Tugas Metode Sanger Haris Nurhidayat.pdf

Nama : Haris Nurhidayat NPM : 1306404336 Metode Sanger Informasi latar belakang

Sekuensing DNA memungkinkan kita untuk melakukan analisis mendalam mengenai DNA karena memberikan informasi yang paling dasar dari semua: urutan nukleotida. Dengan  pengetahuan ini, misalnya, kita dapat menemukan lokasi pengaturan dan urutan gen, membuat  perbandingan antara rangkaian gen homolog ho molog spesies dan mengidentifikasi mutasi. Para ilmuwan mengakui bahwa sekuensing berpotensi menjadi alat yang sangat kuat, dan oleh karena itu muncul persaingan untuk menciptakan sebuah metode yang bisa menjelaskan urutan DNA. Kemudian pada tahun 1974, dua metode yang secara independen dikembangkan oleh tim Amerika dan tim Inggris untuk melakukan hal ini. Tim Amerika, dipimpin oleh Maxam dan Gilbert, menggunakan "protokol belahan dada kimia", sedangkan Tim Inggris, dipimpin oleh Sanger, merancang prosedur yang serupa dengan proses alami replikasi DNA. Meskipun kedua tim berbagi Hadiah Nobel 1980, metode Sanger menjadi standar karena kepraktisan (Speed, 1992. Metode Sanger, yang juga disebut sebagai sequencing (pengurutan/peruntunan) dideoksi atau pemutusan rantai, didasarkan pada penggunaan dideoksi (ddNTP ini) selain nukleotida normal (NTP) ditemukan dalam DNA. Dideoksinukleotida pada dasarnya sama dengan nukleotida kecuali dideoksinukleotida mengandung gugus hidrogen pada karbon 3 'bukan gugus hidroksil (OH). Nukleotida dimodifikasi, ketika diintegrasikan ke dalam urutan, mencegah  penambahan nukleotida lebih lanjut. (Speed, 1992) .Ini terjadi karena ikatan fosfodiester tidak dapat membentuk ikatan antara dideoksinukleotida dan nukleotida yang baru masuk berikutnya, dan dengan demikian rantai DNA diakhiri. Metode

Sebelum DNA dapat diurutkan, DNA harus didenaturasi menjadi untai tunggal dengan menggunakan panas. Berikutnya sebuah primer ditambahkan ke salah satu helai Template. Primer ini secara khusus dibangun sehingga dimana ujung 3 nya terletak di sebelah urutan DNA. Baik primer atau salah satu nukleotida harus diber label radioaktif atau fluresen (berpendar) sehingga produk akhir dapat dideteksi pada gel (Russell, 2002). Setelah primer melekat DNA, larutan ini dibagi menjadi empat tabung berlabel "G", "A", "T" dan "C". Kemudian reagen ditambahkan ke sampel ini sebagai berikut: "G" tube: all four dNTP's, ddGTP ddGTP dan  dan DNA polymerase "A" tube: all four dNTP's, ddATP ddATP dan  dan DNA polymerase

ddTTP dan  dan DNA polymerase "T" tube: all four dNTP's, ddTTP "C" tube: all four dNTP's, ddCTP ddCTP dan  dan DNA polymerase

Seperti ditunjukkan di atas, semua tabung berisi ddNTP yang berbeda, dan masing-masing konsentrasi sekitar pada “one-hundreth”  dari prekursor normal (Russell, 2002). Selama DNA disintesis, nukleotida ditambahkan ke “rantai bertumbuh/the growing chain”  dengan DNA  polimerase. Namun, pada saat sebuah dideoksinukleotida disatukan ke rantai di tempat nukleotida normal, yang hasilnya pada peristiwa pengakhiran rantai. Sebagai contoh jika kita melihat hanya "G" tabung, kita mungkin menemukan campuran produk berikut:

Gambar 1: Contoh kemungkinan fragmen yang bisa dihasilkan di tabung "G". Panjang semua fragmen berbeda karena integrasi acak dari ddGTP ini (Metzenberg). Kunci untuk metode ini, adalah semua reaksi dimulai dari nukleotida yang sama dan berakhir dengan basa tertentu. Jadi dalam larutan di mana rantai yang sama dari DNA akan disintesis lagi dan lagi, rantai baru akan berakhir pada semua posisi di mana nukleotida memiliki kemungkinan ditambahkan karena integrasi dideoksinukleotida (Russell, 2002). Dengan cara ini, pita - pita dari seluruh panjang yang berbeda dihasilkan. Setelah reaksi ini selesai, DNA sekali lagi didenaturasi dalam persiapan untuk elektroforesis. Masing-masing isi empat tabung bergerak di jalur yang terpisah pada sebuah gel polyacrilmida untuk memisahkan pita yang berbeda ukuran satu sama lain. Setelah isi sudah bergerak di gel, gel ini kemudian disinari baik sinar UVatau X-Ray, tergantung pada metode yang digunakan untuk pelabelan DNA.

Gambar 2: Ini adalah gel polyacrilmida pada reaksi di tabung "G" (urutan yang sama terlihat  pada gambar 1). Fragmen DNA yang lebih panjang bergerak pada jarak pendek dari fragmen yang lebih kecil karena massa molekulnya lebih besar. Bagian birumenunjukkan primer, bagian hitam menunjukkan untai yang baru disintesis dan merah yang menandakan ddGTP, yang mengahiri rantai (Metzenberg). Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2, fragmen lebih kecil dihasilkan ketika ddNTP ditambahkan lebih dekat dengan primer karena rantainya yang lebih kecil dan karena itu bermigrasi lebih cepat di seluruh gel. Jika semua reaksi dari empat tabung digabungkan pada satu gel, urutan DNA yang sebenarnya di arah 5 'ke 3' dapat ditentukan dengan membaca pola pita dari bagian  bawah gel ke atas. Hal ini penting untuk diingat lebih dulu bahwa urutan ini melengkapi untai template dari awal.

Gambar 3: Ini merupakan autoradiogram dari sequencing gel dideoxy. Huruf  –  huruf  huruf diatas jalur mengusulkan bahwa nukleotida dideoxy yang digunakan dalam sampel yang diwakili oleh jalur itu. Ketika Anda membaca dari bawah ke atas, Anda membaca urutan komplementer dari untai cetakan (Metzenberg). Automated Sequencing

Dengan banyak kemajuan dalam teknologi yang telah dicapai sejak tahun 1974, tidak mengherankan bahwa metode Sanger telah menjadi usang. Namun, teknologi baru yang telah muncul untuk menggantikan metode ini didasarkan pada prinsip-prinsip yang sama dengan

metode Sanger. Sekuensing otomatis telah dikembangkan sehingga lebih banyak DNA dapat diurutkan dalam waktu yang lebih singkat. Dengan prosedur otomatis reaksi dilakukan dalam tabung yang berisi semua empat ddNTP, masing-masing diberi label dengan warna dye yang  berbeda (Russell, 2002).

Gambar 4: Dalam sequensing otomatis, oligonukleotida primer dapat "end -labeled" -labeled" dengan  pewarna yang berbeda, satu untuk setiap ddNTP. Pewarna ini berpendar pada panjang gelombang yang berbeda, yang dibaca melalui mesin (Metzenberg). Seperti dalam metode Sanger, DNA dipisahkan pada gel, tapi mereka semua berjalan di jalur yang sama.

Gambar 5: Hasil elektroforesis gel untuk pewarna berlabel DNA di sekuensing otomatis. Gambar Gamba r di sebelah kiri menunjukkangel tampak seperti apa jika empat reaksi dijalankan di jalur yang  berbeda, yang bertentangan dengan gambar di sebelah kanan yang menunjukkan gel di mana semua DNA yang dijalankan di satu jalur (Metzenberg).

Sejak empat pewarna berpendar pada panjang gelombang yang berbeda, laser kemudian membaca gel untuk menentukan identitas setiap pita sesuai dengan panjang gelombang di mana  berfluoresensi. Hasilnya kemudian digambarkan dalam bentuk kromatogram, yang merupakan diagram puncak berwarna yang sesuai dengan nukleotida di lokasi yang dalam urutan (Russell, 2002).

Gambar 6: Hasil dari urutan otomatis ditampilkan dalam bentuk kromatogram. Warna-warna mewakili empat basa: biru C, hijau adalah A, hitam G dan merah adalah T (Metzenberg). Daftar Pustaka

Metzenberg, Stan. Sanger Method- Dideoxynucleotide Chain Termination. http://www.csun.edu/~hcbio027/biotechnology/lec3/sanger.html (4 Desember, 2015). Russell, Peter. 2002. iGenetics. Pearson Education, Inc., San Francisco, pp 187-189 Speed, Terrence. Sanger's Method. http://statwww.berkeley.edu/users/terry/Classes/s260.1998/Week8b/week8b/node9.html http://statwww.berkeley.edu/users/terry /Classes/s260.1998/Week8b/week8b/node9.html (4 Desember 2015).