Štrausova Medicinska Biokemija

irjiitffirffifilt f#i{{it$rfifif

ffi

'

lt'f"i"i"'"-rr-'.'-,--rii'$tifffint i' Elflliiifix{illi$i riii*;iii:i'

.n

;i

Predgor)or

Klinidka (medicinska) biokemija jedno je od podrudja laboratorijske medicine koje se najbrie razvijadime pridonosi kontinuiranom poboljlanju kvalitete slrbi o bolesniku. Od posljednj egizdanjao*g od;b.rika do danas u laboratorije su uvedene nove tehrrolgije koje su imale znatajan udinak na pr"kr.t kli.ritke bio[emije. Razvijen je, nadalje, veliki broj osjedjrvijih i specifitnijih metoda bez kojih bi brojni analiti bili nemjerljivi dosadainjim -..oi"-", a znatajan napredak nadinjen je u podrudju standardizacije analitiikih postupaka te harmonizacije referentnih intervala. Laborarorijske pretrage opienito je nadiniti lakSe i u kraiem lrr.-.r,r, a radi praviln. irrt.rpr.t". ije rezultaapotrebna su i jira

znania iz podrudja fiziologiie,patofiziologije, biokemije, te molekularne biologije. logijama i interpretaciji brojnih naleza sadrLaj su ovog udZbenika.

bry.dir4.rro znaryeo novim tehno-

Premda se prof. dr. Boiidar Straus povukao iz aktivne prakse, njegova ostavltina nastavlja se u ovom udZbeniku, s ne5to izmijenjenim, ali najprikladnijim naslovom koji odraZava najdublju zahvalnost gl"urron''".rroru, ,rstr"usova Medicinska biokemija>osjetljivost>specifidnost.. u kontekstu korisnosti laboratorijske pretrage katkad zbunjuje, jer se ti pojmovi rabe i u opisu analitidkih svojstava metoda. Student treba znati da se analitidka osjedjivost odnosi na sposobnoTablica 1-9. Povezanost prevalencije st metode da otkriva male koncentracije analita, a analitidka specifidnost bolesti i PV+ pretrage sluZi tomu da se metodom odreduje upravo analit od interesa, a ne analit nekog drugog slidnog spoja.

1.s.2. Prediktivne vrijednosti

/ / \

Lijednika u praksi najvi5e zanima hoie li bolesnik imati ili ne ie imati bolest, na Sto odgovara pozitivna ili negativna prediktivna wijednost. Pozirivna prediktivna vrijednost (PV+) povezuje dijagnostitku osjetljivost i specifidnost pretrage s prevalencijom bolesti u skupini koja se ispituje, 5to je prikazano u tablici l-9. Pozitivna i negativna wijednost izradunavaju se kako je prikazano u tablicama 1-10.

i

1-l

l.

Tablica 1-10. lzraiunavanje pozitivne prediktivne vrijednosti (PV+) i negativne prediktivne vrijednosti (PV-) temeljeno na broju pozitivnih i negativnih rezultata

Ako prevalencija, klinitka osjedjivost i specifitnost ulaze u gotryo jednadZbu, wijede jednadibe u tablici 1-11. Tablica 1-1 l.lzratunavanje PV+ i PV- ako su poznate kliniika osjetljivost, specifiinost i prevalencija

ltiii:t :.l;.,ilii: ;:..l;lttt: :.

:,

i:1.;.'1.1

t:.a1tia

,,t.i:';::

i

16

PoglauAt

I Prevalencija, osjetljivost i specifidnost moraju biti unesene u jednadZbu u postotku. MoZe se zakljuditi da PV+ vrijednost raste s prevalencijom bolesti i dijagnostidkom osjetlji-

vosti i sprcifidnosti pretrage. PV+ vrijednost uvijek je niska u sludaju niske prevalencije, dak iako pretraga ima visoku dijagnostidku osjetljivost i specifidnost. Vrijednost PV- poveiava se s brojem osoba koje nemaju bolest (100-prevalencija). Uz nisku prevalenciju bolesd, vrijednost PV- uvijek ie biti visoka dak ako je dijagnostidka osjedjivost i specifidnost pretrage slaba ili je nepreciznost visoka.

1.s.3. Omjerivjerojatnosti Omjer vjerojatnosti (LR) opienito pokazuje koliko je puta vjerojatniji rezultat neke pretrage u bolesnika nego u zdrave osobe ili izrai,avavjerojatnost da ie se dani rezultat pojaviti u osobe s posebnim stanjem ili, obratno, bez njega. LR za pozitivni rezultat dan je kako slijedi: LRpoz = osjedjivost/(10 govori o tome koliko je puta vjerojatnije da ie ka nego u zdravog ispitanika. LR za negativni rezultat dan je kako slijedi: a

LRneg = a govori o tome

se

-

specifidnost),

pozitivan rezultat pretrage pojaviti u bolesni-

(l - osjedjivost)/specifitnost,

koliko je puta manje vjerojatan negativan rezultat pretrage u bolesnika nego u

zdravog ispitanika.

1.s.4. Dijagnostiika djelotvornost Dijagnostidka djelotvornost pretrage govori o odnosu ispravnih rezultata prema svim rezultatima pretrage. Ovisi o dijagnostiikoj osjedjivosti i specifidnosti pretrage i o prevalenciji bolesti (tabl. l-12). Ta bl

ica

1-1

2. lzratu nava nje d ija g nostiike djel otvornosti pretrage

Djelotvornost =TP + TN/broj svihr rezultata

DjelotVornost=pr€valencijaxosjetljivost+(1 =prevalencija)xspecifiinost Kada su specifidnost 5iu.

i osjedjivost jednako vatne, uzima se pretraga s najveiom djelotvorno-

Literatura 1. Albert-Subii N, Tadej D. Referenme vrijednosti klinitki relevanmih sastojaka krvi i seruma. Zagreb:Skokk" knli9a,1990.

2. Cembrowski GS, Sullivan AM, Hofer TL.

Qrliry control and statistics. U: Bishop ML, Duben-EngelkirkJl, Fody EP, ur. Clinical Chemistry. Principles, Procedures, Correlations. 4. izd. Philadelphia: Lippincott u7'illiams &

'Wilkins,

2000:40-76.

3. evoriSdec D, Stavljenii-Rukavina A. Prirutnik o procjeni laboratorijskih nalazaiz medicinske biokemije. Zagrebz Medicinska nakl ada, 1993.

4. Dufour R. Sources and control of preanalytical variation. U: Kaplan A,

Pesce AJ,

Kazmierczak SC, ur. Clinical

Chemistry. Theory, Analysis, Correlation.4. izd. London: Mosby,2003:65-82.

5. Flegar-Me5trit.Z,Jrgxinec N, i sur. Referencne vrijednosti biokemijskih i hematoloikih sastojaka djece i adole

sc

enara gradaZagreba. Zagreb: Medicinska nakl ada, 1997

.

lrvi

u Skolske

Uuodni dio

6 -&

r' de!"

r:' :1"

e S*,r

&

ffi

Guder WG, Narayanan S,'Wisser H, Zawta B. Samples: From the Patient to the Laboratory. The lmpact of Preanalsdcal Variables on the Qality of Laboratory Results. 2. izd. Darmstadt: GIT VERLAG GMBH, 2001. Sasse EA. Reference intervals and clinical decision limits. U: Kaplan LA, Pesce AJ, Kazmierczak SC, ur. Clinical Chcmistry. Theory, Analysis, Correlation. London: Mosby, 2003: 362-78. fhomas L. Clinical laboratory results. U: Clinical Laboratory Diagnostics. Use and Assesment of Clinical Laborarorv Results. l. izd. Frankfurt/Main: TH-Books Verlagsgesellschaft mbH,1998:1453-63.

17

AutoTnatizacUa

Poglar|t

i

irforTnatizacUa u laboratorUu BoZidar Straus, Jozsef Petrik

A.tit0

,,. ,.',.,, ,'-,' .

Vnte automatizaciie

Pojedinatne Analizatori

,

lntegrirana,auto

Raiunalni Prirnleq

2.1. Automatizacija

19

lre1 '' ,.

.'l ''.,,.,r

18

rr

19 ',' ', . ,' ..

a{| "'

st ."'-,'-"'

"

,,

'

-'-

gl

ratu ia$oid ."

:f lt.t

),

.JL

t3 34,

,36

Naziv

>>autometizeci)a>poluautomatizacija>on line* prijenosa podataka.. Uredaj moZe provoditi 5 L razllirru analizu (od toga tri s pomoiu ISE) ,brzinom oko i.9OO analizana sar, odnosno ukupno 2.630 anaLiza na sat s analizama s

Slika 2'3.

Prikaz analizatora AU 2700.

pomoiu ISE (s1.2-3.).

Epruvete s uzorcima stavljaju se u stalke razlidite boje. Sivi su stalci za rutinske analize, plavi iLutizakalibraciju, zeleni za kontrolu kvalitete, narandasti za ponavljanje analize i crveni zahit' koji se ne pretrage. Ovisno o analizi analizator uzima odredeni volumen uzorka (I,6-25,0 pL) pr*ori o"kirr.ro te se dodaju odredeni volumeni reagens a (LS-ZSO pL). Poslije dodavanjasvakog ,."g.rrr" mijesalice mijeiaju reakcijsku smjesu. Nakon inkubacije uzorak se prenosi u spektrofotori.triyrkoledinicu, gdje-se mjere apsorpcije reakcijskih smjesa. Analizator moie provodiritazliiire wste anafiza,k"o Sto su analize zavrine todke s jednolratnim i dvokratnim mjerenjem, ki-

netiike analize i mjerenje nakon definiranog Yremena na valnim duljinama od 340' 380, 410' 450,480,520,540,570,600,660,700,750 i 800 nm. Osim spektrofotometrijskih miercnja,za

mjerenje koncentracije natrija, kalila i klorida rabe se ion-selektivne elektrode (indirektna potenciometrija), pri temu volurnen uzorka seruma ili mokraie iznosi 20 pL. Prije mjerenja uzorak se ka,urird1111- li,Z puta,a koncentracije Na, K i Ct mjere se uz prethodni postupak automatske libracije s referentnim otopinama velike i male koncentracije' Saieti prikaz moguinlsti nekih biokemijskih analizatora koji se primjenjuju u rutinskom l"boratorlpko- ,"dol gdje su prisutni veii radni zahtievi prikazan je u tablici Z-Z.Poteba za je do razvoia analizas velikim kapaciietom i Sirokim programom analiza dovela "n"lir"torirrra Danas je uobianalize. rora koji su sposobni prouodiri istodobno i biokemijske i imunokemijske mogu mjeriti caiena primjerr" *"lir"rora koji uz odredivanje uobiiajenih biokemijskih analita hormona, lilekova i specifiinih proteina. Veiina biokemijskih analizatora ima mo-

Lo...rrtr".q.

gudnost detekcije prisutnosti

hL

he-oliz., lipemije i poveianih koncentracija bilirubina u uzor-

27

28

PoglauAt 2

Tablica 2-2. Osnovne znatajke nekih biokemijskih analizatora

' t

"

fhtegri ''.''t"

''l":

,,Roche . . t'..

'i"l',.'

,,

l'

>>rendam,,

@'m;;;

Jcc*iiu,,

-

,

.:..

. :poqrb;'r*pfu@f t

ffiSa'*

.,

'

,dis'ki'etn'i'' '- ' .'

:

ErdorHtrBa' -

pqffi.'@1

.

tt

'""

fotomatrija,

;' p

F,ffi''i'ffi# ffiffiil,, =ffi; --+*,-::ffi-;l;;,;

nci6i..,

'metfga,,

'

,2:97 t.

I

','

''i

, ' t't

,,

,

'

..

.

*Jru*.*ffiffiffi ffi *.' ":,'- 'ffi ffijffi*"#ffi;,-:' *ffi

,50-100':,,',; , ,

,..

1..t"...

..' ..

:

bir-kod', ,:, I ,,,1, , ,,' ,.

.-

.,

t' '

.. t

'.

t,

.

.

.tekufi'|li,::, , ,

,

'Repo$rgSno

,prired-efi '" t

,

t

'

' '''

,,v,offfaff halogena

,

ffiWffi'rffih*iffilx ' ' -';

,",

"'

i, '

,lO,,valnih

'lautjini"

.C6 ) 66$^i[sfi Sq,ilr *rffi F'€F#TY} *iffiiffi grqq!@"*= WM qp&r#r qrsry, opfe $s-:,':'tgffiskb; *enrflskc' knqs ' *esp€#tr*' .." rysd*trSp#W$'i SdWg'.#,@: '' ryecf*n+'; sFffiri. , pm*ehSlDfi# ..trmnddt@;"" mf ."; ' Fry@l%i TFM;,'DAU, ;$?

!y-ri I'I":t1T;e

;r+=:q

' ;--,;ld+-:;;ry*kiffE

'

j

:

i"

:

'"

I

'

.

Pq€i4il*ed1ffi4*jte u &l;

*- -

.

-'ffiM

furyS*'..tu.-dq *.W"ffi-

i,r:f, ,1',,

,Random access>puferCl-=Na+ reduju signali natrija i kalija. Odnos signala i koncentracije odreduje se s pomoiu mikroprocesora. Buduii da intenzitet emitiranoga svjeda, osim o samoj koncentraciji iona, ovisi i o nekim drugim dimbenicima, prije svega o jakosti plina i dovodu zraka (zanatrij i kalij potrebna rempc-

Voda

i

eleknoliti 69

istim uvjeupotrebljava acetilen)' istodobno se pod ratura iznosi 1.900'c, pa se umjesto butana plamenatrija i kfria (standardi)' Postoji viSe tipova tima mjere i otopine poznatih koncentracija

nihfotometaraiprinjihovojuporabitrebasetoinodriatiuputaproizvodada. Napomene ViSe timbenika utjete na totnost mjerenja

l.

plamenom.eti{tf": fotometrijom'

njego-

izvor svjeda plamel' Za razlilstod izvora svjetlosti kod fotoln..r" 1*j..iljka), 3vdj1 ie dotoku i tlaku plina i zraka' Zato iebolje raditi va stabilnost i irrr.Jtlt ovise o jednolitrroa

s

za e istoia je plina takoder vaina' Kompresor ptrrro* iz boce (bo*i ,r.go s gradskim plinom. od. zrakom, p".,. ,".o kompresor mora stalno zrak mora jednoliino opskrbljivati instrument probama' i standardima ,.i), k"ii se rabi kao interni standard' dodaje se rLavati.Litij emisije natrija i kali promjene u stabilnosti automatski se izravnavaju, jer instrument usporeduje emisija tih elektrolitija te daje -i.renja kao omjer izmedu ja s referentn.^r.'r,lt# referentnog signala i na njega utjeiu iste razlike lita i litija. Buduii da litij u tome ima funkciju se viskoznosti, kao i na mjerene elektrolite, time u stupnju r"sprsivanla, stabilnosti pl"*.,,",i poveiava Preciznost mjerenja' U se osigurao jednoliian protok otopine' 2. Plamenik i rasprSivai moraju biti uvijek iisti da bi koji mogu smanjiti prohodnost' a dme protok rasprSivadu se s vremenorn istaloze proteini

(litii;

.*;;;;

probe,iligapotpunozaiepiti.Zatoseraspr5ivatmoraPovremenodistiti.Zbogistograz|oga (npr' Exstran)'

otopinom ioja sadriava ittttgt"t bez iona probe i standardi i o koncentraciji elektrolita u otopi3. Stupanj razrjedenja u"oraka ovisi o svojswirnla instrumenta dobiju opdmalna osjedjivost i toinost instrumenni koja se mjeri. Razrijediti treba toliko da se proteina u tekuiini i viskoznost' a to pogoduje ta. Razrjedivanjem se smanjuje koncentracija jednolitnom protoku u . :^r^- drugom l-,,- pri mier ---:-- jedan smetaju ^,i mjerenju' +. 'zbogblirrrr. ,p.t.rJrrih linila narrija i kalija, ovi kadoni mjerenje provodi usporedivanjem inDa bi se ta pogrjeSka svela na 5to manju mjeru, 1 \"ko.t. ove katione' ," r."r,i"rdima, dobro je da istandardi sadriavaju tenziteta emirry. redestiliranom centrifugirati i razrijediti 5. Mokraiu je za odredivanje kalila i natrija potebno mjerenja' U likvoru se natrij i kalij linearnosti vodom kako bi t"rr..rrr".q" Uil" o poaroiu odreduju istim metodamakao i u serumu'

;;-.d"j;;.

rasprSivatu

,

-

;;;";J.

Potenciometrijsko odredivanje natrija i kalija i kalimetoda za odredivanje koncentracija natrija Potenciometrija je jedna od preporuienih i elektrode staklene membranske :. odreduje ,. ,""1#" elektrokemijskog potencijala izmedu. (plazmi' natrijwih/kalijwih iona u tt:1-,1 :eterentne .t.t rroa., mlaie razmjein" l>alkalije "" -.A-

HH+) furan

A

C

a-D - fraktop iran oza (a-D- frukto za) 6

cH20H

ZO1

furanoza

,

cH2oF

5

HHO

H

2

OH

OHH a- D

-

fruktofu

ra noza ( a-D - fruktoz a)

Glukoza se u kristalidnom obliku nalazi u obliku a-D-glukopiranoze, a fruktoza kao a-Dfruktopiranoza. Medutim, u disaharidima (saharoza) i polisaharidima (inulin) fruktoza je u obliku a-D-fruktofuranoze.

6.1.2. Disaharidi Dva monosaharida mogu se medusobno vezati glikozidnom vezom u disaharid. Pri tomu se aldehidna ili ketonska skupina je dnog monosaharida ve ie s aldehidnom, ketonskom ili hidroksilnom skupinom drugog monosaharida. Vezanjem aldehidne skupine glukoze s ketonskom skupinom fruktoze nastaje saharoza ili sukroza. Vezanjem aldehidne skupine galaktoze s alkoholnom skupinom glukoze nastaje laktoza, avezanjem aldehida glukoze s alkoholnom skupinom glukoze maltoza (s1.6-2.). Reducirajuie svojswo disaharida ovisi o tome sadrZe li 1o3 slobodnih aldehidnih ili ketonskih skupina. Tako saharoza ne reducira, jer su obje reducirajuie skupine, aldehidna glukoze i ketonska fruktoze, medusobno yezane. Laktoza i maltoza sadriavaju po jednu slobodnu aldehidnu skupinu, pazato reduciraju, ali upola slabije od odgovarajuiih monosaharida.

6.r.3. Polisaharidi Medusobnim povezivanjem veiega broja monosaharida nastaju polisaharidi. U iivotinjskom se organizmu nalazi polisaharid glikogen, koji dini ugljikohidratnu rezeryu lokaliziranu u jetrima i miSiiima, a ne5to malo i u bubregu. Molekula jetrenog glikogena sastoji se od oko 30 000 glukoznih jedinica i ima molekularnu masu oko 5 000 kDa, dok je molekula miSiinoga glikogena manja s molekularnom masom oko I 000 kDa. Molekula glikogena eliptidnog je oblika, a glukozni su ostarci medusobno vezani I,4i L,6-vezama. Na svakih L0-I4 glukoza vezanih ulanac I,4' yezema,lanac se grana tako da se glukoza glikozidno veZe izmedu C-l i C-6-atoma.

Ugliikobidrati 103 cH20H

cH2oH

cH2oH

cH20H

H H

HO

OHH a-D-glukoza

B-D-fruktoza

cH20H

cH2oH OH

H

H

OHH

HOH a-D-glukoza

HOH laktoza

p-D -galaktopira nozid-4- a-D -glukopiranoza

cH20H

cH2oH H

H

HO

+ H2O

OH

HOH

H H

OHH

OHH

OH

cH2oH

cH20H HO

OHH

H

H

-+fi

a-D-glukoza

B-D-galaktoza

cH20H

HO

HOH

HOH

H

a-D -glukopiran ozid-Z-$-D -fruktofuranoza

H

H

HO

saharoza

cH2oH

H

OHH

OH

H H

HO

OHH HOH

HOH a-D-glukoza

cH20H

OHH

HOH

OHH

HOH

HO

+ H2O

o

+ H2O

o

HOH

maltoza a-D -glukopiran ozid-4- a-D -glukopiranoza

Slika 6-2.Disaharidi. se ova djelovanjem glukokinaze iiheksokinaze fosforilira prelazi u glukoza-1-fosfat. Glukoza-1fosfoglukomutaze u glukoza-6-fosfat, a ovaj djelovanjem fosfat dalje reagira s uridin-trifosfarom (UTP) i nasraje uridin-difosfat-glukoza (UDPG) koja se veLe w glikogen djelovanjem glikogen-sintaze. U biljkama se najveii dio prituve ugljikohidrata nalazi u obliku polisaharida $[roba. Taj se polisaharid sastoji od dvaju strukturno razliditih glukozana, amiloze i amilopektina. Relativni odnos amiloze i amilopektina varira u razliditim biljkama. Amiloza je gradena od 250 do 300 glukoznih jedinica, medusobno vezanih l,4-vezom u spiralno uvijeni lanac koji ima jednu terminalnu slobodnu aldehidnu skupinu. Ovisno o broju glukoznih jedinica, relativna molekularna masa amiloze iznosi od 40 do 50 kDa. Amilopektin se takoder sastoji od a-glikozidno vezanih ostataka glukoze. Nakon svakih 25 glukoznih jedinica, povezanih l,4-vezom nalazi se 1,6-veza swarajuii na taj nadin granu (sl. 63.). Amilopekdn sadrZava oko 1.000 i vi3e glukoznih jedinica, a relativna molekularna mu je

Glikogen nastaje iz glukoze tako da

masa oko 50-1.000 kDa.

Skrob s jodom daje karakteristiinu modru boju. Sama amiloza takoder se boji modro, dok amilopektin s jodom daje ljubidastu boju. Hidrolizom ili enzimskom razgradnjom s amilazom 5krob, odnosno njegovi sastojci, razgraduju se na dekstrine i mdtozu manje molekularne mase, koji s jodom viSe ne daju boju. Od ostalih polisaharida u biljkama treba joi spomenuti celulozu i inulin. Celuloza je izgradena od jedinica glukoze koje su medusobno povezane 1,4-B-glikozidnom vezom. Jedinica od dviju glukoza vezanih p-glikozidnom vezom izmedu atoma C-L i C-4 naziva se celobiozom (s1.6-a.). Lanac celuloze ima oko 8.000-12.000 glukoznih jedinica s relativnom molekularnom masom oko 2.000 kDa i micelarne je strukture. Derivati celuloze, npr. DEAE-celuloza

ili CM-celuloza, primjenjuju

se

kao adsorbensi u lromatografiji.

1O4

Poglaulje 6

cH2oH

cH2oH H

H

H

H

H

OHH H

OH

OH

Slika 6-3. Struktura:

H

H

OHH H

cH2oH

d

OH

a) amiloze i b)

t\l,/ d

CH,

cH2oH HO

H

cH2oH

cH2oH

H

cH2oH

H

OHH

cH2oH H

H

amilopektina.

cH2oH

cH2oH

cH2oH celobioza

H

d"

cH2oH celobioza

Slika 6-4, Struktura celuloze.

Inulin je polifruktozan, sastavljen od oko 100 jedinica fruktoze vezanih Z,L-vezom, relativne molekularne mase 5,1 kDa. Dobro je topljiv u vodi. llnosom u tijelo, rasprostire se samo u izvanstaniinoj tekuiini, pa se s pomoiu inulina moie odrediti i volumen izvanstanitne tekuiine. Iz organizma se izluduje putem bubrega, i to iskljudivo glomerularnom filtracijom, pa je klirens inulina ,>zlatni standard.. za odredivanje brzine glomerularne filtracije. U morskim se algama nalazi polisaharidni agar koji se sastoji od D-galaktoze i L-galaktoze povezanih 3,6-eterskom vezom. Primjenjuje se kao hranjiva podloga u milrobiologiji.

62

Metabolizam ugljikohidrata

Ugljikohidrati se unose u tijelo hranom. U usnoj Supljini na Skrob i glikogen djeluje salivarna anilaza (ptijalin), koja ih razgraduje na dekstrin i maltozu. Kiseli pH ieludca inhibira akrivnost salivarne anrrlaze pa se daljnja razgradnja do maltoze nasravlja u tankome crijevu pri alkalnom pH pod utjecajem gu$teratne amilaze. U tankom crijevu djeluju disaharidaze, maltaza, saharaza,

Ugliikohidrati 105 i laktozu na monosaharide: glukozu, u jejunumu i ileumu, a manje monosaharidi nastali i Tako se fruktozu galaktozu. i u kolonu, apsorbiraju. Apsorpcija monosaharida obavlja se razliditom brzinom. Relativno se najbrZe apsorbira galaktoza, a zatim glukoza, fruktoza, manoza, ksiloza i arabinoza (tabl. 6-1.). Apsorpcija glukoze i galaktoze obavlja se preko jedne wste nosada, sekundarno aktivnim transportom ovisnim o natriju zakojije potrebna energija, dok se apsorpcija fruktoze obavlja preko nosada drukdije strukture od nosada za glukozu i galaktozu. Taj je transport neovisan o natriju, a apsorpcija fruktoze je mnogo polaganija. Ostali monosaharidi (npr. ksiloza) apsorbiraju se pasivnom difuzijom kroz crijevnu mukozu. Apsorpcija ugljikohidrata moZe biti smanjena ako su prisume promjene na crijevnoj sluznici, npr. kod upale (enteritis), edema sluznilaktaza, koje razgraduju maltozu, saharozu

Tablica 6-1. Brzina apsorpcije monosaharida u tankome crijevu

glu*oaa'

'

ffi

manoea

"ffi,ri

ksiloea,

'

arabi;";;

6-5.). Stvaranje glikogena iz glukoze naziva se glikogenezom, a razgradnja glikogena na glukozu glikogenolizom. Nastajanje glukoze iz neugljikohidratnih tvari, aminokiselina, mlijedne kiseline

glikogen

glukoza

----+ +-

It It

filiJerolfosfat

it

trioza fosfat

--.--+

-fosfat *- galaktoza

glukoza-6-fosfat

fruktoza-6-fosfat olicerol

galaktoza-1

-

/

+-

. fruktoza

,/

lt

\ (masti) )

trigliceridi

masne kiseline

-l izoleucin I

tr.i. I I I

tirozin

fenilalanin

I

;*

citrat

acetil-CoA

\\

/ m

I tijela

o

.s

Tvl

izocitrat

=oC

I I

a-ketoglutarat I

-

/

=

E

proteini

(o

sukcinat I

Slika 6-5. Metabolizam ugljikohidrata i njegova povezanost

s

lffi

*u

ili celijakije. Apsorpciju stimulira tiroksin, pa moZe biti usporena u hipotireoidizmu. Sve te timbenike treba uzeti u obzir pri interpretaciji rezultata testa oralne tolerancije glukoze (OGTT, enfl.. oral glucose tolerance test). Manji dio apsorbiranih ugljikohidrata prelazi u limfu i preko torakalnog duktusa u opiu cirkulaciju, a veii se dio transportira portalnim krvotokom u jetru, koja je najvainiji, organ u daljnjem metabolizmu ugljikohidrata. lntenzitet metabolizma heksoza ovisi o potrebama tijela. U jetri se glukoza metabolizira u viSe smjerova. Metabolizira se do CO2 i H2O uz oslobadanje energije, moie se pohraniti u priduvnom obliku - glikogenu, u odredenim stanjima iz nje mogu nasrari ketonski spojevr, moZe posluZiti za sintezu neesencijalnih aminokiselina ili prijeii u masti. Galaktoza i fruktoza u jetri se ukljuiuju u metaboliike puteve razgradnje glukoze (sl.

It

,

,iiii;...,,i

ce

glukoza-1 -fosfat

tff *t'til

'Efit#

metabolizmom PlglelltSj rnglli

,

ffi t$r.ti ;i,,$

106

PoglauAt 6

i glicerola, naziva se glukoneogenezom. Glikoliza jepaknaziv zarazgradnju glukoze do piruvata, odnosno laktata. Pod aerobnim uvjetima na glikolizu se nastavlja ciklus limunske kiseline (ciklus trikarbonskih kiselina) i proces stanidnog disanla i oksidacijske fosforilacije, pri demu ie se osloboditi energija i sintetizirati AIP. Tiansaminacijom piruvata, oksalacetata i a-ketoglutarata povezuje se metabolizam glukoze s metabolizmom aminokiselina, a preko nastanka piruvata i iz njega nastalog acetil-CoA s metabolizmom lipida.

6.2.i. Glikogeneza Najveii dio rezerve ugljikohidrata nalazi se u jetri u obliku glikogena. Jetra u dovjeka sadrLava oko 150-200 gglikogena, Sto dini oko l0% njezine mase i to je dostatno za 24-36 sati gladovanja. Razgradnjom glikogena u jetri, oslobada se glukoza koja se potom otpuSta u [rv. U prisutnosti AIP-a glukoza se djelovanjem enzima glukokinaze fosforilira u glukoza-6-fosfat, a ovaj djelovanjem fosfoglukomataze prelazi u glukoza-1-fosfat, koji vezanjem s UTP-om stvara energijom bogatiju UDPG, ili aktivnu glukozu (sl. 6-6.).

OH

*/\ OH

cH2oH

".L.-j

P-P-P-O-CH

cH2oH

H

HO

OHH

O-P-P_O_CH

OH

oz\N./

il

+PP

OH

UTP

glukoza- I -fosfat

-i */\

Slika 6-6. Aktivacija glukoze

uridin-difosfat-glukoza

(UDPG) OH

OH

s UTP-om.

Thko aktivirana glukoza ugraduje se pod katalitidkim djelovanjem glikogen-sintaze |,4-glikozidnom vezom u glikogen. Za ovu je reakciju, medutim, potreban starter, a to je molekula glikogenina. Drugi enzim, tzy. enzim grananja (Q-enzim) katalizira pak vezanje glukoze I,6-yezom, 3to dovodi do grananja glikogenskog lanca. lnzulin sdmulira glikogenezu tako 5to inducira glukokinazu i fosforilaciju glukoze. Inzulin se, naime, veie na specifitne receptore na stanitnoj membrani i tako vezan uzrokuje djelovanje jednoga >>drugoga glasnika 42 sata), za odrLavanje normalne koncentracije glukoze u krvi odgovoran je proces glukoneogeneze. Nakon obroka poveianje koncentracije glukoze stimulira jate lutenje inzulina pod iijim se utjecajem onda pojadaa ne3to malo

jetrii miSiiima, pa glukoza prelaziuglikogen i normalizira se u krvi, a isto tako, nakon 5to su popunjene rezerve glikogena, viSak glukoze pretvara se u mast, tj. intenzivira se

va glikogene zau

proces lipogeneze.

lnzulin potide procese kojima se glukoza uklanja iz cirkulacije i ulazi u tkiva koja su osjedjiva na inzulin pa tako inzulin stimulira ulazak glukoze u stanice miSiinoga i masnoga tkiva. Dok je za ulazak glukoze u ove stanice potreban inzulin, u eritrocite, stanice jetre i SZS-a glukoza ulazi pasivno i za to nije potreban inzulin. Inzulin zatim stimulira glikolizu, glikogenezu, sintezu proteina, a inhibira glukoneogenezu, glikogenolizu, lipolizu, ketogenezu i proteolizu. ZalrJjutno, inzulin djeluje na smanjenje koncentracije glukoze i slobodnih masnih kiselina u lrvi rc sprjetava pojavu ketonskih spojeva. Na izludivanje inzulina, osim koncentracije same glukoze u krvi, stimulativno djeluju neke aminokiseline, kao arginin i leucin, te hormon iz tankoga crijeva koji se viSe izluduje pri peroralnom uzimanju glukoze. Lutenje inzulina pospjesuju i deri vati sulfanil-ureje (Tolbutamid, Diabinese, Meldian, Euglucon), pa se u tu svrhu i rabe u terapiji Seierne bolesti. Glukagon je polipeptid koji stvaraju a-stanice Langerhansovih ototiia. Sastoji se od 29 aminokiselina i ima djelovanje suprotno inzulinu, tj. poveiava koncentraciju glukoze u lrvi. Glavni ciljni organ za djelovanje glukagona jesu jetra. Stvaranje glukoze u jetri glukagon pospjeluje procesima glikogenolize i glukoneogeneze. [J manjoj mjeri djeluje i na masno tkivo, gdje stimulira lipolizu. Njegovo lutenje, kao i luienje inzulina, odredeno je koncentracijom glukoze u [rvi. NajsnaZniji poticaj za ludenje glukagona jest smanjena koncentracija glukoze u krvi. Gladovanje

i

stres pospje5uju ludenje glukagona.

111

112

Poglauljt 6

Hormon rasta jest polipeptid

5to ga

luti prednji reianj hipofize. Poveiava koncentraciju glu-

koze, jer sprjetava ulazak i iskoriStavanje glukoze u miSiiima, a pospje3uje glukoneogenezu i

lipo-

lizu te poveiava koncentraciju slobodnih masnih kiselina u krvi. Takoder stimulira sintezu proteina.

Kortizol je hormon kore nadbubreLne Llijezde. Njegovo je luienje sdmulirano ACTH-om. Kortizol stimulira glukoneogenezu te proteolizu i lipolizu i tako poveiava koncentraciju glukoze u krvi. Adrenalin je hormon srii nadbubre LneLlijezdekoji pospjeSuje glikogenolizu. Njegovo djelovanje dolazi napose do izraLajapri stresu i osjeiaju straha. Osim toga, adrenalin inhibira luienje inzulina, a pospjeSuje ludenje glukagona. Adrenalin ima kljutnu ulogu u sludaju kad je poremeieno ludenje glukagona (u tipu I Seierne bolesti). U feokromocitomu, tumoru srZi nadbubreine i:lijezde, pojadano je ludenje adrenalina pa dolazi do hiperglikemije. Somatostatin je polipeptid iz hipotalamusa i D-stanica gu5teratnih ototiia. lnhibira lutenje hormona rasta iz hipofize, kao i ludenje inzulina i glukagona pa time moZe utjecati na njihove koncentracijske odnose. Tiroksin iz ititnjaie takoder ima udjela u regulaciji koncentracije glukoze u krvi. Ponajprije stimulira glikogenolizu i povedava crijevnu apsorpciju glukoze. Ljudski placentni laktogen (HPL) jest polipeptid koji ludi posteljica. Djelovanje mu je su-

protno inzulinu, pa moie dovesti do ketoacidoze u uudnica.

Faktori rasta sliini inzulinu (IGF-I i IGF-2) tine skupinu peptidnih hormona iz rtznih tkiva koji mogu djelovati lokalno. Nadeno je da su anabolitka aktivnost i djelovanje somatotropina na rast povezani s tom skupinom peptidnih hormona. To su relativno male molekule, molekularne mase oko 7,5h.Da.IGF-I (prije poznat kao somatomedin C) pospje5uje rast sranica, dok je fizioloika uloga IGF-2 jo5 nepoznata. Biolo5ki udinak IGF-a otituje se preko specifidnih IGF-receptora ili preko inzulinskog receptora. Inade ti peptidni hormoni stimuliraju sinrezu DNA i RNA te ugradnju sulfata u hrskavicu. Oba, IGF-I i IGF-2, imaju650/o sekvencije aminokiselina iste, dok im je ostalih 35% slidno kao u inzulinu. Iz svega proizlazi daje regulacija koncentracije glukoze u krvi sloieni proces u kojem sudjeluju mnogi hormoni. Organizam je osjedjiviji na smanjenje koncentracije glukoze nego na njezino poveianje. Zato ima viSe hormona koji poveiavaju glikemiju, dok na smanjenje djeluje samo inzulin.

6.4. Promjene koncentracije glukoze u krvi Koncentracija glukoze u krvi odrZava se navedenom hormonalnom regulacijom u granicama od oko 3,3-5,6 mmol/L. Fiziolo$ki dolazi do laganogpoveianjapri stresnim situacijama, strahu ili teSkim naporima zbog jadeg ludenja adrenalina. Nasuprot tomu, u trudnoii se katkad nalaze lagano smanjene koncentracije glukoze. Novorodentad ima odmah nakon rodenja vrlo malu koncentraciju glukoze u [rvi, oko 1,8 mmol/L, koja se u prvih 5 dana Zivota poveia na oko 2,5

mmol/L, a tijekom prve godine iivota pribliiava

se vrijednostima u odraslih osoba. Razni poremeiaji mehanizama regulacije glukoze uzrokuju poveianje (hiperglikemiju), od-

nosno smanjenje (hipoglikemiju) koncentracije glukoze u krvi. Povedana koncentracija glukoze (hiperglikemija). NajteSii uzrok hiperglikemije jest Seier-

ili

relativan manjak aktivnog inzulina iz guiterate. Hiperglikemija se susreie i pri svim stanjima s poveianim ludenjem adrenalina, Soka, feokromocitoma, teikih opeklina, a i injekcije adrenalina uzrokuju prolaznu hiperglikemiju. Bolesti hipofize i nadbubreine i:lijezde s prekomjernim lutenjem hormona rasta, ACTH ili glukokortikoida uzrokuju hiperglikemiju, pa se ona nalazi kod gigantizma i akromegalije (horna bolest. Uzrok je toj bolesti apsolutan

Ugljikohidratt 113 mon rasta) te Cushingova sindroma (hiperfunkcija nadbubreine t,lijezde). Sekundarna hiperglikemija prati i akutni panlreatitis, rjede lronitni pankreatitis i karcinom gu5teraie (manjak inzulina). Hiperglikemija se takoder nalaziahipertireozi zbog djelovanja tiroksina te u encefalopati-

j*". Smanjena koncentracija glukoze (hipoglikemija). Postoj e razniuzroci hipoglikemije, iako se susreie rjede od hiperglikemija. O hipoglikemiji se govori kada je koncentracija glukoze u krvi manja od 2,5 mmol/L,prema nekim autorima manja od 3,5 mmoUL. Adrenalin nakon prolazne hiperglikemije uzrokuje klasitne simptome hipoglikemije: drhtanje, znojenje, mudninu, ubrzano bilo, glad i osjedjivost na wjedo. Pri vrlo malim koncentracijama glukoze od oko 1,5 mmol/L dolazi do teSke disfunkcije SZS-a koja se odituje sljedeiim simptomima: glavobolja, komeSanje, zamagljen vid, wtoglavica pa tak i smrt. Ti su simptomi poznati pod nazivom neuroglikopenija. Toksitna hipoglikemija nastaje zbog vi5ka egzogenog inzulina ili oralnog hipoglikemika (npr. predug razmak od inzulinske injekcije do obroka). Kod inzulinoma dolazi do ludenja viSka endogenog inzulina (gu5teradna hipoglikemija). Razlitite jetrene bolesti uzrokuju poreme iaj u skladi5renju, odnosno oslobadanju glikogena (akutni hepatitis, ciroza jetara, metastaze u jetrima, kao i toksitna olteienja jetara tetraklorugljikom, arsenom, kloroformom, fosforom i drugim hepatoroksidnim agensima), Sto dovodi do hepatidne hipoglikemije. Hipoglikemija se nalazi takoder u glikogenozama, osobito u glikogenozi tipa I (von Gierke) pri kojoj postoji manjak glukoza-6-fosfa:aze,pa se glikogen ne moie razgraditiu glukozu. Endokrina se hipoglikemijanalazi u hipopiruitarizmu (manjak ACTH dovodi do manjka ko rtizola) i hipoadrenalizmu (manjak kortizola). Eranol moZe prouzrotiti hipoglikemiju inhibiranjem glukoneogeneze (alkoholna hipoglikemi-

ja). Hipoglikemija se nalazi i u lronitnoj bubreinoj bolesti (nakupljanje veie kolidine lijeka u djelu). Uzrok su hipoglikemije i izostajanje obroka i prekomjerna tjelesna aktivnost. Svakom bolesniku sa sumnjom na hipoglikemiju treba dati glukozu odmah nakon uzimanja krvi za analizu. U blaiim oblicima hipoglikemije, ako nije do5lo do teSkih neuroglikopenidnih simptoma, dovoljno je uzeti malo Seiera peroralno (bombon, komadii tokolade, voini sok, zasladena voda). Teii oblici hipoglikemije zahtijevaju parenteralnu primjenu glukoze.

6.4.1. Seterna bolest Seierna bolest (diabetes mellitus) kroniini je metabolidki sindrom nastao zbog apsolumog i,/ili relativnog manjka inzulina, a karakteriziran je lronidnom hiperglikemijom koju prate poremeiaji u metabolizmu ugljikohidrata, masti i proteina. Manjak inzulina uzrokuje niz patolo5kih promjena. Glukoza ne moZe uii u stanice mi5iia i adipocite ; pojadana je glikogenoliza, a inhibirana glikogeneza, inhibiran je takoder metabolizam

{v,koza-6-fosfata putem pentoznog ciklusa i smanjena je glikoliza. Sve to dovodi do poveianja koncentracije glukoze u krvi. Takoder je inhibirana lipogeneza, a pojadana lipoliza, zbog lipolize s€ swara vi5e acetil-CoA, inhibiran je ciklus limunske kiseline i inhibirana je sinteza proteina. Te metabolidke promjene imaju kao posljedicu swaranje ketonskih spojeva (iz acetil-CoA), poveianje koncentracije slobodnih masnih kiselina, triglicerida i kolesterola u lavi (lipoliza) rc porast koncentracije aminokiselina u krvi (smanjena sinteza proteina). U wijetu je registrirano oko 190 milijuna osoba sa Seiernom boleSiu, a, prema procjenama SZO-a i IDF-a (International Diabetes Federation), taj ie se broj do godine 2025. povetari na 3O0 milijuna. U Hrvatskoj je viSe od 170.000 osoba sa Seiernom bolesiu a procjenjuje se da je reod>Stiftman l1,l

mmol/L,

b) wijednost

glukoze nata5te u plazmi > 7,0 mmol/L

ili

Ugljikohidrati 119 c) vrijednost glukoze

y.

2 sata nakon optereienja u

OGTT (glikemija u 120. minuti) > 11,1 mmol/

L. Ako je zadovoljen bilo koji od ovih triju krirerija, potvrdno odredivanje sljedeiegdana nuZno postavlany. ji,;"grro".. Ponovljeno odredivanje glukoze nije potrebno za bolesnike s nedvos-

"a mislenom hiperglikemijom i akutnom metaboliikom dekompenzacijom. SZO preporutuje redovitu kontrolu glukoze u asimptomatskih osoba > 45 godina svake 3 godine, a jedinom godilnle u osoba s poveianim rizikom za nastanak Seierne bolesti: pozitivna Seieine bolesti, ranije prisutni IGT ili IFG, pretilost (BMI > 30), hipertenIbitelska "n"-rr.r" < mmol/L zija (Lrvni rJak> I4O/90 mmHg), sindrom policistitnih ovarija, HDl-kolesterol 0,9

i/ili

trigliceri di > 2,82 mmol/L i Zene koje su rodile djecu mase > 4,5 kg.

Zairatenje tijeka Seierne bolesti i uspjeinosti lijeienjaprimjenjuje se odredivanje HbAlc. pr.porok" je ivim bolesnicima odrediti HbAt. najmanje dvaput godiSnle kako bi se dokazala konltrola glikemije. Za rano otkrivanje oSreienja bubrega pri Seiernoj bolesti treba odrediti tzv. mikroalbimirrorilo. GodiSnle odredivanje mikroalbuminurije u bolesnika bez klinitke proteinurije treba zapoieti 5 godina nakon postavljanj a dijagnoze tipa I Seierne bolesti i u vrijeme Postavrip^Z Seierne bolesti. Za procjenu rizika i progresije- kardiovaskularnih komplilianja dijagno "e k".i1" tt b" svim odraslim osobama sa Seiernom boleSiu godi5nje odrediti lipidni profil. Odredivanje koncentracije glukoze u krvi Krv

za odredivanje koncentracije glukoze uzima se ujutro, nakon 5to je osoba gladovala tije-

kom noii (barem S sati). Koncentracija glukoze moZe se odrediti u venskoj krvi ili plazmi te u kapilarnoj krvi ili plazmi. U punoj krvi koncentracija glukoze in uitro smanjuje se s vremenom tbog glikolize. Naime, stajanjem krvi dolazi do razgradnje glukoze djelovanjem glikolititkih enn^;;eritrocita, leukocita i bakterija. Smanjenje koncentracije glukoze iznosi 5-7o/o svakog sata ,.0,5 mmol/L). Glikoliza se moZe sprijetiti na nekoliko natina: 1. odvajanjem plazme neposredno nakon uzimanjakrvi. Venska se krv centrifugira najkasnije 30 minuta nakon :uzimania.Plez4"C, a, ma se odmah prenese u drugu epruveru. U takvom uzorku glukoza je stabilna 24 sata na

,."bilnor. glukoze znatno je dulja (72 satana4"C).2. ghkoliza se moie ,ma.tliiii"hibicijom glikoliriikih eiola"as natrijevim fluoridom Q,5 mg/mLkrvi) ili rjede s litiinim jodoacetarom (b,5 -g/-t krvi). Natrijev fluorid veLe Mgz* koji ie vai:an za akdvnost en-

eko su epruveie sterilne,

zima glikolize (koncentracija glukoze onda ostaje nepromijenjena tijekom 3 dana na sobnoj tempcrarJri). Ovi se inhibitori glikolize upotrebljavaju zasebno ili teSie uz antikoagulans litijev he-

pcrin. Najtesie se rabe ,t"rrq.ln fluorid i heparin (2'0 mgnatrijeva fuorida + 75IU heparina/l nL krvi). 3. uzimanjem kapilarne lrvi izravno u deproteiniziraitti medil. U talcvom se uzorku glukoza moze odrediti odmah, nakon nekoliko sati pa sve do sljedeieg dana. Referentne vrijednosti razlikuju se ovisno o uzorku u kojem se odreduje koncentracija qlykodijagnoze Seierne bolesti preporuiena je venska plazma. Molalnost gl"!t^ E^zapostavljanje upunoj krvi iupiazmiistovjetnaje. Iako su eritrociti stanice koje slobodno propu5taju glukozu koncentracija vode (kg/L) u plazmi je - llo/o veia nego u punoj ftrvi Gz staniinu

-.rrrbr*o,

aLo je

hematolrit normalan. Koncentracija glukoze u hepariniziranoj plazmi je

5o/o

manja nego

u plazmu zbog utjecaja anti,q serumu. Ta se pojava moie pripisati pomaku tekuiine iz eritrocita &oagulansa.

&4.r.6. Metode za odrecfivanje koncentracije glukoze u krvi Za odredivanje koncenrracije glukoze u krvi preporuka je koristiti se enzimskim metodama s hctsokinazom i G-6-PD ili glukoza-oksidazom. Metoda s heksokinazom i G-6-PD referenme su glukoze. Premda obje metode imaju malu analitiiku nePremtode za odredivanj. korr..^t ".ije u ciznost pri vrijednosii-" od 7,0 mmol/L i 11,1 mmol /L gdjeje dijagnostiiki prag odlutivanja

12O

Poglaufe 6

procjeni glukoze nataite u plazmi i nakon optereienja, pogrjeSke u klasificiranju mogu biti posljedica relativno velikih intraindividualnih bioloSkih varijacija (CV S-7yo).

Metoda s heksokinazom Metoda s heksokinazom (HK) i G-6-PD specifidna je i pogodna za odredivanje glukoze u plazmi,likvoru i mokraii. Glukoza se u prisutnosti AIP-a djelovanjem HK i Mgz+ fosforilira u glukoza-6-fosfat, a ovaj se djelovanjem G-6-PD i NADP* oksidira u 6-fosfoglukonat. Mjeri se poveianje koncentracije NADPH na 340 nm: glukoza +

AIP

glukoza-6-fosfar + NADP+

HK

'

G-6-PD

glukoza-6-fosfat + ADP

> 6-fosfoglukonat + NADPH + H+.

Ova je metoda strogo specifidna jer, iako u reakciji

heksokinazom, mogu reagirati i fosforilirati se druge heksoze, u drugoj reakciji, G-6-PD oksidira samo glukoz*6-fosfat, dok na fosforne estere fruktoze ili manoze ne djeluje. Osim toga 3to je specifidna za glukozu, ima i drugih prednosti - osjetljiva je, totna ibrza, te se njome moie obuhvatiri Siroko podrutje koncentracija od vrlo malih do velikih. Takoder ima prednost pred metodom s glukoza-oksidazom jer urari, askorbinska kiselina i druge reducirajuie tvari ne utjetu na rezultat. Neki lijekovi, npr. baralgin, koji interferiraju pri odredivanju glukoze s glukoza-oksidazom, ne smetaju pri odredivanju s heksokinazom. s

Metoda s glukoza-oksidazom U primarnoj reakciji, glukoza se oksidira u prisutnosti glukoza-oksidaze (GOD) na glukonolakton, odnosno glukonsku kiselinu uz stvaranje vodikovaperoksida. GOD je specifidna zap-D-glukozu koje u krvi ima 640/o. Ostalih 360/o tini a-D-glukoza. Radi toga se u reakcijsku smjesu dodaje mutarotaza ili do pretvorbe a-D-glukoze u p-D-glukozu dolazi spontano, inkubacijom. U indikatorskoj reakciji mjeri se nastali vodikov peroksid koji u prisutnosti peroksidaze (POD) oksidira kromogen (akceptor vodika) koji prelazi u obojeni spoj. Kao kromogen najde5ie se rabi 4-aminoantip irin-Z,4- diHorfenol (PAP). Nekoi se kao kromogen desto upotrebljavala diamonijeva sol2,2-azino-di-(3-etilbenzodazolin-2-sulfonske kiseline), ABTS (benzidinski derivati su karcinogeni). p-D-glukoza + O,

-g--*-

glukonska kiselina + HrOr (primarna reakcija)

HrOr+ neobojeni lromogen PoD > obojeni kromogen + H2O (indikatorska

reakcija).

U metodi s GOD-om primarna je reakcija oksidacije glukoze specifidna, ali indikarorska reakcija, u kojoj HrO, oksidira kromogen, nije, jer interferiraju askorbinska kiselina, urad, homogentizinska kiselina, adrenalin, hidrokinon i bilirubin-glukuronid koji se oksidiraju umjesto lromogena i dovode do niskih rezultata. Th interferencija dolazi manje do izraLajau ftrvi, a viSe ako se odredivanje provodi u mokraii koja sadrZava viSe redukdvnih tvari. I raznioksidansi, npr. hipoklorit, mogu oksidirati kromogen i biti uzrokom previsokih rezultata. Oksidacija glukoze moie se pratiti i mjerenjem utro5enog kisika s pomoiu specifidne elekrrode za kisik. Na tom principu radi npr. Beckmanov analizator glukoze. Test oralne tolerancije glukoze

OGTT je osjedjiviji test od odredivanja koncentracije glukoze naralte, ali ga karakterizira ADA ne preporutuje uporabu OGTT-a za postaylianje dijagnoze tipa I ili tipa 2 Seierne bolesti, nego samo za postavljanie dijagnoze trudnidke Seierne bolesti i kad je

slaba ponovljivost.

Uglikobidrati 121 vrijednost glukoze u krvi dvosmislena. SZO preporutuje utiniti OGTT kad je god to moguie, Sto podriava i Hrvatski odbor za dijabetes. eimbenici koji utjedu na slabu ponovljivost OGTT-a obuhvaiaju bioloSku varijabilnost koncentracije glukoze u plazmi, utjecaj temperature okoliSa i varijabilnost uvjeta pri uzimanju hiperosmolalne otopine glukoze. Test je standardiziran i provodi se ujutro nakon najmanje trodnevne ugljikohidratne, ne' restriktivne dijete (najmanje 150 g na dan) i normalne fizidke aktivnosti. Ispitanik 12 sati prije testa ne smije jesti, piti i puSiti niti se tei:e fizitlt umarati. Pola sata prije testa mora mirovati i sjediti. Neposredno nakon uzimanja uzorka krvi odraslom se ispitaniku daje75 g glukoze u 300 mL vode tijekom 5 minuta. Standardno optereienje glukoze za djecu iznosi 1,75 g/kg tjelesne mase. Ispitaniku se krv ponovno uzme 120 minuta nakon optereienja. Tijekom testa skuplja se i mokraia. Kad se u organizam unese 75 g glukoze, koncentracija glukoze u krvi potinje rasti. Porast uzrokuje pojadano swaranje i lutenje inzulina, smanjuju se glikogenoliza i glukoneogeneza, a intenzivira se ulazak glukoze u miSiie, jetru i ostala tkiva, gdje se, osobito u jetri, intenzivnije obavlja glikogeneza, a pojadavaju se i glikoliza i oksidacija glukoze. Sve to uzrokuje da se koncentracija glukoze u krvi opet smanji. Kad se koncentracija dovoljno smanji, regulacijski mehanizam potinje djelovati u smislu jadeg ludenja antagonista

inzulina, ponajprije glukagona i hormona rasta, ali i glukokordkoida i adrenalina, pa se smanjenje koncentracrje glukoze zaustavlja. Zdrav dovjek reagira na optereienje glukozom tako da mu koncentrrcija glukoze u krvi raste tijekom 30-60 minuta i dosegne maksimum oko S\o/oveii od podetne vrijednosti natalte, a onda se dva sata nakon toga opet normalizira. U Seiernoj bolesti nema dovoljno inzulina ili se polaganije ludi, pa ie zato porast glikemije, uzrokovan optereienjem glukozoln, jade izraten i dulje uaje nego normalno. Koliko krivulja odstupa od normalne krivulje, ovisi o reLini bolesti, tj. o rome je li manjak inzulina manji ili ve ii (sl. 6- 12.). U tablici 6-3. prikazane su vrijednosti OGTT-a u dijagnostici Seierne bolesd i ostalih kategorija hiperglikemija. Od vanjskih utjecaja na rezultate

OGTT-a ponajvi5e utjedu godine tako da se nakon 50. godine otekuje porast od 0,6 mmol/L po sva-

Tablica 6-3. Dijagnostiike koncentracije glukoze za Seiernu bolest i druge kategorije hiperglikemije prema SZO-u i21999. godine

>6,7 >6,1 > 10,0 ) 1 1,1 optere(enja,glukozom ,,

>7,0, >l 1,1

>'12,2

:

7,A

l

POre

ze ttGTi

<

n6ta$,,t9"',,i'-"' .' rl ::

.rt:

:::, tr:,r.,,:lt:::.:,.r,

::..::a,a::

:

.l

t':.

:

?tsat$"fifik$fi

6,7

6,1

(

6,

a7,A

- 10,0 7 ,8- 10,0 7 ,8- 1 ,1 1

8,9

-

12,2

optereienja glukozorn

Poremetajgfuko=*.nbt,Ete{fFG}''.'.'...'

mmol/L

teika 5eierna bolest

kom desetljeiu.

6.4.2. Hemoglobin A1c HbAlc nastaje glikacijoffi, odnosno procesom neenzimskoga kovalenmo g vezanja gluko ze na slo-

laka 5e(erna bolest

bodne aminoskupine globinskih lanaca. Procesu glikacije podlotni su svi proteini, a, razlikuje se od

i perfu n kcija 5titnjaie normalna oSte(enja jetre

h

glikozilacije, koja dini enzimsku fazu u sintezi mem-

branskih i drugih glikoproteina. U prvom stupnju glikacije nastaju nestabilne i reverzibilne Schiffove 6aze s aminoskupinama terminalnog valina. Ketimini se potom polagano pregrupiraju (Amadorijeva reakcija) stvarajuii stabilnu kovalentnu yeztr. Tako

90 124 50 180 1

min

Slika 6-12. Krivulja OGTT-a kod Seierne bolesti, hiperfunkcije Stitnjate i oiteienja jetre.

122

PoglauAt 6

promijenjen hemoglobin podloZniji je razgradnji i ima promijenjen povr3inski naboj. Kolitina nastalog HbA 1 c izravno je razmjerna koncentraciji glukoze.

Eritrociti zdravog dovjeka sadrZavaju

907o

HbA, a ostatak iine produkti alternativne

sinreze

globina (HbA2, HbF), te posttranslacijskih modifikacija HbA. Kromatografijom s kationskim izmjenjivatem odvojene su tri manje hemoglobinske komponente s jadim negativnim nabojem od HbA. Prema redoslijedu ispiranja s kolone kationskog izmjenjivada komponente su nazvane HbAla, HbAlb i HbAlc. HbAlc je izravni produkt posttranslacijskog vezanja glukoze na molekule hemoglobina i postoji povezanost izmedu HbAlc i prosjedne koncentracije glukoze u kni tijekom prethodnih 5-10 tjedana unatrag, koliki je iivotni vijek eritrocita s tako nestabilnim hemoglobinom. HbAlc je >zlatni standard.. za klinidko praienje Seierne bolesti. Ako je vrijednost HbAlc < 7o/o, ro znati da je terapija uspjelna, odnosno da je rizik za razvoj komplikacija Seierne bolesri minimalan. Na pouzdanost primjene HbAlc u klinitkol praksi znatno utjetu raznovrsna metodologija. varijabilnost kemijskih entiteta nastalih glikacijom hemoglobina i nepostojanje primarnoga referentnog materijala. Godin e 2002. objavljena je lFCC-referentna metoda za odredivanje HbAlc. No, primjena ove metode onemoguiena je zbog znatno niZih vrijednosti HbAlc u odnosu na vrijednosti dobivene DCCT/UKPDS (Diabetes Control nad Cornplications Thial/United Kingdorn Prospectiue Diabetes Stufu) referentnom metodom (HPLC na koloni BioRex) na kojima se temelje smjernice i standardi zapratenje Seierne bolesti. Zbogrcgaje preporuka do daljnjega rezultate HbAlc izrai,avati u DCCT-ekvivalentima, a metode koje su preporudene ukljuduju metode kationske izmjene, imunokemije, elektroforeze i afinitetnogvezanja koje imaju certificiranu sljedivost prema DCCT/UKPDS standardu.

6.4.3. Mikroalbuminurija Manifestnoj dijabeddkoj nefropatiji uvijek godinama prethodi povremena ili trajna mikroalbuminurija (minimalna albuminurija). Milroalbuminurija je definirana kao izlutivanje 30-300 mg albumina/du ili 30-300 mg/mg kreatinina li20-200 mg/min u dva od mi uzorka skupljene mokraie (zbog visoke intraindividualne varijacije). Nastaje kao posljedica glikacije bazalne membrane glomerula, 3to nakon nekoliko godina rezultira dijabetitkom nefropatijom. Bolesnici s tipom I i tipom 2 Seierne bolesti i mikroalbuminurijom imaju poveian rizik zaraz,roi kardiovaskularne bolesti. Uobidajene testne trake koje se rabe za odredivanje proteina u mokraci nisu dovoljno osjetljive da otkriju male koncentracije albumina u potetnoj fazi nefropatije. U ru svrhu primjenjuju se osjedjivije testne trake na principu imunokromatografije. Rano otkrivanje mikroalbuminurije omoguiuje i ranu intervenciju sa svrhom odgadanja podetka dijabetidke nefropatije. Osim dijagnostiike wUednosti, mikroalbuminurija ima i prognostidku wijednost. Naime, u 80% bolesnika s tipom I Seierne bolesti i mikroalbuminurijom tijekom sljedeiih 10-li godina razvija se klinitki manifestna proteinurija.

6.4.4. Fruktozamin Neenzimsko vezanje glukoze za aminoskupine serumskih proteina rezultira nasrankom ketoamina. Albumin je najzastupljeniji serumski protein, pa se naziv fruktozamin odnosi na ketoamin koji nastaje interakcijom glukoze s e-aminoskupinom lizina u albuminskoj molekuli. Kako je vrijeme zadrLavanja albumina u cirkulaciji 14-20 dana, fruktozarnin odratava stanje glikemije u znamo lraiem razdoblju (Z-3 tiedna) u odnosu na HbAlc. Zbogtoga mjerenje frukrozamina moZe biti korisno u praienju uudnica s trudnitkom Seiernom bolesti i pri promjeni terapije.

Ugfikohidrati 123 Albumin je takoder podloiniji promjenama koncentracije u brojnim patolo5kim stanjima (razne upale, gubitci putem bubrega i probavnoga trakta), medutim u sludajevima kad mjerenje ne daje pouzdane rezultate

HbAlc

(hemolitiika anemija, hemoglobinopatrje), odredivanje fruktozamina

moie imati klinitku vrijednost.

6.4.s. Ketonskispojevi Acetoacerar, p-hidroksimaslatna kiselina i aceton, produkti su razgradnje slobodnih masnih kiselina. Poveiane koncentracije upuiuju na razvoj komplikacija (dijabetidka ketoacidoza) koje zahtijevaju himu medicinsku slrb. Keconski spojevi u krvi ili mokraii ueba odredivad kao pomoi u dijagnostici akutne dijabetidke ketoacidoze. Dva su mehanizma pojave velike koncentracije ketonskih spojeva u bolesnika sa Seiernom boleiiu, pojadano nastajanje iz triglicerida ili smanjena razgradnja u jetri, a oba su procesa uzrokovana manjkom inzulina. Ketonski spojevi normalno su prisutni u mokraii i krvi u vrlo malim koncentracijama (< 0,5 mmol /L).Zanjihovo se dokazivanje upotrebljavaju testne trake, a odredivanje se temelji na stvaranju ljubidasto-crvenog kompleksa izmedu ketonskih spojeva, ponajprije acetoacetata i nitroprusida.

Literatura l.

Adeghate E. Diabetes mellitus

-

Multifactorial in aetiology and global in prevalence. Arch Physiol Biochem 2001;

109:197-9. 2. American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus, Diabetes Car.e 2004;27:55-

st0. 3. LeahyJL. Pathogenesis oftype 2 diabetes mellitus. Arch Med Res 2005; 36:197-209. 4. Mlinar B, Marc J, Pfeifer M. Molekularni mehanizmi inzulinske rezistencije, pretilosti i metabolilkog sindroma. Biochemia Medica, 2006t 16:8-24. 5. Sacls DB. Carbohydrates. U: Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, ur. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics,4. izd. St. Louis: Elsevier Saunde rs,2006:837-901. 6. Sacks DB, Bruns DE, Goldstein DE, MaclarenNK, McDonaldJM, Parrott M, The National Academy of Clinical Biochemistry: Guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus. Clin Chem 2002;48:436-72.

7. Stipandii G. MODY-dijabetes. Pediatr Croat 2003;472147-50. 8. Topii E, ur. New trends in classification, monitoring and management of metabolic syndrome. Handbook of the 6th FESCC Continuous Postgraduate Course in Clinical Chemistry. Dubrovnik,2006. 9. Topic E, Primorac D, Jankovii S, ur. Medicinskobiokemijska dijagnostika u klinidkoj praksi. Zagreb: Medicinska naklada, 2004. 123-33. 10. Vuiii-Lovrentii M, Topii E. Hemoglobin Alc: Standardizacija >>zlamogstandarda... Biochemia Medica 2006; 16:25-36. ll. \?'orld Health Organization. Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycemia. 2006.

7

Poglaulje

Lipidi i tipoproteini BoZidar Straus, Jozsef Petrik

Lipidi (ili masti) imaju znatajnu ulogu u ljudskom organizmu, oni su izvor

fl,:',ffi[f1l,|li,fifi-* 'i,o

energije, mogu stvarari energijske priduve, glavni su sastojci stanidnih membrana te su znadajni u stanidnoj signalizaciji, bilo kao steroidni hormoni bilo kao

125 177 () dasnidke molekule. j:: Pod nazivom lipidi razumijeva se skup raznolikih kemijskih spojeva kojima 729 ,n je zajednidko svojstvo da su netopljive u vodi, a topljive u nepolarnim organ60 skim otapalima, kao 5to su eter, kloroform, petroleter i sl.

Fosfolipidi

Glikolipidi Neosapunjive wari

Lipidi u organizmu Apsorpcrja lipida

lipidiukn* Masne kheline

13?

Pmstaglandini

135

Triglireridi

136

Fosfolipidi

137

(olesterol

138

7J.

Klasifikacija i kemija lipida

Ima nekoliko klasifikacija lipida. Mogu se podijeliti i na sledeii nadin: 1. H#;:l**r,ip0pr0reina T jednostavni lipidi: a) triacilgliceroli ili trigliceridi ili neutralni lipidi i b) voskovi 143 r# te 2. sloteni lipidi: a) fosfolipidi, b) glikolipidi i c) neosapunjive tvari. Apolipoproteini 144 Jednostavni lipidi sadrZavaju samo masne kiseline i neki alkohol. U lipidima lleabdiramlipwnrrina 145 je alkohol glicerol, a u voskovima je to neki alkohol veie molekularne mase (celipoproteina '" ,ou tilni' miricilni)' tt*,nri't-itto,o-i-J,nii, Klasifi kacija

lipoproteina

Funkcija apolipoproteina

Poremecajimetabolizma

Sekundarne

147

hiperlipoproteinemije

Laboratorijska drlagnostika poremeiaja

lipoproteina

151 151

uetodeodredivaqpromentndJe 7.1.1. Triacilgliceroli (trigliceridi) lipidr,lipopmteinaiapolipopmtelna

153

Metodeodredivanjakoncentracijetriglicedda

15i

Metodeodredivanjakoncentracijekolesterola

155

u trigliceridima su hidroksilne skupine glicerola MetodeodredivaniaHDl-kolesterola 156 lititim masnim kiselinama. Metode odredivanja LDl-kolesterola Hr- C- O- R Metodeodredivanja koncentncijelipoproteina(a)

esterificirane istom ili raz-

157

158

lzvorvarijacija u odredivanju lipida i

lipoproteina

158

Metodeodredivanjakoncentracijeapolipoproteina 159

H2-

Noviji analiti vezani uz metabolizam lipoproteina, aterogenezu i kardiovaskularna

oSte(enja

H-c-o-& C-O-&

160

Sve masne kiseline koje se nalaze

u organizmu jesu zasiiene i

nezasiiene

masne kiseline s parnim brojem C-atoma. Masne kiseline s 4-8 C-atoma teku-

124

Lipidi i

lipoproteirui 125

one s 8-12 C-atoma imaju uljnu konzistenciju, a one s viSe C-atoma su tvrste. Osim zasiienih masnih kiselina, u organizmu se nalaze i jednostruko ili viSestruko nezasiiene masne kiseline (tabl. 7-1.).

6e su,

Tablica 7-1. Masne kiseline

maslatna

4

cHJCH2)2COOH

kapronska

6

cH3(cH2)4cooH

kaprilna

8

cH3(cH2)6cooH

kaprinska

10

cH3{cH2)scooH

Iaurinska

12

cH3(cH2)rocooH

miristinska

't4

cH3(cH2)12cooH

palmitinska

16

cH3{cH2}rlcooH

stearinska

18

cH3{cHa16cooH

arahidinska

20

cH3(cH2)18cooH

lignocerinska

24

cH3(cH2)22cooH

palmitoleinska

16

1

CU(CH2)?CH : CH(CH,)'COOH

oleinska

t8

1

CH3(CF|2)7CH : CH(CH')?COOH

nervonska

24

1

CH3{CH2)?CH : CH(CHr) r 3COOH

linolna

18

2

CH3(CH')4CH : CHCHTCH : CH(CH')?COOH

linolenska

18

3

CH3 CH2 CH : CHCHTCH : CHCHTCH : CH{CH2)7COOH

arahidonska

2A

4

CH3{CH2}4CH : {CHCHTCH)3CH(CH2)3COOH

Od navedenih masnih kiselina, u ljudskom

organizmu najvi$e nalaze palmitinska, stearinska, palmitoleinska i oleinska kiselina. Vi3estruko nezasiiene linolna, linolenska i arahidonska kiselina za organizam su esencijalne, 5to znaii da ih treba unositi hranom, jer se ne mogu sintetizirati. Te viSestruko nezasiiene kiseline, nazvane i vitaminom F, porebne su za pravilan rast i pravilno obavljanje metabolidkih procesa u kojima tvore ishodiSne molekule za biosintezu niza medijatora poput prostaglandina, leukotriena i dr. Tligliceridi u ljudskom organizmu mogu stvoriti energijske priduve, ponajprije u potkoZnome tkivu, ali i u drugim dijelovima tijela. Oni su energijski najbogatiji prirodni spojevi (39 kJ/S). tigliceridi su netopljivi u vodi. Dodatkom luZine (NaOH ili NarCOr) ili proteina daju stabilnu emulziju, jer se oko kapljica lipida stvara haptogena opna sapuna ili proteina koja sprjedava sjedinjavanje manjih u veie kapi. Kuhanjem s NaOH ili KOH trigliceridi se saponificiraju i stvaraju se slobodni glicerol i odgovarajuii sapuni, tj. natrijeve ili kalijeve soli masnih kiselina. TaliSte lipida ovisi o odnosu zasiienih i nezasiienih masnih kiselina te o duljini lanca masnih kiselina. Tali5te se smanjuje s relativnim porastom nezasiienih i masnih kiselina kraiih lanaca.

7.1.2. Fosfolipid

se

i

Fosfolipidi (ili fosfogliceridi) sasavlieni su od glicerola esterificiranog dvjema masnim kiselinama, od kojih je barem jedna nezasiiena, i fosfatne kiseline na koju jevezanajoS jedna du5ikova baza. Kao duSikovebazeu fosfolipidima sluZe kolamin (aminoetilni alkohol) i

kolin (oksietil-tri-

metilamonijev hidroksid) te aminokiselina serin (a-amino-p-oksipropionska kiselina):

126

Poglaulje 7

cH20H

cH2-cHr-oH

CH.,OH

cH2NH2

N(CH3)3

CHNH,

OH

COOH kolin

kolamin

tt-

serin

Prema tome koji od navedenih duSikovih spojeva sadrZavaju, fosfolipidi se dijele na: 1.

kefaline (fosfatidil-kolamin),2.lecitine (fosfatidil-kolin) i 3. fosfatidil-serin:

o cH2o-c-R, lt

lo Itt cHo- c-& lo Irr

o cH2o-c-R,

o cH2o-c-R,

il

il

lo lIt cHo- c-& lo Irr

lo Irr cHo- c-& loNH, I tt

cH2o- p-ocHzcH2NH2 cH2o- p-ocH2cHrN(cH3)3 cH2o-

tlt OH

OH

a-kefalin

a-lecitin

OH

l-

P-ocHf cH-cooH I

OH a-fosfatidil-serin

Svi se fosfolipidi sastoje od dvaju ugljikovodikovih lanaca koji dine nepolarni dio moIekule te od polarnog dilela koji sadrLavafosfatnu skupinu uz odgovarajuie supstituente.

Fosfolipidi su ropljivi u alkoholu i u ostalim organskim orapalima, ali se ne rope u aceronu. Kefalini su slabije topljivi u alkoholu od lecitina. Fosfolipida ima u membranama gotovo svih stanica, a osobito su njima bogate stanice SZS-a. U krvi se transportiraju vezani u lipoproteinima, a najviSe ih ima u lipoproteinima visoke gustoie (a-lipoproteini). Lecitini, kefalini i fosfatidil-serin nazivaju se zajednidkim nazivom monoaminofosfaddi, jer svi sadriavaju jedan du5ik. No, ima fosfolipida koji ne sadrZavaju duSikovu bazu. To su inozitolfosfaddi ili lipoziroli. Ovi spojevi umjesto glicerola imaju hidroaromatski alkohol inozitol esterificiran s dvije molekule fosfatne kiseline, na koje su vezane dvije masne kiseline: OH I

i-l-oocR, HO

oH ort

HO

o

I

-

i -oocR,

o

inozitolfosfatid

Inozitol fosfatidi su po topljivosti slidni kefalinima. Ima ih u mozgu. Posebnu skupinu monoaminofosfatida tine acetal-fosfolipidi ili plazmalogeni. Plazmalogena ima u iivtanome tkivu, jetri i, manje u drugim organima. U plazmalogenima, umjesto dviju masnih kiselina, nalazi se aldehid masne kiseline yezan za glicerol u obliku acetala, a ue(a hidroksilna skupina glicerola, kao i kod drugih monoaminofosfatida, esterificirana je fosfamom kiselinom na koju je vezana du5ikova baza:

Lipidi i

lipoproteini 127

H,g_ol | ,rcH-criH3r HC-O'

loH Ir H2C-O- P-OCH2CH2NH2 il

o a-palmital plazmalogen

Sfingomijelini gozin:

su

diaminofosfatidi koji ne sadriavaju glicerol, nego aminoalkohol sfin-

oH cH3(cH2)

"-

T",

cH- cH- 3n- cH- cH,oH sfingozin

U sfingomijelinima je fosfatna kiselina esterski vezanana primarnu OH-skupinu sfingozina,a masna je kiselin ayezanaamidnom v€zom. Osim alkohola, fosfame i jedne masne kiseline, sadriavaju dulikovu bazu vezanu na fosfatnu kiselinu:

*-?:o

cH3(cH2)

"-

OHNH ? cH:cH- cH- cH- cH,- o - 'l

p

o

- cHz-

?i

cH2- N(CH3)3

OH sfingomiielin

Sfingomijelini su topljivi u vruiem eteru i alkoholu, a iz hladnog se taloZe, dok su n.rop!i1'i u aceronu. Ima ih u SZS-u, a nalaze se i u krvi. Poveiana koncentraclia sfingomijelina u jetri, slezeni i u drugim tkivim a nalazi se npr. u Niemann-Pickovoj bolesti (v. pogl. 24.).

7.1.3. Glikolipidi Ovi sloZeni lipidi gradeni su od alkohola sfingozina, masne kiseline i Seiera galaktoze, a rjede od gluko ze. tJ tu skupinu ubrajaju se cerebrozidi, sulfolipidi (ili sulfatidi) i gangliozidi. Cerebrozidi, koji su dobili naziv po rome 3to ih ima u mozgu, sadrZavaju zasiiene i nezasiiene masne kiseline s 24 C-aroma u lancu (tabl. 7-2.), koje su Yezane amidnom vezom na sfingozin, te heksozu yezanu preko primarne OH-skupine sfingozina:

*-?:O

masnakiselina

OH NH CH3(CH2),'-CH:Cn-EH-CH- 9H, O- CH- (CHOH)1 CH- CHz- OH

sfingozin

I

lg

galaktoza

Cerebrozida ima u malim koncentracijama u mnogim tkivima, a veie se koncentracije nalaze u iivianome rkivu, bilelol moZdanoj tvari i u mijelinskoj ovojnici iivaca. LJ raznim tkivima, a posebno u jetri i slezeni velike se kolidine nakupljaju u Gaucherovoj bolesti (v. pogI.24.).

128

Poglaulje 7

Tablica 7-2. Masne kiseline u cerebrozidima

kerazin nervon

lignocerinska

cerebron (frenozin)

cerebronska

CHr(CH2)2r

oksinervon

oksinervonska

CH3(CH2),

nervonska

lltr]aOOtCH CH3{CH2)7

-

-

= CH

CHOH

-

CH = CH

-

{CH')'3COOH

COOH

-

(CH2)12CHOH

- COOH

Sulfolipidi sadriavaju iste sastojke kao i cerebrozidi, samo je na C-6 atom galaktoze

Yezana

jo5 i sulfatna kiselina:

OH_NH-COR

CH3(CH2),'-CH:CH-Cu-E"-?",

?

o- cH- (cHoH)'- cH- cH,- o- s- oH

t6

sulfolipid

takoder nalaze u moZdanim stanicama. Gangliozidi su glikolipidi koji sadriavaju masnu kiselinu s 22 ili 24 C-atoma, zatim sfingozin, heksoze, heksozamin i neuraminsku ili sijalinsku kiselinu. U raznim su gangliozidima razliditi odnosi i vrste heksoza, glukoze i galaktoze te heksozamr'

Sulfolipidi

se

na:

COOH

COOH

c:o

C:O

I

I

CH,

t'

HOCH HCNH. t' HCOH HCOH HCOH I

I

I

I

cH2oH neuraminska kiselina

I

I

CH,

t-

HOCH I

HCNH-CO-CH2 I

HCOH I

HCOH HCOH I

I

cH2oH sijalinska kiselina (acetil-neuraminska kiselina)

7.1.4. Neosapunjive tvari i steroidi, kolesterol, Zudne kiseline, steroidni vitamini i steroidni hormoni. Svi ti spojevi imaju u osnovi opiu policikliiku strukturu, tzv. ciklopentanoLJ ovu se skupinu ubrajaiu steroli

perhidrofenantrensku jezgru :

Lipidi i

lipoproteini 129

Zajednidko im je s lipidima da se otapaju u organskim otapalima, a i metabolizam im je dvrunasro povezan s merabolizmom lipida. Inade su to spojevi vrlo razliiitih fizioloSkih svojstava' ili potencijalne aktualne centara viSe sadriava struktura tot istoj osnovnoj strukturi. Steroidna Rezultirajuii srereo izomerizam od velike je vaZnosti, osobito u sludaju steroidnih hor-

"rirrr.rril.. mona, i o njemu ovisi njihovo fizioloSko djelovanje. Kao sreroli oznaiuju se alkoholni derivari sterana koji nemaju hormonsko djelovanje, a kao steroidi derivati s hormonskom aktivnoSiu. Razni steroli i steroidi razlikuju se Po broju dvostrukih veza i funkcionalnim skupinama (najdeSce OH i CH3-skupinama) na osnovnom steranskom C-5 atomu prsrenu, kao i po alifatskom lancu na C-L7 atomu. Ako se reducira dvostruka Yeza ne su u ravniU kolestanonu Lol.rt.rola, prsteni A i B mogu zauzetidvrje prostorne konfiguracije. ni, a u koprort"rronu je prr,.r, A zavijen pod pravim kutom Prema Prstenu B. Funkcionalne skupine ,.r" r,.r"rrrko- prrt.nu mogu takoder imati razliditu prostornu orijentaciju, iznad ili ispoi ,"rrnine prsten", ito odreduje i- njihovu kemijsku reaktivnost. Ako je funkcionalna skupina tih iznad ravnine, oznaduje se kao p, a ako je ispod ravnine, kao a-izomer. U pisanju formula (---OH). Kod iscrtkano a-poloLaj (-OH), a crtom spojeva, p-poloZaj se oznaiuje punom kolesterola je hidroksilna skupina na C-3 u Prstenu A u p-poloLaiu:

HO Samo OH,skupina u p-poloiaju reagira s digitoninom, dok OH-skupina u a-poloZaju ne reagira. Zato se digitonin upotrebljava za razdvajanje tih spojeva. U organizmu je kolesterol ma-

tidni spoj izkojegnastaju drugi steroli i steroidi.

7.2. Lipidi u organizmu U organizmu su u lipidima masne kiseline s parnim brojem C-atoma, najieSie palmitinska, te srearinska, palmitoleinska i oleinska kiselina, dok se masne kiseline s manjim brojem C-atoma one s vije od 18 C-atom a i nezasitene, osim oleinske i palmitoleinske, nalaze u manjim koncentracijama. Masne se kiseline nalaze esterificirane u neutralnim lipidima, fosfolipidima, glikolipidima i kolesterol-esrerima, a samo vrlo malo kao slobodne masne kiseline.

7.2.1. Apsorpcija liPida vrlo mali dio hidrolizira, a glavni Proces probave i resorpcije lipida odigrava se u tankome crijevu. Djelovanjem iutnih kiselina iz Luti i alkalija g,rit.r"ioog rlk" hpidi se u crijevu emulgiraju i na te fino emulgirane destice s velikom povriinom ilidrolitiif.ia;a";. guSteradna lipaza. Glicerol je topljiv u vodenoj sredini i lako se apsorbira, dok

Lipidi

se

unose u tijelo hranom. U ieludcu

se

je apsorpcija masnih kiselina sloZeniji proces. One se apsorbiraju mko Sto se veiu sa iutnim ki,.1i""r" i kolesterolom. DospjevSi u enrerocire, masne se kiseline oslobadaju i veZu Ponovno s i traglicerolom stvarajuii trlgliceride. Ovi egzogeni trigliceridi, uz neito kolesterola, fosfolipida duktusa, Prenose u cirkugo.,r" proreina stvar"lo liilo-ikrone koji se limfom, preko torakalnog masne kiseline transportiraitizenterocita nadin se i".i;oi. krvlju u jetru i u masne stanice. Na taj

130

Poglaulje 7

duljih lanaca, dok masne kiseline s kratkim lancem ulaze u portalni krvotok i jetru. Hilomikroni su destice promjera oko 1.000 nm, pa nakon masnih obroka, kad njihova koncentracija u krr-i poraste, serum postaje mlijeino zamuien ili, kako se to naziva, lipemidan. Lipide u organizmu dine rezervni lipidi, tj. trigliceridi u mezenhimalnim stanicama ili u masnim stanicama, te lipidi koji dine strukturni dio stanica. Rezervnih ili depo-lipida ima najviSe u potkoZnome rkivu, mlijeinim Llijezdama, omentumu, mezenteriju i uperianalnoj regiji. Rezervni lipidi u rim depoima karakteristidnog su sastava za pojedine iivotinjske vrste, ali se na njihov sastav moZe donekle utjecati prehranom. Funkcija rezervnih lipida jest da organizmu osiguravaju rezervni materijal zaizgaranje, tj. energiju. Lipidi su za to pogodniji od ugljikohidrata i proteina

lipidi pak sastavni dio svake stanice. Njihov je sastav karakteristidan i konstantan zapojedine vrste tkiva i na njih se ne moie utjecati prehranom

zbog veie kaloriine vrijednosti. Strukturni su

(tabl. 7-3.). Tablica 7 -3. Znaiajke staniinih i depo-l i pida

kemijska priroda

fosfolipidi, glikolipidi, steroli

specifiinost kemijskog

specifitniza svako tkivo i ne mijenjaju

rrigliceridi se

prehranom

specifiiniza pojedinu vrstu, mogu

se

mijenjati

prehranom

sastava

koncentracija

stalna za svakiorgan

promjenljiva

oblik

sastavni dio stanitne strukture

deponirani u masnim stanicama

uloga

specifitan sastojak citoplazme i membrane stanica

depo hranjivih tvari

moguinost detekcije

teiko se otkrivaju bojenjem jer su kompleksnovezani

lako se boje

mogutnost ekstrakcije

teiko

se

ektrahiraju

lako se ekstrahiraju

DepoJipidi ne mijenjaju se nakon apsorpcije i sinteze u crijevnoj stijenci, dok strukturni lipidi trebaju proii jetru, gdje se pregraduju u pogodan oblik. Osim apsorbiranih lipida, krv transportira i lipide iz depoa u jetri i odatle u druge organe. Zbogtoga stupanj mobilizacije rezervnih lipida ima veliki utjecaj na koncentraciju lipida u krvi. Neki tzv. lipotropni dimbenici, a to su kolin, metionin ili inozitol, pospjeSuju transformaciju lipida u jetri (sinteza sloZenih lipida, prije svega fosfolipida). Poremeiaji u vezi s lipotropnim dimbenicima mogu dovesti do nakupljanja lipida u jetri, do rzv. masne infiltracije (steatoze) jetre i do promjene koncentracije lipida u krvi.

7.3.

Lipidi u krvi

Lipidi krvne plazme i krvnih stanica medusobno se razlikuju. U krvnim stanicama lipidi su strukturni, integralni dio tih stanica, dok lipidi krvne plazme ili seruma tvore lipide u transportu u tkivo i iz tkiva. Lipidi krvnih stanica manje variraju u raznim fizioloSkim i patoloSkim stanjima od lipida u plazmi, na kojima se jade odrai,avaju promjene u metabolizmu i mobilizaciji lipida. Za odredivanje lipida bolje je rabiti serum nego plazmu, jer antikoagulacijska sredstva mogu mijenjati osmotidke prilike u krvi. Pod normalnim uvjetima lipidi seruma u iste osobe vrlo malo variraju i tijekom duljeg razdoblja. Ukupni lipidi u eritrocitima ne5to su niZi nego u serumu. Sadriavaju manje triglicerida, minimalno kolesterol-estera, a i slobodni je kolesterol neSto niZi (ima ga u eritrocitnoj membrani). Eritrociti sadriavaju gotovo dvaput viSe fosfolipida nego serum, uglavnom kefalina, kojih je oko 50-600/o u odnosu na ukupnu kolidinu fosfolipida. Leukociti su bogati lipidima, posebno fosfo-

lipidima. Zbog navedenih razhka izmedu seruma i krvnih stanica, serum za analizu lipida smije biti hemolitidan.

ne

Lipidi i lipoproteini 131

Tablica 7-4. Utjecaj fiziolo5kih iimbenika na koncentraciju lipida u serumu

djettnjstvo da puberteta

menstruacija

l

+

+

+

ffudhofa

+

+

+

+

matniobrak

+

+

+

+

0

nedovoljna prehrana +

post + poveiana,

t+)

+

0

- smanjena,0 nepromijenjena

Na koncentraciju ukupnih i pojedinadnih lipida u serumu utjedu raznl dimbenici (tabl. 7-4.). U djece serum sadrL,avamanje kolesterola, fosfolipida i triglicerida, pa je i koncentracija ukupnih lipida i ukupnih masnih kiselina manja. Kolesterol je u djece relativno viSe u slobodnom obliku nego ,, odr"rlih osoba. Sve se te koncentracije postupno poveiavaju, a u doba puberteta doseZu koncentracije u odraslih osoba. u starosti su lipidi nepromijenjeni, osim kolesterola dija se koncen uacija nesto smanjuje. U vrijeme menstruacije lipidi su neSto vi5i, osim koncentracije ukupnog kolesterola, koja se smanjuje vei pred menstruaciju. Takoder je koncentraciia lipida i svilr,njihovih frakcija poveian a zavrijeme trudnoie, a poveiava se i udio slobodnog kolesterola.

I

i ir

ili ri

$

'l

ii ,1,

Koncentracije se podinju poveiavati vei u Prvom trimestru trudnoie. Nedovoljna prehrana uzrokuje smanjenje koncentracija ukupnih lipida, fosfolipida i ukupnog kolesteiola, dok se trigliceridi ne mijenjaju, a slobodni kolesterol moZe i porasti. Za razllku od-rr.douoljne prehrane, potpuni posr uzrokuje poveianje koncentracije lipida. Tomu ie uzrok pojadana mobiliza.ija lipida iz depoa, jer se energijske potrebe organizma zadovoljavaju razgradnjom tjelesnih sastojaka. Na koncentracije lipida u serumu utjetu i endokrin e Llijezde. Tiroksin iz Stitnjade utjede na koncentracije lipida o ,.rornr, obratno nego na bazalni metabolizam, tj. poveiane su u hipofunkciji, a smanjene u hiperfunkciji Stitnjaie. Prednji retanj hipofize pospjeSuje masnu infiluaciju jetre,a s druge straneiegulira koncentraciju lipida u serumu. Utjecaj guSteraie, odnosno inzulina, povezan je s -etabolizmom ugljikohid rara.Inzulin stimulira sintezu lipida i djeluje antiketog.^o. U tom sludaju osobito je poveiana koncentraciie neesterificiranih masnih kiselina i kolesi.rol". Esrrogeni hormoni smanjuju koncentracije lipida u serumu. U nedostatku spolnih hormona smanjuje se oksidacija u organizmu, p? tako i masnih kiselina, te se pojatavaju anabolidki procesi i stvaraju masne rezerYe. Na koncentraciju lipida u serumu utjedu

i pojedini

lijekovi

i kemikalije.

Narkoza eterom

uzrokuje hiperlipidemiju zboginhibitornoga djelovanja etera na metabolizam ugliikohidrata. Kloroform, fosfot i tetraklorugljik djeluju toksidno na jetru i uzrokuju najprije prolaznu hiperlipidemiju s mobilizacijom rezervnih lipida, a zatim hipolipidemiju kad je jetra vei jako o$teiena. Veie kolidine tiamina, ribofavina, nikotinske kiseline i biotina pogoduju masnoj infiltraciji jetre

i

zato uzrokuju hipolipidemiju, dok veronal

i luminal dovode do hiperlipemije. Koncentracija

se i nakon intenzivne tjelesne aktivnosti. poveiana koncentracijalipida nalazise kod hipofunkcije Stitnjade, Seierne bolesti, kolestatske iutice, kronidnih bubreinih bolesti, nefroze, akumih infekcija, depresivnih bolesti i poremeiaja meabolizma lipida (Niemann-Pickova bolest, Gaucherova bolest). Pritom u hipofunkciji Stitnjace osobito raste koncentracija kolesterola, u Seiernoj bolesti i fosfolipidi, a dosta rano poveiava

rriglicerida i kolesterola smanjuje

132

Poglaufe 7

se

i koncentracija neesterificiranih slobodnih masnih kiselina. U kolestatskoj iutici poveiava

se

i koncent racija slobodnog kolesterola. Smanjena koncentracija lipida nalazi se kod hiperfunkcije Stitnjade (Basedowljeva bolest). Osobito su smanjene koncentracije kolesterola i triglicerida u degenerativnom te5kom hepatitisu, cirozi jetre, anemiji zboghemoragije, pernicioznoj anemiji, tuberkulozi, kronidnim infekcijama i shizofreniji.

7.3.1. Masne kiseline Metabolizam. Masne se kiseline sintetiziraju uglavnom (na kompleksu masnokiselinske sinaze) u citosolu jetrenih stanica te manjim dilelom u stanicama adipoznoga tkiva. Glavni izvor ugljikovih atoma za njihovu sintezu jesu ugljikohidrati iz hrane te neke aminokiseline, todnije, acetil-CoA nastao njihovim metabolizmom. Sinteza zapodinje s acetil-CoA, a serijom reakcija produljivanja lanca za 2 C-atoma nastaju masladna, kapronska, kaprilna i tako sve do palmitinske kiseline. Biosinteza masnih kiselina odvija se na multienzimskom kompleksu u citoplazmi stanice. Aktivacijom nastale palmitinske kiseline nastaje palmitoil-CoA izkojegprocesom elongacije nastaju ostale masne kiseline. Regulacijaprocesa sinteze masnih kiselina odvija

se

kontrolom

aktivnosti acetil-CoA karboksilaze. Kao izvor reduktivne energije u procesu sinteze sudjelule NADPH2 nastao u pentoza-fosfatnoj skretnici. Masne se kiseline, prema Knoopu, razlaLu u procesu p-oksidacrje koji se dogada u mitohondrijima stanica. tI ovom se procesu stvara acetil-CoA i velika kolidina reduciranih koenzima (FADH, i NADH r) iz koiih se u procesu stanitnog disanja i oksidacijske fosforilacije dobiva

velika kolidina AIP (sl. 7-1.). Prije procese razgtadnje masnih kiselina potrebna je prethodna aktivacija (proces koji se dogada u citosolu ili mitohondrijima) masne kiseline s AIP-om (uz acil-CoA sintetazu) re povezivanje s CoA u acil-koenzim A (acil-CoA):

AIP + R-COOH -+ AMP-OCR + H4P2O7 AMP

-

OCR + HS

-

CoA -+ R- CO

-

SCoA + AMP.

t/ procesu razgradnje znatajnu ulogu ima i karnitin. Karnitin je spoj koji se dobiva prehranom ili se sintetizkaizlizina reakcijama koje ukljuduju prijenos metilnih skupina sa S-adenozilmetionina i reakcije oksidacije zakojeje potreban vitamin C. Taj spoj prenosi dugolandane masnokiselinske skupine kroz unutarnju membranu mitohondrija. U mitohondriju se zatim aktivirana dugolantana masna kiselina u obliku acil-CoA nizom reakcija p-oksidacije skraiuje za po dva C-atoma. U svakom ciklusu reakcija oni se otpu5taju kao acetil-CoA. Nastali acetil-CoA u zdravih osoba ulazi u ciklus limunske kiseline u tkivima (npr. mi5iii), a iz njega mogu u jetri nastari i ketonski spojevi, dok skraieni acil-CoA ulazi u ponovne reakcije p-oksidacije. Ketogeneza.U odredenim fiziolo5kim i patolo5kim stanjima, npr. gladovanju, manjku ugljikohidrata u hrani ili prehrani s mnogo lipida uz malo ugljikohidirata i u Seiernoj bolesti, mogu se u krvi i mokraii pojaviti ketonski ili acetonski spojevi. Pod tim se nazivom razumijeva acetoctena kiselina, p-hidroksimaslaina kiselina i aceton. Ketonski spojevi nastaju iz masnih kiselina zbog njihove nepotpune oksidacije. Do ketonemije i ketonurije dolazi: 1. zbog manjka metabolidkog produkta ugljikohidrata, piruvata, odnosno oksalacetata, koji je potreban za konadnu oksidaciju acetil-CoA nastalog djekom p-oksidacije masnih kiselina. Naime, kada nedostaju ugljikohidrati (gladovanje) ili kad je poremeien njihov metabolizam (Seierna bolest), ne srvara se dovoljno piruvata za sintezu oksaloctene kiseline i onemoguiena je sinteza limunske kiseline, pa se acetil-CoA nagomilava. Nagomilani acetil-CoA kondenzira se u p-hidroksi-p-metilglutaril-CoA

Lipidi i lipoproteini 133 CH.

HO-CH cH3(cHJ"-

CH2

-

CH2

masna kiselina

-

*l-

CH,-N-CH3

l'l H2C -COO-

COOH

CH,

karnitin

staniina membrana masna kiselina

- vezni protein vanjska membrana mitohondrija

karnitin cH3(cH2)n

-cH2-cH2-c

o

cH3(cH2)n

acil-CoA

-cH2-cH2 -c'/ to-5t

CH.

*l-

- cH, -1-tt'

cH,-coo-

acil-karnitin

cH3

unutarnja membrana mitohondrija

acil-karnitin

I-roo ,,r,n ('to,'t't

l*toot, .o CH3(CH2)"-CH-CH

-"raoo -*--C(

_//o CH3(CH2)" t}]fl* -C : -ttraoo ttJ'g

cikrus rimunske ^ kiseline (misiti) 1,. cH,-clroo(\

enoir-coA "12'13

ii,o I

cH3(cH2)"-

[l-

tt'-

z,o *\o c

NADH,

ketoni(jetra)

'u''t

[t- rl!ll'-t"o ^ rC" cH,(cH,): -

-rffi

[-.r,-

L-3-hidroksiacil-CoA

itd. cH3-cH2-

^

o

L-3-ketoacil-CoA

cur-ctscon

butiril-coA

11 rno

'\*toon' to CHr-CH: Cn-C(Con I

rHro

r

lo

cH3

-cH-c ar'-c/dscoa runo

At

p-hidroksibutiril-coA

fz-

f- To'' H,-C(SCol '-C-C 8 | /nsc"a 'o ,rol I

CH,

CH3^,SCoA +

Slika 7-1. p-oksidacija masnih kiselina.

1

-

CHr(-5gsx

acetoacetil-CoA

acetil-CoA

prijenosni protein masnih kiselina; 2 - prijenosni sustav karni-

tina; 3-acii-Consintetaza;4-karnitin-palmitoil-transferazal(CPTI);5-acil-karnitin-translokaza;6-karnitin-palmitoil-transfe raza ll (CPT ll); 7 - dehidrogenaza dugolantanih acil-CoA (LCAD) 8 - dehidrogenaza acil-CoA srednjih lanaca (MCAD);9 - dehidrogenaza acil-CoA kratkih lanaca (SCAD), 10 - elektron-transferflavoprotein (ETF); 1 1 - dehidrogenaza elektron-transfer-flavoproteina IETFD); 12 - hidrataza enoil-CoA dugih lanaca; 13 - hidrataza enoil-CoA kratkih lanaca; 14 - dehidrogenaza L-3-hidroksiacil-CoA dugih lanaca (SCHAD); 16 - tiolaza 3-ketoacil-CoA dugih [1CHnO); 15 - dehidrogenaza L-3-hidroksiacil-CoA kratkih lanaca izomeraza;19 - dienoil-coA reduktaza. 18 enoil-coA lanaca; kratkih tiolaza3-ketoacil-coA 17 lanaca; -

134

Poglaufie 7

masna kiselina g-oksioaciia

{

CH3-CH-CH2-CO -SCoA OH

-2H

o

I

t CHr-f -CH2-CO -SCoA

il

CHr-C-

SCoA

,

ooHo iltil C-CH'- C-SCoA HSCoA +-O-C-CH, -

o +HSCoA

CH,

lf tt."o

B-h id

CH.-C -il -SCoA + CH, -C -SCoA

oo

il

NADH+H*

roksi-B-meti

I

g

lutaril-CoA

lo \il-CH3-C+ oo ilil

SCoA

cH3-c-cH2-c-oH acetoctena kiselina

oHo lil cH3-cH

-cH2-c-oH

B-hidroksimasladna kiselina

I

I'r

I o

*cH,

lt

cH3-c-cH3 aceton

Slika 7-2. Stvaranje ketonskih

koji se enzimski cijepa na acedl-CoA i acetocrenu kiselinu. Ova se moZe reducirati u Bhidroksimaslainu kiselinu ili spontano dekarboksilirati u aceton, pa se njihove koncenrracije poveiavaju u krvi i izluduju se u mokraii (sl. 7-2.). Pri poveianim koncentracijama ketonskih spojeva u krvi govori se o ketonemiji (acetonemiji), a kad se pojave u mokraii, o ketonuriji (acetonuriji). Njihovo nagomilavanje u krvi uzrokuje metabolidku acidozu (v. pogl. 5.) te moZe uzrokovati komu i smrt. U zdravih osoba srvara se vrlo malo acetona i krv ga sadriava samo u tragovima, jer se aceton, ako ga je malo, metabolizira u

jetri, miokardu i u drugim tkivima. Aceton najprije prelazi u enolni oblik i s molekulom vode stvara propandiol, koji se dalje oksidira u piruvat ili razlaL,e u acetar i formilni ostatak:

CH3-C-CH. I

o

+HrO _ -,CH3-CO-COOH + CH.-Q:CH, 3 CH.-CH-CH,OHa - | "-H"O 'l ' -CH3-COOH OH OH

piruvat acerar

+ aceton

enolni oblik

Specifidne reakcije sinteze

i

propandiol HC

-rr,,,_,rrHr-o(D(D CH, anhidro- HrC'

dekarboksilnt

-

izopentenilpirofosfat-rzomeraza

,

ttt\

'/'

,.\ G

-ra\raHr-ot9tg CH HtC

3-izopentenil-pirofosfat

3,3-dimetil-alil-pirofosfat

tt,

HrC. '\

H.C '\

'.

+

'.

cH: ' I

HrC.

- \-

^/1/1

/cH,-o@@-ef| + HrC. )t )o ,zt^,geranil-kondenzirajuii HrCio,rt*,rtx tit ct-t, tH

HrC t'H

r'H,-o@@

CH,

farnezil-kon9enziraju(i

geranil-pirofosfat

E'rt{'X ,tt' c cH.c -

-cr,

;HC..ll

H2

,

,"6"-c', -cr, H"cr, I ll

-i li"ll-.,i)'*; -.i>rY\/V\1"-o@@,')l\ cH HrC -+ ttor-tirft' I

!t'

!t'

"t..

-

/a/\

cH cH, cH cHr

NAD'H NAD'* ,,q"-J

,kurl"n-rt,.,,TG-.u.- H.C, -cr,

skvalen

farnezil-Pirofosfat

*o'

fttr. cH cH. t/\-/ cH,\-"L'H2 ll ;HctHr..

H.C "',\A^/"'.

cH'

L..r\i\,, 5

ry

,".'\ 'r

''Hi ll I i'- cH,'l l' -t -tn' / *.."t1/\/ \t', ' .t. ,Jn .;.-tt' ).['\.7 '"rr./\rrh,

t ) \\ )

' llv- { Hrc .t,

CH.

cc Y"'( t\ tt, a--x^

Loorr" NADP

tf,\. tt-

F,

,/

I

epoksiderivat cH,

H:C

/"'

CH

\.r,

\,,

\,-,,

I

CH,

-3CO, -4 HO

H3

lanosterol

Slika 7-6. Biosinteza kolesterola.

zimosterol

dezmosterol

kolesterol

140

Poglaulje 7

7,5

7,0 6,5

1,006 sedimentira, pa se jo5 zove >>sinking pre-p 1,006 g/mL) obraduje se taloZnim reagensom (heparin-sulfat-MnClr) na vei opisani nadin. Nakon odredivanja kolesterola u frakciji > 1,006 g/mL te u supernatantu nakon selektivnog taloienja, LDl-kolesterol se ratuna kao razlika koncentracije navedenih frakcija. Potrebno je naglasiti da se s pomoiu ove referentne metode dobiva tzv. Siroka frakclja, koja sadrtava odredene kolidine IDL-a i Lp(a), ako su

prisutni.

U

metodama koje se primjenjuju u rutinskom radu takoder se odreduje kolesterol Sirokoj frakciji, gdje su, osim primarnog LDl-kolesterola (1,019-1,063 g/mL), prisutni

u tzv. i IDL

(t,Oo6-1,019 g/mL) i Lp(a). LDl-kolesterol moZe se odrediti primjenom indirektnih i direktnih metoda. Indirekne metode za odredivanje koncentracije LDl-kolesterola jesu raiunska metoda ili metoda p-kvantifikacije. Direktne su metode ili one na principu selektivne precipitacije ili one na osnovi homogenog imunokemijskog odredivanja. LDl-kolesterol moie se odrediti i elektroforezom.

Rutinski

se

koncentracijalDl-kolesterola odreduje izradunavanjem prema tzv. Friedewaldo-

voj jednadLbi, iz podataka za ukupni kolesterol, HDl-kolesterol i trigliceride LDl-kolesrerol mmo I/L =ukupni kolesterol

-

trigli-cJridi

:

I

- HDl-kolesterol

da je ukupni kolesterol - LDl-kolesterol + VlDl-kolestekolesterola i triglicerida u VLDL-u oko l/4, pe je reLinski odnos a odnos No, to vrijedi samo ako je koncentracija triglicerida manja od 4,6 mmol/L i ako nisu

JednadZba se zasniva na

iinjenici

rol + HDl-kolesterol,

oko l/5.

prisutni hilomikroni. Vei je navedeno da je koncentracija LDl-kolesterola poveiana kod hiperkolesterolemije i da znati rizikzakoronarnu bolest. Smatra se da taj izrkpostoji ako je koncentracija LDl-kolesterola > 4,L4 mmol/L, a da su granidne koncentracije 3,36-4,11 mmol/L. Postoji dobra korelacija izmedu koncentracije ukupnog i LDl-kolesterola u podruiju 5,17-6,2 mmol/L kolesterola, 5to odgovara 3,36-4,14 mmol/L LDl-kolesterola. Metoda p-kvantifikacije upotrebljava se u uzorcima zakoje Friedewaldova jednadZba nije prikladna. Todno odmjeren volumen seruma centrifugira se pri 105.000 g tijekom 18 sati na 10 'C. Pod tim uvjetima VLDL i, ako su prisutni, hilomikroni i p-VLDL (karakteristitni za hiperlipoproteinemiju tipa III), nakupljaj" se u plutajuiem sloju, dok donji sloj sadriava primarno LDL i HDL. Ova frakcija isto tako moie sadriavati IDL i Lp(a). Plutajuii sloj uklanja se zarezivanjem epruvete. Donji se sloj promijeia, nadomjesti do prvobitnog volumena i odredi koncentracije kolesterola. HDl-kolesterol obidno se odreduje u odvojenom volumenu seruma, ali, ako j. posebno, dijelovi s d > 1,006 g/mL mogu se obraditi radi uklanjanja lipoproteina koji sadriavaju apo-B-100 [IDL, LDL i Lp(a)], te se HDl-kolesterol tada odredi u bistrom supernatantu. \LDl-kolesterol i LDl-kolesterol se izradunaju kako sliledi:

fVlDl-kolesterol] = [ukupni kolesterol] flDl-kolesterol] = ld >

- [d t

1,006 g/mL kolesterola]

1,006 g/mLkolesterola]

- lHDl-kolesterol]

l

!

158

Poglaufe 7

Na koncentraciju LDl-kolesterola odredenog na ovakav nadin ne utjede prisutnost hilomikrona, lipoproteina bogatih trigliceridima

ili P-VLDL. VlDl-kolesrerol obidno se izradun a iz gor-

nje jednadZbe, delie nego da se izravno odreduje u supernatantu dobivenom nakon ultracentri-

fugiranja.

Lipoproteini ukljuteni u indirektno odredivanje LDl-kolesterola. LDl-kolesterol zaprevo ukljuduje kolesterol iz LDl-destica te IDL-a i Lp(a). Iako IDl-kolesterol i Lp(a)-kolesterol obidno pridonose samo s nekoliko postotaka pri odredivanju LDl-kolesterola, njihove koliiine mogu biti znadajne u pojedinih osoba s visokim IDL ili Lp(") koncentracijama. Zaro NCEP (National Cbolesterol Education Programe) preporuduje da se provedu daljnja istraZivanja radi utvrdivanja doprinosa lDl-kolesterola i Lp(a)-kolesterola i LDl-kolesterola riziku za CYD, a koji se zepravo odrai,ava u aktualnom LDl-kolesterolu. Za odredivanje LDl-kolesterola primjenjuju se i razne direktne metode. Kod veiine se LDL selektivno taloti s polivinil-sulfatom ili heparinom pri niskim pH-vrijednostima. Zatimse LDL-kolesterol izraduna kao razlika izmedu ukupnog kolesterola i onog u supernatanru

ili se odredu-

je izravno iz LDL-precipitata.

7.7.s. Metode odredivanja koncentracije lipoproteina(a) Strukturna heterogenost fp(") kao poslje dica razliditosti velidine apo(a) znatno utjede na preciznost odredivanja koncentracije Lp(") u plazmi. Prisutne su antigenske determinante koje

ponavljajurazliiit broj puta na raznim Lp(a)-desticama, a imunoreaktivnost pojedinih antitijela takoder varira ovisno o velidini destice. Do danas je opisano viSe od trideset izo-oblika Lp("). Za odredivanje koncentracije Lp(a) primjenjuju se razlidite imunokemijske metode, kao ito

se

su imunoturbidimetrija i imunonefelometrija te RIA, ELISA i EIA. U svima se, osim u ELISA-i, upotrebljavaju poliklonska antitijela iz razlititih Zivotinjskih yrsra. Odredivanje Lp(a) za sada nije standardizirano, ali,bez obzirana analitidke poteSkoie, koncentracijaveia od 0,3 g/Lukup-

ne mase Lp("), tradicionalno se uzimakao granidna vrijednost iznad ko;'e se smarra da je poveia-

na koncentracija Lp("). Koncentracije Lp(a) mogu se izraziti s pomoiu broja destica,

mase

apo(a), apo-B-100 ili kao Lp(a)-kolesterol.JoS nije definirano koji je nadin najbolji zaizraL,avanje rizika za CYD. Postupak s najviSom rezolucijom i osjetljivoSiu za odredivanje apo(a) fenotipa kombinira razdvajanje apo(a) s pomoiu elektroforeze na agaroznom gelu s tehnikom imunoblota sa speci-

fidnim antitijelima i detekcijom s pomoiu t2'I-vezanog proteina. Ova tehnika omoguiuje idendfikaciju do 34 apo(a) polimorfnih struktura.

7.7.6. lzvor varijacija u odredivanju lipida i lipoproteina Uzroci varljacija koncentracije lipida i lipoproteina u pojedine osobe mogu biti analitidki i fizioloSki. Uloga je laboratorija da izvorevarijacija svede na najmanju moguiu mjeru, {. da osigura uvjete za toina odredivanja pojedinih analita. Strudna skupina NCEP zalaboratorijsku standardizaciju izdala;'e posebne preporuke u svrhu smanjenja predanalitidkih utjecaja na odredivanje lipida i lipoproteina, te predloZila sljedeie: l. odredivanje lipida i lipoproteina reba provoditi dok je metabolizam osobe u uravnoteienom stanju; 2. ispitanici trebaju imati normalnu pre-

hranu i nepromijenjenu tjelesnu masu barem 2 lednaprije odredivanja lipida i lipoproteina; 3. odredivanja lipida i lipoproteina treba ponavljati tijekom dva mjeseca prije odluke o primjeni lijekova s razmacima od najmanje tjedan dana; 4. ispitanici trebaju izbjegavati intenzivne tjelesne aktivnosti najmanje 24 sa:.a prije odredivanja lipida i lipoproteina; 5. za odredivanje ukupnog kolesterola mogu se rabiti uzorci bez posta i nakon njega, no, za odredivanje triglicerida i lipo-

Lipidi i lipoproteini 159 uporaba uzorka uzetog nakon 12 sati posta; 6. ispitanici trebaju biti u sjedeiem poloiaju barem 5 minuta prije uzimanja uzorka;7. podvezuLrle ne upotrebljavati dulje od I minute tijekom uzimanja krvi; 8. koncentracije ukupnog kolesterola, triglicerida i HDL-kolesterola mogu se odredivati u serumu ili plazmi; kada se EDTA rabi kao antikoagulans, plazmu

proteina, preporuiuje

se

treba odmah ohladiti na2-4 'C kako bi se sprijedila promjena sastava; 9. serum za odredivanje ukupnog kolesterola mo|,e biri transportiran smrznut ili na 4"C; uzorke za odredivanja kolesteoC, o za odredivanje triglicerida, lipoproteina i apolipoproteina na -70 rola treba duvati na -20

'C ili nite;10. treba uzeti u obzir dinjenicu

da su uzorci krvi uvijek potencijalno zarazni i u skla-

du s time treba s njima postupati. Upute za pripremu bolesnika prije odredivanja lipidnoga statusa mogu

se

naii u prilozima.

7.7.7. Metode odredivanja koncentracije apolipoproteina Za sada nema posebnih preporukayezano uz odredivanje apolipoproteina. No, buduii da je rijei o slidnim postupcima kao i pri odredivanju lipoproteina, potrebno je uzeti u obzir slidne dinj enice za smanj enj e predanalitidkih izvora varijacija.

Koncentracija apolipoproteina odreduje se razliditim imunokemijskim postupcima, ukljudujuii RIA, ELISA i RID te imunoturbidimetrijske i imunonefelometrijske metode.Za odredivanje apo-A-I i apo-B-100, koji su prisutni u relativno velikim koncentracijama, primjenjuju se imunorurbidimetrijske i imunonefelometrijske metode. Za apolipoproteine koji se nalaze u znatno manjim koncentracijama, kao Sto su apo-C-I i apo-C-II, prikladnije su osjetljivije metode, kao 5to su ELISA i RIA. No, za te metode, koje

se

kontinuirano usavrSavaju, potrebno je postaviti graniine vrijednosti

za dono$enje klinidke odluke, te je potrebno vi5e informacija s obzirom na njihovu klinidku korist, 5to ukljuduje i izradbu nacionalnih refcrentnih intervala, uz primjenu standardnih materijala.

Zaodredivanje izo-oblika apo-E tradicionalno se primjenjuje izoelektridno fokusiranje, tehnika koja omoguiuje otkrivanje razlike u naboju pojedinih izo-oblika. Fenotipizacija apo-E nakon izoelektridnog fokusiranja ukljuduje tehniku imunoblota sa specifidnim antitijelima. Pri karakterizacijiizo-oblika potrebno je koristiti se svjeiim uzorcima ili uzorcima koji su bili duvani na -70 "C kako bi se sprijeiile promjene na strukturama prije analize. Medutim, mogu se pojaviti poteSkoie tijekom analitiikog postupk ayezane uz posttranslacijske modifikacije, neenzimsko vezanie glukoze na apo-E, prisutnost rijetkih vrsta apo-E koje imaju naboj vrlo slidan uobidajenim izooblicima, 5to moZe rezultirati latno pozitivnim rezultatima za pojedine izo-oblike.

7.7.7.i. Genotipizacija

pojedinih apolipoproteina

Apo-B-100 kljudan je u metabolizmu lipida i lipoproteina, pri demu ima znaiajnu ulogu u homeostazi LDl-kolesterola u plazmi. Stoga apo-B-100 i strukturne modifikacije toga proteina imaju znarnu ulogu u razvoju hiperkolesterolemije te ateroskleroze. tanzicijom gvanina u adenin na poloZaju 10708, tj. na kodonu 3500 (neSOOO dolazi do zamjene arginina s glutaminom, Sro rezuhirauzstrukturne promjene na apo-B-100 i poveianom koncentracijom LDl-kolesterola u plazmi. Druga mutacija na kodonu 3500 jest tranzicija citozina u timin na poloZaju 10707, Sto dovodi do zamjene arginina triprofanom (R3500\7'). Za analizu apo-B-100 gena primjenjuiu se metoda PCR i digestija s restrikcijskim enzimima (PCR-RFLP, engl. pofi,merase chain reaction-restriction fagment length pofurnorphbm) ili metoda PCR u stvarnome vremenu (>>real ti-

z;e.. PCR).

150

Poglaulje 7

Gen zaapo-E je polimorfan s tri najudestalija alela; e2, e3 i e4. Genska osnova navedenih alelavezana je uzkodon lI2 i 158. Na mjestima ll} i 158 pojedine izoforme apo-E mogu sadrZavati sljedeie aminokiseline: E2 (Cys/Cys), E3 (Cys/Arg) iE4 (Arg/Arg). Alel e3 je predominantan u zdravoj populciji, alelu e2 pripisuje se uloga pri razvoju obiteljske dislipoproteinemije (hi-

perlipoproteinemija tipa III), dok se e4 smatraznatainimzapoveiani rizikrezvoja ateroskleroze te za razvoj demencije i Alzheimerove bolesti. Uloga apo-E4 pri navedenim poremeiajima nije dovoljno poznata.Za analintapo-E gena primjenjuje se PCR-RFLP, >>real tirne C:NH +H'ot C:o ---

l_^^__

COOH iminokiselina

I

+NH1

I

COOH ketokiselina

166

Poghufe 8

Na taj nadin katalititkim djelovanjem enzima glutamat-dehidrogenaze (GLD), uz NAD* kao akceptor vodika, oksidativnom deaminacijom glutaminska kiselina prelaziu a-ketoglurarnu kiselinut glutamat + NAD(P)

:9

a-iminokiselina + NAD(P)H.

+ H.O

a-ketoglutarat

NH*

Oksidativna deaminacija glutaminske kiseline vaL,na jeu metabolizmu aminokiselina, jer transaminacijom raznih aminokiselina nastaje iz a-ketoglutarne glutaminska kiselina, koja se tako Ponovno deaminira u a-ketoglutarnu kiselinu, potrebnu u procesima rransaminacije. Pri tome oslobodeni amonijak ulazi u ureja-ciklus kojim nastaje ureja koja se potom molraiom izluduje

iz organizma (sl. S-4.).

o il

citrulin

/ R_CH_COOH

o -cH2-cH2-c-cooH

NHr, karbamoil-fosfat

transaminacija

oksidativna deaminacija glutaminske kiseline

-,1ornitin >_)

arr

il

+H*

)

r

NH2-CO -NH, ureja

tli["*9-:-f:jgy,gg,!-o:t-Pl9--q-.e1g _tl?ls-qfilqqlje s oksidativnom deaminacijom slutaminske kisetine.

Osim opisanih opiih metabolidkih reakcija dekarboksilacije, transaminacije i oksidativne deaminacije, pojedine aminokiseline ulaze u daljnje metabolidke pretvorbe. Detaljniji prik az metabolizma pojedinih aminokiselina prelazi okvire ove knjige, pa se ditalac upuiuje na udibenike biokemije. Razliditi metabolidki putevi omoguiuju da aminokiseline n"kon deaminacije mogu: 1. oksidacijom prijeii konadno u CO, i H2O i posluZiti kao izvor energije poput ugljikohidrata i

lipida;

2. posluiiti kao izvorni materijal 3. posluZiti kao izvorni materijal 4. prijeii u druge aminokiseline.

za stvaranje acetoacetara;

za stvaranje glukoze, a rime i glikogena ili lipida,

Tablica 8-1. Glukogene i ketogene aminokiseline (produki razgradnje naznaieni u zagradama) leucin (acetil-Co4 acetoacetat) I izi n (acetil-CoA, acetoacetat)

alanin {piruvat} asparagin (oksaloacetat)

fen ilalan i n (acetoacetat, fu marat)

aspartat {oksaloacetat i fumarat) arginin (a-ketoglutarat)

tirozin (acetoacetat, fumarat) treoni n (acetil-CoA, piruvat) triptofan (acetoacetat, piruvat)

cistein (piruvat)

glicin (piruvat) glutamat i glutamin (a-ketoglutarat) histidin (a-ketogl utarat) metion in (sukci nil-CoA) prolin' (a-ketoglutarat) serin (piruvat) valin (sukcinil-CoA)

izoleucin (acetil-CoA, sukcinil-CoA)

Arninokiseline 167 fumarata ili Aminokiseline koje se razgraduju do piruvara, a-ketoglutarata, sukcinil-CoA,

Ketogenim aminooksaloacerara prerede su gluko ze pase nazivaju glukogenim aminokiselinama. te mogu tako biti kiselinam a nazivajur. ol. koje se razgradaju do acetil-CoA ili acetoacetata jesu lizin i leucin (tabl. prevedene o ,,'"rri ili ketonske ,pol.'.lPorpuno ketogene aminokiseline 8-1.).

poremeiaji u metabolizmu pojedinih aminokiselina nalaze se u nekim naslednim metaboliili njihovi metadkim poremeiajima. U takvim se sluiajevima pojavljuju pojedine aminokiseline npr' mokraiom, izluiivanje njihovo se boliti u poveianim koncentracijama u krvi i poveiava i izoleucin leucin, cisrin, .riptof"n, fenilalanin i fenilpiruvat, homogentizinska kiselina, histidin,

valin (v. pogl.24.).

vezom izmedu Stvaranje peptida. Aminokiseline se mogu medusobno vezati tzv. peptidnom vode' karboksilrr. ,t.rpine jedne i aminoskupine druge aminokiseline uz eliminaciju

H '9

NH'OHH

,o .( -+-.(o" -l.A-n R,-9-c( i---)*-{- -toH ' "):or-t----ui^' t\ i t

)',ro r\r

-H'o

n.

R,

aminokiselina

I

aminokiselina

II

dipeptid

sastoNa taj nadin nastaju peptidi. Naziv peptida obuhvaia aminokiseline od kojih se peptid vz Yezena peptidno skupina je ji. pri tome se najprije oznaiuje aminokiselina tija karboksilna sufiks ,ril.., npr. alanil-glicin. od triju Ako se peitid ,"rtoyi od dviju aminokiselina, oznaduje se kao dipepdd, ako se sastoji se nazivaju aminokiselina do 30 aminokiselina, naziv" r. trip.ptidom itd. Peptidi s viSe od 6 pa fizikalno-kepolipeptidima. Kada b-y p.pridno vezanih aminokiselina prijede 50, lanac dobiva nemaju toplinom) (npt koagulacija Proteoze i peptoni, ,.rrojsrva proreina. Takva svojstva

-ryrk"

manje od 50 aminokiselinskih ostataka' N.l" manji peptidi i polipeptidi imaju vaL,neuloge u dovjedjem organizmu. Tako u sprjetava(1-glutamil-cisteinilnju oksid".ry. ti.-oglobirr"., -.th.^oglobin sudjeluje tripeptid glutation 8 aminokiselinskih od gii.irr;, rr.ki r., hor",,'oni polipeptidi, kao oksitocin, oktapeptid izgraden

polipeptidi ^

s

"

ostataka.

8.1.1. Aminokiselinski duSik Aminokiselinski dulik dini oko 75o/o neproteinskog dudika. Odredivanje aminokiselinskog koncentracije ukupnih du5ika nema dijagnostiiko znadenje jer je kiniiki beznadajna promjena kod nasljednih podolazi aminokiselina. VJnije su promjene pojedinih aminokiselina do kojih remeiaja metabolizma aminokiselina. do 4'3 Koncentracija ukupnoga aminokiselinskog duSika u serumu ili plazmi iznosi od 2,28 mmol/L, ovisno o metodi odredivanja. poveiana koncentracija aminokiselinskog dulika u serumu opisana je pri teikim oSteienjima jetre, osobito akutne nekroze zbogotrovanja arsenom, tetraklorugljikom ili kloroformom. U jetri Pa se natakvim stanjima slabe sinteza proteina, sinreza ureje i deaminacija aminokiselina u nemetabolizirane aminokiseline. kupljaju i pojedinih va'erdijagnostiiko znatenje ima izludivanje aminokiselina mokraiom, i ukupnih aminokiselinskog aminokiselina. Mokraiom se normalno izluduje oko 3,57 do 14,28 mmol/dU duSika, 5to dini oko L-Zo/o ukupnog duSika u mokraii. a katkad Normalno se mokraiom izluduje najviSe glicina, zatim serina, alanina i glutamina, kip-aminoizomasladne histidina i medlhistidina. Medutim, neke orob. izluduju viSe taurina ili

168

Poghulje 8

seline. Fiziolo5ka se aminoacidurija pojavljuje u trudnoii i u prerano rodene djece, a patoloika aminoacidurija moie biti posljedica metabolidkih porem ehjapri kojima dolazi do tolikoga porasta koncentracije aminokiselina u cirkulaciji da se sve ne mogu reapsorbirati u bubreinim tubulima ili moZe bitiposljedica porem etajab,rbr.g" pri iemu dolazi do sniZenja bubrein ogpregaze aminokiseline pa se one pojadano izluduju mokraiom. Osim podjele aminoacidurija na metabolidke i bubreZne, one se diyele i na primarne i sekundarne. Sekundarna je aminoacidurija deiia i susreie se u jetrenoj nekrozi ili bubreZnoj insuficijenciji te u nekim kongenitalnim poremeiajima kakav je Wilsonova bolest ili Fanconijev sindrom. U Wilsonovoj bolesti dolazi do odlaganja bakra u tkivima, 5ro, medu ostalim, olteiuje i bubrege koji onda jade propuitaju aminokiseline, a u Fanconijevu sindromu takoder se radi o oSteienju bubrega koje rezultira glukozurijom, fosfaturijom i aminoacidurijom. Kod primarnih aminoacidurija obidno se poveiava izludivanje jedne ili samo nekoliko aminokiselina kao rezulatnasljednih poreme&ja metabolizma aminokiselina (v. pogl.24.).

8.1.2. Kemijske reakcije aminokiselina koje se primjenjuju za njihovo dokazivanje i odredivanje Aminokiseline reagiraju s ninhidrinom (triketohidrinden) rako da se oksidiraju na aldehid s jednim C-atomom manje uz otpu5tanje CO, i NH3.

?

H

H

+

R-i;l.".H--+ (Yty"". \}.'-tr

R-c(o -\os+co,+NH.

I

o hidrindantin

Na taj nadin reagiraju i proteoze, peptoni i proteini koji imaju slobodne amino-skupine, ali ne reagiraju prolin i oksiprolin. Na toj se reakciji temelji manomerrijsko odredivanje aminokiselina tako da se mjeri oslobodeni CO2.

Ninhidrinska se reakcija iskori5tava i za dokazivanje aminokiselina i njihovo odredivanje spektrofotometrijskim metodama. Naime, u slabo kiseloj sredini pri pH oko 3-4 ninhidrin s NH, iz aminokiselina daje crvenu do plavkastu boju, odnosno iutu boju s prolinom i oksiprolinom, kompleksa ninhidrina, nastalog hidrindantina i amonijaka:

Specifidne reakcije za dokazivanje pojedinih aminokiselina opisane su u 24. poglavlju.

8.1.3. Kromatografsko razdvajanje i odredivanje aminokiselina Za razdvaianje smjesa aminokiselina i odredivanje pojedinih aminokiselina najvi5e se primjenjuju razne kromatografske tehnike. Kromatografrjaje separacijska tehnika kojom se opienito

Arninokiseline 169 smjese tvari razdvajajana svoje sasravne komponente, a upotrebljava se u raznim podrudjima medicinske biokemije. Ima raznih kromatografskih tehnika, ali je svima zajedniiki princip da se razdvajanje smjese tvari provodi na temelju nekog fizikalno-kemijskoga svojstva, nPr. lipofilnosti, ionskog naboja, velidina molekule i sl. Princip je kromatografsko grazdv{anja da mobilna faza, ukojoisu tvari otopljene, te rvari nosi i one putuju duZ stacionarn e faze koja ih pak, ovisno o topljivosti u stacior"rroj fazi rliadsorpciji, zaustavlja. Pri tome se u dijelovima stacionarn e faze

,rrpori"utla ravnoteia izmedu npr. topljivosti u objema fazemakoju, medudm, stalno nadolazeia faze te ih nosi dalje do drugog dijela -obilrr" faza remeti, jer ponovno otapa tvari stacionarne smcionarn e faze. Ovi se procesi stalno Pona-

vljaju. Buduii da se pojedine tvari, nPr. pojedine aminokiseline, razlikuju medusobno po topljivosti, odnosno adsorpcljiza stacionarnu fazu, one putuju raznim brzinama i

+ +-

mobilna faza smjesa koja se

kromatografira

tako se razdvajaju.Yezanieza stacionarnu fa.zltmoircbiti na raznim principima, pa se kromatografske tehnike, prema tome, dijele na adsorpcij sku, raspodj elnu, ionsko -izmj enjiva-

(A,B,C)

+-

stacionarna faza (adsorbens)

+

vata i staklena vata

dku, afinitetnu kromatografiju, gel-kromato-

grafiju i dr.

Adsorpcijskom kromatografiiom tvari se razdvajaju na osnovi razlidite adsorpcije na adsorbense koji tvore stacionarnu fazlJ. Kao adsorbensi upotrebljavaju se aluminijev oksid, razni silikati, aktivni ugljen i kalcijev oksid ili karbonat. Kromatografija se provodi na koloni, cijevi napunjenoj adsorbensom kroz koju prolazi mobilna faza s otopljenim warima (sl. 8-5.). Raspodjelna kromatografija temelji skoj fazi, a

oirogo

se na

Slika 8-5. Adsorpcijska kromatografija: 1. kolona, 2.razviian)e razdvojene frakcije,3. i4. postupno eluiranje pojedinlh frfg!3

razliditoj topljivosti neke tvari u vodenoj i organ-

plinu. Stacionarnu fazu obiino oznallevoda vezan na celulozu ili silikagel,

mobilnu fazu organska otapala. lonsko,izmjenjivaika kromatografija

izvodi na koloni napunjenoj ionskim izmjenjivadem. To su razne smole s kovalenrno vezanim ionskim skupinama za koje se tvari otopljene u mobilnoj faziveLuelektrostatidkim silama. Kadonski izmjenjivadi imaju negativno nabijene funkcionalne skupine (npt sulfonske) za koje je labilno vezan neki kadon koji se zamjenjuje otopljenim kationom iz ,nobilrr. faze. Anionski izmjenjivaii imaju kovalentno yezane pozitivno nabijene skupine na koje je labilno yezan neki anion koji se izmjenjuje s anionom iz otopljene tvari u se

mobilnoj fazi. Kationski izmjenjivadi fAmberlit, Dowex 50, karboksimetil (CM) celuloza] obidno su u natrijevu obliku, a anionski fAmberlit 400, Dowex 1, dietilaminoetil (DEAE) celuloza] u obliku klorida (sl. 8-6.). Aminokiseline u jako kiseloj sredini veZu se za kationski izmjenjivai zamienom za labilno vezanikation, azatimse poveianjem pH eluiraju ponovnom zamjenom kationom. Na tom principu rade i automatski analizatori aminokiselina kojima se odreduje koncentraciia aminokiselina ,, bioloskom materijalu. Ionski se izmjenjivadi upotrebljavaju i za uklanjanje interferirajuiih spojeva u nekim postupcima, npr. za uklanjanje inhibitora pri enzimskim odredivanjima. Afinit"rrr" k"o^"tog""fiy" nazivje za kromatografsku tehniku u kojoj se tvari izoliraju tako da reagiraju s nekim ligandom imobiliziranim na nosadu u koloni. Na taj se nadin mogu veza' njem ila*yiri raznervari, npr. enzimi vezanjem za supstrat, receptorivezaniemz^ligande, anti-

17O

Poglaulje 8

,/--\

,'

R

T -c,H. T cH2-cHr-N.( -'. Cl- HrN-Q

I

SOINa* HrNLC-g

c,H,

COOH H

I

C.H. L)

cH2-cHr-N*(

SO;Na*

\loo

.Cl-

C,H, H

I -C,H. cH2-cHr-N*(

SO3Na*

.Cl-

C,H,

a)

b)

Slika 8-6. Kationskisulfonirani ionski izmjenjivai u natrijevu obliku izmjenjivat u kloridnom obliku.

a

- Anionskidietilaminoetil,

b

-

ionski

geni vezanjem za antitijela i sl. Kao nosadi upotrebljavaju se inertne tvari poput agaroze, poprjedno vezanih dekstrina, poliakrilamida, celuloze ili polistirena. Ligand se na nosat veZe ili izravno ili preko meduspoja, npr. amino-karboksi-heksana. Prolaskom kroz kolonu dolazi do vezanja interakcijom liganda i npr. enzima. Nakon toga se vezani spoj eluira iz kolone s pomoiu otopina izmijenjenog pH i ionske jakosti ili otopina ureje, gvanidina ili sulfita koji kidaju vodikove veze i tako oslobadaju vezanu tvar. Postoje i specifidna eluiranja, npr. enzima otopinama njegova supstrata ili inhibitora.Yezanje je strogo selektivno pa se ta tehnika primjenjuje za izolaciju raznih proteina, enzima i antitijela, jer otpada potreba kasnijega proii5iavanja. Gel-kromatografija temelji se na razdvajanju komponenti smjese na temelju velidine molekule. Stacionarna faza pri tome je obidno sastavljena od gelirajuiih hidrofilnih iestica dekstrana (Sephadex), poliaLrilamida (Bio-Gel) ili agaroze (Sepbarosa). eestice su medusobno povezane tako da u njima ostaju porozni otvori i mali kanaliii. Poroznost, tj. velitina pora i kanaliia moZe se tijekom izradbe varirati pa su komercijalno dostupni gelovi razlititih velidina pora. Kad se na kolonu napunjenu takvim gelom nanese mobilna faza s otopljenim materijalom, koji se ieli razdvojiti na sastavne komponente, molekule tija jeveliiina manja od pora lak5e u.laze u pore i tu se >>zaglav\uju((, x veie molekule ne mogu u pore, pa brl,e prolaze kroz relativno velike meduprostore izmedu destica stacionarne faze. Na taj se nadin u eluatu s kolone najprije pojavljuje komponenra s velikom molekularnom masom, a 5ro komponenta ima manju molekularnu masu, to se kasnije eluira s kolone (sl. 8-7.).

Slika 8-7. Shematski prikaz gel-filtracije. eestice Sephadexa o, velike molekule o, male molekule .. Prolaze(i kroz kolonu, molekule putuju raznim brzinama. lzmedu iestica Sephadexa velike molekule prolaze brLe, a manje polaganije.

Gel-filtracijom se mogu razdvajatihidrofilne i hidrofobne tvari, ovisno o upotrijebljenom gelu. Hidrofilni gel sluZi za separaciju u vodi topljivih tvari, kao enzima, proteina, hemoglobina itd., dok se hidrofobni gelovi (metilirani Sepbadex ili Styragel) upotrebljavaju za raz-

Arninokiseline 171 dvajanje lipofilnih tvari. Gel-filtracija takoder je pogodna tehnika za odredivanje relativne molekularne mase: komponenta nepoznate molekularne mase i ne-

0,12

ribonukleaza A

koliko tvari poznatih molekularnih masa podvrgnu gel-filtraciji. Postoji, naime, linearni odnos izmedu volumena elucije i logaritma relativne molekularne mase, pa se iz podataka za Poznate tvari konstruira kalibracijski dijagram iz kojeg se interpolacijom izrase

duna nepoznata molekularna masa (sl. 8-8.).

Iako je princip razdvajania naivaLniji timbenik razlikovanja kromatografskih tehnika, one se mogu klasificirati i prema nadinu izvedbe procesa. Prema tom kriteriju razlikuju se tankoslojna, tekuiinska i 104 106 10s relativna molekularna masa plinska kromatografija. Postoje i neke druge kromatografske tehnike poput papirne kromatografije ili Slika 8-8. Odreclivanje relativne molekularne mase gel-filtracikromatografije u superkritiinoj fazi. Papirna ftromajom. Odnos izmedu reciprotne daljine putovanja (1/D) i relativne tografija nadelno se ubraja u tankoslojnu kromatogramolekularne mase proteina razdvojenih tankoslojnom gel-filtrafij u, a kromato g r afija u sup erkritidnoi fazi ima obilj ecijom na Sephadex G-| 50 superfine. Zja plinske i tekuiinske kromatografije. Tankoslojna kromatografija (TLC, engl. thin layer cbrornatograpbfi provodi se na tankome sloju sorbensa nanesenog na neki nosat ili bez nosata. Kromatografsko razdvajanje obavlja se difuzijom mobilne faze kroz tanki sloj. Pri tekuiinskoi kromatografiji proces razdvajanja obavlja se u koloni napunjenoj sorbensom kroz koju struji tekuia mobilna faza. Plinska kromatografrja (GC, engl. gas chrornatography) razlikuie se od ostalih kromatografskih tehnika po rome sto se kao mobihnafazaupotrebljava neki plin, obidno du$ik, helij ili vodik, a ispitivane se tvari moraju prevesti u plinovito stanje. Stacionarnu fazu dini neka tekuiina s visokim vreliStem koja je imobiliziranana nosadu, obidno na stijenkama kapilarnih cijevi. Kao stacionarna fazaupotrebljavaju se tekuiin e razliiitapolariteta: parafini, silikonska ula ili polimeri kao Carbowax. Stacionarna se fazanalazi u dugim uskim kolonama, obitno oko 2 mi2-6 mm Promjera.

injicira se na podetku kolone u uredaj u kojem se na poviSenoj temperaturi odmah prevede u plinovito sranje i s plinskom mobilnom fazom ulazi u kolonu, gdje se obavlja razdvajanje. Buduii da se ispitivane tvari ne smiju razLagati na visokoj temperaturi, obidno se prije samog kromatografiranja moraju prevesti u stabilne sililne derivate. Mobilna plinska faza eluira razliditom brzinom razdvojene tvari koje nakon razliditih vremenskih Smjesa za analizu

razmaka (vrijeme retencije) dospijevaju na kraj kolone, gdje ih biljeZi detektor dije signale joi pojadava elektronsko pojadalo. Te signale u odnosu na vrijeme retencije registrira pisad (sl. 8-9.). Intenzitet signala razmieran je kolidini tvari pa se iz povrSine ispod pika na pisadu mot ekvantitativ no izr azitikoncentracij

a

ne-

ke komponente u usporedbi sa standardnim

tvarima. Kvantitativna analiza

s pomoiu

1 - kolona, rezervoar plina

Slika 8-9. Shematski prikaz plinskoga kromatografa. Oznake: 2 - termostati za injektor, kolonu i detektor, 3 - injektor,4

-

l"9llgl*s9yEJ3-Ple-9ktlng-1-oj-19L9*ge-t9gql-z----Prs-9..9-"----.--"--

172

Poglaulje

I plinske kromatografiievrlo je osjetljiva i ottriva tvari i do 10-12 g (t pg). Tekudinska kromato grafij a vis oke uiinkovitos-

ti (HPLC, engl. hrsh pt&nnance liquid cbrornatog,opbi novija je kromatografska tehnika. Tekuiina

Slika 8-10. Shematski prikaz urecfaja

za

visokouiinkovitu teku(in-

- rezervoar za mobilnu fazu, 2 - mijeSalica, 3 - pumpa,4 - ureefaj za uvocfenje probe, 5 - termostatizirana kolona, 6 - detektor, 7 - Pisai.

sku kromatografiju. Oznake:

1

koja dini mobilnu fazu visokodadnom se PumPom fazaleralcroz kolonu u kojoj se nalazi stacionarna Kolona je dugatka oko 10-60 cm i 2-6 mm Promjera i izradenaje od tantala, delika ili jakog stakla koje podnosi visoki tlak. Na podetku kolone nalui se uredaj u koji se unosi uzorak topliv u mobilnoj fazi. Ll koloni se komponente rastavljaju pod visokim tlakom i, slidno kao kod plinskog kromatogafa, njihov se izlazakiz kolone registrira nekom fizikalnom metodom (npr. mjerenje apsorPc9e), a signali se prenose na pisai (sl. 8-10.). Nakon odredenog vremena retencije pojavljuju se na kraju kolone

i pojedine tvari. prema tome, ovom se tehnikom mogu raditi sve vrsre ftromatografije, a prednost joj je dobro kao lipide, razdvajanje komponenti i brzina izvedbe analize. MoZe se primijeniti na razne wari ugljikohidrate, aminokiseline, steroide i dr. Plaviic ViSe o kromatografskim tehnikam a nalazise u knjizi Straus B, Stavljenii-Rukavina A, laboratoriju' F, i sur., ur., Analitiike tebnike u klini&orn

8.1.4. Tankoslojna kromatografija Kod TLC-a stacion arnu fazuiini tanki sloj (oko 2 mm ili manje) silikagela ili nekog drugog U nosada (aluminijev oksid) koji je nanesen na staklenu plodu ili aluminijsku ili plastiinu foliju. TLC se nadelno ubraja i kromato grafijana filtar papiru. Prema nadinu izvedbe (polonaj ploiice faza spram mobilne faze) TLC moie iiti url^rna (plodica postavljena okomito ili koso, mobilna mobilna a struji odozdo prema gore), silazna, horizontalna (ploiica postavljena horizontalno, faza struji, y.irr. ,.rirr. plodice prema drugoj), cirkularna (mobilna se faza dovodi u sredinu kruZplodice i struji prema periferiji kruga) i anricirkularna (mobilna se fazadovodi po rubovima jednodimenziokao nice i struji prema ,r.diSto). Kromatografsko se razdvajanje moie provesti nalno ili dvodimenzionalno. Idendfikacija neke tvari temelji se na odnosu udaljenosti te tvari na kromatogramu' mierene od srarra, prema udaljenosti do koje je stigla fronta otapala. Naziva se Rr (faktorom zadrlavanie ili retencij., pr.doiuje relativnu udaljenosr prema fronti). \vrijednost neke tvari karakteristii" na je za tu war, a ovisi o uvjetima kromatognfije, tj. o otapalu i vrsti nosaia. Udaljenost putovanja od startaizmieti se u cm i unese t Lzfazz

o-

udalienost tvari od starta udaljenost fronte otapala od starta

pod strogo kontroliranim kromatografskim uvjetima mogu se na osnovi \identificirati komte se ponente. tpJk, obiino se usporedo s uzorcima na istome tankom sloju stavljaju i standardi aminokisekromatografiji O ,r. orrroui ,rlihorr. ptrtou"nj" identificiraju komponente u uzorcima. lina na filtar papiru govori se u 2. izd. ovog udibenika'

Arninokiseline 173

8.r.s. Kromatografija aminokiselina na celulozi Princip Aminokiseline nakon razdvajanja jednodimenzionalnom ili dvodimenzionalnom kromatografijom na celulozi reagiraju s ninhidrinom dajuii ljubidastu obojenost. Samo prolin i oksiprolin dalu iutu obojenosr. Aminokiseline se identificiraju usporedbom \vrijednosti prema \vrijednostima standarda pojedinih aminokisleina.

Pribor Plodice velidine

l0 x

10 cm prevudene slojem celuloze debljine 100 pm, kada za kromatogra-

fiju, suiilo s toplim zrakom, aplikatori ili mikropipete. Reagensi

1.

2. 3.

4.

Pokretna fazazajednosmjernu kromatografiju: butanol, aceton,ledena octena kiselina i destiliranavoda u omjeru 28 228: 8 :16 mL. Pokretna fazezadvosmjernu kromatografiju: piridin i destilirana voda u omjeru 13 :7 mL. 0,4 mol/L ninhidrina. OtopitiT,L gninhidrina u 100 mL smjese butanola i acetona (t : t). Otopinu treba duvati na +4"C. Matidni standardi aminokiselina.

Standard A: otopiti u 100 mL l0%o-tnog izopropanola, uz dodatak I kapi koncentriranog HCL-a, 20 mg histidina, 100 mg glutamina, 30 mg glicina, 30 mg treonina, 50 mg alanina, 20 mg p-aminoizomasladne kiseline, 40 mg valina i 60 mg leucina. Standard B: otopiti u 100 mL l0%-tnog izopropanola, uz dodatak I kapi koncentriranog HCI-a, 30 mg lizina,2O mg taurina, 20 mgserina, 30 mg tirozina, 20 mg triptofana, 30 mg fenilalanina, 20 mg glutaminske kiseline i 50 mg prolina. Radni se standardi prireduju razrjedivanjem matidnih standarda I : 10. Na celulozne se plode nanosi 3 pL radnog standarda.

Uzorak Serum treba pohraniti na +4 "C. Prije nanoienja na celuloznu ploiu serum treba deproteinizirati. PomijeSati 0,1 mL seruma i 0,4 mL 96o/o-tnog alkohola u epruveti s ubruSenim depom, osraviti stajati 30 minuta te centrifugirati. Na celuloznu plodu nanositi l5 pL bistrog supernatanta.

Mokraia

se

skuplja 24 saaili

se

uzima prva jutarnja mokraia. Pohranjuje

se

na

+4"C. Nano-

si se 3 pL nativnog uzorka,bez razrjedenja.

Postupak Na celuloznoj se plodici lagano olovkom oznati startna linija 1,5 cm od donjeg ruba plode te podrudja nanoienja uzoraka, odosno standarda Sirine I cm, s medusobnim razmakom 0,5 cm. Na startnu se liniju nanosi 15 pL deproteiniziranog seruma te3 pL nativne mokraie i3,pL razrijedenoga standarda u obliku tanke linije. Uzorci se nanose nekoliko puta na isto mjesto uz suienje strujom vruiegazrakaprije opetovanog nanolenja. U kadu za kromatografiju stavi se 80 mL pokretne faze zajednodimenzionalnu kromatografiju i ostavi 10 minuta da se prostor iznad otapala zasiti parama. Nakon toga se uroni celulozna ploiica i ostavi da otapalo putuje oko 50 minura, dok fronta otapala ne dode I cm od gornjeg ruba plodice. Tada se plodica izvadi i osuSi srrujom vruiega zraka te ponovno stavi u isto otapalo kojemu su dodana 3 mL ninhidrina te u isrom smjeru ponovi kromatografija. Nakon 50 minuta plotica se izvadi iz kade i osu5i strujom rruiega zraka, stavi na 80'C tijekom l0 minuta i nakon toga odtita.

174

Poglaulje 8

60

Pri dvodimenzionalnoj kromatografiji nanosi se ista koIidina uzorka, ali u jednu todku koja je 1,5 cm udaljena od donjega lijevog ruba plodice. Kromatogram se razvije 2 Puta u isiome smjeru u stacionarnoi faziza jednodimenzionalnu kromatografiju te jedanput u drugome smjeru, zaoktenurom 90" u sracionarn oi faziza dvodimenzionalnu kroma-

54

tografiju.

Tablica 8-3. Referentni intervali aminokiselina u odraslih osoba

m 240-600

i

200-550

p-aminoizomaslaina kiselina d-aminomaslaina kiselina

m 10-40

i5-40

5

8.1.6. Odredivanje koncentracije

m 35-140

arginin

,25-135 m 35-65

asparagln

i.30-65 0-5

asparaginska kiselina

m 20-55

citrulin

z 15-55 m 85-150

cistin

i

fenilalanin

m45-75 ,.4A-70

60-1 5s

glutamin glicin histidin

m 25-90

220-70 m520-774 2410-770 m 150-320 z 50-s30 m 65-1 10 z 55-1 10 m

hidroksiprolin izoleucin leucin lizin

metionin

prolin serin

taurin tirozin treonin

triptofan valin

3

25

koniloi.anja s kolor. aminokiseline reagiraju

t0

20

76 280 165

0-40

0-35 m 50-120

240-90 m 105-215

i75-170 m 105-215

27547A m 20-45

i20-4a

s ninhidri-

nom na visokoj remperaruri, pri demu nastaju obojeni spojevi. Intenzitet nastalog obojenja izravno je proporcionalan Lohdini aminokiseline prisurne u eluatu i mjeri se na dvjema valnim duljinama , 570 i 440 nm. Iminokiseline s nin-

z

hidrinom daju obojeni spoj koji apsorbira svjetlo valne duljine 440 nm, dok sve ostale aminokiseline daju obojene ,poj.u. koji apsorbiraju na570 nm. Pojedine se aminokiseline identificiraju na osnovi vremena retencije na kromatogramu, dok je povrlina ispod dobivenog pika razmjerna koncentraciji. Na tablici 8-3. prikazani su referentni intervali aminokiselina u serumu i u mokraii odraslih osoba' Referentni intervali aminokiselina u serumu, mokraii i

likvoru djece razliiite dobi mogu 50

se

naii u odgovarajucoi

literaturi.

5

24

3-metilhistidin ornitin

Koncentracije pojedinih aminokiselina najte5ie se odreduju na automatskim analizatorima aminokiselina. Aminokiseline se razdvajaju s pomoiu gradijenta pH koji se postiZe uporabom 5 pufera razlititog pH i ionske jakosti. Na-

10

4

fosfoetanolamin glutaminska kiselina

aminokiselina 12

m 30-100

220-90 m 100-380 ,.70-27A m 70-160 i 70-185 m 40-280 z 30-255 m 40-100 z 35-90 m 100-190

i75-235 m 35-65

i

30*65

rn 180-325

t't50*27A

6

Literatura ML, Fody EP, Schoeff LE. Clinicai chemistryr Principlesp.o..dor.r, correlations. 5. izd. Philadelphia: Lippincott \williams

1. Bishop 65 106

20

& \W'ilkins, 2004. 2. Burtis cA, Ashwood ER. Tietz Fundamentals of clinical chemisvy. 5. izd. St. Louis : Saunders/Elsevier, 200 1'

ur. Tietz Textbook of clinica, 4. izd. St. Louis: Elsevier Diagnostics. Chemistry and Molecular

3. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE., Saunders,2006.

4A

4. eepelak I, Straus B, Dodig S, Labar B. Medicinsko-biokemijske ernice. Zagreb : Medicinska nakiada, 2004' 5. Devlin TM. Texbook of Biochemistry with Clinical Correlation. izd. New York: \WileY-Liss, 200 1' 6. Gamulin S, MaruSii M, Kovad Z,isu',ur' Patofiziologija' 5'izd'Za' smj

greb : Medicinska naklad e,

i'

2002'

Aminokiseline 175 2003' 7. Guyron AC, HallJE. Medicinsk afiziologrja. 10. izd. Zagreb: Medicinska naklada, g. Kaplan LA, Kazmierczak S, Pesce AJ, i^r irrrr^k SC. Clinical chemistry: Theory - Analysys

-

Correlation' 4'

izd. London: Mosby, 2003. 9. Robins SL. Osnove patologije. Zagreb: Skolska kniiga,1994' 10. Stryer L. Biokemij a.Zagreb: Skolska knjiga, 1991. & Co Ltd, 2002' 11. Stryer L, BergJM, TymlczkoJL. Biochemistry. 5. izd. NewYork: Freeman'WH laboratoriju .Zagreb: MedicinB, stailjenii-Rukavina A, plavSii F, i sur., ur. Analititke rehnike u kliniikom

12. Su"os ska naklada,1997 . Clinical Laboratory Results' l. izd' Frankfu13. Thomas L, ur. Clinical Laborarory Diagnostics. LJse and Assessment of 8' I mbH' 99 Verlagsgesellschaft : Th-Books rtlMain u klinidkoj praksi. zagrebt Medicinska nak14. Topii E, primorac o,1"r,ioiie S, Medicinskobiokemijska dijagnostika Lada,2004. Skoltka kniiga,1992' 15. ZiivaJ1,pannall pR. Klinidka kemija u dijagnostici i rerapiji. 3. izd.zagrebz

sl i

.il

&

#

$k

Protei,ni

Poglaulje

BoZidar Straus, Karmela BariSii

1?8

Proteini u krvi

Promsnt koncentadia utuprib

alhnfnr

protdna,

i glotulina: u

1gt

*nmomsarusn Promiene koncenuacije ukupnih proteina

180

Promjene koncentracije albumina

180

Promjene koncentracije globulina

181

litukopr*ehi

i

18r

$ifoprotelni

181

lmurwglobrdinl

184

Monoklonska i poliklonrka reakcla

Fibrinogm

184

diiaEro*i*t rnatenic mtih rpeff&rih$rst inr

185

lletod* odretftrnrp ulrpnit proteinr

190

{bobine

i

0dre$vanje ukuprih proteina u serumu 191

biuretskom metodom

lietoda odrcdhnnia

fon(lnurdie 19t

rfrum{na Hetr{c drdivanfr koncefindie

191

fhrftrogenruplmrri tnnnokcmiiske

n*od* n dolnrhnqie i

odtefiwnirpttcinr

192

lmunokemijskemetodeugelu

194

obiljeiivaia

195

obiljeZivaiima

195

tmunokemijske metode u otEini

bu

lmunokemijske metode u otopini

s

Elettrolonrrprstdna

lS

Proteini (od grdke rijeti protos - zauzimam prvo mjesto) gradevni su materijal dovjeijeg tijela. Vrlo su razLliiti i specifitni za poiedina tkiva i organe. Sastavljeni su od aminokiselina medusobno povezanih peptidnim vezama. Sastoje se od ugljika, vodika, kisika, duSika i ka&ad sumpora, fosfora i raznih metala. Metali se nelazeuglavnom u enzimima.Zaproteine je karakteristidno da sadriavaju dusik, i to u prilidno konstantnom omjeru od oko 160/o cjelokupnih proteina. Prema sasravu, proteini se dijele na jednostavne i sloiene proteine ili proteide. Jednostavni su proteini izgradeni samo od aminokiselina, dok proteidi ili konjugirani proteini sadriavaju, osim svoje proteinske strukture, i tzv. neProteinsku ili prostetidnu skupinu. Prema prostetidnoj skupini konjugirani su proteini svrstani u nekoliko vrsta: metaloproteini, lipoproteini, glikoproteini, mukoproteini i fosfoproteini. Glikoproteini i mukoproteini imaju kovalenmovezane ugljikohidratne prostetitne skupine, kod glikoproteina udio prostetidne skupine se kreie od 5 do l5o/o, a kod mukoproteina oko 75o/o. Pojam apoprotein oznatuje konjugirani protein bez prostetidne skupine. Slijed (sekvencija) aminokiselina karakteristitan je za svaki protein. Drugim rijedima, svaki protein ima odredeni slijed aminokiselina. Razlikuje se nekoliko razina proteinske strukture: primarna, sekundarna tercijarna i kvartarna. Primarna struktura oznaiuje slijed aminokiselina, sekundarna struktura oznaduje pravilno pojavljivanje ponavljanoga prostornog rasporeda primarne strukture u

jednoj dimenziji (a-uzvojnica ili a-heliks, p-nabrana ploda), a tercijarna struktura podrazumijeva unurarmolekularno slaganje polipeptidnoga lanca u kompaktnu trodimenzionalnu strukturu specifi dnoga oblika. Kvartarnom strukturom oznaduje se agregacija viSe peptidnih lanaca u molekulu proteina. Proteinsku strukturu odriavaju razlidite vrste kovalentnih i nekovalentnih interakcija izmedu kemijskih skupina kao 5to su vodikove veze, ionske, elektrostatiike, dipolne, hidrofobne interakcije te disulfidne Yeze. Nabiranjem i uvijanjem lanaca nastaju razni oblici proteina, nitasti ili fibrilarni, globularni i eliptidni. Fibrilarnu strukturu u kojoj su a-uvojnice medusobno isprepletene popur konopca posjeduju netopljivi skleroproteini. U sklero-

176

Proteini 177

-?< -.S..

,C.J

qO )

a-heliks

[\-

tercijarna struktura

l^t

N{H}---------o:c l-l

RCH l^l

c:o NH I

HC

HCR

-

elT

c:o I

R-NFi.looc -R CH

I

vodikove i ionske veze izmelu heliksa

Slika 9-1. Struktura proteina: a-heliks, tercijarna struktura, vodikove i ionske veze izmecfu heliksa.

proteine se ubrajaju keratin iz kose i noktiju, kolagen vezivnoga tkiva, elastin iz tetiva, miozin iz miSiia i fibrinogen iz krvi. U globularnim proteinima proteinski je lanac ponajprije .vezen disulfidnim yezamai na odredeni nadin zavinut. Tal$i su npr. hemoglobin, mioglobin i lizozim. Varijacije u broju aminokiselina i njihovu slijedu, natinu kako su lanci nabrani i medusobno vezani, omoguiuju da se u organizmu nalazi vrlo mnogo raznih specifidnih proteina u pojedinim organima, tkivima i stanicama. Relativna molekularna masa raznih proteina kreie se u velikom rasponu od 5.738 Da, koliko iznosi molekularna masa podjedinice inzulina (lt aminokiselina), do nekoliko milijuna. Struktura proteina uvjetuje i njihova fizikalno-kemijska svojstva. Ako se otopina proteina, kakva je i krvna plazma, zagrijava na 60 do 70 'C, dolazi do denaturacije proteina, jer se uniStava sekundarna i tercijarna struktura. Denaturirani proteini su netopljivi. Mnoga se svojstva proteina iskoriStavajt za njihovo razdvajanje, identificiranje i odredivanje koncentracije, kao 5to su: 1. velidina molekule. Veiina su proteina makromolekule velikih molekularnih masa. Na temelju velidine i molekularne mase proteini se mogu razdvojiti od malih molekula dilalizom, ultrafiltracijom, gel-filtracijskom kromatografijom i ultracentrifugiranjem u gradijentu gustoie. 2. ropljivost. Na topljivosr proteina utjede pH, ionska jakost, temperatura i dielektridna konscanta otapala. Kad se ovi parametri mijenjaju, proteini postaju viSe ili manje topljivi. Ovo svojstvo proteina iskoriStavasezaisoljavanje ,tj.razdvajanje proteina otopinama soli razlliitekoncentracije ili alkoholom razlidite koncentracije, a najviSe pri izolaciji pojedinih proteina. 3. naboj. Ovisno o pH sredine, proteini imaju razliditi broj pozitivnih i negativnih naboja. Svaki

protein ima svoju karakteristidnu izoelektriinu todku, tj.pH pri kojemu je broj pozitivnih i

4.

negativnih naboja jednak (sl. 9-1.). Thko pH otapala utjede na nastanak proteinskih oblika razliiitanaboja koji se razliditim brzinama kreiu u elektridnom polju. Na razlikama u gustoii naboja (naboj/masa) temelji se elektroforetidko razdvajanje smjese proteina, a na razlikama u izoelektridnom pH (pI) temelji se izoelektritno fokusiranje. Proteini krvnog seruma mogu se elektroforeddki razdvojiti na albumine, a,-globuline, ar-globuline, p-globuline i 7-globuline. adsorpcija na inertni nosad. Nosati imaju velike povr5ine za hidrofobne, apsorptivne, ionske ili

vodikove interakcije. specifidno vezanjena antitijela, koenzime ili hormonske receptore.Jedinstveno svojstvo proteina da prepoznaje i veie komplementarne molekule visokom specifitnoSiu osnova je imunokemijskih metoda. Apsorpcija i metabolizam proteina. Proteini se unose u organizam hranom, gdje th razgraduje nekoliko proreolitiikih enzima (proteaze). Razgradnja proteina poiinje u Zeludcu, u kojem na njih djeluje pepsin. Razgradnja se nasravlia u tankome crijevu djelovanjem tripsina i kimotri-

5.

178

Poglaulje 9 psina, a nastali peptidi razgradujuse dalje djelovanjem

COOH

karboksipeptidaza, aminopeptidaza i konadno dipeptidazado aminokiselina. Svaki od navedenih enzima

I

CH'

t-

J1.1"1. samo na odredene PePtidne veze (s1.9-2.).

Oslobodene aminokiseline apsorbiraju pepsrn

CH,

se iz

intesti-

nalnog trakta i prelaze krvotokom u jetru i u ostala tkiva, gdje se iz njih sintetiziraju specifitni peptidi i

proteini pojedinih organa i tkiva. Sinteza proteina vrlo je sloien Proces. U tom kompleksnom procesu sudjeluju mRNA koje nose inforI I

kimotripsin

_HN-CH_ CO*XH_ CH_R -li CH, CHJ

0

naii u odgovarajuiim ud2benicima biokemije.

rlt

Razgradnja stanidnih proteina enzimski je proces. Vec je bilo govora o proteazama i peptidazama koje

NHt I

CHt tnpsm

I

CH, I

CH, I

CH,

I

t' _HN-CH_ CO+NH_ CH-RO_ -ll i

in

---CO+NH_CH I

I I

aminopeptidaza

RrR lll HrN- CH-COINH- CH--I I

dipeptidaza

RrR lrl HrN-CH-COtNH-CH-COOH I I

Slika 9-2. specifiinosti proteaza i peptidaza.

sudjeluju u probavi proteina. U lizosomima tkivnih stanica nalaze se proteolitidki enzimi koii razgtaduju proteine do aminokiselina. Aminokiseline nastale razgradnjom tjelesnih proteina, kao i aminokiseline apsorbirane iz intestinalnog trakta, koje nisu bile uporabljene za biosintezu Proteina, metaboliziraju se u procesima transaminacije, oksidadvne deaminacije i dekarboksilacije te u reakcijama dijela molekula uz zadr t av anje a- aminokarb onske kis el inske skup ine.

rR rl karboksipeptidaza

maciju s DNA, IRNA koje donose aminokiseline na ribosome, ribosomi, izgradeni iz proteina i rRNA te brojni proteinski dimbenici ( inicij acij ski, elongacij ski i terminacijski). Detaljnije o sintezi proteina moZe se

Pepsin djeluje na

peptidnu vezu izmeCtu karboksilne skupine jedne dikarbonske

kiseline i a-ami noskupine jedne aromatske aminokiseli ne. Kimotripsin djeluje na peptidnu vezu izmedu a-karboksilne skupine

DuSik nastao oksidativnom deaminacijom aminokiselina prelazi u amonij ak, spoj vrlo toksi ian za organizam s napose Stetnim djelovanjem na mozak. Zbog toga se amonijak pretvara u ureju u Krebs-Henseleito-

vu ciklusu ili ciklusu ureje te izluduje Putem bubrega iz organizma. Prema tome, ureja je konadni produkt metabolizma proteina. Regulacija metabolizma proteina Ziviana je i hormonska. NadbubreLna Lliiezda, Stitnjada i estrogeni stimuliraju razgradniu miSiinih proteina pa u jetru krvotokom dolazi viSe aminokiselina. Tada se u jetri stvara viSe proteina, dijom tazgradniom nastaje vi3e konadnog produkta, ureje. To se isto dogada i u sludaju zloiudnih bolesti, kada dolazi do kaheksije. Obratno djeluju hormon rasta, inzulin i androgeni koji stimuliraju sintezu proteina u miSiiima (sl. 9-3.).

jedne aromatske aminokiseline i a-aminoskupine neke druge aminokiseline. Tripsin djeluje na peptidne veze izmedu karboksilne skupine lizina iliarginina ako je druga aminoskupina dibazidne aminokiseline slobodna. Karboksipeptidaza otkida krajnje aminokiseline s karboksilnom, a aminopeptidaza krajnje aminokiseline sa slobodnom aminoskupinom. Dipeptidaza razgracfuje dipep_tjd.9,_

s.1. Proteini u krvi U krvnoj plazmi proteini imaju razne funkcije:

- imaju zaStitnu

ulogu od infekcila (antitijela)

Proteini 179

ci;) \:::-/----___6([]) ei19

I

proteini jetre

nadbubreina Zlijezda

proteini-

-

iz hrane

iz hrane

Slika 9-3. Regulacija metabolizma proteina.

-

utjedu na koloidno-osmotidki tlak i time na raspodjelu vode izmedu vaskularnog i medustanidnog prostora (prije svega albumin) djeluju kao puferi, zbog dega su vaLni ze odri.wanje acido -bazne ravnoteZe (v. pogl. 5.) imaju transportnu funkciju, jer se raznilijekovi, neki hormoni, vitamini, elementi u tragu i elektroliti u cirkulaciji veZu na pojedine proteine (albumin, transferin i dr.) pojedini proteini imaju specifidne funkcije, npr. enzimi, hormoni, inhibitori enzima, kom-

plement, faktori koagulacije, hemoglobin itd. Krvna plazma sadriava albumin, globuline i fibrinogen, dok serum ne sadriava fibrinogen. Ti se proteini sintetiziraju u tijelu iz aminokiselina. Albumin i fibrinogen stvaraju se iskljuiivo u jetri, gdje se stvara i manji dio globulina (a-globulini i

p-globulini), dok

ra

a

se

veii dio globulina (7-globulini) stva-

plazma-stanicama

i stanicama

Tablica 9-1. Neke proteinske frakcije krvne plazme

retikuloendotelnog

sustava (RES).

Albumin je topljiv u vodi i u viSe ili manje razriiedenim otopinama soli, a netopljiv u jako koncentriranim otopinama soli. Zato se moZe istaloZiti zasiienom otopinom amonijeva sulfata. Albumin ima molekularnu masu od 66 kDa. YaLen je za odrtavanje onkotidkoga tlaka unutar vaskularnoga prostora, a ima i transportnu funkcrju jer se na njega veiu bilirubin, slobodne masne kiseline, razni elementi u tragu, hormoni kao kortizol, tiroksin, aldosteron, a takoder i kalcij, razni lijekovi itd. Imunokemijskim metodama, elektroforezom na raznim nosadima (Skrobni gel, agar-gel, celogel, ag roza,poliakrilamid) i frakcioniranim centrifugiranjem utvrdeno je da su albumin, a posebice globulini vrlo heterogeni i sastavljeni od mnoStva raznih proteina, koji imaju i razne fizioloike funkcije (tabl. 9-1.). Ukupni proteini, albumin i globulini odreduju se u krvnom serumu. U serumu zdravih adolescenata i odra-

albumin

prealbumin albumin a-kiseli glikoprotein

a,-globulin

ar-globulin

{orozomukoid} a-lipoprotein {HDL}

55 66 40

4,7 4,9 2,7

180-360

q-antitripsin

54

4,0

ceruloplazmin cr-HS glikoprotein haptoglobin 1-1 a-makroglobulin

134

4,4

49 100

4,1

725

5,4

tranEferin

2,75x1A3 76,5

5,9

fibrinogen

fibrinogen

341

5r8

160 160

5,8-7,2

1-globulin

imunoglobulin imunoglobulin imunoglobulin imunoglobulin imunoglobulin

p-globulin

B-lipoprotein (LDL)

G

A M D E

950 160 190

180

Poglaulje 9

slih osoba nalazise 66-8 L g/Lukupnih proteina, od dega na albumin otpada 35-52 g/L. Omjer albumin/globulini je izmeJu 1,5 i2,5 : I. Zaodredivanje fibrinogena potrebna je krvna plazma, a referentni interval za odrasle osobe iznosi I,8-3,5 g/L' i Koncentracija proteina ovisi o prehrani; obidno je malo veia u mulkaraca nego u Zena, a veia je u mladih osoba nego u starijih.

s.2. Promjenekoncentracijeukupnih proteina, albumina i globulina u krvnom serumu s.2.1. Promjene koncentracije ukupnih proteina promjene koncentracije proteinskih frakcija u raznim bolestima treba uvijek Promatrati poveapsolutzeno,jer se desto dogadaju pro-y.rr. raznih frakcija, pri demu moZe doii ili do promjene nih koncentracija ilisamo do relativnih promjena medusobnih odnosa. Zbogtoga koncentracija ukupnih proteina u serumu moZe biti i unurar referentnog intervala, a da koncentracije pojedi,rih prot.inskih frakcija budu promijenjene. NajieSie su promjene u smislu smanjenja albumina, dok su promjene globulina obidno u smislu poveianja neke od globulinskih frakcija.

por,.i"na korrJ.r,tr"cija ukupnih proteina (hiperproteinemija) pojavljuje se pri dehidraciji, jetremonoklonskoj gamapatiji (paraproteinemiji), a katkad i u kronidnim bolestima kao 5to su naciroza,r"rkorn, krtniine upale i autoimunosne bolesti kakve su reumatoidni artritis i sistemni konceneritemski lupus. Dok su pri dehidraciji, zbog hemokoncentracije, ravnomjerno poveiane proteina ukupnih tracije svih proteina, kod monoklonske gamapatije poveianje koncentracije uzrokuje pof"rr" monoklonskoga proteina ili paraproteina, a u kroniinim bolestima to poveianje uzrokuj e poveiana koncentracij a 7- globulina. S^"'pn" koncentracija proteina (hipoproteinemija) pojavljuje se pri prekomjernoj hidraciji, gubitku proteina iz organizma, smanjenoj sintezi proteina ili pojadanom katabolizmu proteina, ipr. ., hipertireozi ili leiernoj bolesti. U re5kom nefritisu, a napose u nefrotiikom sindromu, proteini se gube mokraiom, kod opeklina koje zahvacajuveiu povrSinu tijela gube se kroz oiteZ.rro koiu, t"a enteritisa s teikim proljevima putem crijeva. Zbog smanjene sinteze proteina, " hipoproteinemija se nalazi kod telkih jetrenih bolesti, u kojima je smanjena funkcija jetre za sinNadalje, proteini su smanjeni pri manjku proteina u hrani, malapsorpciji, tuber,.ro "lbomina. kulozi i zloiudnim bolesrima. Dok je u jetrenim bolestima obidno smanjena samo koncentracija u malapsorpciji i manjku proteina u hrani smanjene su sve proteinske frakcije, jer or-

albumina,

ganizam ne prima materijal potreban za sintezu tjelesnih proteina'

s.2.2. Promjene koncentracije albumina Osim u hemokoncentraciji, kada su poveiane koncentracije albumina zbog dehidracije' Promjene koncentracije albumina klinitki su vaine kada je njihova koncentracija u serumu smanjena otpada oko 50-60% ukupnih proteina, ihipo"lbominemija). Buduii da na albumin normalno hipoalbuminemija obidno rezultira i hipoproteinemijom, px su joj uzroci isti kao i hipoproteineje osobito izratena pri nefrotiikom sindromu zbogjake proteinurije. -^iyi. Hipoalbuminemija Kako albumin ima relativno malu molekularnu masu od 66 kDa, gubi se poglavito Putem bubkada se izluduje a isto rako i pri teikim opeklinama, kada prelaziu eksudat ili kod enteritisa rega,

kroz oSteienu sluznicu u crijevo. postoje i dva nasljedna poremeiaja metabolizmaalbumina.Jedan je bisalbuminemija, kada se simptou serumu pojavljuju dvije albuminske frakcije, 5to, medutim, ne Prate nikakvi patoloSki

Proteini mi. Druga je abnormalnost analbuminemija, kada

se

albumin uopie ne sintetizira. Buduii da

albumin ima ulogu u odrZavanju onkotidkoga tlaka, u ovom sludaju zbog niLega tlaka dolazi do pojave edema. Katkad se koncentracija albumina u serumu smanjuje i za vrijeme normalne trud-

noie ili laktacije, ali i u eklampsiji.

s.2.3. Promjene koncentracije globulina Poveiana koncentracija globulina, hiperglobulinemija, pojavljuje se u jetrenoj cirozi i desto u kronidnim i infektivnim bolestima, sifilisu, reumatskojvruiici, artritisu, bakterijskom endokardi-

tisu, tuberkulozi, kala-azaru, sarkoidozi, multiplom mijelomu, limfatidnoj leukemiji itd. U takvim sludajevima dolazi i do smanjena omjera albumin/globulini. Promjene pojedinih globulinskih frakcija moguie je uwrditi elektroforezom. U fazi akutne reakcije, pri akutnom oSteienju tkiva poveiavaju se ar-globulini, i to dini nespecifidan nalaz koji prati upalne procese, zloiudne rumore, poslijetraumatska i poslijeoperacijska stanja i autoimunosne bolesti. Pojedini proteini koji pri elektroforezi putuju u ar-globulinskoj frakciji mijenjaju pojedinim bolestima i stanjima. Tako se u nefrotidkom sindromu osobito poveiava ar-makroglobulin. U hemolitidkim bolesdma smanjuje se haptoglobin, jer se vei,e zaoslobodeni hemoglobin i taj se kompleks brie razgradaje. Ceruloplazmin je poveian u trudnoii, pri terapiji estrogenima i u jetrenoj cirozi, a smanjen u hepatolentikularnoj degeneraciji (v. pogl. 16.). B-globulini se pojavljuju u poveianim koncentracijama u opstrukciji Zutnih vodova i u nefrotidkom sindromu, a katkad i u trudnoii. Porast p-globulina odral,ava porast B-lipoproteina, koji se u

dine glavni dio ove globulinske frakcije.

U p-globulinima se nalaze i komponente sustava komplementa, kojih ima oko 20 i stvaraju jetri, a uloga im je da pospje5uju fagocitozu i druge simptome akutne upalne reakcije. U

se u

akutnom nefritisu i u kronidnim jetrenim bolestima smanjena je C3 komponenta, a poveiana u ostalim akutnim upalama. Porasr 7-globulina (hipergamaglobulinemija) nalazi se u kronidnim infektivnim bolestima, npr. u subakutnom bakterijskom endokarditisu, kala-azaru, limfogranulocitozi, zatim u jetrenoj cirozi, kronidnom hepatitisu, sarkoidozi, sistemnom eritemskom lupusu, reumatoidnom artritisu, i opienito kada se kao odgovor na infekcije podinju intenzivnije stvarati antitijela (npr. u akutnome virusnom hepatitisu). Smanjenje je 7-globulina (hipogamaglobulinemija) rjede. Nalazi se u sludajevima proteinurije ako se gube i 7-globulini (nefrotidki sindrom), ili kad je smanjena njihova sinteza, Sto se p"jalj"je kod malapsorpcije i malnuricije te primarnog i sekundarnog poremeiaja imunosti. Vrlo rijetko moZe se pojaviti i potpuni manjak 7-globulina, tzy. agamaglobulinemija. Takve su osobe jako podloZne raznim infekcijama, jer im je obrana organizma oslabljena.

9.3.

Mukoproteini i glikoproteini

Mukoproteini i glikoproteini sloieni su proteidi koji, osim proteina, sadrZavaju i ugljikohidratnu prostetidnu skupinu. Ugljikohidratni dio molekule tih proteida sadriava heksoze, obidno galaktozu i manozu, heksozamine glukozamin i/ili galaktozamin, zatim fukozu (metilpentozu) i sijalinsku kiselinu.

Razlika izmedu mukoproteina i glikoproteina samo je u relativnom sadrZaju ugljikohidrata. Ako molekula sadriava manje od l5% ugljikohidrata, odnosno do 4o/o heksozamina, takav se proteid nazivaglikoproteinom, dok se mukoproteinima oznatuju oni koji sadrZavaju viSe od 4%o

181

182

Poglaulje 9

odvaja od heksozamina i 15-75o/o uglikohidrata. Prema rome kako se ugljikohidratna skupina ugljikohidrase mukoidima U mukopolisaharide. kisele proreinskog dilela dijele ,Jr" mukoide i in",krpirri,.it o oir,";", dok se polarna vezaizmedu ugljikohidrata i proteina u kiselim mukopolisaharidima lagano kida. mukoproteini nalaze se u raznim tjelesnim tekuiinama. U krvnom serumu Glikoproteinil -l-Z%o ukupnih proteina i imaju specifiine funkcije. Glikoprotein transferin veZe i predine oko a imunoglonosi ieljezo, ..rrrlopl"r-ir veie bakar, protrombin ima funkciju u koagulaciji krvi, i bulini kao antitijel" i-a;o funkciju u imunosnim reakcijama, dok mukoproteini, haptoglobin

n'T,ilfiIJ:il

jest u rome rto se oni, osobito a-kiseli glikoprotein i C-r."i.iuni protein, poveiavaju u serumu u reakciji akutne faze. tuberkuKoncentracija ukupnih mukoproteina u serumu poveiana je u akutnim infekcijama, pri nalaze koncentracije lozi, reumatoidnom aitritisu, k"r.ino-u i limfosarkomu, a smanjene se doakutnim i kronidnim jetrenim bolestima i insuficijenciji nadbubreZne Lliiezde.Zaro se moie nadbubreine funkcijom smanjenom sa bolesnika jetrom ili u goditi da u bolesnika s odteienom

*Xil:t*koproteina

iliirrdrizostane njihovo poveianje kod akutnih upalnih i proliferativnih bolesd. U praksi se ne odr.doj. koncentracija ukupnih mukoproteina, nego se odreduju pojedini od njih, npr. haptoglobin, c-reaktivni protein, a,-antitripsin i drugi.

s.4. lmunoglobulini nalaze veiim dijelom u frakciji 7-globulina i nosioci su humoralne imunorazredi imunosd. Oznaduju se oznakom Ig,uzSto se navodi oznaka njihova razreda. Poznati su

Imunoglobulini

se

globulina IgA, IgM, IgG, IgE i IgD. Molekuia i-o.ogtb.rlirr" ima karakteristiinu gradu u obliku slova X a sastoji se od 4 poliYezama peptidna lanca, 2 teSta (H) i 2laka(L) lanca. Lanci su medusobno povezani disulfidnim

$t. ' e-a.).

ii^ike imunoglobulina ovise o gradi teSkih lanaca koji se oznaiuju kao 4,7, [r, D i e, i prema (rc) i rome stvaraju A, G;M, D i E razredi imunoglobulina. Lakih lanaca ima dvije vrste, kapa lambda (1). U jednoj su molekuli oba laka lanca uvijek ista i o njima ne ovisi tip imunoglobulina (tabl. 9-2.). vezanje antigena Yeznamjesta za antigene na imunoglobulinima nazivaju se Fab domenama, a dine ih varijabilni dijelovi te5-

Zn

N-kraj(-NH3)

laki lanci (L-lanac)

varijabilni dio konstantni

teiki lanci (H-lanac)

C-kraj (-COOH)

Slika 9-4. Molekula imunoglobulina.

kih i lakih lanaca. IgM se nalaziintravaskularno

i

prvi od imunoglobuli-

na reagira na infekciju. Prisutnost mikroorganizama stimulira njegovu sintezu. Sinteza poiinje vet za fetalnog razvoja, a koncentraciju u serumu odraslih doseZe nakon 9 mjeseci djetetova Livota. Referentni interval za odrasle osobe i adolescente iznosi 0,4-2,3 g/L. IgM veie komplement. IgG dini oko 75o/o ukupnih imunoglobulina u serumu, nalazi se u medustaniinim prostorima i Stiti te Prosrore od infekcije. Jedini od imunoglobulina prolazikroz posteljicu, a fetus ga sam stvara vrlo malo tako da ga veii-

r.ro- prima od majke. Koncentraciia u zdravih odraslih osoba i adolescenata od 7 do 16 g/L doseZe se u 3'-5'

Proteini Ta bl

i

ca 9 -2. Znataj ke i f u n kcij a i m u n og

molekularna masa (kDa) broj tipova Svedbergov koeficijent

I

obu

I

i

n

183

a

160

ipolimeri 3

5

7S-1

1

S

195

7S

7S

85

0,4-2,3

7-16

0,03**

0,0003**

da

da

sedimentacije referentni intervali (g/L)*

veie komplement funkcila

0,7-4,0 da sekretorni lgA

prva zaitita

od

zaitita izvanstaniinih

ititipovriine infekcija,djeluje prostora,neutralizira u cirkulaciji topljive antigene (toksine) tijela

ne ne zna

se

ne vezan za PovrSine stanica, rea kcija Preo5jetlj ivosti

*Odnose se na koncentracije lgG, A i M; **Odnosi se na srednje koncentracije lgD i lgE.

godini Zivota. Toksini stimuliraju sintezu IgG-a. IgG takoder veZe komplement. Koncentracija mu se u serumu poveiava u kronidnim bolestima, a pri manjku IgG-a dolazi do destih infekcija tjelesnih Supljina, pluia i koie. IgA se srvara u-submukozi intestinalnog i respiracijskog trakta, a u epitelu se spajaju po dvije nalazi se_u sekretima bronha, crijeva, -ol.kol. IgA stvaraj u(i tzv.sekretorni IgA. Sekretorni IgA

znoju,ror"*" i kolostrumu re 5titi ponajprije respiracijski i intestinalni trakt od virusnih infekciy". N. prolazi placentu, a u djece korr..rrtr"cije odraslih doseZe tek nakon 15. godine. Referentni interval za odrasle osobe i adolescente iznosi 0,7-4,0 glL' IgD dini samo oko l% ukupnih imunoglobulina. Ne veie komplement i ne prolazikroz potodna fizioloSka stelji"cu re koncentracije odraslih dosiie oko 15. godine. Joi se ne zna njegova 0'03 g/L' oko iznosi funkcija. Koncentracija u serumu odraslih osoba

sintetizira u plazma-smnicama, submukozi diSnih i probavnih organa te u limfoidnokrvi je vezan za stanitne povrline, -. ,trro nosa i grl" p" g" sadrZavaju sekreti bronha i nosa. Utragovima.Yezan za antigen,lrzro' u tek je serumu u osobito bazofilnih granulocita, a slobodan Koncenserumu. u poveian sludajevima kuje preosjedjivosti alergijsku reakciju, pa je zato n tim tracija u serumu odraslih osoba je oko 0,0003 g/L' Koncentracije IgM, IgG i IgA opienito rastu kao odgovor na infekcije, a u nekim patoloSkim i autoimunostanjima ,p..ifiino ,. po.,,.i"uaju pojedini imunoglobulini. Tako je pri kronidnim bililarhepatitisa, snim bolestima IgG opcenito poveian, IgM je poveian kod akutnoga virusnog katkad i u podetne ciroze i p^r^rior , alg|pri bol.r.ima crijeva, di5nih organa, tuberkuloze te i IgM, dok je IgA koncentracije povedane imaju noj fazij.ir.n. ciroze. Djeca s pneumonijom interje referentnog unutar IgG unutar referenrnog intervala. U djece s asrmom, medutim, IgA

IgE

se

**1", kon.entracija IgM-a je poveiana, a koncentracija IgG znatno smanjena' Manjak svih ili ,i-o poledinih imunoglobulina (humoralni poremeiaji) moZe biti primaran ili sekundaran. U takvornje stanju prisutna hipogamaglobulinemija. Primaran manjak imunoglobulina obiino je nasljedna bolest. Takva je agamaglobulinemija, koja se pojavljuje vei u djetinjako sinteza, swu, i ro samo o *rrik djece. Primarni manjak IgG-a moZe se pojaviti u male djece prenosi od jer najvi5e IgG se koja podinje normalno nakon rodenja, kasni, ili u nedonoSdadi, k o, porteljicu u zadnjim mjesecima trudnoie. Sekundarni manjak imunoglobulina Poja-

-";f..

vljuje ,. d.si. i moL,e se na6i kod Seierne bolesri, bubreine insuficijencije, limfoma, multiplog mileloma, makroglobulinemije i opienito u telkim bolesdma.

184

Poglaulje 9

s.4.1. Monoklonska i poliklonska reakcija Plazma-stanice i limfociti koji stvaraju imunoglobuline istog razrede i vrste dine jedan klon. Umnoiavanjem stanica, imunocita, jednoga klona nastaje veia kolidina imunoglobulina istog razredai vrsre, Ito se nazivamonoklonskom reakcijom.Zarazlikaod monoklonske, poliklonska reakcija pojavljuje kada se prekomjerno umn otavaju razniklonovi imunocita koji tada stvaraju imunoglobuline razliditih rezredai vrsta. Porast razliditih imunoglobulina kao odgovor na infek-

se

ciju oznaduje poliklonsku reakciju, a na elferogramu proteina pojavljuje

se pojadana

i difuzna

frakcija 7-globulina. Nasuprot romu, u monoklonskoj reakciji na elferogramu se vidi zbijena, o5tra definirana, istaknuta frakcija proteina. Takva se frakcija moZe pojaviti u raznim zonama globulina. Najieiie se pojavljuje u zoni 7-globulina, ali mogu biti i u zoni a ili p-globulina ili izmedu njih. Takva se frakcija nazivamonoklonskim proteinom ili paraproteinom, a oznaduje se obidno kao M-protein

ili M-globulin. M-proteini

su obidno znakzloiudnog bujanja imunocita, ali

mogu pojaviti i u dobrodudnim bolestima.Zlofudne monoklonske gamapatije (paraproteinemija) najieSie su kod plazmacitoma, monoklonske gamapatije neodredenog znaienia, multiplog mij eloma, \Taldenstromove makroglobulinemij e i sistemne AL- amiloidoze. Monoklonski protein moZe se takoder naii u bolesti teSkih lanaca te u zloiudnim bolestima razliiitih tkiva, a katkad moZe pratiti bolesti s poliklonskom reakcijom, nPr. jetrenu cirozu, kronidne infekcije, reumatoidni artritis i druge autoimunosne bolesti. e.rto se u zloiudnim monoklonskim gamapatijama mokraiom izluduje Bence-Jonesov Protein (BJP), monoklonski slobodni laki lanac Ig rc ili), tipa ili njihovi fragmenti. Pojavljuje se kada se lakih lanaca sinretizira nerazmjerno vi5e nego telkih lanaca. BJP ima malu molekularnu masu (monomeri oko 20 kDa, dimeri oko 40 kDa), pa lako prolazi kroz glomerule u mokraiu, a moZe se

ulaziti i u tkiva i dovesti do amiloidoze. BJP se aloLi u slabo kiseloj sredini oko pH 4,9 ve( pri oC, o poveianjem remperature opet se otapa. Ovo svojsto BJP-a nekod se iskori5tavalo za 40-60 njegovo dokazivanje u mokraii (v. pogl.2L.). U W'aldenstromovoj makroglobulinemiji u podrudju 7-globulina nalazi se velika koncentracija IgM-a. S obzirom na to da je IgM pentamer, poveianje njegove koncentracije poveiava visko-

znost bolesnikove krvi. Bolesr teSkih lanaca je rijetkosr, a u krvi se nalaze dijelovi teSkih lanaca (o,

t p). Nalazi se kod (a-lanci) kronitne limfaddne leukeili generaliziranih limfoma (7-lanci), intestinalnih limfoma mije (p-lanci). U svim monoklonskim gamapatijama, osim bolesti teSkih lanaca, mogu se pojaviti i krioglobulini. Krioglobulini su serumski imunoglobulini, najde5ie IgG, IgM ili njihove smjese nastale poremeienom sintezom imunoglobulina. Reverzibilno precipitiraju ili geliraju kada se serum hladi ispod tjelesne remperarure. Krioglobulinemija moZe biti zloiudna ili relativno neoPasna, esencijalna krioglobulinemija. Krioglobulini se katkad pojavljuju u bolesnika s multiplim mijelomom ili u drugim B-stanidnim neoplazmama, a od dobroiudnih bolesti mogu se naii u hipergamaglobulinemiji, autoimunosnim bolestima te u razliditim infekcijama. S obzirom na to da se krioglobulini taloZe u hladnome, dokazuju se jednostavno tako da se serum ostavi preko noii u hladioniku. Pri tome treba obratiti paL,nju da se krv nakon uzimanja mora drtati na37'C te pri toj temperaturi i centrifugirati.

e.s. Fibrinogen Fibrinogen se nalazi u krvnoj plazmi koja se dobiva kada se krv, kojojje dodan antikoagulans, odvoji od krvnih elemenata. To j. izduLeni globulin koji se sintetizira u jetri i dija molekularna

Proteini krvi. Proteolitidkim djelovanjem trombina iz fibrinogena odvaja se peptidni ostatak koji sadriava oko 3% dulika fibrinogena, a iz topljivog fibrinogena nastaje fibrilarni netopljivi fibrin koji agregacijom stvara prozirni fibrinski gel. masa iznosi 341kDa. Fiziolo5ka mu je uloga u koagulaciji

Talog koji nastaje kad krv odstoji sadrZava fibrin i krvne stanice. U plazmi zdravih odraslih osoba nalazi se 1,8 do 3,5 g/L fibrinogena. Dijagnostidko znadenje fibrinogen ima poglavito u upalnim stanjima i poremeiajima koagulacije. Fibrinogen je, slitno kolesterolu, dimbenik rizika za koronarnu bolest, a poveianje od 0,6 g/L iznad srednje referentne vrijednosti rizik poveiava 85o/o. Razlike su u koncentraciji pri tome rezultat genskog naslijeda, a vanjski dimbenici nemaju utjecaja. Poveiana koncentracija fibrinogena nalazise u blaiim o5teienjima jetre, jer u takvim stanjima jetra kompenzarorno srvara viSe fibrinogena. Poveiana koncentracija nalazi se i u plazmi trudnica iIi zavrijeme mjese dnice. Koncentracija fibrinogena poveiava se nakon rentgensko ga zraienja, kod fokalnih infekcija kao tonzilirisa, sinusitisa ili kolecistitisa. Osobito se velike koncentracije, i do l0 g/L, mogu naii u akutnim bakterijskim infekcijama, npr. pneumokokima, pri sepsi, a ta-

koder u reumatskoj vruiici i nefrotiikom sindromu. U nefrotitkom je sindromu poveiani fibrinogen takoder rezultat kompenzatorno pojadane sinteze u jetri zboggubi*a albumina. Poveiani fibrinogen uzrokuje i ubrzanje sedimentacije eritrocita. Smanjena koncentracija fibrinogena nalazise pri funkcionalnojjetrenoj insuficijenciji, jer mu je smanjena sinteza u jetri. To se moie naii pri teSkim oSteienjima jetre, u toksidnom hepatitisu, jetrenoj cirozi ili akutnoj atrofiji jetre. Thkoder se koncenrraclja fibrinogena smanjuje u te5kim krvarenjima i kaheksiji pri zloiudnim bolestima. Fibrinogen je malo smanjen i kod tifusa, Sto je iznimka jer je inade poveian kod lnfektivnih bolesti. Nadalje je fibrinogen blago smanjen pri bolesdma koStane srZi, mijeloidne leukemije, perniciozne anemije, Sarlaha i pelagre. Postoji i konstitucionalna fibrinogenopenija, a osobe s takvom fibrinogenopenijom sklone su krvarenjima. Aktivacija koagulacije potide prjelazak fibrinogena u fibrin. Nastale fibrinske molekule sponrano agregiraju i umreZavaju se s pomoiu faktora XIII, time nastaje talog fibrina. Aktivacija susrava fibrinolize dovodi do konverzije plazminogena u aktivni plazmin koji se ugraduje u fibrinogenske i fibrinske fragmente D i E. Zbog kriinih veza izmedu D-domena i fibrinskog ugrulka djelovanjem plazminogena otpu5taju se degradacijski produkti s umreZenih D-domena. Najmanja jedinica je D-dimer. Detekcija D-dimera stoga je pokazatelj reaktivne fibrinolize. Odredivanje D-dimera ima dijagnostidku vrijednost kod tromboembolidkih stanja. Poveiane koncentracije D-dimera indikativne su za prisutnost tromba npr. pri venskoj trombozi, plucnoj embolili i diseminiranoj intravaskularnoj koagulaciji (DIK). D-dimeri se mogu odrediti lateks-turbidimetrijskom metodom kojom se utvrduje koncentracija umreienih fibrinskih degradacijskih produkata. Na polistirenske destice vezenoje monoklonsko antitijelo koje prepoznaje D-dimere. Nakon mijeSanja s uzorkom koji sadriava D-dimere dolazi do aglutinacije. U krvi zdravih odraslih osoba nalazi se manje od 5 mgll- D-dimera. Poveiane koncentracije D-dimera nalaze se u trudnica, starijih osoba, u inne koje se koriste oralnim kontraceptivima i u osoba koje su izloi,ene fizidkom naporu i stresu.

s.6.

Osobine i dijagnosticko znaienje nekih specifiinih proteina

C-reaktivni protein (CRP) glikoprotein je sasavljen od 5 identiinih polipeptidnih monomera. Molekularna masa CRP-a je 118 kDa. VeZe se za fosforilkolin i fosforiletanolamin te polisaharide bakterija iz o5teienoga tkiva, avezenjeje ovisno o kalciju. Yezan aktivira klasidni put komplementa koji poiinje s Clq. VeZe se na receptore limfocita. U serumu zdravih odraslih osoba i adolescenara ima manje od 5 mg/L CRP-a. Koncentracija mu je poveiana kod upalnih bo-

lesti u kojima se mogu naii vrijednosti i do 500 mg/L. Poveiane koncentraclje nalaze se u rano-

185

186

Poglaulie 9

infarktu miokarda, poslijeop eracijme kolorektalnom karcinomu, metasta zamakarcinoma dojke, septikemiji. CRP moze Poraskim komplikacijama, infekcijama Zivianog susrava i u neonatalnoj upalne reakcije. odredivanje CRP-a dobra ie pretrega ze

sti u arerosklerozi

i to je onda

znak

se odreduje imunonefelorazlikovanje bakterijskih, kada je poveian, od virusnih infekcija. cRP metrij ski, i-orrotorbidimetrijski ili radij alnom imunodifu zliom. lanac ima terminalThansferin (Tf). Tlansferin ili siderofilin jest glikoprotein, a polipeptidni vezene na asParasu koje lancima, ne sijalinske skupine na dvama identidnim heterosaharidnim i jajniku' eini najveii dio 0t-8login. Sinre ttzirase u jetri, a manjim dilelom u RES-u, testisima i na taj se naiin t'eljezo transbulina. Ionskom vezom Tf veteFe3*, i to 2 atoma po molekuli Tf, je boje, 5to se iskoriStava i za portira u krvi. Dok je Tf bezbojan, kompreks Tf i terieza ruzidasre Ori- roga 5to veL,e L,eliezo, potreban je za rast kultiviranih stanica' Pa su

,1.go.,ro odredivanj.. stanica in uitro' Molekularna ,r1.io;".rro Tf ili ,...pto.i ,",r""r,rf.rin (TfR) vatniza proliferaciju je masaTf 76,5kD; pa se kod proteinurija relativno lako gubi mokraiom. Postoji oko 20 gense nalazi transferin TfC' Elektroskih v"rilanti koje se sve mogu normalno pojavljivati, a najiesie p,-globulina razlikovad do u podrudju se mogu forezom na agaru, .elrrlora-aceratu ili ceiogelu na poliakritri varijant., i6o!. se transferinske varijante razdvaiaiuizoelektritnim fokusiranjem zdravih odraslih osoba i lamidnom ili agaioznom gelu ili kapilarnom elekrroforezom. u serumu Tf odreduje se imunokemijskim adolescenata konce'tr".iyl Tf iznosi 2,0-3,69lI-. Koncentracija imunonefelometrija i imunoturbidimetrija. Poveiana je u serumu trudnica

merodama kao 5to su jetrenoj cirozi, upalama i infekcijau zadnjem trimestru i u sideropenitnoj anemiji, a smanjena u sindromu i ne,,'", gl"dovanju (zbog sm"nlene sinteze), zloiudnim bolestima, te u nefrotitkom

fritisu zbog gubitka u mokraii. 134 kDa, C.rolopi"zmin (Cp) j. glikoprorein plave boje, relativne molekularne mase od je ceruloplazu cp. vezano koji se nalazio ar-glob,ili"rkJl n"Lryi. viie od 90% bakra u serumu a njegove promjene u serumu pokazatelj su promjena koncentracije min ima \wil"ktiurrorJoksidaze, odr."rl. orob. iadolescente jest 0,2-0,6 g/L. Cpje smanjen u bakra. Referentni interval

"" u reakciji akutne faze, zlo' sonovoj bolesti, nefrotidkom sindromu, teSkim proljevima, a poveian Zudnih iudnim bolestima, kronitnim infekcij"r.r", trod.,oii, pri uzimanju estrogena i opstrukciji i imunoturbidimetrijski. putova. Koncentracija Cp odreduje se imunonefelometrijski dini a,-AI, molea,-antitripsin (a,-41j. N";,,.eidio, oko 90o/o,a,-globulinske frakcije seruma Izoelektridnim fokusirakularne mase 54 kDa.Inhibira aktivnost proteaza, ponajprije tripsina. genotip P,tt, dok se u imaju osobe Zdrave varijante tut, S i Z.

njem mogu se razdvojiti genske pi" i pi". Heterozigoti PiMz imaju neSro smanjehomozigota s manjko- oanr pojavljuje genotip ,r. pokazuju jo5 znakove manjka.Zdrave odrasle osobe i adolescenti imaju nu koncentraciju, "li akutne faze, a neSto je u serumu 0,9-2,0 g/t i-Nl. Poveiana koncentracija nalazi se u reakciji dijagnostidki je vazniji u poveiana i u trudnf ca i i,enakoje uzimaju oralne kontraceptive. a,-Ar kod pankreatitisa i plustanjima porpunog manjka ili smanjen. korr..ntracije koja se pojavljuju proteaze razorno jer neinhibirane irroi.-dr.-". Ulravo'je manjak a-AI uzrok tim bolestima, nemaju pluini emfizem' djeluju na navedene organe. Medutim, neki puSadi s manjkom a,-AT u novorodentadi, a,-AI se sintetizira u jetri, pa moie biti smanjen i pri o5teienju jetre, osobito se imunokemijodreduje jio o takve djece moi,edovesti do jetrene ciroze. Koncentracija ar-Ar skim metodama ( imunonefelometrij om i imunoturbidimetrij om)' u stabilan Haptoglouirri (rrp). Haptoglobin je ar-glikoprotein koji moie vezatihemoglobin eritrociraspada ko-pl.kr, di-. ,pr;.t",," g"ui,"L hemoglobinskog t'eliezau stanjima pojadanog i dva teSka dva laka ta. Sadriava oko z14o ugli'kohidrata. Slidno kao imunoglobulini,.sadriavaju (ot,o') i iedne vrste ,..:ryg (p) lanca, Ianca. Molekula Hp -oi. biti gradena od dviju vrsra lakih 1-1 (or.'9r.)'tip 2-l (o'o' 9r) i tip 2' pa postoje 3 genski determinirana tipa norrnalnih HP, tip a tipa z-2 400 kDa' Koncen)1orrpr1.'t to[k rl"rrra masa tipa 1-1 ;e roo kDa, tipa2-l200 kDa,

Proteini 187 tracija Hp r serumu poveiava se u reakciji akutne faze i u nefrotidkom sindromu. U crnaikim populacijama moie se katkad naii kongenitalna anhaptoglobinemija, tj. potpuna odsutnost Hp u serumu. Male se koncentracije mogu naii u hemolitidkim stanjima i pri akutnom o5teienju je-

;*, ii:.

iiii

i

# f f;

tre. Koncentracija Hp odreduje se imunonefelometrijski i imunoturbidimetrijski, a referentni interval za odrasle osobe i adolescente iznosi 0,3-2,0 g/L Troponin (T"). Postoje tri vrste troponina T, I i C. Ovi proteini pripadaju obiteli Th iz miSiinih stanica koji su vezani na tanki filament miocita. TirT veie druge troponine na tropomiozinsko vlakno miocita. ThI inhibitor je aktomiozinske AIPaze, a ThC na kalcijeve ione. Iz oSteiene miSiine stanice u cirkulaciju najprijeizlaze slobodni citoplazmatski Th, kojeg je oko 4- L}o/o, a porom kompleksirani Th re na kraju strukturno vezani Th. Tako se praienjem Th moZe pratiti infarkt miokarda. TtiT i ThI strukturno se razlikuju, a nalaze se i u miokardu i u skeletnom miSiiju. Strukrurne su razlike omoguiil e razvoj specifidnih antitijel a za €frif i iThl. Sriani se troponin I, irhl, nakon izlaska iz srca u cirkulaciju fragmentira, mko da se u krvi mogu detektirati najmanje tri oblika. ThI je specifiiniji za srce. O odredivanju Th u dijagnostici infarkta miokarda

naii u 17. poglavlju. Tianstiretin. Ovaj je protein najprije identificiran u likvoru kao prealbumin koji veZe tiroksin (TBPA, engl. thiroxine bindirug prealbumin), a tek poslije i u serumu te je dobio naziv transtiretin. Pri elekrroforezi putuje kao slaba vrpca ispred albumina. No, glavni nositelj serumskog tiroksina i trijodtironina jest globulin koji veZe tiroksin (TBG, engl. tbiroxine bindtng globulin), dok su albumin i TBPA sporedni nositelji. TBPA je tetramer koji se sintetizira u stanicama koroidnih spletova. Brza mijena u tijelu dini TBPA dobrim pokazateljem malnutricije i kronidnih molrc se

bolesti. Thanstiretin se odreduje imunonefelometrijski i imunoturbidimetrijski, a referentni interval za odrasle osobe i adolescente iznosi 0,2-0,4 g/L. Komplement. Pod tim nazivom razumijeva se nekoliko proteina, oko 20 faktora u krvi i u tkivnoj tekuiini. Svi se oni sintetiziraju u jetri. Pri elektroforezi putuju uglavnom u zoni 9-globulina. U krvi se nalaze u inaktivnom obliku, a kod upalnih procesa ulaze u niz medusobno povezanih reakcija kojima se aktiviraju uzrokujuii upalu i pospj elujuii fagocic3 tozu i citolizu. Aktivacij a komplemenrr f.-*.t. Faktora anafilatoksinska ta obavlja se na dva nadina, klasidnim C3 konvertaza , C5a aktivnost

ffi

i alternativnim putem. U klasiinom putu djeluje najprije pet proteina oz-

1

P-*

*-.,b-/

nadenih kao komponente Cl do C5, a u alternativnom putu aktivacije sud-

feluju inicijalni faktor (IF), faktor B (proaktivator C3), faktor D (proaktivator konvertaze) i faktor P (proper-

klasidni

put

Cl

a^t

|

vazniji osobito u osoba koje ne stvara-

inhibitor

-

AKIVAToR

i u novorodendadi. Na-

(antigen

kon aktivacije C3 i stvaranja C5-kon-

c5 konvertaza

/

vazodilatacija

-a\1f#i.\';,.lj. /. i+ l| imunosna cs csb c5b i-,.^^-^- c5 c3a uun"r"nCijr c24 lac6 (opsonizacija) t ,/ csb-6 c4tl Crq lacT rt cu'* | c5b-7

din) te C3 i C5. Alternativni je put

iu antitijela

\

I

-

lgG

lact .Jot

citoliza

rn

- lgM)

C5b_9

vertaze daljnja aktivacija komplementa zajednidka je zaklasidan i alternativ-

ni put i sastoji

od slileda C5 do C9 koji napada membrane i uzrokuje ci-

rolizu

(s1.

se

9-5.).

Cijeli proces aktivacije regulira se orlo kratkim Zivotom intermedijara i

Slika 9-5. Aktivacija komplementa. Klasiinim putem

C3 djelovanjem C3-konvertaze ptelazi u C3b koji se veie na testicu koju treba fagocitirati (opsonizacija) putem C3b receptora na membrani neutrofila i makrofaga. C3b takoCler aktivira C3konvertazu uzrokuju(i daljnju aktivaciju C3. Alternativnim putem djelovanjem inicijalnog faktora i properdina aktivira se C3 i C5-konvertaza. Oba puta dovode do stvaranja kompleksa C5b-7 koji se moZe vezatiza membrane bakterija i nakon ve-

laljq

i FQ 9?

qlqkqvqli.qilof

izy.

...-

, " ..

_*

188

Poglaulje 9

tako da

CI komponenta

specifiinim inhibitornim proteinima. Klasidni p": aktivacije podinje s IgG ili IgM. L)z caz*, c4 i cz aktivira se c3 u c3b koji i sam i.,rir" komprekso^ "r,tig.na "k C3. Nastala C3b komponenta uzrokuje opsonizaciju' Pri preko kor,,r.it""e pojadavi "kti.,n".i;u i C5a' Komponente C3a i akrivaciji C3 n"rt"j*i C3a i C5-konvertazakoja ga prevodi u C5b se

akrivnost uzrokujuii oslobad anie vazoaktivnih amina histamina i "r"fil"ioksinsku dalje komponente do C9 koje uzrokuju lizu stanica (npr. eritrocita, seroronin a. rz C5b nastaju fagocite u podruije uPaali i bakterija). C5a i CSb-7 imaju ke^otaktidka svojstva, tj. privlaie C5a imajo

le.

jer se ne mora Alternativni je put brza, nespecifidna obrana protiv prodiruieg organizma, Inicijalni iimbenik kojim aktivirati antitilelima, iako ga mogu akdvirati i IgA ili IgG kompleksi. iimbeniku koji se nalazi u seuz proakrivator C3 zapoiinje taj put istovjetan je tzv. nefritiikom

Daljnji slijed ukljuiuje raz-

-.^br"rrop-iif.rativnim glomerulonefritisom. ima enzimsku aktivnost i napada gradnju C3 i C5 na veie i manje fragmente. V.ei fragment fragment iq.a.i,, komponenru re se veze na stanitne membrane ili imunokomplekse, a manji rumu bolesnika,

djeluje na razne stanice prisutne u upalnim procesima'

'

imunokemiiskim metodama. Razne komponenr. ko^plementa mogu se odrediti raznim

molekula proteina, C1q, C1r i Cls u molarnom odnosu 1 : 2 samo u patololkim stanjima' : 2. Ove su tri komponenre povezane djelovanjem Ct* idisociraju zapodinje klasidni put aki IgM IgG Clq veie se s IgG i IgM i vezanjem ," Lo-pl.ks antigena s

C1

se sastoji

od triju

,"rliiitih

tivacije komplementa.

Inhibiror cl-estera ze ilicl inhibitor (c1 INH) kontrolira prvu reakciju u klasidnom Putu, uzrok je nasljednih angioedea inhibira i plazmin, trombin i kalikrein. Manjak tog inhibitora ma.

nalazi u p-globulinima. To j. polimer sastavljen od dviju podledini aktivacije komplemenca. Reaktant je akut ne fazei zajednidki je klasitnom i alternativnom Putu djelovanja aktivatora konta. Aktivacijom se smanjuje koncent r^ri1^C3 u serumu, a prestankom

C3 jeglikoprotein koji

se

centracija se oPet normalizira.

u klasiinom PuC4 j,et"kod., p-glikoprotein sastavljen od triju podjedinica. Sudieluje samo

tu aktivacije komPlementa.

aktiviC3 proaktivator ili faktor B takoder je p-globulin koji sudjeluje u alternativnom Putu

ranja komplementa.

intervali C3 iC1odreduju se imunonefelomerrijski ili imunoturbidimetrijski, a referentni za C4' g/L i 0,1-0,4 odrasle osobe i adoiescente jesu sljedeii, 0,9-1,8 g/L ze C3

za

postoji nasljedni manjak pojedinih komponenata komplementa. Pri manjku Cl inhibitora dominantno pojavljuju se potkozni' bronhalni i gastrointestinalni koji se ,r"rry.do;. "rrroro-rro manjku C1, CziCLpoj"ulj"edemi, a smanjena je i koncentracija C4ur.ro.rro. Pri nasljednom i antitijela' a je se bolert i,,'rrrrolompleksa u kojoj se prekomjerno stvaraju kompleksi antigena leukocita. Mapri manjku C3 i C3b iostoji sklonost infekcijama i poremeiena je mobilizacija infekcigonokoknim njak Cl do C9 po..,r.r* je s" sklonostima razliditim infekcijama, posebice jama.

smislu poveianja ili smaSekundarne ili stedene promjene faktora komplementa mogu biti u faze, a smanjene u bonjenja njihovih koncentracija u serumu. Poveiane su u reakcijama akutne antigena i antitijela i lestima stvaranja imonoko-pleksa, kad se intenzivno stvaraju kompleksi odreduju, poveiane u upalaodlaZu se u tkivima. Tako su koncentracije C3 ic4,koji se najdeSie a smanjene kad je smanjena ma prouzrodenima bakterijama, u bilijarnoj opstrukciji, amiloidozi, malnutriciji ili kad je pojanjihova sinteza kao u membranoprolif.r"tivnom glomerulonefritisu, lupusu, Sjogrenovu sindromu' reumatoiddan njihov kambol izamkao u ,iri.-ro- eritemskom hemolitiike aneartritisu, DIK-u, pri odbacivanju bubreinog presatka, kod autoimunosne

nom

Proteini gram-negativnih bakterijemija, respiracijskog distresnog sindroma u novorodendeta ili pak zboggubitka proteina u teikim opeklinama i u gastrointestinalnim bolestima . C4 jepoveian i u

^tte,

zloiudnim bolestima. a,-kiseli glikoprotein. To je glikoprotein s mnogo ugljikohidrata i niskom izoelektridnom todkom (pI2,7-3,5). Ima molekularnu masu od 40 kDa. Naziva se jo5 orozomukoidom. To j. protein akutne faze nepoznate uloge. Sintetizira se u jetri, ali i u nekim tumorima. Postoji polimorfizam togaprote inabezjasnogaklinidkog znatenja.Odreduje se imunonefelometrijski i imunoturbidimetrijski. Referentni interval za odrasle osobe i adolescente iznosi 0,5-L,2 g/L. ar-makroglobulin. To j. protein vrlo velike molekularne mase od725 kDa, koji se nalazi u cirkulaciji, gdje moie vezati razne proteaze. Vjerojatno ima ulogu u upalama. MoZe posluZiti u ispitivanju selektivnosti proteinurije, a odreduje se imunokemijskim metodama popur imunonefelometrije i imunoturbidimetrije. Referentni interval za odrasle osobe i adolescente iznosi 1,33,0 g/L.

pr-mikroglobulin je protein koji se nalazi na povrSini nuklearnih stanica i dospijeva u krv limfocitima i tumorskim stanicama. Sastoji se od jednoga polipeptidnog lanca molekularne mase oko I1,8 kDa. Zbogvelidine prolazi glomerule, ali se reapsorbira i katabolizirau proksimalnim rubulima pa se normalno izluduje mokraiom manje od lo/o kolitine koja se u glomerulima filtrira. U serumu je poveiana koncentracija pr-mikroglobulina u bubreZnim bolestima, upalama i u zloiudnim bolestima (multipli mijelom). I-J serumu zdravih odraslih osoba nalazi se 0,8-2,2 mg/ L Br- milro glo bulina. Sinukleini. Ovi se proteini nalaze u Zivdanim zavrdetcima, u blizini simpatidkih vezikula. Sinukleini su selektivni inhibitori fosfolipazeD2. Sl00 B kiseli je sinuklein koji veZe kalcij i preteino se nalazi u glilalnim stanicama. S100 protein ima molekularnu masu od2l kDa. Nalazi se u trima oblicima: Sl00ao, S100a i S100b. To su dimeri sastavljeni od podjedinica aa, aB i pB. Uglavnom se nalaze u poprjeinoprugastim miSiiima, srcu i bubregu, a podjedinice u mozgu. 5100 protein se uglavnom nalazi u astrocitima, a ima ga i u melanocitima, adipocidma, kondrocitima u limfnim dvorovima i ne5to u limfocitima T. tI serumu zdravih osoba ima manje od 0,105 ltg/L S100. Poveiane koncentracije u serumu naleze se kod meningoradikulitisa, encefalitisa, Guillain-Barrdova sindroma, sindroma steiene imunodeficijencije (AIDS, engl. acquired irnrnune def'ciency syndrorne) i periferne neuroparije, tumora SZS-a, osobito meningeoma, glioblastoma i neurinoma. Odreduje se imunokemijskim metodama s obiljeZivaiima. Amiloidi. To su razniproteini fibrilarne strukture koji se pod odredenim patolodkim uvjetima nakupljaju u izvanstanidnim prostorima. Za amiloid je karakteristidno da se boji jodom i Kongo-crvenilom uz zelenu fuorescenciju u polariziranome svjetlu. PatoloSko stanje u kojem se nakuplja amiloid naziva se amiloidozom i nalezi se u raznim bolestima. Amiloid je netopljiv u vodi, a njegove su pretede topljive. Kao pretede amiloida pojavljuju se razliditi proteini, npr. laki lanci Ig u multiplom mijelomu, ili amiloid A protein u kronidnim upalama. Buduii da nakupine amiloida mogu pritiskivati okolno tkivo, amiloidoza je telka bolest i moZe uzrokovati smrt.

Stresni proteini. Stresni proteini (Hsps, engl. heat sbock proteizs) skupina je proteina koji se brzo sintetiziraju pri poviSenoj temperaturi ili u drugim stresnim stanjima. To su zaititni proteini koji se induciraju djelovan;'em toksidnih agenasa, inhibitorima energijskog metabolizma, parogenim miftroorganizmima, ishemijom i opienito raznim oblicima srresa. Odgovor na toplinski Sok opieniti je odgovor na stres. Pri stresu nastaju nenormalno agregirani proteini. Stresni proteini Stite stanicu tako da pomaZu denaturaciju ili degradaciju proteina. Stresni su proteini prisutni u fiziololkim uvjetima u maloj koncentraciji, a sudjeluju u strukturiranju i translokaciji proteina, prijenosu signala, aktiviranju razliditih regulatornih proteina, organizacrjistanidnoga skeleta i predstavljanju antigena. Veiina stresnih proteina pripada skupini molekularnih pratitelja

189

190

Poglaulie 9

u strukturiranju i sazri(engl. rnolecular cbaperons).T"i pojam oznaiuje molekule koje sudjeluju nekoliko skupina: mali stresni jevanju novosintetiziranih proteina. Stresni su proteini svrstani u te veliki stresni proteini. Mali streproteini, stresni proreini +6-eo,obiterj Hsp70, obitelj Hsp90 programirane sranidne smrti ili sni proteini imaju razlidite funkcije, -.do ostalim, u regulaciji iz obitelj Hsp70 sudleluju u strukturiranju proteina, apoptozi' predstavljanju apoproze. Proteini

presatka protein iouoai u vezu s kardiovaskularnim bolestima, odbacivanjem yaLanje za funkcioniranje stejezgri. i t.r"rpilo^ ,"k". Hsp90 nalazise u membrani, citosolu i u liganda. Stanja u kojima roidnih receptora, jer ih odriava u inaktivnome stanju u odsutnosti tkiva, poviSena tjelesna ozljede dolazi do poveiane ekspresije stresnih proteina jesu ishemijske

antigena i sl. Taj

se

remperatura, upale, infekcije, mehanidke ozljede, sok i otrovanja.

s.7. Metode odredivanja ukupnih proteina razlidite metode' koje odredivanje koncentracija ukupnih proteina mogu se primjenjivati

za

1. metode kojima se odreduje prema principima kojima se koriste mogu svrstati u tri skupine: podrudju spepro,.ir,rki du5ik, 2. ,p.ktrofotometrijske metode (u vidljivom i ultralubidastom Ltt.) i 3. metode kojima se mjeri refrakcija'

se

Metode u kojima se odreduje proteinski duiik

r.

Na tom principu djeluju sve metode koje

se temelje na

klasiinoj Kjeldahlovoj metodi. Pri

kolidina duSika mnoii polazi od^pr.,pori".,k da proteini sadrtauaiu 160/o duSika, Pa se No, svi serumf"ktoro- 6,25 (roozo,ie;) da bi se dobila masa, odnosno koncentracija proteina.

romu

se

15,1 do 16,8. Za tazne proteinske ski proteini nemaju toino'16% dusika i taj postotak varira od ali odvei dufr"k i;. trebalo bi uzimati faktore od 6 do G,6s. Kjeldahlova je metoda vrlo todna, kao referenrna metoda i prema njoj gotrajna za rutinsku primjenu, pa se danas primjenjuje samo ]. UiiUriraju druge metode za odredivanje koncentracije ukupnih proteina' z.

Spektrofotometrij ske metode odredivanje koncentracije proteina temelji na sredini s pepddnom vebiuretskoj reakciji. princip je sljedeii: ioni bakra reagiraju u alkalnoj za odredivanje koncentrazom deja'ci ljubidasto oboieni kompleks. ova se metoda preporutuje s Folin-Ciocalteuometoda i ubrojiti se cije ukupnih proteina u serumu. [J ovu skupinu moie i dodama reakcija tirozina vim fenolrkirn ,""gensom u kojojje, osim biuretske reakcije, prisutna od same biuretske reakcii triptofana iz proleina s fenolrkinr r""gensom. Metoda je osjetljivija u tielesnim tekuiinaproteina j., p" se zato primjenjuje za odredivanle malih koncentracija

A) Ovoj skupini meroda pripada metoda u kojoj

se

ma.

B) Mjerenje molekularne apsorpcije u ultraljubitastom podruiju spektra elektromagnerno zraienie u ultraljubidastom dijelu spektra Otopine proteina "prorbir"yu ovisi o broju peptidnih (210 nm, ZL5 nm, 279 nm).Sposobnosr apsorpc ije zraienia kod 215 nm uzrokuju pepapsorpciju Tu tirozina. yeza,a kod 279 nmu vezi je s prisutnoSiu aminokiseline se mjeri apsorpcija kod 280 ddne veze (215 nm) i aromatski Prsten tirozina (279 nm). veiinom frakcija, 5to napose dolazi do iznm, pa na todnost utjeie sadrLajtirorin" pojedinih proteinskih je vrlo osjetljiva, pa se odMetoda rai,ajau patoloSkim promjenama odnosa proteinskih ft"k iy". nm, a kod 215 nm serum se razrjeduje redivanje provodi razrijedenim serumom r : r00 kod 280 dak

I

: 1.000. Rabi

se za

odredivanje malih koncentracija proteina'

191 :. Mjerenje refrakcije Indeks refrakcije 1 neke otopine ovisi o koncentraciji otopljenih krutih tvari u dotidnoj otopini. Refrakcija seruma ili plazme takoder ovisi najveiim dijelom o sadrZaju proteina. Postoje gotove tablice iz kojih se na osnovi refrakcijskog indeksa moZe odditati koncentracija proteina.

s.6.1. Odredivanje ukupnih proteina u

serumu biuretskom metodom Biuretsku reakciju daju dvovalentni ioni bakra u slabo alkalnoj sredini s proteinima. Mehanijoi porpuno jasan. Vjerojatno je da se Cu2* veZe koordinatnim vezama na 4

zam te reakcije nije

N atoma iz susjednih peptidnih veza i pri tome nastaje obojeni kelatni

OR [l R_C-N \/ Cu /\ R_C-N ill OR

spoj.

RO lll

N_C_R

N_C_R

lil RO

biuret

Reakciju daju proteini, polipeptidi i peptidi, a amonijak, aminokiseline i dipeptidi ne reagiraju. Reakcija nije sasvim specifidna, nego je daju spojevi koji sadrZavaju barem dvrje NH2CO -, NH2CH, -, NH2CS - i slidne skupine. No, buduii da tih spojeva kao i peptida u serumu nema ili ih ima tek vrlo malo, oni praktidki ne smetaju, pa su biuretske metode dovoljno todne i precizne zeodredivanje serumskih proteina. Kako su one i vrlo jednostavne i brze, to su danas metode

izbora za odredivanje serumskih proteina. Prednost je biuretske reakcije u tome 5to je apsorpcijski maksimum za sve proteine oko 456 nm, pa na rezultate ne utjede odnos proteinskih frakcija. Prva biuretska metoda potjeie od Kingsleya. Danas postoji mnogo njezinih modifikacija, ave(ina ih odreduje masu proteina od 1 do 15 mg, pri demu intenzitet reakcije ovisi o broju peptidnih yeze. Razlike izmedu raznih metoda uglavnom su u sastavu samog reagensa. Reagens koji je opisao Veichselbaum sadriava, osim bakrova sulfata, jo5 kalij-natrijev tartarat fkompleksno veZe i

(OH)r) i KJ (sprjedava autoredukciju bakra)]. U nekim reagensima dodaje se i ureja koja u koncentraciji od 6 moI/L sprjedava zamuienje uzorka, 5to se moZe sprjedava taloZenje bakra kao Cu

pojaviti osobito ako se radi s krvnom plazmom. Pojedinadne metode za odredivanje ukupnih proteina biuretskom metodom opisane su u 2. izdanju ovo g udZbenika.

Referentni intervali 66 do 8l g/L za ambulantne odrasle osobe 60 do 78 g/L zalei.e(e odrasle osobe

e.8. Metode odredivanja koncentracije albumina Razne merode za odredivanje koncentracije albumina mogu se svrstati u nekoliko skupina.

l. Metode u kojima se albumin odreduje kjeldahlizacijom nakon isoljavanja globulina. Zetoje pouebno odrediti ukupni du5ik, albuminski duiik koji zaostaje nakon taloi,enjaglobulina i, posebno, neproteinski du5ik. Globulini se taloie po Howeu s 1,514 mol/L NarSO, ili po

192

Poglaulje 9

Hannau s 1,587 mol/L NarSOr. Nakon alotenja globulina uzorak se filtrira i u dilelu filtrata, koji sadrZava 0,1 mL seruma, odredi se du5ik. Iz dobivenih podataka "liLuotrrom i za koncen,r".iyo du5ika izrainnese koncenuacijaukupnih proteina, albumina globulina: (g/f) x 6,25) dulik neproteinski ukupni proteini (g/f) = fukupni du5ik G/f) x (g/r) 6,251 albumini (g/I-) -ldosik u filtratu (g/I-) - neproteinski duiik globulini fitrl = [ukupni proteini G/f) - albumin (g/f)]' i. M.tod."o koli-" r. tt"kon isoljavanja globulina albumini odreduiu biuretskom metodom. Taloienje se provodi, kao i u prethodnim metodama, s NATSO4 ili s NarSOr. Amonijev je uveo dodasulfat nije prikla d^i r^taloZenje globulina jer smeta u biuretskoj reakciji. Kingsley i etervanje erera prije centrifugiranj", di-. se postiZe da ralog globulina pliva izmedu vodenog

Campbellu

i

nog sloja, a to olakSava odvajanje. indikatorom, 3. tvt"tode u kojima se albumin izravno odreduje tako da se veie s bojom u raznim metodama sluie s kojim daje promjenu boje (tzv. indikatorska grje5ka). Kao indikatori

bromkrezol-r.lenilo, rn.iil-orani,

ili 2-(4'-dihidroksiazobenzen)-benzojeva

kiselina (HABA).

Metoda s bromkre zol-zelenilom prilagodena je za izvedbu na automatskim analizatorima. 4. tmunokemijske metode, u kojima se albumin odreduje imunonefelometrijski i imunoturbidimetrijski. preporuiene metode za odredivanje albumina u serumu jesu imunonefelometrija i imunoturbidimetrija te spektrofotometrijska metoda s bromkre zol-zelenllom. Referentni interval za odrasle osobe iznosi 40,6-51,4 g/L.

s.s. Metode odredivania koncentracije fibrinogena u Plazmi preporutena metod a za odredivanje koncentracije fibrinogena jest koagulometrija. Referentni intJrv al za odrasle osobe iznosi 1,8 do 3,5 g/L. U prollosti su se primjenjivale razhiite metode od kojih su neke detaljno opisane u2. izdaniu ovog udibenika.

e.10.

lmunokemijske metode za dokazivanje i odredivanie Proteina

Imunokemijske metode primjenjuju se za otlrivanje, razlikovanje i mjerenje koncentracije razliditih antigena i antitijela prisutnih u serumu ili u drugim tjelesnim tekuiinama. Sve se imuannokemijske --.tod. ..-.iy. na reakciji antigena i antitijela . Zahvajuiuii specifidnosti reakcije jednostavne. tigena i antitijela imunokemijske su metode vrlo osjetljive, reproducibilne i Imunokemijske se metode svrstavaju u dvije skupine, neobiljeZene ili direktne (ttPt imunodifazijai imunonefelometrqa) i obitleiene metode (radioimunokemijska, enzimimunokemijska i sl.) Loje zahtijevaju uporabu obiljeiivada (izotopa, enzima, fuorofora i dr.). Antigeni ieg) jeru proteini, polipeptidi, nukleinske kiseline ili neke druge tvari koje uvedene u srran i org iir^m induciraju stvaranje antitijela, ili male molekuke (hapteni), koje same ne mogu inducirlti stvaranje antitijela, nego ih je prije potrebno vezati na veie proteine molekule imanosaie. Kao nosadi mogu posluZiti npr. govedi serumski albumin ili tireoglobulin. Antigeni Da imunokompleksa. velikih stvaranja vezanjem kriinim ju sposobnost reagi t""j^s antitijelima i strukturimati mora bi neka war imalJrporobrrost stvaranja anritijela, tj. da bi bila imunogena, dino stabilne dijelove molekule, molekularnu masu barem oko 10 000, kompleksnu strukturu,

Proteini 193 jelovi se molekule ne smiju ponavljati, epitop ili antigenska determinanta treba biti smje5rena u molekuli tako da je mogui pristup antitijelu i stvaranje kompleksa. Osim toga, mora po strukruri biti strana organizmu u kojem treba prouzroditi imunoloiku reakciju i mora se metabolizirati. Antitijela (At, engl. anti body)jesu proteini sposobni specifitno vezati rezneprirodne ili sintetidke antigene. Oni su po svojoj kemijskoj strukturi imunoglobulini. Specifidnost antitijela odreduje razliiit slijed aminokiselina na N-terminalnom kraju imunoglobulinskih lanaca. Imunosna reakcija u organizmu dogada se tako da imunogen nakon ulaska u strani organizam stimulira limfocite sposobne da se dijele i stvaraju plazma-stanice koje lude antitijela. Pri tome svaki soj plazma-stanica (klon) stvara specifidna, monoklonska antitijela. Ako je antigen kompleksan, uzrokuje stvaranje vi5e sojeva ili klonova koji lute antittjela razliiite specifitnosti, tj. poliklonska anritijela. Energija vezanjaepitopa na antigenu s antitijelom oznaduje afinitet antigena prema antitijelu, a ukupna energija vezanja antitijela s antigenom naziva se avidnoSiu antitijela i obuhvaia zbroj afiniteta za sve mjesta vezanja na antitijelu. IgG ima npr. dva mjestavezanjapo molekuli, a IgM ima deset takvih mjesta, pa ie njegova avidnost ve(a. Stvorena antitijela reagiraju i in uitro s antigenima pa sluZe kao reagensi u imunokemijskim metodama. Kako monoklonska antitijela reagiraju samo s jednim epitopom na antigenu, px se zato kriZno ne veZu i ne stvaraju makromolekularne precipitate, nisu pogodna za imunoprecipitaciju i hemagludnaciju, nego se upotrebljavaju u drugim imunokemijskim metodama (npr. u imunokemijskim metodama s obiljeienim reagesima).

Mehanizam reakcije vezanjaantigena s antitijelom. Vezanje antigena i antitijela odigrava se u trima fazamapri demu nastaju van der Waalsove, ionske i vodikoveveze te hidrofobne interakcije. U prvoj ili primarnoj faziveie se multivalentni antigen s antitijelom i ta je reakcija vrlo brza, azatim u drugoj fazi kompleksi nastaju sporije:

A&+

n,f asn,f nsn,o

j. mnogo veia od k, kada se stvara kompleks od a molekula antigenai b molekula antitijela. je Sn u jednadZbi oznaden broj epitopa po molekuli antigena. Ovisno o koncentracijama, Ag i At kompleksi mogu se u treioj faziL.rii,no yezeti i stvarati veie komplekse koji precipitiraju. Na brzinu tih reakcija utjedu koncentracija elektrolita, pH, temperarura, tip antigena i antitijela, kao i njihov afinitet i avidnost. Za precipitaciju kompleksa iz otopine vaian je odnos koncentracija antigena i antitijela. Ako je antitijelo u veiem suviSku, onda je veii broj mjestevezanja na antitijelu od broja epitopa na antigenu pa se epitopi brzo zasite antitijelom, i to prije nego 5to moZe doii do kriinog vezanja. Nastaju mali kompleksi antigena i antitijela koji su ropljivi. No, ako je antitijelo u malom suvi5ku, oko 2-3 molekule na jednu molekulu antigena, dolazi do kriZno gvezanja i stvaraju se veliki netopljivi kompleksi koji precipitiraju iz otopine. Ako je antigen u velikom suviSku, opet je manja vjerojatnost stvaranja veiih kompleksa, jer se mjesta vezanja na antitijelu brzo zasite anrigenom, pa se stvaraju mali topljivi kompleksi od najviSe dvrje molekule antigena s;'ednom molekulom antitijela. To se moie prikazati krivuljom precipitacije, pri temu je koncentracija antitijela konstantna, a mijenja se koncentracija antigena (sl. 9-6.). U zoni I pod uvjetima kada je koncentracija antigena mnogo manja od koncenrracije antitijela u otopini ima slobodnih, nevezanih antitijela, a kompleksi AgAt maleni su i topljivi. Poveianjem koncentracije antigena u zoni ekvivalencije njihova se koncentracija pribliiava koncentraciji antitijela, stvaraju se veliki kompleksi i u toj zoni dolazido kriinog vezarya. Daljnjim poveianjem koncentracije antigena ova prelazi koncentraciju antitijela, poveiava se odnos Ag/At i u tj. h

194

Poglaufe 9

otopini ostaju slobodne molekule antigena, gena 1

gena i antitijela u zoni ekvivalencije i tada dolazido imunopre-

antitijelo

cipitacije.

E

g

(! o-

,-

E

o

o o

o-\ +

:lSl ,r$i

ffii, i$ii

'#'

flri

i$j

fil

njim promjerom kationa, odnosno aniona. Na topljivost Proteina utjeiu i laniasti (linearni) polimeri. Sto je molekularna

Slika 9-6. Krivulja precipitacije. 1 . Zona u kojoj je viiak antitijela i niski odnos AglAt. 2.Zona ekvivalencije i 3. zona u kojoj postoje viiak antigena i visoki odnos A9lAt.

,ffi

antigena. Jadina inhibicije vezanje antigena na antitUelo raste s porastom promjera iona. Zato treba izabrati pufer sa 5to ma-

-4 antigena

rl: l; :lgll

Osim izbora odredene koncentracije antitijela u odnosu na moguie koncentracije antigena koji se odreduje, za imunoPrecipitaciju je vaL,an izbor odgovarajuieg pufera i polimere.Izbor je pufera vaLan,jer vrsta iona i ionska jakost utjedu na vezanje antigena s antitijelom. Vezanje kadonskih antigena inhibiraju kationske soli, a anioni inhibiraju vezanje anionskih

o

Koncentracija

kompleksi anti-

antigen (o

=

i

a

antitijela su mali. Prema tome, optimalni je odnos anti-

masa takvogpolimera ve(e,to je topljivost proteina manja.Za-

to

se dodavanjem polimera veie molekularne mase otopini,

poj adava precipitacij a imunokompleksa. Kao linearni polimeri

poliedlenglikol (PEG), polipropilenglikol, polivinilni alkohol, polivinilpirolidon, dekstran i posebno modificirana celuloza. Najbolji je PEG u koncentraciji 30-50 g/L, jer ima relativno veliku molekularnu masu, Ianac mu je linearan i slabo se grana' a dobro je topljiv u vodi. u tu

se svrhu rabe

;ii ,i:1i'

,il('

,iii jr,

e.10.1.

rlil ,ii,

lmunokemijske metode u gelu

Imunodifuzijske metode provode se u agaru ili agarozi. Ovaj polukruti medil stabilizira difuziju, apogodan je i zato Sto se u njemu dobro vide precipitacijski lukovi. Kao i u otopinama, i u gelu na reakciju antigena s antitijelom utjedu koncentracija soli, prisutnost landanih polimera i odnos koncentracija antigena i antitijela. Difuzija reaktanata u polukrutom gelu moie se prikaza-

d Fickovom jednadZbom:

#=-oof gdje dQ oznaduje

koliiinu difundirajuie tvari koja u vremenu t prode ftroz podrudje A, dc/dx

oznaduje koncentracijski gradijent, a D je koeficijent difuzije. Imunoreakcija zapodinje kada se fronte antigena i antitijela koji difundiraju jedan prema drugom prekriju, ali stvaranje precipitacrjskog luka zapodinje tek kada je antitijelo u malom suvi$ku.

Tijekom difuzije precipitacijski

se

luk

viSe puta stvara

i otapa dok

se ne

postigne stanje ravnote-

te.

Kvalitativne imunokemijske metode u gelu. Dvije kvalitativne imunokemijske metode u gelu koje se temelje na pasivn oj difuzijijesu jednostruka imunodifuzija (Oudin) i dvostruka imunodifuzija (Ouchterlony). U jednostrukoj imunodifuziji koncentracijski se gradijent uspostavlja samo za jedanreakrant, npr. antigen koji difundira kroz gel koji sadriava antitUelo. Ta se metoda primjenjuje za raz\ikovanje antigena. Ouchterlonyjeva dvostruka imunodifuziia rabi se za dokazivanje idenriteta proteinskih tvari. Koncenrracijski se gradijent uspostavlja i za antigen i za anti' tijelo, a oni difundiraju jedan prema drugom do upsostav\anjaravnoteie i nastanka precipitacijske linije.

Kvantitativne imunokemijske metode u gelu. Imunokemijske metode koje se primjenjuju za odredivanje koncentracije antigena jesu radijalna imuno dlfinija u gelu i elektroimunoprecipi-

;l

Proteini 195

ilI ilir

'ilii'

,llii, lllllil

iltili

iillli

protacija. Radijalnom imunodifuzijom (RID) u gelu mogu se odrediti koncentraciie pojedinih zato prikladna je osobito teina, u serumu, likvoru ili u drugim tjelesnim tekuiinama. Ta metoda (osjetljiiro iziskuje vrlo malo uzorka i pogodna je za odredivanje malih koncentracija proteina kvan,,orr i"rrori 5 pglml-). Elektroi-rmopr..ipitacija (Laurell), >>roket>Usjedne>vezari>trovanje>vara>katalitidkih.. aminokiselina (sl. l3-11.). Zaro se hipoteza naziva induciranom spremnoSiu. Kompetitivna je inhibicija reverzibilna i ovisi o odnosu koncentracija supstrata i inhibitora. Intenzitet inhibicij e izr airn j e konstantom inhibicije K,:

r,=lslll [EI] Za kompetitivnu j e inhibiciju karakteristidno da u Lineweaver-Burkovu dijagramu grafidkog prikaza inhibirana reakcija ima isti l/V-"* kao i neinhibirana reakcija, tj. ne mijenja se maksimalna brzina reakcije (V-"*). Poveianjem koncentracije supstrata moie se nadjadati utjecaj kompetitivnog inhibitora. Ako se dovoljno poveia koncentracija supstrata moie se u potpunosti istisnuti kompetitivni inhibitor i postiii maksimalna brzina V-"*' Nekompetitivni se inhibitor ne veLe za aktivni centar, nego se reverzibilno vei,e za drugo mjesto enzimskog proteina i time uzrokuje promjenu

enztm

konformacije enzima. Tako promijenjeni enzim moZe onda vezatisupstrat, ali se kompleks ES ne razgrl\Inhibicija se odituje u sniienju U^*

i\bicije karakterizirapoveianje o,.f" f'v-:' odsjedka u Lineweaver-Burkovu dijagra\ nepromijenjeni - X_ f. 1. ", nagib pravca strmiji.

reakcija katalize sporije tede. Taj tip enzrm

Slika 13-11. Kompetitivna inhibicija.

-

a)

pribliZavanjem supstrata, kontaktne

i

>katalitiike< aminokiseline zauzimaju pogodan poloZaj; b) - supstrat vezan za aktivni centar; c) - inhibitor vezan za aktivni centar, ali >katalitiika< aminokiselina (B) nije u poloZaju pogodnom za katalitiiko djelovanje.

U metabolitklm procesima, koji su u organizmu regulirani mehanizmom negativne povratne sprege, produkt reakcije desto djeluje kao nekompetitivni inhibitor. Alosteriika inhibicija ne ovisi o koncentraciji supstrata, nego samo o koncentraciji inhibitora . Zato se ne sprjedava poveianjem koncentracije supstrata. Akompetitivna inhiblcija nasraje kad se inhibitor veL,e za vei stvoreni kompleks ES i time onemoguiuje disocijaciju toga kompleksa na slobodni enzim i produkt reakcije. Na Lineweaver-Bur-

Enzirni koyu dijagramu karakterizira ju promjena odsjedka na apscisi

ti $ (sl. l3-12.),rj. poveianje K,,, i smanjenj€ V-"". Postoji jo5 jedan sluiaj inhibicije. Naime, neki

fi

i ordina-

se enzimi inhibiraju i velikim vi5kom supsrrara. To se moZe tumaditi tako da pri prevelikoj koncentraciji supstrata velik broj njegovih molekula smetaju jedne drugima pirvezanju za aktivni centar enzima (sl. l3-8.) . Za tajje tip inhibicije karakteristidno da se u Linewaever-Burkovu grafidkom prikazu pravac u blizini ordinate, tj. kod veiih koncentracija supstrata uvija prema gore. Takoder, brzinu reakcije kod reverzibilnih enzimskih reakcija moZe smanjiti i nakupljanje produkata reakcije u odvei velikim koncentracijama, jer u tom sludaju produkt reakcije postaje supstrat za povratnu reakciju.

13.2.s.

253

+

-1 rK

1

tsl

Slika 13-12. Grafitko odredivanje tipa inhibicije po Lineweaver-Burku. a) neinhibirana enzimska reakcija; b) nekompetitivna inhibicija; c) kompetitivna inhibicija; d) akom petitivna inhibicija.

Aktivacija

Da bi neki enzim oditovao punu aktivnost, iesto je potrebno da se aktivira. NajdeSie su aktivatori razniioni. Amilazi jepotreban aktivator Cl-, arginaziCoz+ ili Mnz+, ALP-u Mf* iZnz+ itd. Katkad, osobito u sludaju dvovalentnih iona, ovi se mogu zamijeniti kao aktivatori. U sludaju enzima koji sadriavaju SH-skupine kao aktivatori sluZe sulfhidrilni spojevi, koji Stite SH-skupine enzima od oksidacije. Takav je primjer kreadn-kinaza (CK) koja za svoje optimalno djelovanje treba glutation ili N-acetilcistein (NAC) ili neki slidan tiolski spoj.

13.3. Enzimske reakcije s dvama

supstratima ili viSe njih

Osim enzimske reakcije u kojoj enzim reagira s jednim supstratom, postoje enzimske reakcije u kojima enzim reagira s dvama ili trima supstratima i u kojima nastaju dva ili viSe produkata reakcije. Tako npr. transferaze prenose odredene skupine s jednog supstrata na drugi. Mehanizam je takvih reakcija sloZeniji, ali, ako se varira samo koncentracija jednog supstrata, a koncentracije drugih su konstantne, onda zavarirani supstrat takoder vrijedi Michaelis-Mentenov izraz

" = *#.

U reakciji s dvama supstratima u kojoj nastaju dva produkta:

A+B=P+Q teii sekvencijalno, i to tako da enzim stvara kompleks s jednim supstratom na koji se zatim veZe drugi supstrat u ternarni kompleks izkojegse sekvencijalno disociraju i produkti (sl. 13-13.).

postoji viSe moguinosti reakcijskog mehanizma. Reakcija moZe

E+A==EA EA +

B:

(EAB

-

EQ:E

EPQ)+ EQ+ P +Q

Drugi je tip reakcije u kojoj enzim reagira izmjenidno sa supstratima, prelazeii u dva enzimska oblika (E i E') kao 5to stolnoteniska loptica prelazi s jedne na drugu stranu, pa se to naziva >>ping-pong mehanizmome< GGT AGA

- a-glikozidaza

BGAL

-

AST ALP

Id H

zima prethodno pripremiti. Inhibitori se mogu ukloniti razlititim na-

p-glikozidaza

Slika 13-24.Aktivnostienzima iizoenzimski profili

iinima prethodne pripreme molrau mokra(i u bolesnika zl?)*

glgn-s:g!9"lgrlli*r:49t-9-q:s3lq$y!qil,

--

s

akutnim

(e za analizu (dtializa mokraie, gelfrkraclja na Sephadex-G-50, a kat-

Enzirni 273 kad je dovoljno samo mokraiu razrljedid (.tpt za odredivanje NAGA i nekih drugih glikozidaza). Metode odredivanja aktivnosti u mokraii odgovarajuie su optimirane metode, koje se inade primjenjuju i za odredivanje aktivnosti istog enzima u serumu. Detaljnije o enzimima u mokraii moie se naii u odgovarajuioj literaturi.

13

rs. Dijagnostiiki znacaJnr enzimi

13.1s.1.

Laktat-dehidrogenaza (LD) (L-laktat: NAD-oksidoreduktaza,

EC.1 .1 .1

.27)

Laktat dehidrogenaza je enzim koji sudjeluje u ftrajnjoj reakciji glikolize, tj. anaerobne razgradnje glukoze. Krajnji produkt glikolize jest LJaktat nastao iz piruvata. U miSiiima se tijekom njihova rada nakuplja laktat nasrao glikoliddkim putem 5to se otituje osjeiajem umora. LD kataIizira reverzibilnu reakciju prjelaska piruvata u laktat.

CH. CH. l"pH9,2 l" _-' H_C-OH + NAD* C:O + NADH PH7,5 , COOH COOH

+ H*

I

Llaktat

piruvat

U toj, reverzibilnoj reakciji ravnoteZa reakcije pomaknuta je u smjeru stvaranja laktata. Reak-

) piruvat, tede optimalno kod pH 8,8 do 9,8, dok reakcija u smjeru piruvat laktat, tede optimalno kod pH 7 ,2 do 7,8. Enzim je izoliran i dobiven u kristalnome stanju. Sadriava SH-skupine, vjerojatno u aktivnom centru, jer su te skupine vaine za njegovo katalitiiko djelovanje. Zbos toga se LD inhibira p-kloromerkuribenzoarom, a reaktivira cisteinom. Dalje inhibitorno djeluju N-etilmaleinid, oksalati, jodati, borati, sulfit, kao i vi5ak piruvata i laktata. LD je rerramer sastavljen od 4 monomera, polipeptidnih podjedinica. Djelovanjem 12 mol/ L ureje ili 5 mol/L gvanidina molekula LD-a mote se razgraditi na svoje monomere. O sastavu, kombinaciji monomera ovisi izoenzimski oblik LD-a. LD se pojavljuje u multimolekularnim oblicimaiizoenzimima. Ovisno o kombinaciji monomera, postoji 5 izoenzima koji se oznaduju kao LD-1, LD-z, LD-3, LD-4 i LD-5. LD-1 sastoji se od 4 jednaka H-monomera (engl. beart, stce), aLD-5 od 4lednaka Mtetramer Mr oko 120 kDa monomera (engl. rnuscle, miSii). LD-z sadriava 3 H i I M-podjedinicu, LD-3 izgraden je od po 2H i2M, aLD-4 od I H i 3 M-monomera (sl. + cija u smjeru laktat

+

13-25).

M-podjedinica nalazise u tkivima u kojima se dogada anaerobni metabolizam (skelemi miSiii), a H-podjedinica uglavnom se nalazi u tkivima u kojima se dogadaju aerobni metaboliiki procesi, kao npr. u miokardu. LD reagira samo s Llaktatom i s nikotinamid-adenin-dinukleotidom (NAD, odnosno NADHT, dok ne reagira s NADP, odnosno NADPH2. LD je u stanici lokaliziran iskljuiivo u citoplazmi,pa je dovoljno da se promijeni samo propusnost stanidne membrane da enzim iz citoplazme prijede u cirkulaciju i da se aktivnost u serumu poveia. Zbogtoga mu se aktivnost u serumu poveia i pri lakSim oSteienjima tkiva u kojima se nalazi. Klinitko znatenje. Kao enzim koji sudjeluje u glikolizi, LD je Siroko rasprostranjen u raznim tkivima i organima (sL 13-26.).

!

It! ttt

!

obradba s 12 mol/L ureje ili 5 mol/L gvanidina

I

E trt

E E

+++

EE]trI

EE@ tf@@ @@@

I @ @ @ @

podjedinice Mr oko 30 kDa

Slika 1 3-25. Elektroforetiiki razdvojeni izoenzimi LD-a. Sastav tetramera od dviju vrsta monomera (Htr i ME).

274

Poglaufe I

j

u/g

NajviSe LD-a ima u jetri i skeletnoj muskulaturi, zatim

180

ga ima mnogo u srdanom miSiiu, bubregu, gudteradi, sleze-

ni, pluiima, posteljici, eritrocitima, trombocitima, leukocitima itd. Prema tome, pripada enzimima koji nisu osobito specifidni, odnosno karakteristidni za neki organ. Kod srdanog infarkta aktivnost LD-a u serumu poiinje se poveiavati oko 8-10 sati nakon infarkta, te maksimalnu aktivnost doseZe nakon 3 do 5 dana. To poveianje aktivnosti doseie

160

140 120

vrijednosti

100

i do peterostruko veie od gornje granice

refe-

rentnog intervala. Nakon toga se pri nekompliciranom infarktu aktivnost podinje smanjivati i 8 do 14 dana poslije infarkta je unutar granica referentnog intervala. Poveianje aktivnosti LD-a nelto je sporije od poveianja CK-a i ASTa, ali se i sporije vra(ana vrijednost unutar granica referentnog intervala. Uzrok sporijemu smanjivanju aktivnosti LD-a u odnosu na ostala dva spomenuta enzima jest dulji

'- :u 6ie (UE

v

(o

o

Fg 's 6 €E €E Eb 5 = 3'O,6'=

's

A

3o

Slika 13-26. Rasprostranjenost

LD-a u raznim organima.

poluvijek LD-a (srdanog LD-l) u cirkulaciji, koji iznosi 53-173 sata. Eritrociti i leukociti sadrtavaju mnogo LD-a. Zato se u hemolitidkim anemijama nalaze visoke aktivnosti u serumu (i do 5 puta vi5e od gornje granice referentnog intervala). Joi su veie aktivnosti u pernicioznoj anemiji, i do 30

puta iznad gornje granice referentnog intervala, ali se brzo smanjuju tijekom terapije. Aktivnost LD-a u serumu takoder je poveiana kod mijeloidne leukemije, dok je u limfatidnoj leukemiji obidno unutar referentnog intervala. Thkoder je aktivnost LD-a poveiana u infektivnoj mononukleozi. U jetrenim bolestima i bolestima Zudnih vodova obiino se nalazi umjereno poveianje aktivnosti LD-a u serumu. U akutnome virusnom hepatitisu povetanjeje aktivnosti LD-a obidno 2 do 3 puta iznad gornje granice referentnog intervala, dok je u toksidnom hepatitisu (hepatotoksidni agensi kao CCl4, arsenovi spojevi itd.) jo5 veie. U kronidnom hepatitisu LD je u serumu obiino unutar referentnog intervala, a poveian je u jetrenoj cirozi, no, ne toliko kao aktivnost aminotransferaza. Za razhku od hepatocelularne Zutice, u kolestatskoj je Zutici aktivnost LD-a u serumu obidno unurar referentnog intervala ili slabo poveiana. Medutim, kod metastaza, a osobito metastaza u jetri, nalazi se visoka aktivnost LD-a koja potjede iz samo ge zlo(adnog tkiva koje obiluje glikoli-

tidkim enzimima. Za poveianje aktivnosti LD-a u zloiudnim bolestima karakteristidno je da prevladavaju spori izoenzimiLD- i LD-5. Zbognespecifidnosti LD-a za pojedine organe, desto se postavlja pitanje iz kojeg organa enzim potjede, tj. koji je organ oiteien. Stoga se mogu odrediti i izoenzimi LD-a, jer su veie specifitnosti za pojedine organe. Postoje tri razlidite izoenzimske slike u pojedinim tkivima, 5to moie biti vaZno za dijagnostiku. Anodna skupina, u kojoj prevladavaju LD-l iLD-z nalazi se u miokardu, eritrocitima i bubregu. Katodna skupina u kojoj prevladavajuLD-4 i LD-5 nalazi se u jetri, skeletnim miSiiima i u nekim zloiudnim tumorima. Srednja skupina koju karakterizira LD3 dolaziu limfatidnome tkivu, trombocitima i zloiudnome tkivu. Pri infarktu miokarda poveiava se aktivnost LD-1 i ne5to LD-Z,izoenzimasastavljenih od >>srdanih 20 godina < 241U /L.

13.1s.1:.Elektroforeticko razdvajanje izoenzima LD-a u serumu NajdeSii postupak razdvajenja izoenzima LD-a jest zonska elektrofo teza na celogelu i agarozi (preporudeni postupak) u puferu alkalnog pH. Nakon razdvajanja, izoenzimi se vizualiziraiu i identificiraju inkubacijom s reakcijskom smjesom koja sadriava: laktat i NAD u odgovarajuiem puferu. NADH nasrao u pojedinoj izoenzimskoj frakciji mjeri se fuorometrijski ili redukcijom retrazolijevih soli, stvarajuii obojeni formazan (detaljni postupak moZe se naii u2. izdanju ovog udZbenika).

Elektroforezom na npr. celogelu izoenzimi su lokalizirani kako sliledi: LD-l u zoni a1-globulina 36 do 52o/o LD-} u zoni ar-globulina 27 do 52o/o LD-3 u zoni B-globulina 5 do 20o/o LD-4 u zoni p-7-globulina 0 do 60/o LD-5 u zoni 7-globulina 0 do 3o/o Osim elektroforetidkog razdvajanja moguie je primijeniti i postupak selektivne inhibicije (inhibitori npr. Na-perklorar, gvanidin-tiocijanat) ili imunoprecipitacije radi odredivanja LD-1.

r 3.r

-6-fosfat-d e h d ro g e n aza (G-6- P D) (D-g I u koza-6-fosfat: N AD P o ksid o red u ktaza, EC. 1 .1 .1 .49.)

s.2. G I u koza

i

Glukoza-6-fosfat-dehidrogenaza kaalizira prjelazak glukoza-6-fosfata u 6-fosfoglukonat, prvu reakciju u penroza-fosfatnom ciklusu (Warburg-Dickensov Put, heksoza-monofosfatna

277

278

Poglaulje

I3

hemoglobin

\

r'.

GSSG

YO

methemog lobin

/ \

\

,,-NADPH2-

YO

ott -'l \

6losfoqlukonat

n

Q

Ye

NADP

-./ \

pentoze za sintezu nukleotida

glukoza-6-fosfat fruktoza

It -6-fosfat +t

glikoliza

Slika 13-31 . Uloga glukoza-6-fosfat-dehidrogenaze

u metabolizmu.

1.

glukoza-6-fosfat-dehidrogenaza,

2.

skretnica). Enzimom su osobito bogati eritrociti u kojima je pentozni put metaboliziranja glukoze dominantan. Svojom ulogom G-6-PD je vatan za odr|,avanje reduciranog oblika koenzima

NADPH riimaveliko znatenje u sprjedavanju oksidacije hemoglobina u methemoglobin. Buduii da sudjeluje u reakciji pentoznog ciklusa kojim nastaju pentoze, vatan je i zasintezu nukleotida i energijom bogatih spojeva (ATP). Ova uloga G-6-PD u metabolitkim procesima vidljiva je na slici 13-31. G-6-PD je dimer sastavljen od dviju jednakih podledinlca kodiranih genom na X-kromosomu, ali kod raznih pH, ionskih jakosti i koncentrucijaproteina postoje i monomerni, tetramerni ili polimerni oblici sa slabijom aktivnoliu ili bez reduktivne aktivnosti. Dimerni aktivni enzim iz eritrocita ima molekularnu masu oko I l0 kDa, ali ona varira ovisno o izvoru enzima. Enzim djeluje ponajprije na glukoza-6-fosfat, ali je takoder slabije akrivan prema galaktoza-6-fosfatu kao supstratu. Za reakciju je potreban NADP, ali i NAD, iako mnogo slabije moZe sluZiti kao akceptor vodika.

G-6-PD je ra5iren u mnogim tkivima. Nalazi

se

u nadbubreZnoj Llijezdi, masnome tkivu, kr-

vnim stanicama, jetri, guiteraii, pluiima, bubregu, mozgu, miokardu, skeletnim mi5iiima, dojci za vrijeme laktacije, a sadriava je i zlocudno tkivo. U krvnom serumu nalazi se vrlo slaba aktivnost. Eritrociti su bogati G-6-PD-om, a aktivnost se u njima smanjuje sa staroSiu stanica. Kliniiko znatenje.Za dijagnostiku je korisno odredivanje aktivnosti G-6-PD-a u eritrocitima. Promjene aktivnosti eritrocitnoga G-6-PD-a mogu biti uzrokovane i nekim lijekovima. Lijekovi kao primakin, sulfanilamid, fenacetin, acetanilid, fenilhidrazin i furadantin mogu uzrokova-

ti hemolitidku anemiju. Stvarni uzrok tomu jest urodeni manjak G-6-PD-a u eritrocitima. Do danas je opisano oko 400 milijuna ljudi s ovim, najradirenijim manjkom enzima (jedna od tzv. enzimopatija). Prema teiini manjka G-6-PD-a postoji nekoliko varijanti ove enzimopatije: klasa

I (te5ki manjak povezan s kronidnom hemolitidkom anemijom), klasa II (te5ki manjak obidno bez hemolitidke anemije; < 10o/o ostatne aktivnosti), klasa III (umjereni do blagi manjak, 1060% ostatne aktivnosti); klasa IV (vrlo blagi oblik) i klasa V (poveiana aktivnost; opisana samo jedna takva varijanta, G-6-PD Hekroen). Ova pojave, pozneta pod nazivom >>primakin senzitivna kreatin + ATP.

CK je izolirana u kristalinidnom obliku. Ima molekularnu masu oko 8l kDa. Enzim ima dva aktivna centra, a svaki sadriava po jednu reaktivnu SH-skupinu iz cisteina, Sto objaSnjava njegovu nestabilnost na zraku. Mf* aktivira CK stvarajuii AIP-Mg2* i ROn-Mt'* komplekse. Razni su anioni nekompetitivni inhibitori CK: I-, SO*'-,NOr-,Br-, SOr2-, Cl-, F-, kao i puferski anioni Tlisa, imidazola, Pipesa

i Mopsa.

Caz* interferira

r Md*, pa zato inhibira enzim. Isto interferiraju

Fe3+

i CuZ*.

Inhibicija ovih kationa uklanja se dodatkom EDTA-a u reagens za odredivanje CK-a. Nadeni su i izoenzimi i multimolekularni oblici CK. Molekula CK je dimer koji se sastoji od jednakih ili razliditih monomera s molekularnom masom oko 4L,3 kDa. Monomer M (engl. I 'v'r\ ' Tnuscle, mlsrc/ I lTronomer B (engl. brain, mozak) spajaju se u dimere MM, MB i BB, te tako stva-

rri izoenzima. Izoenzim MM karakteristidan je za mi$iie i pojavljuje se u obliku MMr, MM, i MM3, e izoenzim BB karakteristiian je za mozak. Kombinacija monomera M i B, izoenzim

raju

u miokardu. Izoenzim CK-BB putuje pri elektroforezi najbrte prema anodi pa se u skladu s PrePorukama Odbora za enzime IUB-a, oznaiuje kao CK-1, neSto sporiji CK-MB nazivase i CK-2, a katodni CK-MM oznaduje se kao CK-3. CK-Z i CIC3 postoje u viSe multiplih oblika ili izoforma. Naime, podjedinica M se u cirkulaciji posttranslacijski modificira pa nastaju tri izoforme CK-3 (CK-3r, CK-3zi CK-33 ili MM-l, MM-z i MM-3) i dvije izoforme CK-Z (CK-2r iCK-Z1).U tkivima se nalaze samo CK-zzi CK-33 kao pravi izoenzimi. Kad ovi izoenzimi CK-a udu u cirkulaciju, gube terminalne aminokiseline djelovanjem enzima karboksipeptidaze N (CK-konver-

MB, nalazi

se

tirajuii faktor, kinaza I, arginin-karboksip epddaza,Ec 3.4.17.3) koja se nalazi u krvi, pa nastaju molekule enzima koje imaju manje molekularne mase i brZu anodnu pokretljivost pri elektroforezi. Tako sve tri izoforme CK-3 imaju slidnu specifidnost enzimskog djelovanje, ali razhdite naboje i izoelektridne todke, jer CK-3 2imajednu manje, a CK-31 dvije karboksilne skupine terminalnih lizina manje koje odcjeplj"j. karboksipeptidaza N. Osim ovih citoplazmatskih izoenzima, postoji i mitohondrijski izoenzim, smjesten izmedu unutarnje i vanjske membrane mitohondrija (CK-MI), a prolazno se u serumu mogu pojaviti i tzv. makroenzimi CK-a (kompleksi najielie CK-l s IgG-om ili lgA-om) te oligomerni CK-MI. CK ima najviSe u skeletnim miSiiima, srdanom miSiiu i mozgu, a vrlo malo u gastrointestinalnome traktu, Stitnjaii, bubrezima, jetri, pluiima i samo u tragovima u eritrocitima (sl. 13-39.).

Enzirni

289

skeletnim je miSiiima oko 97o/o aktivnosti citoplazmatski UlS 3o/o CK-2, a CICI i mitohondrijski CK-MI nalaze se samo u tragovima, dok je u miokardu oko 600/o aktivnosti u CK-3, 30-40o/o u CK-2 i do 10% je CK-MI. U mozgu, prostati i u gastrointestinalnome traktu najviSe je CK-l. 1.000 Zbog toga je dijagnostidka vaZnost odredivanja akdvnosti tog enzima prije svega u bolestima miSiia, srca i mozga. einjenica da CK-a ima tako mnogo u skeletnim miSiiima smanjuje donekle specifidnost te pretrage, jer jati udarci i ozljede, pa iak i intramusku800 larne injekcije vei uzrokuju poveianje aktivnosti CK-a u serumu

U

CK-3 i oko

inade zdravih ljudi.

Kliniiko

znatenje. Kod raznih tipovaprogresivne miSiine distrofije, osobito Duchenneova tipa, aktivnost je CK-a u serumu vrlo visoka. U veiine takvih bolesnika aktivnost je poveiana i do 50 puta iznad gornje granice referentnog intervala, a moi,e dosegnuti i 10.000 U /L. Kod Duchenneova tipa CK je visokvei od rodenja, a poveianje aktivnosti u serumu ovisi o vremenu i teZini bolesd. Kod drugih tipova mi5iine distrofije aktivnost je manje poveiana, a kod nekih moZe biti i unurar referentnog intervala. Lagano poveianje aktivnosti CK-a u serumu moZe se naii i u neurogenoj distrofiji. Aktivnost CK-a u serumu dosta je visoka i kod polimio-

600

400

200

zitisa, osobito dermatomiozitisa. U miotoniji i miasteniji gravis aktivnost CK samo je lagano poveiana ili je unutar referentnog intervala. Pri oSteienju skeletnih miSiia ili miokarda poveianje aktivnosti u serumu djelomidno ovisi i o transportu CK-a limfom. Pri traumi miSiia, osim CK-3, nalazi se i viSe od 5 U /L CK-z. Vrlo visoke vrijednosti CK-a nalaze se kod akutne mioglobinurije. Aktivnosti CK-a u serumu poveiane su i nakon teLih fizitkih napora (npr. dugi i naporni mar5evi), a aktivnost je katkad poveiana i u trudnoii. U svim tim sluiajevima CK potjede iz mi-

'E:9 t 6:6 N gE -eu E

g =io ; Ei!3

Slika 13-39. Raspodjela CK-a ma.

nove bolesti. Za dijagnostiku je najvaL,nije poveianje aktivnosti CK-a, posebice CK-z u serumu kod akutnog infarkta miokarda (promjene aktivnosti CK-2 opisane su u pogl . 17.).Medutim, dinjenica da se aktivnost CK-a u serumu moZe poveiati vei nakon nekoliko intramuskularnih injekcija, pogotovo injekcija nekih antibiotika kao penicilina i tetraciklina, te ostalih vei spomenudh uzroka, donekle umanjuje specifidnost te pretrage za dijagnostiku srdanog infarkta u odnosu na speci6dne srdane proteine kao 5to su rroponini. Smatralo se da izoenzim CK-1 ne dolazi u serumu normalno i da je njegova aktivnosr u serumu poveiana samo pri oSteienju mozga, kao jedinog izvora izoenzima. No, sada je poznaro da ga ima i drugdje, a u tragovima u serumu, te da mu se aktivnost poveia kod karcinoma prostare, ali katkad i kod zloiudnih tumora bubrega i pluia. Danas ga se smarra tumorskim biljegom za zloiudne tumore mozga. Lijekovi kao prednizon, neki drugi steroidni preparati i citostatici sma-

C'r(o gri =o 5

-o

6

5iia. Aktivnost CK-a u serumu desto je, i do 90% sludajeva, poveiana kod hipotireoidizma, zloiudne hipotermije, cerebralnog infarkta, akutnih psihoza s grdevima, otrovanja sedativima i alkoholom te kod 3oka, a nalazi se poveiana i kod nekih hematoloSkih bolesti kao mijelofibroze, mijelogene kronidne leukemrre,mijelogene akume leukemije,limfocitne leukemije i Hodgki-

njuju aktivnost CK-a.

E,E

J

u

iovjetjim organi-

Poglaulje 13

1

3.1 s.6.1.

Metode odredivanja aktivnosti CK-a

Aktivnost CK-a moZe se odredivati postupkom kontinuiranoga mjerenja. CK kaalizirareverzibilnu reakciju: kreatin-fosfat +

ADP

PH' pH7

=kreatin

+

AIP

Pod uvjetom da postoji dovoljan viSak supstrata, optimalni pH za reakciju smjera od lijeva nadesno iznosi oko 7, dok je za reakclja u obratnom smjeru optimalan PH 9. Buduii da je CK zbog svojih reaktivnih SH-skupina koje se lako oksidiraju vrlo nestabilan, aktivnost je potrebno odrediti odmah nakon uzimanjal 20 godina: muSkarci I

13.1s.8.

l-55 U /L, tene 9-35 U /L.

Fosfataze

Fosfataze su enzimi iz skupine hidrolaza

koji razgraduju organske monoestere ortofosforne

kiseline na odgovarajud alkohol i fosfat:

o il R-O-P-OH

o + HrO

fosfaraza,

R-O-H

+

HO-|l-Ot I

I

OH

OH

Specifidnost tih enzima nije velika i odnosi se na estersku vezu monoestera fosfata. Kao supsrrar mogu sluZiri raznialifatski alkoholi, polialkoholi ili aromatski hidroksi-spojevi esterificirani ortofosfornom kiselinom. S klinidkoga gledi5tavatne su dvije skupine fosfataza, koje su tako podileljene prema oprimalnom pH: alkalne fosfataze s optimumom aktivnosti kod pH 9,8 do 10,5 i kisele fosfataze s optimumom aktivnosti kod pH oko 4,9 do 5.

1

3.1

s.8.1.

Alkalna fosfataza (ALP) (o rtofosfat- m o noeste r-fosfoh

i

d

rolaza, EC.

3. 1 .3. 1 )

Pod nazivom ALP razumijeva se skupina enzima s optimumom aktivnosti u alkalnom podrudju kod pH izmedu 9,8 do 10,5 i koji ovise i o supstratu i vrsti pufera. ALP se nalazi u organizmu u multimolekularnim oblicima od kojih su neki pravi izoenzimi, a drugi su multimolekularni oblici nastali nakon sinteze enzima, te se govori o jetrenom, koltanom, crijevnom, bubreinom i placentarnom ALP-u. Veiina podataka o strukturi ALP-a dobivena je eksperimentima s prodiS-

ienim enzimom iz Escbericbia coli,jer je taj enzim vrlo stabilan. ALP iz E. colije dimer,

a svaka

podledinlca (monomer) sadrZava atom cinka. Djelovanjem kiseline, ureje ili gvanidina, kao i kraiim zagrijavanjem na visokoj temperaturi dimer disocira na dva monomera, koji pri tome gube cink. Gubitkom cinka monomeri gube i aktivnost, ali se dodatkom cinka u suviSku i u neutralnoj sredini ponovno srvara aktivni dimer. Prema tome, cink je sastavni dio molekule i prijeko je potreban za aktivnost enzima. Kompleksoni veZu cink i zato inaktiviraju enzim. Md*, Co2* i Mn2+ smatraju se aktivatorima fosfataze, a djeluju stimulirajuii defosforilaciju veLu(i se za efekrorsko mjesto svake podjedinice (alosteriiki efekt). Inhibitori aktivnosti jesu fosfati, borati, oksalad i cijanidi. ALP u dovjeka ima slidna svojstva. I dimer ili polimer sastavljen je od podjedinica od kojih svaka sadrZava najmanje jedan atom cinka. Monomer se sintetizira u sranici na poliribosomima, odakle putuje na mjesto gdje enzim konadno djeluje i gdje se polimerizacijom i ugradnjom cinka, iz monomera stvara aktivna enzimska molekula.

295

296

Poglaulje

1j Alkalne fosfataze su enzimi koji djeluju na esterski vez izmedu fosforne kiseline i alkohola. Pri tome djeluju samo na monoestere fosforne kiseline, a ne djeluju na disupstituirane i trisupstituirane derivate

:

R

R

I

I

o HO-P:O I

I

OH monoe ster-fosforne

kiseline

U/g

o I

RO-P:O I

OH diester-fosforne kiseline

R I

o I

RO-P:O I

OR criester-fosforne

kiseline

Osim na oksiestere (-OR), enzim djeluje i na tioestere (-SR) i spojeve u kojima je na fosfat Yezan radikal -NR. Kao supstrati obidno se rabe razni fosfatni oksiesteri. Supstrat se veie na aktivni centar koji u svim alkalnim fosfatazama ima isti slijed aminokiselina: -treonin-asparagin-serin-alanin. Pri vezanju supstrata na aktivni centar enzima fosfat iz supstratavete se za serin iz aktivnog centra. To j. dokazano time $to se iz reakcijske smjese izolirao fosfoserin. Osim toga 5to djeluje hidrolititki, fosfataza u prisutnosri akceptora djeluje i transfosforilirajuie, pa se te reakcije mogu prikazati na sljedeii nadin: l. -serin-H + ROP J -serin-PoR J -serin-P + ROH 2. -serin-P + H2O J -serin-H + P hidroliza 3. -serin-P + RIOH e -serin-H + R,OP transfosforilacija Relativna molekularna masa ALP-a iz raznih tkiva medusobno se neito razlikuje. Jetreni ALP dovjeka ima molekularnu masu oko 220 kDa, placentni 200 kDa, crijevni oko 195 kDa, a ALP iz seruma oko 150 kDa. Medutim, u serumu se katkad nalaze i kompleksi ALP--a i imunoglobulina G ili fragmenata stanidnih membrana(tzv.makrofosfaaze).Enzim jevezanu stanidnim membranama i prisutan u veiini iovjedjih tkiva, a najvi5e ga ima u epitelu tankoga crijeva, placend, bubreZnim tubulima, kostima, jetri, pluiima, slezeni i leukocirima

60

(sl. l3-43.). ALP u serumu zdravih osoba potjede obidno iz jeue i kostiju, dok je bubreg izvor mokrainog ALP-a. Iako je poznato da ALP ima znatnu ulogu u okoitavanju, transpor-

50

tu lipida u tankome crijevu, a i u drugim procesima regulacije fosfata u organizmu, ipak se todno ne zna koji je njegov prirodni supsrrar u

40

organizmu.

Klinitko znatenje. ALP-a ima mnogo u osteoblastima, epitelu Zudnih vodova, jetri, posteljici, bubregu i tankome crijevu. Zato je u raznim bolestima koje zahvecaju spomenure organe njegova aktivnost u serumu poveiana. Osobito je velika dijagnostidka vrijednost odredivanja ALP-a u bolestima kostiju, jetre i Zudnih vodova. Fizioloiki je aktivnost Poveiana u djece zbogaktivnosti osteoblastazavrijeme rasta kos-

30

20

10

tiju (kostani ALP). Aktivnost je 2 do 3 puta veia od gornje granice referentnog intervala, a na vrijednosti kao u serumu odraslih osoba

.-xiE6

='Floora 3-v'qEfi ro70 c!h_ rtt

!

Slika 13-43. Raspodjela alkalne fosfataze u raznim tkivima.

smanjuje se nakon puberteta. Prjelazak ALP-a iz posteljice uzrokuje poveianje njegove aktivnosti u serumu ircnazavrijeme trudnoie u tijeku treieg trimestra. Aktivnost ALP-a u serumu blago se poveiava pri zara5iivanju ko5tanih prijeloma i stvaranju kalusa. Ako rakvo poveianje aktivnosti ALP-a izostane, to je znak lo5eg i smanjenog stvaranja kalusa. Poveia-

Enzimi ne aktivnosti ALP-a u serumu nalaze se u osteitisu deformansu ili Pagetovoj bolesti, kada se mogu poveiati i20-40 puta iznad gornje granice referentnog intervala, te u osteomalaciji, rahitisu, hiperparatireoidizmu, zloiudnim tumorima kosdju i metastazama u kostima.

Poveianje aktivnosti kod zloiudnih tumora kostiju ovisi o masi osteoblasta. Najveie aktivnosti, slidne onima u Pagetovoj bolesti, nalaze se kod osteosarkoma i koStanih metastaza karcinoma prostate (obidno j. poveiana i aktivnost kisele fosfataze). Za razliku od zloiudnih, kod dobroiudnih tumora aktivnost je u serumu obidno unutar referentnog intervala. U diferencijalnoj dijagnostici koStanih bolesti uz aktivnost ALP-a treba obratiti pozornost i na koncentraciju kalcija i fosfata u serumu (tabl. l3-8.). Odredivanje aktivnosti ALP-avrlo je korisno zadiferencij alnu dij agnostiku bolesti hepatobilij arnoga tra-

297

Tablica 13-8. Aktivnost ALP-a i koncentracije kalcija i fosfata u serumu u nekim fizioloSkim stanjima i bolestima

Djeca u rastu

Trudnoia ZaraS(ivanje kostiju

Tunrorikostiju

t t t t

Metastaze u kostima

f

Osteitis deformans

t

(Pagetova bolest) Osteomalacija

Hiperparatireoidizam

t f

Nefritis

t

Rahitis

.t

.t

J.

t

i

t

t

t

.t

.t

+

T

J

f

;

J

J

i

t

kta (pogl. 19.). Kolestaza uvijek uzrokuje poveianje - unutar referentnog intervala, t poveiana aktivnosti ALP-a u serumu, i to je glavni razlogpovesmanjena koncentracija ianju aktivnosti u jetrenim bolestima, jer je vrlo desto u njima prisutna i kolestatska komponenta. Zatoje aktivnost ALP-a poveiana u kolecistitisu, kolangitisu, cirozi i hepatitisu. Odredivanje aktivnosti ALP-a dobra je pretraga za razlikovanje kolestatske od hepatocelularne Zutice. U kolestatskoj Zutici aktivnost ALP-a u serumu obidno je viSe od 3 puta veia od gornje granice referentnog inrervala, za razhku od npr. virusnog hepatitisa, kada je samo blago poveiana, katkad dak i unutar referentnog intervala. U kolestatskoj iutici uzrokovanoj zloiudnim tumorom vrijednosti su obidno veie nego kad je opstrukcija prouzrodena Zudnim kamencima. Visoke aktivnosti nalaze se i kod zloiudnih tumora jetre, a osobito kod metastaza u jetri. Bolesti intestinalnog trakta, kao kronidni kolitis, malapsorpcija, steatoreja, takoder mogu prouzroditi jade poveianje aktivnosti

ALP-a u serumu. Poveiana aktivnost u serumu nalazi se katkad i u bubreZnim bolestima (glomerulonefritis, pijelonefritis), a osobito kod kronidne bubreine insuficijencije. Buduii da ureja inhibira aktivnost ALP-a, u bolesnika na hemo dljaliziveie se aktivnosti obidno nalaze nakon diialize (zbog uklanjanjaureje iz krvi). Niske aktivnosti ALP-a naLaze se pri malnutriciji, manjku magnezijai hipofosfatemiji.

lzoenzimi i drugi multimolekularni oblici alkalne fosfataze Alkalna fosfataza iz raznih organa razlikuje se po mnogim fizikalno-kemijskim svojstvima: pokretljivosti u elektridnom polju, inhibiciji Zudnim solima, L-fenilalaninom, urejom, raznim Seierima, alkoholom i nekim drugim tvarima, sadrZajem sijalinske kiseline, termostabilnosti, imu-

nololkim svojstvima te po brzini razgradnje supstrata, dok im je svima zajednidko da razgraduju fosfatne monoestere u alkalnoj sredini s optimalnom aktivnoiiu kod pH izmedu 9,8 i 10,5. Smatralo se da postoje jetreni, koitani, crijevni, placentni, bubreZni i drugi izoenzimi ALP-a. Medutim, sada je poznato da svi ovi oblici nisu pravi izoenzimi nego su neki oblici nastali posttranslacijskim modifikacijama enzimske molekule. Tri su prava izoenzimaAl-P-a koje kodiraju tri razna gena. To su intestinalni, placentni i tzv. tkivno-nespecifidni izoenzim. Tkivno-nespecifidni gen izrai,enje u jetri, kostima i bubregu. Postranslacijske modifikacije nastaju osobito glikozilacfo*, a i izoenzimi i tako nastali multimole-

t

.t

koncentracija, J

298

Poglaufe I

j kularni oblici mogu biti tkivno-specifidni. Prema tome, intestinalni i placentni ALP pravi su izoenzimi, dok su jetreni, koltani i bubreZni ALP oblici jednoga tkivno-nespecifiinogizoenzima. Osim roga,

multipli oblici ALP-a pojavljuju

se

i kao agregati enzima s proteinima i fragmen-

tima jetrenih membrana, osobito u kolestazi i pri metastazama u hepatobilijarnome traktu, a stvaraju se agregati i s imunoglobulinima i lipoproteinom X (LpX), 5to se moZe naii u serumu kod dobroiudne prolazne hiperfosfaazemije. Agregati ALP-a s proteinima, lipoproteinima ili fragmentima plazma-membrana nazivaju se raznim nazivima kao ALP visoke molekularne mase (Zx tO3 i vi3e kDa) ili makro-AlP, ili stacionarni kolestatski izoenzim, ili patoloSki Zudni ALP.

ili manje tkivno-specifidnih multimolekularnih oblika ALP-a. U mokraii se nalazi takoder viSe oblika ALP-a, a u zdravih osoba i u bolesnika s hepatocelularnim karcinomom ALP j. po svojstvima slitan jetrenom i/ili Sto izoenzima, a 5to ostalih oblika, u serumu postoji najmanje 6, viSe

koStanom ALP-u.

Razliditi oblici ALP-a mogu se razdvojiti elektroforezom na raznim nosadima (Skrobni gel, celulozni acerar, celogel, agar, agaroza, poliakrilamid) te s pomoiu raznih inhibitora sluZeii se razlikama u rermosrabilnosti i imunokemijskim metodama. Od inhibitora mogu se rabiti fenilalanin i ureja. Na L-fenilanin su osjetljivi placentni i crijevni ALP, dok su koitani, jetreni i Zudni razmjerno otporni. Na inhibiciju urejom osjetljiv je koStani, a manje jetreni ALP. Zagrijavanjem na 56 'C najviSe se inaktivira koitani enzim, nesto manje jetreni, dok su ostale alkalne fosfataze relativno termostabilne. (J serumu zdravih odraslih osoba nalazi se jetreni uz neito ko5tanog ALP-a, dok se u djece uz jetreni nalazi vi5e koStanog ALP-a. U trudnoii, osobito u treiem trimestru, osim jetrenog, nalazi se i placentni ALP. U serumu bolesnika s jetrenom cirozom ili kronidnim ulceroznim kolitisom dospijeva u serum, osim jetrenog, i intestinalni ALP. U telkim jetrenim oSteienjima uz normalnu jetrenu katkad se pojavljuje jo5 jedna ili dvije fosfaaze iz jetre ili Zudi. ZuiniALP poj""lj"j. se u kolestatskoj Zutici. U zloiudnim bolestima nalaze se, iako rjede, atipidni oblici ALPa. Najpoznatiji je tzv. Reganov enzim koji je dobio naziv po bolesniku u kojega je prvi put naden (karcinoplacentni izoenzim). Veiina atipidnih alkalnih fosfataza Sto se katkad nalaze u serumu bolesnika sa zloiudnim tumorima (pluia, jetra) slidne su po svojim svojstvima placentnom enzimu, ali se ipak po nekoj karakteristici, npr. elektroforetidki ili imunokemijski, razlikuju od enzima iz posteljice (Kasahara izoenzim). NajdeSce za odredivanje multimolekularnih oblika ALP-a u serumu sluii zonska elektroforeza na agarozi u prisutnosti lektina koji omoguiuju bolje razdvajanje izoenzima ALP-a. U istu svrhu moguia je i prethodna obradba seruma s neuraminidazom koja uklanja terminalnu sijalinsku kiselinu.

Metode od redivanja a ktivnosti ALP-a Buduii da su alkalne fosfataze specifidne samo za razgradnju fosfatnih monoestera, postojale rabili razni fosfatni esteri (npr. dinap-glicerofosfat, fenoftalein-fosfat, p-nitrofenilfosfat (4-nitrofenilfosfat, 4trijev monofenilfosfat, NPP), a odredivao se ili odcijepljeni anorganski fosfat ili preostali nefosfatni dio molekule supsrrara. Kao puferi s alkalnim pH rabili su se npr. barbiton, karbonat/bikarbonat, glicin, a poslije aminoalkoholi dietanolamin (DEA) i 2-amino-2-metil-l-propanol (AMP). Utvrdeno je naime, da u prisutnosti akceptora fosfata, kao 5to su aminoalkoholi, fosfaaza djeluje ne samo hldrolitidki nego i rransfosforilirajuie. Pri tome je transfosforilirajuia aktivnost veia nego hidrolitidka, a ovisi o tipu i koncentraciji akceptora fosfata. Koliki je udio transfosforilacije, moie se ocijeniti ako se usporedi aktivnost ALP-a u aminoalkoholnom i karbonatnom puferu (tabl. l3-9.). Na temelju brojnih ispitivanja kao optimalni pufer za navedene modifikacije metoda zaodresu brojne metode odredivanja, u kojima su se kao supstrati

divanje aktivnosti ALP-a odabran je AMP.

299

Enzirni Problemi optimiranja metode za odredivanje aktivnosti ALP-a bili su veliki, jer je zaprayo rijed o skupini razliditih oblika (pravi izoenzimi, multimolekularni oblici) enzima koji se po svojim svojstvima dosta razlikuju. Tedko je bilo rijeSiti i problem supstrata, jer je afinitet pojedinih oblika ALP-a razliiit

Tablica 13-9. Odnos aktivnosti alkalnih fosfataza raznih tkiva u AMq DEA i karbonatnom puferu

8,1

2,5

jeua 10,5 4,8 prema raznim supstratima. Utvrdeno je da je najpogodniji sup9,1 4,8 crijevo strat p-nitrofenilfosfa\ jer je afinitet svih oblika enzima ALP-a 4,7 12,7 bubreg prema njemu podjednak. Mf* aktivira enzim, pa se u raznim metodama dodaje Pufe,o ., othko magnezijeva klorida, sulfata ili acetata. Buduii da enzim sadrZava Znz* koji je Potreban zanjegovu aktivnost, u najnovijim se preporukama metoda, osim Mt'*, dodaje i Znz+ , avi'

2,2

kosti

3,3

1,9

2,7

cinka veZe s HEDTA-om. Opienito je razvoj, odnosno optimiranje metoda, tijekom yremena bio usmjeren poveianju brzine i osjetljivosti reakcije odredivanja. U tome smislu nadinjena je selekcija supstrata i pufera, akceptora fosfata, i uvedene su optimirane metode s kontinuiranim mjerenjem. Sak

Preporutena metoda od recfiva nja IFCC-metoda, 37 "C, sasrav reagensa: p-nitrofenilfosfat, AMP-pufer, Mg-acetat,Zn-salfat, HEDTA. Princip

ALP razgraduje p-nitrofenilfosfat, akceptor fosfata ie AMP, orlobodeni p-nitrofenol (koji se u alkalnim .ruj." 'Yi? tima pretvara u 4-nitrofenoksid ion) mjeri se kondnuira1000 ALP-a, no kod 405 nm. Da bi se osigurala puna aktivnost reagensu je dodan cink, a njegov se viSak vei,e

1

100

naHEDTA:::

Napomena

7oo

Znz* u tragovima aktivira ALP, ali ga u veiim koncentracijama inhibira. Zato se uz Znz+ dodaje i keladrajuii spoj, HEDTA s kojom cink stvara kompleks. Na taj se nadin cink uklanja, osim tragova potrebnih za maksimalnu aktivnost enzima.

600 soo 400 300

2oo

Referentni intervali

100

Muikarci > 20 godina: 60-142U /L, t'ene 20-50 godina: 54-lL9 lJ /L, tene > 50 godina z 64-153 U /L. 13.1s.8.2.

5

4 3

Kisela fosfataza (ACP) (o rtofosfat- m o n oesterfosfohid roaaza, EC. 3.1 .3.2.)

2 1

(!'EO)(!l!(o(5(!(!

Skupina fosfatazadiji je optimum aktivnosti u kiselom podrudju niii od pH 7,0, zajednidki se nazivaju kiselim fosfatazama (ACP). U dovjeka se ACP nalazi u lizosomima raznih stanica (osim eritrocita) te izvan lizosoma. ACP se nalazi ponajprije u stanicama Prostate, slezene i u

kostima te manje u bubregu, sjemenicima, pluiima, jetri,

g .q. '- 'u g -o r Y

E P^ E e o .E

tE_o'i.n;LNE

cg 'Ur 'F or

X.-;E

3.'

'H

'=

.E

'6

(o

C

I

I

i

tg t +11'

"le :p-o-4j

e

!

q \i

r

t

e fq

:f?lqrx

:q-'

tl:rtf

ivg

L"

Poglaufe

l3 crijevu, nadbubreLnoj LIijezdi, jajnicima, miSiiima, miokardu, timusu, Stitniati, koii, uterusu, trombocitima i eritrocitima i u serumu (sl. L3-44.). ACP iz raznih tkiva moZe se raznim analiddkim postupcima razdvojiti u viSe oblika enzima. Neki od tih oblika enzima potjedu od raznih genskih lokusa za ACP. To su izoenzimi koji se razlikuju po svojim katalititkim svojstvima, brzini hidrolize ortofosfornih estera, otpornosti, odnosno osjetljivosti prema inhibitorima, temostabilnosti i imunolo5kim svojstvima. Primjerice, enzim iz lizosoma i prosrar e znaiajno se inhibira s tartaratom, dok se enzim iz eritrocita ne inhibira. Poznata su, naime, najmanje 4 genakoja odreduju ACP: a) gen na kromosomu Zkojikodira eritrocitni ACP i koji je polimorfan, b) gen na lromosomu 19 koji kodira ACP koji je rezisrenran na rarrarat i eksprimiran u osteoklastima i drugim tkivnim makrofagima, c) gen na kromosomu 11 koji kodira ACP koji inhibira tartarat i d) gen na kromosomu 13 koji kodira ACP iz prostate koji inhibira tartarat. Glavnina, normalno niske aktivnosti (nehemoliziranog) seruma jest tzv. tartarat-rezistentan ACP (TR-ACP), koji je najveiim dijelom podrijetlom iz osteoklasta. Buduii da je aktivnost ACP-a u serumu osjedjiva na promjene temperature i pH, za stabilizaciju enzimske aktivnosti

potrebno je uzorak seruma odmah nakon odvajanja zakiseliti na Kl i n

itko znatenje

pH niLi od 6,5.

TR-ACP-a

Odredivanje ACP-a iz prostate, koju inhibira tartarat, zamijenjeno je s odredivanjem koncentracije PSA, a odredeno klinidko znadenje danas se pripisuje samo odredivanju TR-ACP-a. Aktivnost TR-ACP-a opienito je poveiana u serumu bolesnika s bolestima koje ukljuiuju znadajne osteolitidke promjene ili oSteienja kostiju: Pagetova bolest, u iena s karcinomom dojke s presadnicama u kostima, hiperparatireoidizam s promjenama na kostima, osteoklastom (giantcell tu-

ruor)

osteoporoza. Poveiana vrijednost TR-ACP-a u serumu nalazi se i u Gaucherovoj bolesti (lizosomska boIest nakupljanja) u kojoj su izvor enzima abnormalni makrofagi slezene i drugih tkiva. Veliki makrofagi sadrZavaju mnogo glukocerebrozida i ACP-a zakojije karakteristidno da je neosjetliv na inhibiciju L-tartararom, Cu2* i relativno otporan na formaldehid. Buduii da stanice koje se pojavljuju u leukemiji vlasasdh stanica (leukemijska retikuloendotelioza) eksprimiraju osteoklastni tip ACP-a, to moZe biti koristan histololki biljeg bolesti. Medutim, u ovom stanju izoenzim tb,

ne ulazi u plazmu u poveianim kolidinama. Za odredivanje aktivnosti TR-ACP-a mol,e se

primijeniti metoda kontinuiranoga mjerenja oslobodenog a-naftola koji stvara obojeni produkt s Fast RedTP. (diazonijeva sol l-amino-5klortoluen-1,5-naftalen disulfonat), a za odredivanje koncentracije TR-ACP imunokemijske metode koje se koriste antitijelima protiv TR-ACP-a.

Napomena Serum je potrebno odmah odvojiti od eritrocita i stabilizirati ga zakiseljavanjem. Hemolizira-

seruma ne smije se prihvatiti jer je kontaminiran znatnom kolidinom eritrocitnog ACP-a koji je takoder rezistentan na tartarat.

ni uzorak

13.1s.e.

Kolinesteraza (CHE) (acilkolin-acilhid rolaza, EC. 3.1 .1 .8)

Akrivnost kolinestereze u serumu potjeie preteZno od enzima koji

se

sintetizira u jetri i

luti

u ftrv. Osim ove, ima tragova jo5 jedne kolinesteraze, tako da u serumu postoje dvije kolinesteraze, tzy. serumska kolinester aza ili pseudokolinesteraza (acilkolin-acilhidr oIaza, EC. 3.1.1.8, kolinesreraza

II, CHE) i acetilkolinesteraza

,

tzy. praya kolinesteraza (acetilkolin-acetilhidrolaza, EC.

Enzirni

3O1

ACHE). Tip reakcije koju kataliziraju obje kolinesteraze jestpretvaranje acetilkolin-bromida u acetat i kolin-bromid. Enzimi pokazuju razliditu specifidnosr prema raznim supstratima. Elektroforetidki, ovisno o primijenjenoj tehnici, rastavljaju se u vi5e izoenzima, od kojih ACHE u dva izoenzima, a CHE u 7 do 12. Zivianikrajevi vagusa luie acetilkolin, koji je transmitor Zivdanih impulsa vagusa. Djelovanje acedlkolina vrlo jebrzo, abrzo se i hidrolitidki razgraduje djelovanjem ACHE-a na kolin i octenu kiselinu. Molekularna je masa ACHE-a oko 256 kDa i lako stvara agregate s molekularnom masom od 1.000 kDa i vi5e. Ovaj se enzim nalaziuLiviaanionski poloiaj nome tkivu, sivoj moZdanoj tvari, pluiima, slezeni i timuesterski poloZaj su, a ima ga i u eritrocitima, pa se jo5 naziva i eritrocitnom cH, enztm kolinesterazom. Enzim je relativno specifidan za supstrat B:H -O CH, .. @,rct, acetilkolin (K* = 90x 10-6 mol/L kod pH 7), dok mu je CH, )Nbrzina reakcije s ostalim supstratima, kao butirilkolinom -cH, -o -c:o CH, CH, ili benzoilkolinom, mnogo manja. Sam mehanizamyezanja supstrata acetilkolina na aktivni centar i grada enzima Slika 13-45. Vezanje supstrata za aktivni centar acetilkolinvrlo su dobro proudeni. Specifiinost ACHE-a posljedica hidrolaze. je grade aktivnog centra enzima. Aktivni centar ima, naime, dva dilela, anionski i esterski poLoi,aj. Za anionski se 3.1.1.7, kolinesterazal,

I

I

I

poloZaj veie kolin , a za esterski acetatna skupina supstrata (sI. L3-45.). ACHE je stabilan enzim. Aktivnost se odrZava24 sata na sobnoj temperaturi, a dva mjeseca na * 4 "C. Na -20 "C aktivnost se odri,ava i nekoliko mjeseci. Krv za odredivanje aktivnosti ACHE-a treba vzeti s heparinom. ACHE inhibiraju viSak supstrata, prostigmin, neostigmin, morfin, kinin, tercijarni amini, fenotiazini, pirofosfat, Zudne kiseline, citrat i fuorid, a napose je osjetljiv na djelovanje organofos-

fornih spojeva kao alkil-fosfata, tetraeril-pirofosfata (TEPP) i diizopropilfluorofosfata (DFP), koji su reverzibilni kompetitivni inhibitori:

HrC.

?

N_C

HuC'

-o-1\ \_/ -{ s.c-Tlcu" 'CHrr

?",

HC_O t\ CH, 'I

cH' H6-gr

\r"t,

,/

I

CH, prostigmin

diizopropilf

uo rofosfat

Na tom inhibitornom djelovanju na ACHE temelji se i djelovanje tzv. nervnih bojnih otrova (tabun, soman, sarin) i pesticida nabazi organofosfata (paration, paraokson i dr.). Kompetitivna inhibicija prostigminom i fizostigminom uzrokovana je karbamiliranjem aktivnog centra, 5ro je reakcija analogna fosforilaciji. Inhibicija organofosfatima uzrokovana je fosforilacijom serina u esterskom poloZaju akdvnog centra. Osim u jetri, serumski CHE nalazi se i u guSteradi, bijeloj moidanoj tvari, sluznici tankoga crijeva i srcu. CHE hidrolizira razne estere kolina, a ne samo acetilkolin. Najveiu aktivnost ima prema butirilkolinu koji hidroliziraT5-100%o brZe od acedlkolina. CHE je preteZno tetramer, a o kombinaciji podjedinica ovisi njezin izoenzimski sastav. Molekularna je masa podledinice oko 80 kDa. Aktivni centar sadrZava serin, jednako kao i ACHE. Takoder se inhibira organofosfornim spojevima, kvarternim amonijevim solima i drugim inhibitorima kao i ACHE, ali ne vi}kom supstrara. Selektivno je inhibira kinidin-sulfat. Akdviraju ga Caz+ i Mf*.

302

Poglaulje 13

Klinicko znaaenje U dijagnostidke svrhe aktivnost CHE-a u serumu odreduje se ponajprije kod jetrenih bolesti, zatimkao indikator moguieg trovanja insekticidima te u otkrivanju bolesnika s atipidnim oblicima enzima, u kojih postoji rizik produljenog odgovora na neke miSiine relaksanse (npr. sukcinildikolin, mivakurium) pri kirurikim zahvatima. Buduii da se CHE sintetizira u endoplazmatskom retikulumu stanica jetrenog parenhima i odatle ludi u cirkulaciju, to se pri slabljenju funkcija jetre, kada se smanjuje sinteza proteina u jetri, smanjuje i njegova aktivnost u krvnom serumu.Zatoje smanjenje aktivnosti CHE-a u serumu karakteristidno za teike kronidne jetrene bolesti kao 5to su ciroza, tumori i metastaze. U akutnom hepatitisu aktivnost CHE-a obidno je unutar referentnog intervala ili tek vrlo malo smanjena. U kronidnom je hepatitisu takoder rijetko smanjena, ali se aktivnost u serumu obiino kreie oko donje granice referentnog intervala. Aktivnost CHE-a smanjena je i u kolestatskoj Lutici uzrokovanoj tumorima, dok je u kolestatskoj Lutici zbogkamenaca obitno unurar referentnog intervala. Estrogeni i kortizon smanjuju aktivnost CHE-a, pa je aktivnost smanjena zavrijeme trudnoie i pod utjecajem kontraceptiva. Smanjena aktivnost CHE-a u serumu nalazi se katkad i pri izratenom manjku proteina, kaheksiji, raznim akutnim i kronidnim infekcijama, paramijeloblastidnoj leukemiji, pluinoj embolili, miSiinoj distrofili, nakon kirurikih zahvata, a moZe biti niska i prvih 4-5 dana poslije infarkta miokarda. Organofosforni spojevi (npr. paration, sarin, tetraetilpirofosfat) smanjuju aktivnost CHE-a u serumu. Aktivnost u serumu moie se smanjitii 40o/o prije nego se pojave prvi simptomi otrovanja, a kada se smanji 80%, pojavljuju se neuromuskularni simptomi . Zbogtoga je potrebno kontrolirati aktivnost CHE-a u serumu osoba koje rade s pesticidima na bazi organofosfata. Inhibirani se enzim reaktivira oksimima (npr. piridin-2-aldoksim), koji se terapijski rabe kao antidod. U novorodendadi je aktivnost CHE-a samo oko polovinu aktivnosti u odraslih osoba, aIi vei 2 mjeseca nakon rodenja doseie vrijednosti odraslih osoba. Aktivnost CHE-a u serumu ovisi i o spolu. Zrn imaju u prosjeku oko 10%o niZe aktivnosti od muSkaraca. Poveiana aktivnost enzima u serumu nalazi se u stanjima pojadane sinteze proteina u jetri, npr. kod nefrotidkog sindroma, hipertireoidizma, a katkad i u izrazito pretilih dijabetidara.

Posebno treba istaknuti smanjenje aktivnosti CHE-a zbog nasljednog poremeiaja, kad se stvara atipiina kolinesteraza. Takve osobe imaju dva abnormalna gena. Nasljedivanje atipidne kolinesteraze je recesivno. Aktivnost je enzima u heterozigota oko donje granice referentnog intervala, dok je u homozigota najde5ie niska. Zbog moguinosti takvoga nasljednog poreme&ja ili pak smanjene sinteze normalnog CHE-a zbogfunkcionalne jetrene insuficijencije, prije kirurSkih zahvata treba odredivati aktivnost CHE-a u serumu bolesnika. Naime, danas se prije opera-

cije bolesnicima daju miSiini relaksansi na bazi sukcinilkolina. Manjak CHE-a ili atipidni CHE, koji sporo razgraduje te spojeve, uzrok su da se sukcinilkolin ne hidrolizra,lli se razgraduje vrlo sporo pa dolazi do apneje i moguiega fatalnog incidenta . Za utvrdivanje genski uvjetovanog atipidnog CHE-a osjetljivog na sukcinilkolin sluii inhibicija dibukainom (10-20 pmol/L) ili fuo-

ridom (50-100 pmol /L), apostorak inhibicije izrai,ava tzv. dibukainski ili fuoridni broj. Sukcinildikolin (Suxametboniurn) inhibira CHE u koncentraciji od I mmol/L, a inhibira je i natrijev klorid u koncentraciji od 5OO mmol/L. Atipidni oblik CHE-a samo je detvrtinu aktivan kao normalni enzim, a rezistentan je na inhibiciju dibukainom i fuoridom. Znanje o polimorfizmu CHE-a znatno se prodirilo. Geni koji kontroliraju sintezu CHE-a mogu postojati u mnogim alelnim oblicima (4 najdeSia oblika oznaduju se kao E , E", El i E'), koji se mogu kombinirati u jedan normalan oblik i devet abnormalnih genotipova. Opisano je oko 40 drugih oblika, a i drugi genski lokus (E). eovjek s oba normalna gena zakolinesterazu

Enzimi ima fenotip UU ili El" Er", dok

se

fenotip homozigota

s

dva atipidna gena rezistentna na dibu-

kain oznaiuje kao AA ili Er" Er" (oznaka u prema engl. usual, a oznaka a prema engl. atypical). U kemijskoj se gradi razlikuju po tome, 5to atipiini enzim ima histidin umjesto glutaminske kiseline koja se nalazi u normalnom enzimu. Poslije je nadeno da postoje daljnji fenotipovi

CHE-

a. Na fluorid je neosjetljiv fenotip Er(oznaka f prem a engl.f.uoride resistant), dok homo zigoti za tzv. silent gen (Er'E1') uopie nemaju ili imaju samo minimalnu aktivnost CHE-a u serumu. Takoder je naden fenotip J koji se moie utvrditi samo kada dolazi u kombinaciji s atipidnim ili oblikom rezistentnim na fuorid (8," E,i ili E,r E,i) te fenotip K(E,' Erk). Thkve osobe imaju inhibitorske brojeve kao i oni s normalnim CHE-om, ali im je aktivnost CHE-a samo oko treiine aktivnosti s normalnim enzimom. Sve 3to je do sada redeno o klinidkome znatenju odnosilo se na serumski CHE dija se aktiv-

nost odreduje obidno supstratom butirilkolinom. No, u sludaju otrovanja organofosfatima bolje

je odredivati ACHE sa supstratom acetil-kolinom, i to u hemolizatu eritrocita, gdje ima 1.070 +111 ll /IOrz eritrocita ili 37+3,8 U/g Hb. ACHE je inade jo5 smanjen u paroksizmalnoj noinoj hemoglobinuriji i megaloblastidnoj anemiji. Odredivanje aktivnosti ACHE-a i njegovih izoenzima u amnijskoj tekuiini opisano je u 26. poglavlju.

1

3.1 s.e.1.

Metode odredivanja aktivnosti CHE-a

Aktivnosti CHE-a mogu se odrediti metodama koje se koriste esterima acetilkolina kao supstratima. Thkva je npr. metoda Ellmana i sur. u kojoj enzim hidrolizira acetiltiokolin, a nastali tiokolin reagira s 5,5-dido-bis-nitrobenzoatom (DTNB ili Ellmanov reagens) stvarajuii Luto obojeni anion koji

mjeri na 410 nm. Na uporabi acetiltiokolina osnivaju se i metode u kojima se mjeri smanjenje apsorpcije u UV-podrudju i metode koje se koriste redukcijom 2,6-dl}Jorfenolindofenola s oslobodenim tiokolinom. Kao supstrati najviSe se rabe i benzoilkolin, butirilkolin i propionilkolin te njihovi tiolski derivati. S acetilkolinom reagiraju obje kolinesteraze, ali serumski CHE ima veiu brzinu reakcije s butirilkolinom i zato se u serumu s ovim supstratom dobivaju veie aktivnosti. se

Preporucena metoda od redivanja Kontinuirano mjerenje uz butiriltiokolin kao supsrrar, 37 "C.

Princip

CHE djeluje na supsrrat butiriltiokolin

i

oslobada tiokolin

koji s DTNB-om stvara Zuti

anion 5-merkapto-2-nitrobenzojeve kiseline (:-UXBA). Brzina nastanka obojenoga produkta mjeri se kontinuirano kod 410 nm.

Napomene ACHE ne reagira s butiriltiokolinom ili to dini vrlo ski CHE.

sporo , pa je metoda specifidnija za serum-

Referentni intervali Muikarci > 20 godina: 5.255-12.847 ll /L,

L,ene

20-50 godina: 4.728-L0.7 13

IJ

/L,Zene

>

50 godina: 5.646-12.117 U /L. Metoda za odredivanje aktivnosti CHE-a i dibukainskog broja s benzoilkolinom kao supstra-

tom moZe

se

naii u2. izdanju ovog udibenika.

3O3

I

I

3O4

Poglaufe 13

1

3.1 s.1 o.

Li

paza (LPS) (triaci

I

g

I

icerol-aci l-h id rolaza, EC.3. 1 . 1 .3)

Lipaza hidrolizira esrere glicerola i masnih kiselina duljih lanaca. Enzim hidrolitidki odcjeplj"j. masne kiseline u a-poloZaju, na 1. i 3. atomu C, te tako ostaje ostatak p-monoglicerida. No, p-monoglicerid moZe se izomeriziratiu d,-monoglicerid na koji zatim LPS dalje djeluje, tako da je skupna reakcija porpuna hidroliza triglicerida u glicerol i tri masne kiseline:

CH"OOR

t' CHOOR + 3 H"O t"

liPazar

CH"OH t"

cHoH+3RCooH I

cH20H

cH2ooR

glicerol

riglicerid

Osim pravog LPS-a (EC. 3.1.1.3), u dovjedjem Iaza

se

ili alilesteraza (3.1.1.1), aril-ester-hidrolaza ili

masnekiseline

organizmu nalazejoS karboksil-ester-hidroi lipoprotein-lipaza

arilesteraza (EC.3.L.L.2)

(3.I.1.34). Alilesteraza hidrolizira esrere glicerola s masnim kiselinama kratkih lanaca. Ovu hidrolazu inhibiraju natrijev arzenilat i fluorid, a Zudne je kiseline ne aktiviraju. Arilesterazadjeluje na supsrrate kao fenilacetat i a-naftilbutirat, a lipoprotein-lipaza razgraduje proteinski vezane trigliceride na masne kiseline i monoglicerid, koje se zatimprenose na proteinski akceptor, uglavnom albumin. Lipoprotein-lipazuaktivira heparin, a buduii da hidrolizkatrigliceride iz lipoproteina i time bistri lipemidni serum, prije se jo5 nazivala >>heparin clearingfactorkontinuirana>reuptake..). U otpultanju katekolamina sudjeluju acetilkolin i kalcijevi ioni. U srii nadbubreZne Llijezde adrenalin i noradrenalin stvaraju se u odnosu L :4. Dopamin i noradrenalin stvaraju se u cijelome simpatidkom Zivdanom sustavu. Oni su prijenosnici hormonskih ili iivdanih signala u mnogim fizioloSkim procesima. Imaju vaZnu ulogu kao neurotransmitori u SZS-u ili kao periferni neurohormonalni transmitori u simpatoadrenalnom medularnom sustavu koji ima ulogu u homeostaziiadaptivnim odgovorima zavrijeme stresa. Glad, bol, strah, srdZba i dr. aktiviraju simpatidki Zivdani susrav i sri nadbubrel,ne Llijezde i dolazi do pojadanog ludenja katekolamina. Na taj naiin organizam dobiva viSe energije i trenutadno poveiava funkcionalnu sposobnost. Katekolamini djeluju na SZS, srce i krvotok re na metabolizam ugljikohidrata i lipida. Njihovi se udinci ogledaju na svim organima koje inervira simpatikus. Djeluju vezanjem na a- i p-adrenergidke receptore. Alfa-adrenergidki receptori specifidni su za adrenalin i noradrenalin, a p-adre-

nergiiki receptori samo za adrenalin. Beta-adrenergidkim receptorima signal se prenosi adenilciklaznim sustavom, a kod a-adrenergidkih receptora potrebni su ioni kalcija. Noradrenalin je glavni hormon cirkulacije i uzrokuje vazokonstrikciju (osim u koronarnim iilama), poviSenje krvnoga tlaka, srdane frekvencije i konstrikcijske snage srca. Neuroni koji proizvode noradrenalin u mozgu ukljudeni su u regulaciju sna, raspolotenjai patologiju depresije.

Adrenalin u malim dozama Siri Zile, a osim na krvotok djeluje na metaboLizam ugljikohidrata i lipida. Vezanjem na p-adrenergidke receptore uzrokuje glikogenoliza i lipolizu, kodi ludenje inzulina i uzrokuje poveianje koncentracije glukoze u krvi. Zbogglikogenolize u mi5iiima se poveiava koncentracija laktata, a zboglipolize koncentracija slobodnih masnih kiselina u serumu. Prije se smatralo da je dopamin samo preteda u sintezi noradrenalina i adrenalina, a danas mu se pripisuje fizioloSka uloga u perifernome autonomnom Zivdanom sustavu. Specifidni receptori za dopamin nalaze se u koronarnim krvnim Ltlama, bubregu i u drugim organima. Djeluje yazokonstrikcijski i uzrokuje hipertoniju. Biosinteza katekolamina. Katekolamini se stvaraju iz tirozina, koji uz enzim tirozin-hidroksilazu dobiva jo5 jednu hidroksilnu skupinu u benzenskoj jezgri. Nastaje dihidroksifenilalanin (DOPA), koji se uz enzim DoPA-dekarboksilazu dekarboksilira i nastaje dihidroksifeniletilamin (dopamin). On se prenosi u granule u zavrietcima simpatidkih Livaca i u srii nadbubreZne Lhjezde, gdje hidroksilacijom na p-poloiaju postranog lanca az enzim dopamin-p-oksidazu ili hidroksilaza prelazi u dihidroksifeniletanolamin (noradrenalin), koji se uskladiSti u granulama. U srZi nadbubreLne Llijezde noradrenalin se oslobada iz granula i uz feniletanolamin-N-medl-

Hormoni

H ltltH n A.r=.?-+-cooH *ro)t2 H NHz

HH

TT

c "o1Ar+-+@, ""n+1{-i-*", -+ H NHz -drHo)') HH

,Jt)

(dihidroksifenilalanin

HOH

Hol^r?-?tp lll-\

H

H

^Jt2

)

4li:eo)\/-?-?-T ITT?", HO- -,4.-

noradrenalin (dihidroksife nil-etanolamin)

transferazu

)

HOHH

ika 1 4-23.

dopamin (dihifroks ifeniletilamin

DOPA

tirozin

5l

GI

adrenalin

(dihidroksifenil-etanolmetilamin)

A

- tirozin-hidroksilaza - DoPA-dekarboksilaza C - dopamin-p-oksidaza D - feniletanolamin-N-metiltransferaza

B

Biosinteza katekolamina.

i donor metilne skupine S-adenozilmetionin

prclezi u dihidroksifeniletanolmetila-

min (adrenalin), (sl. 14-23.). Metabolizam katekolamina. Djelovanjem katekol-O-metiltransferaze (COMT) dolazi do metilacije hidroksilne skupine na poloZaju 3 benzenske jezgre katekolamina. Iz noradrenalina

iz adrenelina metanefrin, a iz dopamina 3-metoksidramin. Djelovanjem monoaminooksidaze (MAO) iz metanefrina i normetanefrina nastaje 3-metoksi-4-hidroksibademova kiselina (vanilmandeliina kiselina, VMA). Djelovanjem MAO-a na 3-metoksitiramin nastaje krajnji produkt metabolizma dopamina homovanilinska kiselina (HVA). Ako najprije djelu-

nastaje normetanefrin,

MAO, iz noradrenalina i adrenalina nastaje 3,4-dihidroksimandelidna kiselina koja uz COMT prelazi u krajnji produkt metabolizma noradrenalina i adrenalina VMA. Djelovanjem MAO-a na dopamin nastaje 3,4-dihidroksifenil octena kiselina, a daljnjim djelovanjem COMT-a krajnji produkt metabolizma dopamina HVA (sL 14-24.). Kliniiko znatenje.Iako katekolamini imaju vaZnu ulogu u mnogim fiziololkim procesima kao 5to su stres, pad tlaka ili volumena krvi, manjku hormona Stitnjade, kongestivnom zatajenju srca i aritmijama, njihovo mjerenje primarno sluLizadijagnozu neurokromafinih tumora feokromocitoma, paraganglioma i neuroblastoma. Korisno je i kod psihijatrijskih poreme(aja, kada se osim noradrenalina mjeri i njegov metabolit 3-metoksi-4-hidroksifenilglikol (MHPG), koji nastaje kao meduprodukt metabolizma noradrenalina i glavni je njegov metabolit u mozgu. Feokromocitom je tumor srii nadbubreZne Llijezde, najdeSie je dobroiudan, uzrokuje paroksizmalnu hipertenzt;r, katkad i hiperglikemiju i glukozuriju. Rijedak je i pojavljuje se u 0,1" 0,3o/o opie populacije. Bolesnici pojadano izluiuju katekolamine i njihove metabolite mokraiom. Kod feokromocitoma je poveiana aktivnost svih enzima koji sudjeluju u biosinrezi katekolamina, a smanjena je aktivnost enzima koji sudjeluju u metabolizmu. Feokromocitom se moZe pojaviti i u nasljednoj bolesti - multiploj endokrinoj neoplaziji (MEN) dpa} uz karcinom C-stanica ititnjade. Feokromocitom oslobada katekolamine intermitentno, a i njihov raspad moie biti brz, pa su im koncentracije desto unutar referentnog intervala ili malo poveiane, 5to oteiava dijagnosriciranje. Mogu se primjenjivati stimulacijski i supresijski testovi, ali se izbjegavaju zbog rizika.

je

U lokalizaciji tumora primjenjuje na u plazmi

ili

scintigrafrja.

se

selektivno uzimanje uzoraka izvenazamjerenje katekolami-

361

Poglaufe 14

HOHH --I -l- -l-

HOH ^^I ^t^

Ho-r-r?-?-*"' A

,n\)

"ol-fi-[-i rHr

H

no.\/

:.llD-C-cooH 3,4-dihidroksimandelidna kiselina (DHMA)

3,4-dihidroksi-feniloctena

CH3O

coMr

%

3-metoksitiramin

\conr \Ho

H OH

I

-ro)r2

&H? -g COMT

H

^ Ho-l^r?-?-*"''odo]i^l-c-cooH H HH

^Jr)

adrenalin

noradrenalin

HHI I

I

*",f"

homovanilinska kiselina (HVA)

HOHH tll

ti C_C_NH, cH3o tt MAO .# HH HO

3-o -metilnoradrenalin

3-metoksi-4-hidroksi mandelidna kiselina (vanilmandeliina kiselina) (VMA)

(normetanefrin)

Sli

3-O-metiladrenalin (metanefrin)

ka 1 4-24. Metabol izam katekolamina.

Paragangliom je rumor kromafinih stanica koji se nalazi izvan nadbubrei,ne Lliiezde. Neuroblastom je tumor simpatidkih Zivdanih stanica u srii nadbubreLne Lliiezde, ali i izvan nje, zloiudan je i pojavljuje se u djece. Poveieni su noradrenalin, njegovi metaboliti, dopamin i HVA u

mokraii. Katekolamini i njihovi metaboliti izludulu

se

slobodni ili konjugirani kao sulfati i glukuroni-

di.

14.s.1

Metode odredivanja katekolamina i njihovih metabolita

Katekolamini se odreduju HPLC-om, te fuorometrijskom, imunokemijskom i radioenzimskom metodom. Kod fuorometrijske metode katekolaminiizmoftraie adsorbiraju se na aluminijev oksid ili ionsko-izmjenjivadku smolu, eluiraju s kolone, ciHiziraju s jodom i natrijevim jodidom u indolske spojeve adrenolutin i noradrenolutin, koji u luZnatom mediiu prelaze u fluorescentne derivate. Metoda je slabo osjetljiva i specifidna i ima mnogo interferencija. Od imunokemijskih metoda uglavnom se primjenjuju metode s neradioaktivnim obifeZivadima. Metanefrini se odreduju HPLC-om, imunokemijskom, spektrofotometrijskom, fuorometrijskom i radioenzimskom metodom. Kod spektrofotometrijske metode metanefrini se nakon hidrolizekonjugata izoliraju iz mokraie adsorpcijom na ionski izmjenjivad, eluiraju s kolone i oksidiraju s natrijevim perjodatom u vanilin, dija se apsorpcija odredi spektrofotometrijski. Prije skupljanja mokraie vai,na je drjeta,jer mnogi prehrambeni proizvodi, kao i neki lijekovi mogu utjecati na rezultare pretraga. Kod fuorometrijske metode metanefrini se hidroliziraju, adsorbiraju na kationski izmjenjivad i prevedu u adrenolutine, koji u luZnatom mediju prelaze u fuorescentne spojeve.

Horrnoni 363 VMA se iz mokr ate izoliraekstrakcijom organskim otapalima ili adsorpcijom na ionski izmjenjivad. Prevodi se u vanilin dija se koncenuacijamjeri spektrofotometrijski. Odreduje se i imunokemijskim metodama s neradioaktivnim obiljeZivadima, te HPLC-om. Smatra se da je odredivanje metanefrina najosjedjivija pretraga za dijagnozu feokromocitoma. Iako je laajnji proizvod normalnog metabolizmakatekolamina VMA, katekolamini koje ludi tumor uglavnom se metaboliziraju u metanefrine. No, moguii su laZno pozitivni rezultati pri stresu ili uzimanju nekih lijekova, pa se mjere i katekolamini i VMA koji su manje osjetljive, ali specifidnije pretrage.

mjeri u mokraii, plazmi i likvoru HPlC-metodom. U mokraii se nalazi u obliku glukuronida i sulfata, a u plazmi slobodan i konjugiran. Katekolamini u plazmi odreduju se imunokemijskom i radioenzimskom metodom, te HPLC-om. Kod radioenzimske metode adrenalin, noradrenalin i dopamin se uz dodatak enzima COMT i metil donora S-adenozilmetionina obiljeZenog radioizotopom metiliraju u metanefrin, normeranefrin i 3-metoksitiramin (sl. 14-24.), koji se odvoje TLC-om i eluiraju s plode silika gela. Metanefrin i normetanefrin oksidiraju se s natrijevim perjodatom u vanilin. Odreduje se radioaktivnosr 3-metoksitiramina i vanilina i usporeduje sa standardima poznate koncentracije. Metoda je vrlo osjetljiva, ali dugotrajna i sloiena. Primjenjuje se i HPLC na obratnim fazama ili na ionskim izmjenjivadima uz elektrokemijski detektor. Pri uzimanju krvi treba poduzeti sve mjere da se sprijeie leL,no pozitivni rezultati zbogstresa ili davanja nekih lijekova, te laZno negativni rezultati zbog raspada vrlo osjetljivih katekolaminskih molekula. Koncentracija katekolamina u plazmi raste 2-3 pwau stojeiem poloiaju. Dopamin se takoder odreduje imunokemijskom, radioenzimskom i HPLC metodom, dok se njegov metabolit HVA moZe odrediti spektrofotometrijskom, fuorometrijskom i HPLC metodom.

MHPG

14.10.

se

5-hidroksiindoli

U granulama enrerokromafinih crijevnih stanica, te u sredi5njim i perifernim neuronima stva(5-HT serotonin) kojl ima vazokonstrikcijsko i stimulirajuie djelovanje na glatke mi5iie. U krv se prenosi trombocitima. Nalazi se u crijevnoj mukozi, ra se biogeni amin 5-hidroksitriptamin epifrzi i SZS-u.

Serotonin se sintetiziraiz aminokiseline triptofana koji se hidroksilira na poloiaju 5 indolske jezgre uz enzimtriptofan-hidroksilazu, a srvoreni 5-hidroksitriptofan (5-UTP) dekarboksilira se uz enzim triptofan-dekarboksilazu u 5-HT. Metabolizam 5-HT-a obavlja se uz enzim MAO, koji ga prevodi u glavni metabolit 5-hidroksiindoloctenu kiselinu (5-HIAA), (rl. 14-25.).Izluduje se mokraiom slobodna ili manjim dijelom kao O-sulfat. Kliniiko znaienje. 5-HT se pojadano stvara u tumoru enterokromafinih stanica, karcinoidu. Normalno 3o/o hranom unesenog triptofana prelazi u 5-HT, dok se u karcinoidnim tumorima dak 600/o triptofana metabolizira tim putem. Bolesnici izluduju i do 100 puta veie kolidine 5-HIAA nego zdrave osobe. Tumori se najdeSie pojavljuju u probavnom sustavu, bronhima, timusu i dr. Klinidki simptomi jesu proljevi, rumenilo lica, stenoza bronha, srdani poremeiaji i krvarenje. Ovisno o mjestu nastanka tumora ludit ie se 5-HT ili 5-HTP, dok neki, kao npr. rektalni karcinoid, ne lude poveiane koliiine 5-hidroksiindola. Karcinoidi lude i druge tvari kao Sto su histamin, bradikinin, prosraglandini i vazoaktivni peptidi tahikinini. Mogu se pojaviti i u sklopu MEN ripa I uz tumore paratireoidne LItjezde, te adenome hipofize i gu5terade. Pri sumnji na karcinoid mjeri se koncenuacija 5-HIAA u mokraii, a, ako je ona unutar referentnog intervala

ili granidna,

moZe se mjeriti

i 5-HT u punoj lavi ili trombocitima.

364

Poglaulje 14

n TH' *-cHr-iH-cooH

rn Hofu

,u]l_r1; #tll ,

r

l

T"'

+

-cHz-cH-cooH

\-

)/

HH triptofan

5-hidroksiriptofan

(5-HrP)

HO--Hofu-.",-lX] "W-cH2-cH' :"fu

-,cHz-cooH

\,.

N'/ I

I

H

H serotonin

(;-Hr;

5

-hidroksiindoloctena kiselina (5-HIAA)

Slika 14-25. Biosinteza i metabolizam 5-hidroksiindola.

5-HT je neurotransmitor u mozgu. Ukljuden je u razne fiziololke procese kao 5to su san i percepcija bola, te u psihijatrijske bolesti shizofreniju i depresiju. U depresiji je nadena smanjena koncentracija 5-HIAA u likvoru, te smanjena kolidina S-HT-a i 5-HIAA u mozgu plst rnzrtern. Davanje nekih antidepresiva selektivno inhibira ponovno pohranjivanje 5-HT-a u presinaptidkim neuronima i poveiava njegovu koncentraciju u serotoninergidkim sinapsama.

14.10.1.

Metode odredivanja serotonina i njegovih metabolita

Serotonin i njegov metabolit 5-HIAA odreduju se spektrofotometrijskim, fluorometrijskim i imunokemijskim metodama te GC-om i HPLC-om. Najdelie se primjenjuje HPLC (particijska kromatografija na obramim fazama ili kromatografija na kolonama ionskih izmjenjivada uz fuorometrijski, spektrofotometrijski ili elektrokemijski detektor). Od spektrofotometrijskih metoda za mjerenje 5-HIAA najdeiie se primjenjuje metoda s 1-nitrozo-2-naftolom, dioksoduSidnom kiselinom i 2-merkaptoetanolom u kojoj nastaje derivat plave boje. Pri skupljanju mokraie treba izbjegavati odredene prehrambene proizvode i lijekove koji interferiraju. U prilozima ovog udibenika dani su referentni intervali za hormone i srodne spojeve prema L. Thomasu, (vidi literaturu pod 9).

Literatura l.

KL, ur. Principles and Practice of Endocrinology and Metabolism. Philadelphia: JB Lippincom Company, 1990. 2. Brent GA. The molecular basis of thyroid hormone action. N EngJ Med 1994;33L847-53. 3. Burtis CA, Ashwood ER, ur. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo:'WB Saunders Company, 2006. 4. Ekins R. Measurement of free hormones in blood. Endocr Rev 1990; ll:5-46. 5. Imura H, ur. The Pituitary Gland. New York: Raven Press, 1994. Becker

Hormoni 365 6. NicoloffJT, Spencer CA. The use and misuse of the sensitive thyrotropin assays. J Clin Endocrinol Metab 1990; 7l:553-8. 7. Speiser PW'W'hite PC. Congenital adrenal hyperplasia. N EngJ Med 2003; 349:776-88. 8. Spencer CA, LoPrestiJS, Patel A i sur. Applications of a new chemiluminometric thyrotropin assay to subnormal measurements. J Clin Endocrinol Metab 1990; 70:453-60. 9. Thomas L. Clinical Laboratory Diagnostics. Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. l. izd. FrankfurrlMain : TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, I 99 8. 'W'illiams Textbook of Endocrinology. Philadelphia, Lon10. W'ilsonJD, Foster D'W', Kronenberg HM, Larsen PR, ur. '$78 don, New York, St Louis, Sydney, Toronto: Saunders Company, 1998.

15 vi,tarnini

Poglauf e

BoZidar Straus, Roberta Petlevski

367

Uitamini topljivi u mastima Vitamin A

367

Vrtamin D

369

Vitamin

E

372

Vitamin

K

373

t75

Vitamini topljivi u vodi Tiamin

-

vitamin B'

Riboflavin

-

375

vitamin B,

377

Piridoksin, piridoksamin, piridoksal

[ijanokobalamin Folna kiselina Niacin

-

-

-

-

vitamin

vitamin B,

Bu

379

i82 184

-

vitamin B,

185

l86

H

Askorbinska kiselina

vitamin

380

vitamin B,

Pantotenska kiselina

Biotin

vitamin 8,,

-

-

vitamin

C

187

Vitamini su organski spojevi razliiite kemijske strukture potrebni organizmu u malim kolidinama (od pg do mg vrijednosti po danu), a nuZni su za i reprodukcrju. Mogu se dobiti iz prirodnih izvora ili kemijskim purem. Naziv im dolazi od latinske rijedi uita, iro znati iivot i rijedi arnin, prema Funku koji je istraZivao antiberiberi faktor i smatrao je da je rijei o aminu. eovjedji organizam ne moie sam sintetizirati vitamine, nego mora njih ili njihove prekursore unositi hranom. Uobidajena mijeSana hrana redovno sadriava dovoljne kolidine vitamina. Medutim, neogovarajuta prehrana moie uzrokovati manjak nekog vitamina, 5to dovodi do hipovitaminoze ili iak avitaminoze.Manjak nekog vitamina uzodrLavanje zdravlja, rasta

rokuje karakteristidne poremeiaje. Mnoge su avitaminoze popraiene poremeiajem u razvoju i rastu, a deste su i promjene na koZi. Hipervitaminoze (viSak vitamina) vrlo su rijetke i nikad ih ne uzrokuje prehrana. Do hipervitaminoze moZe doii uglavnom samo ako se predozira vitaminska terapija. Prema topljivosti dijele se na vitamine topljive u mastima i vitamine topljive u vodi. U mastima su topljivi vitamini A, D, E i K, a u vodi tiamin (Br), ribofavin (Br), niacin (Br), pantotenska kiselina (B5), piridoksin (86), folna kiselina (Be), cijanokobalamin (Brr) i askorbinska kiselin" (C). Uloga vitamina u metabolizmu jest u tome 5to su mnogi od njih koenzimi ili prostetidne skupine enzima, pa su potrebni za odri.avanje aktivnosti mnogih enzima. Vitamini kao koenzimi sluZe kao davatelji ili primatelji kemijskih skupina iona ili elektrona. Oni se u tim reakcijama kemijski mijenjaju i troSe pa je organizam potrebno stalno opskrbljivati vitaminima. Osim hrane, izvor vitamina mogu biti i crijevne bakterije. One su npr. izvor vitamina K.Zaro lijekovi koji uniStavaju crijevnu foru, kao antibiotici ili sulfonamidi, mogu dovesti do hipovitaminoze ako se dugo uzimaju. Koncentracija vitamina relativno se rijetko odreduje u klinidke svrhe, iako bi to trebalo dedie diniti, kako za utvrdivanje hipovitaminoza, kad obidno joi izostaju klinidki simptomi koji se pojavljuju tek kod avitaminoza, tako i u pra-

ienju viraminske terapije da ne bi dollo do hipervitaminoze.

366

Vitamini

topljivi u mastima

1s.1. Vitamini 1s.r.1.

Vitamin A

Vitamin Aie izraz za skupinu spojeva koji u svojoj kemijskoj strukturi sadriavaju cikloheksenilski prsten (B-iononski prsten) s 3 metilne skupine i pobodni lanac od 9 C-atoma koji na kraju ima hidroksilnu (retinol), aldehidnu (retinal), karboksilnu (retinoidna kiselina) ili esterrko ,k rpinu (retinil-ester)(sl. l5-l). Navedeni spojevi jo3 se nazivajuretinoidim a, a najvaLniji medu njima jest retinol, primarni nezasiieni alkohol. Osim retinoida u skupinu vitamina A, ubrajaju se i karotenoidi (C40 poliizoprenoidni spojevi) tijim cijepanjem u organizmu nastaje retinol. Najaktivniji karotenoid naden u biljkama jest B-karoten (provitamin A). Izoliran je iz mrkve goji.r. 1830. i nazvan ttkarotenom>ljuStenjem 36 pmol/L i vrijednostiTfS-a na7|o/o, a povefana je i koncentracija TIBC-a

manjak ieljeza u organizmu

koncentracije Fe smanjene ili unutar referentnog intervala, vrijednost TfS-a smanjena ili unutar referentnog intervala, poveiana koncentracija TIBC-a

preoptereienje ieljezom

pove(ane koncentracUe Fe poveiana vrijed nost TfS-a, koncentracija TIBC-a unutar referentnog intervala ili smanjena

(hemokromatoza)

hepatitis

akutne upale (respiracijske infekcUe), apsces, imunizacija, infarkt miokarda

kroniine upale ili zloiudne bolesti

vrlo poveiane koncentracije Fe, mogude poveianje koncentracije Fe na > 180 pmol/L zbog hiperferitinemije uzrokovane oiteienjem hepatocita koncentracije Fe smanjene ili unutar referentnog intervala, n ost TfS-a u n uta r referentnog i nterva la i I i sma njena

vrijed

koncentracije Fe smanjene ili unutar referentnog intervala, vrijed nost TfS-a un utar referentnog i nterva la i I i sma njena

397

398

Poglaulje

l6 jednost. To j. stoga 5to se u serumu nalazi samo vrlo mali dio telieza, px koncentracija teljeza u serumu ne mora uvijek davati ispravnu sliku ukupne kolidine teljeza u tijelu. Glavni su poremeiaji u metabolizmu i,eljeza manjak L,eIjeza u organizmu i preoptereienje teljezom.Ipak, promjene u metabolizmu L,ehjezamogu pratiti mnoge druge bolesti, popur anemije, kardiovaskularnih bolesti, kronidnog hepatitisa, infekcije HIV-om i drugih infekcija. Manjak teljeza. Manjak i,eljezajedan je od najde5iih poremeiaja u !udi, a osobito u djece, mladih isnai u starijih osoba. Manjak i,eljeza u organizmu moZe biti uzrokovan nedovoljnim unosom hrane (malnutricija) i lo$om apsorpcijom (malapsorpcija). Do manjka L,eljeza u iena dolazi zboggubitka krvi tijekom menstrualnoga ciklusa, dok je u mu5karaca uzrok romu najde5ie kronidni gubitak krvi u gastrointestinalnome traktu (ovo je takoder dest uzrok gubi*a krvi i u Zena). Koncentracije teljeza smanjene su kod mnogih, ali ne i svih, osoba s anemijom zbog manjka i,eljeza te u osoba s akutnim i kronidnim upalnim bolestima (smanjeno je otpultanje L,eLjeza iz stanica retikuloendotelnoga sustava). Akutna ili nedavna krvarenja, ukljuiujuii i dobrovoljno davanje krvi i menstruaciju, uzrokuju male koncentracije teljeza. Oralni kontraceptivi poveiavaju koncentracije i,eljeza, ali nakon 5to se prekine njihovo uzimanje koncentracrje L,eljeza smanjuju se i do 30o/o. Zbog brojnih razliditih uzroka koji dovode do smanjenja koncentracije i,eljeza, rezultati se moraju oprezno i pailjivo interpretirati. Vrijednosti za TIBC razlikuju se pri razliiitim poremeiajima u merabolizmu L,eljeza. TIBC je iesto poveian pri stanju manjka teljezau organizmu i to zbogkompenzarorno pojadane sintezeTf te kod nekroze jetre zbog otpultanja feritina. Oralni kontraceptivi takoder uzrokuju porasr TIBC-a, a isto se zapal,a u podetku trudnoie. TIBC je desto smanjen pri cirozi i hemokromatozi zbogmanjka feritina te pri nefrozi zboggubitka Tf-a. TIBC je smanjen i kod kronidnih upalnih bolesti, zloiudnih bolesti i opienito u stanjima s malom koncentracijom i,e\jeza, ali i u onima pri kojima ne dolazi do opieg manjka teljeza u organizmu. Pri dijagnosticiranju stanja manjka teljeza u organizmu desto se odreduju Lrchjezo i TIBC. Ipak, mnoge osobe s manjkom teljeza u organizmu imaju vrijednosti Leljeza i TIBC-a unutar referentnih intervala. Smatra se da je odredivanje koncentracije feritina u serumu mnogo osjetljiviji i pouzdaniji pokazatelj ovog poremeiaja. Vrijednosti su feritina unutar referentnog intervala u osoba s B-talasemijom (heterozigoti), stanju koje se desto zamjenjuje sa stanjem manjka L,e\jeza u organizmu. U membranama eritrocitnih prekursora u ko5tanoj srZi uklopljeni su brojni receptori zaTf. Na te se receptorevei,e kompleks teljeza i Tf-aprije uvladenja u stanicu i otpuitanjateljezaiz kompleksa u citosol. Broj receptora zaTf poveian je pri manjku L,eljeza u organizmu, a smanjen je kad jeL,eljezo u vi5ku. Takve se promjene u broju receptoraza Tf u eritropoetidkome tkivu odra|,avaju i u promjenama koncentracije topljivih transferinskih receptora (sTfR; nastaju proteolizom transferinskih receptora) u serumu. Stoga odredivanje sTfR-a u serumu upuiuje na razinu eritropoeze u ko5tanoj srZi. Topljivi TfR odreduju se u krvi imunokemijskim metodama. Ova je pretraga osjetljiv pokazatelj funkcionalnog manjka teljeza u osoba dija su skladiSra i,eljeza ispraZnjena, ali u kojih se jo3 nije razvila anemija zbog manjka i,eljeza. Zbog moguinosti da se ovom pretragom razlikuju anemija koja je posljedica kronidnih bolesti od anemije zbog manjka teljeza, odredivanje sTfR-a vatanje parametar u odredivanju statusa L,eljeza. Prosjedne vrijednosd za iTfR u serumu iznose oko 5,6 mg/L. Najpouzdanija metoda u dijagnosticiranju stanja manjka teljeza u organizmu jest citokemijsko bojenje punktata koitane srZi s pruskim plavilom kojim se, uz uporabu mikroskopa, utvrduje je li hemosiderin prisutan u uzorku ili nije. Ova se pretraga najdeiie primjenjuje za razlikovanje anemije koja je posljedica kronidnih bolesti od anemije zbog manjka Leljeza. Normalno se oko lo/oi,eljezau serumu nalazi u feritinu. Smatrase da je feritin u serumu u ravnoteZi s feritinom u skladiStima. Promjene u kolidini teljeza u skladi$tima odraZavaju se u

Elernenti u tragu

koncentraciji feritina u serumu. Koncentracije feritina u serumu smanjuju se vrlo rano tijekom razvojastanja manjka teljezau organizmu, mnogo prije nego 5to se mogu uoditi promjene u koncentraciji hemoglobina u krvi, volumenu eritrocita ili u koncentraciji i,eljeza. Stoga je mjerenje koncentracije feritina u serumu vrlo osjetljiv pokazatelj stanja manjka i,e\jeza u organizmu koje nije uzrokovano nekom drugom boleliu. Koncentracije feritina u serumu mogu se poveiati zbog brojnih razliditih kronidnih bolesti, popur kronidnih infekcija, kronidnih upalnih bolesti (.tpt reumatoidni artritis ili bubreZne bolesti), srdanih i zloiudnih bolesti (osobito limfoma, leukemija, karcinoma dojke i neuroblastoma). U osoba u kojih je prisutan bilo koji od ovih kronitnih poremeiaja zajedno sa stanjem manjka teljeza u organizmu, koncentracije feritina desto su unutar referentnog intervala. Koncentracije feritina poveiane su kod virusnog hepatitisa ili nakon toksidkog odteienja jetre zbog otpu5tanja feritina iz oiteienih jetrenih stanica. Koncentraciie feritina poveiane su i u osoba s hemosiderozom ili hemokromatozom. Ipak, pokazalo se da je mjerenje koncentracije feritina u serumu pri probiranju za ranu detekciju preoPtereteniateljezom manje osjetljiv parametar od mjerenja koncentracije serumskogai,eljeza, TIBC-a i postotka TfS-a.

Preopteredenje il,eljezom. Poveiana koncentracija teljeza u serumu pojavljuje se u hemolitidkoj anemiji zbogpoveianog raspada eritrocita i razgradnje hemoglobina. U takvim se stanjima poveiava i kolidina ircljezau stanicama retikuloendotelnog sustava. Koncentracrjai.eljeza je poveiana i kada je smanjena eritropo ezauko5tanoj srZi, a to je sludaj pri otrovanju olovom i pri manjku piridoksina, vitamina 812 ili folata. Kod jetrene ciroze poveiano ircljezo u serumu posljedica je pojadanog otpuitanjateljezaiz togorgana, dok se kod perniciozne anemije L.eliezo poveiava u serumu zbog smanjenog odlaganja u skladi5ta. Osim toga, koncentracije i,eljeza poveiane su pri akutnom otrovanju i,eljezomdjece, nakon oralnog uzimanja pripravakaL,eljeza,nakon parenteralnog davanjaL,eljezaili u stanju preoptereienja i,eljezom. Stanja povezana s PreoPtereienjem i,elje' zom jesu hemosideroza, hemokromatoza i sideroblastidna anemija. Pojam r>hemosideroza 250 pg/g). Do nakupljanja bakra u jetri te eventualno i u drugim tkivima dolazi zbog manjka enzima AIP7B. Procjena bolesti trebala bi se osnivati na iscrpnoj anamnezi i klinidkom pregledu, odredivanju

Cp-" i biokemijskih pokazateljajetrene funkcije, na serolodkim pretragama za virusni i autoimunosni hepatitis, oftalmolo5kom pregledu odiju uz upotrebu posebne lampe, biopsiji jetre uz kvantitativno odredivanje bakra u jetrenome tkivu i/ili DNA analizi. Molekularnom je dijagnostikom moguie probiranje kako bi se utvrdilo postojanje mutacija u kodirajuioj regiji genaATPTB. Ipak, iako je genetidko testiranje na \Tilsonovu bolest moguie, ono nema veliko znadenje u dijagnostici ove bolesti zbog velikoga broja mutacija u ATPTB genu i zbog utvrdene dinjenice da su osobe s \Tilsonovom boleSiu najdesie heterozigoti za dvrje razlidite mutacije.

Metode odredivanja koncentracije bakra i ceruloplazmina

16.2.7.L

Najveii dio bakra u serumu .vezan je za Cp te se bakar najprije mora osloboditi da bi mogao reagirati s reagensima na bakar, pri demu nastaju kelatni kompleksi bakra i reagensa. Bakar se oslobada zakiseljavanjem i deproteinizacijom, a zatim se provodi reakcija s jednim od reagensa (tabl. 16-7.). Buduii da je bakar jako raSiren, postoji opasnost od kontaminacije uzorka, reagensa i stakla, bakrom iz okoliSa. Zbog toga posebnu pozornost treba obradti na pranje stakla, distoiu kemikalija i vode te na uvjete pod kojima se

uzima materijal za enaliza. Preporutene metode za odredivanje

u

serumu jesu metoda AAS i spektrofotometrija s kuprizonom, a za

bakra

mokraiu AAS. Opiirnije o metodama za odredivanje bakra moZe se

naii u

2.

izdanju ovo g udZbenika.

Cp se odreduje imunonefelometrijom ili imunoturbidimetrijom standar-

Tablica 16-7. Reagensi za spektrofotometrijsko odreifivanje bakra

dietilditiokarbamat voda izoamilnialkohol dibenzilditiokarbamat CCl4 CCl4 ditizon (kuproin) 2,2-bikinolin izoamilnialkohol 2,9-dimetil-1,10-fenantrolin etanol

440 44O

435

16.200

508

24.600

540

5.900

454

8.000

n-heksanol

480

14.200

voda

600

16.000

(neokuproin)

2,9-dimetil-4,7-difenil-1,10fenantrolin (batokuproin)

biscikloheksanon-oksalildihidrazon (kuprizon)

oksalilhidrazid-acetaldehid voda

542

29.500

1,5-difenilkarbohidrazid

540

158.000

voda

diziranima prema CRM 470. Referentni intervalzaadoLescente i odrasle osobe iznosi 0,2-0,6 g/L. Ispitivanja su pokazala da je specifidna enzimska aktivnost Cp-a (omjer enzimski aktivnog Cp-" i imunoreaktivnog Cp-") osjetljiviji pokazatelj statusa bakra u tijelu od odredivanja koncentracije bakra u serumu.

16.2.8.

8.000 12.740

cink

Cink se unosi u tijelo hranom, vodom, pa dak i zrakom. Normalnom se prehranom na dan unosi l0 do l5 mgcinka. Sadriavaju gaLitarice i braSno,5eier, meso, ribe, masti, orasi itd. No, mnoge su danaSnje namirnice zbog prodiSiavanja (rafiniranja) siroma3ne cinkom. Rafinirano braino sadriava samo 20o/o Litnog cinka, a rafiniranjem Seiera gubi se gotovo sav cink te ostaje samo 2o/o odukupne kolidine cinka koju sadrZava sirovi 5eier. Zbogfitata (inozitolfosfat) u Zitaricama smanjuje se apsorpcija cinka, pa organizam ne iskoriStava sav cink koji prima s hranom. Zato su danas glavni izvor cinka crni ili rai,enikruh, meso, riba i orasi.

405

406

Poglaulje 16

Cink je potreban

za rasr, keratinizaciju koZe

Poznato je vi5e od 300 enzima za

tijuje

i sintezu proteina. U tijelu je vezan

za proteine.

aktivnost potreban cink. Osim toga, viSe od 500 protei-

na ukljudenih u regulaciju transkripcije i replikacije sadrZava cinkove ione. Cink se kao struktur-

ni dio molekule nalaziu karboanhidrazi, karboksipeptidazi, alkohol-dehidrogenazi, glutamat-dehidrogenazi, Iaktat-dehidrogenazi, glicerol-3-fosfat-dehidro genazi, malat-dehidrogenazi, RNA polimerazi i DNA polimerazi, timidin-kinazi i alkalnoj fosfatazi. Vei sama dinjenica da je cink potreban za aktivnost tolikih enzima upuiuje na njegovu vainost za metabolizam i odriavanje normalne funkcije organizma te da je manjak cinka prisutan pri razliditim patolo5kim stanjima. No, dok cink neke enzime, poput adenozin-trifosfataze, kisele i alkalne fosfataze, aktivira, druge, npr. ribonukleazu, inhibira. Zanimljivo je da cink ima aktivirajuie svojstvo samo u vrlo malim koncentracijama, dok u veiim koncentracijama inhibira te iste enzime. Thkav je sludaj s alkalnom fosfatazom. Promet i metabolizam cinka. U tijelu odrasle zdrave osobe (ZO kg) ima oko 1,3-2,3 g cinka, koji se uglavnom nalazi u stanicama, tako da je cink najzastupljeniji stanidni element u tragu. Cink se u dvanaesniku i proksimalnom jejunumu brzo apsorbira u crijevnu stijenku. Najprije se vete zapovrlinu membrana u crijevnoj stijenci , e zatim polagano prolazi kroz membrane, vjerojatno vezen na ligand koji se naziva intestinalnim proteinom bogatim cisteinskim ostatcima (CRIP, engl. cysteine-rich intestinal protein), a koji omoguiu;'e medustanidni prijenos cinka. Na smanjenu apsorpciju cinka utjedu neki kationi, poput kalcija iL,eljeza, dok neke aminokiseline, poput histidina i triptofana, imaju pozitivan udinak na njegovu apsorpciju. Apsorpciju pospjeSuju i dugolandane masne kiseline (zasiienost i duljina lanca imaju pozitivan utjecaj). Pikolinat, citrat i fitat in uitro znatno inhibiraju apsorpciju stvarajuii s cinkom komplekse koji su ili netopljivi ili onemoguiuju vezanje cinka na receptore u mukozi. No, istraZivanja in uiuo pokazuju da se apsorpcija cinka poveiava kompleksiranjem cinka s pikolinatom, za razliku od citrata ili glukonata. nalazi u stanicama gotovo svih organa u obliku kompleksa s proteinima. NajviSe se nakuplja u prostati, a ima ga i u jetri, bubregu, slezeni, guSteradi, pluiima, miSiiima, srcu, aorti, mozgu, koii i dr. U bubrezima je cink vezan za metaloprotein metalotionein. U leukocitima je takoder naden metaloprotein s cinkom. Eritrociti sadrZavaju oko l0 puta vi3e metaloproteina sa cinkom nego krvna plazma. Cink stvara i spoj s inzulinom koji, dini se, ima fiziolodku ulogu. Cink takoder

Cink

se

ima ulogu u odrianju konfiguracije molekule RNA.

Cink u krvi. U krvnoj se plazmi cink prenosi uglavnom vezan za albumin (60-700/o) i za ar-makroglobulin (30-4Oo/o), dok je u maloj kolidini yezan zaTf i za slobodne aminokiseline. Cink se pri akumoj intermitentnoj porfiriji izluduje yezan s uroporfirinom u mokraii i stolici, a pri otrovanju olovom i akutnoj reumatskoj vruiici kao cink-koproporfirin. Zbog toga kod tih bolesti moie doii do manjka cinka koji, isto kao i viSak cinka, moi,e uzrokovati abnormalni metabolizam hemoproteina. Iz organizma se cink veiim dilelom izlutuje stolicom, a manje mokraiom. Nalazi se i u drugim tjelesnim tekuiinama, poput sline, Zeludanog soka, Zudi i znoja, pa se pri jakom znojenju gubi i tim putem. VrijedTablica 16-8. Vrijednosti cinka nosti cinka prikazane su u tablici l6-8. krvni serum ili plazma 9,9-17,9pmolll Klinitko znatenje. Koncentracija cinka u serumu mijepuna krv 76,0-92,0 pmol/L nja se u nizu bolesti. Poveiana koncentracija (hipercinkemi0,13-0,25 pmol/l010 eritrocita eritrociti ja) dosta je rijetka i nalazi se kod hipertenzije, eozinofihle, 0,18-0,25 pmol/ l0e leukocita leukociti multiplog mijeloma i kadito kod megaloblastitne anemije. 2,3-18,4 pmol/dU mokra(a Mnogo je de5ii manjak cinka u organizmu, do kojeg najdeiie dolazi zbog neodgovarajuie prehrane. Zbog manjka 76,0-753,0 pmol/24 sata stolica

Elernenti u

cinka pojavljuju

se

zastoj u rastu i sazrijevanju skeleta, atrofija testisa, hepatosplenomegalija, pod-

loinost infekcijama, slabo zarai(ivanje rana, ulceracije, dermatitis i proljevi. Manjak moZe biti i posljedica nekih bolesti ili terapije anabolicima ili kelatorima poput penicilamina. Smanjenje cinka u serumu opaZeno je pri akutnoj tuberkulozi, akutnim i kronidnim infekcijama, infarktu miokarda, jetrenoj cirozi, hepatitisu, poremeiaju gastrointestinalnoga trakta, opeklinama, leukemijama, nekim zloiudnim tumorima, npr. bronha i kolona, pernicioznoj anemiji, teSkoj aterosklerozi, uremi;'i, nefrotidkom sindromu i dugom poslijeoperacijskom tijeku te kod jednog genetidkog poremeiaj

a,

Acrodermatitis enteropatbica.Jetrenu cirozu, nefrozu, stanje nakon operaci-

je i Seiernu bolest prati i pojadana cinkurija, tj. izludivanje cinka mokraiom. Smanjena koncentracija cinka u serumu (hipocinke-U") pojavljuje se u trudnoii jer fetus troSi majiin cink, a odraz je manjka cinka u stanicama. Oralni kontraceptivi smanjuju koncentraciju cinka u serumu, ali je koncentracija cinka u eritrocitima veia; dakle, dolazi do preraspodjele cinka u krvi. Mnogi smatraju da su hipocinkemija i manjak cinka vrlo desti i da bi terapija cinkom trebala biti isto tako vaina kao i terapija i,eljezom. Koncentracija cinka u serumu i eritrocitima upuiuje na kolidinu cinka u tkivima, dok se odredivanjem cinka u mokraii dobiva uvid u eventualni gubitak cinka iz organizma. Sliino kao i L,eljezo, organizam Stedi cink i u sludaju manjka smanjuje se izludivanje. i6.2.8.1.

Metode odredivanja cinka

Buduii

da je cink

vrlo raSiren, postoji velika moguinost kontaminacije samog biolo5kog maprovodi odredivanje, a isto tako i reagensa i pribora. Zatoje potrebno posebnu pozornost obratiti na distoiu stakla, vode i kemikalija, kao i na igle za uzimanje krvi, posude za sakupljanje mokraie i sl. Laboratorijsko staklo treba distiti i prati kao i za odredivanje bakra i Leljeza. Voda mora biti redestilirana, a kemikalije sve pro analisi. Pretrage za odredivanje cinka mogu se svrstati u dvije skupine: one kojima se odreduje cink u tkivima ili u tjelesnim tekuiinama te one kojima se odreduju neke funkcije koje ovise o cinku. Korisne pretrage koje pripadaju prvoj skupini ukljuduju odredivanje koncentracije cinka u serumu, krvnim stanicama, mokraii i slini. Funkcionalne pretrage ukljuduju mjerenja aktivnosti enzima koji sadriavaju cink. Ipak, usprkos velikom broju enzima koji sadrZavaju cink, jo5 se ni jedan nije pokazao kao prihvatljiv pokazatelj statusa cinka u organizmu. terijala u kojem

se

Cink u serumu ili plazmi Iako odredivanje koncentracije cinka u serumu desto moZe upozoriti na manjak cinka, ono ipak ne odratava uvijek stvarni status cinka u organizmu. Koncentracije su cirkulirajuieg cinka u korelaciji s albuminom, koji je glavni proteinski nosad cinka. Stoga smanjene koncentracije cinka koje su opaZene u stanju hipoalbuminemije, poput jetrene ciroze i malnutricije, mogu zapravo odraL,avati sman;'eno vezanje cinka.

Utvrdeno je da postoje dnevne varijacije cinka. Koncentracije cinka znatno se smanjuju nakon uzimanja obroka, a poveiavaju nakon kratkotrajna gladovanja. Buduii da su koncentracije cinka u eritrocitima l0 puta veie od onih u serumu, cirkulirajuii bi se cink trebao odredivati samo u nehemoliziranim uzorcima. Koncentracije su cinka u serumu za5-15o/ove(e od onih u plazmi jer se tijekom procesa zgraSavanja otpuita cink iz eritrocita i trombocia (uz uporabu razliditih antikoagulansa osmotidka se tekuiina odvaja od krvnih stanica). Koncentracija cinka u serumu ostaje vrlo dugo nepromijenjena na

-20 "C.

Preporudena metoda za odredivanje cinka u serumu je AAS.

tragu

4O7

4O8

Poglaulje 16

Cink u mokraii Pri manjku cinka u organizmu najdedie se smanjuje izludivanje cinka mokraiom. Ipak, u nekim stanjima u kojima dolazido smanjenja cinka (jetrena ciroza,poveiani unos alkohola, virusni hepatitis, anemija srpastih stanica, razdoblje nakon kirurikih zahvata, iskljudivo parenreralna prehrana) desto je prisutno pojadano izludivanja cinka mokraiom. I za odredivanje cinka u mokraii preporudena metoda je AAS.

Literatura P, Enns C, W'essling-Resnick M. Chemistry and biology of eukaryotic iron metabolism. IntJ Biochem Cell Biol2001; 33:940-59. 2. Black RE. Zinc deficiency, infectious disease and mortality in the developingworld.J Nutr 2003;13Tl4S55-9S. 3. Brown KM, ArthurJR. Selenium, selenoproteins and human health: a review Public Healrh Nutr 2001; 4:593-

1. Aisen

9.

4. Chesters JK.Zinc. U: O'Dell BL, Sunde RA, ur. Handbook of Nutritionally Essential Mineral Elements. New York: Marcel Dekker, 1997:185-230. 5. Delves HT. Atomic absorption spectroscopy in clinical analysis. Ann Clin Biochem 1987;24:529-51.

6. Domitrovii R, Milin e. Biokemila cinka. Biochemia Medica 2000; L0:21-7. 7. Fairbanks VF, Beuder E. Iron metabolism. U: Beutler E, Lichtman MA, Coller

BS, Kipps TJ, Seligsohn U, ur.'Williams Hematolo gy. New York : Mc G raw-H ill, 200 | :29 5 -30 4. 8. Ferenci P, Caca K, Loudianos G, i sur. Diagnosis and phenotypic classification of 'W'ilson disease. Liver Inr 2003;

23:139-42.

9. Forrer R, Gautschi K, Lutz H. Simultaneous measurement of the trace elements Al, As, B, Be, Cd, Co, Cu, Fe, Li, Mn, Mo, Ni, Rb, Se, Sr, andZnin human serum and their reference ranges by ICP-MS. Biol TLace Elem Res 2001; 80t77-93. 10. Linder

MC, Hazegh-Azam M. Copper biochemistry and molecular biology. Am J Clin Nutr 1996; 63:7975-

8l ls. I

l.

Milne DB. Laboratory assessment of trace elements and mineral status. U: BogdenJD, Klevay LM, ur. Laboratory Assessment of Tlace Elements and Minerals. Totowa, NewJersey: Humana Press, 2000:69-90.

12. Thomas L, ur. Clinical Laboratory Diagnostics.

(Jse and Assessment of

Clinical Laboratory Results. l. izd. FrankfurtlMain : TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, I 998. 13. TierzNW, ur. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics .4. izd. St. Louis: Elsevier Saunde-

rs,2006. 14. Vukasovii I. \(ilsonova bolest. Laboratorijska dijagnostika bolesti. Biochemia Medica 2001; I l:41-7. '!7'orwood 15. M. The laboratory assessment of iron status - un update. Clin Chim Acta1997;259:3-23.

Poglaulje

17 Funkclasrc, lvana Cepelak

Akutni koronami sindrom

412

Angina pectoris

413

Akutfli infarkt miokarda

413

Mioglobin

415

Troponin T i

I

Zatajivaniesra

Sroninatrijuretiikipeptidi

416

tll8 419

(imbenici rizika kardiovaskularnih bolesti 420 Lipoprotein (a)

420

(-reaktivan protein

420

Homocistein

421

Za odgovarajuiu opiu funkciju organizma, medu ostalim, potreban je uskladeni rad srca i krvnih Zila. Kardiovaskularni sustav odgovoran je za opskrbu organizma prehrambenim sastojcima i kisikom, kao i za prijenos otpadnih produkata metabolizma do organa za izluiivanje. MiSiini organ srce odgovoran je za pokretanje krvi l 95% miofibrila jela drugi dan nakon oSteienja miokarda upuiuje na blfK, lC slobodni I, slobodnlT < 5% citosol opsegnekroze miokarda. U tablici L7-L.navedeni su mo2. modificirani oblici tTtC, lC ilft't - tkivo i krv guii oblici srtanih troponina. al C i N-terminalna razgradnja Brojni su izooblici troponina koji su razlitito raspodijeljeni izmedu srdanog mi5iia i sporotrzajuiih ibrzouzab) fosforilacija juiih skeletnih miSiia. Razliditi geni kodiraju srdani i c) okidaiija, redukcija skeletni troponin I. Srdani je izooblik za30 aminokiselin3. komplek asocijacijaldisocijacija skih ostataka duii nego oblik iz skeletnih miSiia, 5to odTIC - trojni/trostruki kompleks reduje njegovu visoku kardiospecifidnost. Ekspresija takuog oblika nije zabiljetena u normalnim ili obolelim skeletnim miSiiima dovjeka ili Zivotinje. Razlidiri su i geni koji kodiraju srdane i skeletne izooblike troponina T. Kardiospecifiinost srdanog troponina T odredena je jedinstvenom sekvencijom od 1l aminokiselina. Male kolidine srdanog troponina T stvaraju se, medutim, i u ske,

letnim miSiiima ze vrijeme fetalnog razvoja, obnove mi5iia i bolesti miSiia. Neke od prednosti odredivanja koncentracije troponina kao srdanih biljega ukljuiuju' a) ranu kinedku otpu5tanja, slidnu CK-z, od 4 do 8 sati nakon bola u prsima, b) poveianje koncentracije troponina koje traje 6-7 dana, avra(a se u grani-

ce referentnog intervala nakon 7-I0 dana), c) moguinost kori5tenja niiim dislriminiraju6im vrijednostima (u usporedbi sa CK-2) za procjenu olteienja miokarda i izike suatifikacije, jer su u osoba bez bola u prsima vrijednosti vrlo niske ili dak nemjerljive te d) eliminaciju lainih AIM-a u osoba u kojih je vrijednost enzima poveianazbog oSteienja skeletnih miSiia. Dinamika otpuStanja glavnih srdanih biljega nakon AIM-a prikazana je na slici l7-5.

(5

|!

f

OJ\ .=

O........... troponin

G---

C')

o c

Eq o I

o o

(!U

cl! O)

o

c') o

c'l X

mioglobin CK-MB

III it:rit

I it tii tJ5 it

12 16 20

24

24

72

vrijeme nakon AIM (sati)

Slika 17-5. Dinamika promjena vrijednosti srtanih biljega nakon AIM-a.

418

Poglaufe 17

17.1.4.i.

Metode od rediva nja

a) Princip kvalitativne metode zaTrif (POCT). Za dokazivanje prisutnosti Tirl-a u punoj ftrvi rabe se dva razliiita irirl-a specifidna antitijela, od kojih je jedno obiljeZeno zlatom, a drugo je sadrZava irirl, antitijela ie stvoriti imunokompleks koji je vezanna dvrstu fazu. Nakon odvajanja eritrocita u specijalnu zonu, plazmaprolazi kroz zonu detekcije na kojoj nastali Tirl-kompleks obiljeZen zlatom postaje vidljiv kao obojena linija. ViSak antitijela obiljeZenih zlatom nastavlja migrirati ivete se na kontrolno mjesto. Pojava ove, kontrolne linije potvrduje integritet antitijela, odnosno funkcionalnost testa. Granica detekcije testa je 0,1 Vg/L.Ako kontrolna linila nije vidljiva, rezultat se smatra pogrjednim. b) Kvantitativno se koncentracijatroponina T i I odreduje u serumu imunokemijskim metodama s obileZivaiima, a rezultati se izralavaju u Vg/L. Referentni interval ovisi o metodi odredivanja. Tlenutadno je u tijeku procjena i nekih drugih biomolekula kao potencijalnih biljega srdanih bolesti. To su npr. serumski amiloid, sCD40 ligand, razni citokini, mijeloperoksidaza, fosfolipaza A2, oksidirani LDL, plazma protein-A poyezan s trudnoiom (PAPP-A), metaloproteinaze matriksa, MCP-1, TNFa, izoprostani, adhezijske molekule, ishemijom modificirani albumin, nevezane masne kiseline, kolin, nourin i dr.

biotinilirano. Ako krv

17.2. zatajivanje srca Kritidna komplikacija veiine srdanih bolesti jest zatajivanje srca, s udestaloiiu od 0,5 do L,\o/o populacije. To j. khnitki sindrom dija je znaiajka nesposobnost srca da uz normalne volumene i tlakove punjenja, izbaci minutni volumen pod tlakom koji bi mogao zadovoljiti metabolidke potrebe organizma. Ako se smanjuje funkcija pumpanja lijeve strane srca, viSak tekuiine akumulira se u pluiima, 5to rezultira pluinim edemima i smanjenim minutnim volumenom krvi u sistemnoj cirkulaciji. Bubrezi na ovo odgovaraju smanjenim protokom krvi i pojadanom retencijom tekuiine pogor5avajuii tako stanje. Ako se smanjuje funkcija desne strane srca, viSak tekuiine akumulira se u venskom cirkulacijskom sustavu, Sto rezultira opiim edemima. Takoder je smanjen dotok krvi u pluia i u lijevu stranu srca, a to rezultira smanjenim minutnim volumenom u sistemnu atrijsku cirkulaciju . Zatajivanje srca obuhvaia cijeli spektar stanja od primarnog pogorSanja funkcije srca kao pumpe (5to se moie pojaviti nakon jadeg infarkta miokarda), poveiane sriane krutosti koja uzrokuje pove&nje tlaka u srcu, ogranidava punjenje i poveiava hidrostatiike tlakove iza podrutja smanjene popustljivosti i situacije u kojima su periferne potrebe poveiane Najde5ii uzroci zatajivanjesrca jesu koronarna arterijska bolest, arterijska hipertenzija, kardiomiopatije i bolesti zalistaka, a uzrok mogu biti npr. i opstruktivna pluina bolest, jetrena ciroza, anemije, endokrine, neuromuskularne i autoimunosne bolesti te neoplazme. Osnovni simptomi zatajivanjasrca jesu dispneja (telkoia u disanju), ortopneja (dispneja u leZeiem poloiaju), nepodnoSenje veiega tjelesnog napora, osjeiaj umora i periferni edemi. Dijagnoza se desto postavlja teiko, jer su znakovi i simptomi u podetku bolesti nespecifidni, fizikalni nalazi nedovoljno specifidni za postavljanje todne dijagnoze, a biokemijske laboratorijske pretrage za dijagnostiku zatajivanja srca donedavno nisu niti postojale. Unatrag l5 godina

intenzivno se radi na otkrivanju biokemijskih biljega zatajivanja srca re na procjeni njihove dijagnostidke osjetljivosti i specifidnosti, ulozi u praienju bolesnika sa zatajivanjem srca te ulozi u prognozi bolesd. NajviSe su ispitani biljezi zajedniiki nazvani srdanim natrijuretidkim peptidima. Prema preporuci ESC-a, odredivanje srdanih natrijuretidkih peptida (posebno BNP i NT-

Funkcija

srca

419

urodilatin

Slika 17-6.Struktura natrijuretidkih peptida

iki prptid;

CNP

- natrijuretitki peptid

(ANP

- atruski natrijuretitki peptid; BNP -

moZdani natrijureti-

B-tipa).

pro BNP) ukljudeno je u prvi stupanj algoritma za dijegnostiku kronidnog zatajivanja srca, zajedno s elektrokardiografijom i rentgenskim pregledom pluia.

17.2.L Srcani

natrijuretitki peptidi

Sriani natrijuretidki peptidi dlanovi su porodice koju iine 4 natrijuretidka peptida: atrijski natrijureridki peptid (ANP), moZdani natrijuretidki peptid (BNP; naziv se zadrtao, iako je danas poznaro da se najveie koncentracije nalaze u ventrikulu miokarda), natrijuretidki peptid B-tipa (CNP; lude ga stanice vaskularnog endotela) i urodilatin (lokaliziran u bubregu i izluduje se mokraiom). Gradeni su od 17 aminokiselina od kojih je l l identidno postavljeno unutar prstena koji nastaje stvaranjem disulfidnog mosta izmedu dvrju molekule cisteina (sl. 17-6.). Ova specifiina struktura odgovorna je zavezanje na specifidne receptore ciljmiocit nih tkiva: bubrega, vaskularnog endotela, nadbubreZne Llliezde i

preproBNP (134)

stanica sredi5njega Zivdanog sustava, odnosno za biolodku aktivnost

peptida.

Pro-peptidi (proANP-a i pro-BNP-a) nastaju cijepanjem signalnogpeptida (prepro-pepdda) i pohranjuju se u sekretornim granulama atrija. Dalje se cijepaju u duZe amino-terminalne (NT-proANP i NT-proBNP) i lraie karboksi-terminalne fragmente (ANP i BNP) koji se lude u krv u ekvimolarnim kolidinama (sl. 17-7.). ANP i BNP imaju kraii poluvijek pa su i njihove koncentracije u plazmi manje od koncentracija NT-proANP-a i NT-proBNP-a. Na koncentracije u plazmi utjede dnevni ritam, Zivotna dob, tjelesni napor, poloiaj tijela, prehrambene navike (posebno unos natrija u organizam),lijekovi (ttp.. hormoni Stitnjade, glukokortikoidi, ACE-inhibitori, diuretici, spolni steroidni hormoni) te razna kli-

nitka stanja.

peptid (26

aa)

Y

proBNP (108)

NT-proBNP

1-76

BNP

plazma

NT-proBNP 1-76

Slika 17-7. BNP-a.

Sinteza

ffi

BNP

i sekrecija BNP-a i

NT-pro-

42O

Poglaulje 17

Najvainiji fizioloSki uiinci srdanih natrijuretidkih peptida jesu vazodilatacija i hipotenzivni udinak, inhibicija simpatidkoga iivdanog sustava i aktivnosti nekih hormonskih sustava kao 5to je reninsko-angiotenzinsko-aldosteronski sustav, zatim endotelina, citokina,yazopresina, poticanje natrijureze i diureze, inhibicija mehanizama ventrikularne i vaskularne hipertrofije te povoljni udinci na disfunkcrju endotela u procesu ateroskleroze. Brojnim je ispitivanjima utvrdeno da odredivanje koncentracije NT-proANP-a i NT-proBNP-a bolje odgovaraju definiciji biljega bolesti za razhku od ANP-a i BNP-a koji su pouzdaniji pokazatelji aktivacije ANP/BNP-sustava. Buduii da je BNP glavni natrijuretidki peptid ventrikula (najosjetljiviji je za ventrikularno preoptereienje) stabilan u EDTA-plazmi na sobnoj temperaturi do 6 sati, odredivanje koncentracije tog peptida preporuduje se pri postavljanju dijagnoze, praienja tijeka bolesti i terapije te procijeni prognoze zatajivanja srca, kod ventrikularne disfunkcile poslije AIM-a, hiperrofiine opstrukcijske kardiomiopatije, hipertrofije lijevogventrikula i dilatirane kardiomiopatije. Metode odredivanja srdanih natrijuretidkih peptida jesu imunokemijske metode s obiljeiivadem.

Referentni interval: ovisi o metodi odredivanja.

i7.3. eimbenici rizika kardiovaskularnih bolesti Biokemijske pretrage koje se primjenjuju u smislu poaeianog rizika od kardioaaskularnih boIesti, patako i akutnoga koronarnog sindroma jesu: koncentracija triglicerida, ukupnog kolestero-

la, LDl-kolesterola, HDl-kolesterola, Lp("), fibrinogena, CRP-a i homocisteina. Tiigliceridi, kolesterol, LDL i HDl-kolesterol opisani su u 7. poglavlju, fibrinogen u 9. poglavljr, ovdje su " opisane znatajke Lp("), CRP i homocisteina.

17.3.L

Lipoprotein

(a)

Dokazano je da je Lp(a) rizidni dimbenik koronarne ateroskleroze koji je neovisan o svim drugim parametrima i vanjskim dimbenicima. Preporuduje se stoga njegovo odredivanje u svrhu ranog prepoznavanja fizikaza aterosklerozu, posebice u prisutnosti poveiane koncentracije LDL-a. Lp (") je dimer koji se sastoji od LDL molekule koja je vezana na apo(a) disulfidnim vezama. Apo (a) je glikoprotein znaiajno strukturno homologan s plazminogenom, zimogenom proreo-

litidkog enzima plazmina, koji otapa fibrinske ugru5ke. Polipeptidni lanac apo (a) varijabilne je duljine, Sto je uzrok heterogenosti njegove molekularne mase, a do danas je opisano vi$e od 30 izooblika Lp("). Zbog slidnosti strukture, Lp(") natjede se s plazminogenom u fibrinolizi i interferira zavetu(a mjesta na stanicama i molekulama te tako ubrzava trombozu. Iako je sliian LDl-molekuli, dini se da mu je metabolizam drugog tijeka. Za razllku od LDL-a, koncentracija Lp(") ne mijenja se s promjenom nadina prehrane ili primjenom lijekoyazasmanjenje koncentracije kolesterola. Metode odredivanja Lp(a) jesu imunonefelometrija, imunorurbidimetrija i RID. Referentni interval ovisi o metodi.

17.3.2.

c-reaktivan protein

CRP po strukturi pripada porodici pentraksina, kalcij-veiuiih proteina

sa

svojstvima imuno-

sne obrane. Graden je od 5 istovjetnih, neglikoziliranih podjedinica sastavljenih od jedinstveno-

ga polipeptidnog lanca od 206 aminokiselina s molekularnom masom od 118 kDa. Sintetizira

Funkcija

srca 421

mg/dan, a u akutnoj upali > I g/dan) nakon indukcije s porodicom citokinalL-6, dok moguia sinteza izvanjetre ne pridonosi vrijednostima CRP-a u bolesnikovu serumu. Vrijeme znadajnog poveianja vrijednosti CRP-a u krvi, ako je rijei o sistemnoj upali, iznosi oko 6-12 (10) sati, a vrijednosti mogu biti poveiane i do 2.000 puta; granidna je vrijednost < 5 mg/L. U odsutnosti induktoralL-6 sinteza se smanjuje na fizioloiku vrijednost za. 2-4 sata. CRP djeluje u neadaptacijskom obrambenom mehanizmu, opsonizirajuii i invadirajuii mikse

u jetri (u normalnim fiziololkim uvjetima

l-10

roorganizme zafagocitozu. Ima svojstvo vezanjasirokog raspona endogenih i egzogenih liganda, dime se olakiava njihovo uklanjanje iz tkiva i krvi. U prisutnosd kalcijevih iona CRP moZe vezati ne samo polisaharide prisurne u veiini bakterija, gljivica i nekih parazita nego i produkte ne-

krotidnih i istro5enih stanica, kao i membranskih fragmenata (vezanjem npr. na fosforilkolin,lecitin, DNA), a u odsutnosri kalcijevih iona vete polikatione (npr. histone). Kada se poveZe s jednim od liganda, CRP je sposoban aktivirati brojne bioloSke sustave, tiji je rezultat uklanjanje liganda procesima aktivacije komplementa, fagocitoze, maftrofagima slezene koji diste CRP presvuden ligandom, vezanjem CRP-a na specifidne limfocite T i B i poveianjem aktivnosti NK-stanica. U organizmu se razgraduje topljivim proteazama na mjestu upale. Biololki je poluvijek 19

biti i kraii nakon vezanja s ligandom. Ateroskleroza, proces koji je temelj veiine koronarnih srdanih bolesti, podinje rano u iivotu i sporo i tiho progredira desetcima godina. Klinidki se odituje u obliku infarkta miokarda, motdanog udara, angine ili iznenadnom smriu, najdeiie izmedu 50. i 60. godine Livorau mu5karaca i izmedu 60. i70. godine Livota u Zena. Probiranje na temelju koncentracije kolesterola pomaie u identifikaciji osoba ko;'e imaju poveiani rizlk razvoja buduiih koronarnih komplikacija. No, iako je ovaj pristup koristan, oko L/2 :.alr.rih osoba ne otkriva se jer su koncentracije kolesterola samo umjereno poveiane ili unutar preporudenih vrijednosti. Klinidka i laboratorijska ispitivanja pokazuju da ateroTablica 17-3. Koncentracije CRP-a u procjeni relativnog skleroza nije jednostavno bolest lipidnih depozita, nego da rizika za AIM i moZdani udar (Physicians Health u aterosklerotidkome procesu, toinije, inicijaciji, progresiji i destabilizaciji ateroma ili fibroznog depa, znaiajnu ulogu < 0,55 mg/L t,0 {niski} ima i upala. Dokazuje to izraircna prisutnost mononuklera"1,"15-2,10 mg/L 2,5 (srednji) nih stanica, makrofaga i limfocita T u aterosklerotidnom

sari, ali moZe

>2,'l mg/L 2,9 (visoki) plaku arterijske stijenke, posebno u fibroznome iepu, poveiane koncentracije citokina, koji uzrokuju de nouo sintezu proteina reaktanata akutne faze patako i CRP-a, u bolesnika s akutnim koronarnim sindromom, premda ne postoji nekroza miokarda. Nekoliko je velikih istraiivanja upozorilo na povezanost izmedu koncentracije CRP-a i rizika za razvoj AIM-a i moZdanog udara (tabl. 17-3.). CDC (Centers for Disease Control and Preuention) i AHA (Arnerican Heartb Association) preporuiuju sljedeie vrijednosti CRP-a za procjenu rizika kardiovaskularne bolesti.

< 1,0mgll

nizak

'1,0-3,Orag/L

srednji

'>3,0mgr/l-

visok

Metode odredivanja CRP-a jesu lateks-imunonefelometrija, imunoturbidimetrija i RID.

17.3.3.

Homocistein

Poveiana koncenrracija homocisteina povezuje se s patogenezom ateroskleroze joi od godine 1969., a mnogim prospektivnim i retrospektivnim ispitivanjima dokazano je da je homocistein

422

Poglaufe 17

neovisan rizidni dimbenik za nastanak ateroskleroze.

proteini(hrana)

Pi

+

Homocistein je aminokiselina koja nastaje u merabolitkom putu esencijalne aminokiseline metionina (sl. l7-8.), istodobno i

PPi

metioninadenoziltran sferaza

/-,)"

|

5-adenozilmetionin

-sintaza (81'?)

| 5,10metilen-THF

CH, (fosfolipidi, proteini,

l P f

dimetilglicin

o-

betain-homocistein

=6

metiltransferaza

sU o

mijelin, katekolamini, kreatin, karnitin,

metil-transferaza

betain

+-

polisaharidi, DNA, RNA)

Eo

7 cistationi n-B-sintaza

-/r-"oenozi

put 7-cistationaza

tionin, u ljudskom

organizmu

ja nastaje S-adenozilhomocistein

koji brzo uz djelovanje S-adeno-

senn

Tra nssu lfu

NH4

ovisna u magnezijevim i kalijevim ionima nastaje S-adenozilme-

tilacije. Demedlacijom ovoga spo-

homocistei n hidrotaza I

(86)

a-ketobutirat +

dj elovanj em L-metionin-S - adeno ziltransferaze. U reakciji koja je

najznatajniji donor metilne skupine potrebne za niz reakcija me-

/t

kolin

E

jedinog izvora homocisteina u organizmu. Metionin se aktivira

(Bu)

racijski

zilhomocistein-hid rolaze p r elazi u adenozin i homocistein. Nastali homocistein moZe se djelovanjem odgovarajuiih enzima dalje remetilacijom merabolizirati natrag u metionin

ili transsulfuraci-

jom, preko dviju enzimski katalisulfati + CO,

ziranih reakcija, u a-ketoglutarat

i

cistein. Kojim ie se putem homocistein metabolizirati, ovisi o Slika 17'8. Nastajanje i metabolizam homocisteina.TF - tetrahidrofolaq MTHFR - metitrenutainoj raspoloiivosti metiolen tetrahidrofolat reduktaza. nina. U sludaju potreba za metioninom metabolizira se u metionin uz N5-N1O-metilentetrahidrofolat-reduktazu (MTHFR). Znatajno je da je polimo rfizam ovog enzima povezan s hiperhomocistinemijom, odnosno patogenezom ateroskleroze. Ako je dovoljno metionina, a postoje potrebe za cisteinom, homocistein se metabolizira u cistationin. U metabolizmu homocisteina sudjeluju i neki vitamini kao koenzimi ili prostetidke skupine. Primjerice, vitamin Bu potreban je za aktivnost cistationin-B-sintaze i 7-cistatio naze,vitamin B' za djelovanje metionin-sintaze, vitamin Brzadjelovanje MTHFR-a, vitamin Buzareakcije rranssulfuracije te vitamini B, i Bl2, kao i folat za uspjeSnu remetilaciju homocisteina u merionin. U plazmi se nalazi u reduciranom sulfhidrilnom (1%o) i oksidiranom obliku (98-99o/o) kao homocistein-disulfid i mijeSani disulfid. Od 80 do 90% homocisteina vezanoje na albumin, a 5-l0o/o na cistein. Svi oblici homocisteina, osim onog vezanog na protein, normalno se filtriraju, reapsorbiraja i razgraduju u bubrezima pa se homocistein mokraiom ne izluduje znatajno. No, smanjeni stupanj pretvorbe u cistationin (uz cistationin-B-sintazu) ili vraianje u metionin (uz MTHFR) moZe uzrokovati homocistinuriju. Normalno se ne akumulira u plazmi (cirkulirajuie su vrijednosti u plazmi < 15 pmol/L), jer je nestabilan, a kada je u viSku, podlijeZe oksidaciji u homocistin. Poieljne su vrijednosti homocisteina < l0 pmol/L, a dokazano je da poveianje za svakih 5 pmol/L poveiava rizikzanastanak glutation

Funkcija

koronarne bolesti za 1,3 puta. Granidno poveianim vrijednostima tako se smatraju one od l0 do 15 pmol/L, a teSkom hiperhomocistinemijom smatraju se vrijednosti >100 pmol/L. Na vrijednosri homocisteina u plazmi utjedu nasljedni dimbenici (npr. manjak cistation-Bsinraze, manjak ili nestabilnost MTHFR-a, manjak metionin-sintaze), Zivotna dob i spol (mu5ki spol i postmenopauza), prehrana s nedostatnim kolidinama folata, vitamina 86 i Bl2, bolesti bubrega i zloiudne bolesti, poremeiaji vezivnoga tkiva, hipotireoidizam te lijekovi kao 3to su npr. kolestiramin, kolestipol, metformin, metotreksat, antikonvulzivi, L-dopa, ciklosporin i androgeni koji poveiavaju, te penicilamin, N-acetilcistein i betain koji smanjuju vrijednosti homocisteina. Ako je rijei o nasljednom metabolidkom poremeiaju, koncentracije homocisteina u krvi mogu biti > 100 pmol/L, a oboleli imaju kardiovaskularne poremeiaje vei u mladoj iivotnoj dobi.

Brojna epidemiolo5ka ispitivanja dokazala su da je umjerena hiperhomocistinemija (vrijednosti >15 pmol/L) prisutnau20-30% bolesnika s kardiovaskularnim bolestima. Smatra se da homocistein kao rizidni dimbenik ateroskleroze djeluje izravno navaskularni endotel mehanizmima koji ukljuiuju oksidativna oSteienja, primarno mijenjajuii vazodilatacijska svojstva endotelnih stanica zbog poremeiena stvaranja duSikova oksida (NO.). Za razliku od hiperlipidemije, populacijsko se probiranje na hiperhomocistinemiju za sada ne preporuduje, ali se smatra da bi odredivanje bilo korisno u osoba s neobja5njenom preuranjenom kardiovaskularnom boleSiu. Promjena koncentracije homocisteina pokazarcljje i stedenoga manjka folata, vitamina B,, i 86, a poveiane se koncentracije povezuju i s poremeiajima neuralne cijevi i preeklampsijom. Metode odredivanja homociteina. Metode za odredivanje homocisteina ukljuduju redukcijski stupanj kojim se cijepaju disulfidne veze. Mjeri se ukupni homocistein, 5to, medutim, ne ukljuduje homocistein inkorporiran u proteine putem disulfidnihveza. Tehnike za mjerenje ukljuduju GC-MS, HPLC (s elektrokemijskom ili fuorescentnom detekcijom) ili imunokemijske metode (s enzimskom detekcijom ili detekcijom s fuorescentnom polarizacijom). Imunokemijske metode rabe S-adenozilhomocistein (SAH) hidrolazu u katalizi stvaranja SAH-a iz homocisteina. U FPIA se rabe monoklonska antitijela na SAH i fluorescentni analog SAH-a. Bolesnik treba biti nata3te jer obrok bogat proteinima poveiava vrijednost ukupnog homocisteina l5-20o/o. Zbogoslobadanja homocisteina iz krvnih stanica koje ovisi o temperaturi i vremenu stajanja, uzorak je potrebno odmah staviti na led i u roku od 30 minuta odvojiti plazmu od stanica. Vrijednosti ukupnog homocisteina na sobnoj temperaturi poveiavaju se, naime, 515% po satu. Referentni interval ovisi o metodi odredivanja. Osim specifidnih biljega koji su opisani, nizom osnovnih laboratorijskih pretraga prati se funkcija srca opienito, mjereii udinke rada srca na druge organe, primarno pluia, jetru i bubreg. Tako primjerice, buduii da se respiracijska acidoza s poveianimpCOrdesto nalaziu bolesnika sa srdanim bolestima, arterijski krvni plinovi odreduju acido-bazni status bolesnika i status kisika. U bolesnika s edemom nastat ie promjene u koncentraciji elektrolita i osmolalne promjene kao renthtat zadri,avanja tekuiine i redistribucije iona. Stoga poveiano izluiivanje kalija i smanjeno izludivanje natrija mokraiom moie biti rani pokazatelj ove neravnoteie. Smanjeni minutni volumen srca rezultira bubreZnom retencijom natrija, Sto opet uzrokuje poveianu retenciju tekuiine. Zbogtoga koncentracija natrija u serumu moie ostati unutar referentnog intervala ili biti blago smanjena. Odredivanje koncentracije elektrolita u serumu (natrij, kalij, kloridi, kalcij) vaLno je za pratenje diuretidke terapije i opienito terapije koja se primjenjuje u srdanih bolesnika. Rutinsko odredivanje broja eritrocita vaino je radi otkrivanja anemije pri infekcijama; hemoIiza moi,e upozoriti na potrebu dodatnog ispitivanja na hemoglobinuriju i mioglobinuriju, pokazatelje kardiovaskularnih oiteienja i bolest miokarda; poveianje broja leukocita moZe upozoriti na perikardiris, endokarditis ili infekcije zalistaka. Infekciju povezanu s perikarditisom, endokar-

srca 423

424

Poglaulje 17

kulturom; ako se disfunkcija bubrega ditisom i problemima zalistaka treba identificirari krvnom zbog smanjenoga swaranja eritropojavljuje kao rezultat srtane bolesti, moie se razviti anemija

Poietina'

..

i 1

.r

r

Y-:^

- --: -^-povedane aktivnosti AST-a, ALT-a i ALP-a teste su u bolesnika s kroniinim zetajlanjem referengranice poveiana od gornje desnog ventrikula, a aktivnosr GGT -a mote biti dvostuko na kongestiju i oSteienje jetre. Procjet.rog iit.rvara u kongestivnom zatajivanju srca, Ito upuiuje

koronarnu arterijsku bolest. Bolesninom koncentracije lipidnih ,"rro;al" procjenjuj. ,._ri"ik za gbr--kolesrerola, LDl-kolesterola i uiglicerida iscima se preporuduje odrzavanje vrijednorti o zatajivanje srca zbog disfunkcije pod preporudenih vrijednosri. Bolesnici koji imaju sekundarn su prerrage takoder dragocjene za Idtnjaie otkrivaju r. ,.rrorn sdmulacije TSH.a. Laboratorijske praienje terapije nakon dijagnoze sriane bolesti'

Literatura l.

infarcdon redefined - A consensus document of TheJoiAlpertJS, Thygesen K, Anrman E, BassandJP. Myocardial commitee for the redefinition of myocardial cardiology of nt European society of cardiolo gy/A,meriian college

infarction'J Am coll cardiol 2000;36959-69' 2. Antman EM, Grudzien C, Sacks DB. Evaluation of a rapid bedside T.

JAMA

199 5 ; 27

3

:r27

9

assay

for detection of serum cardiac troponin

-82'

Ashwood ER, ur. Tietz Fundamentals of clinical chemiscry 3. Apple FS.Jaffe AS. cardiac function. u: Burtis cA, saunders' 2006:1619-700' and Molecular Diagnos is.4. izd,.St. Louis: Elsevier Chem specifications for B-type natriuretic peptide assays' clin FS, panteghini M, Ravkilde J, i sur.

Qality

4. Apple

2005;512486-93. lyu AHB. Myocardial infarction redefined' Role of cardiac troponin tesdng' Clin Chem 2001 ; 47 :377 5. Apple FS,

-

9.

6.Bolander-GouailleC.FocusonHomocysteine.Springer200l. relevance of the measurement of cardiac natriuretic pep7. Clerico A, Emdin M. Diagnosti. "c.rr.".y ".rd p.ogrrortic tides: A Review' clin chem 2004;50,33-50' smjernic e'zagreb: Medicinska naklada' 2004:49s. e.p;r"L r, Str"r* B, Dodig S, Labar B. Medicinsko-biokemijske 67.

9. Gamulin

S,

popovii Z.poremeiaji rada srca. \J: Gamulin S, Maru5ii M, Krvavica S, i sur', ur' Patofiziologria'Za'

greb: Medicinska naklada, 1995t57 0' Chim Acta 1995; 246:2L-38' 10. i{egele RA. The pathogenesis of atherosclerosis. Clin patofiziologija susrava. U: Kujundiii M, i sur' Klinidka patofiziolokardiovaskularnog l l. Kujund Li(M,Bergovac M. fakultet, 200 3 : 1 1 3 - 8 8. gtja. Zagr eb, F".-a..utsko.b iokemij ski N EnglJ Med 1998; 339,321-8' 12. Levin ER, Gardner DG, Samson'w'K' Natriuretic pepddes' Atherosclerosis 2003; 169:203-14' and 13. Lind L. Circ,rlari.,g markers of infammation "ih.ror.l..osis. IFCC guidelines for the use of cardiac markers and NACB of Validation i sur. G, Heller 14. Mockel M, Gerhardt'W, acute coronary syndromes' Clin Chim Acta 2001; 303:167 for early diagnosis and risk assessmenr in patients with

-

79.

in

of immunoassay for measurement of myoglobin 15. panteghini M, Linsinger T, \7u AHB, i sur. Srandardisation reference materials. Clin Chim Acta2004:341.65-72' serum. phase I. Evaluation of candidate secondary L, ur. clinical Laboratory Diagnostics. Use and Assessment of 16. puschendorf B, MairJ. cardiac diseases. U: Thomas TH-BooksVerlagsgesellschaft mbH' 1998:101-19' Frankfurt/Main: Clinical Laboratory i..rolrr. l. izd. for cardiovar.rl* dir."r. detection and prevention' circulaprotein pM. c-reactive of applicadon clinical 17. Ridker tion 2003; I07:363-9. a new biochemical marker of myocardial lg. Singa MK, Roy D, Gaze DC. Role of >rischemia modified albumin.-L)) mmol/L. Slobodni HCl, kisele soli, mukoproteini i organske kiseline ako su prisutni, svi zajedno dine

ukupni aciditet Zeludanog soka. Ukupna kiselost Zeludanog soka iznosi oko 10-50 mmol/L nata5te. Razlika izmedu ukupnog aciditeta i slobodnog HCI-a oznaduje se kao yezanakiselina i iznosi nataite oko 10-20 mmol/L. T" j. kiselina vezana uglavnom za proteine, ali i druge spojeve u Zeludanom soku. Odredivanje vezanog HCI-a nema posebno dijagnostidko znadenje. U Zeludanom soku nema organskih kiselina, ali, ako hrana stoji u Zeludcu viSe od 6 sati uz manjak HCI-a, onda se pri neutralnoj ili slabo alkalnoj reakciji djelovanjem bakterija stvaraju mlijedna i masladna kiselina. To se nalazi obidno kod karcinoma Zeludca ili stenoze pilorusa. Zeluiani sok nata5te sadrZava malo sluzi, viSe sluzi nalazise kod gastritisa, karcinoma Zeludca ili nadraZajateluiane sluznice sondom. Sluz se sastoji od mukopolisaharida i mukoproteina koji sadrtavaju sijalinsku kiselinu, kondroitin-sulfat i fukozu. Sluzni selret ima pH oko 7,4-8,2, a luii se iz povrSinskih epitelnih stanica i glavnih stanica vrata Llijezda. U ieludanom soku nata$te nema mnogo ostataka hrane, ali kod piloridne opstrukcije i smanjene pokretljivosti ieludca hrana zaostaje u Zeludcu, 5to se moZe utvrditi mikroskopskim pregledom. Takoder se nalaze razne stanice Zeludane mukoze i regurgitirani materijal koji sadrZava guSteradni i dvanaesnidni sok te Zud. Promjene koje se mogu naii kod raznih ieludanih bolesti obuhvaiaju promjene volumena, kiselosti i peptidne aktivnosti te eventualnu pojavu krvi ili abnormalno zaostajanje sastojaka hrane u Zeludcu (tabl. 18-1.). Klinitko znatenje pretrage ieluianog soka. Promjene volumena, kiselosti i peptidne aktivnosti Zeludanog soka daju uvid u funkcionalno stanje Zeludca i imaju malu vrijednost u diferencijalnoj dijagnostici Zeludanih bolesti. Stoga je pretraga sadrLaja Zeludanog soka gotovo potpuno zamrjenjena endoskopskim postupcima koji omoguiuju izravan pregled unutrainjosti ieludca. To vrijedi i za odredivanje ludenja HCI-a nakon stimulacije pentagastrinom ili obrokom. Jedino se zadrtalo odredivanjebazalnog ludenja kiseline (BAO, engl. basal acid output) za razlikovanje aklorhidrije ili hipoklorhidrije od Zollinger-Ellisonova sindroma, u bolesnika s poveianim koncentracijima gastrina natadte.

Tablica 18-1. Laboratorijski nalazi u funkcionalnim Zelutanim poremeiajima

ielul{ani ulkus ,

,,

_,..

li

katkad poveian aciditet, ali ieiie normalan ili dak hipoacidan Zeluiani sok zbog kroniinog gastritisa; moguca prisutnost krvi'u ieluianom soku

dvanaesnitni ulkus

hiperaciditet u vise od 70% slutajeva, a rijetko hipoaciditeU volumen ielutanog soka pove(an do dvo-':.: ,, strukih.vrliednosti, a bazalno lutenje rnofu bitii viSe:od @,rTrUlal ' :

atroftfui gartritii

,' smanjen

.:

,:

volqlg*n ieluiangg,s*ka,:l srr$njen*r lutenj* H€Lasqnanjeno lute$e pepsina; koncentracija

gastrina u serumu malo povecana

uglavnom anacidan ili hipoacidan ieluiani sok; desto prisutna mlijetna kiselina, Boas-Opplerovi bacili

karcinom: .ludca

opstr 6 jtoroo

povedan volumen ielutanog soka nata5te i prisutni ostatci hrane; HCluglavnom vezan na mukoproteipiisqtnA.ltti$fna'kis.elina ikva$deve stanice iprotein!;uslujaiu

ne

Zollinger-Ellisonov sindrom : r.: ;

::

:_

:

, , pojaiano,[utenje

ahaci{if

gastrina

HCI-a poveiana nataite

,

13596-6q4qq't#Lr*ro*ut:figulip.luteljeielutanog

,

soka; koncentracija

inakon stimulacije; poveiana ahivnost pepsina

stres

anaciditet i odsutnost pepsina u ieluianom soku (ahilija) ismanjeno luienje ieluianog soka; koncentracija gastrina u serumu povecana ' iutenje iel*taryg

depresivna stanja

smanjen-o,

pqrnKio:na Fnefi{ja '. : ':

'::. ::j ;:'::

i

krv; smanjeno luienje pepsina

',-l

t@no

i+

lufenje teluianag saka

430

Poglaufe 18

18.1.3.

Odredivanje bazalnog lucenja kiseline

Poveian BAO u Zeludanom soku dokazuje da je uzrok poveiane koncentracije gastrina u plazmi Zollinger-Ellisonov sindrom. Test se provodi u bolesnika s duodenalnim ulkusom i poveianom koncentracijom gastrina. Nije prikladan za bolesnike s atrofidnim gastritisom. Prije procjene BAO-a treba iskluditi pernicioznu anemiju, ko;'a takoder uzrokuje hipergastrinemiju, kao i infekciju bakterijom H. pylori. Najmanje 14 danaprije testa treba prestati uzimati inhibitore protonskih crpki, a 3 dana antagoniste Hr-receptora. 18.1.3.1.

Uzimanje Zelucanog soka

Zeluianise sok uzima uvodenjem gastridne sonde u Zeludac i sukcijom soka kroz sondu. Ujuse, nataite, iscrpi Zeludani sadri,aj i nakon toga se skuplja Zeludani sok tijekom 60 minuta. ZabiljeLi se todan volumen skupljenoga Zeludanog soka i u njemu odredi slobodni HCl. Puienje i fizidki napor treba izbjegavati prije uzimanja ieludanog soka.

tro

18.1.3.2.

Odredivanje slobodne klorovoditne kiseline u Zelutanom soku

Slobodna HCI u Zeludanom soku odreduje se titracijom s natrijevim hidroksidom do pH 3,5 s

pomoiu pH-metra.

1. Izmjeri se i prenese odredeni

volumen ieludanog soka (5 do

Ako Zeludani sok sadrZava destice hrane ili sluzi, uzorak

2.

se

l0 mL) u distu tikvicu od 50 mL. centrifugira ili filtrira preko filtar

papira ili gaze. Odredi se pH uzorka ieludanog soka pH-metrom. Ako je pH veii od 3,5, nije prisutan slobod-

ni HCl. Takav uzorak ne treba titrirati.

3. U suprotnome,

uzorak ieludanog soka titrira se s 0,10 mol/L NaOH-a do pH 3,5 uporabom

pH-metra.

Raiun slobodan

HCI (mmol/L) = mL NaOH x 100/mL titriranoga ieludanog soka.

Ako je titrirano 5 mL Zeludanog soka, izratun je sljedeii: slobodan slobodna

HCI (mmol/L) = mL NaOH x

HCI (mmol/h) = mL NaOH x 20 x 60-minutni volumen

20 Zeludanog soka u

mll1.000.

Interpretacija i napomene Ako je pH ieludanog soka > 2,5 nije vjerojatno da je uzrok poveiane koncentracije gastrina Z ollinger-Elliso

n

ov sindrom.

Gornja granica bazalnog luienja slobodnog HCI-a za mu$karce iznosi 10,5 mmol/h,

a

zai,e-

ne 5,6 mmol/h.

U Zollinger-Ellisonovu sindromu nalaze se vrijednosti slobodnoga HCI-a od 15 do 100 mmol/h. Vrijednost slobodnog HCI-a > 25 mmol/h s velikom koncentracijom gastrina dovoljna j

e za dij agnozu Z ollinge r- Ell

i

s

on

ova s in d ro m a.

Odredivanje klorida u Zeludanom soku moZe dopuniti odredivanje aciditeta i pokazati nedoli slobodnog HCI-a zato Sto se ne izluduje ili zbog toga Sto je neutraliziran slinom i alkalnim neparijetalnim sekretima i regurgitiranim sadriajem iz dvanaesnika. Odredivanje klorida provodi se istim metodama kao u serumu ili mokraii. Koncenrracijaklorida u bazalnom sekretu iznosi u zdravih osoba oko 50-155 mmol/L. staje

Funkcijagastrointestinalnogtrakta 431 18.1.4.

Helycobacter pylori

Dokazivanje prisutnosti H. pltlori, destog uzrodnika Zeluianog i dvanaesnidnog ulkusa, odnosno kronidne upale Zeludca, sastavni je dio endoskopske pretrage gornjeg dijela probavnog sustava. To je invazivan postupak kojim se otkriva infekcija u bioptidkom uzorku primjenom histolo-

metode sa specifidnim antitijelima, obileZenima fuoresceinom ili testom ureje koji se provodi u medrju koji sadrtava ureju i fenolftalein. Ureaza koju stvara H. pylori hidrolizira ureju u amonijak i ugljikovodik, Sto uzrokuje promjenu pH medija, odnosno promjenu boje indikatora.

5ke

Postoje i neinvazivni postupci, l3C ureja izdisajni test i imunokemijsko odredivanje IgG-specifi-

dnih antitijela protiv H. pltlori u serumu. Specifidnost je imunokemijske pretrage 89-93o/o. Pogodna je zaprobiranje asimptomatskih osoba, osobito tlanova obitelji oboljele osobe, ali nile pogodna za potvrdu uspjeha provedene terapije, jer se titar antitijela u serumu smanji viSe od 50%o tek 6 mjeseci nakon terapije. Osim u serumu, specifidna IgG antitijela protiv H. pylori mogu se odre-

divati u slini

ili u punoj krvi.

Postoji

i

moguinost dokazivanja specifidnog antigena u stolici.

Najpouzdanijim testom za dokazivanje uspjeinosti terapije smatra se 13C ureja izdisajni test.

18.2.

crijevo

Crijevo je cjevasti zavojiti organ, koji se nadovezuje na pilorus Zeludca i zavrdava analnim otvorom. Sastoji se od dvaju dijelova, tankog i debelog crijeva, koji se razlikuju morfoloSki i po funkciji. Thnko se crijevo sastoji od dvanaesnika, jejunuma i ileuma. Dvanaesnik dug je oko 20 cm, a jejunum i ileum zajedno oko 3-5 m. Debelo je crijevo dugo oko 1,3 m, a smjeSteno l. poput okvira oko zavojitoga tankog crijeva. Sastoji se od cekuma, na kojemu je crvuljak (slijepo crijevo, apendix), kolona (uzlazni, poprjedni, silazni i sigmoidalni kolon) i rektuma (sl. 18-2.). Crijevne stijenke gradene su od triju slojeva.Izvanase nalazi glatka peritonealna ovojnica (tunica serosa),koja je rahlim vezivom povezana s miSiinim tkivom, a prema crijevnom lumenu nalazi se sloj sluznice (crijevna mukoza). I crijevna je sluznica gradena od triju slojeva. Na njenoj povriini prema lumenu slojje epitelnih stanica, ispod kojeg se nalazi vezivo, te sloj glatkih mi5iinih vlaka-

na (larnina rnuscularis rnucosae).U vezivnome sloju sluznice (larnina propia mucosae) nalaze

se

limfni dvorovi i Llijezde koje izluduju crijevni sok. Sluznica tankoga crijeva posuta je s oko 5 milijuna crijevnih resica (uilli intestinales), u kojima zavriavaju limfni vodovi i putem kojih se hranjivi sastojci apsorbiraju u tankome crijevu. Time se povrSina apsorpcije jako poveiava. Izmedu tih resica nalaze se Lljezdani otvori. Crijevni sok koji se ludi kada je crijevo prazno sadriava vodu, sluz, soli s dosta bikarbonata i deskvamirane stanice, a pH mu je 7-8. Kada sadri,aj iz L,eludca dospije u crijevo, u crijevnom se soku ludi i viSe enzima. Kolidina crijevnog soka i enzima u njemu postupno se smanjuje od pilorusa prema daljim dijelovima crijeva. Sok 3to ga ludi debelo crijevo guSii je i sluzaviji s alkalnijim pH oko 8,4. Na dan se izludi ukupno oko 3 L crijevnog soka. Stanice crijevne mukoze lude hormone sekretin, kolecistokinin, vazoaktivni intestinalni polipeptid, Zeludani inhibitorni polipeptid i dr. Sekretin je linearni polipeptid strukture slidne glukagonu, vazoaktivnom intestinalnom peptidu, gastridnom inhibitornom peptidu, peptidu histidin-izoleucin i hormonu koji otpuita hormon rasta. Lude ga mukozne granularne S-stanice dvanaesnika i gornjeg dijela jejunuma. Njegovo ludenje stimuliraju HCI ieludanog soka, masne kiseline i aminokiseline. Sekretin je sastavljen od27 aminokiselina. Osnovno fizioloiko djelovanje sekretina jest stimulacija ludenja bikarbonata i enzima iz gulterade, pepsinogena u Zeludani sok i Zudi iz Luinoga mjehura. Sekretin takoder inhibira ludenje gastrina (osim u Zollinger-Ellisonovu sindromu) pa tako, i ludenje HCI-a.

432

Poglauf e 18

ieona duplja klinasta kost nosna 5upljina usna 5upljina

jezik

Zdrijelni otvor sluine cijevi meko nepce Zdrijelo

jednjak grkljan

Zuinimjehur

jetra guSteraia i projekcija njezine odvodne cijevi

Zuina izvodna cijev

duodenojejunalni pregib

dvanaesnik

lijevipregib debelog crijeva

desnipregib

poprjeino

debelog crijeva

debelo crijevo

taito tanko crijevo

uzlazno

debelo crijevo vito tanko crijevo silazno debelo crijevo slijepo crijevo

crvuljak

zadnje crijevo

Slika 18-2. Shematski prikaz probavnih organa.

masniprivjesak

zavrino debelo crijevo

Fankcijagastrointestinalnognakta 433 Kolecistokinin (CCK) takoder je linearni polipeptid koji postoji u nekoliko molekularnih oblika. Prvi je izoliran peptid sastavljen od 33 aminokiseline, CCK-33. Ostali su oblici CCK-8, CCK-39 i CCK-58. Pet C-terminalnih aminokiselina isto je kao i u gastrinu u svim oblicima i potrebno je, zajedno sa sulfatiranim tirozilnim ostatkom, za fizioIo5ku aktivnost. CCK regulira kontrakciju Zudnoga mjehura i poveiava pokretljivost tankoga crijeva. Stvara se u mukozi dvanaesnika i gornjeg dijela jejunuma. Njegovo lutenje stimuliraju polipeptidi, metionin, valin, fenilalanin, masne kiseline i HCI kada dospiju u dvanaesnik. Peptid stimulira donekle i lutenje HCIa i pepsinogena u Zeludcu, pokretljivost Zeludca i gu5teradno ludenje bikarbonata. Poluvijek CCK-a manji je od 3 minute. CCK se odreduje radioimunokemijskom metodom, a koncentracija u plazmi zdrave osobe iznosi do 500 ng/L. Vazoaktivni intestinalni polipeptid (VIP) linearni je polipeptid sastavljen od 28 aminokiseIina i strukturno slidan sekretinu, gastridnom inhibitornom peptidu i glukagonu. Naden je u crijevu i Zivdanome tkivu, ali ga ima i drugdje u tijelu. Nasuprot sekretinu i drugim gastrointestinalnim hormonima, VIP nije naden u mukoznim endokrinim stanicama gastrointestinalnoga rrakta. Smatra se da je VIP neurotransmitor ograniden na periferno i srediSnje Zivdano tkivo. Iako se nalazi dui crijeva od dvanaesnika do kolona, vi5e ga je u jejunumu, ileumu i kolonu. Biolo5ka je aktivnost togpolipeptida raznolika. Osim toga 5to djeluje kao neurotransmitor, VIP stimu-

lira ludenje vode i elektrolita iz gu5terade i crijeva te otpuStanje hormonaiz crijeva, guSterade i hipotalamusa. Nadalje, stimulira lipolizu i glikogenolizu i tijek Luii, a inhibira gastrin i ludenje ielutane kiseline. Odredivanje koncentracije VIP-a u plazmi korisno je za otkrivanje tumora koji

i

uiinka terapije takvih tumora. Odreduje se radioimunokemijskom metodom koja nije dovoljno todna zavrijednosti u referentnom intervalu, a one za odrasle osobe iznose do 50 ng/L. U tumorima koji luie VIP nalaze se koncentracije od 600 do 9.000 ng/L. Gastriini inhibitorni polipeptid (GIP) takoder je linearni polipeptid sastavljen od 43 aminokiseline diji je N-terminalni kraj sliian glukagonu i sekretinu, dok C-terminalni slijed od 17 aminokiselina nije zajednidki ni s jednim poznatim crijevnim hormonom. Stvara se i ludi iz K-stanica sluznice dvanaesnika i jejunuma. Djeluje na lutenje inzulina pa se naziva i inzulinotropnim peptidom ovisnim o glukozi (GIP). BioloSka je uloga GIP-a stimulacija ludenja inzulina u

lude VIP, kao

metastaza, te za procjenu

prisutnosti hiperglikemije, smanjenje pokretljivosti crijeva sa stimulacijom ludenja crijevnog soka i elektrolita te u koncentracijama veiim od fizioloSkih inhibicija ludenja HCI-a, pepsina i gastrina. Smatra se da je inzulinotropno djelovanje najvatnija bioloika uloga GIP-a. U plazmi zdravih osoba nalazi se do 100 nmol/L. Koncentracija GIP-a poveiana je nakon oralnog davanja glukoze i triglicerida te intraduodenalnih infuzija otopina koje sadriavaju smjesu aminokiselina, ali ne i ako su dani intravenski. Odreduje se radioimunokemijskom metodom. U crijevu se nalazi jo$ nekoliko hormona/peptida koji djeluju u gastrointestinalnom traktu, izravno ili putem drugih hormona. Tako npr. motilin poveiava praLnjenje ieludca i pokretljivost mnkoga crijeva, bombezin stimulira otpu$tanje CCK i gastrina, lromogranin A je sekretorni protein, lepdn kontrolira t€k, somatostatin inhibira ludenje i djelovanje mnogih hormona itd. U tankome crijevu nalaze se i faktori rasta koji imaju vaLnu ulogu u kontroli stanidnih funkcija. Kada hrana kroz pilorus dospije iz i.eludca u dvanaesnik, crijevo ritmidnim peristaltitkim gibanjem tjera sadri,aj dalje, i tako se obavlja protok crijevnog sadrtaja kroz crijevo. Tijekom rog puta djeluju Zud, enzimi iz guiteratnog soka i enzimi koji se izluduju u crijevni sok (enterokinaza koja aktivira tripsin, alkalna fosfataza, disaharidazekaolaktaza, saharaza i maltaza). Oni ruzgraduju hranjive sastojke na produkte koji se mogu apsorbirati preko crijevne mukoze, a neprobavljivi sastojci hrane (ttpr. celuloza) prelaze dalje u debelo crijevo koje ih izbacuje iz tijela. Apsorpcija se obavlja u tankome crijevu, a samo se voda, alkohol i ne5to soli mogu apsorbirati i u debelome crijevu. Buduii da se apsorpcija obavlja preko crijevne sluznice, to i funkcija crijeva u cjelini

434

Poglaulje

I8 ovisi o stanju te sluznice, pa kod raznih bolesti crijevne mukoze dolazi do porem etajaapsorpcije. Za apsorpciju je vaino da je apsorptivna povrSina tankoga crijeva vrlo velika, demu pridonose

sluznidni nabori i prisutnost resica na enterocitima. U crijevo se, medutim, neke tvari i izluiuju, i to uglavnom u debelo crijevo. Tako se izluduju kalcij, magnezij i neki te$ki metali.

ls.2.L lspitivanje poreme caja apsorpcije ugljikohitrata Poremeiaj apsorpcije ugljikohidrata rezultat je opieg poremeiaja apsorpcije ili izoliranog manjka pojedinih enzima. Test apsorpcije ksiloze omoguiuje procjenu apsorpcijske povriine tankoga crijeva. Odrasla osoba popije natadte 25 gD-(+)-ksiloze u 500 mL vode. Mokraia se skuplja tijekom 5 sati, a krv 2 sata.Jedan i dva sata nakon optereienja ponoyno se popije 250 mL vode. Za

se uzme nakon

ispitivanje u mokraii dy'eci se daje l5 g ksiloze po m2 povrSine tijela u 300 mL vode, te poslije jo$ po dva puta 150 mL vode, a za ispitivanje u krvi 5 g ksiloze u 100 mL vode. Mokraia se takoder skuplja tijekom 5 sati, a krv se uzme nakon I sata. Ksiloza je pentoza koja se aktivnim transportom apsorbira u dvanaesniku i jejunumu i najveiim dijelom nepromijenjena izludi u mokraiu. Oko 60% uzeteksiloze se apsorbira i nakon 2 satau odraslih osoba dosegne maksimalnu koncentraciju u plazmi od 2 mmol/L, au djece nakon 1 sata 1,33 mmol/L. Tijekom 5 sati odrasle osobe izlude 22-33o/o, a djeca 15-37o/o od ukupno uzete ksiloze. Ne5to ksiloze vjerojatno se reapsorbira u bubreZnim tubulima, a preostalih 40o/o metabolizira se do ugljikova diokslda i u pentoza-fosfatnom ciklusu. Smanjena koncentracija u plazmi i smanjeno izluiivanje u mokraii, odnosno smanjena apsorpcija ksiloze nalazi se u celijal>negativoo>l/+2f ++rr, ,r3/+++sumnjivu>izoenzim 10 pg/L

> 50%

20-25%

1694

> 25%

Ba/s

vat ni.Veiina imunolo5kih testova mje-

state nego i u bolesnika s dobroiudnom hipertrofijom prostate

ili prostatitisom. Brojna

su ispiti-

vanja pokazala da je udio fPSA (odnosno omjer koncentracija slobodnog i ukupnog PSA) statis-

tiiki znadajno niZi u bolesnika s karcinomom prostate u odnosu r" bol.rnike s dobroiud.nom hipertrofijom Prostate. Danas se PSA smarra glavnim tumorskim biljegom za pra(enje uspjeinosti terapije karcinoma Prostate (odreduje se ukupan PSA i cPSA), pri ranom otkrivanju recidiva

(PSA, cPSA), u prognozi bolesti (PSA, cPSA i %fPSA o, digitor.ktalni pregled i odredivanje Gleasonova stupnja diferencijacije karcinoma nakon biopsije), a vrlo ;e koiisran i u probiranju, tj. ranom otkrivanju karcinoma prostate u muikaraca starijih od 50 godina (PSA, cPSA i %6PSA uz digitorektalni pregled). Hormoni. Pojedini su hormoni poznati i kao tumorski biljezi. U hormone kao tumorske biljege ubrajaju se ACTH, ADH, bombezin, kalcitonin, gastrin, hormon rasra, HCG, humani placentni laktogen, neurofizin, PTH, prolaktin i vazoaktivni intestinalni polipeptid (VIp). U osoba s tumorima, hormoni se mogu stvarati na dva razliiitanadina: .nJoLtirro tkivo, koje i inade normalno stvara hormone, moZe podeti stvarati prekomjerne kolidine hormona; osim toga, tkiva koja nisu endokrina i normalno ne stvaraju hormone, mogu u ovim uvjetima podeti stvarati hormone na nekom udaljenom mjestu, 5to se nazivaektopidnim sindromom. Poveiana koncentracija nekog hormona ne upuiuje na prisutnosr nekog specifidnog rumora, jer taj hormon mogu stvarati tazliiite vrste tumora. Primjerice, ACTH normalno srvara hipofiza, ali ga mogu ektopidno swarati SCLC te karcinomi gu5terade, adrenalnog korteksa i gasirointestinalnog trakta, pa se u tim sludajevim e nalazi u poveianim koncentracijama u serumu. Inzulin je pak poveian kod inzulinoma, dok su katekolamini biljezi feokromocitoma i neuroblastoma. Poveiana koncentraciia eritropoetina nalazi se kod hepatocelularnog karcinoma, feokromocitoma i tumora bubrega, a PTH kod tumora paratireoideje. Promjene pojedinih hormona kod zloiudnih tumora opisane su u 14. poglavlju. Humani korionski gonadotropin glikoproteinski je hormon molekularne mase oko 40 kDa koji se sastoji od dviju nekovalentno povezanih podjedinica (o i g).HCG se fiziolodki sintetizira u placentnim sinciciotrofoblastima i koncentracija mu je poveiana u serumu trudnica. HCG je koristan biljeg pri postavljanju dijagnoze i prognoze, otkrivanju recidiva i praienja uspjednosti terapije kod tumora placente (trofoblasddki tumori) i kod nekih vrsta rumora restisa, osobito kod neseminoma.

23.s.i. Ostali

tumorski biljezi.

Estrogenski receptori (ER) i progesteronski receptori (PR) rabe se kao prognostitki pokazatelii kod karcinoma dojke te pri praienju uspjednosti hormonske terapije. Bolesnice s pozitivnim ER-om i PR-om uglavnom odgovaraju na hormonsko lijeienje, dok se u onih s negativnim

528

Poglaulje

2j receptorima treba primijeniti neka druga cerapija, npr. kemoterapija. Bolesnice s pozitivnim receptorima uglavnom Zive dulje.

CYFRA 2l-l odratavarazinu fragmenta citokeratina 19, biljega citoskeleta koji ima molekularnu masu oko 30 kDa. Koncentracija CYFRA 2l-l poveiana je kod razliditih vrsra karcinoma pluia, a osobito je koristan biljeg u diferencijalnoj drjagnozi karcinoma pluia nemalih stanica (NSCLC), i to osobito karcinoma pluia ljuskastih stanica (podtip NSCLC-a), te ostalih histolo5kih tipova karcinoma pluia, prognozi, otkrivanju recidiva i praienju uspjeSnosti lijeienja. Katkad je ovaj bily'eg poveian i u bolesnika s uznapredovalim dobroiudnim jetrenim bolestima i u bolesnika sa zetajenjem bubrega. Pri odredivanju toga biljega treba izbjegavati kontaminaciju uzorka slinom. 5-100 protein je kiseli protein molekularne mase 2l kDa, koji selektivno i s visokim afinitetom veZe kalcij. 5-100 je dimer i sastoji se od dvrju podledinica, d. i p, uz moguie kombinacije aa, ap i pp. S-100-0 j. homodimer koji se sastoji od dviju B-podjedinica. S-100 se nalazi u citoplazmi i nukleoplazmi stanica, a katkad je vezan na stanidnu membranu ili se ludi iz stanice. Ima ulogu u progresiji stanidnoga ciklusa i u diferencijaciji stanica. Preporuduje se odredivanje ovog biljega u bolesnika

s

melanomom,

a

vrijednosti u serumu osobito su poveiane kod uznapredova-

le bolesti.

TA90 je glikoprotein molekularne mase 90 kDa koji lude tumorske stanice. L/ serumu je prisutan u obliku cirkulirajuieg imuno-kompleksa s IgG-om, M90-IC. Preporuduje se odredivanje ovog biljega u bolesnika s melanomom, i to pri postavl;'anju dijagnoze i prognoze, otkrivanju recidiva i praienju uspje5nosti terapije. Inhibirajuda aktivnost melanoma (MIA, engl. rnelanorna inhibitory actiuitl) mali je globularni protein molekularne mase I I kDa stabiliziran dvjema intramolekularnim disulfidnim vezama. Eksprimiran je specifitno u stanicama melanoma (ali ne u melanocitima) i u kondrocitima, iz kojih se ludi u izvanstanidni prostor. Smatra se da ima vainu ulogu u invaziji i metastaziranju melanoma jer sprjeiava interakciju stanica melanoma s izvanstanidnim matriksom, tj. posreduje u odvajanju stanica od komponenti matriksa poput fibronektina i laminina. Preporuduje se odredivanje ovog biljega u bolesnika s melanomom, a osobito metastatskim melanomom, i to pri

prognozi i otkrivanju recidiva.

Kromogranin A (CgA,

engl. cbrornogranin

A) protein

je molekularne mase 49 kDasveprisu-

tan u neuroendokrinim tkivima. Odreduje se u serumu pri posmvljanju dijagnoze i pracenju veiine neuroendokrinih tumora, uklludujuii i one koji nisu povezani s klinidkim endokrinim sindromom. Neka ispitivanja upuiuju i na otpu5tanje oyog sekretornog proteina u serum u bolesnika sa SCLC-om.

Peptid koji otpuSta progastrin (ProGRP, engl. pro-gastrin-releasing peptide) prekursor je pepdda koji otpuita gastrin. Pri odredivanju ovoga biljega moraju se iskljuditi bolesnici sa zatajenjem bubrega jer su u njih prisutne znatno povedane koncentracije PToGRP-a u serumu. Koncentracija PToGRP-a u serumu ovisi o hisroloSkom tipu karcinoma pluia i znatno ie veia u bolesnika SCLC- om.Zarazliku od NSE-a, hemoliza ne utjete na odredivanje PToGRP-a. Preporuduje se odredivanje ovog biljega u bolesnika s karcinomom pluia, i to pri diferencijalnoj dijagnozi, otkrivanju recidiva i praienju uspjeSnosti lijeienja.

sa

NACB (National Acaderny of Clinical Biochernistry) priredila je i objavila Nacrt praktiinih zahtjeve smjernica i preporuka za uporabu tumorskih biljega u klinidkoj praksi koji ukljuiuje kvaloralitete za uporabu tumorskih bitjega (predanalidike, analitiike i poslijeanalititke zahtjeve litete), ,p..ifitn. preporuke za uporrebu rumorskih biljega u 16 zloiudnih bolesti te predlaie

nove tehnologije u dijagnostici tumora (tabl' 23-6')'

Biokemija i dijagnostika zloiudnih

turnora

529

Tablica 23-6. NACB-preporuke za uporabu tumorskih biljega u klinitkoj praksi

Testikularni

''

AFPt't1fi6;,LD':,,;.,: ;:,,.,AFP"HCG".IF

AFP, HCG, LD

AFq HCG, LD

tumori

tuz'

PJA,cPSA %fPSA

prostate

digitorektalni pregled) digltorektatni pregled -.

PSA, cPSA,

96P5* PSA, cPSA ,{*sdigitdi€ktatni ,,'

%ffSA{tJz'' ffiIu'eP5

Karcinom

P5e;cPSA

' .'.,, prsglcdiodiedi-,, ,- -.:., ;,: -', ' i,, vanji€teasonoy,a, . ,:.i, ,:. ,. :',,,'stulp*jadireret$ija- ' 1,,. ,-,', cije tumora nakon

,

biopsije) Kolorektalni

karcinom

ko

"'CEA ',

{EA

okultno krvarenje u stslici (u osoba stariJih od 50 godina), genetiiko testiranje u viso-

'

CEA

riziinih osoba

riziinih.

Karcinom

AFP (u visoko

jetre

'osoba)

Karcinom

CA 125 tsamo u

jajnika

binacijistransvagi-

: i,

kom-

CA 125 (samo:kod na u

ie-

.

..AFP .

AFP

AFP

,i,

',,.rg$,,13$..

eA 125

postmenopauzi)

,'t

: r:"

I

i:,:, .' r,1;

l' r:r

AFP

:

-.1:,l .e6.,.l

25

:

nalnim ultrazvukom za rano otkrivanje na-

sljednih sindroma) Karcinom

ER, PR, HER-2, UPA,

CA 15-3, CEA (prate-

dojke

PAI-I

nje uznapredovale bolesti)

Karcinom

ieludca Karcinom

mjehura CA 19-9 {rabi se isklju- CA 19-9 uz kompjutorsku tornografiju ifi

Karcinom

guiteraie

iivo

t

endoskopski ultrazvuk, ito u prikladnome klini-

,

:''

tkom kontekstu)

,_

_

ublativanje bola uz rlikovne pretrage ili nakon potencijalno uspjeinoga kirur-

;.-"--',

Skog zahvata)

{eventualno ljusI

Karcinom vrata

SCC

maternice

kod karcinorna kastih stanica vrata maternice)

Monoklonske gamapatije

:

SCC

,

(eventualno

kod:kariincma ljus-

SCe

{Eventualno 5{C (eventualno

"koi*karcinorna

kod karcinoma ljuskastih stanica vrata , .ljuskastih stanica' kastih stanica vrata

Elektroforeza proteina {serum imokrafa} primjenjujeseudijagnozi,,probirynj*,ipra€enju terapije.

lmunofikacija (serum.imokraia) primj*njuje s€ u dijagnozi i identi*kaiiji'klofidinois {utvrffvanje fazreda i ' tipa rnonoklonskih proteina). Odrefivanje slobodnih lakih lanaea imunoglo'bulina {serurn i rnokrada} prinrjenjuj€se u'dijagnozi i pra(enju uspjeSnosti terapije kod nesekretornog.rnijeloma, monoklonske gamaFatiie neutvrSenog zna{enja iami}oidoze.

Odredivanje viskoznosti seruma primjenjuje se pri utvrdivanJu sindroma hiperviskoznosti. pr-mikroglobulin je prognostiaki biljeg {prognoza jeloSa ako je$r*mikrogbbulin > 4,0mg/L}.

Melanom

LDH,TA9&|C

Mr&

5100,

TA96.f€

..

Mt&TA90-K ,..

TA90-|C

.,

Tumori parati-

Posebne preponrke za upotrebu ksncentraeiB kalctja i p4rxircoidnog harmonau:obradbi bolesnika

reoidneilijede

ma paratireoidne ilijezde.

s

tumori-

530

Poglaulje 23

Neuroendokrini

tumori

Kod neuroendokrinih tumora koji proizvode serotonin preporuieni biljeg je 5-hidrokiindoloctena kiselina (5-HIAA) koji se odretluje u 24-satnoj m.okra(i, a primjenjuje se u dijagnozi-i u pradenju uspjeinosti terapue

kod neuroendokrinih tumora povezanihs klinitkirn katcinddnim sidro-morr. , : ,, U vecine tumora dispeznoga neuroendokrinog sustava preporutenije biljeg serumski kromogranin A (CgA), koji se primjenjuje u dljagnozi i pracenju uspjeSnosti teraprje kod vedine neuroendokrinih tumora ukljutuJu. fi ione koji nisu povezanis kliniikim endokrinim sindrornom. Kod inzulinoma preporuienibiljeg jest serumskiinzulin kojise odreduje nataite, a primjenjuje se u dijagnozi i praienju uspjeinosti terapije inzulinoma guiterate. Kod gastrinoma preporuteni biljeg jest serumski gastrin koji se odreifuje nataite, a primjenjuje se u dijagnozi i praeenj u u spje5nosti terapije gastri noma g u5teraie. Kod neuroendokrinih crijevnih tumora preporudeni je biljeg serumskivazsaktivni intestinalni potipeptid {Vlp) koji se odreduje nataite, a primjenjuje se u dijagnozi i praienju uspjeSnosti terapije kod turnora koji praizvo,

l -

..

deVlP.

Karcinom

tireoglcbulin,

Stitnjaie

antitijelaprotivti- prctivtireoglobutina

tireoglobulin,ailtitijela

reoglobulina '

Karcinom pluda

Ksd karcinoma malih pluinih stanica {SCLO preporueeni su biljezi NSE i ProGRP, koji ---'- se -- primjenJuju

cijalnoj dijagnozi, praienju uspleinosiiterap'ije iu otkrivanlu

r

, ''.

reciJiur.

u'dif

n-

lt.t.

Kod karcinoma nemalih pludnih stanica (NSCLC) prepcruie*i su biljeziCEA i €yfRA eEA se primjenjuje' u diferenc'rjalnoj d'rjagnozi, pradenlu uspjeinottii"rriUe i u ottrivanju recidiva, dok se CyrRR zi-i ptiri.niru diferenciial i u otkrivaniu recidiva.

Odredivanje tumorskih biljega

23.s.2.

Tumorski

biljezi odreduju imunokemijskim metodama s obiljeZivadima, 5ro podrazumijeYa sve obileiivade (enzimi, fluorescentne tvari, kemiluminiscentne tvari) te metodama molekularne biologije. Nadela imunokemijskih metoda opisana su u 9. poglavlju. Tleba istaknuti da dostupni literaturni podatci upuiuju na nemoguinost standardizacije metoda za odredivanje mmorskih biljega kao i harmonizacije referentnih intervala za ove analite. Medu osralim, glavni su nzlozi razlike u specifidnosti antitijela koja se primjenjuju u posrupku odredivanja pojedinoga tumorskog biljega, lo5a moguinost kalibracije te razliditost oblikovanja samog posrupka za odredivanje rumorskog biljega. Osim toga, referentna metoda za odredivanje rumorskih biljega ne postoji, kao ni potvrdeni referentni materijali zave(idio tumorskih biljega. Prema tome, referentni intervali za tumorske biljege znarno ovise o primijenjenoj metodi.

23.6.

se

Genetiiki biljezi - onkogeni

i

tu mor-su presorski geni Genetiiki biljezi (onkogeni i tumor-supresorski geni) primjenjuju se u dijagnostici tumora, i za utvrdivanj e rizika za razvijanje neke vrste rumora u pojedine osobe. Genetitki biljezi mogli bi upozoriti na progresiju od normalnog do dobroiudnog, od dobroiudnog do primarnoga zloiudnog tumora te od primarnoga zloiudnog tumora do razvojamerasraza. a rabe se

23.6.L

onkogeni

Onkogeni uzrokuju transformaciju normalnih stanica u tumorske stanice tako da mijenjaju normalne signale, dime se gubi kontrola rasta i proliferacije pa se stanice nekontrolirano dileleOnkogeni se oznaduju kraticama od tri slova prema tumoru kod kojeg su prvi put otkrivenl

Biokernija i dijagnostika zloiudnib

Primjerice , ras je naden kod sarkoma Stakora, myb kod mijeloblastoze kokoii, myc kod mijelocitoma ptica itd. Pri tomu se stanidni onkogeni oznaduju s >>c>v ls,oo 2o,oo 2s,oo 3o,oo

35,00

45,00

Slika 24'2. Kromatogram organskih kiselina bolesnika s metilmalonskom acidemijom. 1 - mlijetn a;2 - 2-oH-izomaslaina; 3 - 3-oH-propionska;4 - 3-oH-maslaina; 5 - 2-metil-

3-OH-maslaina;6-3-OH-izovaleruanska;7-metilmalonska;8-3-OH-valerijanska;9

- propinilglicin; 10 - piruvidna; 1 1 - acetoctena !f gliry, .1 I r, .Teli !_ci!t,q! ?!is_ i_?_s"i ry:

sin i anti; 12 - a-keto-3-metilvaleruanska

Zabrantitativnu analizu organskih kiselina najprikladnija je meroda stabilne izotopne dilucijske masene spektrometrie. U analizi se rabe deuterijem obiljeZeni interni standardi organskih kiselina dija se koncentracija mjeri. Prethodno je potrebno napraviti i kalibracijsku krivulju, tako da se na ordinatu nanese omjer povrsina karakteristidnog m/z odredene kiseline i internog srandarda, a na apscisu koncentracija te kiseline. Metode zaanalizu organskih kiselina razlikuju se medu laboratorijima s obzirom na posrupke izolacije, identifikacije i osjetljivosti. Stoga je teSko usporedivari nalaze izmedu laboratorija, a uputno je i pratiti tijek lijedenja bolesnika u istom laboraroriju. Zbognjihove kompleksnosri, za pravilno razumijevanje nalaza organskih kiselina nuina je odgovarajuca interpretacija nalaza u skladu s klinidkom slikom.

24.3.s.

Karnitin i acil-karnitini

Karnitin (:-hidroksi-4-N-trimetil-aminobutiridna kiselin a) ze dovjeka je od vitalne vaZnosti. Njegova najznatajnija uloga jest prijenos masnih kiselina dugog lanca (>I2 C atoma) iz citosola kroz unutarnju mitohondrijsku membranu u unurralnjost mitohondrija (matriks), gdje se ukljuduju u procese B-oksidacije masnih kiselina. BioloSki je aktivan L-enantiomer karnitina. Masne kiseline kemijski su relativno inertni spojevi i stoga se njihova reakcijska sposobnost poveiava prevodenjem u tioestere. Prijenos masnih kiselina kroz vanjsku membranu mitohondrija zapoiinje stvaranjem tioestera dugolandane masne kiseline s CoA, pri demu se tro5i jedna molekula AIP-a. Reakciju kaaliziraacil-CoA sintetaza koja se nalazina vanjskoj strani mitohondrija. Tioester dugolandane masne kiseline i CoA ulazi u mitohondrijski medumembranski pro-

Nasljednirnetaboliikiporerneiaji 549 stor i u ravnoteLi je s drugim energijom bogatim derivatom, esterom karnitina. Molekula acil-karnitina lagano prolazikroz lipidrr. -.-brane. Izmedu dvije mitohondrijske membrane obavlja se reakcija u koju ulazi s jedne strane tioester dugolandane masne kiseline i CoA, a s druge srrane karnitin. Iz reakcije izlazi acil-karnitin i CoA. Reakciju kaalizira karnitin-palmitoil-transferaza (CPT I, engl. carnitine palrnitoyhransferasef koja se nalazi na vanjskoj membrani mitohondrija. Karnitin-translokaza (CT, engl. carnitine-acylcarnitine translocase) prenosi acil-karnitin iz medumembranskoga prostora u matriks mitohondrija u zamjenu za molekulu karnitina koja iz matriksaizlazi u medumembranski prostor. Aktivirana masna kiselina ulaziu proces p-oksidacije mas-

nih kiselinaizkojegse u konadnici dobiva energija iz razgradnje masti. Prijelazom masne kiseline iz spoja s karnitinom na CoA ponovno nastaje acil-CoA. Iz mitohondrija izlazikarnitin koji se vei spomenutim prijenosom pomoiu CT II vraia u medumembranski prostor mitohondrija, da bi mogao ponovno sudjelovati u reakcijivezenje sljedeie masne kiseline te prijenosa kroz unurraSnju membranu mitohondrija u matriks. Osim toga, karnitin potide oksidaciju a-ketokiselina razgrananog lanca, kontrolira omjer acilCoA i CoA u mitohondriju ivei,e potencijalno toksidne spojeve CoA s razliditim molekulama koje se mogu nakupljati pri metabolitkim krizama, otrovanju lijekovima i drugim patololkim stanjima. Te molekule mogu inhibitorno djelovati na procese u ciklusu ureje, ciklusu limunske kiseline, glukoneo genezi i p-oksidacij i masnih kiselina. Najznadajniji izvor karnitina u organizmu jest hrana Zivotinjskog podrijetla (oko 75o/o), dok se ostatak endogeno sintetizira u jetri i bubrezimaizlizinai metionina. U vegetarijanacaendogena sinteza pridonosi

do

80%o

i

s viSe

od

90o/o.

(J normalnim okolnostima

karnitina iz hrane. Prijenos iz krvi u tkiva obavlja

se s

se

u crijevu reapsorbira oko 70

pomoiu aktivnih transportnih

Procesa uz dvije vrste prijenosnika karnitina kroz stanidne membrane (prijenosnik karnitina nis-

kog afiniteta za organske katione neovisan o natriju i prijenosnik karnitina visoko g afiniteta za aminokiseline ovisan o natriju). ViSe od 90o/o tjelesnog karnitina nalezi se u skeletnim mi5iiima. Koncentracija u plazmi veiim je dijelom regulirana bubreZnim pragom koji iznosi oko 40 pmol/ L. Aktivnim transportom u proksimalnome bubreZnom tubulu sprjetava se prekomjerni gubitak karnitina. U fizioloSkim uvjetima resorbira se viSe od90o/o filtriranog karnitina. Primarni manjak karnitina genski je uvjetovan nedostatak transporra karnitina kroz stanidnu membranu. Klinidka slika primarnog manjka karnitina smatra se ponajprije posljedicom nemo-

guinosti unosa dugolanianih masnih kiselina u sranicu, tj. stvaranja energije i ketonskih spojeva iz lipida, te desto nemoguinosti da vezanjem razliditih molekula pospjesi njihovo izludivanje i odriava slobodnom dovoljnu kolidinu slobodnog CoA. Glavne klinidke posljedice takvih zbivanja jesu hipoketotidka hipoglikemija, ponajprije u riziinim situacijama kad su potro5eni drugi izvori energije ili je poveiana potreba za energijom (dulje gladovanje, iscrpljujuii napori i dr.), krize nalik na Reyeov sindrom, miSiina hipotonija i kardiomiopatija. Nagla smrt moZe nastupiti u bilo kojoj Zivotnoj dobi. Osim hipoketotitke hipoglikemije, laboratorijski nalazi koji se nalaze pri primarnom manjku karnitina jesu poveian omjer FFA prema ketonskim spojevima, hiperamonijemija, poveiane aktivnosti aminotransferaze i CK-a, eventualno poveiana koncentracija mioglobina u serumu i njegova pojava u mokraii, te najkarakteristidnije - vrlo nizak ukupni i slobodni karnitin u plazmi, bez nakupljanjabilo kojeg acil-karnitina. Manjak karnitinskog nosaia lijedi se vrlo uspjelno peroralnim nadomjeStanjem karnitina. Brojni su nasljedni metabolidki poremeiaji koji uzrokuju sekundarni manjak karnitina (ponajprije iz skupine organskih acidurija i poremeiaja p-oksidacije masnih kiselina). Za najve(i broj rih poreme&je karakteristidno je da se za karnitin veZe neka molekula koja se zbogenzimskoga manjka normalno ne razgraduje, nego se nakuplj a, veLe za slobodni karnitin i tro5i ga. Zato je u akvim stanjima, uz smanjen ukupni karnitin, smanjen i slobodni karnitin, a poveian je omjer acil-karnitina prema slobodnom karnitinu.

550

Poglaulje 24

Osim nasljednih merabolidkih poreme&ja mnoga su druga stanja desto povezana sa smanjej. sludaj npr. u Fanconijevu sindromu (koji ne mora biti uzrokovan samo nasljednim metabolidkim poremeiajem), dugotrajnoj hemodiializi, u sve te5ko bolesne djece (zbog poremeiene reapsorpcije u tubulu ili zbog smanjenja bubreinog praga za karnitin), pri strogoj vegetarijanskoj prehrani, kronidnoj ishemiji i slidnim drugim stanjima. Mnogi lijekovi (pivampicilin, benzoat, a posebice valproati) mogu se vezati za karnitin i tako dovesti do smanjenja slobodnog karnitina. Buduii da su stanja u kojima nastaje manjak karnitina brojna, a desto i od Zivotne vaZnosti, znaiajnoje njegovo mjerenje posebice u uzorcima plazme. Karnitin u mokraii ima dijagnostidku vaZnost samo pri sumnji na manjak karnitinskog nosada i pri sumnji na Fanconijev sindrom. Dugo je jedina metoda za mjerenje karnitina bila radioenzimska metoda, diji princip mjerenjem koncentracije serumskog karnitina. To

nja jest:

karnitin + *acetil-CoA

cff t

*acetil-karnitin + CoA

Uzorak (plazma, mokraia) inkubira se s (1-raC)-acetil-CoA poznate specifidne aktivnosti u prisutnosti karnitin-acetiltransferaze (CAT, engl. carnitine acetyhransferase), pri demu nastaje obiljeZeni acetil-karnitin. Dodatak N-etilmaleimida pomiie reakcijsku ravnoteZu udesno yezanjem oslobodenog CoA. Vi5ak radioizotopom obiljeZenog acetil-CoA odvaja se propu5tanjem reakcijske smjese kroz anionski ionski izmjenjivad. U eluatu se mjeri radioaktivnost nastalog acetil-karnitina, a koncentracija prisutnog karnitina odreduje se iz standardne krivulje. Izravnom analizom uzorka dobiva se slobodni karnitin, a nakon hidrolize ukupni karnitin. Razliku izmedu ukupnoga i slobodnoga karnitina dini acil-karnitin (acil-karnitini kratkog, srednjeg i dugog lanca). Metoda je osjetljiva i specifidna, no dugotrajnaizahtjevnazaprovodenje, te nije pogodna za rutinski rad. Stoga se sve vi5e primjen;'uje spektrofotometrijsko mjerenje karnitina. Princip mjerenja osniva se na reakciji karnitina s acetil-CoA koju katalizfta enzim CAT. Pri reakciji nastaje acetil-karnitin i CoA. CoA reagira neenzimski s 5,5'-ditio-bis-2-nitrobenzoarom (DTNB), pri demu nasraje 5-tio-2-nitrobenzoat (TNn). Koncentracija TNB-a mjeri se spektrofotometrijski na 410 nm. Prvi dio reakcije podrazumijeva hidrolizu (prekid esterske veze karnitina i masne kiseline), deproteinizaciju, zatim neutralizaciju reakcijske smjese te odvajanje supernatanta i taj dio postupka mora se provesti rudno. Tako prireden supernatant zatim shaLi za mjerenje ukupnog karnitina na nekom od biokemijskih analizatora. Priprema uzorka za mjerenje slobodnog karnitina ne ukljuiuje postupak hidrolize. Ukupni acil-karnitin (acil-karnitini kratkog, srednjeg i dugog lanca) izraduna se iz razlike ukupnog i slobodnog karnitina. Referentni intervali karnitina bitno se razlikuju ovisno o dobi i metodi mjerenja. Karnitin se moie mjeriti s MS-MS u uzorcima suhe kapi krvi na 6ltar-papiru. T" j. ujedno tehnologijaizbora i za mjerenje pojedinih acil-karnitina i acil-glicina u tim uzorcima. Poznavanje tih metabolita desto je od kljudnoga znatenja za dijagnostiku nasljednih metabolitkih poreme(aja, posebice onih vezanih uz poremeiaje mitohondrijskoga stvaranja energije (v. priloge). Uzorci na filtar-papiru (pune krvi, seruma ili mokraie) trebaju se ostaviti minimalo 4 sata na sobnoj temperaturi i tada su pogodni za slanje u laboratorije u kojima je takva enaliza moguia. Najinformativniji su uzorci uzeti u vrijeme l>barijera. je vi5eznadan i obuhvaia specifidne izmjene u oba smjera na dodirnim plohama izmedu krvi i likvora, odnosno krvi i samoga iivdanoga tkiva (parenhima). Specijalizirane stanice koje dinc susrav ,rkrvno-moZdane.. i >>krvno-likvorske.. barijere odvajaju SZS od periferije, i osim toge 5ro ga Stite od djelovanja mnogobrojnih Stetnih dimbenika (mehanidkih, kemijskih, zaraznih klica), sluie i za oiuvanje njegove osjetljive homeostaze (sl. 25-4.). Kruno-rnoidana barr.jera. Krvno-moidanu barijeru (engl. blood-brain banier) morfolo5ki iine endotelne stanice dubokih moZdanih kapilara diji su rubovi, za razliku od sistemnih kapilara spojeni dvrsrom elektrosratiikom vezom (engl. tryhtjunctiaz). Nadalje, oko 80%o povr5ine moidanih kapilara obavijaju zavrSne noiice (engl. endfeet) astrocita, te stanice glatkih miSiia (periciti). Danas se smarra da upravo astrociti u SZS-u podriavaju stvaranje dvrste elektrostadike veq odnosno tvrstoga spoja. Stoga je ulazak nepotrebnih wari kroz moidane kapilare gotovo u potpunosti ograniien postojanjem dvrstoga spoja medu endotelnim stanicama, malim brojem pinocitnih vakuola, te poveianom koliiinom mitohondrija i specifidnih enzimskih sustava, 5to omoguiuje razgradnju tvari koje kroz njih prolaze. Kruno-likuorska barr.jera. Za rErzlik.u od moidanih kapilara, endotelne stanice kapilara koroi& nog spleta povezane su slabim vezamai sadriavaju brojne pinocitne vakuole. Buduii da koroidni spletovi imaju fenestrirane kapilare, znaii da zajedno s ostalim cirkumventrikularnim organinn

Cerebrospinalna

dije kapilare imaju iste karakteristike

Pacchionijeve granulacije

(neurohip ofiza, corpus pineale, area postrernai dr.) leie izvansusrava ttbarijeratight junction>barijerekanala>lakom>tedkulaku< otopinu da se vizualno moZe pratiti oblikovanje gradijenta

578

Poglaulje 25

Postupak zaizlijevanje otopina monomera i oblikovanje gradijenta:

l.

Z.

3. 4.

Stakleni kalup za oblikovanje poliakrilamidnoga gela napravi se od dviju staklenih ploda spojenih stezaljkama (sl. 25-15. a-e). Na jednu staklenu plodu zalijepise Gel-Bond PAG film na koji ie se nakon polimerizacijeprilijepiti gel. Na drugu staklenu plodu postavlja se niz uskih samoljepljivih trakica koje ie nakon polimerizacije gela u njemu ostaviri utore za nanolenje uzoraka, kao i U-brwilo za oblikovanja gela odredene debljine (oko 0,5-0,7 mm). U stakleni kalup prethodno ohladen na*4 'C i postavljen vertikalno pipetom se ulije 5,6 rnL >tteike.. otopine otprilike do I cm iznadutora za nanoSenje uzoraka(s1.25-16.). >'Laka4*

/

qlll-----------a b

d

\j

Urecfaj za pripravu ultratankog po liakrila midnog gela s kontin uirani m gradijentom

Slika 25-16.

Slika 25-15.

a)-e). Postupak za pripravu staklenog

kalupa za oblikovanje ultratankog poliakrilamidnog

pora.

gela za SDS elektroforezu. a) Na staklenu plodu se s nekoliko kapi vode zalijepi Gel-Bond PAG film; b)iz2-3 sloja trake za izolaciju (ili sl.) izreZu se uske trakice za oblikovanje utora u gelu (npr. 7 x 2 x 0,3 mm), te u nizu zalijepe na drugo staklo (c); d) na istu se plotu postavi i U-brtvilo odgovaraju(e debljine (najbolje od tvrde gume) namazano parafinom; e) na staklenu ploiu s brtvilom poloZi se placa s Gel-Bond PAG filmom i obje se ploie spoje tvrstim

1, 2 - staklene ili plastitne posudice velidine 2 x 8 cm; posudica 1 sadrZava mali magnetii i nalazise na elektromagnetnoj mije5alici; posudice su sp jene teflonskom cjeviicom unutrainjega promp

stezaljkam3.

kalup. a, b

."

_

_

ra 2-3 mm; isto takva cjeviica sluZi i za izlijevanje

otopine iz posudice 1 u stakleni kalup; na kraju te cjevtice nalazi se tvrda teflonska kapilara koja lakie ulazi izmedu stakala kalupa i smanjuje pre tok otopina, odnosno brzinu ulijevanja otopina u

- metlllg llgzaljke. .

.

..-._.

Priprava uzoraka Zbogvelike osjetljivosti bojenja proteina srebrom, sve biololke uzorke s koncentracijom oko1> nih proteina veiom od I g/L treba razrljeditipuferom za obradbu uzorka. Uzorke s niskim kon-

Cerebrospinalna

centracijama ukupnih proteina treba obraditi s koncentriranim puferom da se sprijedi razrjedivanje ionako malih koncentracija proteina. Standarde treba pripraviti prema propisu koji je odredio proizvodad. 2s.6.s.2. S DS- e I e kt

rofo reza

l. U posude za pufere ulije se anodni i katodni pufer i u svaku namodi 5 listiia filtar-papira l) koji sluie kao mostiii. 2. Ukljuti se hladenje u kadici za elektroforezu (moZe i voda iz vodovoda). 3. Gel-Bond PAG film s polimeriziranim gelom zalijepi se za staklenu plodu (Whatman

kade za hladenje

s

nekoliko kapi vode.

4. Mostiii 5.

se

poloie na anodnu i katodnu stranu gela oko I cm od ruba i prekriju deblim stakal-

cima. Elektroforeza

se

provodi uz stalnu snagu od25 W tijekom 80-90 minuta.

Fiksacija proteina Nakon elektroforeze proteini u gelu fiksiraju se 20-30 minuta u Z\o/o-tnoj trikloroctenoj kiselini, a zatim se gel dobro ispere redestiliranom vodom prije bojenja srebrom.

Procjena rezultata Molekularna masa nepoznatog proteina odreduje se iz kalibracijske krivulje (logJin). Ako je gradijent u gelu dobro oblikovan, odnos izmedu molekularnih masa protein-standarda (log) i duljine putovanja proteina u gelu (lin) bit ie linearan. Oblikovanje gradijenta moZe se pratiti i vizualno kroz plavo obojenje gela koje se postupno gubi prema vrhu kalupa.

2s.6.6.

lzoelektricno fokusiranje proteina u ultratankom poliakrilamidnom gelu uz izravnu imunofi ksaciju

Izoelektridno je fokusiranje elektroforetidka tehnika u kojoj proteini putuju pod udinkom struje prema svojim izoelektridnim todkama (pI) prethodno stvorenom pH gradijentu u polia" krilamidnom gelu ili agarozi. Gradijent se uspost"ulj" izmedu elektroda u prisutnosri sintetidkih kiselina ibaza (amfoliti). Proteini se uguSiuju u uskom podrudju svoje izoelektridne todke i time tehnika postaje izuzetno osjetljiva i ima veliku moi razdvajanja. Ultratanki gel (0,4-0,5 mm) omoguiuje izravnu imunofikseciju L,eljenoga proteina na gel s monospecifidnim serumom, npr. na ljudski IgG (sl. 25-L7.).Izravnaimunofiksacijanagelu poveiava specifiinost i osjetljivost odredivanja. Primjenom izravne imunofiks aclje izbjesava se gubitak proteina koji nastaje tijekom elektridnog prijenosa (elektroblota) s PAG-om na nitroceluloznu membranu. Postupak izravne imunofiksacije na PAG takoder omoguiuje primjenu bojenja proteina srebrom, 5to je znatno jednostavniji i ekonomitniji postupak detekcije proteina.

Uredaji i pribor Izvor struje visokog napona, kada za elektroforezu s hladenjem i elektrodama zaIEF, stakleni kalup zaizlijevanje ultratankog PAG-a, Gel-Bond PAG film, mosticizananoSenje pufera, papiriii za nanolenje uzoraka (5-15 pL), izvor hladnoga svjetla (halogenska lampa).

Reagencije Akrilamid p.a., bis (N,N-metilen-bis-akrilamid) p.a., amonijev persulfat p.a., riboflavin-5-fosfat, sintetidki amfoLiti za uspostavljanje pH gradijenta, glicerol (redestiliran), orto-fosforna kiselina (min. 85 o/o), etilendiamin p.a., amberlit MB 3, pI standardi, anti-humani IgG.

tekutina 579

58O

Poglaulje 25

Slika 25-17 . lzoelektriino fokusiranje proteina likvora i razrijede-

6

B

10

nih seruma (1:200) u pH gradijentu 3-10 (A), uz izravnu imunofikaciju na gelu (B) i bojenje proteina srebrom. B. lzravna imunofiksac'rja na gelu s monospecifiinim antiserumom na ljudski lgG, uz bojenje netopljivog antigen+antitijelo precipitata sa srebrom. Ovim se postupkom poveiava specifiinost metode - precipitira se samo Zeljeni protein (u ovom slutaju lgG). Poveeava se i osjetljivost metode, te su vrpce jaie izraZene - na istome mjestu nalazi se dvostruka koliiina proteina (Ag+At).lsti se postupak moie primjenjivati i za dokazivanje drugih proteina (npr. tau-transferina pri sumnji na likvoreju).

Otopine A. Otopinaakrilamida/bisakrilamida T = l0%o; C =3o/o Priprema otopine : 9,9 gakrilamida i 0,3 bisakrilamida otopiti u redestiliranoj vodi; dodati I g amberlita i mijeSati I sat na sobnoj temperaturi; otopinu dopuniti redestiliranom vodom do 100 mL, profiltrirati i pohraniti na +4"C u tamnu bocu. B. Puferi: Anodni pufer - lo/o-tne orto-fosforna kiselina. Katodni pufer - To/o-tni etilendiamin.

C. Ostale otopine 1.

0,1%-tni riboflavin; pohranitina *4oC u tamnu bocu (postojana nekoliko tjedana).

2. 40o/o -tni amon ij ev p ersulfat ; p ripraviti svakodnevno svj e Z i. 3. 60o/o-tni glice rol.

D. Priprau a radn

e o top

ine akrilarnida/

b is

akrilamida

Za pripravu gela velidine 120 x I l0 x 0,4 mm (ukupno 5,28 mL) - 3,0 mL otopine akrilamida/bisakrilamida; 0,8 mL glicerola; 0,38 mL amfolita; 1,82 mL redestilirane vode. Otopinu uliti u tikvicu za odsisavanje, djekom 3-5 minuta odsisati zrakiz otopine (viSak kisika ometa polimerizaciju),a nakon toga brzo dodad 35 1tL otopine ribofavinai3-4 pL amonijeva persulfata. Ove wari pospjeiuju fotokemijsku, odnosno kemijsku polimerizeciju akrilamidalbisakrilamida.

Priprava ultratankog PAG zalEF

1. Kalup

2. 3.

4.

zaizlijevanje gela oblikuje se prema posrupku opisanom na slici 25-18. se ulije svjeLaotopina akrilamida/bisakrilamida, a prisutni mjehuriii zrakaistjeraju sc odizanjem gornjega stakalca skalpelom. Napunjeni kalup se prenese pod intenzivan snop hladnog svjetla; polimerizacija se provodi

U kalup

oko 2 sata. Kad je polimerizacija gotova kalup se rastavi, i gel koji jevezanza Gel-Bond PAG film moZe sc koristiti za elektroforezu. Kalup s gelom moZe se i tuvati nekoliko dana na +4'C.

Cerebrospinalna

lzoelektritno fokusiranje i izravna imunofiksacija na gelu

1. PAG vezan na Gel-Bond PAG film se

.r; \ :

se s

par kapi

hladiti i vodom iz vodo-

voda).

Mostiie od debelog papira duljine gela natopiri anodnim, odnosno katodnim puferom, lagano ocijediti na filtar-papiru i poloZiti dui. gela,2-3 mm od rubova. Na mostiie postaviti elektrode

za-=-+.

,/ \

1-\

,G @

zaIEF. 3.

IEF; za gel velidine 120 x I l0 x 0,4 mm posrupak traje 20-25 min uz snagu od 4 W. 4. I{an o i e nj e uz o rak a. U zo r ci se nanose na sp ecij al-

nekomadiiefiltar-papiravelidine5 x

5lli5 x t0

mm, $to ovisi o kolidini uzorka (S-zO pL). Filtar-papiriii su prethodno postavljeni na gel, a mjesto postavljanja ovisi o naboju proteina. Kise-

li se proteini postavljaju viSe prema katodi, a baziini proteini prema anodi. Ako nisu poznare

,/

Slika 25-18. Priprava staklenog kalupa za izlijevanje ultratankog polia krilamidnog gela za izoelektriino fokusiranje. a) na staklenu se ploiu s nekoliko kapi vode zalijepi Gel-Bond pAG film; b) na drugu, nasuprotnu staklenu ploiu poloZe se 3-4 sloja leukopora kako bise oblikovao geldebljine oko 0,4 mm; c)zatim se staklena ploca s leukoporima preokrene i poloZi na onu s filmom;

izmedu filma igornje staklene plote se umetne skalpel kojim se re-

gvtip P'ri"lg yle:F qlppilq i i:tjeryjr teqyq nislyri(!"llqtl**

se

skinu

s

gela.

). Izoelektriinofokusiranje. Uvjeti zaIEFjesu sljedeii: snaga 25W,napon se ogranidi na 1.900 V jakost struje (maksimalna). IEF traje 60-75 minuta. Imunof.ksacija.Nakon zavrietka IEF-a tanki se filtar-papir velidine oko 110 x 80 mm natopi monospecifidnim antiserumom (npr. na ljudski IgG), te lagano poloii izravno na gel bez zaostalih mjehuriia. Ako se precipitiraju bazidni proteini (npt imunoglobulini), filtar-papir se poloZi viSe na katodnu stranu gela da bi se prekrilo podrudje pH 6-10; imunoprecipitacija se obavlja 25-30 minuta u vlaZnoj komori. 1 Ispiranje neprecipitiranih proteina. Proteini koji se nisu vezali s antitijelima ispiru se iz gela fizioloSkom otopinom, najbolje preko noii. Nakon toga se gel viSekratno ispere redestiliranom vodom, a netopljivi imunoprecipitati boje srebrom.

2s.6.7.

Metoda bojenja proteina srebrom

Razne boje kojima se proteini nakon elektroforetidkog razdvajanja oboje, Ponceau S, Arnido

crnilo l0 B i

-

skalpel

znadajke proteina, isti je uzorak najbolje postaviti na razlidita mjesta izmedu anode i katode. Ako je IEF dobro udinjen, svaki se protein mora naii na istome mjestu na gelu (tj. u pH podruiju koje odgovara njegovom pI), bez obzirana mjesto nano5enja. Nakon nanoienja uzoraka, provodi se fokusiranje u trajanju od25 do 30 minuta uz sljedeie uvjete zaprrjenavedenu velidinu gela: snaga 5 W, napon se ogranidi na 500 V jakost struje (maksimalna). Nakon 30 minu-

papiriii

leukopori

Gel-Bond PAG film

Predfokusiranje. Preporuka ;'e predfokusiranje napraviti kod ultratankog PAG-a prije nano5enja uzoraka da se stabilizira kiselo podrudje; obidno traje 15% ukupnih voltsati (Vh) potrebnih za

ta

581

Gel-Bond PAG film

vode prilijepi na hladenu staklenu plodu kade za

elektroforezu (moirc

tekuiina

Comassie Brilliant plavilo, imaju veii afinitet prema albuminima nego prema T-globulinima. Osim toga, osjetljivost je tih boja premala za male koncenrracije proreina u nativnom likvoru, odnim vodicama, suzama, razliditim ekstraktima stanidnih kultura i tkiva i dr. Stoga je

*

582

Poglaulje 25

daljnji napredak u detekciji proteina nakon elektroforetiikog razdvajanja bio bojenje proteina srebrom. U svim tehnikama bojenja srebrom, stvaranje slike ukljuduje redukciju ionskoga srebra u metalno srebro. Mehanizam reakcije jo5 nije dovoljno razjainjen, ali se pretpostavlja da proteini (i neki drugi polimeri) u gelu mijenjaju lokalne fizikalne uvjete za ione srebra. Linearnost reakcije sa srebrom je od 0,05-2 ng proteina po mm2 povrSine gela.

Reagencije Srebrni nitrat p.a., kalijev dikromat p.a., nitratna kiselina (min. 65%o) p.a.36o/o-tni formaldehid, natrijev tiosulfat-5-hidrat, krist. p.a., kalijev heksacijanoferat (III) p.a., kalijev karbonat, bezvodni, p. a. metanol p.a., ledena ocrena kiselina (min. 99,5o/o).

Otopine 1. Otopina

za

ispiranje PAG-a: vodena otopina l0%-tnog metanola iSo/o-tne ocrene kiseline.

2. 3,4 mmol/L kalijev dikromat i 3,2 mmol/l nitratna kiselina - sluZi kao katalizetor. 3. 1,2 mmol/L srebrni nitrat. 4. Otopina zarazvijanje boje: 0,28 mol/L natrijevakarbonatakojem je dodano 0,5 mL formaldehida na I L otopine - pripraulja se neposredno pnje bojenja. 5. Otopina za prekidanje reakcije: |o/o-tnaoctena kiselina. 6. Otopina zaizbjeljivanje: 0,03 mol/L kalijeva heksacijanoferata (III) i 0,064 mol/L natrijev

tiosulfat-5-hidrata - pripraulja

se neposredno

prrje bojenja.

Postupak bojenja

l. 2. 3. 4.

Nakon fiksacije proteina u gelu (trikloroctenom kiselinom ili imunoprecipitacijom s anriserumom) gel se vi$ekratno ispire otopinom 1. tijekom 60 minuta. Gel se zatimuroni u otopinu 2. i ostavi u njoj l0 minuta, re se otopina izlije. Gel se uroni u otopinu 3. i ostavi 20 minuta, re se otopina izlije. Gel se brzo ispere malom kolitinom redestilirane vode, i nakon toga doda otopina 4. (oko l/3 volumena). Tfu otopinu treba rn/enjati tri putakako bi se izbjeglo taloZenje srebra na povriinu gela.

5.

6. 7.

se zaustavlja dodatkom otopine 5., i to odmah nakon 5to se pojave prve frakcije prorcina. Time se sprjeiava bojenje pozadine, Sto u drugom ciklusu bojenja srebrom omogucuic postizanj e veie osj etlj ivosti metode. Gel se ispere kratko redestiliranom vodom i doda otopina 6.Izbjeljivanje se provodi dok srr frakcije iz gelane nesranu (oko 10 minuta), te se otopina izlije. Gel se uroni u redestiliranu vodu i ispire viSekratno oko 60 minuta (dok se Zuta boja porpuno

Reakcija

ne izgubi).

8.

Postupak bojenja gela ponovi se od otopine srebrnoga nitrata. Nakon drugog ciklusa bojenja srebrom gel se uz lagano mijeianje ostavi u zadnjoj 1/3 vohr mena otopine za razvijanje boje (a) dok se ne pojave vrpce proteina. O vremenu bojenja oviri osjetljivost metode, ali ako se gel odvei dugo ostavi u boji, pozadina postaje ramna. Obojc frakcije mogu se procijeniti golim okom, a traka se moie i denzitometrirati. Gel s frakcijama proteina moZe se nekoliko mjeseci duvati u redestiliranoj vodi zaStiien od svjetla, a moi,e se saduvati kao trajan preparat obradbom metanolom i glicerolom te su5enjemI{apomene.Pri radu treba paziti na distoiu posuda, kemikalija i redestilirane vode i koristili se rukavicama. Tijekom bojenja preporuduje se stalno lagano mijeSanje gela s pomoiu elektrii* tresalice. U sludaju imunoprecipitacije proteina izravno na gelu moguie je izostaviti otopine l- i 2., i u ciklus bojenja srebrom uii od redestilirane vode (npr. pri odredivanju oligoklonskih IgC'au

likvoru).

Cere brosp

2s.6.7.

Ostali analiti u likvoru

2s.6.7.1.

Glukoza

inalna tekuiina

Glukoza u likvoru potjete iz krvi, i uleziu SZS mehanizmom olakiane difuzije. poveianje ili smanjenje koncentracije u krvi odratava se i u likvoru, ali su te promjene u likvoru manje i znatno sporije. Thko se pri provodenju OGTT-a maksimalna koncentracija glukoze u likvoru pojavljuje tek nakon 150 minuta (u krvi 30-60 minuta) , a zavraianje ,r" ,roi-*lnu potrebno je oko 4 saja (u krvi 2 saa). U odraslih je osoba odnos koncentracije giuko zelil*,or/r.i,r- oko 0,6. pri visokim koncentracijama glukoze u krvi taj se odnos smanjuje jer dolazi do saturacije veznih mjesta na transportnom proteinu.

Odredivanje glukoze u likvoru provodi se istim metodama kao i u krvi. Referentni interval iznosi 2,2-4,4 mmol/L. Vrlo je vai.no da se glukoza odredi u sasvim svjeZem likvoru, jer se pod utjecajem mikroorganizama i enzima iz leukocita vrlo brzo razgraduje, pa se u

lilcvorima^koji dulje stoje dobivaju nii,e vrijednosti, a katkad porpuno nestaje iz likvora. Sindrorn smanjene glukoze u likvoru (ili odnos koncentracija likvor/serum .0,4) ima bitno dijagnostidko znaienje, te se nalazi kod bakterijskih meningitisa, tuberkuloznog meningitisa, meningealne cisticerkoze, trihin eloze i sl., teikih krvarenja, merasr aza u moidanim ovojnicama (neoplastidnog meningitisa), meningealne sarkoidoze i dr. Pri gnojnom meningitisu koncentracija glukoze u likvoru moie biti ispod donje granice osjedjivosii -.toda. S*oiirra koncentracija glukoze u likuoru uuijek upuiuje na difuzne prornjene u mrotdanirn ouojnicarna, a ne lariine. Poveiana koncentracija glukoze u likvoru je rjeda , a nalazise kod cerebrovaskularnog inzulta, encefalitisa, epilepsije, tetanusa, neurosifilisa i hipertonije, re u osoba s hiperglikemijom u krvi. 2s.6.7.2.

Laktat

Koncentracija laktata u likvoru neSto je veta nego u serumu jer je mozak stalno u laganoj i ne korelira s koncentracijom laktata u krvi. Laktar u likvoru odreduje se istom metodom kao i u serumu. Koncentracija laktata u likvoru je 7,1-2,4mmol/L. Laktat je parametar koji upuiuje na anaerobnu glikolizu u moidanome tkivu i njegovo je odredivanje korisno u dijagnostici i diferencijalnoj dijagnostici razliditih bolesd SZS-a'(i^r^rn , vaskularne, metabolidke, neoplastiikne etiologij.).Pri smanjenom proroku krvi i smanjenoj oksigenaciji u mozgu' poveianom intraftranijalnom daku, traumi mozga,intrakranijalnim ftrvarenjima' aPscesu mozga, epilepsiji, te primarnom karcinomu ili metasrazama u SZS-u, koncentracija acidozi

laktata u likvoru se poveiava. Posebno je odredivanje laktata vaZno u diferencijalnoj dijagnostici bakterijskog od virusnog meningitisa. Koncentracija laktata u bakterijskom ,*rriniitir., go.ouo je uvijek veia od 3,33 mmol/L, dok je u virusnom meningitisu koncentracija u likvoru manja od 2,78 mmol/L. Thkoder je biokemijski pokazatelj tijeka bolesd i odgovora na terapiju. Napokon, odredivanje laktata u likvoru bitno je i zaklinidku pro.jen., sindroma smanjene glukoze u likvoru- Ako je smanjena koncentracrja glukoze u likvoi, por!.dica hipoglikemije u krvi (a ne patoloSkoga Procesa unutar moZdanih ovojnica), koncenrr acija|akter" ,rjili,oru bit ie normalna. 2s.6.7.3.

EnZimi

Likvor sadriava uglavnom enzime koji se nalazei u serumu (ALT, AST, LD, CK), ali su njihove aktivnosti u likvoru manje nego u serumu. U klinidkoj se praksi najdeiie odreduje LD, te enzimi, odnosno njihovi izoenzimi tiiaie aktivnost unurar tkiva SZS-" r,.iik, (CK-l i ri.).

M.to-

de za odredivanje enzima u likvoru iste su kao i za serum.

583

584

Poglaufe 25

2s.6.7

.4. La

ktat-deh id rogenaza

LD u likvoru je biokemijski pokazarcIj ubrzane stanidne smrti i pojadane anaerobne glikolize unutar SZS-a. LD moZe biti podrijetlom iz Livianih stanica, stanica periferne krvi koje su se infilrirale u SZS ili iz mikroorganizama. LD je osjetljiv, ali nespecifidan biljeg perinatalne hipoksije i ishemijskog inzulta. Znatno poveiane vrijednosti LD-a u likvoru moZe se naii i kod bakterijskih meningitisa, pa u sluiajevima granidnih vrijednosti za glukozu i proteine, to je koristan diferencijalnodijagnostidki biljeg za razlikovanje septidnog od asepridnog meningitisa. LD je takoder i nespecifiini tumorski biljeg, a koncentracije u likvoru su poveiane u sludajevima metastaza hematoloSkih zloiudnih tumora ili tumora tzv. malih stanica (neuroblasrom, mikrocelularni karcinom pluia i dr.). 2s.6.7.s.

ostali proteini u likvoru

C-reaktiuni protein. CRP je protein akutne faze upa,Ie. U likvor ulazi kroz oiteienu krvnomoidanu barijeru, a neka istraZivanja upuiuju i na njegovu minimalnu intratekalnu sintezu. Odredivanje CRP-a u likvoru primjenjuje se u diferencijalnoj dijagnostici meningidsa (bakterijski nasuprot virusno m). Znatno viSe vrijednosti nalaze jama. Odreduje se istom metodom kao i u serumu.

se

kod infekcija gram-negativnim bakteri-

Betar-mikroglobulin Fr-M u normalnom je likvoru najveiim dilelom lokalnog podrijetla, a oslobada se s povriine razliditih tipova stanica (dio je HLA kompleksa). Koncentracija Fr-M o likvoru znatno poraste u stanjima praienima pojadanom imunosnom aktivnodiu unurar SZS-a (oslobada se s povriine aktiviranih limfocita T). Osim toga, pr-M je koristan tumorski biljegza rano otkrivanje metastaza zloiudnih hematoloSkih tumora u moZdane ovojnice (leukemije,limfomi). Odreduje se istom metodom kao i u serumu. >>Neruno-specif.inio proteini. {J normalnom likvoru nervno specifidnih proteina ima tek u tragovima. U razlititim neurolo$kim bolestima njihova se koncenvacija poveiava i oni mogu biti osjetljiv i specifidan pokazatelj organskog o{tecenjaLivtanoga tkiva. Danas se u likvoru najde5ie odreduju protein 5-100 i NSE. Protein 5-100 i NSE takoder su i tumorski biljezi (povi5eni su npr. kod neuroblastoma, astrocitoma). Oba se proteina odreduju istom metodom kao i u serumu. 2s.6.7.s.

Elektroliti

Iako su koncentracije elekuolita u likvoru slidne onima u serumu, ipak posroje stanovite razlike. Kalij je u likvoru neSto niZi nego u serumu i ne ovisi ni o koncentraciji u serumu ni o koncentraciji proteina u likvoru. Kako krvno-moidana barijera normalno ne propu5ta proteine i kako su proteini u likvoru mnogo niZi nego u serumu, likvor praktidki ne sadrZava nedifuzibilni, nego samo ionizirani kalcij. Zbogtoga je koncentracija kalcija u likvoru gotovo za polovinu manja nego u serumu. Takoder nema korelacije kalcija u likvoru s kalcijem u serumu ni s proteinima likvora. Do porasta kalcija u likvoru dolazi tek kad koncentracija proteina u likvoru naraste viie od 1,5 g/L.U likvoru je takoder nita i koncentractja fosfata. Nasuprot kalciju, koncentracija magnezija u likvoru veh je nego u serumu i korelira sa serumskim magnezijem. Najvainij a razlika u sastavu elektrolita likvora i seruma jest u koncentraciji klorida (t t 5- 130 mmol/L). Oni su u likvoru znatno vi5i i kao anioni nadomjeStaju manjak proteinskih aniona Stoga je i svaki znaiajni porast ukupnih proteina u likvoru (bez obzira na etiologiju osnovnc bolesd) praien sa smanjenjem koncentacije klorida. Koncentracije klorida u likvoru rakoder koreliraju sa serumskim koncentracijama. Praktidki su kloridi jedini od elektrolita koji se rutinski odreduju u pregledu likvora. Za odredivanje klorida i drugih elektrolita u likvoru primjenjuju sc iste metode kao i za krvni serum.

Cerebrospinalna

tekuiina

585

Analiza stanica u likvoru

2s.6.8.

Odredivanje broja i diferenciranje stanica u likvoru jedna je od najstarijih pretraga likvora. U razliiitim bolestima SZS-a stanice se mogu znarno promijeniti, i po broju, i po vrsti. Stoga je uz ukupan broj stanica u likvoru vaZna i njihova morfoloika analiza. Normalni likvor odrasle osobe sadriava do 5 x n6/L leukocita, uglavnom limfocita i do 30o/o monocita. To su stanicekrvnog podrijetla. Ako ne postoji traumatska punkcija, nalaz eritrocita i neutrofilnih granulocita upuiuje na patolo5ki proces unutar SZS-a. Ukupan je broj stanica u zdrave novorodendadi veii, do 30 x 106 /L. Katkad je moguie naii i pokoji eritrocit i neutrofilni granulocit. Broj stanica u likvoru poveiava se umjereno pri kronidnim upalnim bolestima, dok pri akutnim upalnim bolestima njihov broj moie doseii i vi5e desetaka tisuia stanica u litri likvora. Broj stanica moie se naglo poveiati kao kod gnojnog meningitisa (> 90% su neutrofili), a moie rasti i postupno kao $to je sludaj kod sifilitidnih bolesti SZS-a. Pri nekim pak bolestima broj stanica moie ostati normalan, ali se u likvoru nalaze i druge stanice kojih normalno nema. Tako se kod multiple skleroze, osim limfocita i monocita, nalazeplazma-stanice, a kod tumora mozgazloiudne stanice. Stoga jeuz odredivanje ukupnoga broja stanica u likvoru isto tako vai,na i njihova morfolodka analiza.

2s.6.s.

Brojenje stanica u likvoru

Fuchs-Rosenthalovakomorica imapovriinu od4 x 4mm (ukupa dubinu 0,2 mm, tako da je ukupni volumen komorice 3,2 nffi3, pribliino 3 mm3 (s1.25-19.). Komorica se moZe napuniti nativnim likvorom ili se stanice prije brojenja mogu obojiti. Za vitalno bojenje stanica likvora upotrebljavaju se razne otopin.. e.rto se u tu svrhu rabi otopina karbolfuksina sljedeieg sastava: 30 mL ledene octene kiseline, 2 mL zasiiene otopine fenola, 2 mL 10%-tne alkoholne otopine fuksina i do 100 mL destilirane vode.

no 16),

Postupak Otopina karbolfuksina navude

tim

se

u melanZer do oznake 1, a za-

likvor promuika i navude do oznake 11. Melanier se trese u horizontalnom poloiaju nekoliko sekunda. Prve kapi tekuiine issvjeZi

ili vate, azatim se napuni SIika 25-1 9. Fuchs-Rosenthalova komorica. komorica, pazeii da u njoj ne bude mjehuriia zraka. Napunjena se komorica ostavi nekoliko minuta da se stanice istaloZe, a onda se pod slabim poveianjem mikroskopa izbroje svi leukociti na cijeloj povrSini komorice. Leukociti se poznaju po tome 5to imaju obojene jezgre, dok su eritrociti Zuikasti, manji i homogeni.

puste se iz melani,erana malo filtar-papira

Racun

Ukupni broj stanica podijeli

se sa 16, jer

je dubina komorice 0,2 mm, i s

l0/9

komorica ima povrSinu 16 hrn2, zetim se pomnoZi zbograzriedenia likvora u melanZeru. Broj stanica

lrt,i.r 1 mm3

Ako

=

o#ip

ili pribliin"

se Fuchs-Rosenthalova komorica

ne mnoZi s

l}/9,jer

t.

U 1 L ima onda

f

x

106 stanica.

puni natiunirn likvorom, tada

nema razrjedenja likvora u melanZeru. Kad

se

se

ukupan broj stanica

stanice broje nativno, moguia

586

Poglaufe 25

je i njihova daljnja diferencijacija na male i velike limfocite (limfociti, monociti, plazma-scanice), granulocite, fagocite, suspektne stanice i dr. To je izuzetno vaino u djedjoj patologiji u sludajevima kada nema dovoljno uzorka likvora za pripravu preparata za morfoloiku analizu stanica (bo-

jenje po Pappenheimu).

2s.6.10.

Morfoloika analiza stanica u likvoru

Zal 900/o stanica. Bojenje po Pappenheimu, uveianje 100 puta.

Slika 25-208. Morfoloika analiza stanica u likvoru u akutnc me virusnom meningitisu. Limfociti iine > 900/o stanica. Boje. nje po Pappenheimu, uveianje 100 puta.

g'JJ

f

J

),

Slika 25-20D. Slika 25-20C.

Nalaz eritrofaga u likvoru pri subarahnoidnom krvarenju (SAH). Bojenje po Pappenheimu, uveianje 100 puta.

ftrffi m+

Nalaz zlo(udnih stanica u likvoru kod staza u SZS-u (akutna limfatitka leukemija). Bojenje po penheimu, uve(anje 100 puta.

Pry

Cerebrospinalna

Pappenheimu May-Gri.inwaldovom i Giemsinom otopinom, kao i za krvni razmaz. Razlidite citokemijske i imunocitokemijske tehnike primjenjuju se za dokazivanje i diferenciranje imunokompetentnih i rumorskih stanica u likvoru. ViSe o diferenciranju stanica i njihovim znadajkama moie se naii u odgovarajuioj literaturi. U raznim bolestima SZS-a broj se stanica poveiava, a mogu se naii i druge stanice: neutrofilni i eozinofilni granulociti, a vrlo rijetko i bazofilni granulociti, razliditi fagociti, plazma-stanice, stanice koroidnih spletova i zloiudne stanice. Tako se stanicama krvnog podrijetla, u dugotrajnim upalnim procesima mogu pridruZiti i stanice tkivnoga podrijetla koje oblaZu likvorske prostore (s1.25-20.

A-D).

Neutrof.lni granulociti pojav\uju se u akutnim procesima unutar SZS-a (upale, ishemija, traume, krvarenja). Poveiani broj monocita i razliiitihfagocita (leukofaga, eritrofaga,pigmentofaga) nalazise kod ditavog niza upalnih i degenerativnih bolesti SZS-a i to je najdeSia stanitna reakcija u likvoru. Pri kronidnim upalnim bolestima dominiraju limfociti, uz pojavuplazma-stanica. Eozinoflni se granulociti pojavlluju u veiem broju kod parazitarnih bolesti (cisticerkoza mozga) i nekih zloiudnih bolesti, te kao alergijska reakcija na bolest ili terapiju. Zloiudne se stanice nalaze u likvoru znatno deSie kod metastatskih tumora (posebice hemoblastoza) negoli u primarnim tumorima SZS-a. Stanice koroidnog pleksusa i subarahnoidnoga prosrora nalaze se kod kronidnih procesa unutar moidanih komora i ovojnica (upale, zloiudne bolesti).

Literatura Tibojevii-e.p. M, Poljakovit.Z,YrhtN, Bielen I. Detection of IgG oligoclonal bands in unconcentrated CSF by isoelectric focusing in ultrathin polyacrylamide gel, direct antiserum immunofixation and silver nitrate sraining. J Clin Chem Clin Biochem 1989; 27:2ll-6. 2. tbojevii-e.p. M, Kradun I,Jusii A, Pavlidek I. Gangliosides of human cerebrospinal fuid in various neurological 1.

diseases.J

Neurol Sci

l99l;

L05:I92-9.

3. Fishman RA. Cerebrospinal Fluid in Disease ofthe Nervous System. 2.izd. Philadelphia:'W'B Saunders, 1992. 4. Blennow K, Fre dman P,'Waallin A, i sur. Formulas for the quantitation of intrathecal IgG production. Their validity in the presence of blood-brain barrier damage and their udlity in multiple sclerosis. J Neurol Sci 1994; 12l:90-6. 'Watson MA, Scott MG. Clinical utility of biochemical analysis of cerebrospinal fluid. Clin Chem 1995;41-3435. 60.

6. Felgenhauer K. Laboratory diagnosis of neurological

diseases. U: Thomas L, ur. Clinical Laboratory Diagnosis. 1. izd. Frankfurt/Main: TH-Books Verlagsgeseleschaft mbH, 199&1308-25. 7. Tibojevii-eepe M, Brinar M, Pauro M, Vogrinc Z, Sambuk N. Cerebrospinal fuid complement activation in neurological diseases.J Neurol Sci 1998; I54173-8L. .\V.. 8. Felgenhauer K, Beuche Labordiagnostik neurologischer Erkrankungen. Stuttgart: Georg Thieme Verlag,

1999.

9. Reiber H, PeterJB. Review article. Cerebrospinal fuid analysis: disease-related data patterns and evaluation programs.J Neurol Sci 2001; 184:L0l-22. 10. Reiber H. Dynamics of brain-derived proteins in cerebrospinal fuid. Clin Chim Acta 2001; 310 173-86. 11. Verbeek MM, de Reus HPM, 'Weykamp. Comparison of methods for the detection of oligoclonal IgG bands in cerebrospinal fluid and serum. Results of the Dutch Qality Control Survey. Clin Chem 2002;48:1578-80. 12. Lawrence RH. The role of lumbar puncture as a diagnostic tool in 2005. Critical Care and Resuscitation 2005;

7:213-20.

tekuiina 587

Pogtautje

26

Prenatalna d/agnostika BoZidar Straus, Koraljka Duri(

wtsq*&wrh*,. utndmd

I8S

l(srio*:ki gonadifio-pin

585

ilekonjugirani estriol

5-89

EideFnqski testwi pmbiranja feulnih dnofldlia

ShesiFt

iii{&i

Am*ijcktt*a4m

.

Anatiaamnijsktekuiine

ri*e :'

. '::

,$9 591 591

.:

593

Pretrage amnijske teku(ine kod hemolititke

hole{i fetura

593

0dredrvanje zrclosti p1o& metodom

fiuoresrentne polarizacile

Bioffirfa*dhat&lr*tnt, tfftuptmeti

597

Biokemijska dijagnostika dini znatan dio prenatalne zaSdte i obuhvaia pretrage u majiinoj krvi i u amnijskoj tekuiini. Pretragama se nastoje procijenid rast i razvoj ferusa, te funkcionalna uloga posteljice u trudnoii. Usporedo s djetetovim intrauterinim razvojem zbiva se i fizioloika prilagodba majiina organizma na trudnoiu, te se mijenja koncentracija veiine metabolita i enzima u majdinoj lrvi. Tijekom 40 tjedana koliko traje >>normalna.. trudnoca (od prvog dana posljednje mjesednice do porodaja) uvjetno se razlikuju dva odjeljka: majdin i fetoplacentni. Kontakt izmedu tih dvaju odjeljaka zapoiinje vei implantacijom zametka u maternicu (:.-1. dan nakon ovulacije), a 8 tjedana poslije vei je potpuno formirana posteljica koja omoguiuje povezanost majtina i fetalnog krvotoka, te tini fetoplacentnu barijeru. Posteljica je i iznimno endokrino akdrno tkivo koje stvara hormone svojstvene trudnoii (korionski gonadotropin, placentni laktogen) i spolne steroidne hormone (progesteron, estriol, esuadiol).

Veiina hormona sintetiziranih u posteljici dospijeva u majiin krvotok i regulira prilagodbu trudniiina organizma sve do porodaja.

26.1.

Biokemijska analiza majiine

krvi u trudno(i 26.'t.1.

Korionski gonadotropin

Korionski gonadotropin (HCG) jest glikoprotein molekularne mase oko 40 kDa, graden je kao dimer od dviju nekovalentno vezanih podjedinica (o i 9), te ima bioloiko djelovanje slidno hormonu luteinizacije. Hipofiza u muikarace i u Zena swara 2-4IUIL tog hormona, 3to je na granici analitidke osjetljivosi veiine imunokemijskih metoda. Zbogrcgaje HCG idealan biljeg trudnoie a

odreduju ga i svi kvalitativni >>testovi na trudnoiu 2.000 mL), a oligobidrarnnionjest smanjenje volumena (< 100 mL). U drugom tromjesetju trudnoie amnijska je tekuiina bistra i sasvim blago iuikasta. Zutkasta boja PostuPno nestaje, a potkraj treiega rrimesrra, oko 2-3 tjedna prije porodaja, mijenja se izgled amniiske tekuiine, jer verniks koji je do tada pokrivao fetus podinje otpadati s koie u amnijsku tekuiinu. Zbog toga ova postaje murna i na kraju mlijedna izgleda. Tijekom trudnoie

s92

Poglaulje 26

mijenja se kemijski sastav amnijske tekuiine. Natrij i kloridi u potetku trudnoie sliini su kao u plazmi, a onda se tijekom trudnoie njihova koncentracija smanjuje i amnijska tekuiina postaje hipotonidna. Koncentracija ureje, a poglavito kreatinina i mokraine kiseline rasre u amnijskoj tekuiini tijekom trudnoie zbogizlijevanja fetalne mokraie u amnijsku tekuiinu. Koncentracija glukoze u 12. je tjednu oko 3,62 + 0,55 mmol/L, tijekom drugog do treieg trimestra se ne mijenja, a onda se smanjuje i prije porodaja iznosi samo oko 0,55 mmol/L. Ukupnih proteina i albumina ima u drugom trimestru oko 1/10, a u treiem samo oko l/20 koncentracije u majdinu serumu, dok se globulini tijekom trudnoie postupno poveiavaju. U amnijskoj tekuiini nema fibrinogena. Koncentracija aminokiselina slidna je ili ne5to manja od one u majiinu serumu, osim znadajnih promjena kod nekih nasljednih metabolidkih poremeiaja. eesto s. u amnijskoj tekucini nade i oksihemoglobin, a njegova je prisutnost obiino posljedica hemolize. Kada prijeti intrauterina smrt fetusa, u amnijskoj se tekuiini nalazi i methemoglobin. Bilirubina ima malo u amnijkoncentracija smanjuje s trajanjem trudnoie zbograzrjedivanja tekucine fetalnom mokraiom i sposobnosti placente da ga uklanja. Poveiana koncentracija bilirubina nalazi se kod Rhesus-hemolitidke bolesd fetusa senzibiliziranih trudnica i kod hiperbilirubinemije majke. Amnijska tekuiina sadriava i razne hormone, a neki se odreduju kod stanovitih nasljednih poremeiaja. U obiteljima u kojima se nasljeduje kongenitalna adrenalna hiperplazija (autosomna recesivna bolest uzrokovana manjkom nekog od enzima potrebnih u sintezi kortizola), opravdano je u amnijskoj tekuiini odredivati koncentraciju 17-hidroksiprogesrerona (17-OHP)Najdeiie je rijed o manjku enzima 21-hidroksilaze pa se zbog nemoguinosti daljnje sinteze korrikosteroida nagomilava prekursor 17 - OHP - a. Enzimi su prisutni u amnijskoj tekucini, ali se malokad odreduju u dijagnostidke svrhe. Akdrnost LD-a normalno je neSto manja nego u serumu majke, ali kada prijeti smrt fetusa, aktivnosr joj se poveca 2 do 2O puta. Aktivnost ALP-a poveiava se tijekom trudnoie zbog porasta akdvno-' sti u majdinu serumu. Kako se u uudnoii u majke pojavljuje placentni ALP, to se u amnijskcj tekuiini preteZno pojavljuje taj izoenzim. Za placentni ALP karakteristidno je da je termostabiskoj tekuiini i njegova

se

lan i osjetljiv na inhibiciju L-fenilalaninom. Amnijska tekuiina sadrZava 3 oblika acedlkolinesteraze (ACHE): monomerni (7B kDa), dimerni (126 kDa) I rerramerni (256kDa). Nalaze se u tragovima u amnijskoj tekuiini u normalnoj trudnoii. No, kod razvojnih grjeiaka koje imaju kao posljedicu neporpuno zatvararye neura} ne cijevi fetusa (NTD, engl. Neural Tube Dtftu), aktivnost tetramernog izoenztma ACHE-I (specifiian za acetilkolinesterazu podrijedom rz SZS-a) poveiana je i do 60 puta, pa je to specifiina pretraga za otkrivanje tog poremeiaja. Osim izoenzima ACHE-a, za NTD karakteristiino je i poveianje koncentracije AFP-a u amnrjskoj tekuiini, a takoder i u serumu majke. Naime, ako se neuralna cijev koja se stvara vei riikom tetvrtoga {edna trudnoie ne zatvori potpuno, moguia je komunikacija izmedu nje i amniiske tekuiine pa sastojci iz fetalnoga lrvotoka i likvora prelaze u amnijsku tekuiinu. Zato se u amnijskoj tekuiini poveiava koncentracija proteina, a jedan dio tih proteina dospijeva iz amny ske tekuiine i u lrv majke. Buduii da je u ranome fetalnom iivotu AFP glavni protein plazrnc, i njegova se koncentracija u amnijskoj tekuiini poveiava. Koncentracija AFP-a najveh je u feal nom serumu oko 16. tjedna trudnoie, oko 7,5 g/L, i onda se smanjuje do porodaja na oko 3{l mg/L. Razmjerno tomu kreiu se i koncentracije u amnijskoj tekuiini, samo 5to su one oko lfi} puta manje nego u krvi fetusa. Pri NTD-u dospijeva viie AFP-a u amnijsku tekuiinu, a odadc i u majtin krvotok pa se koncentracija toga proteina stalno poveiava i u amnijskoj tekuiini i u serumu majke sve do porodaja. AFP se odreduje u krvi majke od 15. do 2L tjedna trudnois i kod otvorene neuralne cijevi koncentracije dva ili viSe puta premaduju otekivane vrijednosri ze gestacijski tjedan. U trudnica koje su pozitivne u probiranju NTD-a moie se odrediti i koncentracija AFP-a u amnijskoj tekuiini. Za razliku od poveiane aktivnosti neurogenog izoenztn'o

Pren ata lna dij agnos tika

ACHE-a, poveiana koncentraciiaAFP-a u amnijskoj tekuiini ne mora uvijek biti znak NTD-a, se moie pojaviti i kod niza drugih patoloikih stanja kao Sto su kongenitalna nefroza,hidrocelel

ili nelroza jetre. Amnijska tekuiina sadrtava i razne lipidne tvari. Koncenrracije se kolesterola i njegovih estera, triglicerida i masnih kiselina tijekom trudnoie ne mijenjaju, iok se koncen tracijiaflsfolipida falus

izmedu 27. do 33. ledna dvostruko poveiava

26.2.2.

i

najvetaje u wijeme porodaja.

Analiza amnijske tekuiine

Da bi se amnijska tekuiina dobila zalaboratorijsku analizu, porebno je udinid amniocentezu. provodi se tako da se iglom punktira kroz trbu5nu stijenku i maternicu, te Jtrcaljko- od to do 20 mL aspirira amnijska tekuiina (sl. 26-1.). Najpogodniji termin ze ranu amniocenrezu jest 14. do 16. tjedan uudnoie, kada vei ima oko 100- 175 mL amnijske tekuiine. zahvat amniocenreze donekle je invazivan. Najnepovoljnij a komplika cij a koj a moze nastupiti nakon zahv aarane amn iocenteze jest spontani pobadaj. zato se amnioc enteza i prerrage am-

liske tekuiine provode samo kada je to strogo indicirano, a indikacije su prenaralno otlrivanje nasljednih poremeiaja i kromosomopatija (rana amniocen teza), re dijagnosticiranje Rh-hemolitidke bolesti, odredivanje zrelosti i utvrdiva nje ugrotenosti ploda (amniocen teza akasnijoj trudnoii) S obzirom na ro da se koncentracija veiine biokemijskih biliega tijekom trudnode intenzivno mijenja u amnijskoj iekuiini, u procjeni rezultata pretraga amnijske tekuiine treba uvijek uzimati u obzir referentne intervale u odnosu na tjedne trudnoie ,gestacijska dob).

Slika 26-1 . Transabdominalna amniocenteza. 26.2.3.

Pretrage amnijske teku(ine kod hemoliticke bolesti fetusa

Hemolitidka bolest novorodendeta (eritroblastoza) nastaje kada majka koja ima Rhesus (Rh) ncgativnu krvnu gruPu stYara antitijela na Rh+ antigene erirrocita fetusa. Nakon imunizacije u Prvoi trudnoii, tijekom druge rudnoie i sekundarnoga imunosnog odgovora antitijela klase igG prelaze fetoplacentnu barijeru i uzrokuju hemolizu eritrocit" f.tor"lodnosno hemolitidku anemiw in iltero. Nakon rodenja, novorodendad ima poveian broj eritroblasta u perifernoj krvi, ekstramedularna hematopoeddka tarilta, te iuticu i ostale simptome h.-oliridk *.-i;e. Danas se cksangvino-transfuzi"- indukcijom prijevremenog potod"l" uspjelno lijete i teLisludayevi hei molititke bolesti novorodenteta, ali nuZno prepoznati i pratiti razvoj bolesti i za vrijeme inie trauterinog razdoblia. Senzibilizacija majke i rizik za pojavu hemolititke bolesti novorodendera urwduje se seroloikim pretragama, a stanje i ugroZenori f.ror" tijekom trudnoie prare se spekqalnom fotometrijom amnijske teku6ine. Apsorpcijska krivula amnijske tekuiine fetusa s eriroblastozom rezykuje se zbog prisutnog

bilirubina i drugih intermedijarnih produkata metabolizmahema od Lrivulj. tekuiine "-rriyrf. zdravog fetusa. Odekivana apsorpcijska krivulja amnijske tekuiin e zdravogf.,or" pokazuye prije norodaja gotovo linearno poveianje sa smanjenjem valne duljine izmedu SIO i 36j nm.U "pror-

s93

594

,9

Poglaulje

26 Slika 26-2. Apsorpcijska krivulja normalne (a) iamnijske tekutine koja sadriava bilirubin (b). Maksimum kod 450 nm odgova-

0.3

lq

!i!!ry9! l

q, e

ryllliny

lte

o

g

11 9 "l

Ti,!'Fel

gg tebi

I

v._

0,2

0,1

pcrjskoj

krivuli amnijske tekuiine

fetusa s hemolititkom

se kod 450 nm viSe ili manje izrai.en apsorpcijski maksimum koji odgovara bilirubinu (sl,26-

boleiiu pojavljuje s80 0,6

2.).

0,s

Prema Lileyu, razllkaizmedu ravnoga pravca koji spa-

o 0,4 o-

ja apsorpcije na 550 nm

0,3

i 365 nm i maksimuma

na 450

nm naziva se >rdelta-bilirubinaknocking inhvata< hipoklornu kiselinu i na taj natin gtiti o-antiproteinazu) ceruloplazmin (katalizira o.kidaciju Fe2* i fero-kompleka u feri-stanje pogodno za vezanje u transferin (aktivnost ferokidaze l); feroksidazna aktivnost ukljuduje iewerostruku eleltronsku red.ukcU, br; H;o ;i;ri,*j.l"rrtiunir' kisikovih intermedijaI ra; veie bakar nespecifiino i inhibira reakcije radikala ovisne o bakru)

'

ilt

izvonstdnitni l?}{glikoprotein velike molekularne mase, katalititki uklanJa Or, vjerojatno

s

povriine endotelnih stanica)

izvanstoniina glutation-peroksidaza {glikoprotein koji sadriava selen, velike rnolekularne mase, uklanjb HrO, i lipidne perokide)

urafi(hvataii organskih i anorganskih kisikovih radikala; mogu vezati ione ieljeza i,bakra te usporiti katalitiiko djelovanje) bilirubin (hvata perokilne radikale; masne kiseline vezane na albumine moie Stititi od oksidacije)

:i

p-karoten (hvata srngletkisik i

lipide u lipoproteinima u plazmi)

hidrokilni radikal; inhibitor lipidne peroksidacije pod odredenim uvjetima)

koenzimQ (u reduciranom obliku djeluje kao antioksidans, uz njegovu vainu ulogu u energijskom metabolizmu)

superoksid'dismutaza,ZnlCu-SOD iMn-SOD (katalititko uklanjanje superoksidnog radikala iz stanica) kotalaza (katalititko uklanjanje HrO, kad je on u velikoj koncentraciji; ima perokidacijsku aktivnost kad su etanol, metanol i nitriti donori elektrona) glutatian'peroksidaza (perokidacijsko uklanjanje H2O2 i lipidnih hidroperokfda; moie uspjeino uklanjati niske xfea dy-stateK

vrijednosti

H2O2)

644

Poglaulje 30

30.2.1.

Citoprotektivni enzimi

Superoksid disrnutaza

Promjena superoksidnog radikala u vodikov peroksid (tzv. reakcija dismutacije) i kisik SOD-om oznaduje reakciju primarne obrane od oksidacijskoga stresa, jer je superoksidni radikal laki

inicijator landane reakcije. U citosolu stanica sisavaca nalazise metaloprotein, Zn/Cu-superoksiddisrnutaza, o u mitohodrijima stanica Mn-superoksid-dismutaza. Uklanja superoksidni radikal spajajuci se s protonima i stvarajuii vodikov peroksid i kisik: Oz-' + Oz-' + 2H+ -+ HrOr* Oz

soD Enzim je pronaden u gorovo svim eukariotskim stanicama bilaka i Zivotinja. U ljudi postoje

tri oblika enzima: mitohondrijski (Mn-SOD ili SOD-I, homotetramer, molekularne

mase 96

kDa), citosolski (Zn/Cr-SOD, SOD-1, dvije istovjetne podledinice, molekularne mase 32kDe) i izvanstanidni (EC-SOD ili SOD-3, rerramer). Aktivnost enzima inducira se kemikalijama ili stanjima u kojima je pojadano stvaranje superoksidnog radikala. Katalaza je enzim graden od 4 podjedinice koje sadrZavaju atom teljeza, molekularne mase oko 60 kDa. Lokalizirana je primarno unutar peroksisoma (manje u citoplazmi i u mikrosomskoj frakciji), organelama u kojima je smje5tena i glikolat-oksidazakoja katalizira stvaranje vodikova peroksida. Za organizam je vatno da se on odmah i razgraduje jer se time skraiuju put i vrijeme potencijalno Stetnoga djelovanja vodikova peroksida u smislu stvaranja drugih slobodnih radikala. Katalazakatalizira razgradnju vodikova peroksida na vodu i kisik:

zHzoz-+ HrO + O, katalaza

Glutatioru-peroksidaza glavnije enzim koji razgraduje vodikov peroksid nastao djelovanjem SOD-a. Sadriava selen, djelomidno je lokalizirenaunutar stanidnih membrana, a uklanja vodikov peroksid u prisutnosti reduciranoga glutationa, pri iemu nastaju voda i oksidirani glutation: 2HzOz + 2GSH

-+-+-+

GSSG

+ ZHrO

glutation-peroksidaza

U ljudskom

su organizmu poznata4 oblika tog enzima: stanidna, gastrointestinalna , plazmar-

ska i fosfolipid-hidroperoksid-glutation-peroksidaza, prisutna u mnogim tkivima.

Glutation-peroksidaza takoder moie dovr5iti lantanu reakciju peroksidacije, uklanjanjem lF

pidnih hidroperoksida

sa

stanidne membrane:

LOOH + 2GSH -+ LOH + GSSG + HrO Regeneracija GSH-a dogada se uz o NADPH-ovisnu glutation-reduktazu, dime se stanicarrre osigurava ponuda glutationa u njegovu reduciranom obliku.

30.2.2.

Antioksidansi

Vitarnin C - ili askorbinska kiselina (hidrofilni antioksidans) sa svojim dehidro-oblikom, rcverzibilni je oksidoredukcijski sustav koji ima vainu ulogu u bioloSkim oksido-redukcijskim procesima i stanidnom disanju. Reducira a-tokoferolni radikal, perokside i ostale radikale, npr.supe roksidni, hidroksilni re hipoklorit. Askorbat je prisutan u citosolu,gdi. ie reagirati s a-tokoferob silnim radikalom, u procesu u kojem se sam oksidira u dehidroaskorbinsku kiselinu.

Slobodni radikali i antioksidansi

645

Vitarnin E (lipofilni antioksidans) dine a, 0, T i ),-tokoferoli, od kojih je u organizmu 80% prisutno u obliku a-tokoferola. Sastavni je dio bioloSkih membrana i lipoproteina u krvi, koje Stiti od lipidne peroksidacije, prekidanjem landane reakcije nastajanja radikala. PriivrSien je na hidrofobnu strukturu membrane hidroksilnom skupinom diji se vodikov atom lako uklanja.Tako, kad se stvaraju peroksilni i alkoksilni radikali za vrijeme lipidne peroksidacije, oni ie primarno reagirati s ovim antioksidansom, a ne sa susjednom masnom kiselinom. a-tokoferol se pretvara u novi slabo reaktivan radikal, a-tokoferoksil radikal (a-tokoferol-O.), koji ne ie napadati susjedne masne kiseline pokrajnjeg lanca.

Karoteni. Beta-karoten je u lipidima topljivi provitamin A. Pripada skupini biljnih pigmenavoiu i povriu. Sam p-karoten ili u smjesi s drugim antioksidansima djeluje antioksidacijski, primarno uklanjajuii singlet kisik. Premda je koncentracija karotena u plazmi oko 50 puta manja od a-tokoferola, vjerojatno imaju slidni kapacitet >>distadaglutation redoks ciklusu>bujicom.. superoksidnog radikala ko;'i se stvara kada kisik ponovno ulazi u

ATP

I

ADP

o I,l

I

AMP

.l

o

.g E

I

adenozin

ksanti n-dehid rogenaza

+

I

inozin +

hipoksantin

ca2*

|

kalpain

+

ksantin-oksidaza

Or'+ HrO, + urat

o2

reoksigenacija

Slika 30-9. Pretpostavljeni mehanizam oiteienja prouzrocenih slobodnim radikalima, nastalima zbog hipoksije/reoksi genacije, od nosno ishem ije/reperfuzije (pretvorba ksa ntin-dehidrogenaze u ksantin-oksidazu katalizirana je s Ca2* i r

fq!pailgry.leqlqttqr grqleg:gr qlfliyirqlgq I gl',1),

_

ishemidno tkivo (sl. 30-9.). Reperfuzijsko je oiteienje to reZe 5to je dulji period ishemije, a moZe imati ulogu u egzacerbacijskom oiteienju u bolesnika s reumaroidnim artritisom i drugim stanji.

ma s vaskularnom insuficijencijom. Pri upalnoj reakciji,

Slobodni radikali i

antioksidansi 647

Popramom stanju mnogih bolesti,limfociti, granulociti i makrofagi stvarajurazneupalne stimulanse, ukljuduluii prostaglandine i reaktivne kisikove vrsre, koji tkivno o5teienje dine trajnim. Dokazi upuiuju na to da u nekoliko neuroloikib bolesti (npt Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest, Huntingtonova koreja i multipla skleroza) dolazi do nakupljanja Leljeza sekundarno na inicijalna toksidna oSteienja. Razlog tomu nije jasan, ali takvo nakupljanje L,ehjeza moZe biti ukljudeno u egzacerbacije inicijalnih oSteienja stvaranjem reaktivnih kisikovih vrsta. Nadalje, poznato je da su endotelne stanice osjetljive na oiteienja zbog reaktivnih kisikovih vrsta i lipidnih hidroperoksida. Tako lipidni hidroperoksid prisutan u lipoproteinimaplazme moie pridonijeti inicijalnom oSteienju endotela. Makrofagi imaju veLnuulogu u razvoju aterosklerotiikih oiteienja. Aktivirani monociti i makrofagi mogu o5tetiti susjedne endotelne stanice ludenjem superoksida, vodikova peroksida i hidrolitidkih enzima, dok faktori koje otpu5taju makrofagi mogu stimulirati proliferaciju glatkih mi5iinih stanica. Makrofagi imaju receptore za lipoproteine niske gustoie, LDL, ali, ako je LDL vei promijenjen zboglipidne peroksidacije prepoznaje ga posebna vrsta receptora poznatih kao ,rscauenger