch Columbia cơ bản như đã mô tả ờ trên. Sau khi tiệt khuẩn, để nguội tới 50°c, cho thêm 4 ml máu ngựa đã loại tơ huyết vào 100 ml môi trường. Xoáy bình để trộn đều. Phu lên lớp đáy (khi lớp môi trường đáy còn ấm) 5 ml môi trường cơ sở trên máu ngựa. Để nghiêng đĩa để lớp đỉnh được bằng phắng. Để cho môi trường đông lại và khồ trước khi dùng. Bảo quản đĩa môi trường ở 4°c tới 48 h. Loại bỏ bất kỳ đĩa môi trường nào đã đổi màu trước khi nuôi cấy. 43. MÔI TRƯỜNG BHI (BRAIN HEART INFUSION)

6,0 g Infusion from brain and heart 6,0 g Peptic digest of animal tissue 5,0 g Sodium chloride 3,0 g Glucose 14,5 g Pancreatic digest of gelatin 2,5 g Disodium hydrogen phosphate (Na2HP04) 1000,0 ml Nước cất 7,4±0,2 g pH Tất cả các thành phần được hoà tan trong nước cất (thêm 1,5% agar để thành môi trường thạch). Phân vào ông nghiệm 13x100 mm 5 ml. Tiệt khuẩn 121°G trong 15 phút. Bảo quản ở 2-8°C tới 6 tháng.

353

44. MÔI TRƯỜNG INDOL

Tryptone 10,0 g Sodium chloride 5,0 g DL-tryptophan 1,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH 7,0, phân ra cácôrig nghiệm đường kính 16mm, mỗi ống 5 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở121°c. 45. MÔI TRƯỜNG LÀM GIÀU BANG THỊT BĂM (COOKED MEAT ENRICHMENT MEDIUM)

Beef heart 454,0 g Peptone 20,0 g Glucose 2,0 g Sodium chloride5,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH 7,2 chia ra các ống nghiệm 10 ml có nút xoáy. Tiệt khuẩn 15 phút â 121°c. 46. MÔI TRƯỜNG LẺN MEN CARBOHYDRATE

Meat extract 3,0 g Peptone 10,0 g Sodium chloride 5,0 g Chỉ thị Andrade 10,0 ml Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,1-7,2; phân ra các ông nghiệiri có ống Durham. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. Glucose, lactose, sucrose... đậm độ dùng cuối cùng là 1%. Đường cho vào môi trường cơ bản phải tiệt khuẩn trước, trừ disaccharide phải tiệt khuẩn bằng lọc hoặc ở 121°c trong 10 phút và cho vào môi trường .cơ bản đã tiệt khuẩn trước. 47. MÔI TRƯỜNG NITRATE DI ĐỘNG (M OTILITY NITRATE MẼDÍUM)

Beef extract Peptone Potassium nitrate Agar Nước cất

;

!

3,0 10,0. g ; . ' 30,0: g 4,0 1000,0 ml

g í g

354

I

Điều chỉnh pH tới 7,0; chia vào các ông nghiệm có nút xoáy mỗi ống 10 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 48. MÔI TRƯỜNG TEST DI ĐỘNG 3% MUỐI

Beef extract 3,0 g Peptone 10,0 g Sodium chloride 30,0 g Thạch 4,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,4; chia vào các ông nghiệm mỗi ống 8 mì. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 49. MÔ! TRƯỜNG TETRATHIONATE (MULLER-KAUFF1VIANN)

a. Beef extract 5,0 g Peptone 10,0 g Sodium chloride 3,0 g Calcium carbonate 45,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0. Tiệt khuẩn 20 phút ở 121°c. b. Sodium thiosulphate 50,0 g Nước cất vừađủ 1000,0 ml Tiệt khuấn 20 phút ở 121°c. c. Iodine 20,0 g Potassium iodide 25,0 g Nước cất vừa đủ 100,0 ml Bảo qụần ở chỗ tối. đ. Brilliant-green , 0,5 g Nước cất ' 100,0 ml Bảo quản ở chỗ tối. e. Ox bile 10,0 g Nước 100,0 ml

,

Tiệt khuẩn 20 phút ở 121°c Pha chế môi trường: Lấy 900 ml của a), 100ml của b), 20 ml của c), 2 ml của d) và 50 ml của e). Trộn đều, phân ra từng phầíi 100 ml, bảo quản 4°c ở chỗ tối. Dùng trong một tuần.

355

50. MÔI TRƯỜNG THIOGLYCOLLATE LỎNG (FLUID THIOGLYCOLLATE MEDIUM)

15,0 g Trypticase hoặc casitone 0,5 g L-cystine 5,0 g Glucose 5,0 g Yeast extract Sodium chloride 2,5 g Sodium thioglycollate 0,5 g Resazurin 0,001 g 0,75 g Agar Nước cất 1000,0 ml Đun tới sôi cho tan hoàn toàn, để nguội. Điều chỉnh pH tới 7,1 . Phân phối vào các ông có nút xoáy, mỗi ôrtg 10 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. Trước khi dùng ta làm nóng ống trong hơi nước nóng để đẩy hết oxy hoà tan và làm nguội nhanh bằng dòng nước vòi. 51. MÔI TRƯỜNG THỊT BĂM (COOKED MEAT MEDIUM)

a. Beef heart 454,0 g Peptone 2,0 g Glucose 2,0 g Sodium chloride 5,0 g b. Trypticase 10,0 g Sodium thioglycollate 1,0 g Soluble starch 1,0 g Glucose 2,0 g Neutral red (dung dịch 1%) 5,0 ml Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH 6,8 Cho 1 g của a), và 15 ml của b) vào các ống. Để các mẫu th ịt ngập hoàn toàn, rồi tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 52. MÔI TRƯỜNG BILE AESCULIN

Pancreatic digest of gelatin Beef extract Ox - gall (bile) Ferric citrate Aesculin 356

5.0 3.0 20,0 (40,0) 0,5 1.0

g g g g g

Agar 15,0 g Nước cất 1000 ml pH 6,8-7,1 ± 0,2 Tất cả các thành phần được hoà trong nước cất. Đun nhỏ lửa và khuây đều đế cho thạch tan, tiệt khuẩn ở121°c trong 15 phút.Khôn được quá lửa {overheat). Phân vào các ống có nút xoáy một lượng thích hợp và để nghiêng. Môi trường này có thể bảo quản ở 2-8°C trong 3-4 tuần 53. MÔI TRƯỜNG THẠCH MÁU cừu HAI LỚP (CAMP TÉT)

L ớp đáy (Thạch Columbia) Peptone 10,0 g Bitone 10,0 g Tryptic digest of beef heart 3,0 g Com strarch 1,0 g 5,0 g Sodium chloride 15,0 g Agar 1000,0 ml Nước cất 7,3 ± 0,2 pH Tất cả các thành phần đều hoà trong nước cất. Đun nhỏ lửa và khuấy luôn để cho thạch tan. Đun sôi, tiệt khuẩn ở 121°c trong 15 phút. Làm nguội tới 50°c và rót vào các đĩa petri có đườngkính 100 mm mộtlượng 10ml. Để môi trường đông lại. Lớp m ặt Pha thạch Columbia cơ bản như đã nói ở trên. Sau khi tiệt khuẩn, làm nguội tới 50°c và cho thêm máu cừu đă loại tơ huyết, cứ 100 ml môi trường thì cho thêm 5ml máu, xoay bình để máu được trộn đều. Phủ lên lớp đáy 5ml môi trường có máu cừu. Để nghiêng đĩa để lớp mặt được bằng phẳng. Đế' môi trường đông và khô trước khi dùng. Bảo quản ở 4°c tới 1 tuần lễ. Loại bỏ bất kỳ đĩa môi trường nào mất màu trước khi nuôi cấy. 54. MÔI TRƯỜNG VP (VOGES-PROKAUER)

Peptone 7,0 g Glucose 5,0 g Dipotassium hydrogen phosphate 5,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 6,9 và lọc. Tiệt khuẩn 20 phút ở 115°c.

357

55. NƯỚC ĐỆM PHOSPHATE (BUFFERED PHOSPHATE DILUTION WATER)

Potassium hydrogen phosphate 34,0 g Nước cất 500,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,2 với dung dịch sodium hydroxide IN cho đủ 1 lít và bảo quản (dung dịch dự trữ). Cho thêm 1,25 ml dung dịch dự trữ vào 1 lít nước. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 56. NƯỚC MUỐI 3%

Sodium chloride Nước cất Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c.

30,0 g 1000,0 ml

57. NƯỚC PEPTONE KIỂM (ALKALINE PEPTONE WATER)

Peptone 16,0 g Sodium chloride 10,0 g Nước cất 1000,0 ml pH 8,4±0,2 Hoà tan tất cả các thành phần trong nước cất. Điều chỉnh pH tới 8 với 1 M NaOH (khoảng 4 ml) phân ra các bình, tiệt khuẩn ở 121°c trong 15 phút. Môi trường có thể bảo quản tới 6 tháng. 58. NƯỚC PEPTONE ĐỆM

Peptone 10 g Sodium chloride 5,0 g Disodỉum hydrogen phosphate 9,0 g Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g Nước cat 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7; chia vặo các bình 500 ml, mỗi bình 225 ml và ống nghiệm mỗi ông 9ml. Tiệt khuẩn 20 phút ở 121°c. 59. NƯỚC PEPTONE KIỀM

Peptone 10,0 g Sodium chloride 10 0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH từ 8,4-8,6; chia vào các ống nghiệm mỗi ống 7 ml. Tiệt khuẩn 10 phút ở 121°c.

358

60. NƯỚC PEPTONE KIỀM

Peptone 10,0 g Sodium chloride 10 0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH 8,4-8,6; phân vào các ống nghiệm 7 ml. Tiệt khuẩn trong 10 phút ở 121°c. 61. NƯỚC PEPTONE PHA LOÃNG (PEPTONE WATER DÍLUENT)

Peptone Nước cất T iệt khuẩn 15 phút ở 121°c.

1,0 g 1000,0 ml

62. SỮA LITMUS (LITMUS MILK)

Skim milk powder 100,0 g Litmus 5,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 6,8; phân vào ông nghiệm 10 ml. Tiệt phút ở 121 °c. 63. THẠCH BAIRD-PARKER

Môi trường cơ bản 10,0 g Tryptone Beef extract 5,0 g 1,0 g Yeast extract 5,0 g Lithium chloride 20,0 g Agar 0,055 g Sodium sulfamethazine 1000,0 ml Nước cât Vừa đun vừa khuấy cho tan hết. Điều chỉnh pH tới 6,8. Phân vào các bình, mỗi bình 90 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. Chuẩn bị môi trường hoàn thiện Đun chảy và giữ d nhiệt độ (45-50°C) 90ml môi trường cơ bản, cho thêm vào môí trường đó các đung dịch sau đây đã hầm rióng (45’50°C) tiệt khuẩn bằng cách lọc: Dung dịch glycine 20% 6,3ml Dung dịch potassium tellurite 1% 1,0ml Dung dịch sodium pyruvate 20% 5,0ml Oxoid egg-yolk emulsion (Lòng đỏ trứng thể sữa) 5,0ml Trộn đều và đổ ra đĩa Petri, mỗi đĩa 15 ml. 359

64. THẠCH CHỌN LỌC PSEUDOMONAS

16,0 g 10,0 g 10,0 g 1,4 g 11,0 g 1000,0 ml 7,1+0,2 Cho tấ t cả các thành phần trên vào nước cất. Đun nhỏ lửa và khuấy luôn dể cho thạch tan. Đun sôí. Tiệt khuẩn ở 121°c trong 10 phút. Làm nguội tới 50°c. Cho thêm kháng sinh và trộn đều. Rót ra đĩa. Để khô trước khi đùng. Chất cho thêm Cetrimiđe, fucidin, cephaloriđine. Mỗi 1 g kháng sinh pha trong 100 ml nước cất. Tiệt khuẩn bằng màng lọc 0,45 vào bình vô khuẩn. Cho vào một lít môi trường đã chuẩn bị trên: 1 ml dung dịch cetrimide, 1 ml dung dịch fucidin, 5 ml dung dịch cephaloridine. 65. THẠCH CZAPEK

Sodium nitrate 3.0 g Potassium hydrọphosphate 1.0 g Potassium chloride 0,5 g Magnesium sulphate 0,5 g Ferric sulphate 0,01 g Sucrose 300,0 g Agar 15 g Nước 1000,0 ml Ngâm bột trong một giờ, đem đun sôi 5 phút, lọc, cho thạch vào, đun chảy thạch, phân ra ống và hấp 120°c trong 15 phút. 66. THẠCH XLD (XYLOSE LYSINE DESOXYCHOLATE AGAR)

Xylose L-lysine HC1 Lactose Sucrose Sodium chloride Yeast extract 360

375 5.0 7.5 7.5 5.0 3.0

g g g g g g

Phenol red 0,08 g Agar 15,0 g Nước 1000,0 ml Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c, đế nguội tới 50°c, cho thêm 20 ml dung dịch thiosulphate citrate (34,Og sodium thiosulphate + 4,0 g ferric ammonium citrate + 100 ml nước, tiệt khuẩn bằng lọc) và 25 ml đung dịch nước sodium desoxycholate 10% (tiệt khuẩn bằng lọc). Điều chỉnh pH tới 6,9 rót ra đĩa. 67. THẠCH PDA (POTATO DEXTROSE AGAR)

Khoai tây 200,0 g Dextrose 20,0 g Agar 15,0 g Nước 1000,0 ml Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. Trước khi đùng đun chảy môi trường bằng cách thuỷ trong nước sôi, để nguội tởi 50°c, điều chỉnh pH tới 3,5 với tartaric acid 10% vô khuẩn. Lắc đều và rót ra ông hoặc đĩa. 68. THẠCH DINH DƯỠNG (NUTRIENT AGAR)

Beef extract 3,0 g Peptone 5,0 g Agar 15,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0. Tiệt khuẩn 20 phút ở 121°c. 69. THẠCH DINH DƯỠNG MEM (SEMI-SOLID

n u t r ie n t

AGAR)

Meat extract 3,0 g Peptone 5,0 g Agar 8,0 g Nước cat 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0. Tiệt khuẩn 20 phút ở 121°c. 70. THẠCH TSA (TRYPTICASE SOY AGAR, 3% SALT)

Trypticase peptone 15,0 g Phytone peptone 5,0 g Sodium chloride 30,0 g Agar 15,0 g Nước cất . 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,3; phân ra các ống nghiệm. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121 c . 361

71. THẠCH ĐĨA ĐẾM VI SINH VẬT PCA (PLATE COUNT AGAR)

Yeast extract 2,5 g Pancreactic digest of casein 5,0 g Glucose 1,0 g Agar 15-18,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0; phân ra các ông nghiệm mỗi cíng 15ml. Tiệt khuẩn 20 phút ở 121°c. Trước khi dùng đun môi trường cho lỏng ra ở trong nước sôi và giữ các ông ớ chậu nước nóng 45-48°C. 72. THẠCH ENDO

Peptone 10,0 g Lactose 10,0 g Dipotassium hydrogen phosphate 3,5 g Agar 15,0 g Sodium sulphite 2,5 g Basic fuchsin 0,5 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,4; tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c rót ra đĩa Petri, mỗi đĩa 15 ml. 73. THẠCH THALLOUS ACETATE TETRAZOLIUM GLUCOSE

Peptone 10,0 g Yeast extract 10,0 g Agar 4,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 6,0; phân ra từng phần 95ml. Tiệt khuẩn 20 phút ở 121°c. Ngay trước khi dùng cho vào 95 ml môi trường đã đun lỏng, để ở nhiệt độ 45-50°C, 1 ml dung dịch nước 2, 3, 5 triphenyl tetrazolium chloride 1% (lọc qua Seitz), 5 ml dung dịch glucose 20% (lọc qua Seitz) và 2 ml dung dịch thallous ,acetate 5%. Lắc đều rót ra đĩa Petri. 74. THẠCH 5TRARCH AMPICILLIN

Môi trường cơ bản Phenol red agar base Nước cất Soluble Starch (BDH) Nước cất ' pH 362

31 0 g 900,0 ml 10 0 g 100,0 ml

Tinh bột pha trong 100ml nước cất, pha xong đế riêng Pha trộn phenol red agar base trong 900ml nước cất đun nhỏ lửa và khuấy liẽn tục cho thạch tan. Cho dung dịch tinh bột hoà tan và đun lại cho đến khi sôi. Tiệt khuẩn 121°c trong 15 phút. Làm nguội tới 50°c. Thêm l,0ml dung dịch ạmpicillin vào môi trường cơ bản, trộn đều. Rót ra đĩa và hong khô trước khi dùng. Chú ý: Nếu dùng tinh bột tan BDH, thì có thể nhìn rõ vùng tinh bột bị thuỷ phân. Không có thì phải sử dụng dung dịch iodine. Dung dịch Ampiciỉlin Ampicillin sodium saltl00,0 ml Nước cấtio ml Hoà tan ampicillin trong nước cất. Lọc bằng màng lọc 0,45 jam. Dung dịch này bảo quản 4°c được 4 tuần. Môi trường hoàn chỉnh có thể bảo quản ở4°c tới 4 ngày Thạch Starch ampicillin được chỉ định để phân lập định lượng Aeromonas ở trong thực phẩm và các mẫu môi trường (nước...) tác nhân chọn lọc (selective agent) là kháng sinh ampicillin. Aaeromonads di động kháng artipỉcillin, trong khi các sinh vật cạnh tran h khác đều bị chặn lại.

Aeromonas sinh amylase, thuỷ phân tinh bột nên có thể thây (cloudry ring), quanh khuẩn lạc vẩn mây! 75. THẠCH KG

1,0 g Peptone 0,5 g Yeast extract 0,025 g Phenol red 18,0 g Agar 900,0 ml Nước cat Điều chỉnh pH tới 6,8. Tiệt khuẩn 20; .phụt ở Ị21°c làm nguội tới 50°c. Cho them 100 ml hỗn dịch lòng đỏ trứng gà vô khuẩn đậm đặc (oxoid) và poiymixin B sulphate để có đậm độ cuối cùng là 10 mg/ml. Lắc đều và rót ra đĩa petri. 76. THẠCH L-EMB (LEVINE’S ẸỌSIN METHYLEN BLUE AGAR)

a. Peptone Lactose Dipotàssium hydrogen phosphate Agar Nước cất

10,0 g 10,0 g 2,0 g 15,0 g 1000,Ọ ml 363

b. Eosin Y 0,4 g Methylen blue 0,065 g Pha dung dịch a, diều chỉnh pH tới 7,1-7,2. Chia ra từng bình 100 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. Đun chảy trước khi dùng, và cứ 100 ml cho thêm 2 ml đung dịch eosin Y 2% và 4,3 ml dung dịch methylen blue 0,15%. 77. THẠCH KF (KF STREPTOCOCCUS AGAR)

10,0 g Proteose peptone No3 hoặc polypeptone 10,0 g Yesst extract 5,0 g Sodium chloride Sodium glycerophosphate 10,0 g Maltose 20,0 g Lactose 1,0 g Sodium azide 0,4 g Bromocresol purple 0,015 g Agar 20,0 g Nước cất 1000,0 ml Hoà 7,6g môi trường khô với 100 ml nước cất vô khuẩn trong một bình vô khuẩn, đun trong chậu nước sôi để làm tan thạch. Sau khi dung dịch đã hoàn thành thì đun thêm 5 phút. Để nguội tới 50-60°C và cho thêm 1 ml dung dịch vô khuẩn 1% của 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride mỗi 100ml, điều chỉnh pH tới 7,2 với dung dịch sodium carbonate nếu cần. Môi trường có thể để ở 45-60°C tới 4 giờ trước khi rót ra đĩa. 78. THẠCH BRỈLLIANT-GREEN PHENOL RED

a. Meat extract 4,0 g Peptone ' 10,0 g Sodium chloride 3,0 g Di sodium hydrogen phosphate 0,8 g Sodium dihydrogen phosphate 06 g Agar 12,0 g Nước cất 900,0 ml Điều chỉnh pH tới 7 phân ra các bình 500 mm, tiệ t khuẩn 15 phút ở 121°c. b. Lactose 10 0 g Sucrose 10 0 g Phenol red 0 09 g Nước cất 1000,0 ml 364

Đun nóng ở trong chậu nước 70°c trong 20 phút, để nguội tới 55 c và dùng ngay. c. Brilliant-green 0,5 g Nước cất 100,0 ml Để ít nhất 1 ngày ở chỗ tôi hoàn toàn (dark). Môi trường hoàn chỉnh Lấy 900 ml của a, 100 ml của b và ]L ml của c rót ra đĩa Petri, môi đĩa 15 ml. Trước khi dùng làm khô đỉa thạch cẩn thận ờ 50°c trong 30 phút. 79. THẠCH M ENTEROCOCCUS AGAR

Tryptose 20,0 g Yeast extract 5,0 g Glucose 2,0 g Dipotassium hydrogen phosphate 4,0 g Agar 10,0 g 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride 0,1 g 1000,0 ml Nước cất Sau khi ngậm trong nước cất, tiệt khuẩn bằng cách đun tới sôi, pH phải là 7,2, sau khí đun. Rót ra đĩa có thể để được 30 ngày ở chỗ tối và nhiệt độ bảo quản 2-10°C. 80. THẠCH MACCONKEY

20,0 g Peptone 10,0 g Lactose 1,5 g Bile salts 5,0 g Sodium chloride 15,0 g Agar 0,03 g Neutral red 0,001 g Crystal violet 1000,0 ml Nước cất Điều chỉnh pH tới 7,1' Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. Rót ra đĩa Petri. 81. THẠCH MALT (VỚI KHÁNG SINH)

a. Malt extract Agar Nước cẩt

30,0 g 15,0 g 1000,0 ml

365

b. Dung dich kháng sinh Cho thêm 500 mg mỗi thứ chlorotetracyline HC1 và chloramphenicol vào trong 100ml nước cất đệm phosphate và lắc mạnh. Cứ 100 ml thạch malt hoặc thạch mycophil đã giảm nhiệt độ, cho thêm 2 ml dung dịch trên, độ đậm cuôi cùng của môi trường là 100mg/ml mỗi thứ kháng sinh. 82. TH Ạ C H MÁU PARKER (P A R K E R ’S C R Y STA L-VIO LE T AZIDE BLOOD AGAR)

Tryptose 15,0 g Beef extract 3,0 g \ Sodium chloride 5,0 g Agar 30,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,2; phân ra các bình, mỗi bình 100 ml. Tiêt khuẩn 15 phút ổf 121°c. Để nguội tới 50°c và cho thêm vào mỗi 100 ml 5 ml máu cừu đã phá tơ huyết; 0,4 ml dung dịch 0,05% tím tinh thê vô khuấn (hấp ướt) và 1 ml dung dịch sodium azide vô khuẩn (lọc qua Seitz). Lắc đều và rót ra đĩa. 83. THẠCH VIOLET RED BILE AGAR

Yeast extract 3,0 g Peptone 7,0 g Sodium chloride 5,0 g Bile salts 1,5 g Lactose 10,0 g Neutral red 0,03 g Crystal violet 0,002 g Agar 15,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH từ 7,0-7,4. Vừa đun vừa khuấy và cho sôi trong 2 phút, không tiệt khuẩn. 84. THẠCH NẤM Mốc (MYCOLOGICAL (MYCOPHIL) AGAR)

Phytone Dextrose Thạch Nước cất 36;6 í ■

10,0 g 10 0 g 18,0 g 1000,0 ml

Tiệt khuẩn 15 phút ở 118°c, để nguội tới 45°c, điều chỉnh pH tới 4,9 bằng acid trước khi rót ra đĩa hoặc ống nghiệm. Nếu cho thêm kháng sinh thì không cần phải điều chỉnh pH. 85. THẠCH ÓC TIM HÃM

Thành phần óc tim thạch giống như canh thang, chỉ khác thêm 15 g thạch pH phải 7,4 sau khi tiệt khuẩn để các ống nghiêng. 86. THẠCH TSí (TRIPLE SUGAR IRON AGAR)

Meat extract 3,0 g Yeast extract 3,0 g Peptone 20,0 g Sodium chloride 5,0 g Lactose 10,0 g Sucrose 10,0 g Glucose 1,0 g Ferric citrate 0,3 g Sodium thiosulphate 0,3 g Phenol red 0,024 g Agar 12,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,4; phân ra các ông nghiệm, mỗi ống "10 ml. Tiệt khuẩn 10 phút ở 121°c, để nghiêng phần thạch ở đáy ông cao 2,5cm. 87. THẠCH TCBS (THIOSULPHATE CITRATE BILE SALTS SUCROSE AGAR)

5,0 g Yeast extract 10,0 g Peptone 20,0 g Sucrose 10,0 g Sodium thiosulphate 10,0 g Sodium citrate 3,0 g Sodium cholate 5,0 g Ox - gall 10,0 g Sodium chloride (NaCl) 1,0 g Ferric citrate 0,04 g Bromothymol blue 0,04 g Thymol blue 15,0 g Agar 1000,0 ml Nước cất Điều chỉnh pH tới 8,6; đun sôi 1-2 phút. Rót ra đĩa Petri. T 25-V S V T P.

367

88. THẠCH SPS (SULPHITE POLYMYXIN SULPHADIAZIN AGAR)

15,0 g Peptone 10,0 e Yeast extract 0,5 g Ferric citrate 15,0 g Agar 1000,0 ml Nước cất Điều chỉnh pH tới 7,0. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c rồi cho thêm dung dịch lọc qua Seitz: 5 ml dung dịch sodium sulphite 10% mới pha chế, 10 ml dung dịch polymycin B sulphate 0,1% và 10 ml dung dịch sodium sulphadiazine 1,2%. Trộn thật đều và rót ra đĩa Petri. 89. THẠCH BỈSMUTH SULPHITE (WILSON AND BLAIR)

5,0 g 10,0 g 5,0 g 4,0 g 0,3 g 8,0 g 0,025 g 20,0 g 1000,0 ml Hoà tan trong nước đun sôi bằng cách quấy, để nguội tới 40-45°C, pH các chất cuối cùng phải 7,7 rót ra đĩa Petri mỗi đĩa 15ml. Để ở tủ lạnh, không được dùng trước 24 giờ và sau 5 ngày. Thạch sulphite bismuth (Wilson Blair) (làm theo công thức của Butiaus) D ung dịch I (đựng trong lọ vô khuẩn, nút cao su): Hoà tan 3 g bismuth và ammonium citrate trong 25 ml nước cất đang sôi. Hoà tan 10 g sodium sulphite không ngậm nước vào 50 ml nước cất đang sôi Trộn hai dung dịch trên và cho thêm thật nhanh 10 g sodium hydrophosphate (Na2HPƠ4. I/2 H 2O). Để nguội và cho thêm dung dịch sau: 5 g Glucose hoà tan trong 25 ml nước cất đang sôi. D ung d ịch I I (đụng trong lọ Dồ khuẩn, nút cao su): Trộn hai đung dịch sau đây Beef extract Peptone Glucose Disodium hydrogen phosphate Ferrous sulphate Bismuth sulphite Brilliant-green Agar Nước cất

Dung dịch 1% ferrous và ammonium citrate trong 200 ml nước cất Dung dịch 1% brilliant green trong 25 ml nước cất 368

Cách pha môi trường sulphite bismuth Wilson Blair: Đun chảy 50ml thạch, đế nguội tới nhiệt độ 70°c và thêm vào dó 10 ml dung dịch I và 2,25 ml dung dịch II. Lắc và rót vào hộp Petri. Mòi trường Wilson Blair hơi khó làm, nên cần theo đúng những hướng dẫn kể trên, nếu không sẽ ảnh hưởng đến khả năng lựa chọn của vi khuẩn. 90. THẠCH TINH BỘT (STARCH AGAR)

Meat extract 3,0 g Peptone 5,0 g Tinh bộthoà tan Starch (souble) 2,0 g Agar 15,0 g Nước cất 1000,0 ml Cho tấ t cả các thành phần kể trên trừ tinh bột đun sôi, tiếp đócho từ từ tinh bột, đun sôi trong 3-4 phút. Để nguội tới 50°c, điều chỉnh pH tới 7,0. Tiệt khuẩn 15 phút ở 121°c. 91. THẠCH TRYPTOSE

Giông như canh thang tryptose (mt 26) nhưng thêm 15,0 g thạch cho một lít, pH 6,9-7,0 92. THẠCH TRYPTOSE TTC (TRYPTOSE TRIPHENYLTETRAZOUUM CHLORIDE)

Giống như canh thang tryptose, nhưng thêm tetrazolium chloride và 15,0 g thạch, pH 6,9-7,0.

0,1

g triphenyl

93. THẠCH URÊ (UREA)

1,0 g Peptone 1,0 g Glucose 5,0 g Sodium chloride 2,0 g Potassium hydrogen phosphat 0,012 g Phenol red 15,0 g Agar 1000,0 ml Nước cất Tiệt khuẩn trong 2 phút ở 121°c 400,0 g Urea 1000,0 ml Nước cất vừa đủ Tiệt khuẩn bằng lọc. Cho 50 ml b) vào 950 ml a) ở điều kiện vô khuẩn, điều chỉnh pH tới 6,8, phần ra các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml và để nghiêng.

369

94. THẠCH AEROMONAS HYDROPHILA

5,0 g Proteose peptone 3,0 g Yeast extract 10,0 g Tryptone 5,0 g L-ornithine hydrochloride 1,0 g Mannitol 10,0 g Inositol 0,4 g Sodium thiosulphat 0,5 g Ferric ammonium citrat 0,02 g Bromocresol purple 3,0 g Agar 1000,0 ml Nước cất pH 6,7±0,2 Hoà trộn các thành phần trên trong nước cất. Điều chỉnh pH tới 6,7. Đun nhỏ lửa và khuấy luôn để cho thạch tan. Đun sôi. Phân vào các ống nghiệm 13xl00mm mỗi ông 5ml. Tiệt khuẩn ở 121°c trong 12 phút. Bảo quản ở 4°c có thể dùng tới 8 tháng. 95. THẠCH MRSS (MAN, ROGOSA, SHARPE AGAR WITH SORBIC ACID)

Môi trường cơ bản Peptone 10,0 g Beef extract 8,0 g Yeast extract 5,0 g D.glucose 20,0 g Sorbitan mono-oleate (Tween 80) 1,0 g Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO 4 ) 2,0 g Magnesium sulphate 0,2 g Manganese sulphate 0,05 g Ammonium citrate 2,0 g Sodium acetate 5.0 g Agar 15,0 g Nước cất 1000 ml pH 5,7+0,2 Ở 30°c Hoà tan tấ t cả các thành phần trên trong nước cất. Đun nhỏ lửa và khuấy đều, Đun sôi. Tiệt khuẩn ở 121°c trong 15 phút. Làm nguội tới 50°c. Cho íhêm 10ml dung dịch sorbic acid và điều chỉnh pH 5 7 với HCỈ 10%. Trộn đều và rót ra đĩa. 370

Chất cho thêm: Hoà tan 1,4 g sorbic acid trong 10 ml ln NaOH. Cho thêm 10 ml dung dịch sorbic acid vào môi trường cơ bản đã tiệt khuẩn và rót ra đĩa. 96. THẠCH MYP (MANNITOL EGG-YOLK POLYMIXIN)

1,0 g 10,0 g 10,0 g 10,0 g 0,025 g 15,0 g 1000,0 ml 7,2±0,2 Cho các thành phần trên vào nước cất. Đun nhỏ lửa và khuấy liên tục cho đến khi thạch tan. Đun sôi. Điều chỉnh pH tới 7,2 bằng cách sử dụng NaOH 0,1M. Tiệt khuẩn 121°c trong 15 phút. Cho 100 ml lòng đỏ trứng 50% thể sữa và 10 ml dung dịch polymyxin B tiệt khuẩn bằng lọc. Lắc đều. Rót ra hộp lồng và để kho trước khi sử dụng. Môi trường hoàn chỉnh cần phải bảo quản ở 2-8°C tới 2 ngày. D ung dịch P olym ixin vô khuẩn Polymixin B sulphate 0,1 g Nước cất 100,0 ml Hoà tan polymyxin B sulphate trong nước cất. Lọc qua màng lọc 0,45 mm vào bình vô khuẩn. Bảo quản ở 4°c tới 4 tuần. 97. THẠCH VRBD (VIOLET RED BILE DEXTROSE AGAR)

Peptone Yeast extract Bile-salts Dextrose (glucose) Sodium chloride Neutrạl, red Crystal violet Agar Nước cất pH

7.0 g 3.0 g 1,5 g 10,0 g 0,5 g 0,03 g 0,002 g 15,0 g 1000,0 ml 7,4±0,l(sau khi đun sôi) ở 45°c 371

Hoà tan các thành phần trên trong nước cất. Đun nhỏ lửa và khuây liên tục để cho thạch tan. Đun sôi. Không được tiệt khuẩn bằng hấp ướt. Sau khi đun sôi, giữ ở 45°c để rót ra đĩa. Môi trường pha xong dùng trong cùng ngày đó. 98. THẠCH TCBS (THIOSULPHATE CITRATE BILE SALTS SUCROSE)

10,0 g Peptone 5.0 g Yeast extract Sucrose 20,0 g Sodium thiosulphate, pentahydrate 10,0 g 10,0 g Tri sodium citrate dihydrate Sodium cholate 3.0 g 5.0 g Ox-gall 10,0 g Sodium chloride (NaCl) Ferric citrate 1.0 g Bromothymol blue 0,04 g Thymol blue 0,04 g Agar 15,0 g Nước cất 1000,0 ml pH 8,6+0,2 Hoà tấ t cả các thành phần trên trong nước câ't. Đun nhỏ lửa và khuây liên tục để cho tan thạch. Nguội tới 50°c và rót ra đĩa Petri. Không tiệt khuẩn bằng hấp ướt. Đĩa môi trường dể ở 4°c dùng trong 24 h (ISO 1990). 99. THẠCH VIASRIOSTATIC TEST

M ôi trường cơ bản Tryptic soy agar bas 40,0 g Nước cất 1000,0 ml pH 7,3±0,2 Hoà tan tryptic soy agar trong nước cất. Đun nhỏ lửa và khuấy liên tục để cho thạch tan. Đun sôi. Tiệt khuẩn 121°c trong 15 phút. Làm nguội tới 50°c. Cho thêm 10ml dung dịch 0/129 vào 1000 ml mồi trường cơ bản. Lắc đêu. Rót ra hộp lồng và dể khô trước khi dùng. Đĩa môi trường bảo quản ở 4°c có thể được 7 ngày. Chất cho thêm: 0/129 (2.4 diamino-6.7-di sop ropy lteri dine) 0/129 150,0 g Ethanol 10,0 g 372

Hoà tan 0/129 trong 10,0 ml ethanol 95% (W/V). Tiệt khuẩn qua lọc 0,45 mm vào lọ vô khuẩn. Dung dịch có thể bảo quản ở 4°c tối đa 7 ngày. 100. MÔI TRƯỞNG LÊN MEN CARBOHYDRATE (CARBOHYDRATE FERMENTATION BROTH)

Môi trường cơ bản Trypticase peptone BBL hoặc Bacto-peptone (Difco) 10,0 g Lablemco powder 1,0. g Sodium chloride 5,0 g Phenol red (360 mg trong 20 ml 0,1N NaOH) 1,0 ml Nước cất 900,0 ml pH 7,4 Hoà tất cả các thành phần trong nước cất. Điều chỉnh pH tới 7,4. Tiệt kbuấn 121°c trong 15 phút. Để nguội 45-50°C và cho thêm 100 ml dung dịch carbohydrate thích hợp đã được diệt khuẩn bằng lọc. Phân vào mỗi ông có nút xoáy 13x100 mm. C hất cho ịhêm Xylose 5 g trong 100 ml nước cất Mannitol 10 g trong 100ml nước cất Khamnose 5 g trong 100 ml nước cất Lọc từng dung dịch vào từng bình vô khuấn. 101. MUỐI POLYMIXIN (SALT POLYMIXIN)

Môi trường cơ bản Yeast extract 3,0 g Peptone 10.0 g Sodium chloride 20,0 g Nước cất 900,0 ml pH 7,4+0,2 Cho các chất trên vào 900 ml nước cất. Điều chỉnh pH tới 7,4 nếu cần. Tiệt khuẩn 12l°c trong 15 phút. Để nguội ở nhiệt độ phòng và cho thêm 100 ml dung dịch polymixin B : sulphate Môi trường cđ bản (không có kháng sinh) có thể bảo quản ở 2-8°C tới 6 tháng; Dung dịch polymixin. B có thề' bảo quản ở 4°c tới 4 tuần; và môi trường hoàn chỉnh có thể bảo quản ở 0-5°C trong 24 h.

373

C hất cho thêm Dung dịch polymixin B Hoà tan 2,5 mg polymixin B sulphate trong 100 ml nước cất. Lọc tiệt khuẩn qua màng 0,45f^m vào bình vô khuẩn. Bảo quản ở 4°c trong 4 tuầri. 102. THUỐC NHUỘM GRAM

a. Dung dịch methyl violet 1% Dung dịch sodium bicarbonate 3% b. Iodine Potassium iodide Sodium bicarbonate 5% Nước cất c. Thuốc nhuộm đôi lập Saframn (dung dịch bão hoà trong cồn) Nước cất Hoặc basic fuchsin Nước cất

30.0 ml 8,0 ml 1,0 g 2,0 g 60.0 ml 240.0 ml 10.0 ml 90.0 ml 0,05 g 100.0 ml

103. THUỐC NHUỘM NHA BÀO

a. Dung dịch A Malachite green Nước cất Lọc để bỏ phần thuốc nhuộm không tai hết. b. Dung dịch B Safranin o Nước cất

10,0 g 100.0 ml

0,25 g 100.0 ml

104. THUỐC THỬ P-GALACTOSIDASE

a. Sodium dihydrogen phosphate 6,9 g Dung dịch sodium hydroxytđe 0,1N(4g/l) 3,0 ml Nước cất vừa đủ 50,0 ml Hoà tan sodium dihydrogen phosphate trong 45ml nước. Điều chỉnh pH tới 7,0±0,1 bằng cách cho thêm dưng dịch sodium hydroxide vừa đủ. Thêm nước cho đủ 50 ml. Bảo quản ở tủ lạnh. b. O-nitrophenyl P-D-gaỉactopyranosiđe 80,0 g Nước cất 15,0 ml Hoà tan ở 50°c, để nguội,cho thêm 5ml và bảo quản ở 4°c nhưng không được quá một tháng. 374

105. THUỐC THỬ CYTOCHROME OXIDASE

N,n,N\N’ - tetramethyl-p-phenylen-diamine 5,0 g Nước cất 1000,0 ml Bảo quản trong bình thuỷ tinh màu sẫm ở 5-10°C. Thời gian bảo quản là 15 ngày 106. THUỐC THỬ INDOLE

p-Dimethylaminobenzaldehyde Hydrochloric acid concentrated Tertamýl alcohol

'

5,0 g 25,0 g 75,0 ml

107. THUỐC THỬ KOVAC (INDOLE)

p-Diemthylamino benzaldehyde Hydrochloric acid concentrated Tertamyl alcohol

5,0g 25,0g 75,0ml

108. THUỐC THỬ OXIDASE

Para-amino dimethylphenylene-điamine 1,0 g monohydrochloride Nước cất 100,0 ml Hoà cho tan. Thuốc này luôn luôn pha xong thì dùng ngay 109. THUỐC THỬ VOGES-PROSKAUER (V-P)

a. Dung dịch A Alpha naphthol Absolute ethanol b. Dung dich B Potassium hydroxyde Nước cất

5,0 g 100,0 ml

,

40,0 g 100,0 ml

375

12. KIỂM TRA VIRUS TRONG

Nước

VÀ THựC PHÂM

Không có phương pháp tiêu chuẩn thường quy (routine Standard) đế phát hiện virus trong thực phẩm và nước. Kỹ thuật phát hiện dựa trên nguyên tắc chiết xuất từ thực phẩm nghi bị ồ nhiễm đă nghiền xay nhỏ và chiết bằng dung dịch phù hợp sau đó kết tủa bằng Polyethylen glycoỉ (PEG) hoặc nhôm clơrid (AỈCI3), sắt oxyd hoặc sắt (III) cloriđ (FeCls) hoặc sử dụng dịch chiết thịt bò hoặc casein (1). Dịch chiết này được sử dụng để cấy tế bào hoặc kỹ thuật sinh học phân tử.Phương pháp miền dịch khòng nhậy trong phát hiện virus trong thực phẩm và nước, nhưng dược dùng để phát hiện huyết thanh kháng thế và kháng nguyên virustrong dịch sinh học và được mô tả ở hình 12.1. * Kỹ thuật phát hiện virus trong nước phải qua khâu làm giàu tích luỹ từ 10 đến 100ml hoặc 1 lít nước bằng thiết bị lọc hấp phụ, sắt oxyd, polyme điện ly (polyelectrolytes) cổ kềm theo kỷ thuật rửa giải. * Hoặc sử dụng kỹ thuật siêu lọc HFU (Hollow fibre ultrafiltration) để giữ virus tuỳ theo kích thước và trọng lượng phân tử .' 1 Triển khai kỹ thuật trên, đầu tiên cô lại còn 1 lít, sau đó kết tủa và hoà tan trong 20-50ml bằng thao tác kết tủa với PEG, AICI3 hoặc FeCl3 siêu ly tâm hoặc sử đụng kỹ thuật tủa lên bông bằng dịch chiết thịt bò hoặc casein hoặc sử dụng sắt oxyd. Dung dịch đậm đặc cuối cùng được sử dạng để nuôi cấy virus trên tế bào hoặc kỹ thuật sinh học phân tử phán ứng dây chuyền Polyme hoá (PCR). Cần chú ý là đung dịch đậm đặc cuôì cùng phải đạt các yêu cầu sau : Không gây ngộ độc cho kỹ thuật tế bào Không tác động can thiệp trong hoạt động của virus với tê bào Không ngăn cản sự phát triển cua virus Không can thiệp tác động tách acid nucleic trong kỹ thuật PCR Trong quá trình tập trung virus có thể cồ đặc tập trung tấ t cả các hợp chất hữu cơ, kim loại nặng, acid humic, fulvic, và các chất này sè gây dộc cho tê băo và kìm hãm phản ứng PCR. Đế' kiểm tra phát hiện virus trong nước, có thể sử dụng kỹ thuật chiết rửa (elution) với bộ lọc hấp phụ. Kỹ thuật sử dụng thiết bị siêu lọc HFU rất nhậy và yêu cầu dịch chiết mẫu phải có độ đục tối tiểu. Ngoài ra việc sử dụng PEG để tập trung virus có ưu điểm là loại khỏi dịch chiết một số tác nhân ức chế quá trình nuôi cấy tế bào với phản ứng PCR.

376

Trong những nàm gần đây tại Sydney (úc) đă sử dụng kỷ thuật HFU, PEG đê phát hiện virus gây bệnh và nhận thấy trong nước thải có tới 60-70% virus và nước sinh hoạt có 15% virus. Ngoài ra tại bể nước dự trữ dùng để uông cũng đã phát hiện thấy virus đường ruột theo kỹ thuật được trình bày tại hình 12.2. 1. PHÁT HIỆN RNA VIRUS BẰNG KỸ THUẬT PCR

RNA một acid nucleic có trong nhận và bào tương tê bào liên quan đến tổng hợp protein. Trong một sô" virus RNA là chất liệu di truyền. Trừ virus Adeno, các nhà vi sinh học đều thiên về nhận định là các virus đường ruột đều có bộ gen RNA và việc sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích phát hiện sẽ cho phép xác định được RNA của virus và cần sử dụng kỹ thuật phiên mã ngược (Reverse Transcriptase - RT) để sản xuất DNA và tiếp theo sẽ sử dụng kỹ thuật PCR. Quá trình thực hiện kỹ thuật RT-PCR không đắt nhưng có độ nhạy cao để phát hiện virus trong thực phẩm và nước, thường bể sung cho kỹ thuật cấy trên tế bào. Kết quả là chỉ trong 1 giờ có thể phát hiện được virus so sánh với thời gian là 1 tuần khi xác dinh virus Norwalk, Hepatitis A, Astro, Rota, Adeno và các virus đường ruột khác Giới hạn của kỹ thuật PCR trong phát hiện virus ô nhiễm trong thực phẩm và nược là khi eó mặt acid humìc, lipopolysaccharìt và ion kim loại. Các chất này thường phổ biến trong môi trường nước, thực phẩm, nhất là hải sản trong quá trình chiết tách và tập trung virus. Acid humic sẽ liên kết khá bền với protein và ức chế các men trong chức phận phản ứng PCR, và ion kim loại nặng sẽ tác động ảnh hưởng đến hoạt tính của men và làm sai lệch kết quả của phản ứng PCR. Có thể dùng Chelex 100 hoặc gel ưa nước như Sephadex G-200 để loại acid humic và ion kim loại trong kỹ thuật phảt hiện virus bằng phương pháp PCR và cả bằng kỹ thuật RT-PCR. Kiểm tra kết quả của kỹ thuật PCR khi phát hiện virus, với kết quả dương tính chi được chấp nhận, nếu có tiến hành thử nghiệm đối chứng song song có kết quả âm tính, và đôi khi phải lặp lại quá trình kiểm tra, nếu thự ngỊiiệm đối chứng vẫn có kết quả âm tính, chứng tỏ trọng kiểm tra mẫu không bị ô nhiễm chéo. Cũng cần chú ý kỹ thuật PCR có khả năng phát hiện virus còn sống cũng như đã chết, nhưng không nhất thiết để phát hiện các virus mới. Chỉ có cấy trên tế bào mới cho phép phát hiện cả virus còn sông và virus mới, kỹ thuật cụ thể được trình bày ở hình 12.3. ' ,ĩ ' 2. KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG VIRUS RT-PCR

Trận thực tế không có khả năng đếm virus bằng kỹ thuật PCR. Để tàng độ nhạy của phương pháp với phần lớn các virus dường ruột có bộ 377

gen RNA cần sử dụng dung địch đệm phenol có pH thấp đê chiết acid nucleic, sẽ tách được RNA ra khỏi protein và DNA ra khỏi pha hừu cơ (organic phase). Với sự tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử trong kiểm tra virus gây các vụ ngộ độc do thực phẩm và nước, nhằm bảo vệ sức khoẻ cộng đồng và công nghiệp thực phẩm, tránh sự lây ô nhiễm virus, hiện các nhà khoa học đang tiếp tục khảo sát bổ sung một sô nội dung sau : - Xác định chỉ điểm virus để phát hiện sự có mặt của virus đường ruột trong thực phẩm và nước. Tăng hiệu quả của kỹ thuật tập trung cô đặc virus trong các mẫu thực phẩm khác nhau. Loại bỏ các tác nhần ức chế phân tử và thử nghiệm cấy tế bào trong thực phẩm và nước. Phương pháp định lượng bằng kỹ thuật PCR. - Phương pháp chiết suất và phát hiện virus trong thực phẩm và nhuyễn thể. 3. MỘT SỔ BIỆN PHÁP ĐỂ PHÒNG VIRUS GÂY BỆNH CHO NGƯỜI

Tốt nhất là đề phòng sự ô nhiễm từ phân vào thực phẩm và nguồn nước và luôn kiếm tra virus đối với người dịch vụ ăn, khu vực sản xuất chế biến thực phẩm, trọng đĩểm là ngúồn nước và động vật nhuyễn thể. Có kế hoạch tiêm phòng những người dịch vụ thực phẩm, các loại vaccin, virus, hepatitis A, virus polio và rota virus, để hạn chế sự lây lan virus. 3.1. Vởi người dịch vụ thực phẩm: Cần giáo dục người dịch vụ thực phẩm hiểu rõ virus đường ruột có thể nhanh chóng lây lan từ nguồn phân và qua thời kỳ ủ bệnh không có triệu chứng, do đó thực hằnh vệ sinh cá nhân, môi trường thực hành sản xuất tốt sẽ đề phòng ngộ độc thực phẩm do virus. Cần có thói quen rửa tay bằng xà phòng, sử dụng dung dịch rượu iod để tiệt trung tay, sử dụng găng tay mỏng trong thao tác chế biến thực phẩm. Và đăc biệt quan trọng rihư đã đề cặp ở trên, với người dịch vụ thực phẩm, bị ỉa chảy cầti ngừng công việc dịch vụ thực phẩm ít nhất là 48h, sau khi đã hỡàn toàn ngừng ỉa chảy. 3.2. Kiểm tra m ôi trường: Virus có thể tồn tại trên bề mặt dụng cụ chế biến thực phẩm, do đó cần chọn lựa chủng loại hoá chất tiệt trùng để lặm m ất hoạt tính,của virus và vệ sinh môi trường. Virus đường ruột thường có khả năng kháng lậi các loại hoá chât diệt trùng (hợp chất có phenol, cồn và ammonium nhưng lại dễ bị mất hoạt tírih bởi clor tự do, iođ và aldehyde 378

(formaldehyde và glutaraldehyde). Việc sử dụng các chất khử virus cũng phải được quản lý và nghiên cứu thận trọng, do aldehyde có khả năng gây ung thư và gây hoen ố bề mặt của thiết bị khử, khi còn vết đọng của aldehyde trên bề mặt dụng cụ. 3.3. Nhuyễn thể hải sản: Tại nhiều nước có nuôi thả hải sản nhuyễn thể, thường sử dụng nguồn nước lắng ở cửa sông, ngay cạnh khu vực dân cư. Chất lượng nước ở đây thường bị ô nhiễm từ nguồn nước thải có virus hepatitis A, Norwalk, và các loại virus đường ruột khác. Tại úc, nhà nước đã qui định việc nuôi thả và phân phôi nhuyễn thể phải được quản lý theo dõi và kiểm tra của ngành y tế. Nhưng có thời gian việc kiểm tra còn coi nhẹ nên đã dẫn tởi 1978 vụ ngộ độc do ăn sò huyết ở bang NSW vào năm 1983. Để hạn chế việc gây ngộ độc, chính quyền bang đã qui định trước khi bán sò huyết cho người tiêu dùng, phải được ngâm trong nước biển sạch và bể chứa, có thể cho kèm thuốc khử trùng ít nhất là 36 giờ (2,3). Cũng có thể sử dụng đèn tia cực tím (UV) để khử trùng và thay nước sạch sau 12-24h, nhận thấy đối với vi khuẩn có hiệu quả khá tốt, nhưng đối với virus kết quả luôn không được thoả mãn, do vẫn còn virus đường ruột sau khi ngâm vào nước có sử dụng biện pháp tiệt trùng. Do đó biện pháp chủ động đề phòng virus tốt nhất là thường xuyên kiểm tra virus và vi khuẩn tại nơi nuôi nhuyễn thể, mặc dù khi đó các chỉ tiêu chỉ điểm vệ sinh về vi khuẩn âm tính và kỹ thuật sử dụng PCR để kiểm tra virus trong nhuyễn thể và nguồn nước luôn luồn là cần thiết. Trong những thập kỷ tới sẽ có khá nhiều thách thức, yêu cầu các nhà khoa học chuyên ngành sinh vật y học, thực phẩm và nhiều ngành liên quan khác cần phối hợp chặt chẽ để chủ động tìm mọi biện pháp hữu hiệu phòng ngộ độc thực phẩm do virus, ngoài biện pháp tăng cường giáo dục cho người tiêu dùng, người nuôi thả phải cảnh giác cao với sự ô nhiêm virus trong thực phẩm, rất cần chú ý thực hiện một số biện pháp và chỉ tiêu sau (4): -

Khuyến khích việc tiêm vaccin phòng virus cho người dịch vụ thực phẩm.

-

Phát hành các tài liệu, thông tin hướng dẫn người tiêu dùng và cộng đồng, người dịch vụ thực phẩm chọn lựa các thực phẩm lành về chĩ tiêu vi khuẩn và virus đặc biệt là các thực phẩm tươi và nhuyễn thể.

-

Khảo sát nghiên cứu sâu về khả năng gây bệnh và kiểm tra nhanh các loại virus đường ruột chậm gây ô nhiễm trong quá trình chế biến bảo quản thực phẩm. 379

Kiểm tra giám sát thường xuyên các nguồn nước lắng đọng bị ô nhiễm từ nguồn nước thải. Không thu hoạch đánh bắt các loại nhuyễn thể tại nguồn nước bị ô nhiễm. Tìm mọi biện pháp xử lý nguồn nước thải sao cho trong nguồn nước thu hồi tái sinh không còn virus. Có thể sử dụng thuốc khử trùng hoặc màng lọc đặc biệt. Khuyến khích biện pháp làm sạch nhuyễn thể kể cả biện pháp khử trùng. Xây dựng mô hình đánh giá và sử dụng ozon để khử virus trong nước và thực phẩm. Nghiên cứu khảo sát kỹ thuật sinh học để phát hiện virus và đặc biệt là hoàn thiện kỹ thuật PCR để chỉ điểm virus còn sông và định lượng virus.

CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT HIỆN VIRUS TRONG THựC PHAM

CÁC GIAI ĐOẠN

(STEPS)

1. Chuẩn bị mẫu

Sò huyét và nhuyễn thể

Các thực phẩm Khác

Chống sủi bọt

/ \ ..../ \ Mâu được nghiền đổng nhất trong dung dịch đ ệm và loại cặ n bã

2. Chiết suất virus và tập trung nống độ virus trong dịch chiết

__ _ idịch :_L_ Dung chìểt

Kết tủa (pha hữu cơ) Loại

ịs s ti 1 Kết tủa (pha hữu co) loại

Ly tâm pH 7,0 PEG 6000

Dịch chiết loạt

Kết tủa Ly tâm dịch đống nhất

A

Kết tủa Loai

3. Phát hiện virus bằng kỹ thuật cấy ỉẻ' bào và phản ứng dây chuyền Polyme

Oung òịch chiết

Cấy tế bào

Thu hồi, loại cá c chất ức ch ế (sử dụng Chelex - Sephadex)

Chiết acid nucleic

Thử phản ứng dây chuyên Polyme PCR

Hình 12.1. Sơ đồ kỹ thuật phát hiện virus trong thực phẩm

Mãu 50-10001.

CÁC G IAI ĐO ẠN

1. Cò d ặ c lẩn đẩu

Phưong pháp lọc qua màng lọc Hollow

Phưang pháp hấp phụ/và rửa trôi Thêm MgCI; hoặcAiCI, Loại chất hoà tan

Thẽm Tween 80

*' Mẫu đuọc tái quay vòng để lọc tiếp

ị ị ị

Virus hấp phụ vào cốc Ống các tút

......... Cỗ đặc mẳu

Dung dịch đệm glycin pH 11 và dijch chiết thịt bò Rửa sạch virus

Dung dịch cở d ặc (0,51) Tráng rủa dịch lọc bằng dung dịch pH đệm, pH 9,6 vùa đủ 1 lít 1 lít

2. T ái cò d ặ c

Dịch chiết Loại

— ị

Kết tủa bằng PEG 6000

Kẽt tủa Lắc và ly tảm dịch đổng nhất 20-40 ml dịch chiết

3. P há t hiện kiểm tra

Cấy virus trẻn tẻ' bào - Virus Entero ■Virus Ada no - Virus Reo

Tách SVT và xác định băng Kỹ thuật cho tái lọt Q ua (re-passaging)

Loai chất ức chế

Chiết acid Nucleic

í Sử dụng đoạn mổí dể phát hiện các virus Polio, Rota, đưởng ruột, Norwalk, Hepatitis Astro, Adeno

Xác định bâng kỹ thuât gây phàn ứhg dây chuyển pótyme hoặc kỹ thuật lai tạo (blot hybridisation)

Hình 12.2. Sơ đồ phát hiện virus trong nước hoặc nước thải đã được xử lý

â82

CÁC GIAI ĐOẠN

Máu " Sephađex G20Ồ

1. Chuẩn bị mẳu

l.oai các chất ức chẽ PCR

Chelex 100

Bông th u ỷ tinh

Mằu đã chứa SVT 2. C hiết xuất acid N ucleic

Chiết RNA bằng phenol/chloroform CTAB proteinase K vớí thuỷ phân bằng dung dịch đêm hoặc đun sôi 99 C/3 phút

3. Phiẻm mã RNA cDNA đưọc sàn sinh

< ■■ ■ •.

5'

Mục tiêu tiếp theo ssRNA

ỵ

'

■ Dải DNAthứnhất tổng hợp VỚI phiên mã ngiíỌc (RT) Đoạn mõi DNA-RT (RT primer)

3 ' ______

cONA

_5 Tổhg hạp theo Ikhuôn