Tratat de Microbiologie Clinica Dumitru Buiuc Marian Negut Ed a II A

DUMITRU BUIUC MARIAN NEGU_~

EDITIA A II-A

\\

EDITURA MEDICALA

DUMITRU BUIUC Membru al Academiei de Stiinte Medicale Profesor u'M.F. "Gr. T. Popa", Ia§i Catedra de microbiologie

MARIAN NEGUT

Membru al Academiei de Stiinte Medicale Profesor U.M.F. "Carod Davila", Bucure§ti Catedra de microbiologie Director Adjunct Institutul Cantacuzino Bucure§ti

TRATAT DE

MICROBIOLOGIE \J

CLINICA EDITIA A II-A REVIZUITA SI ADAUGITA

EDITURA MEDICAL\. BUCURE~TI 2008

CUPRINS

Partea I: GENERALIT A.TI 1. Logica Microbiologiei

clinice (Dumitru

Buiue)

.

2. Labqratorul de microbiologie clinicii (Dumitru Buiuc) 3. Sterilizarea. dezinfectia ~i spiilarea in circuitnl materialelor din laboratorul de microbiologic (Dumitru Buiue) 4. Microscopie (Dumitru Buiue) 5. Izolarea bacteriilor ~i studiul culturilor (Dumitru Buiue) 6. Cuantificarea microorganismelor (Dumitru Buiue) 7. Tehnici bazate pe studiul acizilor nucleici utilizate in diagnosticul ~i supravegherea microbiologicii a bolilor infcctioase (Maria Damian) 8. Diagnosticul infectiilor virale. chlamidiale ~i rickcttsienc in laboratorul clinic (Dumitru Buiuc)

35 62 80

n 117 125 1SO

Partea a II-a: INVESTIGAREA ETlOLOGICA. A PRINCIPALELOR SINDROAME INFECTIOASE 9. Hcmocultura in diagnosticul infectiei (Dumitru Buiue) . 10. Examenul lichidului cefalo-rahidian in diagnosticul infectiilor sistemului nervos central (Dumitru Buiuc) . II. Examenul microbiologic al pmoiului (Dumitru Buiuc) . 12. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respirator superior ~i cavitiqilor concctc (Dumitru Buiuc) . 13. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respirator inferior (Dumitru Buiuc) . 14. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului urinar (Dumitru Buiuc) . 15. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului genital masculin (Dumitru Buiuc) . 16. Diagnosticul de laborator al infeqiilor tractusului genital feminin (Gabriela Coman) . 17. Diagnosticul de laborator al infectiilor oculare (Dumitru Buiuc) . 18. Diagnosticul de laborator al infeqiilor bacteriene in patologia gastro-duodenalii (Gabriela Coman) 19. Diagnosticul de laborator in sindromul diareic infectios (Marian Negut) . 20. Diagnosticul de laborator a1toxiinfeqiilor alimentare (Dumitru Buiuc, Marian Ncgut) .

165 182 195

208 224 255 278 286 299 317

,~~ I

_'l..;..

363

Partea a III-a: APORTUL LABORATORULUI CLINIC LA INITIEREA SI MONITORIZAREA TERAPIEI ANTlMICROBIENE. REZULTATELE TESTA.RII DE RUTlNA. A REZISTENTEI LA ANTIBIOTlCE CA TEZAUR PUBLIC PENTRU SUPRAVEGHEREA SI CONTROLUL

REZISTENTEI

LA ANTlBIOTlCE

21. Elementele de standardizarc a tchnicilor de laborator pcntru orientarea ~i monitorizarea tcrapiei antimicrobiene (Irina Coditii, Dumitru Buiuc) 22. Determinarea sensibilitiitii la antibiotice: tehnici cantitative (Irina Coditii, Dumitru Buiuc) 23. Detel111inarea sensibilitiitii la antibiotice: teste calitative (Irina Coditii, Dumitru Buiuc) 24. Testiiri pentlU monitorizarea tratamentului antimicrobian (Dumitru Buiuc)

387 420 453 483

Xl

Partea a IV-a: METODE IMUNOLOGICE. METODE ALE BIOLOGIEI MOLECULARE. METODE CROMATOGRAFICE ~I DE DEVELOPARE ENZIMATICA IN MICROBIOLOGIA CLINICA 25. Reaqiile antigen-anticorp pentru depistarea rapidii a antigenelor microbiene $i serodiagnosticul infeqiilor (Luminita Smaranda lancu) 26. Metode moleculare utilizate in diagnosticul $i supravegherea microbiologicii a patogenilor entcrici (Maria Damian, Codruta-Romanita Usein, Marian C\'egut) : 27. Identificarea rapidii a microorganismelor prin cromatografie $i testarea enzimelor prin substrate cromogene sau fluorogene (Olivia Dorneanu)

497 532 545

Partea a V-a: IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR IN LABORATORUL CLINIC 28. Identificarea cocilor gram-pozitivi aerobi $i facultativ anaerobi (Irina Coditii, Dumitru Buiuc, Carmen Panzaru, Vasilica Ungureanu) . 29. Identificarea cocilor gram-negativi aerobi (Marian Negut, Ileana Levenet, Alexandru Rafilal 30. Identificarea bacililor gram-pozitivi aerobi (Angela Diaconescu, Dumitru Buiuc, Carmen Pauzaru, Maria Damian, Dana Magdalena Caplan) . 31. Identificarea bacililor gram-negativi aerobi glucozo-fennentativi (Marian Negut, Dumitru Buiuc) 32. Identificarea bacililor gram-negativi aerobi glucozonefermentativ (Dumitru Buiuc, Marian Negut, Gabriel lonescu) . 33. Identificarea bacililor gram-negativi aerobi sau facultativ anaerobi pretentio~i nutritiv (Nicolae Mihancea, Georgeta Mihai, Veronica Alecu, Liviu A. Sicinschi, Dumitru Buiuc, Marian Negut, Olivia Vizitiu) . 34. Identificarea bacililor acido-rezistenti (Lorena Gabriela Popa, Mircea loan Popa) . 35. Identificarea bacteriilor anaerobe (Alexandra Macovei) . 36. Identificarea microplasmelor $i ureaplasmelor (Daniela Biidescu) . 37. Identificarea spirochetelor (Nicoleta Andreescu, Maria lonescu, Dan Ionescu, Sanda Hristescu) 38. Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de fungi (Mihai Mare~, Olimpia Bazgan) . 39. Bacterii $i fungi cu perete defectiv (Maria Dan, Mihai Mare~) .

562 6m: 619

695 765

796 ~81 900

92~ 935 953 1031

Partea a VI-a: MEDII DE CULTURA. TESTE DE IDENTIFICARE. COLORATII. DILUANTI 40. Medii de culturii, medii de transport $i conservare (Alexandru Rafila) 41. Teste de identificare a microorganismelor (Dumitru Buiuc) 42. Coloratii, coloranti $i reactivi pentru microscopie, micrometrie (Dumitru Buiuc, Carmel]\ Panzaru) 43. Diluenti utili in microbiologia c1inica (Dumitru Buiuc)

XII

1045 1085 1173

1216

j

Partea I

GENERALITA.TI

1. LOGICA MICROBIOLOGIEI CLINICE (DUMITRU BUIUC)

1.1. DEFINITIE 1.2. METODELE M1CROBIOLOG1E1 CLINICE Metode directe Metode indirecte Necesitatea urgentei Neccsitatea preciziei 1.3. VARIA TII, ERORI $1 CONTROLUL LOR IN MICROBlOLOGIA CLlNICt,. Variarii biologice Varia\ii preanalitice Variarii analitice Varia\ii post-analitice 1.3.1. Fluxul informational c1inicii laborator 1.3.2. Performanta testelor de laborator Sensibilitatea Specificitatea PrediC\ia po ziti va PrediC\ia negativa Eficacitatea Rclatii prevalentii-eflcacitate Fiabilitatea Reproductibilitatea 1.3.3. Standardizarea ~i controlul de calitate in microbiologia clinicii 1.3.3.1. De/initii generale 1.3.3.2. ReferentialI' ~'i norme de calilate 1.3.3.3. CO/llrolul variLl{iilor preanalilice Norme de prelevare a probelor pentru exumcl1ul microbiologic Transp0l1ul ~i conservarea probelor Triajul de calitate a! probelor

Criterii ~i proccdura probelor

dc respll1gcrc

a

1.3.3.4. CO/1t1vllll \'ariatiilor analiriec Controlul de calitate 211reactivilor Controlul laborator

performanrei

aparaturii

de

1.3.3.5. CO/llrollli variatiilor posr-wwliticc 1.3A. Criterii obiectiye pentrll interpretan'a rezultatelor in microbiologia c1inica 1.3A.1. Relatiile mieroO/;r;anism-ga::deJ [filial/II. illiel7)lIrrllnderea

1.3A.2. Arglllllenrarea

!lil/amica

Cfi

semnUiea!iei

lIlieroo/ganislllc!or

oporll/nisrc

lur clil/iee

(/

dcpisl(IIC

/ntr-un prelevar parologie

1.3A.3. Arglllllentareu alliicorpi/or

semnUiell!iei depislaji

c/iniee

II

la un paeiclII

1.3.5. SlIperyizarea actiYitatii ~i pregatirea continua a personaluilli de laborator 1.3.6. Comllnicarea c1aJ'a a rezllitatclor 1.3.7. Relatiile laborator-c1inicii in controllli de calitate al investiga(iei microbiologice IA. UTILIZAREA ADECVATA A LARORATORULU1 DE MICROBIOLOGIE CLINICA 1.4.1. Rela(ia cost-beneficiu IA.l.1.

/ndicarea

(eficicn!a)

UdeCl'Ul17 ailll'csriga{iilol'

lIliL'robiologice

lA.

I .2. Tria}u! de culirate 01 prc/eVIIle!or

IA.l.3. Programlll de Illerll u!lobor(/fol'lll"i ] A.l.4. Alegerea lestc/or pel/Ii'll il/l'esrigo(io micmbiologieci

""""""

~

.,7,)

1.1. DEFINITIE

Microbi%gia clinicii este a disciplina a medicinei de laborator, care trebuie sa ofere cat mai rapid .yi precis informatiile necesare pentru decizia clinica la un pacient Cll boala infectioasa. AIgoritmuI investigatiei microbiologice pentru clinic§. are urmatoarele faze principale: (1) ipoteza clinica, (2) ordonanta ~i cererea de analiza, (3) pre levarea, etichctarea, conservarea ~itransportul probelor, (4) i'nregistrarea ~iexaminarea probelor. (5) concluziile trase, etapizat, de microbiolog din rezultatele obtinute, (6) redactarea buletinului de analiza, (7) insu~irea concluziilor de catre medic ~i (8) efectullor asupra deciziei clinice (fig. 1-1). 1.2. METODELE MICROBIOLOGIEI

CLINICE

Metodele de investigatie i'n microbiologie clinica sunt directe ~i indirecte. Metodele directe presupun: I) Depistarea rapida a microorganismelor prin: • microscopie, e.g., preparate microscopice necolorate (umede, intre lama :;;i]al11ela) sau diferit colorate;

PRE LEVARE DE PROBE ADECVATE: MARCARE, CONSERVARE, TRAt-bPORT LA LABORATDR

REZULTAT

PREll MINAR,

DACA ESTE FDSIBIL

,\ EX"MEN

MA CRO sCaPI

c,

MICROSCOPIC, ALTE METDDE PAPIOE

Fig. 1-1. Algoritmul

2

CULTIVARE PENTRU IZOLARE •

DIRECT REZULTAT OAc4

PRELIMINAP.

ES1E FDSIBIL

MEDII ADECVATE ATMOSFERA. TEMPERA TIMP

investigatiei

in microbiologia

rUM,

clinicii.

• tehnici imunologice pentru depistarea $i identificarea antigenelor microbienc: • tehnici de depistare a unor metaboliti sau structuri moleculare specifice. e.g., a acizilor gra$i volatili, a acidului tuberculostearic prin cromatografie gaz-lichicl: a endotoxinei prin testul Limulus; • tehnici de biologie moleculara, e.g., sonde de acizi nucleici, reactia de amplificare genica numita Polymerase Chain Reaction (peR). 2) ]zolarea microorganismelor in cuhura pura cu: • identificarea izolatelor; • preeizarea semnificatiei lor clinice; • antibiograma, cand terapia antimicrobiana este posibila $i necesara. Metodele indirecte includ telmici pentru depistarea, caracterizarea $i cuantificarea efectorilor imunitari: anticorpi (diagnosticul serologic), limfocite specific sensibilizate (e.g., diagnostic prin reactii intradermice). Necesitatea urgentei apare in raport cu impactul asupra deciziei clinice $i sub rapoli economic. In raport cu impactul asupra deciziei cfinice, informatiile furnizate de examenul microbiologic Ie putem aprecia la trei nivele: 1) Foarte urgente. Orienteaza in 1-4 ore decizia clinic a prin rezultatele tehniciJor rapide de depistare directa a microorganismelor in prelevatele patologice. 2) Urgente. Orienteaza decizia clinica in interval de 18-36 ore prin iclentificarca prezumtiva a izolatelor cu semnificatie clinica, mai ales daca testuJ b-Iactamazei sau antibiograma sunt posibile pe primoculturi. 3) Fara constrangere. Influenteaza decizia clinica abia dupa 2-5 zile saL!mai mult prin identificarea definitiva a speciei, antibiograma pe subcultura, determinarea nivclului de eficienta -cida a umorilor in cursul antibioticoterapiei, serodiagnosticul. Investigatiile fomie urgent $i urgente sunt esentiale in bolile infectioase acutc grave (e.g., septicemii, meningite, pneumonii, unele diarei acute) sau in infectii cronice grave determinate de organisme cu cre$tere lenta (e.g., meningite tuberculoase) - tabelul 1-]. Sub raport economic investigatiile care dau mai rapid rezultate utile deciziei clinicc sunt de preferat atat prin economia de materiale, cat $i prin scurtarea spitalizarii (e.g., antibiograma pe cultura primara in infectiile tractusului urinar). Comparativ cu laboratoarele de biochimie, hematologie $. a., in laboratorul de microbiologie clinica variatiile $i erorile au conditionare mult mai complexa, care decurge. in principal, din interferenta $i dinamica relatiilor dintre simbiontii omului, diversitatea agentilor infectio$i cu prevalenta in cre$tere a celor conditionat patogcni. dinall1ica procesului infectios, diversitatea produselor patologice $i a tipurilor de prelcvatc, fragilitatea unoI' agenti infectio$i. De aceea, in cele ce urmeaza, vom aborda separat acestc probleme.

.j::.

robe/III 1-1 I':~lliollarcli illvcstigatiilor III microbiologia c1inica III raport cu impactul asupra dccizici c1illicc Nivelul il1lportan(ei morfi Idcntificarea dcfinitivii a speciei defercn!iere absen!a lade~-Iactamaza 3Transport 0aprezumtivii exsudaVincent: bacili Exsudatul seroasclor sau 2-3Itura Inainte limita cuConfirmare Nivel Baclerioscopie -eid Identificarca dcfinitivii a Examen biochimic monitor Hcmoculturi dc~iInainte antiAntibiogral11a intravcnoase a mononucleoza -eidserolipului Proteina CdiInainte Oaea1000 sunt suficiente bactcrii reactival) Idcntifiearca seric -cid dcfinitivii Cultivare sel11icanlitativii Prczum( icdeCateterul infee!ioasii Oiprezum(iei deprin:Fara speCIeI tampoane 18-24' o/ re)ml microscopia Antigen so!ubil idenlifi~Ipozitiva il1lediat fara refricroseopieii, sonde de AON, granl-negativi Antibiogram:l plcoAntigene IdcllliJ' iIcucograma solubile toxigcncza ba a Foarle Idcnlifieare antibioterapie Citologie cantitativa ~idecalitativii inscqiei angina carea b.carca lterie lest deinser(iei >llcmocu organisme eonstnlngere Urgent tului; ~-lactal11azii Antibiogral11ii ~-lactal11aza Idcntificare prezul11tivii (l11iAntibiogramii"1 Idcntifiearc l1licroscopicii Antibiograma urgentde C01) M(hel110culturi ieroscopic: al11prenta ~-Iactamaza ~-lactal11azii (::: 2-3 zite) Prelevate ~i exigen!e (1-3 ore) dcspeciei If. injllll'l1;'{{{'

IItI,dllll Foarte urgent NJ~~!,lillll)(lI'(;lllIC i semJfoar-te refri-curatii izolatului lorClel inflamatorii hematii, Confirlllarea microscopicii asociate ficativ clinic din sauare, dcalzolare Vezi HCllloculturiVezi HcmocuJturi lobacter sau vibrioni Identificarea aerobilor scuazumtivii semniilllediat tului selllnificativ cantitativii dehemoeulturi Vezi hemoeulturi sau ;::10-15 0 sau+dcfinitivii deepiteliale (IX-24 ore) 1:;' 11'de:eelule1substan(e cOlIsln' Iradiol'campispeeiei polilllorfonucIeSuspiciune shigele, ldentificarea definitivii aeantitativii spc-2Urgent opace intestinale sauholeriei Identificare aaclinic izolapansalllentc diagnosticului Pune(ie-aspira(ie Antibiogramii Inaintea antijetCitobaetcrioscopie: mijlociu/aspirat suprapubian polilllorfonlicieare Antigene solubile probii baetcrii din euprczllmtivii idcntifieare categorie pre-a Antibiograma Prczen(a Prelevate ~iexigen(e exigen(e germel1l biotcrapici; Illobili, prin Idcntiticarea identificarea vibrioni transdefinitivii spirili Identiticarea dcfinitivii bacterii speAntibiogralllii2) inainte de ealitate antibioterapie: C?Citobacterioscopic 3ldelIgl' ,ilt:J_ ...aceea~i Antibiogramii Entitatea Citobacterioseopie: Hemoclilturi In interval cat Illai Urinii: scurt -Transport Uriniiposibil ~i siinge

eoee (1-2 zile

II Dac;'j sunt posibilc dC1Z

100000

1~:'

( 10000

30

10000l

30

~m-

'X)-29

( 10000

5-21, 0- I.

UfUrnl >100000

0- 9

Fig. 14-6. Dispozitia amprentelor de urina pe suprafata pHicii eu mediul agarizat. Cheia pentru interpretarea rezultatelor. 273

6) Mai mult de doua bacterii sunt prezente in concentratii ;;::104 UFC/mL. Comunici'i: Probii contaminatii ~icere 0 noua proba cu respectarea riguroasa a nonnelor de prelevare ~i transport. Dezavantajele metodei decurg din suprafata mica a amprentei cultivate: • Substante antimicrobiene eventual prezente in urina raman concentrate ~i pot detel111inarezultate fals negative. Solutia este numai partiala: confnmtarea atenta eu rezultate1e microscopiei ~i cu1tura de pe placa de epuizare a probei. • La eoncentra!ii bacteriene mari in proM cre~terea pe suprafata amprentei este confluenta ~i nu sesizam corect cultura mixta. Solutia este de asemenea partiala: confruntarea cu cre~terea pe placa de epuizare a probei. 14.4. DIFERENTIEREA BACTERIURIEI VEZICALE DE BACTERIURIA RENALA Trei dintre metode1e majore de localizare a infectiei in eaile urinare fac apel la laboratorul de microbiologie: a) Prelevarea prin catetere uretera1e a probe1or pentru uroculturi cantitative. Este metoda de referinta, dar implica anumite riseuri pentru pacient. Are indicatii strict limitate. b) Pre1evarea probe1or pentru urocu1tura cantitativa prin cateter Foley cu spalarea VeZICll.

c) Detectarea in sedimentu1 urinar a bacteriilor coafate cu anticorpi. Detectarea raspunsu1ui imun seric ca indicator pentru infeqia urinara inalta are 0 efi.cienta nesatisflicatoare.

14.4.1. Prelevarea pro belor • Preleviiri prin cateterizare ureteralii 1) Cistoscopu1 este introdus In vezicii 2) Se pre1eva 0 proM de urina vezica1a, proba 1, pentru urocu1tura cantitativa. 3) Se introduc cateterele ureterale in veziea. 4) Se irigii vezica cu 50-100 mL solutie salina sterila care, co lectata prin cateterele ureterale, f0l111eaZaproba 2 (de spalare a vezicii) pentru izolare eantitativa. 5) Se eonduc eateterele uretera1e in bazinetele renale. 6) Se preleva seriat 4 perechi de probe a 5-10 mL prin cateterele ureterale, respectiv: rinichiul drept (RD) 1-4:ji rinichiul stang (RS) 1-4 pentru uroeultura cantitativa. Tuburile cu probele marc ate sunt expediate laboratorului, avizat in prealabil pentru examinare imediata. Orice temporizare a examinarii impune refrigerarea probelor imediat dupa recoltare. • Preleviiri prin cateter Foley cu spalarea vezicii urinare. 1) Pacientul este cateterizat eu sonda Foley. 2) Se preleva urina vezicala, proba 1 sau prespalare, pentru uroeultura cantitativa. 274

3) In vezica golita se instileaza 50 mL solu!ie salina izotona sterila cu 40 mg neomicina ~i 20 mg polimixina B, 125 000 U streptokinaza ~i 30 000 U dexoxiribonucleaza ~i se penseaza cateterul pentru 30 minute. 4) Se spala vezica eu 2 litri de apa sterila. 5) Se preleva 3 probe de urina la intervale de 10 minute, probele 2-4 sau probele postspalare, pentru uroculturi cantitative. • Prelevarea pentru depistarea baeteriilor eoafate eu antieorpi: proba prinsa In zbor dinjetul mij1ociu.

14.4.2. Examinarea probelor ~iinterpretarea rezultatelor Efectueaza urocultura cantitativa pentru toate probele ob!inute prin cateterizare. Pentru a surprinde minimum 102 UFC/mL urina, epuizeaza cate 0,1 mL din proba nediluata ~idin dilu!iile 1O.J ~i 10-2. • Loealizarea ITU prin eateterizare ureterala: - Bacteriuria veziealii este definita prin: Proba 1 cu ~105 UFC/mL, proba 2 cu < 103 UFC/mL ~i proba RD !ji RS sterile. - Loealizarea renalii bilatera1a a infee!iei: toate probele RD!ji RS ell ~ 102 UFC/mL. - Localizare rena1a unilaterala a infec!iei: probele RD sau RS eu ~ 102 UFC/mL ~i probele eontralaterale sterile. • Diferentierea baeteriuriei renale de eea vezieala prin spalarea vezieii: - Bacteriuria vezieala: proba 1 (prespalare) eu ~ 105 UFC/mL ~i probele 2-4 (postspalare) sterile. - Localizarea renala a infec!iei: proba 1 cu ~ 105UFC/mL ~i probele 2-4 cu ~ 103 UFC/mL. La cca 10-20% din pacien!i rezultatele raman echivoce. • Depistarea £n urina a baeteriilOl' eoafate eu antieorpi 1) Centrifugheaza 0,5-1,0 mL urina 10 minute la 2500 xg. 2) Decanteaza ~i spa1a sedimentul de doua ori cu tampon fosfat salin pH 7,3 prin agitare ~i centrifugare. 3) Resuspensioneaza sedimentulln 0,2 mL imunoeonjugat antigammaglobulina umana diluat la titru ~i incubeaza 30 minute la 37°C. 4) Centrifugheza ~i spala sedimentul de doua ori cu tampon fosfat salinpH 7,3. 5) Efectueaza frotiuri. Usuca. Fixeaza cu acetona. Examineaza la microscopul pentru fluorescen!a cu obiectiv X 60 I.u. Prezen!a bacteriilor fluorescente indica pielonefrita. Sensibilitatea testului este de 0,88, iar specificitatea numai de 0,76. Rezultate pozitive apar ~i la pacien!ii cu prostatita. 14.5. EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL URINEI PENTRU IZOLAREA UNOR PATOGENI SPECIFICI

14.5.1. Urocultura pentru diagnosticul tuberculozei renale Este indicata examinarea a trei probe matinale consecutive de urina din jet mijlociu In volum de cca 50 mL fiecare. Sensibilitatea depistarii cre~te daca pacientului i se impune un regim hidric restrictiv In dupa-amiaza precedenta prelevarii probei. 275

;mi.------

·"'""._011.

Transportul $i conservarea probelor cu acelea~i precautii ca ~i pentru urocultura cantitativa evita utilizarea unei decontaminari drastice care influenteaza negativ sensibilitatea izolarii bacililor tuberculozei. Concentrarea: Centrifugheaza proba 15 minute la 13 000 xg. Dupa decantare, adauga la sediment 0 picatura din solutia 0,2% albastru de bromtimol ~i, daca este acid, neutralizeaza pana la culoarea verde cu solutie 0,1 N de NaOH. Congeleaza sedimentul neutralizat. Procedeaza in acela~i mod cu fiecare proM a pacientului adaugand noul sediment peste depozitul congelat. Decontaminarea: Procedeaza cum este indicat la 13.4.2. Daca pacientul are ~i 0 infectie cu bacili coliformi a cailor urinare, diagnosticata anterior, prelungqte decontaminarea la 15 minute. lnsamanteaza sedimentul neutralizat pe 5-6 tuburi cu mediul Lowenstein-Jensen, iar cu 0 piciitura efectueaza un frotiu ~i coloreaza-l Ziehl-Nielsen. Semnificatia clinica a bacililor acido-rezistenti depistati microscopic nu este certa deoarece micobacterii saprofite pot contamina probele de urina. Urmarirea culturilor: Revezi 13.4.3.

14.5.2. Urocultura pentru depistarea bacililor tifid la bolnav sau purtator In cursul febrelor enterice, bacilii tifici ~iparatifici se elimina prin urina din a doua saptamana de boala, iar 0 parte din pacienti raman pmiatori urinari. Proba din jet mijlociu, proaspat recoltata, in volum de cel putin 20 mL, trebuie centrifugata 30 minute la 3 000 xg. lnsamanteaza tot sedimentul in 10 mL bulion selenit pentru imbogatire timp de 12-18 ore la 37°C. Epuizeaza 2-3 picaturi din mediul de imbogatire pe placa cu agar Mac Conkey sau SS cu incubare de 24 ore la 37"C ~i, eventual, in continuare inca 24 ore la temperatura camerei. Triaza biochimic izolatele in vederea identificarii confonn precizarilor de la 19.3.3.1.3.

14.5.3. Examenul urinei pentru depistarea leptospirelor in cursulleptospirozelor,

leptospirele sunt eliminate prin mina din a doua saptamana

a bolii. Aceste organisme mol' repede in mediu acid. De aceea, in vederea prelevarii corecte a probei, pacientului i se administreaza citrat de potasiu pentru alcalinizarea unnel. Centrifugheaza 30 minute la 3 000 xg 0 proM de cca 20 mL urina proaspat recoltata din jetul mijlociu. Decanteaza imediat sedimentul ~i: • insamanteaza cateva picaturi in mediul Korthof cu 200-400 ~lg5-tluorouracil/mL ca inhibitor selectiv al bacteriilor de contaminare . • injecteaza 1 mL intraperitonealla 276

cobai.

liiii••••••

• efeetueaza ~i examineaza la microseopul eu fond negru un preparat intre lama ~i lamela. Microseopia direeta este relativ putin sensibilii. Urmare~te pana la 30 zile, prin mieroseopie pe fond negru, eultura ineubata la 30°C ~i intunerie. Dupa a patra zi de la inoeulare punetioneaza eobaiul pentru prelevare de exsudat peritoneal in care leptospirele pot fi u~or observate la microscopul cu fond negru. in raport cu patogenitatea tulpinii infectante, cobaii pot muD dupa 10-14 zile de la inoeulare. Urmare~te, la necropsie, prezenta leptospirelor in exsudatul peritoneal ~iprezenta leziunilor caracteristice (icter, hemoragii). Manipularea probelor, in special a animalelor inoculate, trebuie fiicuta eu atentie pentru a evita infectiile de laborator. Identificarea leptospirelor este de competeta laboratoarelor specializate.

15. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR TRACTUSULUI GENITAL MASCULIN (DUMITRU BUIUC) 15.1. INTRODUCERE 15.2. URETRITE 15.2.1. 15.2.2. 15.2.3. 15.2.4.

Consideratii clinice ~i etiopatogenetice Prelevarea ~i transportul probelor Examenul uzua! al exsudatului uretra! Examene ale exsudatului uretral la

cerere speciala 15.2.5. Examenul probelor 15.3. PROSTATITE

seriate de urina

15.3.1. Consideratii clinice ~i etiopatogenetice 15.3.2. Prelevarea seriata a probelor pentru diferentierea infectiei prostatice de infectia segmentelor inferioare ale tractusului urinal' 15.3.3. Examinarea probelor 15.3.4. Interpretarea rezultatelor 15.4. EPIDIDIMITE 15.5. ORHITE

15.1. INTRODUCERE Raporturile anatomice ~i conditia microbiologidi fac din uretra principala cale de acces a infectiei nu numai catre tractusul urinar proximal, ci ~i catre tractusul genital mas cuIin (fig. 15-1). Particulariti'iti1e functionale expun uretra unor microorganisme 11

10

12

13 14

9

15

8 16

7

17

18 6

19

5 4

3 2 1

20

Fig. 15-1. Raporturile anatomice intre caile urinare ~i genitale la barbat: I) vaginala testiculului; 2) testiculul; 3) meatul urinal'; 4)glandul; 5) pliul balanopreputial; 6) metra peniana; 7) uretra prostatica; 8) pachetul vascularal testiculului: 9) simtlza pubianii; 10) peretele abdominal; II) canalul deferent in poI1iunea abdominala: 12) vezica urinarii; 13) ureteml; 14) vezica seminalii; 15) canalul ejaculator; l6) rectul: 17) glanda lui Cowper; 18) canalul excretor al glandei lui Cowper; 19) canalul anal; 20) epididimu\.

278

patogene care gasesc la acest nivel conditii favorabile ~i initiaza infectii, aproape to ate cu transmitere sexualii. Propagarea infectiilor uretrei se face predominant spre organele genitale ~i nu catre ciiile urinare, unde agentii lor etiologici nu se pot implanta. Acestea sunt motivele pentru care am inclus investigatia microbiologica a segmentului inferior al cailor urinare, uretra, alaturi de cea a organelor genitale masculine. Tractusul genital masculin (prostata, canalele ejaculatoare, veziculele seminale, canalele deferente, epididimul, testiculele) sunt nonnal sterile, conditie asigurata prin actiunea mecanicii a mictiunii ~i ejacularii, prin lipsa colonizarii microbiene a uretrei proximale nom1ale, dar mai ales prin aqiunea antibacteriana a unui polipeptid, care confine zinc, eliminat prin secre!ia prostatica. Vom urmari, pe rand, particularita!ile examenului microbiologic al uretritelor, prostatitelor, epididimitelor ~iorhitelor. 15.2. URETRITELE

15.2.1. Consideratii eHnice ~i etio-patogenetice Pacientii cu uretrita acuza disurie ~i scurgeri uretrale. Disliria are intensita!i ~i fonne de manifestare variate: durere, prurit sau fumicaturi uretrale in cursul miqiunii, po sibil ~iintre miqiuni. Disuria nu este specifica uretritelor: poate sa apara ~i ca simptom al cistitelor sau dupa excretia unei urine hiperconcentrate, a un or sub stante iritante, irita!ii provocate de chimicale din vaginul partenerei sexuale. SClirgerea uretralii uneori este foarte discreta, alteori este abundenta. Poate fi purulenta (alba, galbena, verzuie, bruna), muco-purulenta sau clara, filanta. Scurgeri uretrale clare, filante apar in cursul excitatiei sexuale. La cei obsedati de infectii veneriene 0 scurgere mucoida, clara, cu pu!ine polimorfonucleare, este cauzata prin tentativele repetate de exprimare viguroasa a uretrei. Eliminarea unei urine cu mare concentra!ie de saruri poate sugera 0 scurgere uretrala purulenta. Sub raport etiologic, diagnostic ~i terapeutic, diferentiem uretritele in gonococice, non-gonococice ~ipost-gonococice. RapOlwli'ntre etiologia gonococica ~inon-gonococica a uretritelor este in funqie de nivelul socio-economic al colectivitatii. Uretritele gonococice au incubatie scurta de cca 4 zi1e ~i evolueaza acut cu disurie marcanta. Peste 70% din pacienti au ~i scurgere uretrala, uzual purulenta. Numai la cca 5-10% din barbati infectia gonococica a uretrei este inaparenta. N etratata , gonoreea se cronicizeaza ~i se complicii prin propagare, pe cale canaliculara ~i limfatica, la prostata ~i epididim. Mai rara, dar grava prin localizarile metastatice (articulare ~.a.), este generalizarea infeqiei pe cale sanguina. Sechele suparatoare ale gonoreei cronice SW1tstricturile uretrale. Uretritele non-gonococice au incubatie semnificativ mai lunga decat cele gonococice: pana la 7-14 zile. Disuria este mai putin intensa ~ii'nsorita, numai la 38% din pacienti, de scurxgere uretrala, care este purulenta doar la 11-33% din cazuri. 279

Chlamydia trachomatis determina pana la 50% din uretritele non-gonococice. Restul sunt determinate de Ureaplasma urealyticulIl, Mycoplasma gellitalium, Trichomonas vaginalis, vialsul Herpes simplex (mai ales in infectia primara). La pacienti eu fimoza sau cu stricturi uretrale ~ileziuni ale mucoasei dupa instrumentatii, bacili gramnegativi pot detennina reactii inflamatorii, chiar abcese periuretrale. Rar sifilisul poate debuta cu ~ancru uretral. Uretritele post-gollococice sunt frecvente in conditii de promiscuitate sexuala: • Uneori din cauza unei duble infectii din care a doua, determinata de C. trachomatis. U. urealyticwll ~.a., se manifesta, din cauza perioadei de incubatie mai lungi, dupa vindecarea terapeutica a gonoreei. Am intalnit ~i uretrite detenninate de Cryptococcus neofonnans favorizate, probabil, de terapia cu tetraciclina a gonoreei. • Alteori sunt reinfectii gonoeoeiee. datil eu aparitia ~iraspandirea tulpinilor de gonocoei produeatoare de ~-Iactamaze ~imultiplu rezistente la antibiotiee, este po sibil ~iun e~ec terapeutie. Predietia pozitiva, de numai 0,73, a disuriei ~i caracterelor scurgerii uretrale este insufieientil pentru diagnostieul diferential eorect al uretritelor.De aici decurge necesitatea investigatiei de laborator, singura care poate eonfirma diagnostieul de uretrita la pacienti eu seurgeri uretrale minime~i orienta eoreet terapia antimicrobiana.

•0

15.2.2. Prelevarea ~i transportul probelor Examinarea uretrei ~i prelevarea probelor de la acest nivel trebuie tacute la cel putin 2 ore dupa mietiune. in eaz de dubii, la pacienti cu scurgere discreta. bolnavul trebuie instruetat sa reducii liehidele ingerate pana in ziua unnatoare, cand este program at pentru examinare ~i prelevare inainte de mictiunea matinaUi. Plaseaza pacientul pentru a putea observa bine penisul $i meatul urinal' aproximativ la nivelul oehilor. Preleva pe tampon scurgerea uretrala spontana sau provocata prin mulgerea blfmda a uretrei mtre degetul mare $i index, inmanu$ate $i plasate respeetiv pe fata dorsal a $i ventral a a penisului. Daea in aeest mod nu apare seurgere, apuea U$orpenisul intre degetele medius ~iinelar, iar eu degetul mare $i indexul deschide meatul urinar pentru examinare. In afara exeitatiei sexuale sau a mietiunii reeente, meatul nu trebuie sa contina fluid vizibil. Daca, in afara eelor doua conditii mentionate mai sus, in meat exista fluid, preleva-I pe tampon. Cand 0 proba nu poate fi prelevata de la nivelul meatului, recurgem la prelevarea intrauretrala eu tamponul, cu ansa sau cu 0 chiureta oftalmo logic a tocita. Aceste prelevaI'i pot fi neplaeute $i pacientul trebuie prevenit. Sunt mai u~or efectuate cu pacientul in decubitus dorsal. Un tampon fin din vata sau, preferabil, din alginat de calciu este inserat bland cca 2 cm in uretra, tara a forta treeerea in eaz de obstacol. Rote~te $i retrage tamponul. Daca examinarile planifieate (microscopie, cultivare) impun prelevarea a doua probe. insera al doilea tampon cu cca cm mai profund decat primul. Altemativ poti folosi 0 ansa din platina, perfect inchisa circular, sterilizata $i complet raeita, introdusa in uretra tot atat de profund.

I

280

Sensibilitatea cu care depistam Chlamydia trachomatis ~i micoplasl11ele cre~te prin numarul celulelor din prelevat: C. trachonzatis se inmulte~te intracelular, iar micoplasmele adera intim la uroepiteliu. De aceea, in acest scop sunt mai indicate probe Ie prelevate pe tampon din dacron sau, mai bine, obtinute prin u~oara raclare, cu chiureta oftalmologidi tocita,de pe primii 2-3 cm ai mucoasei uretrale distale. In suspiciunea infectiei cu Trichomonas vaginaZis prelevarea trebuie lacuta inaintea mictiunii matinale, iar tamponul imersat intr-un tub cu cca 1 mL solutie salina izotona indilzita la 37°C, pentru examen microscopic lara intarziere. lmediat dupa pril11irea in laborator, descarca tamponul in solutia de transport, prin rotiri insistente cu stoarcere finala pe peretele tubului, ~i examineaza suspensia astfel obtinuta. Pentru examenul cito-bacterioscopic efectueaza extemporaneu doua frotiuri prin rularea progresiva a tamponului pe lama ~i nu in striuri. Usuca ~i fixeaza frotiurile prin caldura sau prin clatire cu metanol pentru expedierea la laborator. Probele destinate cultivarii gonococilor trebuie epuizate il11ediatpe placa cu mediul de cultura preincalzit la 37°C sau expediate la laborator in mediul de transport Amies sau Stuart, tara refrigerare. Pentru C. trachomatis este recomandat transportul tamponului in 2 mL de mediu SPG (zaharoza-fosfat-glutamat) sau in mediul 2SP (zaharoza-tampon fosfat ~i ser de vitel). Orice temporizare a examenului impune congelarea probelor la -70°C. Micoplasmele pot fi conservate prin imersia tamponului de prelevare in 2 mL bulion tripticaza-soia. Examinarea poate fi temporizata ciiteva zile, cand proba este conservata la 4°C, sau ani, cand este conge lata la -70°C. Prelevarea urinei in probe seriate pennite diferentierea uretritei de cistita ~i, racuta la prima mictiune matinala, cre~te sensibilitatea depistarii T. vaginaZis. Pregiite~te pacientul ca pentru prelevarea unei probe curate de urina (vezi 14.2.1). Primul jet de urina, cca 10 mL, este prins in container steril, urmatorii 100 mL spala uretra, iar urmiitorii cca 10 mL sunt prin~i in alt container steril. Marcheaza atent probele: 1~i sau "initial a" ~i"finala".

II

15.2.3. Examenul uzual al exsudatului din lumenul uretral Curent, laboratorul clinic trebuie sa ateste prezenta sau absenta gonococului. Suspiciunea altoI' etiologii trebuie sa faca obiectul unei cereri speciale de analiza completata dupa un prealabil contact al clinicianului cu laboratorul. Microscopia. Coloreaza Gram unul din frotiuri ~ipastreaza-I pe celalalt in rezerva. Daca proba a fast purulenta, examinarea poate incepe direct cu imersia. In cazul probe lor muco-purulente sau mucoide, scruteaza mai intai frotiul cu obiectivul lOX pentru reperarea insulelor cu celule inflamatorii. Putem observa celule epiteliale scuamoase din foseta naviculara, celule ale uroepiteliului (cuboide, mai mici, cu nucleu relativ mare ~i cromatina mai putin dens a, ~i leucocite polimorfonucleare. La 60-90% din pacientii cu uretrita acuta observam mai mult de 4 polimorfonucleare/camp microscopic examinat cu imersie.1n conditiile in care numarul minim de polimorfonucleare care semnifica inflamatia uretrei nu este stabilit, la pacientii cu iritatie uretrala depistarea unei reactii inflamatorii minime sugereaza infectia ~i trebuie sa detenriine un examen bacteriologic atent. 281

Prezenta extracelulara a florei mixte, gram-pozitive ~i gram-negative, ocazional a ciitorva celule levurice, in prelevatele din uretra distala estenormala. La pacienti simptomatici, citobacterioscopia pune rapid diagnosticul de gonoree cu 0 eficienta de 0,98 ciind se observa intracelular diplococi gram-negativi in "boabe de cafea", scade la 0,75 in prezenta acestor diplococi numai extracelular ~i la 0,21 cfmd diplococii gramnegativi sunt extracelulari ~i cu morfologie atipica. Cultivarea prohelor. Epuizeaza tamponul cu exsudat uretral pe un mediu adeevat preincalzit la 37°C (e.g., agar Mueller-Hinton + supliment HYL, mediul Thayer-Martin) eu ~itara amestee seleetiv de antibiotice. Ineubeaza pliicile 24-48 ore la 37°C in atmosfera ell 5% COo' Exarilineaza plaeile pentru identifiearea prealabila a coloniilor de Neisseria dupa aspect (eolonii cu diametrul de 1-2 1mll, rotunde, eu margini regulate, netede, lueioase). reactia oxidazei (pozitiva) ~i caracterele morfo-tinetoriale (eoei gram-negativi in pereehi sau izolati). Repica din coloniile suspecte pentru a obtine eultura pura necesara identificarii, testarii ~-lactamazei ~i antibiogramei. De~i mai comoda, izolarea gonococilor numai pe medii selective da pana la 2% rezultate fals negative din cauza inhibarii unor tulpini de catre vancomicina la coneentratia inclusa in mediu.

15.2.4. Examene ale exsudatului uretralla cerere speciala Sunt justificate dnd prezenta gonococului nu a putut fi demonstrata ~i pentru diagnosticul uretritelor post-gonoeocice. Microscopia. Coloreaza Giemsa frotiul de rezerva. Unnarqte atent prezenta incluziilor intracelulare de Chlamydia trachomatis; coloratia imunofluorescenta este mai sensibila ~i specifica, dar putin accesibila laboratoarelor clinice. Pe frotiul colorat Giemsa, incluziile mature de C. trachomatis apar intraeitop lasmic ca vacuole unice care deplaseaza nucleul ~i sunt fomlate din numero~i corpi elementari eozinofili. Pot fi surprinse fonne intennediare, de la corpii initiali ~ireticulati, bazotlli. pana la inc1uzia matura. Ocazional, la pacienti cu uretrita post-gonococica, se observa numeroase eelule levurice, sferice sau ovale, inmugurite ~iinconjurate cu 0 capsula groasa. Poate tl Ciyptococcus neoformans. Examenul unei probe colorate negativ cu tu~ de India contlrma diagnosticul. Aproximativ 5% din uretrite la barbat pot fi determinate de Trichomonas vaginalis. Frotiul colorat Giemsa este putin satistacator ca metoda curenta de diagnostic: protozoarul, depistat ocazional, are marimea unui macrofag, este pirifoml, cu nucleul situat spre polul anterior; ocazional putem observa ~i membrana ondulanta. Indicata pentru depistarea T. vaginalis este microscopia preparatului umed fntre lama ~i lamela la microscop eu platina calda (pana la 37°C) ~i lumina diafragmata corespunzator. La examinarea cu obiectivull OX putem observa organismul ea 0 strLlctura clara, aproximativ cu diametrul unui piocit, antrenata de mi~cari spasmodice. Cando dupa un timp, mi~carile devin l11aiputin vii, cu 0 l11arirel11aiputemica, se poate observa membrana ondulantii. Microscopia in contrast de faza ofera detalii structurale l11aiclare. 282

La padentii eu fimoza prezenta a numero~i bacili gram~negativi pe frotiul direct din exsudatul uretral poate fi semnificativa clinic. Cultivarea probelor. Curent, laboratoarele c1inice nu pot izola C. tracllOlIlatis, micoplasmele sau virusul Herpes simplex implicate in infectii uretrale. La necesitate, probele conservate corespunzator (vezi Cap. 8) pot fi trimise laboratorului de referinta. Controversata semnificatie clinica a mieoplasmelor izolate din prelevatele uretralc este acum rezolvata prin izolarea lor cantitativa. Ureaplasma ureaf.vticum sau Myco. plasl/za genitalium izolate in cantitati de cel putin 10 000 unitati capabile sa vireze culoarea mediului de cultura au semnificatie clinica. In cantitati mai mici sunt organisme de portaj. Trichomonas vaginalis poate fi cultivat pe mediul propus de FEINBERG ~i WHITINGTON (1957) care, prin nutrientiii din hidrolizatul de ficat ~i semi de cal, favorizeaza cultivarea organismului ~i, prin adaosul de antibiotice, inhiM bacteriile asociate.

15.2.5. Examenul probelor seriate de urina Examenul macroscopic. Filamentele de mucus prezente in prima proba, dar absente in a doua, sugereaza uretrita. Centrifugheaza probele 5 minute la cca 300 xg, decanteaza supematantul ~i retine sedimentul. Microscopia. Examineaza comparativ sedimentul probelor pe preparat umed intre lama ~i lamela cu marire de 400X. Prezenta a;::: l5leucocite/camp microscopic numai in prima proba semneaza inflamatia uretrei. 0 limita minima a leucocituriei semnificativa pentru uretrita nu poate fi stabilita, dar prezenta leucocitelor in numar mai mare in prima proM decM in a doua indica uretrita, iar un numar aproximativ egal de leucocite in cele doua probe semnifica localizarea mai inalta a infectiei. La biirbat, T. vaginalis este depistat in sedimentul primei fraqiuni a minei matinale cu 0 sensibilitate de 0,80 prin microscopie ~i de 0,95 prin cultivare. 15.3. PROSTATITE

15.3.1. Consideratii clinice ~i etio-patogenetice Prostatitele evolueaza cu 0 simptomatologie clinica strans intricata cu aceea a infectiilor tractusului urinar infelior. Pacientii acuza dureri perineale, sacro-coccigiene sau in abdomenul inferior, disurie, ejaculare neplacuta, fumicaturi sau dureri iradiate in gland. Obiectiv, au reactie inflamatorie in secretia prostatica ~i majoritatea au bacteriurii ~i piurii intennitellte. Predictia pozitiva pentru prostatita, a simptomelor clillice ~i examenelor citobacteriologice restranse la probe din jetulmijlociu de urina, este nesatisfiicatoare. Deosebim prostatite bacteriene, acute sau cronice.- ~i prostatite non-bacteriene. Prostatodinia este un sindrom caracterizat prin simptomatologie asemanatoare prostatitelor, dar fara reactie inflamatorie in secretia prostatidi. In majoritatea cazurilor infectia prostatei este ascendelltii, cu origine uretralii. eel mai frecvent prostatitele acute sunt gonococice. Etiologia prostatitelor cronice este mai 283

variata: mai freevent sunt implicate Chlamydia trachomatis, spedi de Enterohacteri· aceae, pseudomonade, enterococi; rar Staphylococcus saprophiticus ori Trichomonas vaginalis. Localizari metastatice septice la nivelul prostatei pot sa apara in infectii sistemice ca tuberculoza sau micoze (blastomicoza, coccidioidomicozii, criptococcoza, histoplasl11oza). Prostatitele acute evolueaza bacteriemic, uzual cu toxemie sistemica. Complicariile lor majore sunt: abcese prostatice, infarctul prostatic, prostatita cronica ~i prostatita granulomatoasa. Infeqia tractusului urinal' se asociaza la to ate prostatitele bacteriene, ca episod unic in prostatitele acute sau ca infeqii recurente in prostatitele cronice. Etiologia prostatitelor "non-bacteriene" nu este dar argumentata: ar putea fi in cauza gonococul, bacterii anaerobe, Chlamydia trachomatis. Ureaplasma ureal.vticum, Trichmnonas vaginalis. Candida albicans, dar nu pot fi excluse nici tulburari ale producriei de prostaglandine, tulburaripsihice sau procese autoimune.

15.3.2. Prelevarea seriata a probelor pentru diferentierea infectiei prostatice de infectia segmentelor inferioare ale tractusului urinar Pregate~te pacientul ca pentru prelevarea curata a unei probe de urina (revezi 14.2.1.1). • Proba mic{ionata I (PMI): primii 5-10 mL, de preferat la mictiunea matinala. • Proba micfionata 2 (PM2): proba curata prins a in zbor din jet mijlociu, dupa cca 200 mL urina de spalare a uretrei ~i dupa care pacientul intrerupe mictiunea. • Secre{ia exprimata prin masajul prostatei (SEMP). • Proba micfionata 3 (PM3): primul jet de 5-10 mL urina prelevati imediat dupa exprimarea ~i prelevarea secretiei prostatice. Probele trebuie transportate pentru examinare imediata. La pacientii suspeqi de prostatita acuta sunt indicate ~ihemoculturi.

15.3.3. Examinarea probelor Procedeaza imediat la cuantificarea bacteriilor in toate probele, la citobacterioscopia SEMP ~i a sedimentelor PMI-PM3. Insamanteaza in paralel placi cu agar-sange ~i agar MacConkey cu incubare aeroba peste noapte la 37°C (revezi 14.3.2., 14.3.3). La pacienti cu antecedente de gonoree epuizeaza SEMP pentru izolarea gonococilor (revezi 15.2.3).

15.3.4. Interpretarea rezultatelor Prostatita: SEMP cu ~ 12leucocite/camp microscopic la marire de 400X in absen!a semnelor clinice ~i paraclinice de uretrita (revezi 15.2.5). Prostatodinie: SEMP cu < 12 leucocite/camp microscopic la marire de 400X. 284

Prostatita non~bacteriana; SEMP fara cre~tere bacteriana, dar cu reactie inflamatorie; absenta bacteriuriei semnificative in probele mictionate. Prostatita bacteriana: Numarul bacteriilor din PM3 ~i SEMP de eel putin lOX mai mare dedh in PMl sau PM2. Diferentele mai mici sunt tot mai putin semnificative. Comparativ cu prostatita bacteriana cronicii, in prostatita bacteriana acuta se adauga semne locale (prostata tumefiata, dureroasa la tu~eu, retentie urinara) ~i semne sistemice (frisoane, febra, toxemie, eventual hemoculturi pozitive). Infecfia liniitata fa vezica urinara: Numar de bacteriimai mare in PM2 dedit in PM3. Contaminare uretrala: bacterii prezente numai in PMl. Dacii diferetele dintre numiirul bacteriilm din PM2, PM3 ~i SEMP sunt nesemnificative, repetii preleviirile dupa 2-3 zile de antibioticoterapie activa numai in urina (e.g., nitrofurantoinii). 15.4. EPIDIDIMITE lnfectia epididimului este uzual ascendentii, de la nivelul prostatei sau uretrei. Traumatismele locale (e.g., prin instrumentatie urologicii), mai ales in conditii de bacteriurie, 0 favorizeazii. Etiologic deosebim: • epididimite bacteriene nespecifice cauzate eel mai frecent de bacili co]iformi sau de pseudomonade, ocazional de coci gram-pozitivi; • epididimite cu transmitere sexuala, cauzate de Chlamydia trachomatis sau Neisseria gonorrhoeae. Afectarea epididimului in cursul unor infectii siste111ice, ca tubercu]oza ~i blastomicoza, este rarii. Clinic se constata: congestie cu tumefiere dureroasii, de obicei unilateralii, a scrotului; scurgere uretralii ~i semne de iritatie a tractusului urinar inferior. Complicatii posibile sunt: extinderea (orhiepididimitii, hidrocel, infarct testicular abcese scrotale cu posibila fistulizare) ~i cronicizarea infectiei. Complicatiile supurative impun interventie chirurgicala. Pentru diagnosticul etiologic examiniim scurgerea uretralii (revezi 15.2), urina (revezi 14.3) sau probe de puroi ori exsudatul vaginalei testiculare (revezi 11.4). 15.5.0RHITE Orhitele pot fi determinate de virusuri sau de bacterii piogene. Virusul urlian ~ivirusul Coxsackie B infecteaza testiculele, unilateral sau bilateraL pe cale hematogeni'i. Uneori orhita urliana evolueaza tara parotid ita punand probleme de diagnostic diferential. Preciziiri privind diagnosticul de laborator al orhitelor virale gase~ti in Cap. 8. Cel mai frecvent, orhita cu bacterii piogene este 0 extindere prin contiguitate a infectiei epididimare. Exceptional apare ca 0 metastaza septic a in cursul unei bacteriemii sau septicemii. Complicatiile lor posibile (infarctul testicular, abcedarea, pioceJul scrotal) impun interventie chirurgicala.Probele prelevate intraoperator sunt examinate pentru diagnosticul bacteriologic (revezi 11.4) ~i orientarea antibioticoterapiei. 285

16. DIAGNOSTICUL

DE LAB ORATOR AL INFECTIlLOR TRACTUSULUI GENITAL FEMININ (GABRIELA COMAN)

16.1. INTRODUCERE 16.2. COND1TIA MICROBlOLOGIC·\ NORMAL'\ A TRACTUSULUI GENITALFEMININ 16.3. INFECTII GENITALE JOASE 16.3.1. Consideratii etiopatogenetice clinice Regiunea vulval'S. Glandele Bartholin Vaginul Cervixul uterin

~i

16.3.2. Diagnosticul etiologic al infectiilor genitale joase Diagnosticul infectiilor vulvare Diagnosticu1 vaginitelor Diagnosticul endocervicitelor Diagnosticul barto1onitelor 16.4. INFEqII GENITALE jNALTE 16.4.1. Consideratii etiopatogenetice ~i clinice 16.4.2. Recoltarea produselor patologice 16.4.3. Diagnosticul de laborator

16.1. INTRODUCERE Infectiile genitale feminine reprezinta 0 cauza fi'ecventa de consult ginecologic. Ele pot evolua ca infectii endogene, detenninate de microorganisme din flora vaginala nom1ala, sau ca infectii exogene cauzate mai ales de microorganisme cu transmitere sexuaL'i: bacterii (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis - serotipurile D-K, Treponenw pallidum), virusuri (Herpes simples, in special tip 2, Papillomavirus) sau protozoare (Trichomonas vagina lis). Infectii cu Haemophilus ducreyi, Calymmatobacterium granulomatis ~i Chlamydia trachoma tis - serotipurile LI-L3 nu evolueaza in zona noastra geografica. particularitate a majoritatii infectiilor cu transmitere sexuala la femeie este evolutia lor frecvent asimptomatica, diagnosticul etiologic in aceste cazuri putfmdu-se realiza mai ales in cadrul unei depistari sistematice efectuate intr-un context epidemiologic (infectii manifeste clinic la partenerul sexual sau la nou-nascut). In absenta unui diagnostic ~itratament etiotrop precoce, cronicizarea unor astfel de infectii poate expune la complicatii locale sau sistemice. Posibilitatea unei contaminari simultane cu doi sau mai multi agenti cu transmitere sexuala impune depistarea activa a acestora. De remarcat ca virusuri prezente in secretii genitale pot fi transmise pe cale sexuala, tara sa determine manifestari la nivelul organelor genitale (virusurile hepatice B ~iC, citomegalovirus ;;ivirusul imunodeficientei umane).

o

16.2. CONDITIA MICROBIOLOGIC'\ NORMAL.\ A TRACTUSULUI GENITAL FEMININ Tractqsul genitalIa femeie este reprezentat de trompele uterine, uter, vagin ~ivulva (fig. 16-1). In raport de colonizarea microbiana exista doua zone distincte: • vulva, vaginul ~iexocolul uterin normal colonizate imediat dupa na~tere; portiunea distala a endocolului uterin constituie 0 zona de tranzitie, flora bacteriana de la acest nivel fiind cantitativ ~i calitativ mai saraci'i decat flora vaginala; 286

• uterul ~i trompele normal sterile, conditie asigurata de mucusul cervical ce contine lizozim, lactoferina ~iimunoglobuline ~ide macrofagele prezente in cavitatea uterina. Flora vulvara, bogata ~i variatii, dependentii numeric de igiena locala individuaIii, este reprezentata de specii microbiene ale Red tegwnentului din vecinatate (regiunea perineala). Flora vaginal a, mai specifica, sufera modificari In raport cu prezenta honnonilor ovarieni ~i instal area activitatii sexuale. Dupa 2-3 saptamani de la na~tere, odata cu disparitia honnonilor ovarieni matemi ~ipana la instlarea Fig. 16-1. Sectiune sagitala prin pelvis; ciclului menstrual ~i, apoi, In perioada post- prezentare schematizata a organelor genitale la femeie. menopauza sunt prezente in vagin numeroase specii, in special bacterii aerobe ~i anaerobe (aproximativ 108_109 bacterii/mL secretie, fiind identificate pana la 100 de specii diferite), intr-un echilibru optim. Aceastii flora nonnala Impiedica, in anumite limite, cre~terea excesiva a unor populatii microbiene sau colonizarea vaginului cu specii patogene. Odata cu instal area functiei hormonale ovariene, are loc 0 modificare profunda a ecosistemului vaginal. Secretia de estrogeni detennina Ingro~area nncoasei vaginale cu depozit de glicogen In celulele epiteliale. Dintre speciile bacteriene nonnal prezente, lactobacilii (flora D6derlein) sunt singurii care pot utiliza acest compus ca nutrient ~i, in consecinta, prolifereaza abundent cu producerea finala de acid lactic. in aceste conditii, sciiderea pH-ului vaginalla valori cuprinse intre 3,8-4,5 creeaza conditii nefavorabile de muItiplicare pentru alte specii bacteriene, inclusiv patogene; numai Candida albicans poate sa se dezvoIte In mediu acid. Mai recent, efectul inhibitor al un or lactobacili s-a dovedit a se datora, in plus, producerii de baeteriocine ~i peraxid de hidrogen. 16.3.INFECTII

GENITALE

JOASE

Infectiile genitale jaase sunt localizate la nivelul zonelor nonnal colonizate. 16.3.1. Consideratii

etiopatogenetice

~i clinice

16.3 .1.1.Regiunea vulvara poate fi afectata de infectii bacteriene, virale, ll1icotice sau parazitare care se pot manifesta izolat sau asociat cu vaginite. Portiunea eutanata a vulvei poate fi sediul unar infectii eomune cu cele tegumentare: folieulite, furuneule, piodennite. Dintre infeetiile specifiee, vulvita cu Trichomonas vaginalis ~i cea ll1ieotiea Insotesc intotdeauna 0 eervieo-vaginita cu etiologie sill1ilara. Infeetia luerica se poate manifesta in stadiul primar prin prezenta ~ancrului dur care, In forma tipiea, nesuprainfeetata, se prezinta ca 0 ulceratie unica indolora (mai rar ulceratii multiple) cu ~11argininete, indurate ~i suprafata eurata cu aspect liicuit, inso!ita de adenopatie inghinala. In stadiul secundar, pe vulva pot sa apara fonnatiuni proieminente, condiloma lata, eonstituite din coalescenta unor leziuni papuloase. Vulvita herpetica primara, detenninata in special de Helpes simplex tip 2, ell transmitere sexuala, evolueaza initial sub fonna unui buchet de vezicule plasate pe 0 287

zona intens eritematoasa, inso!ite cu 0 senza!ie de arsura, usturime, prurit; dupa scurt timp, prin ruperea veziculelor, apare 0 leziune ulcerativa dureroasa care dureaza aproximativ doua sapti'imani ~i, in final, se acopera cu 0 crusta. Infec!iile recidivante au 0 expresie clinidi mai atenuata ~i 0 durata mai scurta. Condilomatoza veneriana, cOlldiloma acumillata, determinata de unele tipuri de Papillomavirus (mai ales 6 ~i 11) evolueaza ca leziuni papuloase variate ca forma ~i marime, de la dimensiunea unei gamaJii de ac. pana la f0D11a!iuni proeminente papilomatoase "in creasta de coco~", de culoare r02. Papule mici, de 1-5 mm, izolate sau grupate, cu centrul ombilicat, caracterizeaza infectia cu un poxvirus, molluscum contagiosum. Mult mai rar pot sa apara la nivelul vulvei leziuni papuloase date de Sarcoptes scabiei. 16.3.1.2. Glandele Bartholin, situate la jonc!iunea dintre vulva ~i vagin, pot fj sediul unor infec!ii gonococice sau cu C. traclzomatis cand glanda este marita de volum, dureroasa, iar prin pres are exprima la nivelul orificiului de deschidere 0 secre!ie mucopurulenta. Blocarea printr-un proces inflamator a conductului glandular poate detennina un abces cauzat, de cele mai multe ori, de 0 flora microbiana aerobi'i ~i anaerobi'i. 16.3.1.3. Vaginul poate fi sediul unei inflama!ii difuze, care cuprinde frecvent ~i regiunea vulvara ~i se inso!e~te de scurgeri vaginale abundente (Ieucoree), cu aspect diferit in raport de etiologie, in general rau mirositoare. Exista ~i 0 pseudolel!c2LE:.~q fiziologica, ce trebuie cunoscuti'i ~i diferen!iati'i, secre!ia fiind constituitii in acestcaz din mucusursecretat de glandele endocervicale asociatcucerule superficiale desprinse dIll epiteliui-pavimentos sCralificat al vagIffiilui (fig. 16-2); aceiiSti este exacerba!~J12pei~lo~da

Fig. 16-2. AspectuI microscopic aI frotiului din secretie vaginala Ia 0 pacienta cu pseudoleucoree: A) imagine de ansamblu, eu obiectiv uscat; B) detaliu, eu obiectiv ell imersic.

288

de ovulatie $i premenstrual, In sarcina sau sub efectul contraceptivelor orale ori poate sa apara in perioada prepubertara, cu aproximativ doi ani inainte de instalarea ciclului menstrual. Aceste secretii nu provoaca tulburari functionale. Sub raport etiologic sunt descrise vulvovaginite specifice cauzate de fungi $i Trichomonas vaginalis $i vulvovaginirenespecifice sau vaginoze. Vulvovaginita candidozica, detenninata cel mai frecvent de C. albicans (aproximativ 80% din cazuri), urmata de C. glabrata (3-5% din cazuri), apare de cele mai multe ori ca infectie endogena, 15-20% dintre femei avand mucoasa vaginala colonizata cu specii de Candida. Circumstantele in care apare infectia simptomatica sunt reprezentate de modificari honnonale (sarcina, contraceptive orale), terapie cu antibiotice, cOliicosteroizi sau citostatice, diabet, stari de imunodepresie. Au fost implicate sporirea glicogenului in epiteliul vaginal, modificarea ecosistemului local, scaderea imunitatii mediate celular. In unele fom1e recidivante, cand alti factori predispozanri nu sunt prezenri, poate fi in cauza partenerul sexual ce prezinta 0 balanita candidoziciL Rezervorul intestinal pare a avea un rol minor. In absenta hormonilor ovarieni (perioada prepubertara $i postmenopauza) vulvovaginitele micotic~ sun! rare. Clinic, vulvovaginita candidozica evolueaza cu prurit intens vUlvar, dispareunie, dismie, leucoreea avand culoare albicioasa, cu aspect branzos, aderenta. Vulvovaginita cu T. vaginalis este cea mai frecventa infectie cu transmitere sexuala, care evolueaza simptomatic la 75-95% dintre femeile infectate. Frecventa este in raport cu numarul partenerilor sexuali, putand evolua In asociatie cu alte infectiii ce recunosc acela$i mod de transmitere. Manifestarile clinice sunt asemanatoare cu acelea din infectia precedenta, leucoreea avand aspect galben-verzui aerat, cu un miros neplacut; simptomele sunt exacerbate In perioadamenstrualii. T. vaginalis poate fi trasmis de la mama la fetita nou-nascuta in cursul traversarii canalului vaginal, manifestarile clinice la aceasta varsta fiind in general minore $i auto limitate, dispariria lor fiind legata de eliminarea hom10nilor sexuali matemi. Receptivitatea mucoasei vaginale la infectia trichomonazidi survine dupa varsta de 10 ani, odata cu instal area activitatii ovariene. Vaginitele nespecifice sau vaginozele reprezinta un sindrom infeqios neinflamator, carac~ri~ scurge~i .alb-ce~u$il om~gen~ cu miros re~~m~ator de pe$t~ alterat. A~a.~ conse IV unel perturban a ecoslstemulm vagmal, de cauza mca n~~noscu~~. Lactobactlrc sunnniocuiti printr-o asociatie bacteriana sinerglca-dintre Gard!_lerellal!ag...iJ.;alis, specii diverse anaerobe (Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyroliwna~~PfJ_',-~f1~tostrepto- --, coccus spp., MobilU1icus~ $i Mycoplasma hominis.R.espectlvele specii fac parte din flora nonna'fa a vaginului, dar irlcazul vaginozelor cre$ter~a nll}11~i~~~_acestora ajunge pana la 1 000 de ori. G. vaginalis, care initial a fos-tconsiderat singuruTagent--etiologic,este specia cea mai constant prezenta, speciile anaerobe fiind fomie diverse $i variabile. Mai frecvent intalnita in perioade cu activitate sexuala, aceasta infectie poate evolua $i la adolescente $i preadolescente virgine. Vaginite determinate de corpi straini apar atat la femeia adulta, legat de prezenta unor dispozitive contraceptive, sau la fetite la care corpi straini diver$i pot ajunge in vag in incidental in timpuljocului sau prin masturbare. Corpul strain determina inflamatie cu necroza celulara a peretilor vaginului $i toto data 0 modificare a biocenozei locale conducand la infectii secundare in special cu bacterii anaerobe. Scurgerile vaginale sunt fetide $i, in mod caractelistic, au un aspect purulent-sanguinolent. 289

Staphylococcus aureus, prezent in vagin Ia 5~10% dintre femeile sanatoase, poate cauza scurgeri purulente vaginale ~i ~oc toxic in conditiile utilizarii de tampoane hiperabsorbante intra vagina Ie in perioada menstruala. Infectia luetica primara poate sa evolueze cu ~ancru localizat pe peretii vaginului. Epiteliul vaginal este relativ rezistent la infeqia herpetica. Pot aparea insa leziuni determinate de Papillomavirus care, comparativ cu cele vulvare, sunt mai purin papilomatoase $i mai deschise la culoare. La fetite, particularitati ale epiteliului vaginal ~i ecosistemului de la acest nivel fac posibile vulvovaginite Cll N. gonorrhoeae, C. trachomatis sall Streptococcus pyogenes. Tot Ia aceasta varsta pot evolua vulvovaginite cu Enterobius vermicularis, legat de migrarea posibiHi a parazitului in vagin. 16.3.1.4. Cervicite. Exocolul uterin, acoperit Cllun epiteliu pavimentos asemanator celui vaginal, este receptiv la infectii cu T. vaginalis sau C. albicans, care pot evolua drept cervico~vaginite. De asemenea, ~ancrulluetic poate fi localizat la nivelul exocolului. Papillomavirus, in special tipurile 16 ~i 18, infecteaza relativ fi'ecvent colnl uterin (aproximativ 1% din femei). Leziunile pot fi atM de plate incat nu pot t1vazute Cllochiul liber, ci numai la exam en colposcopic sau depistate prin examen citologic; a fost implicat in aparitia neoplaziilor cervicale intraepiteliale. Mucoasa endocervical a, constituita dintr-un epiteliu cilindric glandular, poate t1 sediul unor infectii bacteriene sau virale cu tropism pentru aceasta zona, transmise prin contact sexual. In formele manifeste clinic este constant prezenta leucoreea. Endocervicita gonococica poate evolua simptomatic cu scurgeri cervicale purulente sau mucopurulente numai Ia aproximativ 30% dintre femeile infectate, majoritatea dintre cele Cll infeqii necomplicate fiind asimptomatice. Contaminarea prin aceste secretii a mucoasei uretrale sau rectale poate determina localizarea concomitenta la aceste nivele a infeqiei cu manifestari clinice de uretrita sau proctita. Endocervicita cu C. trachol71atis, serotipurile D-K, are manifestari clinice asemanatoare; aproximativ 2/3 dintre femeile ai carol' parteneri sexuali au uretrite negonococice sunt asimptomatice. Cervicita herpetica poate surveni in cadrul infectiei primare cu virusul HellJeS simplex tip 2, mult mai rar al celor recidivante. Evolueaza cu leziuni ulcerative endo- ~i exo~cervicale, uneori putand sugera 0 neoplazie; leziunile de la nivelul organelor genitale exteme pot lipsi. Scurgerea endocervicala este de obicei mucoida, dar poate avea, uneori, un aspect mucopurulent.

16.3.2. Diagnosticul etiologic al infectiilor genitale joase Dupa 0 anamneza atenta ~i un examen clinic general se procedeaza la examinarea pacientei pe masa ginecologica, inregistrandu~se localizarea ~i aspectulleziunilor, apoi sunt recoltate ~i expediate probele destinate examenului microbiologic sau citologic. 16.3.2.1. Diagnosticul infectiilor vulvare. Inspectia incepe cu organele genitale exteme. lnvestigatia microbiologic a a prelevatelor de la acest nivel se realizeaza in special in cazul unor leziuni de tip u1cerativ. 290

Este investigata in primul rand etiologia luetica, conditionata de dotarea cabinetului cu un microscop cu fond intunecat ~iprezenta unui microscopist experimentat. In acest scop, ~terge ulceratia cu 0 compresa sterila uscata insistand pana ce leziunea sangereaza, apoi tamponeaza pana la stoparea sangerarii; preseaza marginile leziunii intre degete pentru a obtine 0 cantitate mica de serozitate. Proteqia cu m~nu~i este obligatorie. 0 piditura din acest produs, aspirata cu pipeta Pasteur, este depusa pe 0 lama subtire, acoperita cu 0 lamela, iar preparatul este examinat extemporaneu la microscopul cu fond intunecat. T. pallidum poate fii recunoscuta dupa morfologia ~i mobilitatea caracteristice. Testul de imunofluorescenta directa confera specificitate absoluta examenului microscopic, dar nu poate fi realizat decat in conditiile unui laborator specializat. In schimb, etiologia luetica poate fi confirmata prin diagnostic serologic. Etiologia herpetica a unei leziuni ulcerative poate fi investigata in laboratorul clinic prin testul Tzanck; in frotiul efectuat extemporaneu din produsul prelevat prin ~tergerea cu tamponul a suprafetei ulceratiei (urmarindu-se deta~area celulelor epiteliale superficiale), colorat Giemsa, pot fi observate celule multinucleare sugestive pentru aceasta etiologie. Testul are insa 0 sensibilitate redusa, pana la 0,40, comparativ cu izolarea virusului in culturile celulare. 16.3.2.2. Diagnosticul vaginitelor este una din cele mai frecvente solicitari de consult ginecologic, prezenta leucoreei fiind constanta. Importanta de stabilit este provenienta acestei scurgeri patologice, eliminandu-se originea ei endocervicalii. Acest lucru este posibil prin examinarea aspectului mucoasei vaginale ~i a orificiului colului uterin dupa introducerea in vagin a doua valve sterile tara lubrifiant (care poate avea efect antibacterian). Secretia acumulata in fundul de sac vaginal posterior este deta~ata cu ajutorul uneia din valve ~i recoltata pe trei tampoane destinate examenului microbiologic. Dupa scoaterea valvelor, cantitatea de secretie ata~ata pe suprafata acestora poate servi la efectuarea a doua teste preliminare, chiar in cabinetul de consultatie: • Determinarea pH-ului secretiei vaginale cu ajutorul hartiei indicator: un pH?: 5 este intalnit in infectia cu T. vagina lis ~i in vaginoze. • Testul aminelor volatile ("whifftest"): depune cateva picaturi din solutia 10% de KOH pe secretia vaginala de pe suprafata valvei; in caz de vaginoza se degaja imediat un miros dezagreabil de pe~te alterat. Sensibilitatea ~ispecificitatea testului sunt de 0,75-0,90, respectiv 0,85-0,95. Cele trei tampoane cu prelevatul vaginal VOl' fi trimise rapid la laboratorul de microbiologie unnand a avea unnatoarele destinatii: Tampollul I este descarcat in 0,5 mL solutie salina izotona sterila, incalzita la 37"C, din omogenat efectuandu-se un preparat umed intre lama ~i lame la, care se examineaza cu putere de marire 100X, apoi 400X. Pot fi obtinute um1atoarele informatii: • Prezenta unei reactii inflamatorii cand raportul PMN/celule epiteliale este peste 1. Inflamatia este intensa in trichomonaza, mult mai discreta in candidoza ~i de regula lipse~te in vaginoza. 29]

• Depistarea T. vaginalis, flagelat pirifonn, pu!in mai mare dedit un leucocit, care poate fi u~or recunoscut dupa mi~carile sacadate, in diferite direqii. Sensibilitatea testului in raport cu depistarea prin cultura este de 0,70-0,90, dupa diver~i autori. • Eviden!ierea de celule levurice inmugurite ~i pseudohife, care apar in candidoza vaginala. Sunt cazuri cand acest diagnostic poate fi stabilit numai prin izolare pe medii de cultura, sensibilitatea microscopiei fiind de aproximativ 0,55. • Prezen!a de "clue cells", celule vaginale superficiale cu contur mascat de 0 abundenta flora bacteriana prezenta pe suprafa!a lor, care reprezinta 20-30% din celulele epiteliale vaginale, aspect sugestiv pentru diagnosticul de vaginoza. Sensibilitatea testului cste de 0,65-0,80, iar specificitatea de 0,80-0,95. Examene cOl11plel11entaresustin aceasta etiologie: pH-ul vaginal peste 5 ~i testul aminelor volatile pozitiv. Tall1pOllU12 este folosit la efectuarea unui frotiu colorat Gram ce pennite, 0 apreciere mai exacta a florei vaginale. In condi!ii nOrlnale aceasta este reprezentata de ba5iljJLlllJ~L gral11-pozitivi, dispu~i izolat, in diplo- sau lan!uri sCUlie,care consfituie flora D6derlein t~d\.vag9

flora ~araeste

Fig. 16-3. Aspectul microscopic al frotiului din secretie vaginaHi normalii la 0 femeie cu activitate hormonalii: A) imagine de ansamblu, eu obieetiv useat; B) detaliu, ell obieetiv eu imersie.

292

inlocuita cu b';;U gra~~.~~~lg0(ili~5'

Fig. 16-4. "Clue cells" ~i aspectul florei bacteriene intr-un frotiu vaginal la 0 pacienta cu vaginoza

Fig. 16-5. Frotiu vaginal in care se remarcii prezenta Mobil/melts (bacili incurbati gd~m-negativi).

Bacteroides spp. - fig. 16-4) ~i baci1i incurbati gram-negativi (Mobilzmcus - fig. 16-5). Co1oratia Gram pelmite exclude{ea unor false "clue cells4-30

1-5 0 1-5 Scor 30 Nr. bacterii/ciimp microscopic

-

293

Fig,16.6, Frotiu vaginalla

0 pacienta

eu leueoree eandidozica

Un scor final, reprezentat de sum a celor trei scoruri individuale, cu valoarea de 7-10 pledeazii pentru diagnosticul de vaginozii; un scor de 0-3 exclude acest diagnostic, iar un scor intermediar de 4-6 impune repetarea exal11enului microscopic pe 0 noua proM. In candidoza vaginalii apar celule levurice ~ipseudomicelii gram-pozitive (fig. 16-6), dar la mai PU!inde 1/3 din cazurile la care Candida poate fi eviden!iatii prin cultura. Un al doilea frotiu, colorat Giemsa, la care recurg unii l11icrobiologi,nu aduce infol111atii suplil11entare fatii de preparatul umed, avand 0 sensibilitate mai redusa in depistarea T. vaginalis. Tamponul 3 serve~te pentru diagnosticul unei candidoze vaginale, prin insamantare pe mediu Sabouraud cu cloramfenicol. C. albicans este normal prezentii in vaginul a ] 5-21 % din femei, chiar panii la 30% in trimestrul al 3-lea de sarcinii. De aceea interpret area culturii trebuie fiicuta prudent. Semnificativa este, in context clinic sugestiv, o colonizare importanta a vaginului cu C. albicans, chiar masiva in cursul sarcinii. La fetite virgine cu leucoree secretia va fi recoltatii de la nivelul orificiului de deschidere al vaginului sau se poate recurge la prelevarea endovaginala cand exista un instrument adecvat. Investiga!ia l11icrobiologicii trebuie sa !ina seama de particularitati1e spectrului etiologic la aceastii varstii, algoritmul de diagnostic fiind necesar a include insiiman!area probelor cu celule inflamatorii pe agar-sange pentru diagnosticul unei vulvovaginite cu S. pyogcnes ~i pe medii adecvate pentru izolarea N. gOl1orrlzoeae (vezi 15.2.3). 16.3.2.3. Diagnosticul endocervicitelor. Dupa introducerea valvelor, examinarea vizualii a vaginului include ~iorificiul extem al colului uterin. In conditii nomlale secreria endocervicalii apare cu un aspect clar ~i mucoid, mai filanta in perioada ovulatorie, mai vascoasa in faza luteaUi a ciclului. 294

Fig. 16·7. Frotiu endocervical eolorat Giemsa sugestiv pentru infectie eu Chlamydw trachomatis

In prezenta unei scurgeri mucopurulente, se procedeaza la ~tergerea suprafetei exocolului cu 2-3 comprese sterile pentru indepartarea secretiilor stagnante, apoi sunt introduse succesiv in endocol, pe a distanta de aproximativ 1-2 cm, trei tampoane care sunt rotate u~or, pentru a pemlite prelevarea produsului patologic ~idesprinderea celulelor de pe suprafata mucoasei. Tamponul I serve~te pentru efectuarea frotiului colorat Gram pe care se apreciaza reactia inflamatorie. Semnificativa este prezen!a a peste 10 PMN/cihnp microscopic examinat cu obiectiv cu imersie. In aceste condi!ii este posibila prezen!a de diplococi reniformi gram-negativi, intra- ~iextracelulari, aspect sugestiv pentru infeqia gonococica. Sensibilitatea testului este de 0,50-0,70. Tamponul 2 va fi folosit pentru diagnosticul prin cultura al endocervicitelor gonococice (vezi 15.2.3). Tamponul 3 serve~te la efectuarea unui frotiu colorat Giemsa, care poate permite diagnosticul microscopic al unei endocervicite cu C. trachomatis (fig. 16-7; vezi ~i 15.2.4) sau cu virusul herpetic (vezi 16.3.2.1). Metode mai sensibile ~i specifice pentru diagnosticul acestor infeqii (testul de imunofluorescen!a directa, testul ELISA, izolarea pe culturi de celule, meta de moleculare) nu sunt accesibile inca laboratorului clinic. 16.3.2.4. Diagnosticul in bartolinite. Daca, prin palparea glandei, la nivelul orificiului conductului glandular apare un exsudat purulent, acesta va fi prelevat cu ajutorul a doua tampoane ce Val' servi pentru diagnosticul microscopic ~i prin cultura al infeqiei gonocoClCe. Puroiul aspirat prin punc!ie, in caz de abces, necesita, in plus, a fi insaman!at pe medii aerobe ~i anaerobe, solide ~i lichide. In cazul unui puroi "steril" este posibila a infeqia cu C. trachomatis sau Ureaplasma urealyticul1l. 16.4.INFECTII

GENITALE

INALTE

In infec!iile genitale inalte pot fi implicate organele pelvine: uter, trompe, oval' (fig.16-8). 295

Trompa Fallopio ! /ff~ ,

Pavilionul trompei

Ligamentullarg Fig. 16-8. Organele

~ Vagin [olul urerin genitale interne la femeie (schema).

16.4.1. Consideratii etiopatogenetice ~iclinice Infec!iile localizate la nivelul mucoasei uterine poarta numele de endometrite; cand inflama!ia intereseaza ~i mu~chiul uterin, termenul este de endomiometrita. Fonnele acute survin in special postpartum sau postabortum, ruptura prelungita de membrane, na~terea prin cezariana, vaginoza constituind factori de risco Eliminarea ciclica a endometrului la femeia adulta indeparteaza eventuale focare inflamatorii superficiale permi!and reacoperirea cu un endometru indemn. In afara sarcinii pot sa apara infectii dupa explorari sau interven!ii endouterine (histerosalpingografie, implantare de sterilet etc.). Evolueaza in special ca infec!ii polimicrobiene fiind implicate 0 varietate de specii bacteriene aerobe ~i anaerobe, ce fac parte din flora endogena a vaginului: streptococi grup B, enterococi, al!i streptococi aerobi, microaerofili sau anaerobi, enterobacteriacee, Gardnerella vaginalis, Bacteroides fragilis ~i al!i bacili gram-negativi anaerobi, Mycoplasma hominis, posibil Clostridium peifringens, in special izolat din avort septic provocat, sau Streptococcus pyogenes, care detennina infectii deosebit de grave. La 10-20% din pacientele cu endometrita acuta infec!ia poate evolua bacteriemic. Endometritele cronice asociate cu endocervicite ~i salpingite pot fi detenninate de bacterii cu transmitere sexuala fiind documentata infec!ia cu C. trachoma tis, prin propagare pe cale ascendenta; endometrita tuberculoasa poate sa apara prin insaman!are pe cale hematogena cu Mycobacterium tuberculosis. Expresia clinica a unei endometrite acute consta in dureri hipogastrice, febra, lohii sau scurgeri vaginale purulente; uterul este marit de volum ~i dureros la palparea bimanuala. Endometrita tuberculoasa evolueaza mai pu!in zgomotos, cel mai frecvent manifestandu-se cu meno-metroragii de lunga durata, rezistente la tratamentul hom1onal. Inflama!ia epiteliului endotubar sau a trompei in totalitate poarta numele de salpingita. Datorita vecin3.ta!ii orificiului pavilionar cu ovarul, apar inflama!ii salpingoovariene. Interesarea in procesul inflamator a mezosalpinxului ~ia peritoneului ce acopera ligamentullarg a creat termenul de anexita. Intrucat din punct de vedere clinic localizarea 296

anatomici1 precisii a infec!iei este greu de stabilit, apare corectii utilizarea denumirii de boalii inflamatorie pelvinii (acest diagnostic este po sibil numai prin laparoscopie sau laparotomie) . Sub raport etiologic intaInim trei grupe de bacterii: bacterii cu trasmitere sexuaU'i, bacterii de origine vaginalii ~iM. tuberculosis. N. gonorrhoeae ~i C. trachoma tis intervin in etiologia salpingitelor in mai mult de jumiitate din cazuri; aceste bacterii insiiman!eazii muoasa tubarii prin propagare intracanalicularii, ca 0 complica!ie a endocervicitelor cu aceastii etiologie, complica!ie care survine in 10-40% din cazuri. Flora aero-anaerobii vaginalii poate determina salpingite dupii endometrite postabortum sau postpartum. In afara sarcinii, existen!a unei vaginoze este consideratii 0 condi!ie preexistentii; infeqia gonococicii sau cu C. trachomatis se considerii a favoriza infec!ia ascendentii eu flora endogenii vaginal ii, putand evolua infee!ii asociate. Rolul mieoplasmelor ( M. hominis ~i U. urealyticum) in etiologia salpingitelor este discutabil. Tuberculoza genitalii este mult mai rarii in compara!ie cu alte localiziiri extrapulmonare, trompe Ie uterine fiind eel mai freevent afectate; in 2/3 din cazuri este interesatii ~i mucoasa uterinii. Manifestiirile clinice de salpingitii acutii sunt foarte asemiinatoare cu cele de endometritii. Durerea pelvinii, predominant in fosa iliacii, cu intensitate diferitii, poate fi inso!itii dfe febrii, leucoree, semne de irita!ie peritonealii. Palparea bimanualii obieetiveaza sediul durerii putandu-se constata 0 impiistare a zonei anexiale, uneori fiind sesizata trompa ingro~ata care ruleazii sub deget. Piosalpinxul ~i abcesul tubo-ovarian reprezinta complica!ii majore ale salpingitelor acute, ruperea spontanii a abcesului detem1inand peritonitii. In boala inflamatorie pelvinii eronicii multe femei pot avea manifestiiri clinice minore sau sunt asimptomatice.

16.4.2. Recoltarea produselor patologice eu excep!ia bacteriilor transmise sexual, a S. pyogenes ~i C. pe/:fringens, celelalte specii aerobe sau anaerobe prezente la nivelul endocolului nu pot fi considerate agenti etiologici ai infectiei localizate in zone normal sterile. De aceea, dupii ob!inerea produsului endocervical, se recomanda recoltarea exsudatului inflamator de la nivelul cavitii!ii uterine, evitandu-se contaminarea cu flora endocolului ~i a vaginului. Realizeazii in acest scop badijonarea cu alcool iodat a exocolului ~i a canalului cervical, unnata de introducerea unui cateter sau a unei sonde sterile. In momentul in care acest dispozitiv a ajuns in cavitatea uterina, adapteaza 0 seringii sterilii ~i aspira lichid endometrial. Ata~eaza apoi la seringa un ac steril, indepiirteazii orice bula de aer protejand varful aeului eu un tampon de vatii steril, obtureazii acul printr-un dop de eaueiue ~i expediazii astfel, in eel mai seurt timp, produsul patologie la laborator. In endometritele postabortum sau postpartum efeetueazii in plus hemoculturi repetate pe medii aerobe ~i anaerobe. In eaz de piosalpinx sau abces tubar rezolvate chirurgical, se recolteaza intra operator puroi prin punc!ionarea colee!iei §i aspirarea produsului in seringii, procedandu-se ca

297

mai sus in vederea expedierii probei. In plus, sunt prelevate fragmente de tesut afectat (uneori puroiul este steril, bacteriile fiind prezente nUl11aiIn peretii colectiei piogene) care sunt introduse intr-un mediu de transport. (e.g., mediul Stuart). Laparoscopia recomandaUi la pacientele cu boala inflamatorie pelvina permite recoltarea exsudatului inflal11ator de la nivelul ostiumului tubar ~i din fundul de sac Douglas. In boala inflamatorie pelvina detenninata de C. trachomatis se poate recurge la un examen serologic. Pentru diagnosticul bacteriologic al tuberculozei genitale se recolteaza sange menstrual, supus il11ediathemolizei cu apa disyilata, sau mucoasa uterina chiuretata in perioada premenstruala. 16.4.3. Diagnosticul de laborator Examenul exsudatului prelevat de la nivelul endocolului se realizeaza pentru N. gonorrhoeae ~i C. trachomatis dupa metodologia descrisa anterior. Produsul aspirat din cavitatea uterina este examinat pentru prezenta florei aerobe ~i anaerobe prin microscopia frotiului colorat Gram ~i insamantare pe medii de cultura adecvate. Microscopia permite descrierea morfotipurilor bacteriene prezente, afinitatea lor tinctoriala ~i raporturile cantitative ale acestora. Pe medii incubate aerob vor cre~te bacteriilor aerobe-facultativ anaerobe a caror identitate se poate realiza pana la nivelul speciei. Pe agarul-sange incubat anaerob se pot recunoa~te cu u~urinta coloniile de C. peifringens, inconjurate cu 0 zona dubla de hemoliza; in rest, cultura mixta este de cele mai multe ori constituita din colonii putin diferentiate macrosocopic, cu dificultatea de a obtine culturi pure. Utilizarea unOr medii selective cu antibiotice (aminoglicozide. acid nalidixic, vancomicina) ar putea rezolva acest aspect. Produsele prelevate intraoperator vor fi investigate atat pentru prezenta N. gonorrhoeae ~i C. trachomatis, cat ~i a bacteriilor facultativ ~i obligator anaerobe. Prezenta micoplasmelor este unnarita numai in scop de cercetare. Pentru diagnosticul bacteriologic al tuberculozei examineaza sange menstrual. biopsie de endometru COnf0l111 precizarilor de la 13.4.

298

1/. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR OCULARE , (DUMITRU BUIUC)

17.1. INTRODUCERE

17.4.

17.1.1. Condipa anatomo-histologicii Globul oculal"

17.4.1. Aspecte etio-patogenetice 17.4.2. Investigarea etiologicii a endoftalmitelor Prelevarea probelor Prelucrarea probelor Microscopia Alte teste: dozarea glucozei ~i asidului lactic in vitros, testul Limulus Cultivarea

Organele anexe de protectie 17.1.2. Conditia microbiologicii 17.1.3. Entitiiti nosologice 17.1.4. Particularitiiti privind prelevarea probelor 17.2. CONJUNCTIVITE 17.2.1. Spectrul etiologic 17.2.2. Investigarea etiologicii a conjunctivitelor Prelevarea probelor Microscopia Cultivarea 17.3. KERATITETE 17.3.1. Aspecte etio-patogenetice 17.3.2. Investigarea etiologicii a keratitelor Prelevarea probelor Microscopia Testul Limulus Cultivarea

ENDOFTALMITE

Locul examenelor serologice 17.5. INFECTIILE PLEOAPELOR 17.5.1. Aspecte cHnice ~i etiopatogenetice 17.5.2. Investigarea etiologicii 17.6. INFECTIILE APARATULUI LACRIMAL 17.6.1. Aspecte elinice ~i etiopatogenetice 17.6.2. Investigarea etiologicii 17.7. INFECTIILE ORBITEI SI SINUSULUI CAVERN OS 17.7.1. Aspecte cHnice ~i etiopatogenetice 17.7.2. Investigarea etiologicii

17.1. INTRODUCERE Infectii pot afecta variatele structuri ale ochiului, orbitei ~i organelor accesorii de protectie. Pentru a intelege posibiliti'itile ~ilimitele investigatiei microbiologice a acestor infectii, sunt necesare cateva repere structurale, microbiologice ~i patogenetice.

17.1.1. Conditia anatomo-histologica Globul ocular Globul ocular, delimitat prin trei tunici, externi'i, medie ~i intern a, contine mai multe medii dioptrice transparente (fig. 17-1). -Tunica externa, groasi'i, fibroasi'i ~i rezistenti'i, di'i forma globului ocular ~i Ii protejeaza structurile fragile. In cele 5/6 posterioare este alba ~i opadi fonnfmd sclerotica, iar in 1/6 anterioari'i devine transparenti'i formand corneea. Cele doua parti ale tunicii ext erne se continui'i una cu alta la nivelul limbului sclero-cornean. - Tunica medie, uveea, cuprinde 0 bogata retea vasculari'i care asigura nutritia tesuturilor oculare, pigment ~i doui'i sisteme musculare. Uveea are trei pi'i11i:anterioara (irisul), mijlocie (c01pul ciliar) ~i posterioari'i (coroida). 299

24

14 12 19 3 10 52S 23

-

",~~

/ /~;17 /'i aspergiloza orbitara sunt infectii rare propagate din sinusuri la pacientiii cu conditii predispozante, e.g., obstructia sinusurilor prin procese inflamatorii alergice, deviatie a septului nazal sau polipi nazali. Tromboflebita sinusului cavernos prin propagarea infectiei orbitare se caracterizeaza prin agravarea sel11nelor oculare 1;>i generale, alterarea con1;>tientului~i aparitia semnelor de l11eningita.

17.7.2. Investigarea etiologidi a infectiilor orbitare Efectueaza sistematic hemoculturi (revezi Cap. 9). Sunt frecvent pozitive cand celulita orbitara complica 0 infectie a tractusului respirator superior la capilul mic. Prelevate importante sunt, cand exista, exsudatul purulent din sinusul maxilar superior (revezi 12.4) sau puroiul conjunctival (revezi 17.2). Olnd oftalmologul practica incizia pentru drenajul infectiilor orbitare in faza de supuratie, preleva 1;>i exal11ineaza probe de puroi (revezi Cap. 11). Daca este suspicionata mucormicoza orbitara trebuie examinate probe biopsice ori rac1at prelevat de oto-rino-Iaringolog din arice zona necrotica a mucoasei nazale sau palatine. Sunt esentiale: • microscopia pe frotiuri colorate Gram 1;>i PAS, eventual pe sectiuni histologice colorate cu hematoxilin-eozina sau prin metoda Grocott-Gomori; • insamantari pe agar-sange, agar-siinge 1;>ocolat, agar Sabouraud, agar-sange anaerob preredus 1;>i, numai probele necontaminate, in bulion triglicolat. In tromboflebita sinusului cavernos se impun hemoculturi 1;>i examenul unei probe de lichid cefalorahidian (revezi Cap. 9 ~i 10).

316

18. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR BACTERIENE IN PATOLOGIA GASTRO-DUODENALA (GABRIELA COMAN) 18.3. DIAGNOSTICUL

18.1. INTRODUCERE 18.1.1. Conditia maeului 18.1.2. Conditia

anatomohistologica

a sto-

microbiologieii

18.1.3. Consideratii

Infectia cu Helicobacter pylori 18.1.4. Patogenia

heilmannii

bolilor gastroduodenale

asociate gastritei

ell H. pylori

18.2. PRELEVAREA, TRANSPORTUL CONSERVAREAPROBELOR

AL

INFECTIEI CU H. pylori 18.3.1. Metode invazive Testul ureazei Microscopia Cultivarea 18.3.2. Metode neinvazive

c1inieo-epidemiologice

Infectia eu Helycobacter

DE LABORATOR

SI

Testul respirator cu uree marcata Diagnosticul serologic Depistarea antigenica In fecale 18.4. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

AL

INFECTIEI CU H heilmannii

18.1. INTRODUCERE Evidentierea, in 1982, prin examen microscopic ~i cultura a Helieobaeter pylori in biopsii de mucoasa gastrica de catre Warren ~i Marshall (Australia), ~i relatia prezentei acestei bacterii cu gastrita antrala constituie una din cele mai importante descoperiri medicale de la sfar~itul secolului XX, pentru care cei doi autori au primit premiul Nobel pentru medicina in 2005. Prin numeroase cercetari ulterioare pe care le-a stimulat, s-a ajuns la implicarea acestei bacterii in afectiuni gastro-duodenale cum sunt u1cerul peptic, cancerul ~i limfomul gastric, modificandu-se astfel brutal concepte etiopatogenice ce pareau definite. Caracterele morfologice (bacili spiralati gram-negativi) ~ifiziologice (microaerofili, azaharolitici) au detenninat includerea initiala a acestei bacterii in genul Campylobaeter sau denumirea de C. pyloridis, apoi C. pylori. Mai recent, studii de taxonomie moleculara au pIed at pentru incadrarea intr-un gen nou, Helicobacter. Investigarea curenta a biopsiilor gastrice pentru infectia cu H. pylori a condus la descoperirea unei alte bacterii spiralate, cu morfologie diferita. Descrisa pentru prima data in 1987 de catre Dent ~icolab., este denumita initial Gastrospirillwll homillls, pentru ca ulterior sa fie inclusa in genul Helieobaeter sub denumirea de H. heibnallnii.

18.1.1. Conditia anatomo-histologidi

a stomacului

Stomacul, primul segment subdiafragmatic al tubului digestiv, reprezinta un organ cavitar cu trei regiuni distincte: cardia, situata distal portiunii terminale a esofagului, corpul gastric, denumit ~ifundus de autorii americani, ~i antrum, reprezentat de treimea inferioara a stomacului, inaintea sfincterului piloric. In stomac se realizeaza mixarea alimentelor ingerate cu sucul gastric bogat in HCl ~i enzime proteolitice. 317

~TI

""""'-~~~--_·~~--

Mucoasa gastrica are structuri ~ifunqii complexe: la nivelul cardiei are loc trecerea de la epiteliul stratificat nekeratinizat la epiteliul gastric constituit din celule cilindrice inaIte dispuse in monostrat pe membrana bazala; la nivelul pilorului are loc inlocuirea gradata a epiteliului gastric cu cel de tip intestinal. Celulele epiteliului gastric realizeaza o secretie apocrina sau holocrina de mucus ce acopera cu un strat de 0,5-2,5 mm grosil11e suprafata mucoasei, cu rol protector fata de agenti agresori endogeni (HCI, enzime proteolitice) sau exogeni. Mucoasa este strabatuta de numeroase orificii ce reprezinta deschiderea unoI' invaginatii, criptele gastrice, in interiorul carora se des chid glandele gas trice, formatiuni tubulare sau ramificate al caror aspect histologic variaza in raport de regiune. Glandele fundice sunt constituite din celule ce secreta majoritatea componentelor sucului gastric: HCI, factorul intrinsec, pepsina. Glandele pilorice, alaturi de celule producatoare de mucus, contin celule endocrine G producatoare de gastrina, care stimuleaza secretia de HCl, ~iin numar mai redus celule D care produc stomatostatina, cu rol inhibitor al gastrinei. In lamina propria se gasesc limfocite in numar foarte redus.

18.1.2. Conditia microbiologica Normal mucoasa gastrica nu este colonizata cu bacterii. Variate specii de streptococi, stafilococi, neisserii, colifonni, anaerobi pot fi prezente in continutul gastric, introduse odata cu alimentele sau prin inghitirea secretiilor oro/nazo-faringiene. pH-ul sucului gastric, cuprins intre 1-4 datorita secretiei de HCl, nu pennite multiplicarea aces tor bacterii de pasaj, multe dintre ele fiind omorite. La persoanele cu hipo- sau aclorhidrie numarul bacteriilor in continutul gastric cre~te semnificativ (> laD/g). La conditiile ostile oferite de stomac este deosebit de bine adaptat H pylori, capabil sa colonizeze cronic mucoasa gastridi, indeosebi antrala. Trei factori fac posibila aceasta colonizare: • producerea de ureaza in cantitate mare hidrolizeaza ureea ~i elibereaza amoniac care tamponeaza pH-ul acid; • forma spiralata ~iprezenta flageIilor unipolari care ii pennit traversarea stratului de mucus pentru a ajunge la niveIul celulelor mucoasei gastrice unde pH-ul este aproape de neutralitate; • prezenta de adezine pe suprafata ceIulei bacteriene, ce realizeazii fixarea speci fica, exclusiv la nivelul receptorilor celulelor epiteliului gastric. Odata stabilit in stomac, H pylori poate persista 0 lungii perioada de timp, chiar toatii viata, disparitia sa spontanii fiind conditionata de instalarea gastritei atrofice Cll metaplazie intestinala ce detennina disparitia receptorilor celulari. Aceastii persistenta este posibila prin faptul ca bacteria este capabila sa reziste la fagocitozii ~i fata de apararea umorala locala (IgA ~i IgG) prin mecanisme inca nedemonstrate. Spre deosebire de flora cOl11ensaliia altor mucoase, prezenta H pylori pe suprafata mucoasei gastrice se insote~te intotdeauna de un infiltrat inflal11ator(limfocite, plasmocite, macrofage, polimorfonuc1eare), cu aparitia gastritei de tip B, depistatii prin examen histopatologic. Uneori in lamina propria se constituie foliculi limfoizi care, prin dil11ensiunea lor, mai ales la copii, pot proemina spre lumenul gastric detenninand gastrita nodularii antralii ce poate fi observatii endoscopic. Eradicarea terapeutica a bacteriei se insote~te intotdeauna de vindecarea procesului inflamator. 318

Prezenta in mucus gastric a H. heilmannii este mult mai rar intalnita, forma sa spiralata, flagelii multipli bipolari ~iproducerea de ureaza pennitandu-i de asemenea sa se implanteze in acest ecosistem restrictiv. Ca ~i in cazul H. pylori, colonizarea este insotita de 0 gastrita eroniea activa. Prezenta eoneomitenta a eelor doua baeterii pe mueoasa gastrica este foarte rara in raport eu prevalenta infectiei eu H. pylori in populatia generala, eeea ee presupune existenta unei relatii de antagonism intre aeeste speeii.

18.1.3. Consideratii clinieo-epidemiologiee 18.1.3.1. Infeetia ell H. pylori. Consecintele cliniee ale infectiei cu H. pylori au fost eomparate metaforic cu un "aisberg", partea scunfundata corespunzand cazurilor majoritare cu gastrita cronic a asimptomaticil, iar varfurile vizibile fiind reprezentate de u1cerul peptic ~i caneerul gastric. Este in discutie existenta unui al treilea varf care ar corespunde dispepsiei neu1ceroase. Se considera ca infectia cu H. pylori este cea mai frecventa ~i persistenta infectie din lume, care afeeteaza aproximativ jumatate din populatia globului. Frecvenla cre~te progresiv eu varsta, intr-un mod diferit in tarile dezvoltate fata de cele in curs de dezvoltare: in acestea din urma colonizarea are loc la varste mult mai mici, iar prevalenta infectiei la adult este mult superioara. Sursa de infectie este reprezentata de om, fiind suspectata calea de transmitere oral-orala ~i cea fecal-orala. In transmiterea infectiei pare necesar contactul strans intre persoane, legat de rezistenta scazuta a H. pylori in mediul extern, cazurile fiind in special grupate intrafamilial sau in coleetivitati parafamiliale. De~i recent, a fost dovedit ca aceasta bacterie poate coloniza mucoasa gastrica la pisici, nici un caz de transmitere directa de la animalla om nu a fost documentat. 18.1.3.2. Infeetia ell H. heilmannii. Manifestarile clinice sunt de tip dispeptic, uneori intense, prin endoscopie putandu-se evidentia la unele cazuri eroziuni sau u1ceratii multiple, in speeialla nivelul mucoasei antrale. Prevalenta infectiei este mult mai scazuta, eomparativ eu H. pylori, apreciata intre 0,25-1,9% la persoanele care au fost supuse unui examen endoscopic gastric. Din 987 copii, intre 3 ~i 16 ani, examinati prin biopsii gastrice la Spitalul clinic de Copii "Sf. Maria" - Ia~i, 18 (1,8%) au avut gastrita cu H. heilmannii (date personale comunicate). Infeetia este suspeetata a fi 0 zoonoza intrucat bacterii necultivabile cu caractere morfologice ~i structurale asemanatoare, dar al caror genom nu a fost caracterizat, au fost puse in evidenta la caini, pisici, porci.

18.1.4. Patogenia bolilor gastro-dllodenale asociate gastritei ell H. pylori Dupa un episod acut de scurta durata, infectia cu H. pylori detennina constant 0 inflamatie eronicil a mueoasei gastrice antrale care ere~te riscul aparitiei u1cerului duodenal, gastrita gastrofundica fiind faetorul de rise pentru ulcerul gastric. Bacteria intervine in u1cerogeneza prin dous. mecanisme fundamentale: direct, prin diminuarea rezistentei 319

mucoasei fata de factori agresivi, ~iindirect, prin cre~terea secretiei acide gastrice consecutiv cre~terii nivelului plasmatic al gastrinei ~i seaderii concentratiei stomatostatinei. Gastrita cronica cu H. pylori este considerata, de asemenea, un factor maj or de risc in aparitia eancerului gastric prin evolutia sa in timp spre 0 gastrita atrofidi ~imetaplazie intestinal a, cu extindere spre corpul gastric. Studii sero-epidemiologice au aratat ca la cei cu gastrita eu H pylori exista un risc aproximativ de 6 ori mai mare de a face cancer gastric. In 1994, in cadrul unei reuniuni a expertilor O.M.S., H. pylori a fost incadrat in grupa I de agenti cancerigeni, fiind prima bacterie careia i se recunoa$te un asemenea rol. H. pylori intervine in aparitia limfomului gastric de tip MALT ("mucosa associated lymphoid tissue ") eu celule mici B, prin inducerea constituirii foliculilor limfoizi in lamina propria. Involutia tumorii sub efeetul eradidirii bacteriei prin antibioticoterapie constituie 0 situatie neintiUnita in bolile neoplazice ~i pledeaza, in plus, in favoarea unei relatii de cauzalitate. Implicarea H pylori in aparitia unor boli atat de diferite, ce survin la un numar redus de persoane, comparativ cu cele infectate, poate fi explicata prin existenta unor tulpini diferite ca virulenta (producatoare de citotoxina vaeuolizanta, posesoare ale antigenului Cag A etc.) care determina infectii la persoane cu anumita predispozitie genetica, in prezenta unor factori de mediu favorizanti (obieeiuri alimentare, tabagism, stress, avfmd de asemenea importanta varsta la care survine infectia). Sunt considerate astfel aceste afectiuni gastro-duodenale ca boli multifactoriale in care prezenta H. pylori este necesara, dar nu suficienta. 18.2. PRELEVAREA, TRANSPORTUL ~I CONSERVAREA PROBELOR Metoda de referinta in diagnosticul infectiei eu H. pylori 0 reprezinta evidentierea bacteriei in biopsiile gastrice prelevate in cursu 1 examenului endoscopic. 0 conditie importanta este ca bolnavul sa nu fi unnat un tratament recent (cel putin 0 luna de zile) cu antibiotice, saruri de bismut sau inhibitori ai pompei de protoni. H. pylori are 0 repartitie neuniforma la nivelul mucoasei gastrice, de aceea se recomanda prelevarea de fragmente multiple de mucoasa, atilt, antrala (la aproximativ 2 cm de pilor), cat ~i fundica (in regiunea marii eurburi). Prezenta bacteriei in sucul gastric este mult mai rar intalnita, incat examinarea acestui produs nu este utila. In conditii ideale de investigatii se recolteaza din cele doua regiuni cate 4 fragmente cu unnatoarele destinatii: • Un fragment va fi plasat direct in mediu cu uree ~i indicator de pH pentru evidentierea ureazei prefonnate. • Alte doua fragmente destinate evidentierii H. pylori prin frotiu ~i cuItura vor fi depuse intr-un flacon cu solutie salina izotona pentru a evita desicatia probelor ~icontactul cu aerul atmosferic; 0 altemativa 0 constituie folosirea unei solutii hipertonice de glucoza 20g%, care impiedica deta~area stratului de mucus. • Un fragment este destinat examenului histopatologic, fiind depus intr-un flacon cu solutie fixatoare: formol sau solutie Bouin. Prelevarea biopsiilor de la nivelul antrului ~i corpului gastric permite incadrarea unei gastrite in "sistemul Sydney", cea mai modema c1asificare. 320

Conservarea probelor in vederea cultivarii este pennisa numai la 4°C pentru maximum 4 ore. Daca se depa~e~te, fortuit, acest interval, este necesar un mediu de transp0l1 (Stuart sau Portagerm pylori-bioMerieux), in care proba poate fi mentinuta la 4°C pana la 24 ore. Dupa acest interval de timp conservarea este posibila numai la -70°C. 18.3. DIAGNOSTICUL

DE LAB ORATOR AL INFECpEI

CU H.PYLORI

Infectia cu H. pylori este investigata in scop de: • diagnostic la persoanele cu 0 simptomatologie digestiva supeIioara; • verificare a eradicarii bacteriei la persoane care au urmat un tratament cu antibiotice; • studii epidemiologice, pentru aprecierea incidentei infectieiin anumite grupe populationale. Posibilitatile de diagnostic sunt multiple, fiind alese preferential in raport cu scopul urmarit. Sunt metode invazive ce permite evidentierea H. pylori sau a ureazei bacteriene la nivelul biopsiilor de mucoasa gastrica ~i metode neinvazive, indirecte.

18.3.1. Metode invazive l8.3.1.I.Testul ureazei consta in decelarea prezentei ureazei produse de H. pylori in fragmentul biopsic prin plasarea acestuia intr-un mediu tamponat cu 2% uree (Jichid sau agarizat) ~i un indicator de pH, ro~u fenol. Ionii de amoniu rezultati alcalinizeaza mediul ~i modifica culoarea indicatorului de la galben la roz-ro~u dupa un interval de timp care variaza in raport cu numarul bacteriilor prezente. Testul se cite~te la 30 minute, o ora, 3 ore ~i 24 ore. lncubarea la 37°C grabe~te desfa~urarea reactiei. Pot fi folosite teste comercializate (CLO-test, CP-test, Helico-test etc.) sau preparate in laborator ("in house"-test), care dau rezultate asemaniltoare, primele pozitivandu-se, in general, mai rapid. Sensibilitatea testului cre~te proportional cu durata incubarii la 37°C. Astfel, intr-un studiu in care autorii au folosit "CLO-test", 66% din probe au fost pozitive dnd citirea s-a facut la 30 minute, 79% la 0 ora, 87% la doua ore ~i 100% la 24 ore. Sensibilitatea globala raportata la cultura a fost de 90%. Utilizand un reactiv preparat in laborator, 39%, 74%, 89% ~i 100% din probe s-au pozitivat, respectiv la 30 minute, 0 ora, trei ore ~i 24 ore (date personale necomunicate). Specificitatea testului este de aproape 100% numai cand virarea indicatorului este urmarita pana la 4 ore. Intr-un numar redus de cazuIi testul poate fi pozitiv cand evolueaza o gastrita cu H. heilmannii. Cand pozitivarea testului este apreciata la 24 ore pot fi inregistrate rezultate fals pozitive la pacienti cu aclorhidrie ce pot avea in stomac, in numar important, bacterii de origine orofaringiana produciltoare de ureaza: stafilococi, Proteus. Klebsiella etc. Din 500 biopsii gastrice prelevate de la copii, 238 au avut testld ureazei pozitiv, din care 36 la 24 ore; la 13 din probele tardiv pozitive, care nu s-au confinnat microscopic, s-au izolat din reactivul virat K. pneumoniae (10 cazuri) sau stafilococi produciltori de ureaza (3 cazuri) (date personale necomunicate). 321

18.3.1.2. Microscopia. H. pylori poate fi recunoscut la microscopia cu imersie dupa morfologia sa caracteristica: bacili incurbati in forma de virguli'i sau, mai ales, cu aspectulliterei S, uneori spiralati, cu dimensiuni de cca 2-6 Ilm, prezenti in stratul de mucus juxtaepitelial, in cripte sau ata~ati pe suprafata celulelor epiteliului gastric. Exista doua posibil,itati de realizare a examenului microscopic direct: • Prin examinarea frotiului din fragmentul biopsic colorat prin metoda Gram sau coloratia simpla cu fucsina Gram timp de 5 minute (fig. 18-1). Metoda este rapida permitand emiterea rezultatului in aceea~i zi in care s-a efectuat endoscopia . • Pe sectiunea histologica colorata Giemsa (fig. 18-2). lntervalul de timp necesar etapelor de lucm temporizeaza emiterea rezultatului. Coloratia Warthin-Starry, folosita initial, este laborioasa, constisitoare ~i, uneori, capabiIa sa dea artefacte.

Fig.lS-I.

Helicobacter pylori: frotiu din biopsie de mucoasii antralii.

Fig. 18-2. Heticobacter pylori in sectiune histologicii de mucoasa antrala.

322

Sensibilitatea examenului microscopic depinde de experienta ~i con~tiinciozitatea microbiologului sau anatomo-patologului, fiind considerata superioara testului ureazei. Repartitia neuniforma a bacteriei pe lama face ca examinarea sa durere 20 minute sau chiar mai mult. Specificitatea examenului microscopic efectuat in conditii obi~nuite nu este absoluta intrudit, la nivelul mucoasei gastrice pot fi prezente, in 1-2% din cazuri, Campylabaete!; jejuni, subspecia doylei sau specii de Campylobaeter din cavitatea bucaIa (c. sputorum, C. eoneisius) care prezinta 0 morfologie asemani"itoare; eroarea este po sibil a mai ales in cazul probelor cu scor redus de colonizare. Utilizarea anticorpilor monoclonali anti-H. pylori, intr-un test de imunofluorescenta, permite identificarea corecta a speciei, atat a formelor morfologice tipice, cat ~i a celor atipice (fonne cocoide). 18.3.1.3. Cultura. Un fragment biopsic va fi dispersat intr-o cantitate redusa de solutie salina izotona (0,5 ml) fie prin mojarare, fie de preferat, folosind un triturator electric (Ultraturex T25). Oite doua picaturi din omogenizat sunt depuse pe suprafata unui mediu selectiv ~i neselectiv, apoi inoculul este dispersat cu ansa sau pipeta Pasteur inchisa. Sunt autori care recomanda folosirea a doua medii selective pentru a cre~te randamentul metodei. Placile sunt incubate la 37°C, intr-un recipient etan~ in care sunt asigurate conditii de microaerofilie (5% 0" 10% CO)' 85% No) cu ajutorul unui generator chimic (Oxoid, Merck Diagnostic) ~i 0- atmosfera:- umeda. -Examinarea culturilor se realizeaza zilnic incepand din ziua a treia pana in ziua a ~aptea, urmarindu-se aparitia coloniilor de H. pylori (mici, transparente) care unneaza a fi identificate microscopic ~i biocbimic. Metoda este costisitoare ~i ofera un rezultat relativ tardiv. Are avantajul unei specificitati de 100% ~ipennite testarea sensibilitatii la antibiotice (metronidazol, macrolide, chino lone ) a tulpinilor izolate, mai ales dupa e~ec terapeutic. Sensibilitatea metodei variaza intre 75-90%, in raport cu conditiile tehnice asigurate: transportul probelor, numarul de biopsii examinate, medii utilizate. Intrucat nici una din cele trei metode invazive nu are 0 sensibilitate de 100% "goldstandard" -ul diagnostic este reprezentat de utilizarea concomitenta a acestora. In laboratoarele care nu dispun de conditii de realizare a culturii se accepta folosirea numai a testului ureazei ~i examenului microscopic. 18.3.1.4. Metode moleculare. PCR ("Polimerase Chain Reaction") este folosita in laboratoare de referinta pentru examinare directa a probelor sau dupa cultivare. Aceasta telmicii, fiind capabila sa evidentieze un numar redus de bacterii (10-100 bacterii), a pennis demonstrarea prezentei H. pylori in placa dentara sau materii fecale. De asemenea poate servi la identificarea genei eagA frecvent asociata cu boala ulceroasa, gash-ita atrofica, carcinomul sau limfomul gastric pre cum ~i la depistare rapida a tulpinilor rezistente la claritromicina sau tiparea moleculara a tu1pinilor in cercetari epidemiologice.

18.3.2. Metode neinvazive Metode1e neinvazive sunt tehnici indirecte, care nu necesita examinarea endoscopicii gastro-duodena1a, dificil de suportat de catre pacient; e1e permit 0 explorare globalii a infectiei cu H. pylori, eliminand erorile de e~antionaj care pot sa intervina la urmarirea bacteriei in biopsia gastrica. 323

"--'-"c~;~;j~m~m~

18.3.2.1. Testul respirator eu uree mareaHi. Principiul testului se bazeaza pe intensa activitate ureazica prezenta in stomac atunci cand H. pylori colonizeaza mucoasa gastrica. Ingerand uree marcata c1l13c (neradioactiv) sau 14C (radioactiv), sub actiunea enrimei va fi eliberat CO2, marcat ce unneaza a fi absorbit in circulatia sanguina ~i eliminat prin plamani, putand fi detectat ~i cuantificatt in aerul expirat. Se prefera a fi folosita uree cu 13C,ce poate fi administrata la orice varsta, inclusiv la femeia gravida. Testul consta in administrarea unei solutii ce contine 100 mg uree marcata, anterior cu 10 minute pacientul primind un pranz standard bogat in lipide sau cu acid citric, care intarzie evacuarea continutului gastric crescand randamentul metodei; inainte ~i dupa 30 minute de la inceperea testului se realizeaza recuperarea aerului expirat intr-un sac de material plastic pentru detenninarea 13CO,prin spectroscopie de masa. Sensibilitatea testului variaza intre 90-98~{ iar specificitatea atinge 99%. Este, in special, indicat ca metoda de apreciere a eficientei tratamentului cu antibiotice in eradicarea infectiei: practicat dupa 4-6 saptamani de la tenninarea schemei terapeutice, permite identificarea pacientilor la care tratamentul nu a fost eficace. Alte indicatii: depistaj preendoscopic al infectiei cu H. pylori la pacienti prezentand tulburari dispeptice, cu varsta mai mica de 45 ani (peste aceasta varsta examenul endoscopic este obligatoriu, din cauza frecventei cancerului gastric) ~iin studii epidemio logice, avand avantajul, in raport cu examenul serologic, de a decela numai pe cei cu infectia activa. Singurul inconvenient al testului, darmajor, il reprezinta dependent a de echipamente speciale, extrem de costisitoare, ceea ce il face accesibil numai un or centre ultraprofilate ~i dotate. 18.3.2.2. Diagnosticul serologic. lnfectia cu H. pylori se insote~te, aproape in toate cazuri1e, de prezenta in ser a anticorpilor specifici, in special de tip IgG. o serie de reactii serologice au fost evaluate, cea mai utilizata in prezent fiind testul ELISA. Specificitatea 'metodei este dependenta de natura antigenului folosit. Antigene de prima generatie, reprezentate de lizate sau sonicate de corpi bacterieni., prin prezenta unor fractiuni comune cu specii de Campylobacter, dau numeroase reactii fals pozitive. Cele mai optime pentru serodiagnostic s-au dovedit antigenele semipurificate sau imbogatite ce sunt in prezent comercializate de catre firme producatoare (Pyloragen, Helico G, Cobas Core etc.). In general, aceste teste demonstreaza 0 buna sensibilitate (80-95%) ~i specificitate (85-95%). Anticorpi anti- H. pylori pot fi evidentiati in saliva. cu 0 sensibilitate $i specificitate mai reduse (81 %, respectiv 73%). Performanta trusvlor comerciale in decelarea infectiei s-a demonstrat variabila in raport cu prevalenta H. pylori in populatia studiata. Pragul de pozitivitate recomandat de fabric ant nu corespunde intotdeauna cu cel ideal, pentru 0 populatie data; de aceea este necesara detenninarea pragului optim prin construirea curbei caracteristicilor operationale. cunoscuta sub numele de curba ROC (,,Receiver Operating Characteristic") inainte ca un antigen sa fie folosit in practica curenta. Limitele testelor serologice sunt legate de existenta unor reactii fals pozitive (in infectii cu C. jejuni sau datorate unor titruri remanente dupa vindecarea infectiei) sau fals negative (infectii surprinse in faza precoce, inainte de seroconversie, sau la pacienri care nu raspund prin IgG). De aceea ele sunt indicate, preferential, in studii epidemio324

logice, la aceasta contribuind caracterullor neinvaziv $i costul relativ sdizut. Unii autori, in scopul de a diminua numarul de endoscopii, in special la copii $i tineri, au folosit determinarea anticorpilor IgG serici ca triaj preendoscopic, iar scaderea semnificativa a anticorpi10r serici dupa 4-6 1uni de la terminarea tratamentului antibacterian poate servi pentru aprecierea eficientei acestuia pe tennen lung. Studii serologice recente s-au axat pe cercetarea printr-o metoda calitativa, Western-Blot, a anticorpilor fata de anumite anti gene proteice prezente la H. pilori, al caror profil poate indica un anumit tip de patologie asociat infectiei; decelarea anticorpilor fata de antigenul CagA s-a demonstrat mai sensibila dedit metodele moleculare in identificarea infectiilor cu tulpini virulente. 18.3.2.3. Evidentierea antigene10r H. pylori in materii fecale. Recent, acest test neinvaziv direct imunoenzimatic a fost propus pentru diagnosticul infeqiei cu H. pylori, cu 0 sensibilitate $i specificitate asemanatoare cu testul respirator cu uree marcata. Grupul European pentru Studiul H. pylori 11considera ca 0 posibila alternativa a acestuia in diagnosticul initial al infeqiei sau pentru uffi1arirea eficientei terapiei antibacteriene. In tabelul18-l sunt redate, comparativ, caracteristicile celor 6 metode mai frecvent utilizate in diagnosticul infectiei cu H. pylori. Tabelul 18- J Compararea

diferitelor

teste utilizate pentru diagnostieul

infeetiei eu Helicobacter pylori

+++ + ++ +++ ++ ++ Teste +++ + +++ Cost Sensibilitate + ++ ++(+) Simplitate Rapiditate Specificitate I Culturiirespirator Testul (l3C)

18.4. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC CU H. HEILMANN!!

AL INFECTIEI

Diagnosticul etiologic este exclusiv microscopic, prin recunoa$terea bacteriei dupa criterii morfologice in frotiul din fragmentul de mucoasa antral a colorat cu fucsina Gram sau, cu randament mai scazut, in seqiuni histologice colorate Giemsa. H. heilmannii se prezinta sub forma de bacili spiralati, cu dimensiuni de 4-6 11111, cu 4-8 spire stranse, regulate (aspecte de "tirbu$on"), avand 0 orientare, in general, rectilinie, dispu$i izolati, dar mai ales grupati in stratul de mucus la distanta de celulele epiteliului gastric (fig. 18-3). Testul ureazei prefonnate este inconstant pozitiv, intrucat H. heilmannii produce enzima in cantitate mai redusa, comparativ cu H. pylori, pozitivitatea fiind dependenta 325

Fig. 18-3. Helicobacter heilmannii

frotiu din biopsie de mucoasa antrala.

ii

de masivitatea colonizarii mucoasei gastrice. Pe 0 cazuistica de 18 gastrite cu H. heilmann la copii, 8 dintre ace~tia au avut testul pozitiv pana la 3 ore, 6 la 24 de ore ~i 4 probe au fost negative (date personale comunicate). Multiplicarea acestei specii s-a obtinut numai in vivo, dupa inoculare intragastrica la ~oarece, tentative de cultivare pe medii artificiale ramanand inca tara succes. Imposibilitatea de a fi cultivat in vitro nu a permis obtinerea de antigene pentru un eventual diagnostic serologic al infectiei.

19. DIAGNOSTICUL DE LAB ORATOR IN SINDROMUL DIAREIC INFECTIOS (MARIAN NEGUT) 19.1. INTRODUCERE 19.2. PARTICULARITATI ALE DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC iN SINDROMUL DIAREIC INFECTIOS 19.3. METODOLOGIA INVESTIGARII DE LABORATOR A SINDROMULUI DIAREIC INFEqIOS 19.3.1. Prelevarea probelor 19.3.1.1. Prelevarea din Scalll1 emis spontan 19.3.1.2. Prelevarea recta Iii 19.3.2. Examinarea primarii a prelevatului 19.3.2.1.Examinarea macroscopicii 19.3.2.2. Examinarea directii • Microscopia electronicii • Microscopia opticii Preparate umede Preparate fixate 19.3.3. Examinarea bacteriologicii 19.3.3.1.lzolarea bacteriilor aerobe

Medii selective pentru Enterobacteriaceae Medii pentru genul Vibrio • Identificarea preliminara a izolatelor 19.3.3.2.1zolarea bacteriilor lIIicroaen~file • Izolarea prin imbogiitire • lzolarea rara imbogalire 19.3.3.3. fzolarea bacteriilor anaerobe • lzolarea cu imbogatire • Izolarea tara imbogatire • Depistarea toxinelor Cl. d(fficile in materiile fecale 19.3.4. Examinarea micologicii 19.3.4.1. Microscopia directii 19.3.4.2. fzolarea levurilor 19.3.4.3. Identificarea preliminarii 19.3.5. Examinarea virologicii 19.3.5.1. Prelevarea probelor 19.3.5.2. Detectarea virusurilor

• lzolarea cu imbogiitire • lzolarea rarii imbogiitire sau izolarea directii

• Microscopia electronica directii • Imunomicroscopia electronica • Teste imunoenzimatice • Latex-aglutinarea

19.1. INTRODUCERE Boala diareiea este, dupa bolile eardiovaseulare, a doua eauza de deees la seadl globala ~i ramane al treilea eel mai freevent sindrom intalnit in praetiea medicala. In multe tari in curs de dezvoltare este prima eauza de mortalitate infantilii ~i eumuleaza singura mai multe eazuri de deees decat toate eelelalte boli impreuna. Estimarile indica 4 600 000-6 000 000 decese infantile anual, in Asia, Africa ~i America latina ~i peste 10 000 in S.u.A. Boala diareiea a eonstituit eauza majora de spitalizare in eadml tmpelor S.U.A. din Vietnam ~i Arabia Saudita ~i a insumat un numar apropiat de spitalizari eu eel determinat de aetiunile ostile. Rata generala a bolilor gastro- intestinale in S.U.A. variaza intre 1,5 ~i 5 imbo Inaviril persoana per an, mai mare la eopii ~i tineri ~i in ariile urbane ~i suburbane. Statistieile ofieiale din tara noastra din perioada 1995-2004 releva morbiditatea prin diaree infeetioasa ca fiind cea mai frecventa in bolile transmisibile ~i situata intre 50 ~i 60%000 locuitori. Estimarile sunt insa mult mai pesimiste. Soeotind Cll adresabilitatea medical a la noi este foarte redusa in formele u~oare ~i chiar medii ale adultului (care prefera "autoterapia"), se apreciaza ea numaml imbolnavirilor prin boala diareica este de eel putin 3-4 ori mai mare decat eel inregistrat. 327

Sindromul diareic este reprezentat in patologia infec!ioasa printr-o gama larga de entitii!i cliriice cu particularitii!i simptomatice ~i evolutive detenninate in primul rand de agentul etiologic. In tabelull9-1 sunt inscrise principalele etiologii cunoscute in prezent ~i coresponden!a clinica in care sindromul diareic este numai una din manifestari. Tabellil 19-1

Etiologia sindromului diareic infectios

- disbacteriotic ce ladiareic Etiologia Dizenteria amoebiana Enterocolita C. albicans Sindr. V. Aero11lonas cholerae diareei toxiinf. necrozanta aFebrele adul- enterice Imunodiareic . Virusurile Trichinella Yersinioze Sindrom n.n. Diareea G.lamblia sindr. diareic caliitoriilor IIdiareic: diareic in Salmoneloze Candida Sindr. Rotavirus diareic toxiinfectios disbacteriotic Clostridium precede Klebsiella Enterobacteriaceae bacilara Norwalk vir. E. histolwica. E.a spp. coli -holera imunodeficienti Agentul diareic/toxiinfecrios Campylobacter Campylobacterioze je;unilC. coli Grupa Tr. spiralis Salmonella spp. Cl. difficile nou-nascuti colita hemoragica Criptosporidium Diareea maligna n.n.infestarile Entitatea c1inica nti estariJe sistemice tului hidrice EPEC Enterocolita necrozanta a n.n. Pseudomonas Plesio11lonas siella erocolwica Adenovirus pseudomembranoasa etc. ?enes acter coli encia s sindr. hemoragic uremic la spp. rfringens ahaemol.

Legenda: enterohemoragic; enteroagregativ

328

EPEC:C. coli enteropatogen; EIEC = E. coli enteroinvaziv;

ETEC = E. coli enterotoxigen; EAEC = E. coli enteroaderent;

EHEC = E. coli EAgEC = E. coli

Frecventa mai mare reprezentata de bacteriozele intestinale - shigeloze, salmoneloze, in statisticile oficiale din tara noastra in perioada 1995-2004 nu reprezinta incidenta reala a etiologiilor posibile, ci mai degraba preocuparile ~i limitele activitatii laboratoarelor de specialitate echipate indeosebi pentru determinarea acestor etiologii bacteriene. Chiar ~i cele mai bine echipate laboratoare nu reu~esc insa sa precizeze etiologia la mai mult de 70-80% din cazuri, fie din imperfec!iunea mijloacelor actuale, fie din interventia unor etiologii ignorate, necunoscute. Motivatia clinica, terapeutica ~i mai ales epidemiologica justifica insa serioasele eforturi umane ~i materiale solicitate de activitatile laboratoarelor in acest domeniu. Definitoriu, sindromul diareic este 0 entitate clinica, ce se caracterizeaza prin scaune frecvente (3-40/24 ore), de consistenta redusa (uneori apoasa) insumfmd volume mari de pierderi lichidiene (uneori pfma la 20 litri/24 ore) ce pot duce la dezechilibrari hidroelectrolitice insotite de tulburari hemodinamice grave (colaps cardiovascular) cauzatoare de deces. Sindromul febril abdominale, insote~te sindromul diareic infectiossunt ialj,fenomenele digestive (inapeten!a, greata, dureri balonare, flatulenta) prezente In diferite grade de intensitate.

19.2. PARTICULARITA.p ALE DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC IN SINDROMUL DIAREIC INFECTIOS 1) Multitudinea agentilor etiologici (virali, bacterieni, parazitari) necesita metodologii diferite aplicate concomitent aceluia~i prelevat. 2) Flora bacteriana nonnala bogata continuta in materiile fecale (> 1012 UFC/g) impune selectarea cu discernamant ~i identificarea patogenilor enterici ocazionali sau recunoscuti. 3) Granita dintre patogeni enterici "recunoscu!i" ~i cei "conditionat patogeni" este din ce in ce mai prost definita datorita punerii in evidenta de factori noi de agresivitate: enterotoxine, factori de enteroaderenta ~i enteroinvazivitate etc. Evidentierea acestor atribute de patogenitate este inca anevoioasa ~i greu accesibila multor laboratoare. 4) $ansa de izolare a patogenilor enterici cre~te, in anumite limite, cu volumul probei ~i numarul de colonii investigate din fiecare proba. Aceasta cerin!a duce la amplificarea considerabila a consumurilor, materiale ~i de fort,a de munca, ce impun uneori reducerea investigarilor ~i abordarea numai a etiologiilor frecvente. 5) Ubicuitarismul unor entitati taxonomice patogene impune, din ra!iuni epidemiologice, caracterizarea acestora pe criterii ce depa~esc gran ita "speciei": serotipuri, biotipuri, lizotipuri, bacteriocinotipuri etc. 6) Numarul mic de unitati infectante/g materii fecale ca ~i eliminarea sporadica la cazurile de portaj sunt surse curente de eroare ce angajeaza la folosirea unor proceduri de Imbogatire a prelevatului ~i repetarea examenului negativ. 329

Evolutia acutii, de scurtii duratii, ~i riispunsul imun serologic nesemnificativ reduc utilitatea diagnosticului serologic numai la salmonelozele sistemice (febra tifoidii ~i paratifoide) yersinioze ~i viroze. 193. METODOLOGIA

INVESTIGA.RII

DE LAB ORATOR

in practica actualii a diagnosticului virologic ~i bacteriologic (mai restrfms parazitologic) al sindromului diareic sunt conturate douii tipuri de metodologii: a) Metodologii conventionale bazate pe postulatele lui Kock unniiresc "izolarea ~i identificarea agentului cauzal", deci cultivarea ~i caracterizarea sa fenotipicii. b) Metodologii neconventionale ce pun in evidentii prezenta agentului etiologic in prelevat prin identificarea unor elemente structurale (antigenice ori genetice) caracteristice (fig. 19-1). Datoritii densitiitii bacteriene imense, 1012 bacterii/g materii fecale, ~i numiirului mare de entitiiti taxonomice prezente simultan in scaun "metodele neconventionale" (imunofluorescentii, latex-aglutinare, coaglutinare, tehnici imunoenzimatice), de~i initial in faza de cercetare ~i chiar experimentalii au dat rezultate promitiitoare, nu s-au putut impune in practica de diagnostic. Din acelea~i ratiuni nici tehnicile de biologie molecularii, bazate pe recunoa~terea structurilor genetice caracteristice prin hibridare dupii amplificarea genic ii, s-au aplicat in micii miisurii in investigarea sindromului diareic de etiologie bacterianii ..

I. CONVENTIONALE

- Izolarea ~i identificarea agentului etiologic prin cultivare: coprocultura, cultivare de virusuri

2. NECONVENTIONALE

- Punerea in evidenta a agentului etiologic sau structurilor sale caracteristice prin: - MET.

IMUNOLOGICE

Identificarea structurilor antigenic caracteristice prin: - Imunofluorescenta (directa, indirecta) - Aglutinare (latex aglutinare, coaglutinare) - Imunodifuzie/imunobloting - Imunoenzimatice - Alte imunoteste - MET. GENETICE Recunoa~terea agentului etiologic prin: - Amplificarea genica cleici Fig. 19-1 -Metodele

330

diagnosticului

direct al sindromului

~i hibridare

diareic infectios.

aClZl nu-

PRELEVAT

~ EXAMINAREPRIMARA

MATERII FECALE--+

REFRIGERARE +4° C (CONGELARE LA -7Q"C) > 24 ore cand CONSER VAREA este DETECTARE - ANTIGENE ~ - VIRUSURI ETIOLOGII VIRALE

1 ETIOLOGII PARAZIT ARE

CULTlVARE (COPROCUL TURA)

1 ETIOLOGII

/'

~

~

BACTERIENE

~

MICOTICE

~

AEROBE MlCROAEROFILE ANAEROBE Fig. 19-2. Diagnosticul

microbiologic

in sindromul

diareic.

Metodologia curent preconizata pentru diagnosticul microbiologic al sindromului diareic este prezentata schematic in figura 19-2. Avand in vedere plurietiologia acestui sindrom posibilitatile de diagnostic trebuie sa anvizajeze 0 investigare multidirectionala. Schema din figura 19-2 prezinta directiile majore, dar nu to ate laboratoarele pot dispune de mijloacele necesare abordarii tuturor acestor etiologii. In consecinta, practic, se abordeaza etiologii unilaterale indeosebi bacteriene aerobe ~i mai rar virale, din care cauza precizarea etiologica rareori depa~e~te 50-60% din cazuri. Oricare ar fi directia diagnosticului, etapa comuna de plecare, respectiv prelevarea, determina prin corectitudinea ei succesul investigarii. Subliniem importanta acestei etape, deoarece actul prelevarii este lasat deseori la latitudinea pacientului sau, in cazuri mai fericite, in preocuparea unor cadre cu pregatire elementara ori medie, frecvent insuficient instruite.

19.3.1. Prelevarea probelor Ca in toate metodologiile ce se bazeaza pe izolarea ~i identificarea agentului etiologic, prelevarea trebuie facuta cat mai aproape de debutul bolii ~i inaintea instituirii oridirui tratament antimicrobian. Ea poate fi prelevare din scaun emis spontan sau prelevare rectaHi. 19.3.1.1. Prelevarea din scaun emis spontan. Este de preferat ~i se indica in toate formele de diaree acuta cand emisia de materii fecale este frecventa. Pentru defecare se preconizeaza containere de unica utilizare din carton sau material plastic care sa poata fi decontaminate ~i indepartate cu u~urinta dupa efectuarea prelevarii. 331

------~----.--.--~--

~-~~--~~~~~~~"'.,,~""""-"'

•• '-------------

1II!iill:c

• Pentru examinari bacteriene 9i parazitare prelevarea din masa fecaloida se face cu tamponul sau "lingurita" coprorecoltorului vizand portiunile lichide ~i indeosebi cele mucoase ~i/sau sanguinolente atunci cand ele exista. Volumul recoltei trebuie sa fie minimum 3-5 cm3• • Pentru izolari ori examene virologice (rotavirusuri) se preleva in container steril 5-10 cm3 materii fecale care se refrigereaza ~i se pastreaza ca atare la +4°C pana in momentul examinarii. Daca se preconizeaza a pastrare mai lunga de 24 are se recomanda congelarea prelevatului la -70°C pentru a impiedica proliferarea micotica ~i bacteriana. 19.3.1.2. Prelevarea rectalii. Acest mod de prelevare este recomandat in shigeloze cronice, unde raclarea mucoasei rectale cu tamponul ori sanda da ~anse mai mari izolarii, ~i la investigarea purtatorilor de Shigella ~i Salmonella cu exceptia celor de S. t)'plzi. Este mai putin indicata in salmoneloze, yersinioze ~i campilobacterioze acute in care agresiunea bacteriana este ileo-jejunala ori colica inalta. La prelevarea rectal a se recomanda folosirea sondelor Nelaton (ur. 14-16) ori a unor tampoane adecvate (cu tija lunga ~i tampon bine ata~at care sa nu pennita retentia intrarectala). Exista dispozitive comerciale continand tampoane in tuburi de plastic cu sau :tara mediu de conservare. Pentru 0 prelevare corecta tamponul, umectat in prealabil cu solutie salina izotona (a nu se folosi geluri lubrifiante), se penetreaza in sfincterul anal prin rotare lenta ~i se introduce intrarectal aproximativ 15 cm. In acela~i mod se va proceda ~i cu sonda Nelaton la care se adapteaza 0 seringa (preferabil de 10 ml) cu care se fac 1-2 aspiratii. Dupa prelevare, atat sondele cat ~i tampoanele se introduc in tuburi sterile cu dop sau epubetecu mediu de conservare, preferabillichid, care sa permita a buna eluare a prelevatului. Regula: Orice prelevat care nu se fnsamanteaza pe medii de izolare (fmbogatire ori selective) fntr-un interval minim de doua ore trebuie supus unui proces de conservare. Sunt cunoscute mai multe procedee: • Conservarea prin refrigerare: este limitata pentru etiologiile bacteriene la cel mult 14 ore la +4°C. Se practica curent ~ipentru rotavirusuri. Cand conservarea dureaza mai mult de 24 ore, prelevatul trebuie congelat la -70°C. • Conservarea sub forma uscata - recomandata numai pentru bacterii enteropatogene, cu mai multi ani in unna, in zonele foarte calde ~i conditii de transport precare. Prelevatul absorbit pe rondele ori benzi de hartie poroasa este uscat la temperatura mediului inconjurator, protejat in plaei Petri ori eristalizoare. Dupa mareare este ambalat individual ~i expediat la laborator prin eurier. Randamentul scazut la izolare ca ~i riseul contaminant pe parcursul prelucrarii sunt limite important restrictive pentru aceasta metoda. • Conservarea In medii speciale a fast recomandata indeosebi pentru bacterii. In tabelull9-2 sunt prezentate cateva dintre mediile ~i grupele de baeterii pentru care au fcst recomandate. 332 ~

alina

Tabelul19-2 Medii pentru transport ~i omogenizarea materiilor fecale EDTA Vibrio sodiu Clorura Fosfat disodic depentru Na Enterobacteriaceae dorura de Mediul Ellterobacteriaceae Amies TipulNa, de mediu Tris, Virusuri (Entero, Rota) Peptona Campylobacter Campylobact Acid tioglicolic Solutie Recomandat Constituenti salina tamponata Tioglicolat de er Na Fosfat Carbune farmaceutic Clorura disodic de Glicerol Hidroxid deCa Ro~u fenol Tioglicolat deNaNa(pH '8,5) Fosfat Agar monopotasic Clorura de Mg Bacto agar

Mediul Cary-Blair, larg folosit in tara noastra, s-a dovedit deosebit de stabil. Pastrat in recipiente bine inchise (care sa impiedice evaporarea) poate asigura 0 buna conservare la temperatura mediului ambiant pana la 7 zile. S-a dovedit util atat pentru prezervarea enterobacteriaceelor (Salmonella, Shigella, Escherichia, Yersinia enterocolitica), cat ~i pentru enteropatogenii din genul Vibrio (V. cholerae, V.parahaemolyticus). 333

jii~illi~Hif~~!~~~::~!!Il.;.,,!!!I!!!_.!!!=!I!! .•!I!!!I!!!I!!!I!! ••••••••••••••••••••••••••••••••

iIiiiiii:~IiIi·-"IiiI'''j''"~

Mediul Stuart de~i are calitati superioare de prezervant este folosit mai putin in practica de transport a materilor fecale datorita costului ridicat ~i dificultiitilor de preparare. Mediile lichide, mult folosite altadata in practica de izolare a enterobacteriaceelor, sunt astazi rar utilizate datorita dificuWitilor intampinate la transport ~i rezultatelor inconstante inregistrate la prezervarea altar patogeni enterici: Vibrio, Campylobaeter. Apa peptonata alealina $i apa peptonata aleaUna eu tioglieolat au fost recomandate ~i se utilizeaza inca pentru izolarea V. eholerae, V.parahaemolytieus ~i Campy/obaeter, cu rezuItate mult superioare altor medii lichide. Sohifia tampon Tris eu adaos de Ca2+ a dat rezu1tate bune pentru conservarea virusuri10r enterice.

19.3.2. Examinarea primarii a prelevatului (fig. 19-3) Se efectueaza din scaunul emis spontan ~i consta din examinarea macroscopicii ~i microscopia directa (fig. 19-3). Prelevare - Emisie spontana

1

Examinare Macroscopica -miros -culoare

primara

~ Microscopica Optica----...::........ Electronooptica

Preparate fixafe:./

-aspect - consisten~a - mucus - sange

________

I\

~ Preparate umede Rotavirusuri

- flora bacteriana dominanta 1. Coloratie Gram: gram pozJneg

Directe

particulare: -Ievuri

Parazili Qua

2. Coloraiie cu - aspecte morfologice safranina Cryptosporidium

Colorate

fI \ Chi~ti (lama,lameHi) Albastru LugollMIF* metilen Paraziti - leucocite - protozoare (amoebe. chi~ti etc.) - trophozoiti

Fig. 19-3. Examinarea primara a materiilor feeale (*vezi textul).

19.3.2.1. Examinarea macroscopidi se efectueaza pe scaunul emis spontan ~i se inregistreaza: • Mirosul: - fecaloid (sa1moneloze, shigeloze, campilobacterioze); - fetid (caracteristic v. eholerae, E. cdli enteropatogen) 334

• Culoarea: - verzuie (V. cholerae); - galbena necaracteristica (E. coli, Salmonella); - ro~u viu ("sindromul scutecului ro~u" - colonizare anonnala Serratia marcescens la nou-nascuti); - hemoragica • Aspectul: - moale, fecaloid neformat (Salmonella, Campylobacter); - moale cu grunji fecaloizi (Yersinia, Aeromonas); - lichid ca "apa de orez" (Vibrio, E. coli enterotoxigen); - muco-purulent "scuipat rectal" (Shigella); - hemoragic, cu sau flira lambouri de mucoasa epiteliala (E. coli enterohemoragica); - mueo-sanguinolent (Shigella); - scaun Inglobat In mucus (Shigella, E coli enteroinvaziv). 19.3.2.2. Microscopia directa 19.3.2.2.1. Microscopia electronidi, preconizata pentru rotavirusuri, este In prezent rareori practicata datoriHi: - accesibilitati foarte restranse (la noi in tara numai in centrele universitare ce dispun de microscop electronic); - introducerii unor metode alteme accesibile ~i rapide de evidentiere a virusului direct in materiile fecale (latex-aglutinare, ELISA). 19.3.2.2.2. Microscopia

optidi include examinarea de preparate umede ~i/sau

fixate. A) Pe preparate umede: se vizualizeaza cele mai utile elemente diagnostice. Examinarea se poate efectua: • Pe preparate native fntre lama ~i lamela: 0 ansa cu materii fecale (preferabil mucus, sange) se omogenizeaza cu 0 picatura de solutie salina izotona; se acopera cu 0 lamela evitand fonnarea de bule ~i se parafineaza marginile lamelei cu un amestee de parti egale de vaselina ~i parafina. Se examineaza cu obiectivul 40X, putandu-se observa: - OlJa$i larve d~ helminti; - proto;ware (Ghi~ti,trofozoiti); 7' Entamoeba histolytica: motilitatea trofozoitilor §i ingestia de hematii. Lama se poate pastra.~i reexamina cateva zile. • Pe preparate colorate: Colora/ia cu albastru de metilen: 0 ansa putin Incarcata eu materii fecale se amesteca pe 0 lama cu doua picaturi solutie cu albastru de metilen $i se acopera cu 0 lamela evitand fonnarea de bule de aer. Se a$teapta 2-3 minute pentru 0 buna colorare nueleara ~i se examineaza cu obiectivu140X. Evidentiaza: - Polimorfonuc1eare ~ 50/camp In shigeloze. - Polimorfonuc1eare :::;20/camp in salmoneloze, dizenterie amoebiana. - Polimorfonuc1eare :::;2-5/camp in holera, infectii cu ETEC, viroze. 335

- Polimorfonucleare, macrofage ~i eritrocite in shigeloze. - Polimorfonucleare ~i hematii in campilobacterioze. - Trofozoiti de amoebe (reexaminarea dupa evidentierea lor pe preparate native). Colora{ia cu solu{ie iodo-iodurata: 0 ansa putin incarcata se amesteca cu doua picaturi solutie iodo-iodurata pe 0 lama de microscop ~i se acopera cu 0 lamela. Evidentiaza: - cu obiectivul lOX: oua ~i larve de helminti, chi~ti ~i trofozoiti; - cu obiectivul 40X ~i reducerea luminii: elemente celulare ~i trofozoiti amibieni. Elementele distinctive ale amoebelor sunt observate mai clar prin colorarea preparatului cu solu{ie mertiolatliodo-iodurata(formaldehida (MIF): 0 picatura de apa distilata se amesteca pe 0 lama de microscop cu 0 picatura de colorant MIF apoi in amestec se omogenizeaza 0 ansa (putin incarcata) cu materii fecale. Se acopera cu 0 lamela, se parafineaza ~i se poate examina mai multe ore, dupa care detaliile se pierd. B) Pe preparatefixate urmarim microorganismele. Frotiul se prepara din portiuni nemucoase ale probei prin omogenizarea unei anse putin incarcate intr-o pici'itura de solutie salina izotona. Dupa uscare se fixeaza cu metanol 3-5 minute . • Frotiurile colorate Gram evidentiaza: - Flora gram-negativa dominanta, bacili incurbati sub fonna de virgula (Campylobacter). - Flora gram-pozitiva: coci gram-pozitivi (posibil toxiinfeqie alimentara cu stafilococ), bacili gram-pozitivi cu capetele retezate, a~ezati frecvent in lanturi scurte, ocazional izolati sau in perechi, cu spor oval central sau subterminal (posibil toxiinfectie alimentara cu Bacillus cereus), bacili gram-pozitivi in scaunul pacientilor sub terapie orala cu antibiotice (posibil Clostridium difficile). - Dominanta fungilor (vezi 19.3.4.1.) . • Frotiurile colorate cu Safranina sau Ziehl-Neelsen (vezi Cap. 41) evidentiaza, cu obiectivu120X sau 40X, oochi~tii de Cryptosporidium care apar, pe fondul albastru al frotiului, oranj stralucitor in coloratia cu Safranina, respectiv ro~ii in coloratia ZiehlNeelsen. Pentru amanunte privind examenul coproparazitologic unor lucrari de referinta.

recomandam consultarea

19.3.3. Examinarea bacteriologidi Dupa cum reiese din figura 19-4, examenul de baza al diagnosticului microbiologic al sindromului diareic infectios este reprezentat de cultivarea materiilor fecale: cop rocultura. Aceasta presupune izolarea agentului etiologic bacterian/micotic pe medii adecvate ~iidentificarea lui pe baza caracteristicilor: morfologice, de cultivabilitate, exoenzimatice ~i antigenice. In unele cazuri este necesara ~i probarea potentialului patogen de enterotoxigeneza, virulenta, aderenta celulara. 336

PRELEVARE

RECTALA.

EMISIE SPONT ANA - tampon

MOMENTUL o

- tampon - sonda Nelaton\

/

101'

- "Iingurita" eoproree. - ansa baet./pipeta

CU~TIVARE~

1

24-72 ore

fMBOGA.TIRE fMB~GA.TIRE t _IMB~GA.TIRE t ~rICROAEROFILA ANAEROBA MEDII SELECTIVE ADECVATE FIECAREI GRUPE

IZOLARE

c:AEROBA

COLONII CARACTERlSTICE IDENTIFICARE

IDENTIF.PRE~ - biochimica - serologica

~TIF.DE CERTITUDINE - biochimica - tipizare: - scrologica - bacteriofagiea - bacteriocinica - moleculara (genetica) - toxinogeneza (vitro/vivo) - virulenla (vitro/vivo)

48-96 ore

~i peste

TESTARE SENSIB.: ANTIBIOTICE Fig. 19-4. Etapele examenului

bacteriologic

al materiilor

fecale.

Etapele examinarii bacteriologice prin cultivare sunt prezentate in figura 19-4. Ulterior fazei initiale, respectiv prelevarea (tratata mai sus), liniile metodologice privind izolarea ~i identificarea corespunzator fiecarei metodologii de investigare sunt: aeroba, microaerofila ~i anaeroba. 19.3.3.1. Izolarea bacteriilor aerobe. Datele inregistrate ne indreptatesc sa afim1am ca etiologia bacteriana aeroba reprezinta mai mult de jumatate din etiologia cunoscuta a sindromului diareic. In parte aceasta "dominanta" este detenninata ~i de posibilitatile de investigare, accesibile celor mai multe laboratoare din spitale ~i centre antiepidemice, ce pem1it precizarea etiologiei mult mai frecvent decat in cazul altar grupe de agenti etiologici bacterieni ori virali. Cunoscute fiind insuccesele izolarii datarate numarului redus de agenti etiologici pe unitatea de volum a probei investigate, in unele enterobacterioze se recomanda "imbogatirea" inoculului prin subcultivare pe medii ce favorizeaza preferential multiplicarea patogenilor enterici. 19.3.3.1.1. Izolarea cu fmbogiitire. Procedeul imbogatirii a fost recomandat ~i se utilizeaza curent pentru 0 suita de patogeni enterici care se afta dispersati in numar mic pe unitatea de volum de materii fecale. Procesul patogen dezvoltandu-se jejunal ori ileocecal, bacteriile excretate se disperseaza intr-o mas a fecaloida devenita abundenta prin inhibarea retroresorbtiei hidro-electrolitice intestinale. In consecinta densitatea redusa a patogenilor (pe unitatea de volum materii fecale) a detenninat introducerea unui proces 337

e tampon

de imbogatire a agentului etiologic in salmoneloze, yersinioze, holera, ca ~i in cazurile de portaj. In sindroamele diareice joase, recto-sigmoidiene ~i in disbacteriozele intestinale postantibioticoterapie, agentul etiologic eliminat la 0 densitate mare nu mai necesiai imbogatire. Mai muIt, in disbacterioze este contraindicata interpunerea unei etape de imbogatire care ar modifica raporturile dintre grupele de bacterii componente ale materiilor fecale. Mediile de imbogatire freevent utilizate pentru izolarea patogenilor enterici aerobi din grupele Salmonella, Yersinia ~i Vibrio sunt prezentate in tabelul 19-3. Tabe!uI19-3 Medii de imbogatire

-- -----

-

24-48 Permite 3-SoC ore 6-]2 ore Durata incubiirii Salm. carea ~i aore altor balnhibitori Shigella 2-3 sapt. 37°C I diu Yersillia Dezoxicolat 18-24 Saruri biliare Verde brilliant 3so/40°C ]]8-24 1Vibrio 8-24 3so/37OC 3so/37°C ore 3so/37°C 22°C sodiu de so de Selenit pH 9,0-9,2 pentru flora multipli-

incubare Temp. de riante -Bulion aregram-negativi multiple vacili pentru bacili

recomandate

pentru patogenii enterici aerobi

Observalii

- cre~te inconstilnt I

• Pentru Salmonella: - Bulionul cu selenit acid de sodiu in mai multe variante. Selenitul cu cisteina a dat cele mai bune rezultate la izolarea serotipurilor intalnite deopotrivii la om ~i animale. Randamentul Iui poate fi imbogatit ~i perioada de incubare seurtatii la 12-18 ore prin incubare la 40-41 DC.Cand posibiIitatiIe nu permit decat un singur mediu de ImbogiiTire, mediul cu selenit este de preferat. Este inhibitor pentru alte enterobacterii (indeosebi lactozo~pozitive), illS a Proteus ~iShigella se dezvolta rclativ fh.'Jcvent. = Bu/ionul Rappaport, Vasiliadis, evidentiat de asemenea ca avand 0 bun a capaci, tate de imbogiitire, a fost mai insistent recomandat in ultimii 10 ani ~i mentionat eu rezultate superioare la imbogatirea tuturor celorlalte serotipuri, cu exeeptia Salmonella serotip Typhi. 338

- Bulionul pentru gram-negativi (BGN) are capacitate presoare mai redusii dedit bulionul selenit ori bulionul tetrationat, permi!and cre~terea ~ia altor bacili gram-negativi nu numai a enterobacteriaceelor, motiv pentru care a fost recomandat ~i pentru izolarea unor bacili gram-negativi nefermentativi condi!ionat patogeni. - Bulionul tetrationat s-a utilizat pentru izolarea salmonelei serotip Typhi. Are 0 folosire mai restransa datorita prepararii laborioase ~i dificulta!ilor de comercializare a lui ca preparat industrial "gata de folosit" ori in forma uscata. • Pentru Yersinia un procedeu curent de imboga!ire este pastrarea tamponului prelevat in solu!ie tampon fosfat 2-3 saptamani la 4-5°C dupa care se insaman!eaza pe medii selective. Deoarece bacteriile din genul Yersinia se dezvolta preferential la 22-29°C, simpla incubare la aceasta temperatura realizeaza Imboga!irea pe bulionul pentru bacili gram-negativi. • Pentru Vibrio apa peptonata alcalina (pH 9,0-9,2) este mediul de imboga!ire cel mai eficient. Atat V. cholerae cat ~i V.parahaemolyticus cresc promt, astfel cii dupa 6-12 ore de incubare la 35-37°C se poate efectua subtrecerea pe mediile selective proprii izolarii vibrionilor. Inocularea mediilor de fmbogatire: suspensia de materii fecale se insaman!eaza cu pipeta:7 -10 piciituripentru fiecare tub cu mediu de imboga!ire (proponia maxima 1/10). Tampoanele din prelevat se transfera direct in mediile de imbogii!ire. Incubarea se efectueaza la 35-37°C maximum 24 ore. Bulionul selenit se poate incuba ~i la 40-41 DC,dar in acest caz trecerea pe medii selective se face la 12-18 ore. 19.3.3.1.2. lzolarea ftira fmbogatire sau izolarea directa consta din insamantarea prelevatului, suspensia de materii fecale, direct pe mediile selective pentru obtinerea de colonii izolate caracteristice, in vederea identificarii lor. Mediile selective sunt intotdeauna medii soli de (agarizate) ce contin in principiu trei grupe de constituen!i: • 0 grupa de constituenti nutritivi ce favorizeaza cre$terea bacteriana (extract de came, peptone, extract de drojdie, factori de cre~tere). • 0 grupa de constituenti indicatori a~a-zisul "sistem de identificare", ce releva dezvoltarea ~i formarea de colonii caracteristice diferitelor categorii. "Sistemul de identificare" poate fi: - Un zahar (lactoza, zaharoza, xiloza, manitol etc.) sau asocieri de zaharuri, un aminoacid (lizina), diver~i compu$i organici (glicoli - e.g., propilenglicolul) ~i un indicator de pH care evidentiaza metabolitii proveniti din scindarea acestora: ro$U ne~ltru, ro~u fenol, brom crezol purpur, albastru de bromtil1101,eozina etc. - Un l11etabolit ca hidrogenul sulfurat, specific unor grupe de bacterii, $i sistemul sau indicator: citratul amoniacal de bismut, citratul de fier. - 0 asociere de l11ail11ulteactivitati caracteristice (fermentarea de zaharuri, scindarea de al11inoacizi sau al!i compu~i ~i producerea de hidrogen sulfurat concomitent) cu indicatori adecva!i. • 0 grupa de componenti selectivi (agen!i presori) care inhiba flora asociata penni!and dezvoltarea patogenilor enterici. S-au propus ~i se folosesc agenti ori grupe de agen!i selectivi in func!ie de capacitatea inhibitorie ~i de bacteriile enterice ce se , 339

egrale Na ibiotice eNa

unnaresc a fi izolate. In tabelul 19-4 sunt prezentati agentii selectivi curent folositi In componenta mediilor selective. Mediile relativ recent propuse, Indeosebi cele pentru izolarea Y. enterocolitica, contin ca factori inhibitori asociatii de antibiotice. Tabelul 19-4 Agenti selectivi ce intra in compozitia Grupa Eozina, Irgasan albastru metilen

mediilor pentru izolarea bacteriilor

enterice

Emerobaueriaceae Cefsulodin Citrat de sodiu Aeromonas, Vibrio Plesiom07Uls Verde brilliant ---Aeromonas Bila uscata Enterobacteriaceae Plesiomona. Pseudomonas Emerobacteriaceae Yersinia emerocolytica patogene Preconizati pentru: Agentul selectiv (Inhibitorul)

A) Medii selective pentru izolarea enterobacteriaceelor. In tabelul19-S sunt grupate, pe criteriul capacitatii selective (inhibitorii), cele mai frecvent utilizate medii de izolare a enterobacteriaceelor. Tabelul19-5 Enterobacteriaceae.

Dezvoltare pe medii selective

AbreLactozo-poz. -V.mm -1-2 EMB necolorate translucide -colonii vierea - sau lactoza -co!. choleme Enterobacteriaceae Yersinia centru inch is biliare Incolore Eozina albastru de---1-2 Categona -2-3 M.C. mm ro~ii eu Tara - Dezv. opalescent -halou E. coli picaturi Lactozo-neg. - ro~ii semitransparente eu sau Tara Observ. Mediul co!. incolore de fucsina ori roz~i(24 37°C 24 ore are I

I

340

la 22-29°C)

e

Tabelul ]9-5 (cantinuare)

-

Abrecentru ILactazo-poz. colonii se dezvolta necolorate -lare 1-2 mm translucide -verde 1-2 HE Yersinia nu colonii 0.5 mn -vireaza colonii rareori sulfura W.B. ADCL Vlerea RA Pseudomonas Salmonella dezvolta semitransparente ---calonii Yersinia nu SMID incolore. mm SS albasu'e-violet mm 1-2 Categoria Dezv. --1-2 1M 11m1 -nu mm XLD -albastre Recomandat verzui albastmi Yersinia se -roz verzi-albastre -poz. Hektoen necolorate Xiloza -1-2 lizina (H2S (H2S paz. albastre (verzi) dezoxicolat rO~1I Shigella, ro~ii semitransparente poz. Blair) ~i pentru izaro~ii -mucaide mediul incolore (H2S poz. -mm -inhibitie opalescente - Enterobacteriaceae centm negru) Shigella, S. typhi negre. ro~ii. halou inhibitie Cll centrul negru) in rO~lI --ro~ii opace ro~ii sau galbene centru negru) spp. ro~ii, halou ro~u -inhibitie inhibitie ]-2 mm (H2S poz. negru) -AVB negru metalic --1-3 1-2 mm galbene Inhibitie 2-3 mm ~i Metzger) Agar enteric (King (Taylor) (Wilson ~i Observ. Laclozo-neg. Mediul dezvolta se dezvolta (H2S negru) Agar (H2S poz. centru

Nota - Mediile selective nu permit dezvoltarea florei gram-pozitive - Mediul MC pennite dezvoltarea diferentiala ~i a altar grupe de bacili gram-negativi (Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas. Acinetobacter etc.).

341

• Mediile slab selective, MC, EMB, permit cre~terea tuturor enterobacteriaceelor (lactozo-pozitive ~i negative deopotriva) ~i chiar ~i a altor grupe de bacili gram-negativi ca Vibrio (inclusiv V. cholerae), PseudolllOnas, Aeromonas, Plesiomollas, Alcaligenes. Sunt, in consecinta, utile pentru: - izolarea patogenilor enterici recunoscuti: - izolarea conditionat patogenilor enterici, indeosebi Escherichia coli din grupele: enteropatogen (EPEC), enterohemoragic (EHEC), enterotoxigen (ETEC), enteroinvaziv (EIEC), enteroaderent (EAEC), enteroagregativ (E)\gEC); - estimarea raportului flora lactoza negativalflora lactoza pozitiva: E. coli sau alri lactozo-pozitivi (indeosebi Klebsiella la copil); E. coli sau alte grupe de bacili gramnegativi (Plesiomonas, Aeromollas, Alcaligenes). • Mediile moderat selective au 0 capacitate selectiva mai inalta, inhiband considerabil enterobacteriaceele lactozo-pozitive. Permit dezvoItarea nestigherita a enterobacteriaceelor lactozo-negative (Salmonella, Shigella, Providencia, Proteus, MOI~~allella) ~i tardiv lactozo-pozitive (Citrobacte/; Serratia, Hafnia). Yersillia enterocolitica se dezvolta mai greu (de obicei dupa prelungirea incubariei la 22-29°C, minimum 24 ore), iar pe unele medii, ca ADCL, XLD, 1M, SMID, este putemic inhibata. Aceste medii sunt de obicei utilizate pentru izolarea patogenilor din genul Salmonella ~i Shigella. lntre acestea, mediile RA ~i SM1D, denumite medii cromogene, pennit diferentierea categorica a genului Salmonella prin colonii distinctiv colorate. In mod particular mediul 1M este recomandat ~i pentm izolarea genului Pseudomonas. • Mediile fnalt selective sunt inhibitoare pentru to ate grupele de enterobacterii, cu exceptia salmonelelor. Mediul WB, electiv pentru dezvoItarea serotipului Typhi, este recomandat indeosebi pentm investigarea suspeqilor de febra tifoida ~i a pUl1atoriior cronici. Mediul AVB, partial inhibnitor pentru serotipurile Typhi ~i paratyphi A, este recomandat pentru controlul produselor alimentare. Tabelul 19-5 cuprinde mediile selective mai frecvent folosite. Utilizarea lor concomitenta nu este posibila ~i in practica se are in vedere ca: - ~ansele izolarii de patogeni enterici cresc cu numarul mediilor selective utilizate; - atunci dnd posibilitatile laboratorului sunt restranse, se vor folosi minimum doua medii, unul slab selectiv ~i altul moderat selectiv; - de pe oricare din mediile de imbogatire se poate trece pe oricare dintre mediile moderat selective.

o categorie de medii selective apa11e folosind antibiotice ~i sulfamide ca factori presori s-a extins foarte mult in uItimii ani. Avantajele de a doza cu precizie cantitatile de antibiotice, de a modifica combinatiile de antibiotice in funqie de activitatea antibiotica fata de flora asociata ~ipretul mai redus sunt luate in considerarie la promovarea acestor medii. Randamentul mai scazut al mediilor slab ~i moderat selective, pe care se poate izola Y enterocolitica, dupa 0 incubare suplimentara de 24 ore la 22-29°C (temperatura camerei), a promovat pentru aceste enterobacterii medii aparte. Dintre acestea mediul propus de Schleman, cefsulodin-irgasan-novobocina - Y. ellterocolitica (CIN- Ye) - este mai frecvent folosit datorita avantajelor sale: u~or de preparat, citire rapida (18-24 ore 342

~3 32=C),

capacitate selectiva buna, relativ ieftin. Coloniile de Y. enterocolitica sunt ro~ii ':1.1 centrul ro~u inchis ~i marginile transparente. Alte enterobacteriacee, ca Serratia .:quefaciens, Citrobacter freundii, Enterobacter agglomerans, pot detennina colonii :oorfologic asemanatoare cu cele ale Y. enterocolitica. Diferentierea se face ulteriorprin Testebiochimice. B) Medii selective pentru genul Vibrio. In tabelul19-6 am grupat 0 serie de medii selective recomandate in metodologiile actuale de izolare a vibrionilor. Tabelul19-6

Medii selective pentru genul Vibrio lncubatia -Plate ide intotObserv. nu maxilizeaza Bombate maxicllOlerae Durata deauna sunt --2-3 Albastru Plate caracverzi a1calin -- Bombate mm --1-2mm 2V. mm mum -2-3mm 4zona zile la turn turnare -- are Translucide cu 12-18 37°C ore 15 mm MED 37°C cu Placile se uti35-37°C Fara irizatii -1-2 TGA BSA mm 'teristice In -18 0.5-2 18-24 ore 37°C TTGA Galbene TCBS ore 18-24 Transparent Aspectele Bombate drept Transparente Cll opa 105 UFC V.Prelevate Sange: parahaemolyticus S Ibolnavilor, g aliment Consumatori Aliment purtatori spp. ore debutul bolii la eventualii Markeri ri manipulan!ii tualii martori Cratoconjunctivita de•• Aeromonas alimente invazivitate Cre§tere dealimente ree, ~i >in4X titrului anticorpilor dinfebra aliment §i fecalele absent imunodeficien!i); dede cubatie 16-48 pulan!ii la cobai); ~i anti C. jejuni dupa 2-4 de de la Cre~terea dupa 2-4 de saptamiini 4X aapenetrare delabolnavilor, lasaptamiini debutul bolii Campylobacter Inmul!ire ill celulele HeLa sau bolnavilor, eventual de manipulan!ii

.

381

Tabelul20-7 (continuare) Prelevate examinate" Sindroame ~i etio]ogii posibi]e

Aliment

Consumatori bolnavi, purtiitori Martori

Digestiv inferior I C ell erampe abdominale, febrii ~i ineubatie de

Feca]e: C I Feca]e: C Sange: C, S

•

Feca]e: C

• Semnificatia izo]atelor feca]e: vezi mai sus

16-48 ore Yersinioze (Y enterocolitica, Y. pseudotuberculos is ~. a.)

Digestiv inferior IC eu erampe abdominale, diaree apoasii ~i incubatie de 16-72

Criterii de re]evanta

Manipulanti de alimente

Specie identica de Yersinia izo]ata din aliment, feca]e, ocaziona] hemoculturi. de ]a bolnavi, eventual prezenta ]a manipu]antii de alimente • Cre~tere de > 4X a titrului anticorpilor anti Yersinia dupa 2-4 saptamiini de la debutu] bolii

•

ore

din

aliment

~l

Enterotoxina termolabi]a depistata in cu]tura tu]pinii suspecte: test biologic pe ans? i1eala Iigaturata de iepure, imunoteste (vezi mai jos la ETEC)

Aeromonas spp.

IC Escherichia coli: ETEC, EPEC, EAEC, EAgEC

Fecale: C

Salmonella serovaruri foidice

IC

Feca]e: Sange:C

IC

Feca]e: C

nonti-

Shigella (rar)

382

I Feca]e: C

• Markeri epidemioiogici: serovar identic al fenotipului diareigen izo]at din aliment ~i feca]e]e bolnavilor, absent ]a eventualii martori, dar posibil prezent ]a manipu]antii de alimente • Markeri de patogenitate, funqie de fenotip: ETEC pentru LT: imunoteste (RPLA, ELISA, testul Biken ~. a,); teste bio]ogice (pe ansa i]eala ]igaturata de iepure, inocu]are intradermica la iepure, ECP in cu]turi de ce]u]e CHO sau Yl) ori deteqie molecu]ara (gena It); pentru ST: imunotest (EIA), test biologic (inoculare intragastrica ]a ~orice] sugar); EPECIEAEC pentru verotoxinele VTl/VT2: imunoteste (RPLA; ELISA), bioteste (ECP in cu]turi de celu]e Vero) deteqia moleculara a genelor de aderenta EAgEC bioteste (agregare in gramezi in cultura lichida, aderenla la ce]ule]e HE p-2); deteqia moleculara a genelor de agregare-aderen(a.

C I Fecale: C

Vezi mai sus

I Feca]e: C

Vezi mai sus

Tabelul20-7 (eontinuare) Pre lev ate examinate" Sindroame

Consumatori

~i etiologii posibile

Aliment

Alte Enterobacteriaceae

IC

IC

Plesiomonas shigelioides

bolnavi, purtatori Mmtori

Criterii de relevanta

Manipulanti de alimente

Fecale: C

• Specie eu markeri epidemioiogici eomuni izolata din aliment ~i feeale de la bolnavi, dar absenta la eventualii martori

Fecale: C

•

Enterotoxina termolabila produsa in eultura de tulpina suspecta: depistare pe ansa ileala ligaturata de iepure sau imunoteste

•

Aceea~i specie izolata din aliment ~i fecalele bolnavilor, dar absenta la eventualii martori

• LT/ST produsa in cultura tulpinii suspecte: depistare prin bioteste sau imunoteste Diaree

• Markeri epidemiologici: E. coli 0157 : H 7 izolata din aliment ~i fecalele bolnavilor, absenta la eventualii martori. • Markeri de patogenitate: prezenta verotoxinelor demonstrata prin imunoteste (RPLA, ELISA), bioteste (efect enterohemoragic la iepura~ sugar, ECP in culturi de celule Vero sau

sanguinolenta rara febra dupa ineubatie de 72119 ore

coli I C

Escherichia EHEC

Fecale: C

endoteliale): detectia genelor de adeziune

moleculara

a

Sindrom neurologic eu ineubatie de 18-36 ore: Clostridium botulinum

C,T

prin toxinele sale Faringita Angina ineubatie ore Streptococi piogeni

I 12-72

C

• Consum

Voma: C, T Feeale: C, T

Tampon faringian eventual sange: C

de alimente

(prezumtie) • Depistarea toxinei intestinal, ser sanguin Tampon nazal, faringian, din leziuni cutanate: C

•

conservate

In casa

in aliment,

conti nut

S. pyogenes (acelasi serovar M/T) sau S. zooepidel11icus izolat din aliment si de la bolnavi, eventual manipulantii de alimenteh

a C = Cultivarea; Cq = izolare cantitativa; T = teste pentru depistarea toxinei; S = examen erologic (testarea anticorpilor serici=. b IzolareaS. zooepidemicus impune investigatii epidemiologice ~imicrobiologice in fennele fumizoare de lapte.

383

PARTEA a II-a BIBLIOGRAFIE SELECTIV A BARON, E.J., S.M. FINEGOLD

(1990): Genital and sexually transmited pathogens. In Bailey and Scott's

diagnostic microbiology, 8-th edn, e.v. Mosby Company, Saint Louis, pp. 263-278. BARTHEL, J.S., D.E. EVERETT (1990): Diagnosis of Campylobacter pylori infection: the "gold standard" and the alternative. Rev. Infect. Dis., 12: S107. BAUER. A.W., KlRBY, W.M.M., SCHERRIS, J.e. et al. (1966): Antibiotic susceptibility standardized single-disk method .Am .J. Clin. Pathol. 45:493.995 BAZZOLL E (1995): Present et avenir des tests respiratoires Leftre de I' blfectiologue., II:SI3.

it

I' uree

POUI'

testing by a

detection de Helicobacferpylori.

BILBlIE, v., POZSGI, N. (1985): Bacteriologie medicalii, Editura Medicalii, Bucure~ti, vol.lI. BIRZOI, D., MEICA, S., NEGUT, M. (1999): Toxiinfectiile alimentare, Editura Diacon Coresi, Bucuresti. BORRIELLO, S.P., P.R. MURRAY, G. FUNKE (2005): Organ and system infections. In Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, 10-th edn. Bacteriology voU, Hodder Arnold. London, pp. 509-768. BRIDSON, E.Y. (1995): The Oxford Manual, 7-th ed, Alphaprint, Alton, Hants. BRITISH SOCIETY for the Study ofInfection Research Committee (1995): Bacterial meningitis: causes for concern. J.bifect., pp. 30- 89. BRUN, G., BRUN, J.L. (1993): Salpingites aigues non-tuberculeuses: etiologie, diagnostic. evolution, prognostic, traitement. Rev.prat., 43: 2015. BUIUC, D. (1990): Criterii de reevaluare a detenniniirilor de laborator in lichidul cefalo-rahidian. Rev.Med.Chir.(Ia~i),

94: 607.

BUIUC, D., E. DUCA, S. HURMUZACHE et al. (1984): Argumente pentru un algoritm mai economic al examenului citobacteriologic al urinei in conditiile amelioriirii controlului de calitate. Bacterial. Virusol. Parazitol. Epidemiol., 29: 355. BURCOVEANU,

e., D. BUIUC, M. BALAN et al. (1986): Interpretarea bacteriologiei sputei in stabilirea

etiologiei baeteriene a infectiilor bronho-pulmonare. Rev.M ed. Chir.(Ia~i), 90:305. COLLINS, e.H .. P.M. LYNE, J.M. GRANCE (1995): Collins and Lyne's Microbiological Butterworth-Heineman. London, U.K.

Methods. 7thedn.

COMAN, G., M. BURLEA. E, BUTNARU (2000): Evaluarea testului ELISA eu truse Pyloragen IgG ~i IgA In diagnosticul infeetiei cu Helicobacterpylori la copii. Rev.Med.Chir.Soc.Med.Nat.la~i, 100: 138. COMAN, G., e. PANZARU, C. DAHOREA (1996): IzolareaArcanobacterium haemolyticliln din exsudatul faringian Ia copil. Bacterial. Virusol.Parazitol.Epidemiol., 41: 141. CIUFECU, E.S. (2003): Virusologie medicalii, Editura Medicalii, Bucure~ti. DEBOGNIE, J.e. (1996): Helicobacter heilmannii, alias Gastrospirilum hominis: un autre pathogene gasuique? Lettre de I' Infectologue, 9:S30. DOROBAT, 0., S. ERSCOIU, M. BURTEA (1996): Faringite produse de Arcanobacterililn haemolyficum. Bacteriol. VirusoI.ParazitoI.Epidemiol., 41: 135. experientii de 15 ani: antibiogramii pe culturii primara DUCA. E., BUruC. D., HURMUZACHE.S. (1985): prin metoda difuzimetricii, posibilitate ~inecesitate in investigarea infectiei traetusului rinar. Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiol. 30:85.

0

384

EDBERG, S. (1981): Methods of quantitative microbiological analyses that support the diagnosis. treatment and prognosis of human infection. CRC Critical Rev. Microbiol., 8:339. EDWARDS, P.R., EWING, W.H. (1986): Identification of Enteriobacteriaceae. 3-rd edn., Elsevier, New York. ESCHERBACH. D.A. (1993): Bacterial vaginosis and anaerobes in obstetric gynecologic infection. Clin. b{fect. Dis., 16: S282. FERRERO, D.V., H. N. MEYERS, D.E. SCHULTZ et al. (1998): Performance of the gen-probeamplified Chlamydia trachomatis in endocervical and urine specimens from women and uretral and urine specimens from men attendings sexually transmitted disease and family planning clinics. J. Clin. Microbiol.,36:3230. FLEJOU, J.F. (1995): Lymphome gastrique et infection a Helicobacter pylori. Lettre de l'i11(ectologlle. 10: 164. FREEMAN, R., P.R. SISSON, B. BURDESS (1996): Heterogeneity within apparently pure cultures of Escherichia coli freshly isolated from significant bacteriuria. J. Med. Microbiol.. 45: 349. FRENEY, J., F. RENAUD, W. HANSEN, e. BOLLET (2000): Precis de Bacteriologie Clinique, Ed. ESKA. Paris. GATTA. L., e. RICCI, A. TAMPIERI et al. (2003): Non-invazive tehniques for the diagnosis of Helicobacler pylori infection. Clin. Microbiol. Infecl., 9; 498. GRAY, L.D., D.P. FEDORKO (1992): Laboratory diagnosis of bacterial meningitis. Clill. Microbiol. Rev.. 5:130. HENRY, J.B., G. A. THREATTE (editors) (2001): Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 20·rhedn, W.B. Saunders Co., Philadelphia. ISENEBERG, H.D. (1998): Essential Procedures for Clinical Microbiology, ASM Press, Washington D.e. KALIN; M., A. A. LINDBERG, G. TUNEVAL (1983): Etiological diagnosis of bacterial pneumonia by Gram stain and quantitative culture of expectoration (Leukocytes or alveolar macrophages as indicators of sample representativity). Scand.J. Irifect. Dis., 15: 153. LEFEVRE, J.e. (1993): Vaginoses bacteriennes: donnees bacteriologiques recentes: de la physiopathologie au traitement. Rev. Fr.Ginecol. Obstet., 88:207. LIOLET, S. (1994): Diagnostic biologique des conjunctivites. In Encycl. Med.Chir.(Paris-France). Ophtalmologie. Eds Techniques, 21-J30-B-1O, pp. 1-17. MANDELL, G.L., 1.E. BENNETT, R. DOLIN (eds) (2000): Principles and Practice ofInfectious Diseases. 5·rhedn, Churchill-Livingstone, Philadelphia. MEDICI, T.e., S. CHODOSH (1980): Microscopie de l'expectoration. II. Bacteriologie des affections chroniques des voies respiratoires. Folia Chemother. 26, F. Hoffmann-La Roche and Cie. S.A. Bilk. MEDICI, T.C .. S. CHODOSH (1978): Microscopie de l' expectoration. I. La cytology des affections chroniques non specifiques des voies respiratoires. Folia Chemolha 21, F. Hoffmann-La Roche and Cie. S.A. BaJe .. MOBLEY, H.L.T., J .W. WARREN (1996): Urinary Tract Infections: Molecular Pathogenesis and Clinical Management, ASM Press, Washington D.e. MOLTER, J.K., L. OSTERGAARD, J.T. HANSEN (1994): Clinical evaluation of four non-related techniques for detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens obtained from a low prevalence population. Immllllol.Irifecl.Dis .. 4: 191. MONTEIRO, L., D. VAIRA, P. MALFERHEINER et al. (2000): Evaluation du test antigeniques de Helicobacter pylori dans les selles (HpSA) apres traitement d'eradication. Lettre de /'b!feClOloglle. 15:S32. MOSSEL, D.A.A., CORRY, 1.E.L. et al. (1995) : Essential of the Microbilogy of Foods: a Textbook for advanced Studies, John Wiley and Sons, Chichester. MUNOZ, N. (1994): Infection ii Helicobacler pylori et cancer de l' estomac. Leltre de /' bifectologuc. 9:54.

385

MURRAY, P.R., E.J. BARON, J.H. JORGENSEN et al. (2003): Manual of Clinical Microbiology, 8-'hedn, A.S.M. Press, Washington D.C. MURRAY, P.R., J.A. WASHINGTON Clin. Proc., 50:339. NEGUT,M.,

(1975): Microscopic

IONESCU, G" POPESCU,

and bacteriologic

analysis of sputum. Mayo

D. (1995): Metodologii "conven!ionale"

identificare la SaJmonella.Reuniunea

~i rapide de izolare ~i

anualii de Microbiologie "boala diareicii acutii: Posibilitiiti

~i

perspective ale diagnosticuli de laborator", Ciilimiine~ti. PENNINGTON, J.E. (1994): Respiratory Infections: Diagnosis and Management, New York.

3-'dedn, Raven Press,

POWERS, W.J. (1981): Cerebrospinal fluid to serum glucose ratios in diabetes mellitus and bacterial meningitis. Am. J. Med .. 71:217. ROSENSTEIN,

I.J., D,J. MORGAN, M. SHEENAN et al. (1996): Bacterial vaginosis in pregnancy: distri-

bution of bacterial species in different gram-stain categories of the vaginal flora .J, Med. Microbiol., 45:120. RUIZ,J.,SEMPERE, M.A., VARELA, M.C., GOMEZ, J. (1992): Modification of the methodology of stool culture for Salmonella detection J. Clin. Microbiol., 30:525. SCHMIDT, K. (1995): WHO SurveiiIance Programe for Control of Foodbome Infections and Intoxications in Europe, Federal Institute for Health Protection, Berlin. STOKES, E.J., G.L. RIDGWAY, M.W.D. WREN (1993): Clinical Microbiology, 7-'hedn, Edward Arnold, London, U.K. STAMEY, E.J. (1980): Pathogenesis

and Treatment of Urinary tract Infections, Williams and Wilkins,

Baltimore, pp. 1-342. SUSSMAN, M. (1997): Mechanism of Virulence, Cambridge University Press, Cambridge, U.K. SWYGARD, H., A.C. SENA, M.M. HOBS et al. (2004): Trichomoniasis:

clinical manifestations, diagnosis

and management. Sex. Transm.!l!fect., 80:91. TOPLEY

& WILSONS'S

Microbiology and Microbial Infections (2005): lO-'hedn, Hodder Arnold, London,

U.K. TUNKEL, A.R., W.M. SCHELD (1993): Pathogenesis Clill.Microbiol.Rev., 6: 118.

and Pathophysiology

of bacterial

meningitis.

VANDEPITTE, J., K. ENDGBAECK, P. PlOT et al. (1994): Bacteriologie c1inique: techniques de base pour la laboratoire, O.M.S., Geneve . WASHINGTON, J.A. and International Collaborative Blood Culture Study Group (1992): An international multicenter study of blood culture practices. Em: J. Clin. Microbiol. Dis., 11: 1115. W. Jr., S. ALLEN, W. JANDA et al. (2005): Koneman's Color Atlas and Textbook of

WASHINGTON,

Diagnostic Microbiology, WOTHERSPOON,

6-th

edn, Lippincott Williams

& Willdns,

Philadelphia.

A. c., C. DOGLIONIC, F. C. DISS et al (1993): Regresion of primary lowgrade B-cell

gastric lymphoma

of mucosa-associated

lymphoid tissue type after eradication of Helicobacter

pylori. Lancet, 342:575. ***Clinical and Laboratory Standards InstituteINCCLS

(2006):Performance

standards for antimicrobial

Susceptibility Testing; Sixteenth Informational Supplement. CLSI/NCCLS Document MlOO-S16. Clinical and Laboratoty

Standards Institute, 940 West valley Road, Suite 1400,

Wayne,Pa. ***Manual for laboratory investigations of acute enteric infections. WHO-CDD/83.3.1987. ***Selective microbiology for the clinical laboratory. Published by Oxoid-Unipath Ltd. Basingstoke Hampshire, England, 1990.

386

Partea a III-a

APORTUL LABORATORULUI CLINIC LA INITIEREA SI MONITORIZAREA TERAPIEI ANTIMICROBIENE. REZULTATELE TESTARII DE RUTINA A REZISTENTEI LA ANTIBIOTICE CA TEZAUR PUBLIC PENTRUSUPRAVEGHEREASICONTROLUL REZISTENTEI LA ANTIBIOTICE

21. ELEMENTE DE STANDARDIZARE A TEHNICILOR DE LAB ORATOR PENTRU ORIENTAREA ~I MONITORIZAREA TERAPIEI ANTIMICROBIENE (IRINA CODIT}\, DUMITRU BUlUC) 21.1. TERMINOLOGIE $1 DEFINITII ARMONIZATE LA NIVEL EUROPEAN

21.3. ASPECTE GENERALE ALE STANDARDIZARII TESTELOR DE SENSlBILITATE.

21.2.TERAPIA

STANDARDUL CLSI (INSTITUTUL PENTRU STANDARDE DE LABORATOR CLINIC. FOST

ANTIMICROBIANA

INTRE

NECESITATE $1 POSIBILlTATE 21.2.1. Scop, optiune, orientare,

monitorizare

2] .2.2. La acest bolnav terapia antimicrobiana este posibila? 21.2.3. La ce antibiotice este sensibil microorganismul infectant? Tintirea etapizata a terapiei antimicrobiene 21.2.4. Este necesarii terapeutic antibiotice?

0 asociatie de

21.2.5. Este eficienta medicatia antimicrobiana administrata?

COMITETUL STANDARDE

NATIONAL DE LABORATOR

PENTRU CLINIC,

NCCLS. U.S.A.) 21.3.1. Mediul de cultura 21.3.2.1noculul 21.3.3 Incubatia 21.4. SELECTAREA SUBSTANTELOR TEST $1 COMUN1CAREA REZULTATELOR 21.5. CONTROLUL DE CALITATE 21.5.1. Tulpini de referinta 2 1.5.2. Controlul variatiilor mediului de cultura 21.5.3. Substante test: solutii stoc ~i conscrvare; surse

21.1. TERMINOLOGIE 81 DEFINITII ARMONIZATE LA NIVEL EUROPEAN Comitetul European pentru Testarea Sensibilitiitii la Antibiotice (EUCAST) al Societiitii Europene de Boli Infectioase ~i Microbiologic Clinicii (ESCMID) a adoptat in anul 2000 Documentul definitiv EUCAST E Def. 1.2., ., Terminologie in domeniul metodelor de determinare a sensibilitafii bacteriilor la agenfi antimicrobieni". 387

Scopul documentului este sa promoveze aplicarea unifom1a a tem1inologiei privind metodele utilizate pentru testarea sensibilitatii bacteriene la antibiotice ~i sa faciliteze comunicarea intre laborator ~i clinician ~i intre laboratoare, la nivel national ~i intemational. Definirea tennenilor nu semnifica nici 0 atitudine a EUCAST fata de aprobarea vreunei metode asociate tenninologiei. Definitiile cuprinse intre ghilimele, considerate utile pentru specialistul de laborator clinic au fost preluate intocmai din textul documentului. Numerotarea seqiunilor redate in text respecta numerotarea din documentul original. (1) ANTIBIOTIC Un antibiotic este 0 substanta de origine biologica, semisintetica sau sintetica (in ultimul caz strict un agent chemoterapeutic antibacterian), care prezinta activitate selectiva impotriva bacteriilor ~i care este potential utilizabil in tratamentul infectiilor. In aceasta categorie nu sunt incluse dezinfectantele, antisepticele .;;iprezervantii. (2) SUBSTANTE TEST Acestea sunt reprezentanti ai unui grup de antibiotice care sunt In mod special potrivite pentru investigatii in vitro, reprezinta In mod optim spectml de activitate al grupului si pennit utilizarea unui numar minim de sub stante pentru testare. in mod ideal, in aproape toate cazurile, trebuie sa testam antibioticul care va fi utilizat in terapie. Aceasta este posibil numai dad clinicienii pe care ii serve~te laboratorul au 0 politic a comuna privind utilizarea restrictiva, dar rezultatele obtinute prin testarea altor antibiotice poate fi utila In identificarea mecanismelor de rezistenta (ci tire interpretativa) ~i identificarea tendintelor epidemiologice. (3) CARACTERE

DEPENDENTE

DE AGENTUL PATOGEN ( Figura 1)

(3) a. Susceptibil (S) (sau sensibil)

Acest termen este utilizat In doua sensuri, unul microbiologic ~i altul clinic. Nu a fost po sibil un consens asupra terminologiei in scopul rezolvarii confuziei care rezu]ta de aici. in fiecare caz, definitia este bazata pe analiza distributiei rezultatelor masuratorilor unuia sau altuia dintre parametrii utilizati pentru definirea sensibilitatii, cum este concentratia minima inhibitorie (CMI - vezi sectiunea 6). (3) a. a. Sensibilitate microbiologidi Bacteriile sensibile sunt cele care apartin celei mai sensibile subpopulatii ~i carora Ie lipsesc mecanismele de rezistenta, uneori denumite popula!ie bazala (sensibila). (3) a. b. Sellsibilitate clillicii Bacteriile sensibiIe sunt acele bacterii, definite prin parametrii in vitro, pentru care s-a demonstrat ca raspund unui regim terapeutic standard atunci dnd sunt implicate intr-o infec!ie. Unele autoritati in domeniul rezistentei la antibiotice fac distinctie Intre bacterii integral sensibiIe (sensibile din punct de vedere microbiologic) de cele la limita ("border-line") sau moderat sensibiIe, care, de~i prezinta un mecanism de rezistent3 388

de nivel jos, raspund de obicei la regimuri terapeutice standard. Numero~i alti factori care influenteaza raspunsul la terapie fac adesea dificila detem1inarea efectului clinic exclusiv al chemoterapiei. in absenta informatiei clinice fiabile, definitia este bazata pe un consens asupra interpretarii proprietatilor in vitro ~i fam1acocinetice ale antibioticelor ~i, in mod par· ticular, pe concentratia de antibiotic care se poate atinge la locul infectiei (sau, adesea, ca aproximatie practica, in sange). (3) b. Rezistent Acest tennen este utilizat in doua sensuri, unul microbiologic (epidemiologie) ~i altul clinic. (3) b.a. Rezisten{a microbiologicii. Microorganisme1e cu rezistenta microbiologidi snnt acele microorgansme care poseda orice mecanisme de rezistenta demonstrate fenotipic san genotipic. Tennenul utilizat poate fi "moderat sau inalt rezistenr' sau "rezistenta de nivel jos sau inalt" . Rezistenta de nivel inalt este asociata cu lips a sinergiei intre antibioticele beta-Iactam ~i aminoglicozide pentru enterococi. Rezistenta disociata poate fi demonstrata fenotipic numai in prezenta unui al doilea antibiotic, ca de exemplu in cazul rezistentei la macrolide demonstrate in prezenta unei lincosamine. (3)b.b. Rezisten{a clinicii. Rezistenta clinica apare dnd este foarte putin probabil ca infectia sa raspunda chiar la doze maxime la un anumit antibiotic. Numero~ii factori care afecteaza raspunsulla terapie fac dificila detenninarea efectului clinic exclusiv al terapiei, chiar atunci cand patogenii sunt rezistenti in vitro. (3).c. Intermediar

o bacterie este clasificata ca fiind intermediar sensibila daca apartine grupului de tulpini care se situeaza intre tulpinile clinic sensibile ~iclinic rezistente. Infeqii Ie cauzate de astfel de bacterii raspund variabil sau indetem1inat la chemoterapie, dar pot fi eliminate dad antibioticul este concentrat la locul infectiei sau daca se cre~te doza. Clasificare clinica

Sensibil

Numar izolate

Integral

CMI

Jos

Clasificare microbiologica

Sensibil

Intermediar

Rezistent

La limita (border-line)

Inalt Nivel interval

Nivel inalt

Fig. 1-1. Distributie ipotetica a eMI pentru tuipinile de bacterii izolate de la pacienti infectati, clasificate in categoria clinic Sensibile (integral sau la limita - border-line), Intermediare sau Rezistente ~i microbiologic sensibile sau prezentand rezistenta de nivel jos, moderat, sau ina\t

389

(3) d. Rezistenta incruci~ata Este absenta completa sau partiala a sensibilitatii la un grup de antibiotice. In sensul strict, rezistenta incruci~ata se aplica antibioticelor din aceea~i clasa chimica (e.g. betalactamine, aminoglicozide, sau macrolide). Totu~i, mecanismele de rezistenta cum sunt cele care rezuIta ca unnare a impenneabilitatii sau efluxului pot afecta mai muIte clase chimice: acest fenomen este denumit uneori "rezistenta asociata". (3) e. Profilul de sensibilitate/rezistenta ~i antibiograma Acestea descriu pattern-ul de sensibilitate la 0 serie de antibiotice. o bacterie rezistenta la penicilina, streptomicina ~i tetraciclina, dar sensibila la eritromicina poate fi descrisa ca avand profilul de rezistenta PST. Optional, un astfel de microorganism poate fi descris prin antibiograma RRRS pentru secventa predefinita de antibiotice. (3) f. Citire interpretativa Citirea interpretativa a datelor de sensibilitate este deductia mecanisme lor biochimice de rezistenta sau a inferentei sensibilitatii sau rezistentei clinice pe baza fenotipului observat. (4) SPECTRU Tennenul de spectru caracterizeazii profilul activitatii unui agent antibacterian asupra unor variate specii bacteriene, sau grupuri de specii (e.g. Gram pozitivi, Gram negativi, aerobi, facultativ anaerobi, strict anaerobi). Rezistenta dobandita poate modifica, din timp in timp ~i din loc in lac, patternu! de sensibilitate care define~te spectrul original. (5) PUNCTE DE RUPTURA (breakpoints) Acestea sunt valori specifice ale unor parametri cum sunt Concentratiile Minime Inhibitorii (CMI) sau zonele de inhibitie (care pot fi corel ate cu Concentratiile Minime Inhibitorii prin metode statistice adecvate) pe baza carora bacteriile pot fi incadrate in categoriile c1inice "susceptibil (sensibil)", "intennediar" ~i "rezistent". Desemnarea ca "intermediar" of era de asemenea un spatiu de joc din punct de vedere tehnic, care minimizeazii confuzia intre microorganismele cu CMI apropiat de punctul de ruptura. Este important de notat in mod particular simbolurile utilizate pentru definirea punctelor de ruptura: < inseamna "mai putin ca", in timp ce:::;;inseamna "egal cu sau mai mic ca" ~i > inseamna "mai mare ca", in timp ce ~ inseamna "egal sau mai mare ca". (6) ACTIUNE ANTIBACTERIANA (6).a. Concentratie Minima Inhibitorie (CMI) Aceasta este cea maijoasa eoncentratie, exprimata in mg/L (numeric egal eu ~g/mL, dar nu se reeomandii utilizarea acestor unitati), care, in conditii in vitm definite, previne cre~terea bacteriilor intr~o perioadii de timp definitii. (6).b. Concentratia minima bactericida (CMB) Este cea mai mica concentratie de antibiotic exprimata in mg/L, care in conditij definite in vitro reduce cu 99,9% (3 logaritmi) numarul de microorganisme dintr-un me diu continand un numar de finit de microorganisme, intr-un interval definit de timp. 390

...

Reducerea este de obicei exprimata printr-o proportie a inocului (numarul de Unitati Fonnatoare de Colonii viabile) care a fost facut inapt de multiplicare in acel interval de timp. Efectul poate fi prezentat ca 0 curba time-kill, in care un inocul este incubat cu antibioticul si probele sunt testate pentru numarul de UFC viabile laintervale definite de timp. Existl ~i aIte definitii ale CMB si, de aceea, este important sa se indice definitia utilizata. (6).c. Concentratia centratie

optima bactericida

(COB) sau cea mai bactericida

coo-

Este concentratia de antibiotic care are ca rezuItat efectul bactericid maxim intr-un interval de timp dat. (6).d. Concentratia

minima inhibitorie

a serului (titru)

Este reciproca celei mai mari dilutii (titrul) unei probe de ser de la un pacient sau voluntar (dozaHi fata de un antibiotic), care previne 0 cre~tere a numarului de organisme capabile de reproducere intr-un interval de timp dat. Este de obicei exprimata ca titrul care previne cre~terea turbiditatii unei culturi in mediu lichid prin incubare. (6).e. Concentratia

minima bactericida

a serului (titru)

Este reciproca celei mai mari dilutii (titrul) unei probe de ser de la un pacient sau voluntar care poate reduce numarul de microorganisme capabile de reproducere, exprimate ca UFC, de obicei cu 99,9% (3 logaritmi), intr-un interval de timp definit. (6).f. Concentratia

minima antibacteriana

(CMA)

Este concentra~ia unui antibiotic, sub CM! a~a cum a fost definita mai sus, care poate sa exercite efecte specifice asupra bacteriei. Astfel de efecte pot include inhibitie partiala a cre~terii sub CMI, modificari ale morfologiei bacteriene, modificari ale aderentei la suprafete, accelerarea fagocitozei, cre~terea sau scaderea activitiitii antimicrobiene in combinatii cu aIte antibiotice, prelungirea timpilor de generatie sau modificari in producerea de toxine. (6).g. Toleranta Toleranta apare atunci cand, in conditii definite, 0 substanta care are de obicei efect bactericid asupra bacteriei testate prezinta un efect bactericid diminuat sau absent, fara pierderea activitatii inhibitorii (CM! nemodificat). Diferenta intre CMI ~i CMB este de obicei cuantificata (e.g. de 16-32 de ori). Toleranta transfonna un agent de obicei bacterioid intr-unul bacteriostatic. (6).h. Persistenta Persistenta apare atunci dind celule individuale (persistenti) supravietuiesc efectelor unui antibiotic, chiar daca concentratia acestuia este deasupra CMB pentru populatia luata ca intreg. La retestare, persistentii prezinta aceea~i sensibilitate ca populatia originala ca intreg ~i nu persista 0 proportie de celule mai mare. 391

(6).i. Efectul paradoxal (fenomenul Eagle) Acesta apare atunci cand, in cadrul teste lor de determinare a CMB a unui antibiotic, microorganismul supravietuie;;te In numar semnificativ mai mare In subculturile de pe mediicontinand concentratii de antibiotic deasupra, dar nu imediat deasupra CMB. (6).j. Efectul postantibiotic

(PAE)

Este 0 Intarziere in cre;;terea bacteriei (comparativ cu cea a unei populatii control adecvate continand acela;;i numar de baCterii), dupa 0 perioada limitata de expunere la un antibiotic, dupa care efectul antibioticului este indepartat (e.g. prin diluarea de > 100 de ori sau prin filtrare ;;i spalare). Termenul poate fi de asemenea aplicat modificarilor morfologice sau biochimice. Rezistenta adaptativa este reducerea sensibilitatii in interiorul intervalului initial, mra a putea fi demonstrat un determinant genetic. (6).k. Indexul efectului postantibiotic

(index PAE)

Este timpul necesar pentru ca numarul de celule (UFC/mL) dintr-o populatie de microorganisme expuse la CMI sau mai mult al unui antibiotic, pentru un interval de timp defmit, sa creascii cu un factor 10 (1log), dupa indepartarea sau diluarea antibioticului, in comparatie cu 0 cultura control netratata (dar diluata adecvat). (7) PROPRIET A TI ALE ANTIBIOTICELOR (7).a. Potenta Este cantitatea de agent antibacterian activ dintr-o substanta test determinata cu ajutorul unui test biologic, de obicei exprimata In micrograme per miligram de substanta test (/.-lglmg). (7).b. Concentrape Este cantitatea dintr-un agent antimicrobian intr-un volum definit de lichid, preferabil de exprimat in mg/L (decM in /.-lg/mLsau mcg/mL), sau intr-o masa definita dintr-un solid, de obicei exprimata in /.-lg/gsau mg/kg. (7).c. Farmacocinetica

~i farmacodinamica

Farmacocinetica este studiul concentratiilor unui antibiotic In timp ~i In diferite compartimente ale organismului, dupa administrarea unei doze date din acel antibiotic. Farmacodinamica este studiul relatiei intre parametri farmacocinetici ~i magnitudinea ~i durata raspunsului patogenului. (7).d. CM150. CMI99 etc. Este concentratia de antibiotic car~ inhiba 50%, 90% etc. din izolatele sau tulpinile 3 ore = 0,5; 398

e = factorul prin care Cmax intrece CMI (normal 4) dar, pentru a permite puncte de ruptura inalte legate de concentrarea mare a antibioticului in anumite situsuri sau de doze crescute, poate fi folosit ~i factorull. Rezultatul este rotunjit spre cea mai apropiata valoare a CMI in cazul dilutiilor duble care includ 1 mg/L. S = este factorul de modificare pentru a obtine reproductibilitatea maxima in raport cu distributia CM!. Cand S este nu se produce nici 0 modificare, cand S este > punctul de ruptura variaza in sus ~i dnd este < I injos. Numai excePtional modificarea produce puncte de ruptura mai mari ori mai mici de doua ori decM cele calculate prin formula principal a, dar aceasta presupune sacrificarea reproductibilitatii de laborator pentru relevanta clinica. In februarie 2005, Comitetul pentru Medicamente de Uz Uman al Agentiei Europene a Medicamentului, impreuna cu Comitetul European pentru testarea Sensibilitatii la Antibiotice (EUCAST) au adoptat procedura operational a pentru annonizarea punctelor de ruptura la nivel european. Metodologia de detenninare a punctelor de ruptura acceptata la nivel european este clarificata prin documentul definitiv EUCAST E.DEF. 2.1 Determination of antimicrobial susceptibility test breakpoints.

I

I

Tintirea etapizata a terapiei antimicrobiene Sunt de considerat trei etape: 1) Microorganismul infectant a fost stabilit cu probabilitate prin ra{ionanzentul clinico-epidemiologic. Putine entitati clinice sunt determinate de bacterii care ~i-au pastrat sensibilitatea naturala ia antibioticele de eleqie pentru terapie (e.g., scarlatina, erizipelul). Cele mai multe bacterii implicate in sindroame infectioase au dobfmdit rezistenta modificandu-~i in grade variate spectrul de sensibilitate la antibioticele uzuale. In aceste situatii: • daca antibioticoterapia este 0 urgenta, se va lua precautia elementara de a 0 incepe numai dupa prelevarea probelor necesare pentru izolarea agentului etiologic; • antibioticul pentru terapie se va alege in raport cu spectrul actual de sensibilitate al agentilor etiologici posibili (vezi mai jos). Dadi ace~tia au dobandit cu frecventa semnificativa rezistenta la antibioticele uzuale, sunt indicate antibiotice de rezerval. Profilul (pattern-ul) de sensibilitate la antibiotice al unei specii bacteriene este suma antibioticelor fata w

I:

..II I'

;: I

w

0::

LL

20

/I

'

•

I I :

ii

ii '

p .•

/ I ,.

(serovar n= 314Typhj ) -------. serovar Java (n-= 36)

-.-.-.-. serovar Agona (n= 50)

• Cloramfen'lcol o Ampicillna

./ i /' .I

o

•

'/

._ ..J,'

I I 2

I

I

B

I I I I 2 8

L

CONCENTRAJII

I I I I I I IfIL-L, I I I I I I I I I 2 8 32 )/256 2 8 32 128 ~256 _n_

MINI ME INHIBITOARE (CMjl:

}lg/ml

Fig. 22- 1. Sensibilitatea la c1oramfenicol ~iampicilinii a tulpinilor fecale ale un or serovanll-i de Salmonella enterica izolate din Estul Romaniei intre 1961 ~i 1980, reprezentatii prin eurbele cumulative ale CMI (BUIUC ~i cola b., 1982). .j::>.

w

",,,.,,".,""";,,,,,,,,",;,,,;,,,,,,,,,,",,.;,,,~;.,;~,ol.;ii,ii"",,,"'.,,;,,,,,,,,,,,,~",,""",,,,,,,,ii;""'' ' ' ';ii"ii,ii'' iiuiWliii.lliiiajiWii~,,,;u.~~;

~

I I I I I

Cloramfenicol (,ug/ml) Sens'lbll Rezisl'en~ I I ••....

N••.•••

p~

~ ~

I I I I I I I I

I

r

Typhi (n=53) 1961- 65 '1m: :::'

Typhi (0-= 751

1966-70

I

o

ex>

~ wN ~~ N00 ~~

~ N ~ 00 ~

1971-75

Agona(n=50)

-}l

~

I

W

ill

Java(n=36) ~ lyphi (rl= 216)

I

.... ....

{1}

..

~~ {TYPhj(n: Agonaln=25)63)

ill :

iH

[

Typhi (n=3141 ->

Hj

-.0

~I

1J}

00

Cl Java (n= 361

Agona(n=50)

.::"

r{I}-1

,.!

~

Fig. 22-2. Reprezentarea grafiea prin metoda hox-plol a sensibilitatii la cloramfenicol ~i ampicilina a tulpinilor analizate in figura 22-1.

a~ {TYPhi(n: Agona(n=25l' 63)

illH

1

I

Hi

reprezentarea grafica a valorilor procentuale cumulative ale CMl permite ca1cularea CMI procentuale: concentra!ia cea mai mica de antibiotic inhibitoare pentru un anumit procent din tulpinile testate; e.g., CMIso' CMI90 sunt concentra!iile care inhiba 50%, respectiv 90% din tulpinile testate. Aceste valori permit orientarea rapida catre cel mai indicat medicament pentru terapia antimicrobiana de prima intentie. Extinderea metodei de analiza grafica box-plot la analiza epidemiologica a rezistentei bacteriilor la antibiotice a marc at un nou orizont pentru studiile informatizate in acest domeniu. Un box-plot este un dreptunghi paralel eu axa graficului pe care sunt marcate valorile CM!. Lungimea box-ului este egala cu intervalul dintre primul ~i al 3-lea quartil (IQR = Q}-QJ Mediana, echivalenta cu CMI50, este indicata printr-o linie care taie box-ul, care este prelungit cu 2 aripi pana la CMI10 ~i respectiv CMIw Un box-plot este mai pu!in afectat prin valorile extreme decat intervalul de confiden!a, pentru ca aceste valori apar marcate prin puncte individuale plasate dincolo de aripi. Pentru orientarea rapida a observatorului, largimea box-ului poate fi egala cu radacina patrata a numarului de observarii (fig. 22-2). In ultimii ani, Comitetul European pentru Testarea Sensibilitatii la Antibiotice (EUCAST) al Societatii Europene de Microbiologie Clinica ~iBoli Infec!ioase (ESCMID) a inceput un proces de standardizare ~i annonizare la nivel european a criteriilor de interpretare valorilor cutt-off ale CMI, pentru 0 serie de antibiotice, in intentia de a face posibila intercomparabilitatea rezultatelor obrinute in toate rarile de pe continent (vezi www.escmid.org) 22.2 DETERMINAREA

ACTIVITATII BACTERICIDE

22.2.1. Tehnica dilutiilor Principiu: CuItivam Ull inocul standardizat al tulpinii testate intr-un gradient discontinuu de antibiotic pentru a determina concentattia minima bactericida (CMB): cea mai mica concentra!ie de antibiotic exprimata in mg/L, care in condirii definite in vitro reduce cu 99,9% (3 logaritmi) numarul de microorganisme dintr-un mediu con!inand unnumar definit de microorganisme, intr-un interval definit de timp. Indicatiile sunt limitate la: • Testarea izolatelor din infeqii grave cand se doresc efecte bactericide ale antibioticului administrat, fie din cauza apararii antiinfectioase compromise a pacientului, fie a localizarii infecriei in situsuri greu accesibile pentru antibiotice (e.g., endocardite, septicemii, meningite, osteomielite). • Depistarea toleran!ei un or izolate la antibiotice cum sunt ~-lactaminele (vezi mai jos 22.2.3). Proba: Cultura pura in faza logaritmica a izolatelor clinic semnificative. N ecesar: Revezi 22.1.3 plus placi cu agar Mueller-Hinton, pipeta 20 mL. Utilizeaza tuburi din sticla boro-silicata tratata cu acid pentru a minimiza adsorbria bacteriilor pe pere!ii tuburilor (e.g., a celor din plastic sau stic1a calco-sodica). 433

Procedura: 1) Efectueaza, in volume de 1 ml sau 2 ml, gradientul dilutiilor necesare de substanta test (revezi 21.4.3). 2) Dilueaza 1:10 cultura tulpinii testate ajustata la densitatea etalonului 0,5 Mc Farland. Asiguri astfel un inocul cuprins intre 105 ~i 106 UFC/O,l m!. 3) Pipeteaza in fiecare tub, incepand cu dilutia cea mai mare, cate 0,1 ml inocul/ml de bulion, imediat sub suprafata t1uidului, lara a stropi ~i lara a agita tuburile. Eviti astfel adsorbtia bacteriilor pe sticla deasupra meniscului. 4) In para1el determina, conform indicatiilor din Capitolul 6, concentratia exacta a UFC din inocul (e.g., prin metoda Miles ~i Misra). 5) Incubeaza 20 are la 35-37°C, agiHi tuburile ~i continua incubarea pana la 24 ore. 6) Cuantifica bacteriile viabile din tuburile lara cre~tere evidenta (>CMl) cu precautia de a incuba placile 48 ore la 35-37°C. Citirea ~i interpretarea: Verifica daca inoculul final a cuprins intre I 05 ~i 106 UFC/ml, ~i anume cat. Identifica tubulin care numarul de bacterii viabile inoculate initial a scazut cu cel putin 3loglo (99,9% din bacterii omorate). Acest tub contine CMB a antibioticului testat: e.g., daca in fiecare tub ai insamantat 5x104 UFC, CMl s-a realizat in tubul 4 cu 64 mg substanta test/L, iar cre~terea pe placile de euantificare prin metoda Miles ~iMisra a fost: 70 colonii pe pladi 4,4 colonii pe placa 3 (mai putin dedt letalitatea calculata de 99,9%) cu absenta ere~terii pe placa 2, atunci CMB s-a realizat in tubul ~ care contine 128 mg substanta test/L. Concentratia minima bactericida nu poate fi determinata prin efectulletal 100% din cauza existentei in arice populatie bacteriana testata a organismelor persistente care, retestate, sunt de fapt tot atat de sensibile ca ~i populatia parentala. Persistente raman acele organisme'care in momentul testarii erau in stare donnanta sau de multiplicare mai lenta. Controlul de calitate: Detennina in paralel, CMB pentru tulpina de referinta corespunzatoare ~i verifica daca se incadreaza intre valorile cunoseute. Reeomandam lucrarea lui REIMER ~i colab. (1981) privind valorile CMB ale 44 agenti antimicrobieni asupra tulpinilor de referinta ATCC. Dezavantaje: Reproductibilitatea CMB este mediocra. Rezultatele trebuie interpretate cu precautie din cauza variabilelor care pot interveni in testare: • Testarea unei probe intrata in faza stationara aceentueaza efectu! paradoxa! in finalul fazei exponentiale: 0 ere~tere progresiva a numarului UFC in eel putin 3 eoncentratii imediat superioare CM!. Efectul paradoxal poate fi ignorat la testarea CMB fata de S. aureus, dar trebuie tinut cont de el eand testam antibiotice ~-laetal11iee fata de baeili gram-negativi eare pot produce ~-Iaetamaze induetibile (e.g., Pseudomonas aeruginosa, Citrobactel~ Enterobacter s.a. - vezi 23.4.2.) . • Adsorbtia bacteriilor din inocul pe peretele tuburilor, eu toate eforturile de a alege ~i spala ingrijit sticlaria, de a pipeta inoeulul sub nivelul t1uidului lara agitarea tuburilor dupa inoculare • Agregarea bacteriilor in ere~tere, eu tot efortul de a agita tuburile dupa 20 ore de inoculare. 434

......'

22.2.2. Tehnica determinarii timpului de omorare (time-killing) Principiu: CuItivam un inocul standardizat al tulpinii testate intr-o concentratie clinic verosimila de antibiotic ~i determinam la intervale fixe (momentul initial. 2, 4, 8 ~i 24 ore) procentul bacteriilor viabile pentru a caracteriza in final, printr-o curba, cinetica letalitatii bacteriene. Indicatii uzuale: • testarea noilor antibiotice; • testarea actiunilor antibioticelor asociate; • testarea tolerantei la un antibiotic. In curs de evalu~re este utili tate a metodei pentru initierea ~i monitorizarea antibioticoterapiei Proba: Revezi 22.2.1. Necesar: Revezi 22.2.1 Procedura: 1) Repmtizeaza in tuburi din sticla volume de 10 ml dintr-un bulion care satisface exigentele nutritive ale bacteriei testate. Adauga suficienta solutie de substanta test pentru a obtine 0 concentratie finaHi apropiata punctului (punctelor) de ruptura (v. tabelul 23-3) Utilizarea de flacoane cu 20-100 ml me diu amelioreaza reproductibilitatea prin numarul mai mare de organisme testate. 2) Ajusteaza cultura tulpinii testate la densitatea etalonului 0,5 Mc Farland. 3) Pipeteaza in fiecare tub sau flacon (inclusiv martorul de cre~tere ~i testul) rara a stropi, imediat sub nivelul de lichid, ciHe 0, I ml inocul pentru fiecare 10 ml bulion. Asiguri astfel un inocul final de 105-6UFC/ml. ; 4) Incubeaza tuburile la 35-37°C. 5) In momentele prestabilite pentru numararea UFC (0,4, 8 ~i24 ore) suspensioneaza prin agitare bacteriile adsorbite pe sticla ~i transvazeaza 0,5 ml in 4,5 ml solutie izotona sterila ~i efectueaza dilutii de la 10-] la 10-4• 6) Cuantifica imediat bacteriile viabile din fiecare dilutie (revezi Capitolul 6) cu precautia de a repica un inocul de minimum 0,01 ml, dar nu mai mare de 0,1 m] per placa. Numara coloniile dezvoItate dupa 24 ~i 48 ore de incubare la 35-37°C. Citirea ~i interpretarea: Traseaza curba cineticii de omonire a bacteriei testate pilotand pe ordonata loglo al UFC, iar pe abscisa timpul de expunere la substanta test. Efect bactericid este inregistrat cand, in raport cu martorul de cultivare, in momentul observatiei se constata scaderea numarului de UFC cu cel putin 3 loglo (99,9 % omorare) La testari fata de concentratii man (> 4 x CMI) efectul antibioticului se poate prelungi ~i pe placile de numarare a bacteriilor viabile. Antibioticele cu efect inoculum' i~i prelungesc efectul chiar la testarea fata de concentratii egale cu CM!. Prelungirea efectului antibiotic poate fi depistata ~i prevenita: 1)Depistarea: Depune, la extremitatea unui diametru, pe 0 placa cu mediu preincalzit, 0,1 1111 din suspensia bacteriana in conditii de testare (adica in prezenta antibioticului). Epuizeaza acest inocul in striuri pe toata suprafata placii. Dupa 10-20 minute, necesare adsorbtiei antibioticului in mediu, descrie incruci~at al doilea ~ir de striuri peste toata ] Cre~terea marcanta a CMI cfmd testarea se face cu un inocul mai dens. Fenomenul apare la antibiotice inactivate enzimatic (e.g., ~-lactamine). La testarea cu un inocul mai dens, inclivizii sensibili pot fi protejati de enzima produsa de cei rezistenti.

435

suprafata placii. Incubeaza corespunziitor. Lipsa cre~terii in zona striurilor initiale de epuizare indica efect antibiotic prelungit. 2) Prevenirea poate fi facuta, dupa caz, prin una din unnatoarele trei modaliti'iti: • Dilutii seriate de la 10-1 la 10-4 a suspensiei testate. • Spalarea bacteriilor din e~antionul prelevat pentru cuantificare. Bacteriile sunt prinse pe suprafata unei membrane filtrante cu pori de 0,22 11m, spiHate cu solutie salina izotona ~i imediat suspensionate la volumul initial in aceea~i solutie. • Ingrediente inactivante inc1use in mediul de cuantificare a bacteriilor viabile: e.g., cate 0,15 D/ml de ~-lactamaza tip I ~itip II, produsa de Bacillus cereus, pentru inactivarea ~ -lactaminelor; NaCl pentru inactivarea aminoglicozidelor.

22.2.3. Depistarea tolerantei Toleranta este 0 fonna particulara de rezistenta a stafilococilor ~i streptococilor in specialla antibiotice ~-lactamice manifestata printr-un raport CMB/CMI de cel putin 1:32 (cel putin 5 log2)' Poate fi responsabila de e~ecuri terapeutice in stafilococii in care este necesar efectul acid al antibioticelor (e.g., septicemii). Cel putin trei mecanisme explica toleranta la antibiotice: efectul paradoxa!, toleranta fenotipica ~i un defect genetic al enzimelor autolitice. I) Efectul paradoxal apare mai ales la testarea fata de antibiotice active asupra peretelui celular ~i consta in cre~terea prop011iei bacteriilor viabile in concentratiile de antibiotic imediat superioare CM!. Aparitia fenomenului la concentratiile mari de peniciline poate fi pusa in legatura cu 0 actiune bacteriostatica primara, prin deprimarea sintezei proteice, care inhiba cre~terea activa necesara manifestarii efectului bactericid pre cum ~i cu efectullitic asupra ARN. 2) Toleranta fenotipidi, posibila la to ate tulpinile testate, este legatii de conditii ale cre~terii insuficient definite. 3) Deficienta genetica a enzimelor autolitice, care controleaza cre~terea bacteriana, deprima efectul bactericid al penicilinelor. Determinarea raportului CMB/CMI prin tehnica dilutiilor depisteaza toleranta, dar nu diferentiaza mecanismul fenotipic de cel genetic. Aceasta diferentiere 0 poate face numai studiul cinetic al efectului bactericid: • In toleranta fenotipica rata initiala a letalitatii este mare, similara cu a tulpinilor non-tolerante, pentru ca apoi sa scada, proportia organismelor viabile ramanand mai mare de 0,1%. • In toleranta genotipica rata letalitatii este scazuta pe tot pal'cursul observatiei. 22.3. TESTAREA SENSIBILlTA.TII BACTERIILOR ANAEROBE

22.3.1. Consideratii generale Rezultatele antibiogramei anaerobe sunt, dinmai multe motive, rar utile pentru cazuri individuale: • frecvent sunt implicate in infectii plurimicrobiene, mai ales endogene; • contiguitatea focarului infectios cu supra fete nom1al colonizate ale organismului face dificila, uneori imposibila, argumentarea semnificatiei clinice a izolatelor; 436

Tabelul 22-3 Substanfe test recomandate pentru testarea sensibilitafii bacteriilor anaerobe (WEXLER ~i DOERN: ]995: NCCLS. J993b: MANDEEE ~i colab .. 1992) Actinomyces B. fragilis C.222 21ale gangrenei I12 2 Arachnia Anaerobi 2 2I2d(fficile 2 2 2 gram-negativi Provotella 2 Clostridii Porphyrolllonas Anaerobi gram-pozitivi C.Fusobacteriulll B. fragilis AHii Cefmetazol Clindal11icina Penicilina rmipenem Ampicilina-sulbactam Cefalosporine gazoase

II

I

.\::.

:::;

Sil11boluri: I = Mcdical11cnte de elcctie: tcstcaza ~i cOl11unica;2 = Medieamente alternative: testeaza doar 111cazuri individuale, e01l1uniea selectiv

• izolarea si identificarea acestor bacterii exigente este laborioasa ~i,n:ecvent, necesita un timp inacceptabil pentru decizia clinica; • focarul de infectie este patiicularizat prin necroza tisulara ~i supuratie, conditie in care primeaza drenajul chirurgical protejat prin antibioticoterapie empirica de prima intentie; Variatii regionale ale sensibilitatii obliga insa la supravegherea epidemiologica a rezistentei fata de antibiotice a bacteriilor anaerobe, care se poate face in laboratoare clinice competente sau in laboratoare de referinta. Testarile individuale se limiteaza, in aceste conditii, numai la izolate din hemoculturi sau din focare supurative metastatice. Gama substantelor test fata de care este indicata testarea bacteriilor anaerobe apare in tabelul 22-2. De-a lungul anilor au fost propuse mai multe metode ~itehnici pentru antibiograma bacteriilor anaerobe. De~i nu exista inca un consens, experienta mai multor laboratoare a pennis 0 ierarhizare a metodelor dupa criteriul reproductibilitatii rezultatelor. Metode ~i tehnici recomandate • Metoda macrodilutiilor /n agar sau /n bulion va fi detaliata mai jos. • Tehnici de microdilutii /n bulion. Galerii de godeuri cu microdilutii de antibiotice sunt comercializate in stare congelata sau liofilizata. A~a este, spre exemplu, sistemul Vitek-ATB Expression, bio-Merieux, Marcy I'Etoile, France, care restrfmge gama dilutiilor la dilutiile critice (revezi 22.1.4) ~i ofera galeria ATB-ANA, care testeaza fata de 25 antibiotice. • Testul E (revezi 22.1.4.), adaptat la conditiile incubiirii anaerobe, are fiabilitate ~i reproductibilitate similare cu testarea anaerobilor prin dilutii. • Testul striului spiral, comercializat de Spiral Systems Instruments, Bethesda, Md. U.S.A.: tulpina testata este insamantata in striu radial pe 0 placa cu mediu agarizat in care antibioticul realizeaza un gradient de concentratii care descrqte dinspre centru spre periferie ~i acest test se coreleaza bine cu tehnica dilutii10r in agar. Testarea ~-lactamazei prin tehnica discului cu nitrocefin (vezi 23.5). Metode ~i tehnici contraindicate: • Metoda difuzimetridi cu discuri pentru bacterii anaerobe. • Tehnica de elutie a discurilor /n bulion, 0 varianta a tehnicii punctelor de ruptura. Rezultatele sunt nesatisrucatoare comparativ cu tehnica dilutiilor in agar sau cea a microdilutiilor in bulion. • Testarea ~-lactamazei prin tehnica iodometrica sau acidimetrica este contraindicatE: din cauza proportiei mari a rezultatelor fals pozitive.

22.3.2. Tehnica dilutiilor In agar Procedeaza conform precizarilor de la 22.1.1, cu urmatoarele precautii: I) Dilueaza antibioticele indicate (v. tabelul 22-3) in agar Wilkins-Chalgren suplimentat 5% cu sange lacat sau agar Brucella suplimentat cu vital11ina K, (I flg/ml. hel11ina (5% flg/1111)si 5% sange lacat de cal (vezi Cap. 39). 438

2) Prepara inoculul pomind de la cultura de 24-72 ore a tulpinii testate pe agarsange anaerob ~ifolosind bulion tioglicolat, bulion Brucella sau mediul Wilkins-Chalgren tara agar. Din suspensia etalonata la densitatea standardului 0,5 Me Farland insaman!eaza cca 1 III pentru a asigura 105 UFC per spot, deci de lOX mai mult decat pentru testarea bacteriilor aerobe. 3) Asteapta, la temperatura camerei, adsorbtia completa a inoculului. 4) Incubeaza placile 48 ore la 35°-37°C anaerob in atmosfera cu 4-7% CO2, 5) Cite~te rezultatele pe fond negru unnarind, comparativ cu martorul de cultivare, cea mai mare dilu!ie la care cre~terea este absenta sau apare numai ca 0 umbra ori cateva colonii pitice.

Controlul de calitate • Insamanteaza ~i unnare~te cate 0 placa cu me diu tara antibiotic incubata anaerob (martor de cre~tere) ~i aerob (martorul absentei contaminantilor aerobi sau facultativi). • Insaman!eaza pe fiecare placa un spot a doua din cele trei tulpini martor: Bacteroides ji-agilis ATCC 25285, B. thetaiotaomicron ATCC 29741 sau Eubacterium lentuJll ATCC 43055. Veri fica daca CMI ale tulpinilor martor sunt cuprinse intre valorile cunoscute (tabelul 22-4). Tabe11l122-4

Valorile acceptate

pentru

tehnica dilutiilor

CMI (mg/L) fata de tulpinile

anaerobe

in agar; exemple din standardul

de referinta

determinate

prin

Mll-A6 NCCLS (2004)

-

- lentlll71 4-16 4-16 4/4-16/4 NR 4-16 16-64 X-32 8-32 4/4-16/4 0.25-2 0.5-2 0.25-1 16-64 64-256 16-64 32-128 32-128 8-32 16-64 16-64 0.5-2 NR 0.06-0.25 2-8 2-8 0.25-1.0 0.03-0.12 ATCC 43055 8-32 8-32 0.12/4-0.5/4 2-8 0.06-0.25 4-16 0.50-2 0.12-0.5 16-64(8-32) 16-64(8-32) !:lIbaclf..rililn ATCC 25285 Bacteroides fagilis thetaiotaomicron Bacteroides n

aNR: fie rangu] valorilor eMI nu este inca recomandat, fie este prea larg pentru ca tulpina sa poata funqiona ca referinriia pentru antibioticul respectiv. bPentru penicilina valorile sunt exprimate in Vim!. iar intre paranteze in mg/L.

439

Interpreteaza rezultatele conform punctelor de ruptura recomandate de ditre CLSl/ fost NCCLS (tabeluI22-5). Tabelul22-5

Cheia pentru interpretarea valorilor CMI la testarea sensibilitatii bacteriilor anaerobe fata de agenfii antimicrobieni; exemple din standardul Mll-A6 NCCLS (2004) _ ..L

----

--

> 28 216 232 216 32 864/4 8a 2128 264 4'7 64 216/8 228' 16 128 64 16/8 Rezistent 8/4 ~~232/16 128/4 64/2 Intennediar 4a ~]28/2_ Agentul antimicrobian

------

CMl ::; ~8/4 ~~4 2' (J..lg/ml) ~8 32/2 ~16 ~2 32 16 ~~ 4/2 ::;32 32/4 ~32

Sensibil

a Se pot ob!ine concentratii sanguine mai mari ale antibioticului; de aceea infeqii neproduciitoare de /3-lactamaza pot fi tratate chiar dad au CMI mai man dedit cele indicate.

cu tu1pini

22.3.3. Tehnica macrodilupilor in bulion Aceasta tehnica 0 inlocuie~te pe cea a dilutiilor in agar la testarea clostridiilor eu cre~tere invaziva. Procedeaza conform indicatiilor de la 22.1.3. Dilueaza antibioticele indicate (v. tabelul 22-3) in volume de 2,5 mL bulion Brucella suplimentat cu I /..l-gvitamina KI/mL, 5 /..l-ghemina/mL ~i 1 mg NaHCO/mL (vezi Cap. 39). Dilutiile trebuie utilizate in interval de 3 ore de la preparare, dar pot fi conservate la -70°C, in tuburi ermetic inchise, pana la 6 luni. Dilueaza: 1:200, in bulion de testare, inoculul etalonat la densitatea standardului 0,5 Mc Farland (vezi mai sus) ~i insamanteazii cate 2,5 ml per tub. Asiguri astfel un inocul final de cca 2,5xl 05 UFC/mL. Incubeaza, cite~te cre~terea, stabile~te ~i interpreteaza valorile CMI (v. tabelul 22-5).

22.4 TESTAREA SENSIBILITApI

MICOBACTERIILOR

Caracterele de cultura, particularitiitile sensibilitiiti micobaeteriilor la agenrii antimicrobieni ca ~i patogenitatea bacililor tuberculozei impun tehnici de testare diferentiate, laborioase ~i in conditii de securitate antiepidemicii. in raport cu implicarea 440

in diagnosticul micobacteriozelor, laboratoarele c1inice se ierarhizeaza in 3 nivele: /livellil 1, de baza, in care este posibila numai baciloscopia; nivelul2, in care se pot face culturi cu identificarea izolatelor pi'ma la nivel de complex (adica diferentieri dupa viteza de cre~tere, pigmentogeneza, diferentierea catalazei dupa rezistenta tem1ica) ~i nivelul 3, in care sunt posibile identificari pana la nive! de specie. Competenta pentI-u testari de sensibilitate a micobacteriilor la agenti antimicrobieni au laboratoarele de nivel 3 ~i, numai partial, cele de nivel 2 in masura in care au experienta ~i respecta 0 buna tehnica microbiologica (siguranta antiepidemica, control de calitate). Chiar ~i aceste laboratoare, pentru teste mai dificile, cu care nu sunt familiarizate, pot trimite, ocazional, tulpini laboratoarelor de referinta. Impactul antibiogramei in tratamentul micobacteriozelor este conditionat de: - prelevarea, expedierea ~i prelucrarea cat mai rapida a probelor; - identificarea izolatelor ca baza pentru 0 testare corecta; - cunoa~terea metodei ~icriteriilor de comunicare a rezultatelor testarii. Comunicarea rezultatelor trebuie sa fie factuala pentru ca responsabilitatea interpretarii revine c1inicianului. Pentru testarea complexului Mycobacterium tuberculosis sunt utilizate patru metode: 1) Metoda concentratiilor absolute, mai accesibila, frecvent utilizata in Europa, dar insuficient standardizata. 2) Metoda proportiilor, mai laborioasa, dar standardizata de catre NCCLS (1990) 3) Metoda raporturilor de rezistenfa utilizata in Anglia cu satisfacatoare corelatie c1inica. 4) Metoda radiometrica BACTEC 460, standardizata de catre NCCLS (1990). Este o ap!icatie a metodei proportiilor. Compara cre~terea din tubul martor (inocul 1%) cu cea din tuburile test (inocullOO%). Indicatii: Scaparea de sub control a endemiei de tuberculoza, cu cre~terea semnificativ peste 5% a cazurilor de infectii prin tulpini cu chimiorezistenta primara, obliga la testarea izolatelor de la toti pacientii cu tuberculoza ~icomunicarea periodica a rezultatelor catre forul metodologic. Documentul pentru discutii EUCAST (Comitetul pentru Testarea Sensibilitatii la Antibiotice al Societatii Europene pentru Microbiologie Clinica ~iBoli Infectioase) E.Dis. 8.1/200 1 recunoa~te valabilitatea tuturor acestor metode ~isemnaleaza dezvoltarea recenta a altoI' metode de investigatie a rezistentei la antibiotice a micobacteriilor, intre care: - metode rapide non-radiometrice cu cultivare pentru testarea sensibilitatii la izoniazida ~i rifampicina - noi metode fenotipice: metode utilizand amplificarea efectului biologic cu ajutorul bacteriofagilor; efectul biologic poate fi constatat fie direct, in sistem PhaB (Phage amplyfied Biologically), prin obiectivarea efectului litic al fagului eliberat din celule bacteriene care supravietuiesc efectului antibioticului, dupa ce acesta infecteaza 0 bacterie indicator, cu cre~tere rapida (M. smegmatis), fie indirect, prin includerea in bacteria de testat a unor bacteriofagi care exprima gena pentru luciferaza, caz in care citirea se face cu ajutorul chemiluminometriei (testulluciferazei Jacobs); varianta ultima beneficiaza ~i de un sistem economic (Bronx Box), cu citire pe film fotografic in sistem miniaturizat 441

- metode moleculare fenotipice ~i genotipice; printre cele din urma sunt enumerate: secven!ierea ADN, hibridizarea in faza solida, studiul polimorfismului ADN monocatenar, metode de analiza a ARNm Noile metode automate ~i metodele moleculare se afla in proces de evaluare pentru standardizare la nivelullaboratoarelor de referin!a, care participa la studii multicentrice ~i in exerci!ii interna!ionale de control extern de calitate. 22.4.1. Metoda concentratiilor

absolute

Principiu: Suspensia, corect etalonata, a tulpinii de testat este insamfm!ata pe mediu tara antibiotic (martorul de cre~tere) ~ipe mediu cu anumite concentra!ii de medicamente antituberculoase, numite concentra!ii critice. Sensibilitatea este indicata de concentra!ia cea mai mica de medicament antituberculos care inhiba total sau aproape total cre~terea. Proba: Dupa sursa inoculului deosebim: metoda directa sau pe cultura primara, care folose~te ca inocul insu~i prelevatul patologic cu baciloscopie pozitiva, ~i cea indirecta, care folose~te ca inocul 0 suspensie etalonata din primocultura sau subcultura. Metoda directa ofera, teoretic, un inocul mai reprezentativ pentru popula!ia bacilara din leziune. Apare justificata mai ales in zone cu prevalen!a crescuta a tulpinilor rezistente la medicamente antituberculoase. Poate sa nu satisfaca rela!ia cost-beneficiu dnd micobacterii non-tuberculoase apar frecvent pe frotiuri (e.g., micobacterii condi!ionat patogene, micobacterii de contaminare a urinei). Prelevatele sunt omogenizate ~i decontaminate (e.g., sputa) sau sunt insaman!ate tara tratare speciala daca provin din zone normal sterile. Densitatea optima a inoculului 0 realizam prin dilu!ii in raport cu rezultatele baciloscopiei (tabelul 22-5). Tabe11l122-5

Indicatii

---

pentru

diluarea

prelevatelor in raport eu baeiloscopia eomplexului M. tuberculosis

la testarea

25-250 $25 ~250 Coloratia(10'\ Numarul de bacili acido-rezistenti/camp microscopic" (1/1), 10'(10'\ 10'2 fluorescenta 10,3

" Marire de 1000X la examinarea frotiurilor colorate Ziehl-Neelsen colorate fluorescent.

directa a sensibilitatii

Dilutia de testatb

~i de 450X la examinarea celor

b Prepara dilutiile in apa distilata. ( ) indica dilutii1e pentru metoda concentra\iilor absolute: ambele dilutii men\ionate sunt indicate pentru metoda ProP0l1ii1or.

Metoda indirecta este metoda de referin!a. Verifica intotdeauna rezultatele metodei directe prin metoda indirecta. Prefera primoculturi bine dezvoltate pe un mediu cu ou (uzual Lowenstein-Jensen) sau agarizat (e.g., Middlebrook 7HlO sau 7HII), niciodata mai vechi de 4 saptamani dupa detect area cre~terii. 1) Suspensioneaza intr-un tub 16/160 mm, care contine cca 2 ml mediu Dubos tara albumina (la nevoie poate fi folosita apa distilata) ~i 6-8 perle din sticla cu diametrul de 442

1-2 mm, aproximativ 2 mm3 de cultura prelevata cu spatula din colonii earaeteristiee. Disperseaza ingrijit, cu spatula uscata, masa bacilara, deasupra nivelului de liehid, pe peretele intern al tubului mentinut inclinat. Inmoaie apoi spatula in liehid ~i continua dispersia pfma obfij 0 masa cremoasa, cu consistenta tot mai redusa, pe care 0 poti suspensiona progresiv in liehid pentru a obtine un inoeui efit mai omogen cu densitate eel putin egala cu etalonui 1 Mc Farland. 2) Omogenizeaza continutul tubului prin agitare 5-10 minute pe VOliex (la nevoie manual). 3) Lasa suspensia in repaus cea 30 minute pentru sedimentarea particulelor grosiere. Decanteaza ~i etaloneaza supernatantulla densitatea etalonului 1 Mc Farland. 4) Dilueaza suspensia etaIonata 1:50 in bulion Dubos rara albumina (la nevoie in apa distilata) pentru a obtine un inocul eu concentratia de 2x;o5-106 UFC/m!. Cand primocultura este saraca, insamanteaza cateva colonii in bulion Dubos eu albumin a ~i ineubeaza cultura la 35-37°C pana la densitatea etalonuiui 1 Me Farland. 5) Prepara un frotiu din suspensia finala si coloreaza Zeehl Neelsen pentru controlul puritatii. Necesar: Pante cu mediul de cultura care contin concentratiile critice ale fieearui medicament antituberculos (tabelul 22-7). Pot fi preparate pornind de la substanta de referinta in fonna de pulbere (este contraindicata folosirea forn1elor terapeutice) sau, preferabil, prin elutia discurilor anume impregnate cu substantele respective (WAYNE ~i KRASSNOW, 1966). Tuburile cu mediul astfel conditionat pot fi conservate ermetic inehise, la 4°C timp de 0 luna. Indicatii minime de testare confonn Indrumarului de tehnici de laborator de bacteriologie BK (Daniela Homorodean ~i co!. - 2005): I tub cu hidrazida acidului nicotinic in concentratie de 0,2 mg/L ~i un tub cu rifampicina in concentratie de 40 mg/L. Mediul de cultura indicat este agarul Middlebrook 7H I 0 suplimentat cu acid oleiealbumina-dextroza-eatalaza (OACD). Cre~terea unor tulpini de M. tuberculosis pe agarul 7H 10 po ate fi pre a saraea pentru 0 testare coreeta. In asemenea situatii este preferat agarul 7H 11. Testarea pe mediul Lowenstein-Jensen da rezultate insuficient reproduetibile pentru ca fosfolipidele, proteinele, unii aminoaeizi pe care ii contine, ca ~i incalzirea pentru coagulare-sterilizare fac greu de controlat activitatea antituberculoasa restantiL Pirazinamida actioneaza numai asupra M. tuberculosis fagocitat ~ila pH 5,2, earaeteristie fagolizosomilor, care trebuie realizat ~i in mediul de testare. Dar in mediul LowensteinJensen la acest pH verdeIe malachit se leaga slab la compu~ii din ou ~ipoate fi inhibitor pentru M. tuberculosis (vezi tabelu122-6 nota de subsol b). Folosirea mediului Lowenstein-Jensen la testarea sensibilitatii micobaeteriilor mai impune cateva precautii: • folosirea unor concentratii mai mari de medieamente antituberculoase (v. tabelu122-6); • controlul conditiilor de coagulare: baie de nisip prevazuta cu orificiu larg de ventilare (pentru a uniformiza rapid temperatura tuturor tuburilor), preindilzirea baii intotdeauna la aceea~i temperatura, introducerea concomitenta a tuburilor cu ajutorul unui stativ, coagulare timp de 45 minute la 80°C. 443

rculosis

.j:::..

Tabelul22-6

.j:::.. .j:::..

Conceutra(iilc ll1edicall1entelor antitllberculoase recomandate, in fllnc(ie de mediul de clliturii, peutru testarea sensibilitiitii prin metoda propor(iilor sall a concentra(iilor absolute (dupa INI)L!{L! 1:1) ~iS!\LFINGFR. 1995: BUN(jLTI;\Nl! ~i MOL[)OV AN. 1987)

I

I

I

71-1106 0.25-3 14-29 5(pg/ml) ~ia conccntratii (fIg/ml) 3inalli' 1-5 3-11 0.50-2.5 1025" 30 0.20.2 125100.2 71111n-.Ienscn 7.52 2010;220inalla 5025 147.5-50 525-50 16-38 01LOIVcnslci 453055230Conccntra(ia 208Mediul 0.2-0.5 (J.06-8 4-7scric[l 0.05-0.2 20-40 2-20 5-20 I-50 10 8.loasa Civil 0.05 2.5-6 i2-4 0.60-2.5 (pg/ml)" tulpinilor de.loasa Kanamicina Amikaeina Il.Oniazida

" Realizeaza lntre 1-4 ore dupa administrare. [,Tesleaza pc mediu L6wwenstein-.lensen

(L-J) aeoperil eu stral de mediu Kirchner (L-J) aeoperit eu strat de mediu semisolid Kirchner (vezi Capitolul 39):

• Prepara un mediu L-J eu eoneentra(ia de verde malaehit redusa la 1/2 ajusteaza la pH 5,2 eu sol. I N de HCI. La 300 ml mediu adauga 7,5 m] din solu(ia stoe eu ]00 mg pirazinamidalml

(pentru testare) respeetiv 7,5 ml apa (pentru martorul de ere~lere). Repartizeazii eate I ml in tuburi ~i eoaguleaza In panta I ora la

87"C. • Adauga la I Imediu Kirchner 1 g agar ~i 3 g piruvat de sodiu. Ajusteaza la pH 5,2 eu sol. 5N de HCI. La 500 mlmediu adauga 12,5 ml solu(ie stoe eu 1000 mg pirazinamida/ml (pentru test.

VI -.J

~VI

]cthell/I 23-1 (continuarc)

00

--------- I

-3-29 .--.-24-30 23-2921-28 22-29 22-30 20-28 22-28 28-35 23-29 19-25 17-21 24-30 18-26 45-54 8-10 26-32 21-27 20-25 16-21 14-22 1\-17 19-26 17-25 12-20 2ATCC 24-32 31-40 15-23 29-37 Agcntul P.24-28 24-30 18-24 26-32 25923 26-34 17-22 23-29 18-22 12-18 23-29 6(.·oli 24-34 7510 23-31 26-37 19-27 75/10 100 25(J..lg) 19-26 14-22 20-28 24-32 22-30 19-29 19-26 S.pllel/II/onit/e 22-28 25-31 1ATCC49247 6-21 12al/rellS 250 sau 300 1549266 300 24-30 17-28 27-36 30 30-42 24-30 33-38 LATCC 21-27 23-27 25-30 31-40 25-33 33-41 29-33 27-33 43-51 ATCC 15-21 19-25 E.100110 coli ATCC ATCC49766 21-29 49619 25922 20-27 27-31 1.25/23,75 35218 27853 Continutul 21-25 H24-30 injlllenzae S.17-21 aerl/ginosa N.~18-25 H.26-34 gO/lorrhoeae injillell;ae discului Vancomicina n

-

f(1I)(!!1i!

23-2

Neconcon1ante sesizabile prin controlul de calitate al testelor de sensibilitate la antibiotice: cauze ~i remedii

inoeulului, illdis~iposibile noulot Remedii at~ml ·Iilllilclol' Neconcordan(a ••Repica Alterarea antibioticului pClltru Verifica ~idin coreeteaza insamiinlare, Reia citirea eueonservul mai observatori inoeulul acccptate Verifiea termostatul (revezi tabelull-4) Concentra\ia Ca' protocolul de~iini(ial lucru: corecteaza VVeritidi. erifica ~icaleompara etaloneaza coreet inoculul daeaIonreterse ununnou Veri Antibiotic fica diseurile/solulia supradozat stoc/pulberea etalon Cauze +mul(i Mg2rcferinla depunerea Veritica mediului plaea Repiea conservul alincorccta Repicii Muta!ii conservul lulpinii deinitial al+din tulpinii discurile/solu(ia stoclpulberea etadccurefer: lotveritica noile loturi de agar (vezi le.\:lul) ~i Mg1' dingrosimea inilial altulpinii tulpiniidedereferin(a Ca2,cu Suplimentcaza bulionul Mueller-Hinton • Intiirzierea momentului critic al culturii: tulpinii de referinli\ inedeiincubator entru etalona-• Modifiearca inla impune ~i com para compara - Incubare in teaneuri mai mari de trei plaei RCZlllt,ltd: tcsUirii PSclidolllonadelor fata dc car-

.j::.

v,

',Q

••=..•.••••.•• --------------------

~

0\

rabellll 23-2 (continuarc)

demarc fat a Neconcordanta prea aminoglicozide ~I cal sau adauga timidin-fosforilaza Rezistenta prea mare ladiamctrul tetraciclinazonei~isensibilitate Fata de trimetoprim: de inhibitic

rctcstare Remedii ••Testeaza Mediul dedecorecteazapH-ul cultura cuprea de timidina Cauze posibile Variante rezistcnte aleexccs tulpinii tcstate sauATCe • tes-~i 29212 pune. suplimcnteaza sau 33186 (rcvczi mediul 21.4.2.). cu 5% siinge Daca lacat sc im-de ~imediul mediului Repica coloniile pentru identiticare Enterococcus faecalis Verifica Mediul culturacurezistente alcalin cultur[\ acid

Tabelul

23-3

Cheia de interpretare a rezultatelor testarilor cantitative sau difuzimetrice de sensibilitate conform Institutului pentru Standardele CHnice ~ide Laborator (fost NCCLS). Standardele pentru Testarea Sensibilitlitii la Antibiotice; ailS-lea supliment de informare. Document CLSI/NCCLS - M HIO-S 16,2006. Haelllophilus iI~/ille11zae.Neisseria g011orrllOeae si Streptococcus p11eU/I1011iae sunt mentionate expres; alte precizari nu I}rivesc acest grup de organisme

::::-In---

-0.25-2 ::019 ::028 ::::16 :S16 ::0]7 :S14 :S19 ::::28 ::::4 ::::20 -::::4::::202-1318::::::::2929de ruptura::017 ~-Iactamaza Sensibil (Punet:SO. 0.12-1 16-14 46-27 29-22 >]7 5]2 16 30-26 21-16 17-15 14-13 17-14 32-101 15-14 >16 8Rezistent 18-16 Intermediar Intermediar 19-17 14-13 22-15 8-16 >162.

0\

---

00

Tabellll 23-3 (eontinuare)

:::16 :::17 -Sensibil 18-14 482:::19 12-14 11-10 >12 18-15

• J>+ •

{TMB} -+

J>

» • + •

»:::r----@

test pozitiv

-+

J> J>=>-© »:::r---@

• »=>-©

+

{TMB} -+ •

• »=>-© test negativ

Legenda: = suport •• «: = antigene adsorbite pe suport sau prezente in proM ~= antigen diferit fata de eel testat = anticorpi specifici *' = anticorpi nespecifici ):::>---@ = conjugat cuplat cu antigene () sau anticorpi (t) TMB = tetrametilenbenzidina • = reactia de culoare prezenta (ser reactiv) = reaC{ie de culoare absenta (ser nereactiv)

t

o

Fig. 25-8. ElA competitiv pentru evidentierea

522

0

de antigene.

Dupa incubare ~i spalare, in a doua etapa, adaugam conjugatul reprezentat, in acest caz, de anticorpi anti-antigen marcati enzimatic. Dupa a noua etapa de incubare ~i spalare, adaugarea substratului cromogen releva activitatea enzimatica, direct propoqionala cu cantitatea de antigen cuplata (fig. 25-9). • Tehnici necompetitive indirecte. Deosebirea fata de tehnica directa apare ~netapa a doua cand antigenul reaqioneaza cu anticorpi nemarcati adaugati in exces. In acest caz revel area a facem printr-un conjugat reprezentat de anticorpi antiimunoglobulina marcati enzimatic (fig. 25-10). Deci conditia pentru ultimile doua tehnici este ca antigenul de dozat sa prezinte cel putin doi epitopi, identiei sau nu, de unde \,i denumirea de tehnici cu dublu situs sau "sand,vich ". In microbiologia clinica tehnicile EIA de evidentiere a antigenelor sunt utilizate pentru: - diagnosticul rapid al un or bacterioze: infectii cu Streptococcus pyogencs ~i infeqiile genitale cu Chlamydia trachomatis; - diagnosticul unor viro+ze in care agentul etiologic este necultivabil sau dificil de cultivat: virusul hepatitei B (Ag HBs, Ag HBe) ~i C (Ag miez), Hiv (Ag p 24) rotavirus \,i virusul Norwalk; - diagnosticul bron\,iolitei sugarului cu virus respirator sincitial pentru orientarea rapida spre tratamentul eu ribavirin \,i evitarea excesului de antibiotiee; - diagnosticul rapid al gripei; - diagnosticul infeqiilor herpetice pentru orientarea rapida a chimioterapiei; - diagnosticul gastroenteritelor virale. 25.6.2.2. Dozarea de anticorpi. Datorita marii lor heterogenitati, anticorpii nu sunt, de regula, detem1inati prin competitie, ci prin meta de secventiale necompetitive directe sau indirecte.

t+

) + t::r-© -+

t) t::::>-© +

{TMB} -+ • test pozitiv

t + + + t::>-© -+ t +

{TMB} -+

0 test negativ

Fig. 25-9. EIA direct pentru evidentierea de antigene. (vezi legenda de la fig. 25-8)

• + • +

t + t:::>-©

•• t =>-© t

+

++

-+

•• t::r-©-+

+ {TMB}

t~

-+

-+.

test pozitiv

• + {TMB} -+

0

test negativ

Fig. 25·10. EIA indirect pentru evidentierea de antigene. (vezi legenda de la fig. 25-8)

523

• Tehnici necompetitive directe cu antigene marcate. Pe baza salida esle tixal In exces antigenul. In prima etapa anticorpii din proba se leaga specific de antigen. Dupa incubare ~i spalare, In a doua etapa un antigen marcal enzimatic reaqioneaza cu al doilea situs al anticorpului din complex. Revelarea complexului fonnat In primele doua etape,o facem prin adaugarea substratului cromogen; activitatea enzimatica masurata este proporlionala cu con centralia anticorpilor din proba (fig. 25-11). Tehnica mai este denumita ~i "a dublului situs" pentru ea antieorpii sunt cel pUlin bivalenli. • Tehnici necompetitive Deosebirea reaelioneaza

indirecte cu antic0l1Ji anti-imunoglobulina

rnarca[i.

fala de tehnica direeta apare In etapa a doua cand anticorpii din proba eu anticorpi anti-imunoglobulina marcali enzimatic (fig. 25-12).

« +

t

+

t=>-©-+

«t t:::r---©

+ {TMB} -+ • test pozitiv

«

+

* + t =>-© -+

« + {TMB} -+

0 test negativ

Fig. 25-11. ErA direct pentru evidenlierea de anticorpi. (vezi legenda de la fig. 25-8)

• +

t -+

.t

t=>-© -+ • t t:::r---©+ {TMB} -+.

+

test pozitiv

• +

* -+

• +

* + t=>-© -+

• + {TMB} -+

0 test negativ

Fig. 25-12. ErA indirect pentm evidenlierea de anticorpi. (vezi legenda de la fig. 25-8) Activitatea enzimatica proM. Cu ajutorul accstci la clase de imunoglobulinc.

este direct proporlionala tchnici putem detennina

cu cantitatea de anticorpi din apartcnenla anlicorpului dozal

• Tehnici prin competi[ie cu anticorpi rnarc(qi. Anticorpii de dozat intra In eompetilie ell antieorpii l11areali, care au aeeea~i spedficitatc pentru antigenlll adsorbit. In cantitate limitata, pe baza solida. Revelarea reactiei 0 facel11 prin adallgarea substratuJui cromogen (fig. 25-13). Activitatea enzimatica este invers proportional a cu cantitatea de anticorpi din proba. Dezavantajele tchnicii sunt necesitatea eonjugaleJor specifice fala de variatele antigene absorbite §i imposibilitatea precizarii cJasei de imunoglobulina a anticorpilor. Proba: Rezulta din descrierea de l11ai SllS a principiilor ~i indicaliilor variatelor tehnici EIA (e.g., ser sangvin, exsudate. secrelii ~i excrete). Neccsar: Trusele comerciale In llZ conlin tOli reactivii necesari Cll exceplia apci distilate. aciduJui sulfuric necesar stoparii reactici, pipctelor automate ~i varfurilor. aparatului dc spalat automat ~i spectrofotometrului. Exista In prezent linii ErA complet automatizate. 524

1

«

•

41::>-©

•

+

•J)::>-©

41

0

test pozitiv -+ «41 «41 + {TMB} -+ «41::r-© + {TMB} -+ • «41::>-©

« + « + « 41::>-©

test negativ

Fig. 25·13. EIA competitiv pentru evidentierea de anticorpi. (vezi legenda de Ia fig. 25-8)

Proccdura. Respecta strict indicaliile producatorului pentru tiecare din ctape1e en umerate mai jos: 1) Repartizarea probei ~i martorilor pozitiv ~i ncgativ; incubarea sistcmului. 2) Spalarea pentru Indepartarea reactantilor nefixati. 3) Adaugarea conjugatului ~i incubare. 4) Spalarea pcntru Indepartarea exccsului de conjugal. 5) Adaugarea substratului cromogen ~i incubare. 6) Stoparea reaqiei. Citire ~i interpret are. in primele 15 min ute dupa stoparea reactiei, cite~te rezultatele la lungimea de unda indieata de produeator. Daca martorii se Inscriu In limitcle normale, calculeaza valoare "prag" a trusei eunoseuta sub numele de ..culojr (CO), care este 0 marime eaIculata pc baza fonnulei indicata de prospeetul trusei. Interpretarea rezultatelor difera In funetie de tehnieile utilizate: • in lehnicile necol7lpetitive, directe ~i indirecte, 0 proba este reaetivii dad absorblia acesteia cstc mai mare sau egala cu valoarea CO ~i nereactivii dad absorblia estc sub limita CO . • in tehnicilc de tip compelitiv 0 proba cste reactiva daea absorblia cste mai m1C3 sau cgala eu valoarea CO ~i ncreaetiva daea absorblia este mai mare decal CO. Probleme de inlerpretare ridica probele care au absorbtia egala cu ± 1000k din CO. Aceasta cstc a~a numita ••zona gri" a trusei. Rezultatul nu poate ti interprctat ~i este reeomandata fie retestarea aeelca~i probe eu 'alt tip de trusa. fie testarea unei noi probe prelevatii dupa 3-6 luni. Data fiind spccificitatea mai redusa a tchnicilor EIA In raport cu sensi bilitatea. in condiliile unci prevalente reduse a infeqiei investigate (vezi Capitolul I). este recomandat, mai ales In cazul infcqiei eu virusul imunodeficienlei umane, ea rezultatele pozitive sa fie confirmate prin tehniei mai specifiee (e.g., Western blot. imuno11uoreseenla). Controlul de calitate estc realizat prin mat10rii pozitiv ~i negativ livrati de producator eu 0 anumita valoare a absorbliei prceizata In prospectul trusei. Surse de eroarc sunt: congelarea repetala a probclor, pastrarea peste 2-3 zilc la 4°C, contaminarea probelor, prezcnta eritrocitelor sau a faetorului reumatoid. 525

-------------

__

~~_~~~--------------------.---

,':f"f]?,;r~:

:..::l~

25.6.3. Imunofluorescenta

(IF)

Principiu: Conjugate

imunofluorescente realizate cu anticorpi specifici recunosc anti gene dintr-un mediu de reactie pennitand evidentierea lor microscopicii. Reaqia de culoare obtinuta difera in funclie de fluorocromul utilizat (vezi 4.3.3.). Tehnicile IF pot fi de tip direct sau indirect. Tchllica IF dirccta (fig. 25-14 A) presupune incubarea probei in prezenta conjugatului. Dupa 0 serie de spalari care elimina artefactele de camp, preparatul este uscat in aer §i montat in vederea microla lama de microscopiei. In tchllica IF indirecta (fig. 25-14 B) proba reaqioneaza scop mai Intai cu un exces de anticorp specific. Dupa spalare, adaugarea conjugatuJui anti-imunoglobulina permite evidentierea antigenului urmarit In proM. "

A) Tehniea directii

/~

+

--+

.A

'-'~

4k/// ,,

B) Tehniea indireetii

~+a

---.

~/,

# ---. :~

~,.

+

~/.%

Fig. 25-14. Imunofluoreseen\a directa ~i indirecta. A) Telmica direeta: antieorpul omolog este marcat eu un com pus fluorescent. B) Tehnica indirecta: fixarea anticorpului ornolog pe antigenul din frootiu este eviden\iata eu un anti· corp anti-imunoglobulina mareat fluorescent.

Indicalii: 1) Depistarea de antigene in: • infeqii respiratorii (virus herpses simplex, v. gripaJ A, v. paragripaJ I. 2, 3. Legionclla pncul1lophila, Bordetclla pertussis §.a.); • infeqii genitale (Chlamydia trachomalis. Treponema pal/idul1l); • cultmi de celule infectate. 2) Depistarea de anticorpi in: • infectii virale (v. citomegalic, v. Epstein-Barr, v. herpes simplex, v. variccla-zoster, v. urlian, v. rujeolic, v. rubeolic §.a.); • i'1feclii bacteriene (Legionella pncumophila. Mycoplasma Plleumoniae, Borrelia burgdolferi. l1elycobacter pylori. Treponema pallidum); • infectii parazitare (malarie, leish rnanioza, tripanosomiaza, pneumocistoza, toxopJasmoza, schistosomiaza). Proba: Exsudate sau raclate de la nivelul leziuniJor cutanate sau ale membn:lor mucoase, sputa, aspirat hipofaringian, secretii genitale. sediment minar ~i de lichid cefalorahidian. probe biopsice. amprente tisulare, culluri de cdule infectatc pentru identificarea de antigene; ser sanguin pentru identificarca de anticorpi. Procedura/Citire ~i interpretare. Cei interesati de amanuntele tehnice ale IF pot consulta bibJiografia recomandata (CAJAL et aI., 1990) §i pot urma cursurile de specializate in laboratoarele de profil ale Institutul de Virologie ,,~tcfan S. Nicolau" sau ale Institutului Cantacuzino.

Limite: Dc§i este 0 tehnica celui care cite~te ~i interpreteaza In prezent exista multe teste incJusiv a~a numita tehnica FlAX 526

sensibiHi, IF depinde foarte mull de cxpcricnta rezultatul. in uz pentru evidenlierea prin IF a anticorpilor, (Solid Phase Fluorescencc ImmUll()(lSsay). Metoda

este similara ca principiu cu IF, dar citirea se face fluorometric ~i nu microscopic. Cel mai folosit este sistemul comercial FlAX (Bio Whillaker, Inc., Wakersville, Md.). In acest sistem antigenul este iinobiIizat pe un disc de nitroceluloza ata~at pe benzi de plastic ~i nu pe lame de microscop. Benzile sunt imersate in proba de ser ~i anticorpii specifici, daca sunt prezenli se leaga de antigenuJ de pe banda. Benzile sunt apoi transferate intr-o solulie care contine anticorpi anli-imunoglobulina marcati cu fluoresccina care, la rfmdul lor, se leaga de anticorpii IgG complexali cu antigenul. Anticorpii legati sunt cuantificati fluorometric. Prin acest sistem pot fi decelati anticorpi anti- VCM anti-VEB, antirujeolo~i. antirubeolo~i, antiurlieni ~.a.

25.6.4. Tehnica Western Blot (WB) Principiu: Numeroase membrane sintetice pot lega proteine suficient de putemic incat devin supon pentru reaqii imunologice in faza solida. ProteineJe legate i~i paSlreaZa reactivitatea antigenica fiind accesibile anticorpilor din proba de testa!. Aeest principiu a dus la dezvoltarea unui numar mare de tchnici sensibile §i eu marc speeificitate, numite generic "imunobloturi". Curent utilizata este tehniea Western Blot (WB) in care proteinele sunt transferate dintr-un gel de eleetroforeza pe 0 membrana suport ~i ulterior reaclioneaza cu anticorpii din proM. Tehnica WB combina selectivitatea electroforezei in gel cu specificitatea testelor imunologice ceea ce pennite detectarea ~i analizarea proteinelor aflate in amestec. RezuItatele sunt calitative. Indicatii: Confirmarea seruriIor reactive In ELISA sau IF. Proba: Serul sangvin prelevat ~i conservat in condilii uzuale. Necesar: I) Truse comerciale reactivii necesari.

care conlin:

benzile de nitroceluloza

cu antigene

fixate

~i

2) Micropipetc automate. 3) Agitator elipsoid. 4) Sistem de spalare a benzilor. Procedura: Respecta indicatiile produc:Horului. Citirc ~i intcrpretare: Vizualizarea rcaqiilor pozitivc presupune aparil13 unor linii cenu~ii-negre in dreptuJ antigenelor fala de care exista antieorpi in proba testata. Liniile de intensitate forte slaM due la interpretari subiective. In acest caz se impune repetarea testului pe 0 noua proba, Ja un interval de 1-3 luni. Controlul de calitatc se face eu seruri pozitive ~i negative incubate scparat (fig. 25-15). Limile: prin seindare, migrare ~i etalare unde situsuri antigenice pot fi denaturate ceca ee genereaza rezultate fa]s negative. Cand un rczultat WE este ncconcludent ~i in contradiqie cu ipotcza c1inica se impune folosirea unei tehnici principia] diferile (ex. PCR).

25.6.5. RIBA (Rccombinat Immunobinding Assay) Principia I telllliea este asemanatoare ell WB, dar antigeneJe fixate pe banda de nitroeeluJoza sunt obtinule prin recombinare ~i sunt plasate Ia distanla egala uncle de allele ~i nu In funqie de l110bilitatea In campul electroforetic.

Indicatii: Confinnarea serurilor reactive in ELISA cu precizarea speeifieiti:ilii antieorpilor fala de antigenele imobilizate pe banda (fig. 25-16). (1) gp 160 (env) gp 120 (env)

p 68 (pol)

(2)

(3)

I-

c

I(I)

p 55 (gag)

(2)

MP (II) NS4

P 41 (env) p 34 (pol)

C.Bc

C,~ NS5

P 24 (gag) .- SOD

-

MP

(II

p (gag)

Legcndii: (1) ~i (2) Benzi senlri pozitive; (3) Banda ser negativ. Criterii de interpretarc (e.g. a.M.S.): 2 benzi env ± gag ± pol cnv - enl'elope; gag: group specific anJigell: pol: polymerase. Fig. 25-15.

WB pentrll cvidentierea anti-HIV.

anticorpilor

Lcgcnda: SOD . sliperoxid disllllllaZa; MP II (mar1or intens pozifiv); MP I (martor slah pozitiv). (I) Control scr pozitiv; (2) Ser testat pozitiv pentrll anticorpi antiC 33c ~i C:l2' Aspectlll bcnzii este confonll tnlsei RIBA de generatia a III-a prodlls de fimla Chiron. Fig. 25-16. RIBA pentnl evidenticrea corpilor anti·vinls hepatitic C.

ani i-

Proba: Serul sangvin. Ncccsar: Truse comerciale (ben7j eu antigene imobilizate, reactivi). Pentru alte materiale ~i facilitali consulta 25.6.4. Proccdura: Respecta indica{iile producatorului. 528

Citire ~i interpretare: 1) Produditorul indica numele §i pozitia fiecarui antigen fixat pe banda. 2) Pe fiecare banda sunt inclu~i doi martori pozitivi (MP), unul "slab" ~i ceHllaJt "intens pozitiv". banda separata folose§te ca martor negativ (MN). 3) Examineaza intensitatea spoturilor pentru MP ~i MN. Rezultatele sunt validate cand:

0

• intensitatea spoturilor MP este cel putin 2+ pe scara de la 1+ la 4+; • spoturile MN trebuie sa aiba 0 intensitate mai slaba decat ale martorului slab pozitiv. 4) Determinarea raspunsului fata de fiecare antigen 0 facem comparand intensitatea sporturilor cu cea a martorilor slab ~i intens pozitiv (fig. 25-16).

25.7.

REACTII DE NEUTRALIZARE

Anticorpii neutralizanti reactioneaza cu antigenele specifice blocand proprii acestora (e.g., infectiozitate, toxicitate, hemaglutinare p.).

activitati

25.7.1. Dozarea antistreptolizinei 0 (ASLO) Princlpiu: Dilutii succesive ale serului testat sunt amestecate cu 0 cantitate standard de streptolizina 0 (SLO) §i incubate 15 min. la 37°C pentru neutralizare. Activitatea SLO restanta este testata prin adaugarea la fiecare dilutie a unui volum constant din suspensia 5% de eritrocite. Dupa reincubare ~i centrifugare stabilim ce ;. ~ 1

"+

+1

+1

+

Z

1

+

~

I I

Z Z

1 I

I

I

I;'

I I I

1

>1+

+

+ +

1

1

1

1

>

Z

8 U!X!w!l0d ~ZBP!ZOPBjBD-9 ~ZBp!U01ml1jD-9 ~ZBP!ZO:lI1ID-g ~ZB;l1n loElB111U Bd1;:J:lnp;:J([ ~U101;:J:lB;:Jp B;:J1;:J:lI1P01d ~ZBP!WBjl1B EUOP!l01!d

1

+

> >

~

- U!U!1l1'V

~U!lB:ljB ~ZB1BJSO..-\ FB;:Jj:ll1uouu;:Jl lBjO:lJj1l0!lj1 m I1!P;:JWU! ~q01;:JBUB;:J1;:J1S;:J1:) 10PB..-\llu!dwl1jJ ~ZBjl1llBO:)

+

~

Z

Z

+

+

+

+

+

>

+

>

+

~

Z

+

~

~

z

z 1

1

I

1

1

I

+

1+

I

1

1

1

I

>1>

+

> +

« « z z

+

>1>

+ ~

Z

+

>

+



+

..s

G

Z

+

"+

+

"+

I

+

+

+

>

1

+

"+

Z

~

+ +

Z

~

+

+

~

+ ~

+ + + +

S.lwelllo/niclls ]6 111111 S.saproplzyricus s.s.

-

28.1.8. Identificarea definitiva Identificarea speciei Datoritil complexitatii actualei scheme taxonomice, identificarea definitiva, de celiitudine, a speciilor ~i/sau clonelor de stafilococi nu poate fi realizata in unele cazuri decat prin metode moleculare: e.g., analiza unor proprietilti moleculare fenotipicc ca: acizii gra~i (HPLC), enzimele multilocus (e.g., proteinele de legare a penicilinei), polipeptidele totale, proteinele exocelulare (electroforeza in gel de poliacrilamidil) sau a unoI' proprietati genetice cum sunt: analiza polimorfismului fragmentelor de restrictie ale materialului genetic plasmidic, ribozomal sau cromozomal, electroforeza In camp pulsator a ADN total, ribotipia, utilizarea concomitenta a un or proceduri de amplificare dupa hibridizarea cu sonde ADN etc. Multe dintre metodele moleculare sunt utilizate curent numai in laboratoare de referintil sau de cercetare cu dotilri speciale. Criteriile de diferentiere curent utilizate, introduse ~idezvoItate dupa 1975 de Kloos ~i Schleifer, iar ulterior de alti alltori care s-au ocupat de acest gen bacterian, au la baza studiul fenotipic aprofundat al speciilor individualizate genetic. (tabelele 28-4 ~i 28-5). La CDC Atlanta, Rhoden et a!. propun 0 abordare noua a metodologiei clasice de identificare a Micrococcaceae/or, pe baza utilizarii conventionale a carbohidratilor ~i a testelor biochimice, alilturi de teste cromogene selectate din sistemul API Staph-IDENT. Aceasta abordare difera de metodele de referinta existente prin adoptarea unui sistem numeric de codificare a testelor convention ale pentru crearea unei baze de date similare eu cele utilizate pentru sistemele comerciale, care inlocuie~te sistemul de identificare pe criteriul "potrivirii eelei mai apropiate" eu earacterele enumerate in tabele de identificare. Utilizfmd aceasta abordare a fost posibila identificarea eoreeta a 95% din tulpinile de referinta ~i/sau complet caracterizate utilizate pentru validare.

28.1.10. Sisteme comerciale Mai multe companii comerciale produc truse de identificare ~i/sau illstrumente automatizate care identifiea speeiile de stafilococi cu 0 acuratete intre 70% ~i peste 90% (tabelu128-8). Fiabilitatea acestor sisteme difera in functie de scopul pentru care au fost propuse ~i este superioara In cazul utilizarii unei baze de date extinse prin diversificarea testelor diseriminatorii. Sistemul comercial fluorogen-cromogen RAPIDEC STAPH propus de BioMerieux - Vitek pentru identificarea Olientativa in 2 ore, utilizand 4 teste, as. aureus, S. epidermidis ~i S. saprophytic us aduce avantajul rapiditatii, dar nu poate orienta diagnosticul cu suficienta acuratete (70-74% pentru S. epidermidis, 81% S. saprophyticlIs). Unele sisteme recomanda utilizarea de teste aditionale, cum sunt coagulaza liberii sau legata, cre~terea anaerobii In mediul cu thioglicolat, rezistenta la novobioeina sau decarboxilarea omitinei (ultimile doua sunt incluse in eomponenta anumitor truse). 577

este ta ificare specii m. bovine Towson

Tabelli/ ::8-8 Sisteme de microteste utilizate pentru diagnosticul bacteriologic al infectiilor Nr. ,i Ii1 I Newark. +NA* ± 18-24 Necesare Liofilchem s.r.l teste ...• 18 Sacramento NP 21 10-13 24 om 1 0 ± CA incubare 34 27 48 h la cu sllbstrat Minitek Analiza acizilor Instrument 18h de la inoculare Becton Dickinson simi lare Bio-Merieux5h Necesare Hid teste teste Bio-Merieux 32 4-24 96 Citire Cbservatii 24h 5h Uneori necesara Bio-MerieuxVitek 20 MIDI. del. Becton Dickinson 30 10 Teste biochimice Vitek. Vitek. Inc. BioMerieuxVitek. Seleqie teste Acuratqe Baxter Diagnostic ROSCO. Taastrup D iscuri impregnate gra~l pnn gaz Hayward aditionale Citire posibila 2 h Inc. I Biolog, Inc U NE* tulpini tilizat penlru izolate pentru Baxter Diagnostic Producator Nume comercial i stafilococi cromatografie aditionale nespecifica Micro Scan pentru Pos ID Panel

stafilococice

•

* NE = neestimata

Identificarea rapida a speciei Saureus poate fi lacuta cu ajutorul reactivilor comerciali de aglutinare indirectii (tabelu128-9). Reactivii sensibilizati cu fibrinogen ~iimunoglubuline G cupleazii coagulazalegatii, respectiv proteina A din peretele Saureus, ceea ce are ca expresie macroscopidi aglutinarea amestecului dintre reactiv ~icultura de Saurells. Tulpinile de S.lugdunensis ~iS schletleri pot da reactii pozitive cu ace~ti reactivi. Reacti\ii 578

Tobe/ill

Reactivi comerciali pentru diagnosticul rapid de specie al Staphylococclis Reactiv

I ..J .-----l --j ACCU-STAPH ---1 I

I

l ---i~Fibrinogen,

--Ii,iIIFirma ~Fibrinogen,IgG Bio-Merieux Bio-Merieux. Franta American Scientific Products BBL. U.S.A. Sensibilizat cu Remel. Scott Laboratoires. U.S.A U.S.A. Roche, Franta FibrinoQ.en, Difco. IQ.G U,SA Sanofi Pasteur. Franta Mlirex Diagnostics produciitoare Can Zeus Scarborough. Technologies, U.S,A. U,S.A. Oxoid, Anglia Fibrinogen.lgG Chemapol. Welcome Diagnostics. Cel1ia U,S,A. Fibrinogen, Fibrinogen. IgG IgG, anticorpi specifici I

IgG hoG

i f

J

21\-0

aI/reus I

care contin in plus anticorpi anti-polizaharid capsular asigura identificarea cu un plus de sensibilitate a tulpinilor de S.aureus meticilino-rezistente, care exprima slab antigeneie parietale. Evaluarea multicentrica efectuata asupra unui lot de 892 stafilococi (278 S.A.MS. 171 SARM, 443 stafilococi coagulaza negativi), in anul 2001 in laboratoare de refcrinra din Olanda, Franta ~i Elvetia a evidenriat sensibilitari (SAMS/SARM) ~i. respectiv. specificitari de 98,2 (98,9/97,1) ~i 98,9 pentru SLIDEX-STAPH PLUS; 98,2 (98,2/98.2) ~i96,2 pentru STAPHAUREX PLUS; 98,7 (98,6/98,8) ~i95,7 pentru PASTOREX STAPH PLUS. Identificarea rapid a a S. aurells a devenit posibiHi ~i cn ajutorul Iestului de hibridizare a acizilor nucleici utilizand cultura bacteriana, respectiv proba clinica (Accu PROBE Culture Staph),lococclis allrells - Gen-Probe, Inc. San Diego, Calif., GENE TRAK Staphylococclis allrells - Neogen corporation). Reactivii comerciali de acest tip au 0 eficienta de 100%, identifica/detecteaza corect toate tulpinile de S.o/lrclIs ell coagulaza negativa pe lama ~i in tub, dar sunt inca destul de scumpe. In 1992, Guzman et aI, au propus in acela~i scop un test imunoenzimatic bazat pe un anti corp monoclonal, C 1-10/11, anti -endo-f3-N -acetilglucozamini daza S.a Ii reI{ S (SaG). Sunt disponibili in prezent reactivi comerciaJi ELISA (TECRA - Internatiunal BioProducts; RIDASCREEN SET - R-Biopharm, Inc.) pentru identificarea S. (flirCIII', precum ~ireactivi utilizfmd 0 varianta ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay). Vidas SET Staphylococcus aureus - Bio-Merieux Inc., Hazelwood. Identificarea c10nalii Prevenirea ~i limitarea infectiilor nosocomiale este conditionata de cunoa~ierea surselor ~icailor de propagare a tulpinilor implicate. De aici derivii necesitatea eviclenlicrii UDormarkeri clonali de interes epidemiologic.

Identificarea donala cuprinde in mod curent biochemotipia, antibiotipia ~ilizotipia. Incepfmd cu anii 1970 au fost propuse ~i utilizate mai multe scheme de biotipie destinate in special diferentierii intraspecifice a stafilococilor coagulaza-negativi, dar recunoa~terea ulterioara in cadrul biotipurilor a mai multoI' specii a scazut interesul pentru asemenea abordare. Spectrul de sensibilitate la antibiotice poate procura inforn1atii pretioase de ordin epidemiologic, in special asupra unor tulpini circulante in arii restranse. Tiparea pe baza sensibilitatii la bacteriofagi se utilizeaza inca pentru identificarea donala a S.aureus (fig. 28.11 - vezi plan~a color). Setul de baza ~imetodologia de tipare sunt standardizate ~i revizuite periodic sub controlul unui subcomitet international care activeaza din anii 1950. Rezultatele obtinute din investigarea stafilococilor coagulaza negativi cu aceea~i metoda nu au fost incurajatoare. In anul 1998, Subcomitetll/ International pentru Lizotipia Stafilococului a distribuit un set de 10 bacteriofagi acti vi asupra S. aureus meticilino-rezistent. Tabelul 28-10 prezinta setul de baza international al bacteriofagilor utilizati pentru tiparea S. aureus de provenienta umana recomandat de Subcomitetul O.M.S. pentru Lizotipia Stafilococului. Tabelll! 28-/0 Setul international i

Grup litic

de bacteriofagi

pentru

tipizarea S.aureus de provenienta

umana

I

I 94.96 3 A. 3E,C. 55. 71 6.42 47. 53. 77, 83 B A. 84. 85 29.52.52 A. 79. 80 69.73. 78.42 B.75, 47 C. 52 81,95 DII 88.89.90. HK,. Bacteriofagi I

Serotipia este putin utilizata, datorita dificultatilor de standardizare a metodei ~i preparare a antiserurilor specifice. La noi in tara, Centrul National de Referinta pentru Stafllococ din Institutul Cantacuzino asigura identificarea curenta a tulpinilor provenite din foe are de infeqii sau toxiinfectii stafilococice prin biotipie, antibiotipie ~i lizotipie. Preocuparile de annonizare la nivel european a metodologiei de tipare a S. Clllreus s-au concretizat in protocoale standardizate de electroforeza in camp pulsat (PFGE) propuse in cadrul proiectului HARMONY, iar mai recent, un subproiect (SeqEuNet) al Sistemului European de Supraveghere al Rezistentei la Antibiotice (EARSS) annonizeaza metodologia de tipare as. aureus prin compararea secventelor locusului spa cromozomal, raspunzator de sinteza proteinei A. In situatii epidemiologice deosebite, prin colaborare cu Departamentul de Epidemiologie Moleculara din Institutul Cantacuzino, este posibila in cadrul Centrului National de Referinta pentru Stafilococ tiparea S. aureus prin PFGE ~i secventierea spa. 580

28.1.9. Detectarea toxigenezei

o serie de companii produditoare ofera reactivi latex-aglutinanti (RPLA Oxoid) sau imunoenzimatici (TECRA Staphylococcus aureus Visual Immunoassay Intemational Bio Products, Redmont; RIDASCREEN SET ELISA R - Biopham1, Inc., Transia Plate ~i Transia Tube ELISA Diffchamb AB, Vastra Frolunda), pentm identificarea enterotoxinelor stafilococice. Firma Oxoid comercializeaza reactivi pentm detectarea TSST I prin aglutinare pasiva inversata (Reversed Passive Latex Agglutination - RPLA), iar fim1a Columbia Toxin Technology, Wis., reactivi ELISA cu aceeasi utilizare. Metodele moleculare constituie in prezent aItemativa preferata in domeniul detectiei capacitatii toxigene. Aceste metode se dezvolta ~iin cadrul Centrului National de Referinta pentru Stafilococi. 28.1.10. Metode de diagnostic ~i epidemiologie moleculadi Metodele moleculare of era 0 altemativa din ce in ce mai mult utilizata pentru atingerea dezideratelor privind rapiditatea ~i fiabilitatea rezultatelor relevante din punct de vedere clinic ~i epidemiologic. Metodele moIeculare pot fi utilizate pentru: - identificarea tulpinilor de stafilococi - detectarea rapida a stafilococilor in prelevat (in relatie mai ales cu contralul infeqiei nosocomiale cu SARM ~i/sau controlul TIA stafilococice) - detectarea rapid a as. aareas ~i SCN, in combinatie cu identificarea geneJor de rezistenta la antibiotice (mecA cu sau tara alte gene de rezistenta) - detectarea genelor care codifica pentru factori de patogenitate (enterotoxine, leucocidina etc.) - tiparea tulpinilor de stafilococi in scop epidemiologic Exista numeroase studii care descriu utilizarea reactiei de polimerizare in lant (PCR) pentru identificarea ~icaracterizarea tulpinilor de S. aLllnts. Pentru cre~terea sensibiJitiitii, majoritatea metodelor utilizeaza amplificarea regiunilor conservate ale genelor ARNr bacterian ~i necesita etape suplimentare, ca de exemplu hibridizarea cu sonde speciespecifice. Alte protocoale vizeaza detectarea S. aareus prin amplificarea genelor intiHnite numai la aceasta specie (gena nac, pentru endonucIeaza tennostabila, gena coa, pentru coagulaza, un fragment nedefinit de 442 perechi de baze al cromozomului S. aureus. gena clfA, pentru proteina de legare a fibrinogenului etc.). Datorita importantei detectarii rezistentei la meticilina (oxacilina), unele dintre metodele utilizate se concentreaza direct pe amplificarea genei mec A, fie singura. fie in PCR multiplex, cu amplificarea simultana a unor markeri aditionali. CLSI (Institutul pentru Standarde de Laborator Clime, fostulNCCLS) a elaborat ~i difuzat procedura Real-Time PCR IDI-MRSA, test validat de Food and Drug 581

pentru contt'olul infeqiilor nosocol11iale. Acest test poate decela prezenta SAMR direct in prelevatul biologic in 4 ore, detectand 0 secventa l1101ecularaunica, cu dubla specificitate. 0 jum3.tate a acestei secvente provine din cromozomul S. al/rel/S, iar cealalta este parte integranta a casetei SCCmec, elementul genetic mobil care mediaza rezistenta la meticilina. Econol11iile care se realizeaza prin utilizarea acestui test se ridica la sute de mii de dolari anual, la nivelul unui singur spital, prin reducerea periodei de spitahzare. in Europa, au fost propuse variante de metode multiplex PCR pentru identificarea rapida a SAMR si/sau diferentierea tulpinilor de S. aurel/s ~i SCN, ori evidentierea unoI' markeri de rezistenta $i patogenitate. In Belgia a fost utilizata 0 metoda tintind gena //lec A $i genafem A, pentru identificare $i diferentiere a tulpinilor, in anul1995 (Yanuffel ~i al). In 1998 aceea$i echipa belgianii aplicii metoda mentionatii pentru identificarea rapida a SAlvlR in aspiratele endotraheale, la pacientii ventila!i. In anu1200 1, in Spania 0 metoda multiplex tintind gena mec A,fem B, ile S-2 (pentru rezistenta de nivel inalt la mupiroein) a fost aplicatii pentru identificare $i deteetarea rezistentei. 0 metoda pentru deteetarea prezentei detenninanti10r enterotoxinelor stafiloeoeiee a fost pusa la punet in anul 2000 de Naresh K. Shrama et a1. (Anglia). In 2001, un grup din Califomia propune utilizarea microchip-urilor pentru detectarea simultana a prezentei $i rezistentei la antibiotice a stafilococilor, direct din produs, iar 0 echipa din Gem1ania ap1ica in 2003 0 metoda similara pentru detectarea simultana a prezentei stafilococi10r, diferentierea speciilor ~i a mai multoI' determinanti de rezistenta la antibiotice $i/sau virulenta. o aWl categorie de metode au fost dezvoltate pentru diferentierea tulpinilor de S. aureus in scop epidemiologic. Aceste metode fae posibila diferentierea tulpinilor circulante Intr-o unitate de ingrijire, dar of era $iposibilitatea diferentierii tulpinilor epidemice de cele neepidemice, pre cum ~i a celor de provenienta spitaliceasca de cele comunitare. A fost abordata Intr-o prima ctapa compararea pattern-urilor de restrictie endonucleazidi ale ADN cromozomal sau plasmidic. Tehnicile de generatia a doua au inclus hibridizarea pe sup01i solid utilizand sonde specifice, ribotipia, polimerizarea in lan1 (PCR-RFLP) ~i PFGE (electroforeza in camp pulsator). Pentru eliminarea elementelor subiective In interpretarea rezultatelor au fost utilizate tehnici de digitizare ~i stocare a imaginilor. Metodele de ultima generatie realizeaza analiza mutatiilor situs-speeifice ale secventelor ADN (single sau multilocI/S), iar rezultatele sunt utilizabile pentru intercompararea tulpinilor de S. aureus. Programul satelit al Sistemului European de Supraveghere a Rezistentei la Antibiotice (EARSS), SeqEU-Net, in care participa $i Laboratorele de Referin!a din Romania, abordeaza armonizarea metodologiei de tipare a S. aurel/s prin secventierea genei spa (pentru proteina A).

Administration,

BIBLIOGRAFIE BAIRD-PARKER. A.C.: The Staphylococci: In Introduction. J.Appl. Bacteriol. Symposium Supplement. pp. j 5-85, 1990. BILBIE. V: Bacteriologia pielii, 1990, Medicina Moderna 3:629. CODIT A. 1.: Genu1 Staphylococclls, 1993, Bacteriol, Viruso/, Parazitol, Epidemiol. 38:5.

582

CODITA,

1., DOROBAT,

hemoculturi.

0.:

Testul termonucleazei

utilizat pentru identificare

rapida a S.aurcus in

1994, Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiol. 39:28.

CODIT A, 1., DOROBA T,

0..DUMITRESCU.

V: Staphylococcus

saprophyticus

izolat. din hemoculturi

provenite de la nou nasculi nom10ponderali cu artrite septice, 1995. Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiol. 40: 153. CODIT A, 1., GRIGORE, L. - Evaluarea unor teste rapide folosind reactivi aglutinanli pentruidentificarea S aureus - 2003. Bacteriol.. Virusol.. Parazitol .. Epidemiol .. 48. 209-213. COMAN, G., DIACONU, G., CRACIUN, E. et al: Consideralii preliminare privihdinvestigalia microbiologica semicantitativa legata de infeqia de cateter. 1994. Bacterial. Virusol. Pa/'{/zitol. Epidemiol. 39:197. DAMIAN, M., CODITA, 1., DUM1TRESCU, V: Phagetyping, Antibiotic Susceptibilitty and Plasmid Fingerprint used for Characterization of S. aureus Strains Insolated in a Burns Unit. 1994. RO/ll. Arch. Microbiol. Immunol. 53:89. FLUIT, AD. C. (EDT)/SCHMITZ, pectives - Publisher:

FRANZ-JOSEF

(EDT)/SCHMITZ,

E 1. (EDT): MRSA : Current pers-

Caister Academic Pro Published 2003111.

GRIGORE, L., CODITA. 1., DUMITRESCU, V: Rezistenta la antibiotice a unor tulpini de S.aurcus iiolate din unitati ell rise nosocomial ridicat ~i din ambulatorii in anu11995, 1997. Bacteriol. Vi1'llsol.Purazitol. Epidemiol. 42:51. KONEMAN, E., W. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology -5-th ed ..Lippincott - Philadelpia. New York, 1997. MASON. w.. J .. BLEVINS, J. S., BEENKEN. K., et al.: Multiplex PCR Protocol for the Diagnosis Staphylococcal Infection - 2001, J.elin. Microbiol., 39. 9. 3332-3338. MONECKE,

of

S., LEUBE. 1.. EHRICHT. R. - Simple and Robust Array-Based Methods for the Parallel

Detection of Resistance Genes of Staphylococcl/s al/rel/s - 2003, Genome Letters, 2,106-118. PEREZ-ROTH.

E, CLAVERIE-MARTIN,

E. VILLAR,

J .. et al.: Multiplex

Identification of Staphylococcl/s aurel/s and Detection of Methicillin 2001. J. Clin. Microbiol. 39, 11,4037-4041. OPREA, M .• CODIT A, 1. - Metode de tipizare moleculara a Staphylococcus 2006, Bacteriol., Virusol., Parazitol., Epidemiol., 51. 1-2, 45-51. SHOPSIN, S .. KREISWIRTH.

B .• N.: Molecular Epidemiology

aurel/s. 2001. Emerging In! Dis., 7, 323-326. WESTIN, L., MILLER, c., VOLLMER, D. et al.: Antimicrobial Utilizing a Microelectronic

PCR for Simultaneous

and Mupirocin Resistance ~ aureus meticilino-rezistenl

of Methicillin-Resistant

-

Staphylococcus

Resistance and Bacterial Identification

Chip Array - 2001. J. Clin. Microbiol., 39, 3, 1097-1104.

28.2. MICROCOCCUS

SI GENURILE iNRUDITE (DUMITRU BUIUC, CARMEN pANZARU)

eu ee1e patru genuri aeeeptate in anii 1980 (MicrococFamilia Micrococcaceae, CllS, StomatococclIS, Staphylococclis ~i PlallococclIs), a fost profund restrueturata. Studii1e ehemotaxonomice, hibridarea ADN-ARNr, cata10garea comparativa a oligonucleotidelor ARNr 165, propoI1ia G+C din struetura ADN au eonturat doua filumuri: (i) Familia Micrococcaceae restructurata din genul Micrococcus, fragmentat in genurile MicrocOCCllS, Dermacoccus, Kocllria, Kytococclls ~i Nesterellkonia, 1a care au fost alaturate genurile Rothia, format din R. dentocariosa ~i StomatococcliS 1Il1icilagillDslis 583

reclasificat ca R. mucilaginosa, $i Arthrobacter. Rothia dentocariosa ~i Arthrobacter spp. sunt bacili corineformi prezentati In capitolul 30.2. (ii) Staphylococcus $i Planococcus, mailnruditi cu gruparea Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus au fost incluse In familia Bacillaceae a ordinului Bacil1ales. Habitat ~iimplicatii in patologia infectioasa. Micrococii In sens larg sunt gazduiti pe Inveli$urile, mai frecvent tegumentul, omului $i animalelor de unde contamineaza larg ambientul (sol, apa, aer). Avirulenti penull gazda n0l1110reactiva,deten11inarar infeqii la gazda compromisa. KLOOS et ~l.(l974), pe un e$antion de 115 persoane investigate In mai multe zone ale U.S.A au stabilit um1atorul procentaj al portajului diferitelor specii de micrococi: Micrococcus luteus 90%, Kocuria varians 75%, M. lylae 33%, Dermacoccus nishinomiyaensis 28%, K.kristinae 25%, K. rosea 15% $i KytocoCClis sedelltarius 13%. Aceste specii sunt parte integranta a microbiotei rezidente a tegumentului pentru ca prezenta lor a fost constanta In sondaje repetate de-a lungul unui an. Speciile altor genuri sunt mult mai putin raspandite pe tegumentul uman $i animal, probabilln legatura cu exigentele lor nutritive. Rothia 1I111cilaginosaeste frecvent prezenta In microbiota orala. Micrococcus luteus a fost sellli1alatdrept cauza de meningite, supuratii intracraniene, $OCseptic ~i pneumonii abcedate la pacienti imunosupresati, iar lvI. l.vlae a fost izolat In hemoculturi ~idin piese biopsice inu"aoperatorii de la pacienti cu cardiopatii $i complicatii septice dupa chirurgie cardiaca. Kytococcus sedentarius a fost comunicat ca una din cauzele keratolizei cu godeuri. Rothia mucilaginosa cauzeaza endocardite, mai des la drogati pe cale intravenoasa, bacteriemii la pacienti imunocompromi$i ori peritonite recurente la pacientii cu dializa peritoneaHi continua ambulatorie. Caractere de cultivare. Pe mediile uzuale de izolare micrococii $i genurile Inrudite fom1eaza colonii "S", rotunde, convexe, cu margini regulate, variat pigmentate In raport ell specia. Coloniile de Kocuria varians ~i de Dermacoccus nishinomiyaensis pot fi similare cu ale bacililor corineformi, iar cele de R. IIll1cilaginosa sunt mucoide ~iaderente la mediu. Microscopic aceste bacterii sunt coci sferici, gram-pozitivi, u~or mai mari decat stafilococii, cu diametrullor de 0,8-1,8 )lm dispusi predominant in tetrade sau perechi. R. mucilaginosa formeazii gral11ezineregulate de coci capsula!i. Teste preliminare minimale prin care diferentiem micrococii de stafilococi ~i streptococi au fost prezentate In tabelul 28-3. in functie de posibilitatile laboratorului mai put em efectua suplimentar: • Testul Schle(fer-Kloos (producere de acid pe agar-nutritiv eu 1% gliceroL O,4/1g eritrol11icinaJmL ~i bromcrezolpurpur ca indicator), care este negativ pentru l11icrococi, pozitiv pentru stafilococi . • Testul de sensibilitate la bacitracinG (0,04 U/rondela): micrococii sunt sensibili, stafilococii rezisten!i. 584

Tubellli 28-11

Teste definitive pentru diferentierea micrococilor (adaptat dupa STACKERBRANT et a!.. 1995; HOLT et a1.1994)

--- ;. '" -++ -- '"- " -+ Roz, ~ NT porto-caliu-+ ~- d-galben --riu aCrem"...•...• '-' '" a- :::+ + + -+ " ~, 2 +~ +:..-:~ sent Por.;:: AlbuAbalbNT + Galben ~ :.0:' "~ ..8 >.~ palid " ~ ~E .~ ~ Galben ~~ dIiu Crem ~ .~ din: Esculinei Glucoza Oxidaza

~

. ...; '" :.-::

•... •... I::l s:: ~ .•... I::l \,,)

I::l ~..c:::ore

-

" -',..~

+-:::

\..)

tocaliu +

-'" '" + alb

~.g c;::

~

:::

'"

~

Agaranorganic cu azot I

aSimboluri: + = 2:90% tulpini pozitive; d = 11-89% tulpini pozitive; - = 2:90% tulpini negative; NT=netestat.

• Tested de sensibilitate stafilococii sensibili.

la lizostafin (200 flg/mL): micrococii sunt rezistenti,

Testele definitive de identificare Sisteme

comerciale

sunt rezumate in tabelul 28-9.

de identificare.

API STAPH-IDENT

(bioMerieux)

are

capacitatea de a identifica specii de Micrococcus. Dar R. mucilaginosa necesita teste de confinnare. Testul sensibilita!ii la lizostafin pentru diferen!ierea de Staphylococcus, testul catalazei ~icultivarea in bulion hipersalin pentru diferen!ierea de K. kristinae. API STAPH 585

(API Staph- Trac; bioMerieLL,()este un sistem de identificare la 18-24 de ore a stafilococilor. micrococilor, inclusiv R. lllucilaginosa. Nu exista pana la aceasta data studii de evaluare a acuratetei acestor doua sisteme. API ID32STAPH. ID32Staph (bioMerieux) are incluse in baza de date urmatoarele genuri $i specii: Staphylococcus, Aerococcus, Dermacoccus nishinoll1iyaensis, Micrococcus luteus, M. lylae, K. kristinae, K. rosea, K. varians $i R. mucilaginosa. Brun et al au evaluat identificarea prin acest sistel11 a 792 tulpini in 8 laboratoare din diferite tari, $i au eOl11unieatrezultate eoreete pentru 95,5% dintre tulpinile examinate. Crystal GP identification System (BD Bioseiences). Este un sistel11de identifieare a baeteriilor gram-pozitive miniaturizat, bazat pe 29 de teste fluorogene, eromogene ~i teste eonventionale modificate. Are incluse in baza de date $i mieroeoeii, inc1usiv R. lllucilaginosa pentru care von Baum et al eomunica 100% identifieare eoreeta. Sensibilitatea la antibiotice. Micrococii sunt sensibili la multe categorii de antibiotice: penicilina, vancomieina, eritromieina, streptomicina, kanamieina, neomieina. tetracielina ~i cloramfenicol. Kytococcus sedentarius este rezistent la metieilina ~i penieilina (KLOOS et al,1974). R. mucilaginosa este sensibila la majoritatea antibioticelor: penieilina G, ampieilina, amoxieilina, earbenicilina, eefalexina, cefazolina, eefalotin, eefamandol, eritromieina, tetraciclina, doxieiclina. Rezistenta la clindamicina $i inalt rezistenta la lincomieina.

BIBLIOGRAFIE GOODFELOW, M. 1998: The Actynomicetes: Micrococcus and Related genera. In A. Balows. B.!. Duerden (eds). Topley and Wilson's Microbilogy Infectious. 9th. vol. 2, Arnold, London, pp 491-506. KLOOS. W.E., TORNABENE, G., SCHLEIFER, KH.: Isolation and characteriyation of micrococci from human skin. two new species: Micrococcus l,vlae and Micrococcus kristinae. 1m. 1. Sisto Bacterial. PEACOCK,SJ.2005: Staphylococcus. In Borello.S.P .. Murray.P.R., Funke,G.(eds). Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, 101h• vol. 2, Hodder Arnold. London, pp. 771-772.' BRUN, Y, J.M. BOEUFGRAS (1990): International collaborative evaluation of the ATB 32Staph gallery for identification of Staphylococcus species. Zentralbl Bakteriol. 273:319-326. Von BAUM, H, F.R. KLEMME, H.R. GEISS (1998): Comparative evaluation of a commercial system for identification of gram-positive cocci. EU/:J.Clin.Microbiol.Inject.Dis.17:849-852.

28.3. IDENTIFICAREA STREPTOCOCILOR (VASILICA UNGUREANU)

28.3.1. Minidefinitie Streptocoeii sunt coei sferici sau ovali, gram-pozitivi, a~ezati in lanturi sub pereehi, imobili $i nesporulati. Pretentio$i nutritiv, faeultativ anaerobi. unii earboxifilL 586

se dezvolta mai bine la tensiuni reduse ale oxigenului, chiar anaerob. Sunt catalazo- ~i oxidazonegativi ~i nu reduc nitratii. Fermenteaza glucoza cu producere de acid lactic ~i 1ntotdeauna rura gaz.

28.3.2. Consideratii taxonomice Familia Streptococcaceae, initial conturata numai pe baza caracterelor fenotipice, a suferit numeroase ~i repetate remanieri pe baza criteriilor de taxonomie moleculara (hibridarea acizilor nucleici, analiza secventelor ARNr 16S, procentajul continutului G+C al ADN, compozitia 1nlipide, analiza electroforetica a diverse lor enzime, utilizarea anticorpilor monoclonali). Astfel din clasicul gen Streptococcus au fost separate genurile: Enterococcus (streptococii enterici - vezi 28.4.), Lactococcus (streptococii din produsele lactate), Vagococcus (streptococii mobili), A biotrophia (streptococii simbiotici dependenti de gruparile thiol, vitamina B6 sau piridoxal). Coci din alte genuri dovedesc inrudiri cu streptococii: Aerococcus, Gel71ella,Globicatella, Helcococus, Leuconostoc. Pediococcus (vezi 28.5.). in cadrul genului Streptococcus analiza comparativa a secventelor ARNr l6S coroborata cu rezultatele hibridarii acizilor nucleici ~i analizei taxonomice numerice au aprofundat relatiile filogenetice intragen ~i au conturat 6 grupari de specii, fiecare cu anumite corelatii patogenice ~i ecologice. Numai un numar redus de specii au ramas in afara acestor grupari filogenetice (tabel 28-10). Practica identificarii curente a streptococilor mai impune considerarea a doua criterii de clasificare: aspectul hemolizei determinate pe agar-sfmge ~i grupele antigenice Lancefield. Clasiflcarea streptococilor dupa aspectul hemolizei este importanta pentru ca ii introduce 1n algoritmul identificarii: • Streptococii ~-hemolitici au coloniile 1nconjurate cu 0 zona clara de hemoliza completa cu diametru variabil in raport cu grupul antigenic. • Streptococii cx-hemolitici fonneaza colonii 1nconjurate cu 0 zona de inverzire a mediului in care hematiile sunt numai part,iallizate. • Streptococii cxprim (cx!)- hemolitici produc 1njurul coloniilor 0 zona de ~-hemoliza, incompleta, bordata cu 0 zona ingusta de ~-hemoliza . • Streptococii nehemolitici = y-hemolitici. Clasijlcarea antigenidi Lancefield este bazata pe antigenul specific de grup: poliozidul C din peretele celular la to ate grupele, cu exceptia grupului D la care este constituit din acidul glicerol-teichoic. Antigenic streptococii se 1mpm1in: • Streptococi grupabili, grupele A-W (cu exceptia literelor I ~i J). • Streptococi negrupabili, lipsiti de antigenul de grup. De~i grupele antigenice nu corespund in totalitate speciilor de streptococi, aceasta clasificare raspunde satisrucator necesitatilor de identificare a principalilor streptococi cu interes medical. Coroborarea celor trei criterii de clasificare: dupa aspectul hemolizei, antigenic ~i fllogenetic (tabelul 28-12) pennite 0 viziune comprehensiva asupra streptococilor. 587

G C,LC

Ul 00 00

Tabelu128-12 Specii de streptococii cu impHcatii in patologia umana: criterii de c1asificare, habitat

~isemnificatii cHnice

Grup Lancefield"

Specie

Hemoliza"

Habitat

Semnificatii clinice

A

S.pyogelles

p

Om

- Frecven(a portajului nasofaringian : ]0-30%. - Cauza cea mai com una a faringitei acute (15 -30% din cazuri la copii ~i 5 - 10% din cazuri la adulti). - Cauza a numeroase infectii poten(ial grave: infectii respiratorii (faringite, angine), tegumentare (impetigo, erizipel), ale (esuturilor moi (celulite, fasciite necrozante), febra puerperala. - Tulpini eritrotoxigene determina scarlatina sau sindrom de ~oe toxic. - Complica(ii supurative datorate propagarii infec(iei prin continuitate, pe cale limfatica sau hematogena. - Complica(ii nonsupurative: febra reumatica (niciodata dupa infec(ii cutanate) cu sau tara cardita,

B

S. agalaetiae

Var. animale, om p f\ Val' . animale. Olll Subsp. Subsp. dysgalacliac S. ("({lIis S.Omequi Subsp. equi PatTi, bovine Cai, Ipmagari ex (P, NIl) I I II S. dysgalacliae I

ph, CAMP+

Bovine, om

glomerulonefrita acuta, coree, eritem nodos. - Portaj vaginal, faringian sau intestinal posibil. - Importanta cauza de infee(ii neonatale : pneumonii, meningite. - Infectii post-partum - Infectii la adul(i imunodeficien(i (cu diabet, cancer, SIDA etc.): ale tegumentelor, ale (esuturilor moi, osteomielite ete. - Variate infee(ii similare eelar determinate de S. pyogclles: angine ~i infeetii grave ale pielii ~i tesulurilor moi, pneumonii. bacleriemii. meningite, endocardile. artrite septice. - Ncfrite - selllnalate dupa infec(ii cu S. zoocpidClI/iells.

Tabelul28-/2 (continuare) d S.am iniac S.S.ale cristatus oralis pacienlii sub antieanceroasa pot endocardita pa({lsanguinis S.Porci, pncumoniac -- Speeii am am ex(P,valvular am Porci florei 70%. mitis viridans. Hemoliza" intcstinale comensale S.S.constellatus imermcdius endoeardului sau tulburari ale dinamicii Habitat S.mutans suis bovine orale, ratoare subaeutc pacicntii eudar leziuni GrupLaSpecii Lancefield" S.calea sanguinis portajului Dupa S.chimioterapie leziuni anginosusex, ale Illucoasci bucale frccvcnt Grupul bacteriemii NH urmari gazda normala, gencale- Frecventa cavitatii Prineipalcle p,infectiilor. Asociat p,Rar PS.dc CAMP+,PYR+ (NH, ex,PYR+ spccii ex) cuexex(NH) cclulita, ex) bactcricl11ie, inaleclinice formarea orofaringelui. placii dentare ~i men in- eomensalc genitale. Traul11atisl11e alelameningita l11ucoaselor potorale, deschide --Rar Specii comensale ale tlorci orale ~ieariogenczii. Specii arbitrar reunite In grupulorale mare. al orofaringian streptococilor estimata intre 30% ~i Semnificatii' pottara determina ladeterminii lueratori din abatoare. Implieati incndocardite infectii purulente ciiilor pimplicate Delfini este izolat deporcinus apa din infeetii urnane inla~ieavitatii sfera genitala. ex,dulcc Specie S. ~ialc gordollii --deterl1lina --La Ocazional determina endocardite subacute. leaza pcste proaspat). bactcricl1lii ~iscpticcl1lii. copii, implicat in etiologia peritonitelor primare. faringite. Rar implicali in I1lcningitc ~ipneul1lonii. tului Determina S.respiratorii puseelor anginosus de(eei frecvent acutizare grup ~iearcetiologic genito-urinar, Lancefield otite bron~itelor medii, Csinuzite, peritoneale, - nervos poate cronice. meningite. filohare cauza teguunor mentelor, -sangvine Principal tesuturilor agent moia sistcmului ~iosului. al leziuni pneumoniei acute gita ladigestiv omcardiace. prczinta cutanate ~ialemanipusuperioare, central, trae-~i

\.J1

00

..0

VI

\0

o Tabelul 28-12 (continuare) S.biotip 11I2) (S. bovis S.gallolyticus vestibularis elega/1.\· defective a((jacem Om S.Stlorei -endocarditc cauza endocardite subacute, in- ~iale cucavitii\ii anil1lale bovis S. alte salivarius alaexCJ,l1lai Necunoseute adenocareinomul -Bovine,ovine, Asociati euGiizduit euNH(a) boala --Hemoliza" ocazional ineronieii colon. Bovine, caini, aom. Habitat . elutetel/sis. gallolyticus S.alte dccat illj(l/Itarius Grup Lancefield"S.A.A.S.equil/us (a)Pot intcstinala, incvcnt special pasiiri,~irespirator animale gelui. - SpeciiS.cercbrale, cOl1lensale orofarinporci, cfiini, rior, intestinal ~iorci, alNH vaginului. Sel1lnificatii clinicc ale eolonului (cancer, paradiverliculila). -Cai, Specii comcnsale ale traetului supc-cu- abcese fi'colonului intiilni\i Implicat ina,NH subacute lapasteurial/us, pacienti leziuni Accidental patogene, implicatiibucalcchnicc~i alesimilare Specie

D-

i1(fcl/Itarius(S.(s.bovis S. pasteurial/us bovis

--

fce\ii ale pliigilor,viridans infcc(ii(veziurinare. streptococilor mai sus).

ei, om

a

Grupul Lancctielcl : - reac(ie negativii. Ilcmoliza : f) -. fizii completii: a - inverzirc; Nil - nchcll101itic, ( ) - reac(ii rare.

h Tulpinile ull1ane produc 0 B -hcmolizil inclisJinctii (de fapt cx'hemolizii), tolu~i aceste tulpini intnl in algorilmul idenliticiirii ca slreptoeoci B-hcmolitici. 0,5 mm diametru) apartin grupelor A, C ~i G (fig. 28.12 - vezi plan~a color). Coloniile, In general transparente, pot fi: - mucoide, cu suprafata lucioasa, plate, filante, tendinta la confluare (matt); - netede, lucioase rotunde, acuminate, cu l11arginiregulate (glossy); - rugoase, turtite, uscate, cu margini dintate (rough). Tulpinile care nu pro due streptolizina S formeaza colonii cx-hemolitice In aerobioza ~i ~-hemolitice In anaerobioza sau la presiune scazuta a oxigenului. • Streptococii ~-hemolitici cu colonii mici, punctifonne, apartin tulpinilor unar specii din "grupul anginosus", mai ales speciilor S.anginoslls ~i S.col1slellatlls. • Streptococii grup B forl11eaza colonii alb-cenu~ii, mai putin acuminate, uneori l11aimari, l11aiu~or de el11ulsionat deeM ale streptococilor grup A, cu zona Ingusti\ de cx'-hemoliza (,,~-indistincta"). Pana la 3% din tulpinile izolate de la om sun: chiar nehemolitice. Unele tulpini incubate anaerob sau cultivate pe agar columbia fonDeaza colonii pigmentate in ro~u-caramiziu. • Streptococii grup D formeaza colonii alb-cenu~ii cu diametrul de cca I 111111. transparente, care se opacifiaza in cultura batrana, nehe1110litice sau cx-he111oIitice, • Streptococii viridans fonneaza colonii 111ici(0,1-0,5 111mdia111etru),bombate. cenu~ii, uzual cx-hemolitice, ocazional nehe11101itice. 592

Fig. 28.1 - Staphylococcus aureus: frotiu din cultura pe agar-sange; co1oratie Gram (900X).

Fig. 28.3 - Staphylococcus aureus: cultura pe agarsange dupa 24 ore de incubare la 37°C (hemoliza negativ, pigment pozitiv).

Fig. 28.4 .- Staphylococcus aureus: cultura pe agarsange dupa 24 are de incubare la 37°C (cx-hemolizina pozitiv, ~-hemolizina pozitiv, pigment pozitiv).

Fig. 28.5 - Staphylococcus epidermidis s.s.: cultura pe agar-sange dupa 24 ore de incubare la 37°C (colonii mai mici, hemoliza ~i pigment negative).

Fig. 28.6 - Cultura de S. aureus, maita pozitiv (stanGa) ~i S. epidermidis S.S., manita negativ (dreapta), pe mediul hiperclorurat solid cu manitol ~iro~u fenol dupa 24 ore la 37°C.

Fig. 28.7 - Testul cata1azei (stanga pozi:;v, dreapta negativ).

Fig. 28.8 - Testul coagulazei lib ere, testul In tub (stanga pozitiv, dreapta negativ).

Fig. 28.9 - Testul pe lama pentm protein a A, clumping factor (coagulaza legata) ~i polizaharid capsular (reactiv Sanofi Staph Plus): dreapta pozitiv (s. aureus), stanga negativ (s. epidermidis s.s.).

Fig. 28.10 - Testul termonucleazei: pozitiv (godeiurile de la ora 4 ~i 6), negativ (restul godeiurilor).

Fig. 28.11 - Lizotipie la S. aureus; liza confluenta, CL (stanga), semiconfluenta, SCL (mijloc), ++ (dreapta).

Fig. 28.12 - Streptococ ~-hemolitic: sange

Fig. 28.13 - Streptococcus pyogenes: morfologia pe frotiul din cultura de 24 ore In bulion glucozat (900X).

cultura pe agar-

:=':g.

28.14 - Streptoeoei f3-hemolitiei: testulla baeitraeina pozitiv (sus) ~i negativ (jos).

Fig. 28.16-

Testulla optoehin: pozitiv (sus) ~inegativ (jos).

Fig. 28.15 - Testul CAMP efeetuat eu rondele din hartie de filtru impregnate eu f3-lizina stafiloeoeiea: stanga S. agalactiae (test pozitiv), dreapta streptoeoe grup D (test negativ).

Fig. 28.17 - Streptococcus pneumoniae eu eolonii mueoide: testarea sensibilitatii la optoehin eu rondelii de 6 mm (sus) ~i de 10 mm (jos).

• Coloniile pneumoeoeilor, gri-opaee, au eea I mm diametru, sunt cx-hemoli tiee asemanatoare, cand sunt tinere, eu ale streptoeoeilor viridans. Dupa incubare in atmosfera cu 5% COo zona de cx-hemoliza este mai larga. Progresiv, uneori in cateva ore, eoloniile pneumococilor devin craterifol111e datorita autolizei enzi111atice. Coloniile tulpinilor care formeaza mai mult polizaharid capsular sunt mai mari, fiind mai virulente formeaza colonii transparente mucoide, la care autoliza este mai rapida ~i freevent completa incat pe suprafata mediului ramane numai urma coloniilor . • La S.suis, ca ~i la unii enterocoei (vezi 28.4.), pe agar eu sange de cal co loniile sunt l3-hernolitice, in timp ee pe agar cu sange de berbec sunt cx-sau nehemolitice. • Streptococii deficienti nutritiv, genul Abiolrophia, eultiva numai pe agar-sange suplimentat cu 10 flg/ml piridoxal hidroeloric ~i 100 flg/ml cisteina. Pe agar-sfmge uzual ere~terea este satelita striului de Staphylococcus aureus.

28.3.7. Caracterele microscopice Streptococii sunt bacterii gram-pozitive. In prelevatele din leziuni active, in.tinse ~i profunde, streptococii piogeni apar sub fOTI11a de coci sferici izolati sau in perechi, in timp ee in puroi forn1eaza lanturi cu diferite lungimi. Pe frotiuri din prelevate patologice S. pneullloniae prezinta aspectul tipic de eoci in perechi, ovali sau laneeolati, cu diametrele lungi in prelungire, capsulati (fig. ] 3.7). In mediile de eultura lichide, streptoeocii care eresc cu depozit, rura tulburarea mediului (grupurile A, C, G) f0l111eaZalanturi lungi (fig. 28.13 - vezi plan$a color), iar eei care tulbura omogen mediul apar in principal ca diplocoei (S. pneul1loniae) sau lanturi scurte (grupurile B, D). In culturi vechi streptococii devin gram-variabili. Pneumococii, chiar in lichidul cefalorahidian, Ul111areautolizei, apar ocazional gram-variabili. Streptococii cultivati in medii deficitare ~i, in mod uzual, speciile de Abiotrophia sunt pleomorfi cu lanturi care includ coci gram-variabili, forme cocobaeilare, bacilare sau globulare. In eultura prelungita pe suprafata mediilor agarizate pot aparea variante filamentoase de S. p.vogenes ~i S. pneumoniae cu aspect de lanturi fomie lungi.

28.3.8. Identificarea preliminara 28.3.8.1. Identificarea genului. Odata ce izolatul a fost earaeterizat preliminar "coc gram-pozitiv cu tendinta de a fOTI11a lanturi ~icatalazo-negativ" trebuie supus testelor fiziologice ~i serologice de identificare. lntroducerea streptococilor In algoritmul de identifieare 0 faeem pe baza aspeetului hemolizei: streptoeoei l3-hemolitici versus streptoeoci non-l3-hemolitici. Dar non-l3-hemolitici sunt ~i enterocorii ~i toate genurile Inrudite lor. Praetie, tulpinile l3-hemolitice pot fi testate direct ea streptocoei. dar tulpinile non-l3-hemoliliee trebuie supuse identificarii de gen conform testelor precizate in tabelul 28-11 (vezi amanuntele tehniee in CapitoluI40): • Testul sensibilitiirii la vancomicinii (Va) diferentiaza genurile Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Aerococcus ~i Gemella care sunt sensibile la Va, de genurile Leuconostoc ~i Pediococcus, care sunt rezistente. 593

T(/beluI28-]_~

Identificarea

de gen a cocilor gram-pozitivi catalazo-negativi9 Cre~tere la -0

)~

"0

-

0..

cr.

~il .- ~ )CI:I

>l:!j

Genul

Microscopia

Relatia Cll oxigenul

HemoJiza

IOVC

45-"c.~ .5 8

8

)CQ:

,.so 3c::() ~ •

? \0 ~ ~ 0 > Z C5

Facultativ c. cb, I, p Facultativ FacuItativ c, I, P Abiotrophia Lactococcus Facultativ ct>. 1. P Facultativ c, I, P Vagococcus Globicatella Facultativ cb, 1,...£ Leuconostoc Facultativ as -+Vg0;0 •... -+...c-::l., .c v + + -r:::0••a c::: :E +>as is:: .E C -« -«

E.avil/ln E.durans E.sl/lfl/reus E./aeca/is E.casse/iflavus

'c

•... (OJ '"

:E :E ::: ~~

-

-~+as

a. sau a_= exceptii posibile cuprind mai putin de 3% din tulpini.

602

• Fermentarea zaharurilOl: Pe baza producerii de acid din manitol, sorbitol ~i sorboza speciile de Enterococcus au fost impartite in 5 grupe. Fermentarea arabinozei, rafinozei ~i zaharozei este utila pentru diferentierea speciilor din cadrul aceleia~i grupe. • Hidroliza argininei: vezi identificarea streptococilor viridans. • Testul tolerantei la te/urit este pozitiv pentru E. faecalis, care reduce teluritul de potasiu la telur metalic ~i detem1ina culoarea neagra a coloniilor. • Testul mobilitatii. Tulpinile mobile, insamantate prin intepare, detem1ina opacifierea coloanei de geloza moale; cele imobile cresc numai pe traiectul de insaman tare ~i lasa restul mediului claro • Pigmentatia indicata de culoarea galbena a culturii, observata pe un tampon cu care ~tergem cultura de 24 ore la 35°-37°C pe suprafata unei placi cu agar-tripticaza soia ~i 5% sange de oaie. Testulnegativ este reprezentat de culoarea alba, crem sau gn. • Utilizarea piruvatului din mediul de cultura de catre microorganisl11ul testat 0 observam Plin virajul culorii indicatorului de pH in dOl11eniulacid. Pe baza fennentarii l11anitolului,sorbitolului, sorbozei ~ihidrolizei argininei, speciile de Enterococcus au fost separate in 5 grupe (tabeluI28-18): Grupa I (5 specii): fem1enteaza toate cele 3 zaharuri, dar nu hidrolizeaza arginina. Aceste specii sunt identificate pe baza fennentarii arabinozei, rafinozei ~i utilizarii piruvatului. Grupa II (5 specii): fennenteaza nUl11aimanitolul ~ihidrolizeaza arginina. Speciile din acest grup sunt diferentiate pe baza tolerarii teluritului, a mobilitatii ~i a prezentei pigmentului. Grupa III (5 specii): hidrolizeaza arginina, dar nu fennenteaza l11anitolul, sorbitolul ~isorboza. Identificarea speciilor din acest grup 0 facel11prin fem1entarea arabinozei, rafinozei ~i zaharozei ~i prin utilizarea piruvatului. Grupa IV (2 specii): nu hidrolizeaza arginina, nu fem1enteaza l11anitolul ~i sorboza. Diferen!ierea 0 face fem1entarea sorbitolului ~i prezenta pigmentului. Grupa V contine tulpini variate ale E. casseliflavus, E. gallinarum ~i E. faecalis care nu hidrolizeaza arginina, dar celelalte caractere fenotipice sunt acelea~i cu ale tulpinilor tip care hidrolizeaza arginina. 28.4.8.2. Identificarea unor markeri epidemiologici. Dat fiind ca enterococii reprezinta 0 cauza importanta de morbiditate ~i sunt totodata, in proportie crescuta, multirezistenti la antibiotice, tiparea ~i subtiparea tulpinilor de enterococi este tot mai importanta in controlul infeqiilor detenninate ~i in supravegherea epidemiologica. • Metodele clasice de tipare sunt: bacteriocinotipia, lizotipia, stabilirea unoI' profile prin reactii biochimice sau prin testarea sensibilitatii la antibiotice, caracterizarea serologica. Dar aceste metode sunt, in general, mari con~Ul11atoarede timp, scumpe, prezinta un grad de subiectivitate ~i deseori e~ueaza in diferen!ierea tulpinilor. • Metodele l110leculare sunt de un ajutor substantial in tiparea tuturor tulpinilor de enterococi : - detel111inareaprofilului plasmidic ~ianaliza enzimei de restric!ie a ADN genomic ajuta in unele cazuri, insa interpretarea profilelor electroforetice este fom1e dificila: 603

- analiza profilului de macrorestriqie a ADN cromozomal prin electroforeza il1 camp pulsat (PFGE) - metoda de tip are cea mai utila, folosita in studiul enterococilor - metode de tipare bazate pe PCR, utile in special pentru detectarea rapida ~i discriminarea genotipurilor de enterococi rezistenti la vancomicina (PCR - RFLP = restriction fragment length ];2olymorphism) 28.4.8.3. Rezistenta la antibiotice ~i vancomicina. • Enterococii prezinta 0 rezistenta intrinseca la concentratii joase de aminoglicozide • Rezistenta ca~tigata la peniciline, glicopeptide (vancomicina) ~i la concentratii inalte de aminoglicozide a crescut in ultima perioada la 0 varietate de specii de enterococi, existfmd riscul de a nu mai putea obtine efectul sinergic intre 0 penicilina sau un glicopeptid ~i un aminoglicozid ~i de avea reale dificultati in tratamentul unei infeqii detenninata de 0 astfel de tulpina. • Majoritatea tulpinilor sunt sensibile la vancomicinii (VA). Studii realizate in SUA au evidentiat aparitia enterococilor rezistenti la VA, considerat un fenomen specific de spital (prin utilizarea VA pe scara larga), care poate pune probleme serioase de tratament. Tulpinile rezistente la VA au apartinut, aproape toate, speciei E. faeciulIl. in Europa nu exista acela~i fenomen; sunt posibile douii situatii de obtinere a rezistentei ]a VA: ) fie eolonizarea intestinului uman eu tulpini de origine animalii rezistente la VA (seleetate prin tratamentul animalelor cu avoparcin - un glieopeptid care seleeteaza ineruci~at rezistenta la VA); 2) fie transferul genelor de rezistenta la VA de la enterococii de origine animalii la enteroeoeii giizduiti de om. • Fenomenul de polirezistentii (eel mai des intalnit la E.faecilllll), preeum ~inatura imprevizibiHi a susceptibilitatii enteroeocilor la agentii antibacterieni impune testarea sensibilitatii la antibiotiee la toate tulpinile izolate din infeetii umane, alegerea antibiotieelor pentru testare depinzand de localizarea infeetiei.

BIBLIOGRAFIE BARBIER, N., SAUINIER, P. et al.: Random ampified polymorphic DNA typing versus pulsed-tield gcl electrophoresis for epidemiologic typing of vancomycin-resistant enterococci. 1. Clin. Microbiol.34: 1096- I 099, 1996. BARNHAM, M., THORNTON, T.J .., LANGE, K. : Nephritis caused by StretococcliS zooepidemi- CliS (Lancefield group C), Lancet, 1:945, 1983. BOSLEY, G.S., FACKLAM, R.R., ROSSMAN, D. : Rapid identification of Enterococcus,J. Clin. Microbiol. 18: 1275, 1983. CLARK, N.C., COOKSEY, R.C. et al.: Characterization of glycopeptide-resistant enterococci from US hospitals. Antimicrob. Agents Chemothet: 37:2311-2317, 1993. DALY l.A., CLIFTON, N.L. et al. : Use of rapid, nonradioactive DNA probe in culture confil111a-tion tests to detect Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae and Enterococcus spp. from pedriatic patients with significant infections, 1. Clin. Microbiol. 29:80, 1991. DAVIS, T.E., FULLER, D.D. : Direct identification of bacterial isolated in blood cultures by using a DNA probe, 1. Clin. Microbiol. 29:2192, 1991.

604

DENYS, G.A., CAREY, R.B.: Identification of Streptococcus pneul1loniae with DNA probe, 1. Clin. Microbiol. 30:31, 1992. DUCA. E., TEODOROVOCI, Get al.: A new nephritogenic streptococcus, 1.Hyg. Camb. 67:691, 1969. FACKLAM. R.R., PADULA, IF., WORTHAM, E.C. et al.: Presumtive identification of group A. Band D streptococci on agar plate media, 1. Clin. Microbiol. , 9: 665, 1979. FACKLAM, R.R., WASHINGTON, 1.A.: Streptococcus and related catalase-negative Gram-positive cocci. 5-th In A. Balows, W.l. Hausler, K.L.Hertmann et al. (eds), Manual of Clinical Microbiology, edn., American Society for Microbiology, Washington, DC, pp. 238-257, 1991. FACKLAM, R.R., TEIXEIRA, L.M. : Enterococcus. In L. Collier, A. Balows, M. Sussman (eds) Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, 9-th edn. Amold. London, vol. 2, pp. 670682, 1998. FACKLAM, R.R., SAHM, D.F., TEIXEIRA, L.M. : Enterococcus, In P.R. Mun'ay, E.1. Baron. M.A. Pfaller et al. (eds), Manual of Clinical Microbiology 7-th edn, AMS Press, Washington DC, pp. 297-306, 1999. FACKLAM, R.R. : What happened to the Streptococci: Clin. Microbiol. Rev.15 : 613-630,2002.

Overview of taxonomic and nomenclature changes.

GRANATO, PA., PETOSA, M.T.: Evaluation of a rapid screening test for detecting of group B streptococci in pregnant women, 1. Clin. Microbiol.,28: 1536, 1991. GREEN, M., DASHEFSKY, B. et a1.: Comparison of two antigen assay for rapid intrapartum detection of vaginal group B streptococcal colonization, 1. Clin. Microbiol. 31 :78, 1993. HEITER, B.1., BOURBEANU, P.P.: Comparison ofGen-Probe group A streptococcus direct test with culture and a rapid streptococcal antigen detection assay for diagnosis of streptococcal pharyngitis, .J. Clin. Microbiol, 31: 2070, 1993. HOFFMAN, S.: Detection of group A streptococcal antigen from throat swabs with five diagnostic kits in general practice, Diagn. Microbiol.l1!fect.Dis .. 13:209,1990. KILIAN, M.: Streptococcus and Lactobacillus. In L. Collier, A. Balows, M. Sussman (eds) Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, 9-th edn, Amold, London, vol. 2, pp. 633-667. 1998. LECLERCQ, R., DUVAL, G., HORAUD, T.: Streptococcaceae: Clasification etpuovoirpathogene. In 1..1. Pociadlo, 1.L. Vide, B. Regnier et al. (eds), Infections dues aux streptoocoques non A, Arnette, Paris, 1986. MIHALCU, F.: Familia Streptococcaceae. In Y.BiilbIie, N. Pozsgi(ed), Bacteriologie medicalii, Ed. Medicalii. Bucure~ti, vol.2, pp. 44-86, 1985. ROUFF, K.L., WHILEY, R.A., BEIGHTON, D.: Streptococcus. In In P.R. Murray, E.1. Baron, M.A. Pfaller et al. (eds), Manual of Clinical Microbiology 7-th edn, AMS Press, Washington DC, pp. 283-296. 1999. SALYERS, A.A., WHITT, D.D.: Group A and group B streptococci and enterococci. In Bacterial pathogenesis. A molecular approach, 2-nd edn., ASM Press, Washington, DC, pp. 232-246. 2002. SCHLEIFER,K.H., KILPPER-BALZ, R.: Transfer of Streptococcusfaecalis and S..faaeciul11 to the genus Enterococcus nom. rev. as EnterococcusfaecaUs Bacteriol.. 34:31, 1984. SCHLEIFER,K.H.,

KILPPER-BALZ,

comb. novoand E.faecium

R.: Molecular and chemotaxonomic

comb. nov .. Int. 1. Syst.

approaches to the classification

of streptococci, enterococi and lactococi: A review. Syst. Appl. MiClvbiol. 10: I, 1987. TURNER, lC., HAYDEN, F.G., LOBO, M.C. et al.: Epidemiologic evidence for Lancefield group C betahemolytic streptococci as a cause of exudative pharyngitis in college students, 1. Clin. Microbiol. 35:1,1997. WETKOWSKI, M.A., PETERSON, M.E., DE LA MAZA, L.M.: Direct testing of blood cultures for detection of streptococcal antigen, 1. Clin. Microbiol. 16:86, 1982.

605

28.5. IDENTIFICAREA COCILOR GRAM-POZITIVI SI CATALAZO-NEGATIVI INRUDITI CU STREPTOCOCII SI ENTEROCOCII (DUMITRU BUIUC, CARMEN PANZARU) Genurile 1nrudite cu streptococii ~ienterococii, Lactococcus, Vagococcus. Gemella. Globicatella. Aerococcus, Helcococcus, Leuconostoc. Pediococcus. Tetragenococcus sunt larg raspfmdite 1nnatura ~ipot fi ocazional izolate din diferite prelevate patologice. Genlella este componenta a microbiotei tractusului respirator superior (G. haemolysans ~i G. morbilorum) ~i digestiv (G. morbilorum). Aerococcus viridans. larg raspandit in natura, este frecvent izolat de pe tegument. Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus sunt componenti uzuali 1n microbiota vegetalelor, furajelor, alimentelor ~i ocazional prezenti 1n tubul digestiv. Vagococcus, Globicatella, Helcococcus fji Tetragenococcus au habitat neprecizat, de~i sunt uneori izolati de la om. Pentru aceste bacterii cu virulenta foarte redusa exista comunicari, argumentate sau mai putin argumentate, privind semnificatia clinica a izolatelor de la gazde compromise. In general receptivitatea apare legata de perioada neonatala, protezarea valvelor cardiace, a capetelor articulare, investigatii invazive, neutropenie, etc. Izolarile din plagi, din urina, din caile respiratorii, dializate peritoneale trebuie apreciate foarte prudent pentro ca relatia dintre contaminare, colonizare ~i infectie este dificil de demonstrat. Nici izolarea 1n hemoculturi nu este necesar semnificativii: MASTRO et a1.(1990) au comunicat hemoculturi pozitive cu Pediococcus spp.fara nicio legiitura cu un sindrom clinic definit. In schimb SIRE et a1.(1992) au izolat Pediococcus acidilactici din hemoculturile ~i abcesul hepatic ale aceluia~i pacient. HANDWERCER et al.(1990) all unnarit relatia 1ntre colonizarea intrapartum ~i bacteriemia neonatala cu Leuconostoc spp. Cauze de endocardite subacute sunt recunoscute Aerococcus spp. (KERN ~i VANEK, 1987) ~i Gemella haemolysans, de meningite Leuconostoc spp, GemelTa haemolysans, Globicatella sanguis, ale unor abcese Gel7lelTamorbilorllm. Primul rol al laboratorului clinic este de a argumenta convingator implicarea etiologica a un or izolate identificate preliminar ca genuri 1nrudite streptococilor (tabelul 28-11). Doar 1n masura 1n care semnificatia clinic a este demonstrata apare justificatii identificarea pana la nivel de specie (pentro care poate fi solicitat laboratorul de referintii) ~i testarea sensibilitatii la antibiotice. Sisterne cornerciale de identificare RAPID ID 32 STREP. Acest sistem (bioMerieux) poate identifica Streptococcus. Enterococcus, Lactococcus, Aerococcus, Gel7lella. Leuconostoc, Erysipelotlz rix, Gardnerella ~iListeria. J. Freney (I 992) a evaluat sistemul pe 433 de tulpini apartinand genurilor mentionate ~ia identificat corect 95,3% dintre acestea. LaClaire ~iR.R. Facklam (2000) au testat 55 de tulpini "Streptococcus-like" neincluse curent 1n baza de date a sistemului ~i au identificat incorect Facklamia spp. drept diferite specii de Streptococcus ~i Gemella. Vitek gram-positive identification (GPI) Card. Sistemul Vitek de identificare bacteriilor gram-pozitive (bioMerieux) utilizeaza cartele ce contin substrate biochimice

f-'

Tabelul 29-3

10

Caracterele speciilor de Neisseria izolae de la oma V..c1+I-C'+,ojlN0

+-V+-MU, 0...~"''+""tj0UIf)0 oe ct)::E:::Reducere "--lNs+ - uscate, -Caractere ,ojzbfircite, -,ojGri/albe, -tipuri -coloniilor decuIturi 'i3 +din +-Csc i:JOJ

01

OJ

ssp. glycolytica

a Simboluri

I

C

"0

S, gri/aIbe, trans parente, uneori

§i abrevieri: +, tulpini tipie pozitive, dar mutante genetic pot fi negative; -, majoritatea tulpinilor negative: V, comportament variat intre tulpini; S+, slab pozitiv; spaliile Iibere, date neeunoscute; S, tulpini "smooth": netede, umede, lucioase, rotunde, bombate, eu margini regulate; MTM, mediul Tayer Martin modifieat; ML, mediul Martin-Lewis; NYC, NYC agar; As, agar-sange; A~, agar-~oeolat; An, agar nutritiv. b Tipull (Tl): colonii mici, u§or vaseoase, bombate, eu aspectul picaturilor de roua; tipul2 (T2): colonii mici, bombate, friabile. Coloniile Tl §iT2 reflecta lumina incidenta ~iapar striilucitoare; au pili de virulenla. Prin pasaje succesive pe medii neselective tulpinile T 1 §i T2 pierd pilli §i se transforma ill tipurile 3, 4, 5 respectiv eu eolonii mari, plate, eu margini crenelate, uscate, care nu reflecta lumina ineidenta. Coloniile de N.elongata eu 2-3 mm diametm la 48 ore, cresc progresiv pana la 4-5 mm, erodeaza agarul subjacent ~i au periferia granulara, invaziva.

C

29.1.6. Teste preliminare Testul crucial al apartenentei la genul Neisseria 11reprezinta oxidaza, care poate fi efectuat direct cu primoculturi utilizand metoda Kovacs (vezi Capitolul 40). Aparitia culorii purpurii, test pozitiv, coroborata cu aspectele morfologice ~icaracterele de cultivare pot constitui criteriile unei identifid.ri preliminare de Neisseria. Caracterele de cultivare (tabelu129-3) orienteaza incadrarea izolatelor intr-un grup sau altul de specii (cu colonii transparente vs opace, nepigmentate, pretentioase 1'S nepretentioase ). Coloniile oxidazo-pozitive ale diplococilor gram-negativi izolate pe mediul ThayerMartin modificat pot fi inregistrate, in raport cu prelevatul insamantat, prezumtiv menigococi (izolarile din lichid cefalorahidian, in hemocultura) sau prezumtiv gonococi (izolarile din exsudate genitale).

29.1.7. Teste definitive In tabelul 29-3, care sintetizeaza diferentierea intre speciile de Neisseria prin C3racterele de cultivare ~i metabolice, este prezentat un set de teste: utilizarea oxidativa a 5 zaharuri (glucoza, fructoza, lactoza, maltoza, zaharoza), reducerea nitratilor ~i nitritilor, producerea de dezoxiribonucleaza ~i sinteza de polizazarid din zaharoza. Zalzaroliza 0 cercetam pe mediul CTA (Cystine Tryptic AgaJ~ Difco). "Se insamanteaza dens tulpina testata pe suprafata unei placi cu mediu CTA ~i se depun apoi discuri impregnate cu solutia 1% a zaharurilor respective. Se incubeaza la 35°C (tara adaos de CO) timp de 1-3 zi1e deoarece Ngonorrlzoeae poate cre~te sarac pe CTA. Unnare~te producerea de acid in jurul discurilor (virajul la galben a indicatorului ro~u fenol). 0 variantii rapidii cu citire dupa 4 ore la 35°C folose~te un inocul foarte bogat (2-3. 109 bacterii) intr-un volum redus din solutia de zahi'll' in tampon fosfat (preparata extemporaneu sau produs comercial) ~i ro~u fenol ca indicator. Pentru testarea sintezei de polizaharid din zaharoza se adauga cateva picaturi din solutia Lugol diluata 1/4 la cultura de 48 ore la 37°C a tulpinii de identificat in bulion cord-creier cu 5% zaharoza. Reactia pozitiva este indicata de aparitia imediata a culorii albastre. Urmare~te reducerea nitratilor.$i nitritilorin bulion Mueller-Hinton cu 0,1 % KNO, ori KNO) dupa incubarea culturii 5 zile la 37°C. Se developeaza reaqia prin adaos din solut1a de acid sulfanilic ~i a - naftalina. Aparitia culorii ro~u intens indica 0 reactie pozitiva. Testul este util pentru a diferentia NgonorrllOeae de N cinerea. care pot da reactii antigenice incruci~ate. Consulta Capitolul 40 pentru amanunte tehnice privind aceste teste. Relativ recent, pentru diferentierea speciilor de Neisseria au fost intl'oduse teste bazate pe substraturi cromogene. Trei dintre acestea, ~ - galactozidaza (ONPG). y - glutamiltransferaza (GGT) ~i hidroxiprolin-aminopeptidaza (HPAP), preluate ~i in unele galerii comerciale de microteste, sunt grupate in tabelul 29-4. Neisseria gonorrhoeae nu produce (~- galactozidaza ~i nici GGT, dar scindeaza HPAP. Neisseria 613

R.I. Md ochek II oratories,

meningitis are numai activitatea y - glutamiltransferazidi, iar N.lactamica scindeaza ONPG ~i HPAP. Moraxella (Branhamella) catarrhalis nu are activitate asupra celor trei substraturi cromogene ~i, ill consecinta, diferentierea intre Neisseria ~i Moraxella (Branhamella) se face cu mare acuratete prin acest set de teste. Tabelul 29-4

Teste care utilizeaza substrate cromogene pentru identificarea lleisseriilor ;

Testul (HPAP) Hydroxyprolil y-Glutamil

+--Neisseria +- -- +-lactamica Neisseria Neisselia Moraxella catarrhalis meningitidis

Sisteme comerciale de identificare biochimidi. Sunt comercializate mai multe sisteme de identificare biochimidi a neisseriilor bazate pe caracterele exoenzimatice. In tabelul 29·5 sunt enumerate cateva sisteme comerciale care functioneaza pe principiul inoculului bogat, rezultatele pumnd fi citite ~i interpret ate in intervale variind intre 30 minute ~i 2-4 ore. Tabellil 29-5

Sisteme comerciale pelltru idelltificarea exoenzimatidi a lleisseriilor ldentificare computerizata Sistemul Producator Ibidem bioMerieux Vitek San Hazelwood Mo Austin Tx Becton Dickinson §i Microbiology producerii de DNA-aza Micro Scan Division Healthcare Placa Caseta speciala cu 16 teste. Cl1 microgodeuri Citire vizual1i. Cl1pentm reactivizahamrilor Principiul Ey Innovative Laboratories, Diagnostics Discuri Mateo Systems hitrtie Inc. Fiole pentm cu testarea zaharuri utilizarii Citire Baxter automata ("Walk Plac1i away") cupentru microgodeuri §i identifi 18deshidrateste. Cuvete din y-Glutamil plastic cu aminopeptidaza reactivi deshidratali Testeaza: ~-Galactozidaza tali pentru 12 teste. Identificare codificata pentm 12 teste. Identificarea codificata pe Benzi din plastic cuimpregnate cupule utilizarel DNA-aza computer care computerizata pc computer. Corp West Sacramento Calif zahamrilor, producerea de penicilinaza §i Calif. Hydroxyprolil amino _jJ~ptidaza

* Sisieme multitest de identificare

614

simultana Neisselia §i Haemophillis

spp.

Identificarea antigenidi. Determinarea grupului antigenic al meningococilor este o metoda curenta efectuata prin reactia de aglutinare ori variante ale acesteia, respectiv coaglutinare sau latexaglutinare. Deoarece aceste reactii sunt efectuate cu suspensii de culturi vii trebuie asigurata securitatea antiepidemica (revezi 2.6.1.). Sunt cunoscute in prezent 12 grupe antigenice ale meningococi1or: A, B, C, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y, Z. Peste 95% din izolatele europene apartin grupelor B, C, A ~i Y. In funqie de aglutinarea cu antiseruri de grup tulpinile de meningococi pot fi: - grup aglutinabi1e: pot fi incadrate intr-un grup definit; - poliaglutinabile: aglutineaza cu mai multe seruri; - neaglutinabi1e: nu aglutineaza cu nici un ser. Intr-un studiu extins pe 0 durata de peste 20 ani in Franta numai 2/3 dintre tulpinile de N.meningitidis au fost grup ag1utinabi1e. Metode neconventionale de depistare ~i identificare rapida a neisseriilor patogene. Metode antigen ice pentru depistarea ~i identificarea gonococilor. De achizitie relativ recenta, acestea pun in evidenta antigenele de inveli~ caracteristice ale gonococului prin alternative ale reactiei de aglutinare ori prin teste imunoenzimatice. • Coaglutinarea suspensiei de S. aureus tip Cowan stabilizata ~i sensibilizata cu anticorpi monoclonali anti-proteina din membrana extern a a gonococilor. Reactivul este amestecat direct cu exsudatu1 uretral. Aparitia unei aglutinari grunjoase stabile indica un rezultat pozitiv. Dintre preparatele comerciale trusele Phadebact Monoclonal GC OMNI (Pharmacia Diagnostics Piscataway NJ) ~i Gono Gen (New Horizons Diagnostics Columbia Md) sunt apreciate cu specificitate maximala (100%). • Un sistem imunoenzimatic £nfaza solida este comercializat sub numele de Gonozyme de catre Abbot Laboratories. Tamponul cu exsudat este descarcat intr-o solutie speciala livrata de producator, iar suspensia rezultata este pus a in contact cu imunoglobuline de iepure antigonococice adsorbite pe suport solid (perle de plastic). Fixarea antigenului pe suport este evidentiata prin ser de capra antiglobulina de iepure conjugat cu peroxidaza din hrean. Schimbarea de culoare poate fi apreciata vizual ori spectrofotometric. La examinarea exsudatu1ui uretra1, .sistemu1 a fost apreciat ca sensibilitate $i specificitate coloratiei Gram. Dar sensibilitatea este mai redusa la examinarea secretiei endocervicale ~i controversata pentru prelevatele orofaringiene ~i anorectale.

I

I

Metode antigen ice pentru depistarea ~i identificarea meningococilOl: Sunt folosite coaglutinarea, 1atexaglutinarea ~i, mai rar astazi, contraimunoe1ectroforeza. • Coaglutinarea ~i latexaglutinarea au fost propuse pentru depistarea meningococului in lichidul cefalorahidian. Reactiile pozitive corel ate cu bacterioscopia of era elemente importante de diagnostic prezumtiv in meningita meningococica. Reactii1e negative nu au va10are predictiva. • Contraimunoelectroforeza efectuata in gel de agar 1% cu tampon veronal pH 7,8. In gel sunt stantate trei ~iruri paralele a cate doua godeuri cu diametrul de 3 mm. Godeurile dinspre catod, sunt umplute cu proba de lichid cefalorahidian 615

clarificata prin centrifugare 30 min. la 3000 rpm, iar in cele dinspre anod sunt repartizate seruri antimeningococice pentru grupele mai frecvente in patologie, respectiv A, B, C. Dupa migrare 60-90 min. la 0 intensitate de 3 miliamperi poate fi um1arita cu ochiul liber aparitia benzilor de precipitare intre godeurile cu Iichid cefalorahidian ~i cele cu antiseUl1specifice. Sensibilitatea metodei este modesta (depisteaza antigenul polizaharidic a11l1eningococilor numai la concentratii mai mari de 0,5 ~g/ml) Metode ale biologiei l710leeulare au fost propuse recent pentru depistarea ~i identificarea gonococilor in prelevate patologice. Sonde moleculare ADN marcate cu ester de acridina au ca tinta ARNr gonococic din prelevat cu care hibrideaza. Un sistem chemiluminiscent evidentiaza reactia de hibridare. Sistemul Gen Probe PACE (Probe Assay Chel71ilullliniseent Enhanced) comercializat de Gen Probe fne. San Diego, Ca ~i-a dovedit eficienta ca altemativa rapida dind cultivarea gonococului nu este posibili'i ~i cfmd transportul probelor ar fi dificiI. Sistemul este acreditat in S.U.A. numai pentru gonoreea genitala. Depistarea gonococilor prin reaqia de amplificare genica (PCR), de~i are 0 mare sensibilitate, nu este inca implementata in practica laboratoarelor clinice. Metodele neconventionale de depistare ~i identificare a gonococilor de~i mai rapide decat izolarea raman cu valoare celia numai pentru diagnosticul gonoreei uretrale. In celelalte loealizari sunt recomandate cu rezerva, numai ea metode orientative, din cauza sertsibilitatii ~i specificitatii insuficiente. Tipizari ale gonococilor ~i meningococilor pot fi efectuate in laboratoare specializate ~i servesc excIusiv investigatiei epidemiologice. (1) Tipizarea gonococilor • Tipizarea antigenicii are la baza antigenele proteice de membrana extern a a gonocoeilor, respectiv Proteina I (P I) eu cele doua subclase ale sale, P I A ~i P I B. In subc1asa P I A au fost descrise 24 tipuri notate P I A-I .... P I A-24, iar in subclasa P I B 31 tipuri, respectiv P I B-1 .... P I B-31. Aceasta tipizare este efectuata prin coaglutinare cu anticorpi monoclonali specifici de subcIasa ~i de tip (Labelul 29-6) . • Auxotipia gonococilor folose~te un set de medii cu compozitie 111inimaladefinita, care difera intre ele prin omisia unor aminoacizi esentiali cre~terii. In investi garea gonoeocului dependenta de arginina, hipoxantina ~i uracil poate stabili auxotipuri cu certa valoare epidemiologica. (2) Tipizarea meningococilor Tipizarea antigenica vizeaza antigenele polizaharidice, proteice ~ilipopolizaharidice (tabel 29-6). Antigenele polizaharidice detennina, dupa cum am aratat mai sus, serogrupele. Incadrarea in serogrup 0 efectuam prin reactii de aglutinare Intr-o prima etapa, celelalte merode de tipizare putand fi aplicate numai tulpinilor aglutinabile de grup. Dintre cele 12 grupe, frecvent izolate sunt A, B, C ~i Y, iar dintre acestea B ~i C insumeaza peste 90%).

Antigenele proteiee sau antigenele de membrana extema (OMP - Outer Membrane Proteins) detennina tipurile ~i subtipurile de N.meningitidis. Proteinele de 616

enta

Tabelul 29-6

Structura alltigenlca a nclsscrillor patogcnc

Pilina: Clasa N.gonorrhoeae

-fagocitozei -§ivimlenla) Stmctura* N.meningiridis Itipizare Absent intravasclliara diseminat1i lor Identificarea subclaProteine: IStabilirea Porine anion selective Oasa Ibidem Pilina eritrocite cu Pl... Proteine: Porine Clasa cation 1-Identificarea selective Incadrarea in B, C coagulare Polizaharidice: A,B,C, lb. proteinele de c1asa Aderen\a §iendotoxinic, Aderen\a la selor epitelii PIA PIB la epitelii N. meningiridis Lipopolizaharide (LPS) ~oc Antigene Funqii Leaga anticorpii IgO (factor de Aderenla lb. proteinele deserovariantele c1asa subtipuilli 4§i Specia Importanla Inhibitor in al LI-L8 serogrupele serogmpe (12) tipurilor I, 2a,2 b213 .. N.meningitidis ori 213 -N.meningitidis ale mellingitidis fagocite L9 LIIN.serogrup A ale

Imunotipurile:

*Alte stmcturi proteice ale membranei externe sau membranei citoplasmice ca Pil C, Pan I. Oxi A, Lip (H 8), Laz, au funqii rnetabolice §i patogenice diferite, dar nu prezinta importan\a antigenic1i in diagnostic.

clasa 2 §i 3 (OMP 2 §i 3) pennit identificarea tipurilor care sunt notate cu cifre arabe insolite uneori de litere mici ale alfabetului (e.g., 1, 2a, 2b). Proteinele de cIasa 1 (OMP 1) detennina subtipurile antigenice, care sunt notate cu P unnat de un indicativ numeric (e.g., Pl, 2 ori P I, 7). A11ligenele lipopolizaharidice determina imunotipurile in cadrul serotipurilor §i subtipurilor. Mandrell §i Zollinger au identificat 8 clase diferite de LPS In grupele B §i C de meningococi, clase pe care Ie-au notat cu L 1 - L 8 denumindu-le imunotipuri. Structura antigenicli completli Ia N.meningitidis se exprima astfel: B: 15:Pl. 2:L2, in care B = serogrupul (grupul polizaharidic), 15 = serotipul (tipul OMP clasa 2 §i 3), P 1,2 = subserotipul (subtipul OMP cIasa I), L 2 = imunotipul (antigenul LPS). 617

• Tipizarea electroforeticii. Electrotipia proteinelor membranei interne a fost aplicata la tulpinile de N.meningitidis netipabile serologic. Mobilitatea diferita a pro teinelor membranei interne in gel de amidon permite diferentierea mai multor tipuri migratorii - electrotipuri. Unele electrotipuri sunt prezente numai la tulpinile pato gene. • Tipizarea molecularii. Utilizand 0 digestie enzimatica a cromozomului bacterian a fost obtinut un profil al fragmentelor rezultate. Compararea profilurilor permite stabilirea configuratiei caracteristice la tulpinile epidemice. • Tipizarea prin antibiotice, antibiotipul, are valoare restransa pentru meningococ. Tulpinile de meningococ producatoare de penicilinaza sunt rare, de aceea rezistenta la penicilina a meningococilor este un marker epidemiologic cu capacitate discriminatorie buna.

30. IDENTIFICAREA BACILILOR GRAM-POZITIVI AEROBI ANGELA DIACONESCU, DUMITRU BUIUC, CARMEN PA.NZARU, MARIA DAMIAN 30.1

IDENTIFICAREA CORINEBACTERII.LOR

30.1.1. Minidefinitie 30.1.2. Consideratii taxonomice 30.1.3. Habitat ~i implicatii in patologia infectioasa 30.1.4. Obtinerea culturii pure necesare indentificarii 30.1.5. Caractere

de cultivare

30.1.6. Caractere microscopice 30.!. 7. Identificarea preliminara 30.1.8. Identificarea definitiva a speciilor Corynebacterium 30.1.9. Scurta caracterizare a speciilor Coryllebacterium 30.2.

cu interes

de

IDENTIFICAREA BACILILOR GRAMPOZITIVI CARE ENDOSPORULEAZA AEROB

30.3.1. Minidefinitie 30.3.2. Consideratii

Minidefinitie

30.5A.6. Caractere microscopice 30.5A.7. Teste preliminare 30.5A.8. Teste definitive 30.5A.9. 30.5B.

Sensigilitatea la antibiotice Gellurile rlzodococcus, gordo Ilia ~i. tsuka murella

30.5B.l. 30.5B.2. 30.5B.3.

Minidefinitii Consideratii

30.5B.5. 30.5B.6.

microscopice

30.3.7. Teste preliminare 30.3.8. Teste definitive 30.3.9. Sensibilitatea la antibiotice

taxonomice

Habitat ~i implicatii in patologie Caractere de cultivare Caractere

microscopice

Teste preliminare Teste definitive Sensibilitatea la antibiotice

30.5B.7. 30.5B.8. 30.5C. Alte actillomicete aerobe Cllimportall(a medicala 30.5C.1.

Minidefinitii mice

30.5C.2. 30.5C.3.

Habitat ~i implicatii Izolarea

30.5C.4. 30.5C.5. 30.5C.6.

Identificarea Identificarea Sensibilitatea

30.6.

IDENTIFICAREA

taxonomice

30.3.3. Habitat ~i implicatii in patologie 30.3.4. Obtinerea culturii pure 30.3.5. Caracterele de cultivare 30.3.6. Caracterele

30.5A.!.

30.5A.2. Consideratii taxonomice 30.5A.3. Habitat ~i implicatii in patologie 30.5A.4. Obtinerea culturii pure 30.5A.5. Caractere de cultivare

30.5B.4. CORI-

NEFORMI DIFERITI DE CORYNEBACTERIUM 30.3.

Gellul Nocardia

de

medical,

altele decat C. diplztlzeriae IDENTIFICAREA BACILILOR

30.5A.

~i consideratii

taxono-

in patologie

prezumtiva definitiva la antibiotice ALTOR

BAC1Ll

30.4.1. Minidefinitie 30.4.2. Consideratii taxonomice

30.6A.

GRAM-POZITIVI MEDICAL Listeria

30.6A.l.

Minidefinitie

30.4.3. Habitat ~i implicatii in patologie 30.4.4. Caractere de cultivare

30.6A.2. Consideratii taxonomice 30.6A.3. Habitat ~i implicatii in patologie

30.4.5. Carctere

30.6A.4. Obtinerea 30.6A.5. Caractere

culturii pure de cultivare

30.6A.6. Caractere

microscopice

30.4.

30.4.6. 30.4.7. 30.4.8. 30.5.

IDENTIFICAREA

LACTOBACILILOR

microscopice

Teste preliminare Teste definitive Sensibilitatea la antibiotice IDENTIFICAREA BACTERIILOR NOCARDIFORME

CD INTERES

30.6A.7. Teste preliminare 30.6A.8. Teste deinitive 30.6B.

Elysipelotlzrix

619

30.1. IDENTIFICAREA CORINEBACTERIILOR (ANGELA DIACONESCU* MARIA DAMIAN **) Corinebacterii non-lipofile: • C. afermentans: subsp. afermentans • C. amycolatum • C. argentoratense • C. atypicum • C. auris • C. confusum • C. coyleae • C. diphtheriae • C. durum • C. falsenii • C. glucuronolyticum • C. imitans • C. matruchotii • C. minutissimum • C. mucifaciens • C. nigricans • C. propinquum • C. pseudodiphtheriticum • C. pseudotuberculosis • C. riegelii • C. sanguinis • C. singulare • C. striatum • C. sundsvallense • C. thomssenii • C. ulcerans • C. xerosis

Corinebacterii lipofile: • C. afermentans subsp. lipophilum • C. accolens • C. appendicis • C. jeikeium • C. kroppenstedtii • C. lipophiloflavum • C. macginley • C. urealyticum • CDC grup PI • CDC grup G

30.1.1 Minidefinitie Bacilii corineformi, tara a constitui 0 grupare taxonomica, au in comun caractere microscopice, de cultivare ~i biochimice. Microscopic, sunt bacili gram-pozitivi, drepti sau u~or incurbati, cu capete maciucate sau elipsoizi, cu extremitatile ascutite ori rotunjite, a~ezati in unghiuri ~ipalisade. Fixeaza colorantul neregulat ~i pot avea incluziuni de polimetafosfat, care se coloreaza metacromatic cu albastru de metilen policrom (in ro~u) sau cu alti coloranti. Sunt neacidorezistenti, nesporulati. Cultiva la 37°C pe agar nutritiv sau agar-sange; exceptie fac speciile lipofile de COlynebacterium pentru care sunt necesari factori de cre~tere sau stimulenti ai cre~terii: lipide naturale (din ser sanguin, galbenu~ de ou) sau sintetice (Tween 80, acid palmitic). Biochimic sunt catalazo-pozitivi, oxidazo-negativi ~i indol-negativi. Unele genuri sau specii sunt facultativ anaerobe (fermentative), altele strict aerobe (non-fermentative). * Centrul National de Referinta pentru Difterie.

** Laborator Genetica Moleculara. 620

30.1.2 Consideratii taxonomice Conform definitiei mentionate, in grupul bacililor corineformi pot sa fie incluse genurile COlynebacterium (cel mai important prin numarul de specii, frecventa izolarilor ~i implicatiilor in patologie), Arcanobacterium, Arthrobacter, BrevibacteriulIl. Cellulomonas, Cellulosimicrobium, Oerskovia, Dermabacter,Le(fSonia. Aureobacteriwn, Microbacterium, Rothia, Turicella. Genul Corynebacterium (Subordin X-Corynebacterineae, Familia I-Corynebacteriaceae) a fost creat initial pentru C. diphtheriae ~iunele specii patogene pentru animale. Numarulmare de specii identificate numai pe baza caracterelor fenotipice a detem1inat insa, redefinirea genului in ultimii ani. Studiile taxonomice efectuate, au pem1is inc1uderea in gen numai a speciilor care contin in peretele celular (1) acid mezo-diaminopimelic, arabinoza ~i galactoza; (2) acizi micolici cu lungime de aproximativ 22-36 atomi de carbon, numiti acizi corinemicolici (cu exceptia C atvpicum C. amycolatulll. C. kroppenstedtii); (3) lanturi drepte saturate ~imononesaturate de acizi gra~i celulari, in principal acid palmitic, acid oleic ~icantitati reduse de acid stearic; aciduI tuberculostearic a fost identificat la anumite specii (c. urealyticum ~i C. confusum); 4) menaquinone dihidrogenate - fonne de vitamina K existente in bacterii - cu 8 sau 9 unitati de izopren; (5) continutul de G+ C variaza de la 46mol% (c. Kutscheri) la 74 mol%(C. auris) Pe baza acestor caractere ~i a relatiilor genetice stabilite prin tehnici de hibridizare ADN-ADN, in prezent au fost incluse in gen peste 50 de specii ~i doua grupe de tulpini corinefonne. Majoritatea speciilor (34) au relevanta medicala demonstrata ~i sunt definite in proportie de aproximativ 61%, dupa 1995 (Tabelul 30-1). Exista insa date care sustin necesitatea c1arificarii unor specii din genul COlynebacterium, in special a celor izolate din pre lev ate umane. Tabe/lll30-1

Cronologia definirii noilor specii din genul Corynebacterium Denumire prezenta C.falsenii C.il1litans C. durul1l C.lipophiloflavul1l C.singulare C.riegelii

1995 1998 Anul Denumire definire anterioara 1997 "c.deulcerans" noua CDCgrupGI CDC grup ANFI (partial) Specie Specie noua

621

Tabelul30-1 -.

--.-

,-

C.kroppenstedtii

-----

(continuarc

- Specie

noua 1998 2002 2003 2004 Specie Specie noua noua

C.confusum C.sundsvallense C.appendicis

Studiul caracterelor fenotipice au conturat in cadrul genului Corynebacterium :grupe de specii: • Grupul Corynebacterium diphtheriae care reune~te 3 specii toxigene ale genulu: C.diphtheriae (cu cele 4 biotipuri -gravis, mitis, intermedius ~i belfanti), C. lll~erans s C.pseudotuberculosis • Grupul altor corinebacterii non-lipofile: 24 specii. • Grupul corinebacteriilor lipofile: cu 7 specii numite ~i doua grupe de tulpi:-. corinefonne, CDC grup F I ~i CDC grup G. Aceasta grupare fenotipica nu se suprapune perfect taxonilor: e.g., C. diphtheric:. biotip intermedius este lipofil, iar biotipurile gravis ~i mitis non-lipofile.; C. afennen tai: subsp. afermentans este non-lipofila, iar subsp.lipophilum este lipofila.

30.1.3 Habitat ~i implicatii In patologia infectioasa Exista in general 0 afinitate de gazda a bacililor corineformi. Unele specii pot tre~;: ocazional dintr-o ni~a ecologica in alta ~i chiar determina accidental,imbolnaviri a:;: gazdelor. Daca aspectul este mai bine studiat privind impactul unor specii prepondere:-:: izolate la animale in patologia umana (e.g. C. ulcerans, C. pseudotuberculosis), due privind identificarea corecta, pun sub semnul intrebiirii unele semnalari privind implicare::. catorva specii umane in patologia animala (e.g. C. minutissimum, C. striatwn, C. xerosis Implicatiile bacililor corinefonni in patologia infectioasa modern a sunt mu: diversificate datorita cre~terii numarului de gazde cu apararea antiinfectioasa compromis~ ~i a procedurilor medicale ~i chirurgicale tot mai agresive (Tabel 30-2). Pentru unele specii neincluse in acest capitol nu exista date suficiente privind izolarea ~i imp lie are::. in patologia umana: e.g., grupul COlynebacterium renale (C. renale, C. pilOSWH C. cystitidis), C. kutscherii, C. bovis, C. mycetoides, C. flavescens, C. vitaerumini, C. callunae, C. glutamicum, C. variabilis, C. ammoniagenes, C. mastitidis, C. camp07'realensis, c.freneyi, C. aurimucosum, C. phocae. Tabelul3' '_

Semnificatia Specii /grupe

622

medicalii a unor specii de Corynebacterium

Uman: nasofaringe, Asocierea Habitat cu Imbolnaviri Endocardite (+) Uman: tegumente Infeqii Otite, infec!ii respiratorii oculare(+)(+)

Infectii respiratorii (+) Bacteriemii (+)

Tabelu/ 30-2 (eontinuare)

l' (+++) Endocardite (+) Endocardite Uman: (+) Bacteriemii tegumente, eavitati nasofaringe, Uman:nasofaringe, tegumente Asocierea Habitat eu caile axilare ,I'imbolnaviri (+) U retrite, prostatite (++) Peritonite de cateter (++) Specii /grupe faringe nasofaringe Osteol11ielite (++) Faringo-amigdalite (+) Otite (+) Bacteriemii nfeetii ale pieiorului (+) (+) Osteomielita (+) stemala (++) Endocardite (++) IPneumonii nfectii urinare la ~i femei (-,-)Colonizari aerodigestive ~i infectii ale protezelor (+) eutanate ale tesuturilor l110i(+) tegumente conjunctiva Na~tere prematura (?) ~i pliurile Infectii respiratorii (?) Uman: faringe, tegumente Infeqii ale tesuturilor Oi, capre, cai: Infectii cutanate ~i ale Uman: perineu, tesuturilor moi (++) Infectii respiratorii (+) moi (+) oculare (++) Osteomielite (+) Bacteriemii, (++) inclusiv de cateter (++) pneul11onii, abcese Limfadenite Sinovite Pneumonii, septiee mediastinite necrozante cu artritii (++) (+)pulmonare (+)(+++) Ulcer ale sanului( (?) +) (?) (++) (++) Bacteriemii (++) Faringite (+~i +) Infectii respiratorii urinare (+) (+) Endocardite (+++) Bacteriel11ii (+) (+++) Retinopatii (+) Difterie, inclusiv eutanata (++++) Colonizari infectii ale protezelor Rar, eavaginal boli profesionale: (+++) Traheite, Bacteriemii, inelusiv de eateter( +)cazeoase Avort spontan (+)

623

njunctiva ctiva Infectii ge,

Tabellli 30-2 (continuare) Uman:Bacteriemii Infectii urinare (++)(+) oro- (+) abcese Endocardite ale Habitat Asocierea cu imbolnaviri ulcere, Specii Igrope otice (++) Vite, cai Osteomielita (++) Endocardite (+) cutanate, tegumente, Infectii oculare (++) Uman: tract uro-genital tegumente Osteomielita stel11ala (++) Endocardite (++) Difterie (+) lnfectii oculare ~i otice (+) Pneumonii, mediastinite (++) si infectii (+) Infectii Bacteriemii (+) Faringite (+) Endocardite (+) Colonizari ~i ale protezelor (+++) Bacteriemii (+) Infectii urinare (++++)

Sel1lllifica{ie medicala: = "agentul etiologic major" (++++) (+++) - (+) = de la "frecvent" pfma la "rar implicat" = "implicare posibila" (?) b unele cazuri comunicate pot sa fie datorate ~i C. amycolatum Q

Bacilii corinefoTI11inon-difterici cu nive1 de patogenitate redus sunt izo1ari mai frecvent decat C. diphtheriae. Trebuie ca laboratoare1e c1inice sa-$i mentina capacitatea de recunoa$tere a acestui agent patogen, Intrucat supravegherea circulariei bacilului difteric $i a C. ulcerans, este 0 condirie esentiaU'i In eliminarea bo1ii. Este de asemenea necesar ca baci1ii corineformi cu potentia1ii semnificatie clinica sa fie complet identificari In cazu1 concordantei dintre aspecte1e clinice $i predominanta In pre1evatul patologic sau izolare din prelevate necontaminate.

30.1.4 Obtinerea culturii pure necesare identifidirii Conduita In aceasta etapa este dictata de: • circumnstantele clinico-epidemio1ogice sugestive pentru difterie sau depistarea portajului de C. diphtheriae, C. ulcerans versus sindroame posibil cauzate de bacili corinefonni (Tabel 30-2); • rezultate1e microscopiei directe. 30.1.4.1 Izolarea C diphtlteriae san C ulceralls de la suspecti, bolnavi sau purtatori necesita unnatoarele medii: mediu1 OST (de Imbogarire), agar sange, mediul Tindsdale modificat $i Gundel-Tietz (medii selective $i diferenria1e), mediu1 Loeffler 624

LA BOLNAV

LA PURTATOR To

To I Tampon gat

ni~~

OST

Tampon nas.

nas

gat

OST

OST

OST

Tampon ~

T:uupon ~

GS

24 h I Citire

24 h

Tinsdale gftt nas

Repicare colonii cu halou pe Loeffler GS

Frotiu

Citire TinsdaIe

48

Citire continuare diagnostic

h

)l~:,~g,OOU

Frotiu

72 h CNR

Teste prelirninare - testul pirazinamidazei - testul cistinazei

Teste de confrrmare - testul catalazei - testul ureazei - teste biochimice de reducere a nitratilor

INTERPRETAREA REZULTATELOR

IDENTl CARE~

It

Frotiu

~ Teste prelirninare - testul pirazinamidazei - testul cistinazei

Vl

To,"",oo"

Teste de confrrmare - testul catalazei - testul ureazei - teste biochirnice de reducere a nitratilor

INTERPRETAREA REZULTATELOR

Centrul National de Referinla

eJ".,

L)

•• CNR

Fig. 30-1. Diagnosticu! de laborator in difterie, la bolnav §i la purtator

(me diu electiv ~i pentru stocare). Mediile se insamfmteaza conform conduitei de izolare rezumata in Fig. 30-1; culturile sunt incubate aerob la 37°C ~i sunt unnarite 24 -48 ore pentru aparitia coloniilor caracteristice. Utilizarea placii cu agar singe este justificata nu numai pentru ratiunile precizate anterior (vezi 12.2.4) dar ~i pentru ca exista tulpini de C. diphtheriae sensibile la telurit de potasiu, care sunt inhibate pe mediile care contin acest ingredient selectiv. 30.1.4.2 Izolarea altor specii de Corynebacterium Majoritatea speciilor de Corynebacterium se dezvolta, la 37°C, pe agar sange In aerobioza sau in atmosfera suplimentata cu 5% COo sub fonna de colonii mici, in 24 -48 ore. Rata de izolare este ameliorata pe medii selectfve cu colistin suIfat (10 Ilg/ml) , acid nalidixic (15 Ilg/ml) in special din prelevate contaminate. Este de asemeni recomandat mediul selectiv agar sange care contine 100 Ilg fosfomicin/ml (+ 12,5 Ilg glucoza-6fosfat/ml) pentru corinefonnii rezistenti la acest ingredient. Este posibila si introducerea unui disc care contine 50 Ilg fosfomicina (+ 60 Ilg glucoza-6-fosfat) pe placa cu agar sange, fiind examinate coloniile care cresc in jurul discului. Dezvoltarea speciilor lipofile de Corynebacterium este stimulata sau total dependenta de prezenta lipidelor: galbenu~ de ou, ser sanguin sau lecitina, acid oleic sau Tween 80 e.g., agar tripticaz - soia suplimentata cu 1%(v/v) Tween 80, bulion infuzie cord-creier suplimentat cu 1% Tween 80. In situatia utilizarii mediilor lichide (In special pentru germenii izolati din zone normal sterile) prezenta acestora trebuie controlata ,prin frotiu colorat Gram,dupa 5 zile de la incubare. Bacteriile corinefonne, altele decat C. diphtheriae, sunt frecvent izolate dintr-o varietate de prelevate clinice. Trebuie identificate pana la nivel de gen ~i specie numai daca: (1) aspectul clinic este relevant; (2) sunt izolate in cultura pura sau ca genneni predominanti in infectii mixte; (3) sunt izolati in hemoculturi sau din alte produse necontaminate; (4) sunt izolati repetat din acela~i prelevat; (5) sunt izolati predominanti ~i in cantitati peste 105 UFC/ml urina; (6) frotiul direct colorat Gram Ie atesta asocierea cu focarul de infectie (pentru amanunte revezi capitolele 1'9,15, 17).

30.1.5 Caractere de cultivare Pe medii Ie cu telurit morfologia coloniilor tipice de C. diphtheriae este mai bine conturata dupa 48 de ore de incubare la 37°C. Pe mediul Gundel-Tietz (agar-sange- cistina-telurit): • C. diphtheriae gravis formeaza colonii plate cu diametrul de 1-2 mm, margini crenelate, striatii radiale ~i suprafata granulara, consistenta friabila sau semi-friabila, greu emulsionabile. Coloniile sunt negre, cenu~ii sau negre cu marginea transparenta. Uneori coloniile au aspectul florii de margareta (fig. 30-2 - vezi plan~a color) . • C. diphtheriae intermedius formeaza colonii de marime variabila, mijlocii sau mici cu diametrul de 0,5 -0,75 mm, aspect plat ~i centrul u~or mamelonat; coloniile sunt negre,cu suprafata granulara sau lucioasa ~imargini circulare, mai transparente. (fig. 30-3 vezi plan~a color). 626

• C. diphtheriae mitis sunt de marime variabiHi eu diametrul de 1-2 Hun, eonvexe, eu margine eirculara, suprafata lueioasa ~i eonsistenta cremoasa (fig. 30-4 -vezi plan~a eolor); prin invechire coloniile devin mai plate ~i suprafata mai granulara . • Aspectul coloniilor de C. pseudodiphtheriticum pe mediul Gundel-Tietz este prezentat in fig. 30-5 - vezi plan~a color. Colonii asemanatoare apar ~i pe mediile Hoyle-telurit sau McLeod (agar-sangetelurit). Pe mediul Tinsdale modificat (agar-ser-cistina-telurit-thiosulfat):C. diphtheriae indiferent de biotip, C. ulcerans ~i C.pseudotuberculosis se dezvolta sub fom1a de colonii mici, negre-cenu~ii, cu halou cafeniu, net, bine delimitat (fig. 30-6-vezi plan~a color). In zonele cu dispersie insuficienta coloniile acestor specii pot sa apara mici, cenu$ii $i tara halou. Mediul permite diferentierea grupului C. diphtheriae de alte specii de COlynebacterium sau din genurile inrudite, care sunt inhibate cantitativ sau, daca apar, sunt lipsite de halou (fig. 30-7-vezi plan$a color). Aspectele morfologice ale culturii pe mediul Gundel-Tietz sunt similare pe agarsfmge; difera numai culoarea coloniilor, care este alba pana la gri perle, din cauza absentei sarurilor de telur (fig. 30-8,30-9,30-10 - vezi plan~a color). Uneori tulpinile gravis, ~i in special mitis, pot sa prezinte 0 zona redusa de hemoliza, insa producerea de hemolizina este caracter variabilin cadrul speciei C. diphtheriae ~i nu are valoare taxonomicii. Pe mediul Loeffler cultura de C. diphtheriae este semicremoasa, granulara, iar eoloniile au aspectul pieaturilor de spermantet; cultura altor corinebacterii este eremoasa $i lueioasa. Alte specii non-lipofile erese bine pe agar-sange $i fom1eaza eolonii nepigmentate sau pigmentate in alb pana la galben (C.falsenii, C. sanguinis) ori negru (C. nigricans). Speeiile lipofile fOTIneazape agar-sange, dupa 24-48 ore la 37°C, eolonii foarte miei de 0,5-1 mm diametru, netede, alb-eenu$ii, rareori pigmentate, nehemolitice (fig. 30-11- vezi plan~a color). Nu cresc pe medii tara sange, dar pe agar-sange suplimentat eu 1% Tween 80 fOTIneaza,in ace1ea$i conditii de incubare, colonii cu diametrul 2-4 mm (fig. 30-12 -vezi plan~a color). La C.accolensapare un adevarat fen omen de satelitism, colonii mai mari in vecinatatea celor de S.aureus, explicat prin lipofilia acestei eorinebacterii.

30.1.6 Caractere microscopice Aspecte1e morfotinctoriale ale bacililor difterici difera in functie de biotipul $i eonditiile de cre~tere. Caracterele microscopice tipice Ie putem observa numai pe frotiuri din falsa membrana sau din cultura pe mediul cu ser de bou (e.g., panta pe mediu Loffler) unde gasesc concentratii optime de fosfati pentru sinteza inc1uziunilor de volutina. Tipic, C. diphtheriae apare ca bacili polimorfi, drepti sau U$or incurbati. de 0,3-0,8 mm grosimell-8 111mlungime, cu capetele maciucate, dispu~i in V, L, Y. ~i frecvent in palisade (aspect de "litere ehineze$ti"). Gram-pozitiv la limita, are 0 inegalitate tinctorial a datorata prezentei inc1uziunilor de volutina (corpusculi metacromatici) dispuse predominant polar. In coloratia gram incluziunile de volutina apar violete pe fondu1 ro~u a1baci1ilor, iar in coloratiile cu albastru de metilen policrom apar ro~ii pe fond albastru 627

(vezi Capitolul 41). Bacilii biotipului mitis sunt lungi, cu aspect moniliform dat de granu1ele metacromatice bine dezvoltate (fig. 30-13 vezi plan~a color), ai biotipului intermedius sunt lungi cu aspect barat pentruca granulele sunt slab dezvoltate, iar ai biotipu1ui gravis sunt scuqi ~i tind sa fie uniform colorati din cauza numaru1ui mai redus de granule (fig. 30-14 vezi plan~a color). Cultivati in conditii suboptimale (e.g., agar-sange, medii cu telurit de potasiu). bacilii difterici i~i modifica morfologia, ceea ce face dificila diferentierea de alte corinebacterii: fonne cocoide, care pot crea confuzii cu C.ulcerans (fig. 30-15 vezi plan~a color), bacili grosolani, mai scuqi, ascutiti sau maciucati - posibile confuzii cu C. pseudodiphtheriticum (fig. 30-16 vezi plan~a color), C. xerosis (fig. 30-17 vezi plan~a color) ~.a. C01ynebacterium matruchotii este polimorf cu filamente ramificate, septate sau neseptate, ~i ia fonna de bici dnd un singur bacil se ata~eaza la extremitatea unui filament.

30.1.7. Identificarea preliminara Bateria de teste pentru identificarea preliminara a bacililor corineformi trebuie aleasa in raport cu circumstantele c1inico- epidemiologice ale izoHirii. 30.1.7.1 Identifiearea preliminadia izolatelor din false membrane in suspiciunea de difterie sau din prelevatele pentru depistarea portajului de baeili difteriei. Testul pirazinamidazei ~i testul cistinazei permit diferentierea grupului C. diphtheriae de aproape to ate speciile de Corynebacterium. Absenta pirazinamidazei ~i producerea de cistinaza sunt caractere metabolice specifice numai speciilor de C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis. Nu recomandam numai testul pirazinamidazei , intrucat in cadrul genului C01ynebacterium unele tulpini de C. accolens. C. nigricans, C. propinquum, C. riegelii o$iC. sundsvallense nu produc pirazinamidaza. Pentru confinnarea speciei C.diphtheriae ~i determinarea biotipurilor se testeaza: (1) prezenta catalazei, (2) producerea ureazei, (3) reducerea nitratilor ~i (4) fem1entarea glucozei, zaharozei, dextrinei ~i glicogenului. Aceste teste permit identificarea bacilului difteric ~i a biotipurilor sale dupa 24-48 ore de incubare la 37°C. In cadrul unor cercetari sau pentru confinnarea unor variante de C.diphtheriae testele biochimice se pot extinde la 0 gama mai larga de zaharuri: maltoza, levuloza. trehaloza, amidon (tabelul 30-3). Tulpinile de C. diphtheriae sunt catalazo-pozitive, ureazo-negative ~i fennenteaza unii carbohidrati, tara eliberare de gaz, produsele majore fiind acidul acetic, acidullactic, acidul propionic. Fonnele tipice de C. diphtheriae produc acid din glucoza ~imaltoza, dar nu ~i din zaharoza. Fennentarea polizaharidelor, dextrina ~i glicogenul, diferentiaza principalele biotipuri ale speciei: gravis fermenteaza dextrina ~i glicogenul; intermedius - numai dextrina; mitis fennenteaza variabil dextrina. Tulpinile mitis netoxigene ~i nitratreductaza negative au fast atribuite unui al patrulea biotip: belfanti. De~i biotipurilor unanim recunoscute de C. diphtheriae Ie sunt asociate caracterele biochimice mentionate anterior, putem intalni tulpini de bacil difteric dificil de clasificat. 628

Tabelul 30-3 Forme scurte margaretii v-v0-;:::N-0~-Nb/j- -N ++..c:N mediul ..c: "0+N·S tip gravis metacromatice N '·s"@)'~b C;.8b5'+2c:~Is'a.Ll". C;'Nu"0::E;::: + 0...Margini pozitivi lapeIimitii coloniilor circulare ~ Convexe, tinctoriale circulare +acuminate Mici tip mitis > plate, Convexe, margini

u

>CIl >CIl CIl •...• •...• >::: -' t'..•)

lJACIU GRAM - I'OZITIVI NERI~GULA TI aerobi I facullaliv anacrohi

I Catalaza

+

I

,---I

Hemoliza

u

I Nehemolitici

~ I

Pigmentogeneza

H2S

Gelatinaza

I C o']onn " nepigmentate

SuspecteazA

1

Corynebacterium Arcanobacterillm (unele spedi) Dermabacter Rotlzia Actinomyces?? Micobacterii CII crestere raoida? Vezi fig.30-l9

I

C 0Ionn.,

C 0IIonn..

galbene

portocaliu - rosH

I

I

SuspecteazA

1

Aureobacterium Brevibacterium Cellulomonas Cellulosimicrobillm Corynebacterium (unele specii) Lei/sonia Oerskovia

Suspecteazll.

I ..

C 0C,onn"

C 0 onn

Archanobacterium

Archanobacterium

roz

negre

pyogenes

haemolyticum

vezi tabel 30-5 Rhodococcus equi (unele tulpini) C.macginley

+

Brevibacterium? (unele tulpini) Rizodococcus ? Microbacterium Curtobacterium? vezi fig. 30-20

a Tulpini

de Actinomyces CDC grup 2 sunt ocazional gazduite de om dar nu au patogenitate cunoscuta

vezi fig. 30-20 Fil:. ]O-Ill. TL'slc prdiminarc penlru idenlifiearea haeililor gram-pozilivi neregulali. aerobi sau facultativ anaerobi.

RACILI GRAM-POZITlVI NEREGULA Tl aerob/facultativ anacrobi. calalazo-pozitivi si nepigmentogeni

I

Difcrcnticri prcliminarc I

I

I

I

Scurti panll la cocoizi

Lungi ramificali rudimentar

Bine ramificati (Iungimca ramificatiilor > 2 lungimi ale bacililor)

J.Y..Yl Actillomices sp.? Micobacterii cu cre~tere rapidll ? Nocardia sp.? Propionibacterium? Rhodococcus sp.? Rothia sp.

C. matruchotii

Vezi tabel 30-5

C.durum Turicella otitidis Actinomyces sp.? Propionibacterium? Rothia sp.s Vezi tabelele: 30-5,

~

+1-

I

I

Corynebacterium afermentans c.argentoratense C.auris; C.confusum C.coyleae C.diphtheriae; C.jeikeiuIII C.lipophiloflavllm C.propinquum C.sangllinis Vezi label 30 - 5,6

C.appendicis Cialsenii C. pseudodiphthericum C.riegelli C.urealyticum Vezi tabel 30 - 5,6

+/+

Maciucali a~ezali In V, Y ~ipalisade

Cic1ul bacili-coci

I

BrevibacteriU/ll cele mai multe specii Arthrobacter

Aspectul coloniilor

y"Uabd30-5

~

1

Relativ mid, cenu~ii

Mai marl, opace obi~nuit albe sau bej uneori maranii

I

Pirazinamidazalcistinaza ureazalzaharoza

-1-

I

+1-

1-1+ C. auris; C.afermentans

C.diphtheriae C.ulcerans C.al11ycolatul11;C.appendicis Corynebacterium Catypicum c.argentoratense C.pseudotuberculosis gI:Up F, C.imitans C.con/itsul11; C.coyleae; C.durul11, C.propinquum C.singulare C.kroppenstedtii (uncle tulpini) C.glucurono(vticul11 c.sundsvallense C.l11atruchotii C.imitans; Cjeikeiul11 C.thomssenii C.xerosis Vezi tabel 30 - 3,6 C. kroppenstedtii Vezi tabel 30 - 5,6, Vezi tabel 30 - 5,6 c.l11atruchotii; C.l11inutissimu/11 C.muCllaciens C.pseudodiphthericul11 C.singulare C.striatum; C.thomssenii C.urea(vticum; C.xerosis

I

I

Vezi tabel 30 - 5.6

0\

W W

Fig. 30-19. Teste preliminare pentru identificare a bacihlor'gram-poziYivi aerobi sau facultativ anaerobi, catalazo-pozitivi, nepigmentogeni

I:

0\

W

BACILI GRAM-POZITIVI NEREGULA TI

.j::..

Aerob I facultativ anaerobi, catalazo-pozitivi si pigmentogeni

1 Pigment galben

'--I

Mobili

Oerskovia Leifsonia unele tulpini de: Arthrobacter Aureobacterium Cellulomonas Microbacterium

I

I Scurti-cocoizi

Aureobacterium? Leifsonia?

Ciclul bacili - coci

Brevibacterium (unele tulpini)

I Ramificali rudimentar

Cellulomas Microbacterium Oerskovia?

Microbacterium (unele tulpini) Curtobacterium? (cele mai multe tulpini)

Microbacterium (unele tulpini)

Figura 30-20 Teste preliminare pentru identificarea baciliJor gram-pozitivi neregulati, aerobi sau facultativ anaerobi, catalazo-pozitiyj

Nocardia? Rhodococcus?

~ipigmentogeni

Ca unnare, bacilul difteric se prezinta sub doua aspecte: tulpini toxinogene sau netoxinogene, dar patogenitatea este calitatea tulpinilor tox+. In acest context, prima cerinta in caracterizarea culturii izo1ate, solicitata ~ide medicu1 clinician sau epidemiolog, este investigarea capacitatii toxinogene. Exista numeroase metode de testare in vitro sau in vivo rezultate1e fiind dependente de dotarea ~i experienta fiecarui laborator in parte. • Testarea toxinogenezei in vitro. Testul Elek (vezi Capitolu140) este un test de imunodifuzie larg utilizat in practica de laborator pentru avantajele sale: rapiditate, simplitate ~iprecizie. Rezultatele testului apar la 24-48 ore de incubare la 37°C. Aparitia unor linii de precipitare in unghiul format de cultura insamantata ~i antitoxina difterica (~ant care contine serul antidifteric sau langheta din hartie de filtru imbibata in ser), indica 0 reactie pozitiva: C. diphtheriae toxigen (fig. 30-2la - vezi plan~a color). Testul se practica in prezenta unor martori: C. diphtheriae biotip gravis toxigen (NCTC 10648), C. diphtheriae biotip be(fanti netoxigen (NCTC 10356) ~i C. diphtheriae biotip gravis slab toxigen (NCTC 3984) . • Testarea toxinogenezei in vivo. Toxina eliberata de cultura tulpinei testate poate sa fie evidentiata prin testul de patogenitate pe cobai. Cultura de cercetat este injectata subcutanat la cobai neprotejati ~i protejati (injectati anterior intraperitoneal cu 1000U! ser antidifteric). In situatia unei tulpini de C. diphtheriae toxinogene cobaiu1 test moare in 24-48 ore cu semne specifice de intoxicatie difterica; cobaiul martor nu prezinta reactii locale sau generale (vezi Capitolul 40). Intrucat realizarea testului necesita personal calificat, metoda este recomandata numai pentru diagnosticul un or tu1pini de C. diphtheriae incerte ~i numai la nive1ul Centrului de Referinta . • Alte metode de testare a toxinogenezei. Exista numeroase alte metode pentru detenninarea capacitatii toxinogene a C. diphtheriae, dintre care remarcam : Testul Elek modificatpoate sa fie folosit ca altemativa a testului conventional Elek. Utilizand 0 concentratie de antitoxin a difterica de 10 U.I / disc situat intr-un rezervor central decupat in mediu1 Elek, pot sa fie testate pentru toxigeneza 3 tulpini de C.diphtheriae pe aceea~i placa. Aparitia unor linii de precipitare la 16-24 ore de incubare 1a 37°C, indica 0 reaqie po ziti va (fig. 30-21 b - vezi plan~a color). Testul se practica in prezenta unor tulpini C.diphtheriae pozitive (NCTC 10648, 3984) ~i negative (NCTC 10356). Este un test specific, sensibil, u~or de efectuat . Testul imunocromatografic strip (ICS) a fost dezvoltat pentru decelarea toxinei difterice din cultura pura de C. diphtheriae. Testul utilizeaza anticorpi policlonali equini ca anticorpi de captura ~i anticorpi monoclonali specifici pentru fragmentul A al toxinei difterice marcati cu aur coloidal, ca anticorpi de detectie. Folosind 0 suspensie standard de C. diphtheriae (108 UFC/m1) in me diu bulion Elek suplimentat cu ser nonnal de bou, incubata 3 ore la 37°C, rezultatul toxigenezei se evidentiaza in 10 minute de la introducerea in suspensia bacteriana a stripului test ICS (culoare ra~ie). Este 0 metoda simpla, rapida, cu 0 1imita de detectie a toxinei difterice de 0,5 ng/ml. Alte metode ca testarea citotoxicitatii toxinei difterice pe celule Vera, western blotting, dot - blotting ~iELISA, sunt specifice, dar sunt laborioase ~inu sunt recomandate pentru 0 testare de rutina. 635

(2) Determinarea sensibilitatii la antibiotice. Cdiphtheriae este sensibilIa antibioticele uzuale, penicilina sau eritromicina fiind agentii chimioterapici de electie pentru: eradicarea colonizarii Cdiphtheriae la pm1ator, prevenirea colonizarii cu bacili difterici la contactii de focar. Prezenta unor tulpini rezistente la penicilina (in special Cdiphtheriae gravis), eritromicina, Iincomicina, cIindamicina, rifampicina, trimetoprim impune testarea sensibilitatii la antibiotice a tuturor tulpinilor de Cdiphtheriae toxigene izolate ~i a tulpinilor Cdiphtheriae netoxigene implicate in diverse afectiuni (vezi Capitolul 23) (3) Metode conventionale de tipizare la C.diphtheriae. Sunt realizate de catre Centrul National de Referinta ~i numai in scop epidemiologic. • Lizotipia are la baza fenomenele de lizogenie ~i de specificitate a receptorilor fata de anumiti bacteriofagi. Folosind schemele de tipizare originala ~iaditionala lizotipia stabile~te sursa de infectie, delimiteaza focarul ~i relatiile dintre focare, identifica tipul epidemiogen. In perioadele interepidemice metoda este utila pentru stabilirea unor tipuri fagice in cadrul unui biotip de Cdiphtheriae predominant in teritoriu. Este un test accesibil in conditiile unor preparate fagice cu titruri optime de lucru; nu necesita echipament sau reactivi speciali. (4) Diagnosticul si supravegherea microbiologica moleculara a difteriei • Diagnosticul molecular Corynebacterium diphtheriae este 0 specie heterogena aIcatuita din popuJarii bacteriene nepatogene ~i populatii patogene. Microo~ganismele nepatogene devin virulente ca unnare a lizogenizarii cu un bacteriofag, purtator al geneIor structurale care codifica sinteza toxinei difterice. Studiile de genetica moleculara au demonstrat ca tulpinile de C diphtheriae sunt capabile de lizogenizare cu corynefagi Wox+,CDtox+~i/sau yox-. lntegrarea cOlynefagilor in cromozomul bacterian se realizeaza printr-un mecanism de recombinare situs-specifica, in regiunea attB (bacterial attachment site). C diphtheriae prezinta pe cromozom doua situsuri attB (attBl ~i attB2), regiuni genomice cu 0 omologie de 120 pb Intre ele ~i de 96 pb cu situsul de ata~are al bacteriofagului (attP). Bacteriofagii ~tox+sau CDto'~se pot insera in unul sau in ambele situsuri, rezuItilnd tulpini dublu sau chiar triplu lizogene. Capacitatea de toxigeneza este dependenHi de numarul de bacteriofagi integrati in cromozomul bacterian, de fenomenele de recombinare dintre ace~tia, de secventa genei structurale (dtox), secventa genei reglatoare (dtxR), factorii externi care actioneaza fie la nivelul genei structurale fie al celei reglatoare, etc. Pot apare astfel tulpini hiperproductive (PW8) sau tulpini care produc cantitati foarte mici de toxina, sub limita de sensibilitate a testului ELEK. Un numar din ce in ce mai mare de tulpini netoxigene au fost izolate, in ultimii ani, din cazuri de boala (afectiuni sistemice sau difteria-like). Studiile genetice au evidentiat prezenta in genomul acestora a genelor codante pentru toxina difterica Intr-o forma criptica. Aceste tulpini, denumite NTTB (non toxigenic toxin bearing) functioneaza ca rezervor de gene dtox care pot fi exprimate sub actiunea unui presor selectiv sau prin reversie spontana. Tehnica peR a fost utilizata pentru identificarea tulpinilor toxigene, precum ~i pentru confirnlarea tulpinilor ELEK negative izolate din cazuri de boala. Metoda a intrat 636

in rutina de laborator ~i face parte dintre testele incluse in controlul extern de calitate organizat la nivelul Re!elei Europene de Supraveghere a Difteriei (DIPNET) ~ia Grupului European pentru Diagnosticul de Laborator al Difteriei (ELWGD), grupuri tematice din care face parte ~i Romania. Metoda, standardizata, utilizeaza pentru amplificare doi primeri cu omologie pe secven!a nucleotidica a regiunii genomice care codifica pentru sinteza subunitatii A a toxinei difterice. Reac!ia este validata cand se amplifica un fragment de 248 nucleotide, fa!a de un martor intern ~i martori externi reprezentati de 0 tulpina sigur pozitiva, 0 tulpina sigur negativa ~iun control de reac!ie reprezentat de apa . • Tiparea moleculara Puterea de discriminare a metodelor conven!ionale utilizate in studiile epidemiologice ale tulpinilor de C. diphtheriae este limitata, mai ales in cazul re-emergen!ei sau raspandirii unor tulpini toxigene rezistente la actiunea litica a bacteriofagilor sau cu un spectru de sensibilitate atipic, dar identic. De asemenea, circulatia aceluia~i tip fagic in diverse regiuni ale lumii sau in acela~i areal 0 perioada indelungata (ani) de timp, necesita utilizarea metodelor genetice de analiza in vederea stabilirii inrudurii epidemiologice dintre acestea. Sondele nucleotidice au fost utilizate pentru studiul profilului de restrictie al ADN total pentru diferite secven!e de interes. Astfel au fost create sonde pentru identificarea fragmentelor de restric!ie pe care sunt localiza!i bacteriofagii ~, gena structural a dtox, gena reglatoare toxR, sirusurile attB, etc. Elementele de insertie (IS), segmente de ADN transpozabil, cu capacitatea de a se ins era in diferite locusuri pe cromozomul bacterian, au fost detectate la C. diphtheriae mai intai in bacteriofagii y, recunoscu!i ca fiind incapabili sa converteasca la toxigeneza tulpinile netoxigene de C. diphtheriae. Studiile ulterioare au demonstrat ca secventa respectiva se insera in interiorul genei dtox ~ieste responsabila de fenotipul netoxigen al bacteriofagului. Tulpinile inrudite epidemiologic prezinta un numar identic de c6pii IS cu aceea~i localizare pe cromozom, in timp ce tulpinile mra legatura epidemiologica pot prezenta un numar diferit de c6pii ale acestuia, integrat in diferite situsuri pe cromozom. Ribotipia, definita ca profilul de restriqie al genelor care codifica sinteza ARN ribozomal (rARN), este metoda eu cea mai mare stabilitate ~i reproductivitate. Aceste proprieta!i se bazeaza pe faptul ca ARN ribozomal este ancestral, universal distribuit, aparent neexpus transferului, cu cea mai mare parte a structurii primare constanta, ceea ce-i confera functionalitate constanta. Aceste proprietati fac ca moleculele de rARN sa fie considerate "cronometre moleculare" in studiile taxonomice, filogenetice ~i epidemiologice. Metoda a fost utilizata in multe laboratoare pentru studiul clonalitatii tulpinilor izolate in diferite regiuni ale lumii. Au fost utilizate sonde diferite, iar profilurile au fost notate GI_n pentru biotipul gravis, M1_n pentru biotipul mitis sau Cd1_n, penhLl Corynebacterium gjphtheriae. Laboratoarele membre ELWGD, care dispun de tehnologia necesara, s-au mobilizat intr-o activitate de armonizare a ribotipiei utilizand tehnica de digestie cu BstEII ~i hibridizare cu 0 sonda alcatuita din 5 oligonucleotide marcate cu dig oxigen ina (5 oligo mix). Imagine a TIFF a membranelor de hibridizare sau profilul de restriqie exprimat in greuta!i moleculare au fost expediate la lnstitutul Pasteur Paris unde au fost introduse intr-o banca de date. Acestea au fost analizate, prelucrate ~i publicate sub forn1a unei nomenclaturi interna!ionale, bazata pe originea geografica a tulpinilor tip pentru fiecare 637

ribotip. Ribotipia a devenit astfel metoda moleculara standard utilizata in explorarea epidemiolopgica a focarelor de difterie din epidemia care a evoluat in anii '90 in fostele tari sovietice, dar ~i a cazurilor izolate raportate in diferite alte tari. Profilul de macrorestrictie in camp pulsator (PFGE) a fost utilizat in studiul tulpinilor izolate din recenta epidemie de difterie din fostele tari sovietice, pentru evaluarea persistentei unei clone intr-o regiune geografica sau pentru identificarea importului de tulpini in tari in care difteria este bine controlata prin vaccinare. Metoda, bazata pe digestia in situ a ADN total cu SfiI, a fost evaluata pe tulpinile izolate din epidemia din Rusia. De~i recunoscuta ca avand 0 putere inalta de discriminare, pe aceste tulpini nu a fost eficienta, nereu~ind sa distinga intre cele doua ribotipuri epidemice. RAPD (random amplified polymOlphic DNA), metoda PCR in care sunt utilizati primeri universali, scurti, de obicei alcatuiti din 10 nucleotide, a fost utilizata ca metoda moleculara de discriminare intre tulpini apartinand aceluia~i lizotip sau ribotip. Metoda, folosind primeri "in house" sau kit RAPD comercial, a fost utilizata cu rezultate bune ~i pentru discriminarea intre tulpinile de C. diphtheriae circulante in Romania, tulpini netipabile sau apartinand aceluia~i lizotip. Metoda este rapida, amplificarea putandu-se realiza pe lizat celular ~i pretabila standardizarii cand se lucreaza cu kit comercial, conform instructiunilor produciltorului. SSCP (Single Strand [;,Ol~formational£olymOlphism) este 0 altil metoda de tipare moleculara bazata pe PCR, utilizata cu succes in diferentierea tulpinilor, mai ales a celor netoxigene purtatoare de gene dtox. Metoda consta din ruperea legaturilor de H dintre cele doua lanturi de ADN ~i separarea lor prin electroforeza in gel nedenaturant de poliacrilamida. Metoda este capabila sa identifice polimorfismul produ~ilor de PCR detectand mutatiile punctiforme. Intr-un studiu pe tulpini izolate din Rusia ~i Ucraina in timpul epidemiei de difterie, utilizandu-se 12 seturi de primeri, 8 pentru amplificarea genei structurale dtox si 4 pentru amplificarea genei reglatoare dtxR, au fost identificate 6 patternuri dtox si 12 patternuri dtxR. In 2003 secventa completa a tulpinii epidemice de C. diphtheriae biotip gravis, ribotip Sankt- Petersburg (NCTC 13129) a fost publicata (http://www.genedb.org/). Aceasta a rucut posibila imaginarea ~i dezvoltarea unor metode bazate pe secventiere ~i tehnica microarray, mult mai specifice, reproductibile, pretabile la construire de bi'inci de date care pot fi accesate prin internet. Difteria ramane 0 amenintare pentru sanatatea publica, cazuri fiind inca raportate in unele tari NIS (New Independent States). Un control eficient al acesteia se poate realiza numai printr-un sistem international de supraveghere capabil sa monitorizeze cu acuratete riscul raspfmdirii tulpinilor patogene. Genotiparea, prin metode armonizate la nivel global, permite identificarea focarelor care raman netipate prin metode traditionale, detecteaza importul de tulpini toxigene, descrie dinamica diseminarii epidemiilor, pern1ite identificarea tulpinilor la nivel infraclonal prin detectarea ~i monitorizarea unor evenimente genetice la nivel de nucleotid. 30.1.8.2 Identificarea definitiva a bacililor corineformi izolati din diferite sindroame eUnice, altele decat difteria. Laboratoarelor de referinta Ie este accesibila schema lilrgita recomandata de CDC dar la nivelul unui laborator clinic se poate obtine o identificare corecta cu un minimum de teste (tabel 30-6). Caracteristici ca forma a coloniei, pigmetatie, prezenta hemolizei, sunt de asemenea utile pentru identificarea lor. 638

Tabe130-6

-+vv:::l+ -~ --+ ~ -.., + v V -V N N (+) (+) -vv "0 -u v 0 ;;; -0+ V '0 + N ~ >~ 'c: ::J -;;; (+)b "0 (v) (+) B '~ (v) '0 >~ ~ '1S 0: 'N ~ (+) ~ 'E

6

Caractere diferentiale ale altor specH din genul corynebacterium '" 0 ~ >~ N + N X N .e Producere acid din: -;;; ~ 2u.. ::C 0...

:;.:u

• sllbsp. afermentans

"Simboluri:

+ = mai mult de 90% din tulpini pozitive; - = mai mult de 90% din tulpini negative; v = variabil (+) reactie pozitiva lenta 'Pigmentogeneza: galben - C. falsenii,C. lipophiloflavum, C. sanguinis roz - C. macgin1ey negru - C. nigricans b

639

Lipofilia poate sa fie determinata prin subcultivarea coloniilor in agar sange si in agar sange suplimentat cu 0,1-1 % Tween 80. Testul CAMP este efectuat cu tulpina de Staphiloccocus aureus B hae7l1olitic (ATCC 25923); reactia pozitiva este indicata prin cre~terea efectului hemolitic al tulpinii de stafilococ, avand ca rezultat 0 hemoliza completa in forma de sageata (fig. 30.22 plan~a color). Testele de fermentare pot fi efectuate pe mediul Hiss cu indicator Andrade suplimentat cu 1-2 picaturi de ser de iepure in cazul unor specii (c.jeikeium, C. matruchotii). Poate sa fie utilizat ~i sistemul comercial API CORYNE, rezultatele fiind evidentiate in 24-48 ore de la incubare. Cu to ate avantajele pe care Ie of era acest sistem standardizat de identificare, exista in prezent un numar variabil de tulpini neidentificate apanimlnd un or grupuri de corineformi CDC sau unor specii neincluse in baza de date. De aceea, pentru definirea corecta la nivel de gen ~i specie sunt necesare investigatii chemotaxonomice accesibile numai unor laboratoare de referinta.

30.1.9. Scurta caraeterizare a speciilor de COIynebacterium eu interes medical, altele dedit C. diphtheriae (1) COlynebacterium accolens. Descrisa in 1991 ca bacil corinefonl1, C.accolens prezinta satelitism fata de coloniile de stafilococ; este specie lipofila. Unele tulpini nu prezinta acest fenomen, dar cre~terea lor este stimulata prin adaos de ser la mediile de cultura. Coloniile sunt convexe, netede, mici « 0,5 mm pe agar-sange). Toate tulpinile reduc nitratii, dar comportamentul lor biochimic este diferit. Reactia pirazinamidazei este variabila ~i negativa pentru fosfataza a1calina pennitand diferentierea de tulpinile corineforme CDC grup G al carol' aspect morfologic ~i biochimic este similar. Este implicata in endocardite la pacienti cu factori predispozanti. (2) Corynebacterium afermentans. Este 0 specie care prezinta doua subspecii lipophilum ~i afermentans, anterior inc1use de CDC in grupul ANF I. Fenotipic, ambele subspecii pot sa fie diferentiate prin marimea coloniei. Pe agarsange-ser, dupa incubare 24 ore la 37°C, subsp. afennentans dezvolta colonii de 1-2 mm albicioase, convexe, cu margini regulate, untoase, iar subsp. lipophilum - colonii gri de 0,5 mm. Daca agarul sange este suplimentat cu 1% Tween 80 este stimulata dezvoltarea subspeciei lipophilum (colonii de 2-3 mm). C.afermentans, subsp. afermentans poate sa fie diferentiat de C.auris prin consistenta coloniilor (C.auris aderent de agar) ~ide Iotitidis prin aspectul morfotinctorial (Iotitidis - celule lungi). De asemenea, aproximativ 60% din tulpini prezinta reactia CAMP pozitiva. Ambele subspecii sunt catalazo-pozitive, ureazo-negative, nu reduc nitratii ~i nu fennenteaza carbohidratii. Sunt sensibile la antibiotice B lactamice. (3) Corynebacterium amycolatum de~i este specie care nu contine acizi micolici, studiile filogenetice (secventa genei ARNr 16S) au demonstrat relatii stranse cu genul Corynebacterium. Microscopic apare ca bacili corinefOTIl1ipleomorfi, gram-pozitivi, a~ezati sub f0TI11a de V, de "litere chineze~ti" sau izolati. Tulpinile tipice de C. amycolatum formeaza colonii de 1-1,5 mm dupa 24 ore de incubare la 37°C., gri-alb, cu contur crenelat, uscate ..

640

Fig. 30.2 - Corynebacterium diphtheriae gravis: eolonii pe mediul Gundel·Tietz.

Fig 30.3 - COIynebacterium diphtheriae intermedius: eolonii pe mediul Gundel-Tietz.

Fig 30.4 - Corynebacterium diphtheriae mitis: colonii pe mediul Gundel-Tietz.

Fig 30.5 - Corynebacterium pseudodiphtheriticum: eolonii pe mediul Gundel-Tietz.

Fig. 30.6 - Corynebacterium diphtheriae formeaza pe mediul Tinsdale eolonii negre eu halou bnm.

Fig 30.7 - Corynebacterium pseudodiphtheriticum, ea ~i alji baeili difterimorfi, formeaza pe mediul tins dale colonii negre lara halou.

Fig. 30.8 - Corynebacterium diphtheriae gravis: colonii pe agar-sange.

Fig. 30.9 - Corynebacterium diphtheriae gravis atipic: cultura pe agar-sange.

Fig. 30.10 - Corynebacterium ulcerans: colonii pe agarsange.

Fig. 30.11 - CO/ynebacteriumjeikeium: sange.

cultura pe agar-

>

"

.~...•

I'

Fig. 30.12 - Corynebacterium jeikeium este 0 specie lipofila; cultura pe agar EHI; prezen!a Tween 80 (dreapta) stimuleaza semnificativ dezvoltarea coloniilor.

Fig. 30.13 - Corynebacterium diphtheriae mitis: mOffologia pe frotiu din cultura colorat Gram.

:='

:g. 30.14 - Corynebacterium diphtheriae gravis: morfologia pe frotiu din cultura colorat Gram.

Fig. 30.15 - Corynebacterium ulcerans. morfologia pe frotiu din cultura colorat Gram; observa\i aspectul cocoid.

t

q 't&.

;0. ..-t"

f ••••• , 'i t •• ~.JSJi

.g. 30.16 - CO/ynebacterium pseudodiphtheriticum: ::-~.)rfologia pe frotiu din culturii.; observati aspectul maciucat al bacililor.

Fig. 30.17 - Corynebacterium xerosis: morfologia pe frotiu din cultura colorat Gram; observati aspectul mii.ciucat al bacililor.

Fig. 30.21 - Testul Elek.

Testele de baza pentru identificarea C. amycolatum sunt indicate in tabelul 30-6. :\u poate sa fie identificat prin sistemul API CORYNE datorita variabilitatii reactiilor Jiochimice $i absentei datelor de baza din sistemul comercial. Datorita morfologiei coloniilor $i similaritatii reactiilor biochimice de triaj, poate sa fie confundat cu C.xerosis, dar $i cu C.striatum ori C minutissimum. Diferentierea se face prin unnatoarele reactii: C.amycolatum $i C. minutissimum nu cresc la 20°C, spre deosebire de C.xerosis $i C. striatum; C. xerosis nu fennenteaza glucoza la 42°C, celelalte Treispecii 0 fermenteaza. Diferentierea de ultimele doua specii se poate face $i pe aspectul coloniei: uscata la C. amycolatum, umeda la C. striatum $i C. minutissimum. Este izolat de pe tegumentul persoanelor sanatoase $i frecvent, din prelevate clinice umane. A fost recunoscut ca agent cauzal al unor endocardite la pacienti cu proteze yalvulare. (4) COlynebacterium

appen dicis. A fost izolat de la bolnav cu apendicita acuta complicata cu abces abdominal. Pe Columbia agar suplimentat cu 5% sfmge, la 48 de ore incubare la 37°C, se dezvolta sub forma de colonii mici, uscate, de culoare cenu$ie, nehemolitice. Colonii mai mari sunt obtinute prin cultivare pe agar cord-creier sau agarTripticaz-soia suplimentate cu 1% Tween 80. Contine acid mezo-diaminopimelic, galactoza $i arabinoza. Sunt prezenti acizii micolici, iar continutul G + C este 65,8 mol%. Este specie lipofila, ureazo-pozitiva, pirazinamidaza pozitiva. Produce acid din glucoza ~i maltoza dupa 7 zile de incubare la 37°C. (5) COlynebacterium argentoratense. A fost propus ca specie in genul COI)'nebacterium pe baza analizei peretelui celular, a continutului in acizi micolici, $i a raportului G+C. Izolat din faringe ar putea sa fie implicat in etiologia unor angine. Microscopic apare ca un corineform tipic. Coloniile pe agar-sange sunt colorate in crem, nehemoiltice, $i ating 2 mm diametru dupa 24-48 ore de incubare la 3 TC. Este catalazo-pozitiv, ureazonegativ $inu reduce nitratii. Fennenteaza glucoza, dar nu zaharoza. Fem1entarea glucozei de ciitre c.argentoratense este rapida, spre deosebire de C.coyleae care 0 fennenteaza lent. Diferentierea de alte specii 0 fac acizii micolici. Este singura specie cu relevanta medicaHi care prezinta activitate a a-chemotripsinei. (6) Corynebacterium auris. Este 0 specie derivata din grupul de corinefonni CDC ANFI. A fost izolata intr-o infectie oculara la copil $i de la pacienti cu otite acute $i cronice, de$i rolul acestora in patogenia otitelor medii este inca neclar. Coloniile de C. auris sunt nehemolitice, au aderenta redusa la agar, devin galbene in timp $i ajung la diametrul de 1-2 mm, dupa 48 ore de incubare la 37°C. Reactiile biochimice sunt asemanatoare cu ale C.afermentans, subsp. afermentans, dar speciile se pot diferentia prin culoarea coloniei: albicioase la C.afermentans $i absenta aderentei. Toate tulpinile de C.aUl'isau testul CAMP pozitiv. Sunt sensibile la antibiotice B-lactamice. (7) COIynebacterium atipicum. Recent introdusa ca specie in cadrul genului COl)'nebacterium, este numita atipicum datorita absentei acizilor corinemicolici. Este facultativ anaerob, catalazo- pozitiv. Coloniile sunt punctifonne, convexe, stralucitoare, albe, nehemolotice. Este specie non-lipofila, pirazinamidaza negativa; produce acid din glucoza, maltoza, zaharoza $i riboza. Este ureazo-negativa, nu reduce nitratii. Pe baza caracterelor fenotipice, prezentei acidului mezo-diaminopimelic $i studiilor filogenetice (secventa genei ARNr l6S), a fost clasificata ca 0 noua specie in cadrul genului. 641

(8) CO/ynebacterium confusum. A fost izolat de la pacienti cu infeqii ale piciorului si din hemocultura. Coloniile sunt albicioase, lucioase, convexe, cremoase, avand un diametru de 1,5 mm dupa 48 de ore de incubare la 37°C. Se dezvolta rapid in conditii de anaerobioza, spre deosebire de producerea de acid din glucoza care este lenta ( vizibila dupa 48-72 ore pe API CORYNE). Daca fennentarea glucozei este negativa, tulpinile de C.confilsum pot sa fie confundate cu C.propinquum. In contrast cu aceasta specie. C. confusum nu hidrolizeaza tirozina. De asemenea, c.cOl~rusum este diferentiat de C.coyleae ~i c.argentoratense prin abilitatea de a reduce nitratii. Tulpinile sunt sensibile la penicilina, maj oritatea cefalosporinelor (cefotaxim. ceftriaxon), aminoglicozidice, tetracicline, quinolone (ciprofloxacin, oxacilin). (9) CO/ynebacterium coyleae. Izolat in cultura pura din lichidul pleural de la bolnavi cu sist~m imunitar deficitar, din hemoculturi si din tractul genito-urinar. Coloniile sunt circulare, convexe, luciose, cu consistenta cremoasa; la 24 ore dupa incubare la 37°C diametrul coloniei este de 1mm. Producerea lenta de acid din glucoza ~i reactia CAMP intens pozitiva sunt cele mai semnificative caracteristici fenotipice. Tulpinile sunt sensibile la ampicilina, ceftriaxon, cefuroxim, cloramfenicol, ciprofloxacin, eritromicina, oxacilina. tetraciclina. (10) CO/ynebacterium durum. Este specie frecvent izolata din faringele persoanelor sanatoase, dar si din tractul respirator. Este non-lipofila, f0l111eaZacolonii de 0,5-1 mm diametru dupa incubare 72 de ore in aerobioza. Coloniile sunt bej, cu suprafa rugoasa, cu margini neregulate, putemic aderente de agar. Microscopic apare sub fomla de bacili lungi, filamentosi, aspect intiUnit numai la specia c.matruchotii. Tulpinile reduc nitratii, unele hidrolizeaza lent ureea ~iesculina. Se diferentiaza de c.matruchotii prin femlentarea galactozei ~iuneori a manitolului. Potentialul patogenic al speciei C.durum nu este inca clarificat. (11) Corynebacterium falsenii. Tulpinile de Cfalsenii au fost izolate numai din zone considerate sterile. Coloniile sunt albicioase, netede, lucioase, cu un diametru de 1-2 mm dupa 24 de ore de incubare la 37°C. Dupa 72 de ore, prezinta pigment galben care se intensifica. Aceasta pigmenare nu a mai fost observata la nici 0 alta specie nonlipofila izolata din prelevate clinice, cu exceptia C.sanguinis si C.xerosis (rareori). Cele mai importante caracteristici biochimice sunt producerea de acid din glucoza (lent), reaqia pirazinamidazei ~i hidroliza ureei (slab pozitiva). (12) Corynebacterium glucuronoliticum este 0 specie definita in 1995. Fiind izolata din infectii genito-urinare, a fost numita de unii autori C.seminale. Aceasta specie face probabil parte din flora genito-urinara la biirbati, fiind incerta prezenta la femei. Microscopic, este asemanatoare cu alte specii de CO/ynebacterium. Se dezvolta pe agar-sange-ser, dupa 24 ore de incubare la 37°C, sub forma de colonii alb-galbui, nehemolitice, convexe cu diametrul de 1-1,5 mm. Remarcabila este insa variabilitatea reactiilor biochimice de identificare (tabel 30-6). Cand ureaza este prezenta, testul pe mediul Christensen se pozitiveaza dupa 5 min. la temperatura camerei. C.glucuronoliticum este una dintre putinele specii patogene pentru om care hidrolizeaza esculina; toate tulpinile prezinta reactia CAMP pozitiva. Cu exceptia unor tulpini la care fosfataza alcalina este pozitiva C.glucuronoliticum poate sa fie corect identificat prin sistemul API CORYNE. 642

Poate sa detem1ine prostatite ~i uretrite. Este sensibilIa gentamicina, rifampicina ~_yancomicina, dar 0 proportie relativ mare de tulpini sunt rezistente la ciprofloxacin, ~:indamicina, eritromicina ~i tetracic1ina. (13) Corynebacterium imitans. Singura tulpina descrisa de Cimitans a fost izolata i~la un copil din Romania, suspect de difterie faringiana. Tulpini cu acelea~i caracteristici fost izolate ~i de la contactii adulti care au prezentat aceleasi simptome de difterie :"iringiana. Este primul caz bine documentat de transmitere directa a unei specii de COlJlne~acterium, alta dedit Cdiphtheriae. Coloniile sunt alb-gri, luciose, cu marginile circulare, :u diametrul de 1-2 mm ~i consistenta cremoasa.Tulpina nu a produs halou caracteristic -=,emediul Tinsdale, dar a fost telurit reductaza pozitiva. Activitatea pirazinamidazei ~i :ermentarea zaharozei a fost lenta. Datorita acestor caracteristici diagnosticul microbiologic initial a fost de Cdiphtheriae atipic sau Cminutissimum. Investigatii biochimice ~ichemotaxonomice precum ~i studiile filogenetice (secventa genei ARNr l6S), au iemonstrat ca tulpina izolata apartine genului Corynebacterium, fiind definita ca specie c.:..:

::loua.

COlynebacteriu/11 jeikeium este considerat, dupa C. diphtheriae. cea mai importanta specie cu relevanta medicala. Caracterizat initial ca difteroid asociat cu endocardite bacteriene post-chirurgie cardiaca, in prezent este implicat in infectii cu localizare diversa: pneumonii, abcese pulmonare, osteomielite, artrite post-aliroplastii, infectii cutanate. Aproximativ 25% din persoanele cu infectii determinate de C jeikeilllll prezinta fie leziuni cutanate localizate injurul defectelor tegumentare, fie eruptii papulare pe fa!a, trunchi sau la nivelul extremitatilor in caz de septicemie. Factorii predispozanti pentru aceste infectii inc1ud: spitalizare ~i antibioterapie prelungita, neutropenie, deficien!e tegumentare post catetere vasculare sau determinate de actul chirurgical. Sunt citate infec!ii nosocomiale la persoane imunocompromise (afectiuni hematologice sau neoplazice, chimioterapie indelungata, transplante osoase, SIDA). Cjeikeium este gram-pozitiv, pleomorf, cu aspecte de cocobacili scurti sau bacili lungi, ocazional maciucati ~i dispu~i in forma de V sau palisade, imobili. Cultura se dezvolta pe agar-sange la temperatura de 30°_42° C (nu la 20°e). Pe agar -sange dupa 18-24 ore de incubare in atmosfera de 5-10% CO? coloniile de C.jeikeium sunt alb-gri, mici (0,5-1 mm), cu suprafata neteda, nehemolltice (fig. 30-11 - vezi plan~a color). Fiind specie lipofila, pe mediu solid cu lecitina ~i Tween 80 coloniile sunt alb-gri, mai mari (2-4mm) , inconjurate cu halou difuz (fig. 30-12 - vezi plan~a color). Se dezvolta ~i in bulion cord-creier suplimentat cu 1% Tween 80. Testele negative pentru reducerea nitratilor ~ihidroliza ureazei, producerea de acid din glucoza, uneori din maltoza, ~i rezistenta la antibiotice sunt caracteristici principale pentru diagnosticul de specie. C jeikeium nu produce acid din fructoza spre deosebire de tulpinile apartinand grupului CDC G. Majoritatea tulpinilor de Cjeikeium izolate au fost sensibile la vancomicina, dar rezistente la cele mai multe din antibioticele utilizate in tratamentul infeqiilor cu bacterii gram-pozitive. (15) COlynebacterium kroppenstedtii. Este 0 specie noua, izolata din sputa unui bolnav cu infeqie pulmonara. Coloniile sunt cenu~ii, translucide, uscate ~iau un diametru mai mic de 0,5 mm dupa 24 ore de incubare la 37°C. Este 0 specie lipofila ~i face parte din putinele specii de Corynebacterium cu relevanta medicala care hidrolizeaza esculina. (14)

643

Nu prezinta acizi micolici. Poate sa fie diferetiata de Cdurum, Cmatruchotii prin aspectu morfologic al coloniilor ~i de C.glucuronolyticum aHh prin aspectul coloniilor, cat ~. prin reactia CAMP negativa. (16) COlynebacterium.lipophilojlavum. Este reprezentat de 0 singura tulpina care a fost izolata de la 0 pacienta cu vaginita bacteriana. Prezinta ace1easi caracteristici biochimice cu Curealyticum, exceptand reacti::. ureazo-negativa ~i prezenta coloniilor pigmentate in galben intens. In contrast cu celc mai multe tulpini de Curealyticum, tulpina de Clipophiloflavum nu este rezistenta I::: antibiotice. (17) Corynebacterium macginley este 0 specie lipofila, imobila cu pleomorfisn; accentuat. Pe mediu suplimentat cu 0,1% Tween 80, unele tulpini de C macginleJ1iproduc colonii pigmentate roz. Este catalazo-pozitiv, reduce nitratii, nu produce ureaza ~i nic pirazinamidaza; fermenteaza glucoza ~i zaharoza, ce1e mai multe tulpini fermenteaza ~. manitolul. Toate tulpinile izolate au fost larg sensibile la antibioticele uzuale. (18) CO/ynebacterium matruchotii , numit anterior Bacterionenza matruchotii. fost izolat din cavitatea bucala de 1aom ~i animale. Aspectul gram-pozitiv este neobi~J1Ui: 1a acest bacil p1eomorf cu dispozitie caracteristiea in "maner de bid", rezultata pri]; ata~area unui singur bacil1a extremitatea unei fom1e filamentoase. Fennenteaza glucoza. maltoza ~i zaharoza. Nu fennenteaza galactoza, caracter diferential de Cdurwn. (19) COlynebacterium minutissimum desclis initial ca agent etiologic al eritrasmei. in prezent poate sa fie implicat in abeese severe de san, peritonita la bolnavi eu dializt peritoneala, septicemii la pacienti eu leucemie mieloida, endoeardite. Este un baci: corinefom1 dispus izolat sau sub fonna de V, in palisade sau "litere chineze~ti". Coloniile sunt alb-gri, eonvexe, eireu1are, cu margini regulate, cu suprafata umeda, lucioasa. examinate la microscopul cu fluorescenta apar portocalii. De~i C minutissirnwn este similar biochimic cu C xerosis se poate diferentia uneori prin testu1 de redueere a nitratilor. negativ la prima specie, pozitiv la a doua. In eadrul speciei au fost descrise doua biotipur diferentiate prin eapaeitatea lor de a fermenta zaharoza. Un numar redus de tulpin: produc acid din manitol ~i au reactia CAMP pozitiva. (20) CO/ynebacterium mucifaciens. Un numar de 8 tulpini apartinand specie. Cmucifaciens au fost izolate in eultura pura, din lichid sinovial ~ihemoculturi. Colonii!::: acestor tulpini prezinta un diametru 1-1,5 mm, dupa 24 de ore incubare la 37°C, iL atmosfera suplimentata cu 5 % CO2; sunt stralucitoare, u~or galbui, cu aspect mucoid Coloniile par sa fie mai putin mucoide dupa incubare de 96 ore. Prin microscopia electronica se evidentiaza filamente fine pana la filament-: electrono-optice care conecteaza celulele adiacente. Nu se cunoa~te structura acestoL filamente, dar probabil sunt alcatuite din polizaharide care pot reprezenta un factor de virulent a a~a cum a fost demonstrat la Rhodococcus equi. C mucifaciens produce constant acid din glucoza, dar productia de acid din zaharoz~ este variabila. De asemenea, produce acid din glicerol, fructoza ~i manoza, caractere care permit diferentierea de tulpinile de R.equi. Din totalul acizilor gra~i evidentiali. acidul tuberculostearic reprezinta 1-2% (aspect rareori intalnit la speciile non-lipofile de Corynebacterium). Toate tulpinile de Cmucifaciens sunt sensibile la vancomicinii. cloramfenicol ~i penicilina. ~c

644

(21) COlynebacterium nigricans. A fost izo1at din tractu1 urogenital feminin . .~.l]oritatea tulpinilor izo1ate au avut ca sursa complicatii ale sarcinii, inc1uz[md aVOliul '~:man, na~tere prematura ~ireducerea volumului de lichid amniotic; 0 tulpina a provenit ::::.rr-un ulcer vaginal. Este 0 specie catalazo-pozitiva, cu aspect tipic de corine/orm. ~Jloniile sunt mici, uscate, aderente de suprafata agarului; produc pigment negru pe -=.;ar-sangedupa 24-48 ore de incubatie la 35°C. Este ureazo-negativ, nu reduce nitra!ii, :-.-1 hidrolizeaza esculina. Fem1enteaza glucoza, maItoza ~i tardiv zaharoza. (22) Corynebacterium propinquum. Denumit anterior COlynebacterium grup ANF3 -=. cost izolat din sputa, nasofaringe, hemocultura. Este implicat in aparitia unor endocardite :=-·Jstproteze valvulare) ~i infectii respiratorii. Coloniile de pe agar-siinge-ser sunt albe, ~J suprafata mata, nehemolitice, cu diametrul de 1-2 mm la 24 ore de incubare la 3 ]0e. '=:stecatalazo-pozitiv, ureazo-negativ, nu fenneteaza carbohidratii. Fenotipic poate sa ::~ diferentiat de C pseudodiphtheriticum care are acela~i tip de reactii biochimice, prin :~actia ureazei care este pozitiva. Capacitatea sa de a reduce nitratii, 11diferentiaza de C. afermentans. (23) Corynebacterium pseudodiphtheriticum este a doua specie dupa C. jeikeium ::nplicata in endocarditele determinate de corinebacterii. Recent, a fost semnalat ~i ca -=.gentetiologic al unor traheite necrozante, bron~ite, traheobron~ite sau pneumonii, factorii :iworizanti fiind afectiunile maligne, diabetul zaharat, intubatia endotraheala. Are as?ect de bacili scurti, ascutiti, a~ezati in palisade, intens gram-pozitivi, tara corpusculi metacromatici. Pe mediile cu telurit produce colonii cenu~ii, care, prin invechire devin negre, loarte asemanatoare cu cele ale C. diphtheriae tip mitis; pe agar-sange coloniile sunt albicioase; nu produce halou pe mediul Tinsdale. Este cistinaza-negativ, nu fermenteaza ;::arbohidratii, reduce nitratii ~i produce ureaza. Unele tulpini hidrolizezaza tirozina. (24) Corynebacterium pseudotuberculosis determina limfadenita cazeoasa, ruberculoza la oi ~i limfagita ulcerativa la cai. In patologia umana este mentionat extrem de rar drept cauza a unor limfadenite granulomatoase supurative la persoane in contact direct cu animale. Microscopic apare gram-pozitiv la limita cu fom1e scurte cocale sau cocobacilare. Pe mediile de cultura se dezvoIta cu intarziere, cre~terea fiind stimulata de lipide. Pe agar-sange coloniile sunt mai mici, albe, friabile, inconjurate cu 0 zona de ~-hemoliza. Pe mediul Tinsdale coloniile sunt negre, cu tendinta la halou; pe Gundel-Tietz, coloniile sunt negre, mici, tip mitis. Fennenteaza glucoza, maItoza, dextrina; nu fem1enteaza glicogenul, zaharoza ~i trehaloza. Produce cistinaza, este ureazo-pozitiv ~i pirazinamidaza-negativ (tabe130-3). Are ca factor de virulenta fosfolipaza D cu actiune specifica asupra sfingomielinelor ~i lizolecitinelor. De~i peste 10% din tulpinile de C. pseudotuberculosis pot sa produca 0 toxina difterica identica cu toxin a produsa de C. diphtheriae ~i C. ulcerans ca efect al lizogenizarii experimentale cu fag difteric, nu au fost semnalate pana in prezent cazuri de difterie datorate acestei specii. (25) COlynebacterium riegelii. Este specie non-lipofila, izolata din urina (> 105 CFU/ml) unor pacienti cu infectii urinare. Coloniile sunt albicioase, stralucitoare cu 645

diametru de 1,5 mm dupa 48 ore de incubare la 37°C. Unele colonii au consistenT3. cremoasa, altele sunt lipicioase. Este intens ureazo- pozitiv (1n 5 minute la temperatura camerei, pe mediu Christensen). Fermenteaza lent maltoza, nu fermenteaza glucoza. (26) COlynebacte,:ium. sanguinis. Este 0 specie nou definita, izolata din hemocultura. Coloniile sunt galbene, cu suprafa!a neteda, cu diametrul de 1,5 mm la 48 ore dupa incubare la 37°C. Cele mai reprezentative caractere fenotipice sunt: producerea de acid din glucoza, dar nu din maltoza ~i zaharoza ~i prezen!a acidului tuberculostearic (2-3 %). C.sanguinis se diferen!iaza de C.coyleae prin reacTia CAMP negativa, de Cfalsenii prin absen!a ureazei ~i de C.confusum prin producerea de pigment galben ~i incapacitatea de a reduce nitra!ii. (27) Corynebacterium singulare. Doua tulpini de C.singulare au fost izolate din hemoculturi ~i lichid seminal. Coloniile sunt circulare, convexe, cu l11arginiregulate ~i consisten!a cremoasa, caracteristici similare cu cele observate la C.minutissimum ~i C.striatum. Exceptand testul ureazei (pozitiv la C singulare) toate reaqiile biochimice principale sunt asel11anatoare cu ale speciei Cminutissimum. Csingulare poate sa fie diferen!iat de C.minutissimum numai prin testarea utilizarii un or surse de carbon ca: D-turanoza si N-acetil-D-glucozal11ina. (28) COlynebacterium striatum. lzolat ini!ial din nasofaringe ~i din laptele vitelor cu mastita, a fost identificat ulterior ~i din hemoculturi, sputa, aspirat bron~ic (la bolnavii cu infec!ii p~1l110nare obstructive), lichid peritoneal, conjunctiva, etc. Coloniile sunt ini!ial mici dar dupa 48-72 ore de incub are la 3rC au un dial11etrude la 1-2 mm.; sunt convexe, cu 0 tenta galbena, suprafa!a neteda, consisten!a mucoasa ~i uneori sunt hemolitice. C.striatum fennenteaza glucoza, dar producerea de acid din zaharoza este variabila. Tulpinile de C. striatum reduc nitra!ii (excep!ie purine tulpini) ~i hidrolizeaza tirozina. Unele tulpini au reaqia CAMP pozitiva. Este considerat ca agent patogen al unor infec!ii variate: endocardite, pneumonii, peritonite, sinovite septice cu artrite. Tulpinile identificate sunt sensibile la vancol11icina, al11piciIina, ~i cefalosporine, dar rezistente la cIindal11icina, eritrol11icina, tetraciclina, fosfomicina. (29) COlynebacterium sundsvallense. A fost propus ca specie in cadrul genului Corynebacterium pe baza caracterelor fenotipice, prezen!ei acidului l11ezo-diaminopimelic, acizilor micolici si a raportului G + C. Microscopic, apare ca bacili gram-pozitivi. pleol110rfi l11aciucati. Coloniile acestei specii non-lipofiIe sunt galben inchis sau u~or galbui, sunt aderente de agar ~i au consisten!a vascoasa. Fennenteaza glucoza, maltoza. zaharoza ~i sunt ureazo-pozitive. Tulpinile au fost izola!i din hel110culturi ~i din secreti; vaginale. (30) COlynebacterium.thomssenii. Este 0 specie non-lipofiIa izolata repetat din acela~i prelevat, de la un pacient cu pleurezie. Se dezvolta lent, sub fonna de colonii cn diametrul < 0,5 mm dupa 48 ore de incubare la 37°C. Dupa 96 ore coloniile sunt vascoase ~i u~or aderente de agar. Produc lent acid din gIucoza, l11altoza ~i zaharoza. (31) Corynebacterium ulcerans, este a doua specie recunoscuta drept cauza a difteriei. Obi~nuit, este un patogen la animale, avand rela!ii filogenetice stranse atat CL C. diphtheriae, cat ~i cu C. pseudotuberculosis. 646

Aspectul microscopic este de cocobacil gram-pozitiv la limita, eu granula!ii ~i colorabilitate asemanatoare cu ale bacilului difteric. Pe mediul Tindsdale, C. ulcerans produce colonii cu halou cafeniu iar pe mediul Gundel- Tietz coloniile sunt negre, lucioase, de tip intermedius sau au un aspect de margareta, tip gravis. Pe agar-sange coloniile sunt asemanatoare cu ale C. diphtheriae gravis ~i prezinta 0 zona redusa de hemoliza (fig. 30-10 vezi plan~a color). C.ulcerans produce cistinaza, ureaza, fosfataza, fennenteaza glucoza, dextrina, maltoza ~i variabil glicogenul (Tabelul 30-3). Exista astfel doua tipuri fennentative: gravis (glicogen pozitive) ~i intermedius (glicogen negative). Nu hidrolizeaza pirazinamidaza, nu reduce nitra!ii in nitri!i; unele tulpini lichefiaza gelatina la 25°C, dar nu la 35°C. C. ulcerans poate sa fie diferen!iat de C. diphtheriae prin activitatea ureazei ~i prin reaqia CAMP revers pozitiva. Datorita capacita!ii sale de lizogenizare cu fagi purtatori de gena tox+ C.ulcerans produce doua toxine: una identic a cu toxina difterica ~i 0 fosfolipaza D raspunzi'itoare de leziunile ulcerative caracteristice. Tulpinile toxinogene de C. ulcerans pot sa produca cazuri tipice de difterie, cu fonnare de pseudomembrane ~i leziuni toxice la nivelul miocardului sau sistemului nervos central sau forme asemanatoare numite diphtherialike .C.ulcerans netoxigen a fost asociat cu granuloame necrotice, noduli pulmonari la persoane imunocompromise ~i faringite acute. Ca urmare a impliciirii acestei specii in aparitia difteriei , supravegherea circulatiei tulpinilor C. diphtheriae ~i C. ulcerans in teritoriu constituie obiectivul principal al Retelei Europene de Supraveghere a Difteriei (DIPNET) (32) COlynebacterium urealyticum~ considerat ca agent etiologic al unor infeqii urinare acute sau cronice, C. urealyticum poate sa fie uneori asociat cu baeteriemie, osteomielite ~i infecTii ale !esuturilor moi. Cauzeaza cistita alcalina incrustata, factorii favorizan!i fiind: procedurile urologice, infec!ii urinare anterioare, varsta peste 65 ani. Frecventa de izolare a acestei specii este uneori dificila, datorita aspectului morfologic de corinefonn care poate determina interpretarea falsa de contaminant, sau datorita timpului indelungat de dezvoltare pe mediile de cultura, dupa 48-72 ore de incubare. Este un baeil corineform dispus in fonna de V sau palisade. In culturi batrane predomina aspectul coeal. Pe agar-sange-ser, dupa 48 ore de incubare la 37°C in atmosfera cu 5% CO2 se dezvolta sub fomla de colonii albicioase, punctifonne, netede, nehemolitice, convexe, aspect caracteristic tuturor speciilor lipofile. C.urealyticum este catalazo-pozitiv, nu reduce nitra!ii. Absen!a fermentarii zaharurilor ~i producerea de ureaza sunt caractere metabolice care il diferen!iaza de C.jeikeium. Fiind sensibilIa vancomicina~i uneori la penicilina, rezistent la majoritatea antibioticelor ~-lactamice, clindamicina, eritromicina, gentamicina, tratamentul de electie pentru infeqiile urinare cu C. urealyticum este vancomicina. (33) Corynebacterium xerosis este comensal comun, colonizeaza tegumentele, nasofaringele ~isacul conjunctival. Ocazional, determina infec!ii, in specialla imunodeficien!i. Este sensibilIa penicilina, cefalosporine ~i vancomicina, dar rezistent la ampicilina. 647

Microscopic, C. xerosis este asemiinator cu C. striatum: bacili gram-por pleomorfi, miiciucati, colorati neregulat cu aspect barat. Coloniile de C. xerosi, ,,_initial mici, dar dupii 48-72 ore de incubare pe agar-sange ajung la circa 2 mm dian~::-'_ Coloniile adeviirate de C. xerosis pot avea tentii galbenii sau galben-bronzat, sunt U5~c;::: cu suprafatii granulara sau punctiforme, translucide; nu produc halou pe mediul Til15cc; : Fennenteaza glucoza ~izaharoza, nu produce ureazii ~ise deosebe~te de C.stri,;' prin reactia de fennentare a maltozei, care este pozitiva.

BIBLIOGRAFIE AHMED, K, KAWAKAMI, K: Corynebacterium pseudodiphtheriticum: Clin Infect Dis. 20 : I: 41-46. AUZIAS, A., BOLLET, C. : Corynebacteriwnfreneyi 41 : 6 : 2777-2778.

a respiratory tract pathogen.

i : ~_:

becteriemia, (2003), Journal of Clinical Microbic' -, :

BABAY, A.H.H., Pleural effusion due to Corynebacterium propinquum in a patient with squamous. e carcinoma, (2001), Annals of Saudi Medicine. 21 : 5-6:337-339. BARRETT, R.L.S., COOKSON, T.B. : Diversity within reference strains of Corynebacterium maTruc includes Corynebacterium durum and a novel organism, (200l), Journal of Clinical Microbic; 39 : 3 : 943-948. BASHISTH, M., DIGNAN. J.R. : Corynebacterium diphtheriae endocarditis - surgery for some but IW:, (2005), Asian Cardiovasc Thorac Ann. 13 : 119-126. BELKUN, A. DNA Fingerprinting of Medically Important Microorganisms by Use of PCR. (1994). C Mirobiol. Rev, 7, 2,174-184. BERNARD, A.K, MUNRO, C. : Characteristics of rare or recently described Corynebacterium spe_ -: recovered from human clinical material in Canada, (2002). J0U111alof Clinical Microbiology. 11: 4375-4381. BIBHUTI, B.D., SCHNELL, P. : Corynebacterium pseudodiphtherticum bacteremia in an Immunocompe:-:' adolescent: a case report and review of literature, (2003), Eastern Journal of Medicine. 8 : 1 : 18, _BOSSHARD, P.P., ABELS, S.: Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic gram positive fc: in the clinical laboratory (anI8-month evaluation), (2003), Journal of Clinical Microbiology. 41. 4134-4140. BRUNE, 1., BRINKLOLF, K. : The individual and common repertoire of DNA- binding trans-criptio;'. regulators of Corynebacterium efficiens, Corynebacterium diphtherieae and Corynebacteriumjeikl'i-, deduced from the complete genome sequences, (2005), BMC Genomincs. 6 : 86 BRDssow, R., CANCRAYA, c.: Phages and the evolution of bacterial pathogens: from GenOlL. rean'angements to lysogenic conversion, (2004), Microbiology and Molecular Biology Reviews. :-. : 3 : 560-602. CIANCIOTTO, NP., GROMAN, NB.: Characterization of bacteriophages from tox-containing, non-toxiger. isolates of Corynebacterium diphtheriae. (1997), Microb. Pathog. CIANCIOTTO, NP., SERWOLD-DAVID, T: DNA sequence homology between {wB-related sites:' Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium glutamicwn and tr.e auP site of gama-corynephage. (1990), FEMS Microbiol. Leu, 54, (1-3), 299-301. CLAEYS, G., VANHOUTEGEM, R. : Endocarditis of native aortic and mitral valves due to Corynebacteriu' accolens : report of a case and application of phenotyoic and genotypic techniques for identificatio-. (1996), Journal of Clinical Microbiology. 34 : 5 :1290-1292. CLARRIDGE, J.E., POPOVIC, T. : Diphtheria and other corynebacterial and coryneform infections, (1998 Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infection ninth edition Leslie Collier, Albert Balow' 3: 19: 347-371.

648

COLLINS, M.D., BERNARD, K.A. : Corynebacteriwn sundsvallense sp.nov., from human clinical specimens, (1999), International Journal of Sistematic Bacteriology. 49: 2 :361-366. CONNOR, M.K, QUIRIE, M.M. : Characterization of United Kingdom isolates of Corynebacterium pseudotuberculosis using pulsed-field gel electrophoresis, (2000), Journal of Clinical Microbiology. 38: 7 : 2633-2637. DAMIAN, M.,GRIMONT,F.,STRAUT, M., DIACONESCU, A. si col. : Study of COIJ'nebacterium diphtherieae strains isolated in Romania, northwestern Russia and the Republic of Moldova. (2002),Res.Microbiol. 13 :99-106 DAMIAN, M.,USEIN, CR., DIACONESCU, A. si col.:Molecular characterisation of nontoxigenic dtoxgene bearing corynebacteria strains. Romanian J Genetics,( 2005), 1, 1, 15-22. DESSAU, B.R., BRANDT-CHRISTENSEN, M. : Pulmonary nodules due to COI)'nebacteriwn ulcerans, (1995), Eur. Respir. J., 8 : 651-653. DEVRIESE, A. L., RIEGEL, P. : Identification of Corynebacterium glucuronlyticum strains From the urogenital tract of humans and pigs, (2000), Journal of Clinical Microbiology. 38 : 12 : 4657-4659. DOMINQUEZ-GIL, B., HERRERO, J.e. : Ureteral stenosis secondary to encrustation by urea-splitting COI)'nebacterium urealyticum in a kidney transplant patient, (1999), Nefrol Dial Transplant, 14 : 977-978. EFSTRATIOU, A., ENGLER, KH., ZOYSA, A.: Diagnosis and Epidemiology of Diphtheria. Methods in Molecular Medicine,( 1998), vol. 15, ed. N. Woodford, A.P. Johnson Humana Press Inc. Totowa. NJ. EFSTRATIOU, A., GEORGE, R.C. : Laboratory guidelines for the diagnosis of infections caused by COIJ'nebacteriulIl diphtherieae and C. ulcerans, (1999), Commun. Dis. Public Healts, 2 : 4 : 250. ENGLER, KH., EFSTRATIOU, A. : Immunochromatographic strip test for rapid detection of diphtheria toxin: description and multicenter evaluation in areas of low and high prevalence of diphtheria. (2002), J. Clin. Microbiol. 40 : 1 : 80-83. ENGLER, KH .. GLUSHKEVICH, T. : A modified elek test for detection of toxigenic coryne bacteria in the diagnostic laboratory, ( 1997), Journal of Clinical Microbiology, 35 : 2:495-498. FARAJ, S., FRENCH, G. : Septic arthritis due to a toxigenic strain of Corynebacterium diphtheriae grm'is. (2003), J. Of the New Zealand Medical Association, 116 : 1172 : 35-36. FERREIRA CAMELLO, T.C., MATTOS-GUARALD, AL. : Nondiphtherial COI)'nebacrerium spp. isolated from clinical specimens of patients in a university hospital, Rio de Janeiro, Brasil. (2003), Braz. J. Microbiol.. 34: 1 . FUNKE, G., LAWSON, P. A. : COIJ'nebacteriwn lIlucifaciens sp. nov., an unusual species from human clinical material, (1997), International J. of Sistem. Bacter., 47: 4 : 952-957. FUNKE, G., PAGANO-NIEDERER, M. : Corynebacteriullllllacginley has to date been isolated exclusively from conjunct. swabs, (1998), J. Clin. Microbiol., 36 : 12: 3670-3673. FUNKE, G., EFSTRATIOU, A : Corynebacterium imitans sp. nov., isolated from patiens wits suspected diphtheria, (1997), Journal of Clinical Microbiology, 35 : 8 : 1978-1983. FUNKE, G., HUDSON, R. A. : Corynebacteriumlipophilo/lavulIl sp. nov., isolated from a patient with bacterial vaginosis, (1997), FEMS Microbiol, Len .• 150: 2: 219-224. FUNKE, G.• RAMOS. e.P.: Corynebacteriulll coyleae sp. nov., isolated from human clinical specimene. (1997). Int. J. Of Sistematic Bacteriology. 47 : 1 : 92-96. FUNKE, G., OSORIO. T. R. : Corynebacterium confusulll sp.nov., isolated from human clinical specimens. (1998), Int. J. Of Sistematic Bacteriology. 48: 1291-1296. FUNKE, G., LAWSON, P. A. : Heterogeneity within human-derived centers for disease control and prevention (CDC) coryneform group ANF- 1 Like bacteria and description of COI}'nebacteriulll auris sp. no1'.. (1995), Int. J. Of Sistematic Bacteriology. 45: 4: 735-739. FUNKE, G., LAWSON, P. A.: Corynebacterium riegelii sp. nov., an unusual species isolated from female patients with urinary tract infections, (1998), Journal of Clinical Microbiology, 36: 3 : 624-627. FUNKE,G.,BERNARD.K.,Coryneform gram-positive rods, Manual of Clinical Microbiology (1999) ,21 :319345.

649

FURUMOTO, A, MASAKI, H. : A case of community-acquired pneumonia caused by COI)'nebacteriv propinquum. (2003), Kansenshogaku Zashi, 77 : 6 : 456-460. GARRITY, G.M., BELL, lA. : Taxonomie Outline of the Prokalyotes Bergey's Manual of Systemat;. Bacteriology, (2004), Second edition, 224. GRAEVENITZ, AWe., COYLE, M.B. : COI)'nebacteria and rare coryneforms, (1999) In L.Collier. _~. Balows, M. Sussman(eds) Op.Cit. 2:536-548. Genus Corynebacterium. 25 : 536. GRIMONT, P.A.D., GRIMONT, F et al. International nomenclature for Corynebacterium diphtheri«(o ribotypes. (2004),Res. Microbial, 155, 162-166. HALL, V., COLLINS, M.D. : COI)'nebacteriwn atipicwn sp. nov., from a human clinical Source. does nc' contain corynomycolic acids, (2003), Int. J. of Syst. and evo!. Microb., 53 : 1065-1068, HAUSER, D., POPOFF, MR.: Polymerase Chain Reaction Assay for Diagnosis of Potentially Toxinogeni, COI)'nebacterium diphtheriae Strains: Correlation with ADP-Ribosylation Activity Assay.( 1993 J. Clin. Microbiol, 31, 10,2720-2723. HOLZMANN, D., FUNKE, G. : Turicella otitidis and Corynebacterium auris do not cause otitis media wit1effusion in children, (2002), The Pediatric Inf. Dis. Journal, 21: 12: 1124-1126 HUNOLSTEIN, e., ALFARONE, G. : Molecular epidemiology and characteristics of CorynebacterillF' diphtherieae and Corynebacterium ulcerans strains isolated in Italy during the 1990s, (2003). J. Med. Microbio!., 52: 181-188. IZURIETA, S.M., : Exudative pharyngitis possibly due to COI)'nebacterium pseudodiphtheriticum. a Ne'.'. Challenge in the differential diagnosis of diphtheria, (1997), Emerging Infectious Diseases. 3: 1 . KANUNGO, R., VIJAYALAKSHMI, N. : Diphtheria due to non-toxigenic COI)'nebacterium diphtheriae ,'., report of two cases, (2002), Indian J. of Med. Microbiology, 20 :1: 50-52. KEMP. M., HOLTZ, K. : Demonstration by PCR and DNA sequnging of Corynebacrerizll." pseudodiphtheriticum a cause of joint infection and isolation of the same organism from a surface swap specimen from the patients, (2005), J. Med. Microbiol., 54 : 689-691. KNOX, K.L., HOLMEZ, AH. : Nosocomial endocarditis caused by Corynebacterium amycolafllm anci other nondiphtheriae corynebacteria, (2002), Emerging infectious diseases 6 : I : 97-99. MARSTON, K. C., JAMIESON, F. : Persistence of a distinct Corynebacterium diphtherieae clonal grour within two communities in the United States and Canada where diphtheria is endemic. (200 I). 1. ot Clinical. Microbiology, 39: 4 : 1586-1590. MARTARESCHA, C., FOURNIER, P.E. : A case of Corynebacterium pseudodiphtheriticll/n nosocomial pneumonia, (2000), Emerging infectios diseases, 5 : 5 . MARTIN, M.e., MELON, O. : Septicaemia due to COI)'nebacterium striatum: molecular confirmation of entry via the skin, (2003), Journal of Medical Microbiology, 52 : 599-602. MIKUCKA, A.,: Znaczenie Corynebacterium sp ..w zakazeniach szpitalnych, (2003), Post. Mikrobiol. 42 : 4: 403-418. MINKIN, R, SHAPIRO, J.M. ; Corynebacterium afermentans lung abscess and empyema in a patient with human ill1Jl1'll1odeficiency virus infection. (2004), Southern Medical Journal Abstract, 97 : 4 : 395. MOKROUSO'., 1., NARVSKAYA, 0.: Efficient Discrimination within a Corynebacterium diphtheriae epidemic Clonal Group by Novel Microarray-Based Method. (2005), J. Clin.Microbiol .. 43,4. 16621668. NAKAO, H., PRUKLER, JM, eta!. Heterogeneity of Diphtheria Toxin Gene, tox and Its Regulatory Element. dtxR, in Corynebacterium diphtheriae Strains Causing Epidemic Diphtheria in Russia and Ukraine. (1996), J. Clin. Microbiol, 34,7,1711-1716. NAKAO, H., POPOVIC, T.:Use of Random Amplified Polymorphic DNA for Rapid Molecular Subtyping of Corynebacterium diphtheriae. (1998), Diagn. Microbiol. b(fect. Dis, 30. 167-172. NIETO, E., VINDEL, A. : Biochemical, antimicrobial susceptibility and genotyping studies on COI)'nebacteriul1l urealyticul1l isolates from diverse source, (2000), Journal of Medical Microbiology. 49: 759-763.

650

OLIVE, M.D, BEAN, P. Principles and Applications of Methods for DNA-Based Typing of Organisms. (1999), J. Clin. Microbiol, 37, 6, 1661-1669. PATEYO., BIMET, E:Clinical and Molecular Study of Corynebacterium diphtheriae Systemic in France. (1997), J. Clin. Microbiol, 15, 2:441-445. POPOVIC,T., MAZUROVA, LK, EFSTRATIOU, A.: Molecular Epidemiology of Diphtheria. Infect. Dis181 (supp!. 1), SI68-177. RAPPUOLI, R.,GROSS,R.,Att.Sites, Tox Gene, and Insertion Elements as Tools for Diagnosis and

Microbial Infections (2000). 1. Molecular

Epidemiology of Corynebacterium diphtheriae.Gene Probes for bacteria,( 1990),Academic Press.lnc. RAPPUOLI, R., RATTI,G:. Physical map of the chromosomal region of Corynebacterium diphtheriae containing corynephage attachment sites attBI and attB2.( (1984), J. Bacteriol, 158. 1:325-330. RAOULT, D.,FOURNIER.: What does the future hold for clinical microbiology? (2004), Nature Rev. 2. 151-159. REGNAULT, B, GRlMONT, F, GRlMONT, P.A.D. Universal ribotyping method using a chemically-labelled oligonucleotide probe mixture.( 1997), Res. Microbioll48, 649-659. REYNOLDS, S.J., BEHR, M. : Turicella Otitidis as an unusual agent causing a posterior auricular abscess. (2001), Journal of Medical Microbiology, 39: 4: 1672-1673. RIEGEL, P., RUYMI, R. : Corynebacterium singulare sp. nov., a new species for urease-positive strains related to COIynebacterium minutissimum,(1997), International Journal of Systematic Bacteriology. 47 : 4 : 1092-1096. RIEGEL, P., REMY, H.:

COIynebacterium

durum sp. nov., from human clinical specimens,

(1997).

International Journal of Systematic Bacteriology, 47 : 4 : 1107-1111. RIEGEL, P., RUYMI, R. : CO/ynebacterium argentoratense sp.nov., from the human throat (1995). International Journal of Systematic Bacteriology, 45 : 3 : 533-536. RIEGEL, P., de BRIEL, D. : Taxonomic study of CO/ynebacterium group ANF - I strains: Proposal of Corynebacterium afermentans sp.nov., containing the subspecies C. afermentans subsp. aferme1/tans subsp. novo and C. afemzentans subsp. lipophilum subsp. nov., (1993), International Journal of Systematic Bacteriology, 43 : 287-292. SEWELL, D.L., COYLE, M. B. : Prosthetic valve endocarditis caused by COI)'nebacteriul11 aferl11entans subsp. lipophilum (CDC coryneform group ANF - 1), (1995), Journal of Clinical Microbiology, 33 : 3 : 759-761. SHUKLA, S.

K,

VEVEA, D. N. : Isolation and characterization of a black-pigmented COIynebacterium sp. from a woman with spontaneous abortion, (2001), Journal of Clinical Microbiology. 39: 3: 1l091113.

SHUKLA, S. K, BERNARD K A. : COIynebacteriul11 nigricans sp. novo : proposed name for a blackpigmented COIynebacteriwn species recovered from the human female urogenital tract, (2003), Journal of Clinical Microbiology, 41 : 9 : 4353-4358. SIMONET, M. ,DE BRIEL, D.: Corynefonn bacteria isolated from middle ear fluid, (1993), Journal of Clinical Microbiology, 31 : 6 : 1667-1668. TITOV, L., KOLODKINA, V. DIACONESCU,A., si col. : Genotypic and phenotypic characteristics of Corynebacterium diphtheriae strains isolated from patiens in Belarus during an epidemic period. (2003),Journal of Clinical Microbiology, 41 : 3 : 1285-1288. YASSIN, A.E, STEINER, U. : COIynebacterium appendicis sp. nov., (2002), International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52 : 26 : 1165-1169. ZASADA, A.A., ZALESKA, M. : The first case septicemia due to nontoxigenic CO/ynebacterium diphtheriae in Poland: case report, (2005), Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 4 : 8 . WAUTERS, G., VAN BOSTERHAUT, B. : Identification of Corynebacterium amvcolatum and other nonlipophilic fermentative corynebacteria of human origin, (1998), Joumal of Clinical Microbiology. 36: 5 : 1430-1432.

651

30. 2. IDENTIFICAREA

BACILILOR CORINEFORMI DIFERITI

DE CORYNEBACTERIUM (CARMEN • Arcanobacterium • Arthrobacter • Brevibacterium • CellulOlnonas • Cellulosimicrobium ·Oerskovia

pA.NZARU) • Dennabacter • Leifsonia • Aureobacterium • Microbacterium • Rothia • Turicella

Genul ARCANOBA CTERIUM In faza exponentiaIa a culturii apar ca bacilli subtiri, neregulat calibrati. Pot avea

capete maciucate ~idispunere in V. Progresiv, in faza stationara, se segmenteaza in bacili scurti ~i forme cocale. Indiferent de varsta sunt gram-pozitivi, neacido-rezistenti ~i nu fonneaza endospori. Facultativ anaerobi. Cultiva sarac pe agarnutritiv. Cre~terea, optima la 37°C, este stimulata prin suplimentarea mediului cu sfmge sau ser ~i atmosferei cu CO2, Toate speciile sunt f3-hemolitice, caracter favorizat de sangele de cal, iepure sau om ~i atmosfera imboga!ita cu CO2, Speciile cu interes medical sunt imobile, catalazonegative ~i degradeaza carbohidratii fennentativ. Genul Arcanobacterium regrupeaza chemotaxonomic acum ~iactinomycete (e.g., A. bernardiae, A. pyogenes). Dintre cele ~ase specii ale genului, trei pot fi izolate din prelevate patologice umane: A. haemolyticum, A. bernardie, A. pyogenes. Omul gazduie~te ocazional A. haemolyticum (faringe, tegument) ~i A. bernardie (mai frecvent pe tegument). In tractusul gastro-intestinal prezenta lor este intamplatoare. A. pyogenes este gazduita pe mucoasele vitelor, oilor, porcilor. Arcanobacterium haemolyticum a fost implicat in etiologia unor faringite, asociat Staphylococcus ~i Haemophilus ilifluenzae in infectii ale plagilor chirurgicale sau cu alte bacterii in infectii ale plagilor traumatice, iar asociat cu Fusobacterium intr-o infeqie fulminanta tubo-ovariana. Incidenta faringitelor cu Arcanobacterium haemolyticum este apreciata la 0,5%, dar cre~te pana la 2,5% in grupa de varsta 15-18 ani. Majoritatea evolueaza cu angina eritemato-pultacee, ocazional pseudomembranoasa ~i se insotesc relativ frecvent cu adenite submaxilare, laterocervicale ~i eruptii cutanate uneori de tip scarlatiniform, care ajung pana la descuamare, alteori urticariene sau eritem multifoI111. La aproximativ jumatate din pacienti Arcanobacterium haemolyticum poate fi asociat cu S. pyogenes. Deci, principala problema in diagnosticul faringitei cu Arcanobacterium haemolyticum este diferentierea de infectia streptococica ~i de difterie. A. bernardie se poate asocia cu bacterii anaerobe in abcese. A. pyogenes poate cauza la am supuratii cutanate, subcutanate, faringite, otite medii, uretrite, cistite. Conditia microbiologica a exsudatului faringian impune pentru izolarea Arcanobacterium haemolyticum utilizarea unor medii selective. Au fast propuse: 652

• Medii selective prin antibiotice: mupirocin 8 flg/mL, aztreonam 4 flg/mL, amfotericina B 1 flg/mL sau colistin 8,8 flg/mL, acid oxolinic 5 flg/mL, mupirocin 8 flg/mL. • Mediu selectiv prin concentratie finala de 3,5% NaCl. Aceste suplimente selective trebuie aditionate la 0 baza nutritiva corespunzatoare: agar (Columbia, tripticaza din soia etc) cu 5% sange de fibrin at de berbec sau cal. In cazul altor prelevate 0 epuizare ingrijita a probei este suficienta. Culturile pe agar-sange, in atmosfera cu 5-10% CO2 trebuie unnarite pana la 48 de ore dnd: • Coloniile de Arcanobacterium haemolyticum ating diametrul de 0,5 mm, sunt circulare, discoide, f:)-hemolitice, usor opalescente, stralucitoare, untoase. Dupa indepartarea cu ansa sub colonie poate fi observata 0 denivelare cu opacifierea mediului. • A. bernardie formeaza colonii sticloase, albe, mai mici de 0,5 mm. Unele sunt cremoase, altele vascoase. • Coloniile de A. pyogenes sunt cele mai mari dintre speciile genului ~ 1 mm, ~i cu cea mai ingusta zona de hemoliza. Identificarea prezumtiva 0 facem pe baza caracterelor de cultivare pe agar-sange, morfotinctoriale, imobilitatii (la 22°C ~i 37°C), testului catalazei negativ (exceptional slab pozitiv) ~i testului CAMP inversat. Testele definitive de identificare sunt incluse in tabelul 30-5. GenulARTHROBACTER Parcurge un marcant ciclu bacili-coci. In faza exponentiala, bacili rectangulari, se dispun in V ori in structuri unghiulare mai complicate datorita ramificarii primare, dar nu ajung la micelii pentru ca lipsesc ramificarile secundare. In faza stationara (~ 2-7 zile) bacilii se fragmenteaza in coci, de ~ 0,6-1,0 /-!mdiametru, dispu~i izolati, in perechi sau gramezi neregulate. Cocii reinsamantati in mediu proaspat reiau ciclul morfologico In ambele faze ale ciclului sunt gram-pozitivi, dar se decoloreaza u~or. Sunt neacidorezistenti. Nu fonneaza endospori. Fonnele bacilare ale unor specii sunt mobile, obligat aerobi, cu metabolism oxidativ, produc in cantitati reduse sau deloc acid ~igaz din glucoza ~i alti carbohidrati pe medii cu peptona. Catalazo-pozitivi. Genul Artrhrobacter cu cele peste 20 de specii ale sale este relativ neomogen a~a cum 0 arata continutul in G+C ext ins intre 59-70%. Habitatul speciilor autentice de Arthrobacter este solul (intre cele mai frecvente izolate), apele de canal, namolurile active. Au fost izolate ~ide la pe~ti ori din profunzimea gunoiului de pasari. Specia cea mai frecvent izolata din produse patologice umane este A. cummisii. Izolatele cu semnificatie clinica lh om provin din infectii ale tractusului urinar, infectii de corp strain, bacteriemii. Cultiva optim la 25-30°C pe agar nutritiv suplimentat cu biotina ca unic factor de cre~tere. Pe mediile agarizate f0TI11eaZain 24 ore colonii de ~2 mm diametru, alb-cenu~ii, u~or lucioase, cremoase. A. cummisii, f0TI11eaZacolonii mai mici ~i vascoase. Arthrobacteriile sunt fenotipic asemanatoase brevibacteriilor, dar cultura lor nu degaja miros de branza. Testele pentru identificarea definitiva a genului Arthrobacter sunt sugerate in tabelul 30-5. Pentru diferentierea speciilor sunt necesare testele de utilizare a carbohidratilor. 653

---------------------------

Genul BREVIBACTERIUM In culturile tin ere apare ca bacili neregulati, dispu~i izolati, in perechi ~i frecvent in V. Nu forrneaza micelii. In culturile batrane se fragmenteaza in mici coci. Sunt grampozitivi, dar se decoloreaza u~or. Sunt neacido-rezistenti. Nu fODl1eaziiendospori. Strict aerobi. Catalazo-pozitivi. Degradeaza carbohidra!ii oxidat}v - nu produc acid (sau doar uDl1e)din glucoza ori alti carbohidrati pe medii cu peptona. In contrast cu arthrobacteriile. brevibacteriile sunt imobile ~i halotolerante. Specii de Brevibacterium sunt frecvent izolate din produse lactate ~i de pe tegumentul uman (contribuie la mirosul neplacut al picioarelor). Peste 90% din izolatele argumentate cu semnificatie clinica la om sunt B. casei (bacteriemii, endocardite. peritonite de cateter, infec!ii de corp strain). Cultiva optim la 20-30DC sau ~ 37DC, functie de specie ~i tulpina. Dupa 24 ore de incubare coloniile ajung la 2 mm, sunt convexe, alb-cenu~ii, cremoase. Cultura degaja miros de branza. Coloniile de B. mcbrellneri tind sa aiba aspect granular. Pentru identificarea definitiva a brevibacteriilor sunt utile testele precizate in tabelu130-5. Genul CELLULOMONAS In faza exponentiala a culturii apar ca bacili subtiri, neregulati, drepti sau u~or incurbati, dispu~i in perechi sau V. Au ramificatii primare, dar nu f01111eazaniciodata micelii. Intrati in faza stationara devin din in ce mai scurti, chiar cu rare forme cocale. Frecvent mobili, monotrichi sau cu cativa flageli. Gram-pozitivi, dar se decoloreaza u~or. Neacido-rezistenti, nesporulati. Preferential aerobi; cre~tere saraca in anaerobioza. FODl1eazaacid din glucoza ~i aIti carbohidrati aerob ~i anaerob. Catalazo-pozitivi. Reduc nitratii in nitriti. Habiteaza solul ~i vegetalele in descompunere. Cellulomonas spp. cresc optim la 30DC pe medii cu peptona ~i extract de levura. Dupa 24 ore coloniile sunt rotunde, convexe, cremoase, cu diametrul de 0,5-1,5 mm. galbene. Cellulomonas hominis este singura specie implicata in infectii la om (infeqii ale plagilor, bacteriemii, meningite). Spre deosebire de celelate specii ale genului nu hidrolizeaza celuloza in testele uzuale. Genul CELLULOSIMICROBIUM Singura specie cu interes medical, C. cellulans a rezultat din reclasificarea chemotaxonomica succesiva. a Oerskovia xanthineolytica drept Cellulomonas cellulans apoi Cellulosimicrobium cellulans. Aspectul microscopic este de bacili imobili, gram-pozitivi, corineformi. Neacidorezistenti ~i nesporulati. Facultativ anaerobi. Coloniile galben palide au 1-2 ml11dupa 24 ore de incubare, sunt convexe, cremoase, ~i excaveaza agarul. Catalazo-pozitivi in aerobioza ~i negativi in anaerobioza. Au metabolism ferrnentativ. FODl1eaza acid din glucoza, l11altoza, zaharoza, xiloza. Hidrolizeaza xantina sau hipoxantina. Dau testul CAMP inversat. Habiteaza solul ~i vegetalele in descol11punere. 654

Genu! OERSKOVIA Formeaza hife vegetative cu diametrul de ~0,5 flm foarte ramificate ~i penetrante in mediu. Nu genereaza hife aeriene. Manipulate cu ansa, hifele se fragmenteaza in fonne cocoide ~i bacilare frecvent mobile. Pe frotiurile colorate Gram apar ca bacili corineformi ~i cocobacili gram-pozitivi in zona activa a talului ~i gram-negativi in eea batrana. Facultativ anaerobi. Catalazo-pozitivi in aerobioza ~i negativi in anaerobioza. Metabolizeaza glucoza oxidativ ~i fennentativ. Nu hidrolizeaza xantina sau hipoxantina (tabeluI30-5). Coloniile in varsta de 24 ore sunt galben palide, eonvexe, cu diametrul de 1-2 mm, cremoase. Unica specie cu interes medical este 0. turbata, prezenta in sol, plante in deseompunere, ape de canal, geluri din hidroxid de aluminiu. Ocazional a fost implicata in bacteriemii, endocardite, meningite, pionefroze, prineipalele conditii predispozante fiind cateterisme prelungite, protezarea valvulelor eardiace, traumatisme penetrante. Genu! DERMABACTER Bacili scurti, corineformi, imobili, gram-pozitivi, neacido-rezistenti, nesporulati. Facultativi anaerobi. Pe agar nutritiv formeaza colonii rotunde cu diametrul de 1-1,5 mm, albe cremoase uneori vascoase care pot fi confundate cu stafilocoeii coagulazo-negativi. Singura specie a genului, D. hominis, poate fi implicata in unele infectii ale plagilor ~i bacteriemii. Testele uzuale de identificare sunt prezentate in tabelul 30-5. Genurile LEIFSONIA ~i AUREOBACTERIUM Genul Leifsonia chemotaxonomic apartine mai mult actinomicetelor deeat corinebacteriilor. Singura specie cu interes medical este L. aquatica, fosta "COl)'l1ebacterium aquaticum". Apare ca bacili fini, neregulati, mobili, gram-pozitivi. Cultiva dupa 3-4 zile de incubatie ~ifonneaza colonii galbene. Este catalaza ~ioxidazo-pozitiva. Testele pentru identificare sunt prezentate in tabeluI30-5. Rar determina infectii ale tractusului urinal' ~i, mai frecvent, bacteriemii. Poate fi confundata cuAureobacterium spp, eventuali contaminanti tara semnificatie c1inici'i. Diferentierea 0 facem prin testarea fata de vancomicina: L. aquatica este rezistenta, iar Aureobacterium spp sensibile. Genu! MICROBACTERIUM Bacili fini, neregulati, dispu~i izolati, in perechi, in unghiuri. Nu fomleaza miceliu; chiar ramificarea primara apare rar. In culturile batrane sunt mai scurti, eu oeazionale fonne cocale, dar nu trec printr-un adevarat ciclu coci-bacili. Imobili sau mobili ,eu unul pana la trei flageli. Gram-pozitivi, neacido-rezistenti, nesporulati. Preferential aerobi, in anaerobioza cultura, daca apare, este saraca. Pe agar cu peptona, extract de levura ~i glucoza fonneaza colonii pigmentate in galben. Produce variabil catalaza. Metabolismul este primal' respirator, dar poate fi ~i slab fennentativ (tabelul 30-5). Prezent in produse lactate ~i ape reziduale, este bacteria corinefonna pigmentogena cel mai frecvent izolata in laboratorul clinic. A fost ocazional implicata in infectii ale plagilor, infectii de corpi straini, bacteriemii. 655

Genul ROTHIA Genul Rothia, inclus acum in familia Micrococcaceae are doua specii cu interes medical: R. dentocariosa ~i R. mucillaginosa (anterior Stomatococcus mucillaginosus i diferite microscopic: bacili corinefonni polimorfi, respectiv coei capsula!i. Pentru ca algoritmul identificarii incepe umal cu observarea caracterelor microscopice, am lasat R. mucillaginosa in capitoluI28.2. intre cocii gram-pozitivi. Rothia dentocariosa are aspect cocoid, bacilar ~i filamentos neregulat calibrat ~i extremita!ile evident maciucate. Cre~terea poate fi exclusiv cocoida (ca a culturilor din primele doua-trei zile in bulion), corinefonna, filamentoasa sau mixta. FOTI1lefilamentoase apar in culturile pe medii solide. Sunt gram-pozitivi, neacido-rezistenti, imobili. nesporulati, necapsulati. Facultativ anaerobi. Cresc optim la 35-37°C in atmosfera imbogatita cu CO2, Dupa 48 ore de incubare f0TI11eaZacolonii cu diametrul de 1,5-2 mm, albe pana la crem, S sau R, frecvent cu aspect de roata cu spite. Au consistenta moale, dar pot fi ~i uscate, srnrimicioase sau mucoide. Catalazo-pozitivi. Fennenteaza carbohidratii (tabelul 30-5). Rothia dentocariosa habiteaza natural cavitatea arala, placa dentara supragingivala. arofaringele. A fost implicata rar in etiologia unor endocardite ~i semnalata drept cauza de infectie abdominal a cu aspect de actinomicoza, abces pilonidal, infectie a unui chist maxilar. Genul TURICELLA A fost fonnat cu 0 singura specie, T otitidis izolata de la un pacient cu otita medie. Apare ca bacili relativ lungi, neregulat calibrati, imobili, gram-pozitivi, neacido-rezistenti. nesporulati. Dupa 48 ore de incuba!ie, coloniile sunt rotunde cu diametrul de 1-1,5 mm, albe, convexe, cremoase. Catalazo-pozitivi. Degradeaza carbohidra!ii oxidativ. Reactia CAMP pozitiva. Pentru diferentierea de al!i bacili corineformi sunt indicate testele precizate in tabelul 30-5. Sisteme comerciale de identificare a bacililor corineformi diferiti de COI:vnebacterium Sistemul API Coryne (bioMerieux) realizeaza 0 buna identificare pentru tori corinefonnii diferiti de Corynebacterium. Sistemul IDS RapID CB-Plus are incluse in baza de date: Brevibacteriul11, Cellulomonas. Cellulosimicrobium, Oerskovia ~iRothia dentocariosa. Microbacterium de~i este inclus in API Coryne necesita teste suplimentare (tabelu] 30-5) pentru diferentierea de Cellulomonas ~i ,J-eifsonia". Speeiile de Microbacterium produc acid din carbohidra!i oxidativ, fenomen care nu poate fi eviden!iat prin incubarea galeriei pentru 24 ore. Sensibilitatea la antibiotice Arcanobacterium haemolyticum este obi~nuit sensibilia toate clasele de antibiotice, incluzand peniciline, cefalosporine, macrolide ~ivancomicina, dar constant rezistent ]a sulfametoxazol-trimetroprim (Almuzara 2002). Unele tulpini sunt rezistente la tetracicline, macrolide, clindamicina ~i ciprofloxacin (Carlson 1999). 656

0. turbata ~i C. cellulans au sensibilitate variabila la antibiotice. De~i majoritatea tulpinilor sunt sensibile la penicilina, ampicilina, cefalotin, tetraciclinii, clindamicina, eritromicina, gentamicina, sulfametoxazol-trimetoprim, ciprofloxacina, au fost comunic:atetulpini rezistente la antibioticele mentionate. La 0. turbata a fost evidentiata rezistenta de nivel inalt la vancomicina ~i teicoplanina, explicata prin prezenta genei vanA similarii eu cea prezenta la Enterococcus jaecium. Funke G et al (1997) au izolat 0 tulpina de Microbacterium de la un pacient cu endolftalmita, sensibila la cefazolina, cefotetan, ciprofloxacina, imipenem, piperacilinii, teicoplanina ~i vancomicinii; rezistentii la gentamicina ~i tobramicina. Rothia dentocariosa este sensibila la toate clasele de antibiotice, de~i au fost izolate tulpini rezistente la f3-Iactamine prin producere de f3-Iactamaze codificate plasmidic. Turicella otitidis este sensibila la ampicilina, cefalosporine, ciprofloxacinii, gentamicina, rifampicina, tetracicline, cloramfenicol; unele tulpini sunt rezistente la clindamicina ~i eritromicina (Funke et ai, 1996). BIBLIOGRAFIE ALMUZARA, M.N., C. De MIER, C.M. BARBERIS (2002): Arcanobacterium haemolyticwn: Identification and susceptibility to nine antimicrobial agents.Clin.Microbiol.1nfect. 8:828-829. CARLSON, P., 1. KORPELA, M. WALDER, M. NYMAN (2002).: Antimicrobial susceptibilities and biotypes of Arcanobacterium haemolyticum blood isolates.Eur.J. Clin.Microbiol.1n(ect. Dis. 18:915917. FUNKE G., G. HAASE, N. SCHNITZLER et al (1997): Endolphalmitis due to Microbacterium species: Case report and review of Microbacterium infections. Clin. bifect. Dis. 24: 713- 716. FUNKE G., V. PUNTER, A. von GRAEVENITZ (1996): Antimicrobial susceptibility pattems of some recently established corynefonn bacteria.Antimicrob.AgentsChemotlw:

40:2874-2878.

30.3. IDENTIFICAREA BACILILOR GRAM-POZITIVI ENDOSPORULEAZA. AEROB (DUMITRU BUIUC, CARMEN PANZARU)

CARE

• Bacillus • Brevibacillus • Paenibacillus

30.3.1. Minidefinitie Acest vast grup bacterian ne obliga sa circumscriem definitia la speciile de Bacillus ~i genurile inrudite pe care Ie izolam in laboratorul clinic. Bacili gram-pozitivi, in culturi tinere, uneori gram-variabili sau gram-negativi, in culturile hatnine; sporulati; cei mai multi mobili prin flageli peritrichi. Aerobi sau facultativ anaerobi; uzual oxidazo-pozitivi ~i, cei mai multi, catalazo-pozitivi. Au evidentii diversitate a caracterelor fiziologice: specii mezofile, tennofile, psihrofile; alcalofile, acidofile; halotolerante sau halofile. 657

A~a am eludat, fara consecinte practice, noile specii de Bacillus greu de incadra: intr-o definitie pragmatica pentru activitatea laboratorului clinic: speciile strict anaerobe (B. infemus ~i B. arsiniciselenatis) sau cele la care nu au fost observati endospori (B. infernus, B. selenitireducens, B. subterraneus ~.a.).

30.3.2. Consideratii taxonomice Analiza secventiala a ARNr l6S a divizat clasicul gen Bacillus in 11 grupe, mai bine definite, cu rang de gen. Dintre aces tea cu interes medical sunt numai Bacillus. Paenibacillus ~i Brevibacillus. Alte 9 genuri de bacterii care endosporuleaza aerob m: deriva din genul Bacillus ~i sunt fara interes medical. Doar Sporosarcina ~i Geobacillus pot fi izolate ocazional din prelevatele examinate, dar fara semnificatie clinica. Bacillus anthracis, B. cereus $i B. thuringiensis sunt de fapt patotipuri de B. cereus. Didactic insa, pentru fluenta prezentarii, le acordam inca rangul de specii.

30.3.3. Habitat ~i implicatii in patologie Gratie rezistentei endosporilor aceste bacterii pot fi ocazional izolate din situsuri ambientale care sunt doar cai de transmitere. U~urinta transmiterii aerogene a endosporilor de B. anthracis i-au facut atractivi prentru acte de bioterorism. Bacillus anthracis este un patogen primar al ierbivorelor ~i ocazional al omului. Endosporii sai sunt vehiculati prin sol, furaje ~i produse animaliere (carcase, piei, lana. par, mina de oase). Speciile patogene pentru insecte sporuleaza in larvele acestora, dar B. thuringiensis. care imbolnave~te accidental ~i omul, poate sporula ~i pe plante sau in sol. Frecvem aceste specii sunt izolate din situsuri in care abunda larvele de insecte: canale de drenaj. sedimente din lacuri, ape de biiltire. Speciile putin pretentioase ca B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis cresc in solun sarace ~i contamineaza frecvent orezul, fructele uscate,etc. Specii mai putin pretentioase cum sunt Paenibacillus azotofixans ori P. maceram sunt asociate radacinii plantelor ~i solului adjacent. Speciile termofile, B. coagulans ~i Geobacillus stearothermophilus, sunt izolate din namoluri ca ~i din alimente supuse unei prelucrari tennice (zaharul din sfecla, conserve in 'cutii din tabla). Multe specii de Bacillus le regasim in microbiota indigena, rezidenta sau flotanta. a colonului. Implicatiile in patologia infectioasa actual a ale bacililor care endosporuleaza aerob sunt rezumate in tabelul 30-7.

30.3.4. Obtinerea culturii pure Mediile de baza pentru izolare speciilor de bacili gram-pozitivi care endosporuleaza aerob sunt agarul-sange sau agarul nutritiv. Izoliirile din prelevate contaminate impun controlul bacteriilor asociate. Fie tratam tennic sau cu alcool prelevate1e pentru omorarea fonnelor vegetative, fie utilizam medii selective. 658

++ +

Tabellil 30-7 Bacili care endosporuleaza

aerob implicati in patologia

infectioasa

umana actualii

++ + +I!II I I ii melanom IiI III ! i I ++++ +++ osteo+sau rezectie ! ++ Endoftalmita Baeteriemie Keratita Bacteriemii, septicemii ++++ Bactel'iemii, septicemii, endocardite, infectii respiratol'ii Frecventa" Infectii plagilor, endoftalmite bactel'iemii, septicemii, abcese Toxiinfectii alimental'e Entitiiti cIinice alemeningite, pliigilor, u~oare pima la severe, necl'otice endocardite, meningite, pseudotumori Bactel'iemii, septicemii, infectia pliigii opel'atorii dupii ! Specii ! ~ Sepsis, infectii ale plagilol', ale deII ~old de la I pl'otezelor +++ I I I I Bactel'iemii sau septicemii, inclusiv la toxicomani cu administrare II

I

,

i

[

I

a Indici de freeventii: + = 1-2 cazuri comunicate; ++ = > 2 comuniciil'i; +++ = mai multe cOl11uniciiri; ++++ = numeroase comuniciiri sau incidentii In prezent cul'entii.

Tratarea termidi: suspensioneaza prelevatul patologie in propoqie de 1:1 (greutate/ volum) in apa distilata steriIa. Mentine suspensia in baie de apa 10 minute la 80°C apoi epuizeaza 0,25 mL pe plaea de izolare. Termorezistenta variatii a sporilor un or speeii poate da rezultate fals negative la izoliiri din probele de mediu. lneonvenientul este evitat prin ineiilzire 15 minute la 62,5°C sau prin tratarea probelornumai eu alcool de 95°. 659

Tratarea cu alcool: suspensioneaza prelevatul patologic in prop011ie de 1:1 (greutate/volum) in etanol de 95° sau absolut, sterilizat prin filtrare, ~i men tine amestecul 3060 minute la temperatura camerei. Epuizeaza ca mai sus suspensia pe mediul de izolare. Medii selective. Sunt in uz mai multe formule de medii selectiv-diferentiale, care folosesc ca agent selectiv polimixina B (100 flg/mL), pentru izolarea ~i cuantificarea B. cereus. Pentru izolarea B. anthracis a fost propus mediul PLET (polimixina-lizozimEDTA-acetat de taliu) caruia i se poate asocia prealabil tratarea termica sau cu alcool a probelor hipercontaminate. Pe mediul PLET B. anthracis se dezvolta dupa 24-48 ore cu colonii mici, mai frecvent netede in timp ce alte specii de Bacillus sunt, in general. inhibate. Mediile de fmboga{ire, bulion nutritiv uzual sau bulion triptic de soia aditionat cu polimixina B (l00 flglmL), asociate cu tratamentul tennic al probelor (niciodata cu alcool) sunt utilizate numai pentru izolarea B. anthracis din cadavre sau carcase in putrefaqie ori a B. cereus din fecale prelevate dupa doua zile de la debutul unei toxiinfectii alimentare.

30.3.5. Caracterele de cultivare Aceste bacterii cultiva aerob sau facultativ anaerob pe medii uzuale: agar-nutritiv, agar-sfmge. Morfologia ~i marimea coloniilor variaza mult in raport cu specia, calitatile mediului de cultura, conditiile de incubatie, varsta ~i densitatea coloniilor, precum ~i cu proportia celulelor sporulate, care poate determina in acea~i cultura pura un amestec de colonii mai mult sau mai putin opace. Totu~i cateva caractere de cultivare sunt orientative catre grupe mari de specii (e.g., hemoliza versus non-hemoliza). Bacillus anthracis fonneaza, dupa incubare peste noapte la 37°C colonii mari de 3-5 mm diametru, alb cenu~ii, turtite, rugoase cu aspect de sticIa pisata, nehemolitice ori slab hemolitice. Periferia coloniei examinata cu lupa apare inconjurata cu prelungiri laterale ondulate ca ~uvitele de par (aspect de "cap de meduza"). La marire mai mare se observa ca aceste prelungiri sunt formate din lanturi de bacili. Coloniile de B. anthracis se particularizeaza prin "tenacitate": marginea coloniei ridicata u~or cu acul de inoculare ramine erecta ca albu~ul de ou biitut spuma. Cultivate in borcan cu lumanare pe agar nutritiv cu 0,75% bicarbonat de sodiu. tulpinile capsulate de B. anthracis fonneaza colonii mucoide. In general, bacilii antracoizi se diferentiaza de B. anthracis prin caracterul hemolitic al coloniilor. B. cereus formeaza colonii foarte asemanatoare cu B. anthracis, dar u~or mai mari ~i lipsite de "tenacitate", inconjurate cu 0 zona larga de ~-hemoliza pe agar-sange. Unele tulpini produc un pigment galben-verde fluorescent, altele un pigment roz-brun difuzibil. Coloniile de B. cereus subsp. mycoides sunt rizoide, caracter care poate fi pierdut in subculturi, ~i numai tardiv hemolitice. Coloniile de B. thuringiensis seamana cu cele de B. cereus. B. subtilis formeaza colonii mari, care cresc ~i invadeaza suprafata mediilor insuficient uscate. Rotunde sau neregulate, au suprafata lipsita de stralucire, sunt opace. greu emulsionavile, pot fi zbarcite ~i devin colorate in crem sau bruno Determina zone largi de hemoliza. Insamantat prin intepare in agar nutritiv glucozat I % fonneaza 0 cre~tere groasa frecvent rugoasa, bruna. Cre~terea in profunzime este limitata ~ipoate fi inconjurata cu un disc submers de pigment ro~iatic. 660

Bacillus coagulans cultiva optim la pH 6,0. Coloniile de B. licheniformis sunt opace, mate pfma la rugoase, aderente la mediu, ~nYaziveprin prelungiri ca firele de par. Prezinta, mai ales pe mediile glucozate, excres2en!e sau lobi fonna!i din acumulari de glicocalix. Coloniile de B. sphaericus prezinta varia!ii de tulpina de la "gramajoare" compacte :a fonne invazive. Paenibacillus alvei crqte invaziv ~i coloniile pot fi mobile. Cre~terea B. cireulans 'Joate avea caractere similare. Colonii1e de P. Inacerans sunt fine, rotunde cu tendin!a invaziva; pe agar glucozat sunt mai opace, niciodata mucoide.

30.3.6. Caractere microscopice Speciile cu interes medical ale bacililor care endosporuleaza aerob se diferen!iaza microscopic in 2 grupe; Grupul 1. Bacili gram-po ziti vi cu sporangiul nedefom1at de sporul elipsoid ori 2ilindric, central sau subtem1inal. Are doua subgrupe: a) Bacili mari cu diametrul peste 111m~i lungi de 3-8 11ma~eza!i mai frecvent in lanturi. Include: B. anthraeis ~i bacilii antracoizi (B. megaterium, B. cereus, B.cereus subsp. mycoides, B. thuringiensis). Au frecvent globule citoplasmice de ~-hidroxibutirat. b) Bacili mici cu diametrul sub 1 11m~i lungi de 1-3 11mdispu~i izoJat sau in scurte lan!Uri.Include: B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus, Paenibaeillus alvei, P. macerans. :'{u sunt observate globule citoplasmice. Grupul2. Bacili gram-variabili cu sporangiul deformat de spori sferici. Exceptand B. sphaericus sunt mra interes pentru microbiologia clinica. B.antrhacis este imobil. Fonneaza spori elipsoizi in culturi aerobe pe medii agarizate sau in cadavrele deschise ale animalelor decedate prin antrax. In prelevate patologice de la bolnavi sau cultivat in bulion apare nesporulat. In organismele bolnave sau in conditii speciale de cultivare in vitro (vezi mai jos) formeaza 0 capsula mare care inconjura continuu tori bacilii dintr-un Ian! ~i se coloreaza metacromatic in roz cu albastru de metilen policrom. Tulpinile avirulente sunt necapsulate. Se impune diferen!ierea B.anthracis de speciile foarte asemanatoare morfologic: B. cereus ~i, mai rar izolata in microbiologia clinica, B.thuringiensis. B. megateriwn fom1eaza spori a caror forma variaza de la elipsoida la sferica; poate fi capsulat.

30.3.7. Teste preliminare In general, caracterele de cultivare ~i microscopice diferentiaza u~or bacilii care endosporuleaza aerob de genul Clostridium. Prezen!a catalazei Ia Bacillus ~i genurile inrudite ~i absen!a ei la genul Clostridium confinna diferen!ierea. Pu!inele specii de Bacillus catalazo-negative sunt rar izolate in microbiologia clinica. Diferen!ierea prezumtiva rapida a B.anthracis de B.cereus poate fi mcuta prin unnarirea mobilita!ji, producerii de capsula ~i testele de sensibilitate Ia penicilina. Mobilitatea. Insamanteaza izolatele prin in!epare in coloana de agar moale cu incubare 4 zile la 3TC ~i urmare~te dezvoltarea culturii in raport cu traiectul de 661

insaman!are. Altemativ, examineaza intre lama ~i lamela cultura in bulion la microsco~ cu diafragmare corespunzatoare a luminii. B anthracis ~i B cereus subsp. mycoides sue imobile. Restul bacililor antracoizi sunt mobili. Rar au fost semnalate tulpini mobile de B. anthracis ~i imobile de B. cereus. Producerea capsulei in vitro. Alege una din 2 metode: cultivarea izolatelor pesk noapte la 37°C in borcan cu lumanare pe agar nutritiv cu 0,75% bicarbonat de sodiu saL subcultivarea unui inocul cat 0 gamalie de ac din primocultura timp de 6-12 ore la 37C( in 2,5 mL sange de cal ori ser fetal de vi!el. Urmare~te cre~terea, efectueaza ~i coloreazi'. frotiuri cu albastru de metilen policrom. Apari!ia coloniilor mucoide ~i/sau capsule: metacromatice tran~eaza diferen!a intre B anthracis ~iB cereus sau al!i antracoizi care ir aceste condi!iJ fonneaza colonii rugoase, iar cultura este fonnata din bacili necapsulari. Teste de sensibilitate la penicilina: • Inhibitia cre$terii. Insamanteaza tulpina de testat pe agar nutritiv cu 10 c: penieilina/mL. B. anthracis nu eultiva, B cereus cultiva. • Testul $iragului eu perle. Prepara 0 suspensie u~or opalescentii din cultura tulpini: de testat in solu!ie salina izotona. Imerseaza un tampon in suspensie ~i stoaree exeesu: de liehid prin rulare pe peretele tubului. Insaman!eaza eu tamponul in trei directii, supra fa!2 unei placi eu agar Mueller-Hinton. Plaseaza in centrul ariei insaman!ate un microcomprimat cu 10 UI penicilina. Incubeaza placa 6-8 ore la 37°C dupa care examineazE: cre~terea microscopic cu marire de 1OOOX.Prezen!a in ~irag de celule sferice cu aspectu: perlelor semnifica un test pozitiv. B. antlzracis da test pozitiv, B. cereus negativ.

30.3.8. Teste definitive Diferen!ierea corecta a principalei specii patogene, B. anthracis, de speciik asemanatoare B. cereus, B. cereus subsp. mycoides ~iB. thuringiensis impune um1atoarek teste suplimentare: liza prin fagul y, producerea de lecitinaza, prezen!a inc1uziunilor cristaline parasporale, asimilarea citratului, cre~terea in 7% in NaCl, descompunere2 tirozinei, prezen!a plasmidului pXO] de codificare a toxinei ~i pX02 de codifieare 2 capsulei, patogenitatea pentru ~oarece (tabelul 30-8). Produeerea de leeitinaza. Insamanteaza izolatul in striu pe 0 placa cu agar-galbenu~ de au. Incubeaza ~i unnare~te dupa 1, 3, 5 ~i 7 zile apari!ia unui precipitat alb in jurul striei de cultura. Unnare~te prezen{a incluziunilor cristaline parasporale prin colorare cu verde malachit: • Plaseaza lama cu ±rotiul in sus pe 0 cupa cu apa la fierbere. • Cand apar picaturi de condens pe fa!a inferioara a lamei, acopera frotiul eu solu!ie apoasa 5% de verde malachit. Mentine 1 minut cu apa in continuare la fierbere. • Spala cu apa rece. • Acopera pentru 30 secunde frotiul cu solu!ie 0,5% safranina sau 0,05% fucsina bazica. • Spala, usuca, examineaza. Sporii apar verzi, iar sporangiul ~i baci1ii vegetativi ro~ii. Um1are~te paraspora! prezen!a cristalelor cuboide sau "in diamant" 662

Tabelu/ 30-8 Diferentierea patotipurilor de B. cereus (adaptare dupa TURNBULL et a!., 1990) C

I

+-d--d v~'-.~ + "::: ::: s+ + 's+ I"~ +-- ~ ::l cO cO -+ ~ 0,9-1,0 j.!m Globule Iipidice In protoplast Caracterele sporului: Elipsoid Cilindric Sferic Central!Paracentral Subtenninalrrerminal Deformarea sporangiului Mobilitatea Cretterea la 50°C CreOterea anaerobii CreOterea In 7% NaCl Acid din:

rn~~ Glicogen D-manitol D-manoza u- metil-D-manozid Amidon D-trehaloza D-xiloza Salicinii Gaz din carbohidrati Amidon, hidroliza Cazeina, hidroliza Gelatina, hidroliza Nitrati, reducerea Voges-Proskauer Lecitinaza pHoj v-v + + N N .oj ++ >oj '" + - v'"+ Cre~tere > 0 din: ....l .", tloj

a Simboluri: + = > 90% din tulpini pozitive; v = 11-89% din tulpini pozitive; - = > 90% din tulpini negative; spa!iile goale indica rezultate necomunicate sau nesemnifieative. bSpecii care nu pot fi diferen!iate de L. acidophilus prin caracterele fenotipice. 'Specii isolate ocazional eu semnifica!ie clinica. d Considerata biovar al L.fermentum: identificarea de certitudine aparrine laboratoarelor de referinta.

carbohidrati1or trebuie excluse din compozitia mediului extractul de came ~i glucoza, iar ca indicator de pH folosit ro~u clorofenolin concentratie de 0,05% (greutate/volum). Aceste identificari sunt de competenta laboratoarelor specializate. Pentru acuratetea identificarii este recomandata utilizarea urmatoarelor metode: gaz-lichid cromatografie, PCR, secventierea ARNr 16S (Baele ~i Woo, 2002). 669

30.4.8. Sensibilitatea la antibiotice Lactobacilii sunt sensibili la penicilina, ampicilina, cefalosporine ~i c1indamicina; numai unele tulpini la gentamicina, tobramicina, c1oramfenicol ~i rezistenti la f1uorochino lone, sulfametoxazol-trimetoprim. Unele tulpini sunt tolerante la penicilina ~icefalosponne. Terapia de electie in infectiile severe (e.g., endocardita) este asocierea penicilina/ ampicilina cu gentamicina sau streptomicina (Bayer AS, 1978). La pacientii sensibilizati la penicilinii alternativa terapeutica este imipenemul sau macrolidele. Cefalosporinele ~i vancomicina nu pot fi alternative pentru penicilina/ampicilina. Tulpinile rezistente la penicilina ~i ampicilina sunt rezistente ~i la cefalosporine (e.g., cefalotin, ceftazidim, cefuroxim, cefotaxim) ~icefamicine (e.g., cefoxitin). L. casei, L. plantarum, L. rhamnosus sunt natural rezistente la vancomicina ~i teicoplanina.

BIBLIOGRAFIE KANDLER, 0., WEISS,N., 1986: Genul Lactobacillus. In P.H.A. Sneath, N.S Mair, M. E. sharpe et al.(eds.) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9thedn, Williams and Wilkins, Baltimore, vol. 2. pp. 1209-1234. KILIAN, M., 2005: Streptococcus and Lactobacillus. In Borello, S.P., Murray, P. R., Funke. G. (eds). Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, lOthedn, vol. 2, Hodder Arnold. London, pp. 863-861. COLMAN, G. (1990): Streptococcus and Lactobacillus. In M.T. Parker, B.!. Duerden (eds) Topley and Wilson' Priniciples of Bacteriology, Virology and Immunity, 8thedn. Arnold, London, pp. 148-159. BAELE, M .. M. VANEECHOUTTE, R. VERHELST, (2002): Identification of Lactobacillus species using "tDNA-PCR. J. Microbiol. Meth. 50:263-271. WOO, P.c.Y., A.M.Y. FUNG, S.K.P. LAU (2002): Identification by 16s rRNA secquencing of Lactobacillus salivarius bacteriemic cholecystistis. 1. Clin. Microbiol. 40:265-267. BAYER, A.S., A. V. CHOW, D. GUZE (1978): Lactobacillemie: report of nine cases: important clinical and therapeutic considerations. Am. J. Med. 64:808-813.

30.5. IDENTIFICAREA BACTERIILOR NOCARDIFORME (CARMEN pA.NZARU) Bacteriile nocardiforme sunt actinomicete aerobe cu aspect filamentos ramificat care se reproduc fie prin fragmentarea hifelor, fie prin formare de conidii. 0 asemenea grupare, taxonomic artificiala, apare justificatii numai de u~urinta cu care morfologia ~i afinitiitile tinctoriale orienteaza identificarea acestor bacterii. Chemotaxonomic, intre bacteriile nocardifonne 0 grupare supragenerica se particularizeaza prin prezenta In peretele bacterian a arabinozei ~igalatozei asociate unor acizi micolici. Lungimea catenei carbonate ~icomplexitatea molecularii a acizilor micolici conditioneaza acido-rezistenta genurilor reunite. La 0 extremitate se plaseaza genul Mycobacterium caruia acizi micolici cu 60-90 atomi de carbon ~i cea mai complexa molecula ii confera acido-rezistenta puternica, iar la cealata genul Corynebacterium practic neacido-rezistent pentru ca are cei mai simpli acizi micolici cu numai 22-38 atomi de carbon. Intre aceste extreme se inscriu genurile slab acido-rezistente: Nocardia, Rhodococcus, Gordonia, Tsuka17lurella. 670

Alte bacterii nocardiforme cu pere!i diferit structura!i de ai primului grup, lipsi!i de acizi micolici, sunt Actinomadura, Nocardiopsis, Streptomyces, ~i Dermatophilus. Ciiteva genuri ale acestui grup neimplicate in infeqii umane, ci semnalate doar in sensibilizari dupa inhalrea sporilor (e.g. Saccharomonosporoa, Saccharopolyspora) nu ne VOl' retine aten!ia. 30.SA. GENUL NOCARDIA 30.SA.I. Minidefinitie Nocardiile fonneaza hife vegetative cu diametrul de 0,5-1,2 f..un,extensiv ramificate, care cresc pe suprafa!a $i in profunzimea mediilor agarizate. Hife aeriene apar spontan, dar uzual sunt vizibile numai microscopic. Hifele vegetative se fragmenteaza frecvent in fonne bacilare sau cocoide atat in situ, cat $i, mai ales, prin manipularile implicate de efectuarea frotiurilor. Hifele aeriene poarta ocazionallan!uri de conidii mai mult sau mai pu!in individualizate $i cu lungimi variate. Sunt imobile, gram-variabile $i pot fi slab acido-rezistente. Cresc aerob, produc catalaza $i ataca zaharurile oxidativ.

30.5A.2. Consideratii taxonomice Identificarea fenotipica a nocardiilor este laborioasa din cauza numarului redus de teste disponibile comercial. Caracterele chemotaxonomice, identificarea moleculara $i analiza spectrului de sensibilitate la antibiotice au deschis un orizont mai larg spre clasificarea naturala a acestor organisme, dar le-a modificat pro fund taxonomia. Dintre speciile de Nocardia anterior recunoscute numai N. otitidiscaviarum este omogena $i a ramas ca atare. Parte dintre tulpinile de N. brasiliensis au fost clasificate ca N. pseudobrasiliensis. Nocardia asteroides s-a dovedit 0 grupare heterogena (,,Nocardia asteroides"). Grupe diferite de tulpini pe care Ie reunea au capatat rang de specii: N. abscess us (antibiovar I), N. cyriacigeorgica (antibiovar VI), N. farcinica (antibiovar V), N. nova (antibiovar III). Tulpini din antibiovaru1 IV au fost transferate in noua specie N. transvalensis. Antibiovarul II $i restul tulpinilor din antibiovarul IV, ca $i tulpina tip de N. asreroides ATCC 19247 s-au dovedit suficient de diferite prin secven!ierea ADNr 16S inciit VOl' constitui probabil alte noi specii. Specii nou izolate $i caracterizate sunt: N. brevicatena (complex format din 3 grupe neomogene de tulpini, posibile alte noi specii), N. paucivorans; N. africana, N. veterana, N. vaccinii strans inrudite cu N. nova :tara a-$i pierde insa identitatea taxonomica.

30.5A.3. Habitat ~i implicatii in patologie Nocardiile sunt organisme saprofite prezente in solurile riverane, in solurile cultivate, in vegetalele pro aspete sau in descompunere, in pu1beri, in apele du1ci sau marine. Studii mai aprofundate ale prezen!ei lor in asemenea habitate indica diferen!e regionale. Ocazional contamineaza tranzitoriu pielea omului $i anima1e1or. 671

Din cele peste 31 specii de Nocardia cunoscute in prezent, doar 13 au potential patogen pentru om: N. abscessus, N africana, N,. brasiliensis, N. brevicatena, N. carnea, N. cyriacigeorgica, N. farcinica, N. nova, N. otitidiscaviarum, N.paucivorans, N. pseudo brasiliensis, N transvalensis ~i N. veterana. Unele specii au fost rar izolate din infectii: eg., N brevicatena, N camea, N. paucivorans, N. veterana sau numai in zone tropicale: e.g., N. africana. Mutatiile taxonomice recente, in particular partajul tulpinilor de N. asteroides ori N. brasiliensis spre noile specii, fac dificila aprecierea precisa a morbiditatii prin diferitele specii actuale de Nocardia. Dar este evidenta cre~terea frecventei nocardiozelor la care contribuie mai multi factori: frecventa conditiilor debilitante favorizeaza nocardioza ca o complicatie (hemopatii maligne ~i alte neoplasme, terapii imunodepresive sau imunosupresive, SIDA), interventii chirurgicale agresive. Nu pe ultimulloc trebuie avuta in vedere ~i ameliorarea diagnosticului etiologic. In raport cu poarta de intrare a infectiei putem deosebi: (1) Nocardioza pulmonara este ocazional generatoare a unor diseminari sistemice cu afectarea creierului, sistemului musculo-scheletal, cordului, maduvei spinarii, peritoneului, ficatului ~.a. (2) Nocardioza cutanaHi ~i comeana. (3) Nocardioza subcutanatil, inclusiv actinomicetoame sau limfadenite. Mai frecvent implicate in infectii din zone temperate sunt: ,,N. asteroides", N. farcinica, N. nova, izolilrile de N. brasiliensis, N. otitidiscaviaru17l sau N. transvalensis fiind rare. (4) Mult timp considerate doar ca infectii comunitare sporadice, astilzi este recunoscut caracterul transmisibil al nocardiozelor ~i au fost identificate mici izbucniri epidemice nosocomiale in sectiile de transplant renal ori hepatic, ca ~i infeqii postoperatorii aerogene (cutanate sau osoase) in serviciile de chirurgie cardiaca ~i vascularil. Noeardiozele primar pulmonare eu diseminari sistemice sunt cele mai frecvente. Nocardia farcinica este implicata in 50% din cazuri. N. brasiliensis de~i ocupa locul secund este mai virulentil: 60% din izolatele invazive provin de la pacienti imunocompetenti ~i numai 28% de la imunocompromi~i. Specii semnificativ implicate mai sunt N. cyriacigeorgica (frecventa ar putea fi chiar considerabila, dar numilrul tulpinilor anterior clasificate ca ,,N. asteroides" rilmane necunoscut). Rar implicate inca sunt: N. abscess us, N. africana (doar 8 izolate din sputa exclusiv in Africa), N. transvalensis, N. nova, N otitidiscaviarum, N. paucivorans, N psedoubrasiliensis, N. veterana. Nocardiozele cutanate. Sunt inca subdiagnosticate. Poarta de intrare uzuala sunt pIagile contaminate cu pilmant, dar ocazional au apilrut ~i dupil zgarieturi de pisicil ori intepilturi de insecte. Speciile implicate sunt 3 (in ordibnea frecventei): N otitidiscavia rum, Nfarcinica ~i N brasiliensis. Evolueazil cronic functie de gravitatea leziunii la poarta de intrare, pot evolua cu limfadenite, abcese, osteomielite. Infectii corneene. Complicil mai frecvent traumatismele, inclusiv cele cauzate prin Ientile de contact spillate cu apil contaminatil. Specii de Nocardia izolate din keratite intre 1991-1996 au fost: ,,N. asteroides" (15 cazuri; nu mai po ate fi stabilitil afilierea tulpinilor) ~i N. otitidiscaviarum (1 caz). Au mai fost implicate: N. nova, N. transvalensis. 672

____

. __

..

,

.u.

. __

'

, __

...__

.

.

.. __

._

Actinomicetoame. Nocardia brasiliensis este cea mai comuna cauza a micetoamelor actinomicotice: 94% din cazuri in Mexic, 13 din 16 cazuri la Sao Paolo in Brazilia. Din cele 197 micetoame actinomicotice inregistrate intre 1981-2000 la $coala de Medicina Tropicala din Calcutta, 78 au fost determinate de N. brasiliensis, 38 de N. otitidiscaviarum, 52 de,,N. asteroides", 23 de Actinomadura spp $i9 de Streptomyces spp. Nocardiozele nosomomiale. Specia mai frecvent implicata este N. farcinica. ocazional N.nova, N.otitidiscaviarum. Infectii survin in sectii de chirurgie cardiaca. transplant renal, hematologie. Anchetele epidemiologice au incriminat: contaminarea aerogena a plagilor cu pulberi provenite de la un $antier vecin, colonizare de cateter intravenos, anestezist purtator de N. farcinica (izolarea tulpinii inclusiv de la domiciliu), pacienti purtatori.

30.5A.4. Obtinerea culturii pure De$i nocardiile cresc pe mediile uzuale cu 0 baza nutritiva de calitate ca infuzie de cord, infuzia cord-creier, agar Sabouraud glucozat $.a., izolarea lor din prelevate patologice poate intampina dificultati din motivele enumerate mai jos: (1) Refrigerarea prelevatelor patologice mai ales cu gheata afecteaza viabilitatea unor tulpini de Nocardia. (2) Unele specii cresc optim la 37°C, altele la 28-30°C, deci este precauta insamatarea probelor in 2 seturi de mediu pentru incubare in regim diferentiat. (3) In tesuturi nocardiile sufera alterari structurale $i funqinale (e.g., aparitia de fonne L). Pot fi vizibile in microscopia directa, cu caracterele morfotinctoriale cunoscute, dar izolarea este imposibila sau intarzie pina cand microorganismul se adapteaza la mediul de cultura oferit. De aceea culturile incubate la 37°C trebuie unnarite 14 zile (21 zile cand sunt insamatate tesuturi), iar cele incubate la 28-30°C timp de 21 zile. (4) Invadarea mediului de izolare prin contaminanti din prelevatul examinat (in special sputa). Metodele de decontaminare chimica $i fluidifierea sputei nu sunt adecvate pentru ca multe tulpini de Nocardia sunt omorate la concentratia de 0,5% N-acetilL-cisteina ori prin metodele uzuale de decontaminare recomandate pentru micobaterii. Rezultate bune dau mediile selective cum sunt: agarul DST Oxoid (Diagnostic Sensitivity Test Agar) suplimentat cu 0 tetraciclina (e.g., metilc10rtetraciclina 5 /lg/mL) $i un antifungic (e.g., amfotericina B 2 /lg/mL); agarul BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract) Oxoid sau Merck suplimentat cu anisomicina 80 /lg/mL, polimixuna B 80 UlImL, $i vancomicina 1 /lg/mL; agar Sabouraud glucozat suplimentat cu cloramfenicol 50 /lg/mL. Rezultate bune da $i un mediu selectiv care ofera ca unica sursa de carbon parafina, folosita exc1usiv de nocardii, rhodococi $i unele micobacterii (MISHRA SK .. et al. 1973: Observations on paraffin baiting as a laboratory diagnostic procedure in nocardiosis. Mycopathol. Mycol. Appl., 51, 147-157) Pentru izolari din prelevate necomtaminate sau cu contaminare nesemnificativa indicat este agarul-sange sau agarul-$ocolat pe baza de infuzie cord ori cord-creier. Hemoculturile pot fi tacute pe mediul difazic sau medii pentru sisteme automate de unnarire. Cu subcultivarea tem1inala deoarece cultivarea nocardiilor nu este detectata de sensorii sistemelor automate. 673

=ti;;!

30.5A.5. Caractere de cultivare Pe agar-sange dupa 48 ore de incubare aeroba la 37°C coloniile de Nocardia sunt mici, uneori inconjurate cu 0 discreta zona de cx-hemoliza, indistincte de cele ale altor izolate din sputa. Dupa alte 3-7 zile de incubare coloniile devin aderente prin incastrarea marginilor in mediu, ca Uffilare a dezvoltarii de hife submerse, cresc in volum. pot fi netede sau granulare, neregulate ~i incretite. Consistenta lor variaza de la cretoasa ~i sfaramicoasa la pieloasa, crustoasa. Nocardiile produc pigmenti carotenoizi care coloreaza coloniile variat in galben, portocaliu sau roz pana la ro~u. Ocazional produc pigmenti difuzibili giHbui pana la bruno Frecvent coloniile de N brasiliensis ,'Ii JV otitidiscaviarum, dar rar ale altoI' specii, sunt ~-hemolitice. Izolate ale unor specii de Nocardia sunt uneori cx-hemolitice. Pe suprafata coloniilor pot sa apara hife aeriene uneori rare, alteori abundente inciit devin vizibile cu ochiulliber. Cultivate in bulion, nocardiile lasa mediu clar, formeaza depozit membranos sau vascos ~i pelicula superficiala groasa, uscata, solzoasa ori pieloasa, pigmentata pe care se dezvolta hife aeriene ce se extind pe peretii tubului. Mai rar mediul prezinta u~oara turbiditate granulara. Uneori cre~terea incepe de la fundul tubului ca un depozit pufos.

30.5A.6. Caractere micros cop ice Nocardiile apar sub fonna de filamente subtiri , cu diametrul de 0,5-1,2 /lm, gramvariabile, care se coloreaza neregulat, de unde aspectullor monilifoffil, ~ise fragmenteaza u~or in elemente bacilare ~i cocoide polimorfe. Sunt slab acido-rezistente. In prelevatele patologice hifele nocardiilor se intretes intr-un miceliu lax, iar caracterul acido-rezistent este mai evident decat in culturi. Atat hifele vegetative, cat ~i cele aeriene pot purta lanturi sCUlie de conidii mai evidente la N. brevicatena.

30.5A.7. Teste preliminare Diferentierea prezumtiva intre Nocardia ~i genurile inrudite 0 fac: caracterele de cultivare, microscopice, sensibilitatea la lizozim ~i testul de oxidare/fermentare (tabeluI30-11). Cre~terea facultativ anaeroba orienteaza identificarea catre Oerskovia ~i Dernlatophilus. Date privind caracterele morfotinctoriale obtinem prin microscopia directa a prelevatelor ~i prin microscopia culturilor . • Microscopia directa. Preparatul umed fntre lama $i lamela. Este indicat atat pentru granulele suspecte din purai, cat ~i pentru probele de puroi fluid-omogen, de sputa, spalatura bron~ica etc. Examineaza preparatul cu lumina corespunzator diafragmata sau, mai bine in cotrast de faza. Unnare~te prezenta filamentelor ramificate eu diametrul - 1 /lm. Preparatul umed este mai sensibil de cat preparatele colorate pentru depistarea hifelor de Nocardia doarece evita manipularile de etalare a frotiului, care detennina fragmentari. 674

Tabelu/ 30-lO Caractere diferentiale prezumtive ale genurilor nocardiforme de interes medical e

;

"

0"vh "2" ~

-!! + -~ .2 -::::v'- 5%. La 4°C L. monocytogenes cultiva cu 0 perioada de lag variabila intre ciiteva zile ~i ~ase luni. Dupa 24-48 ore de incubare la 35°-37°C coloniile de Listeria au diametrul de 1-1,5 mm pe agarul glucozat 2% ~i de numai 0,2-0,4 mm pe agarul triptozat 1-2%. Sunt rotunde, netede, u~or bombate, transparente cu aspectul picaturilor de roua. Centrullor poate avea aspect cristalin sticlos. Au consistenta apoasa. Examinate in lumina oblica, la 45°, apar cu irizatie bleu-verzuie. Coloniile formelor rugoase au centrul opac, sunt mai mari, turtite, cu margini neregulate, cu depresiune central a craterifom1a, friabile, greu de emulsionat. Dupa repicare coloniile de Listeria pot lasa "amprenta" pe agar. Pe agar cu 5% sfmge (de berbec, iepure, cal, bou sau am) coloniile de L. monocytogenes sunt inconjurate cu 0 zona ingusta de ~-hemoliza difuza, cele de L. seeligeri sunt mai slab hemolitice, iar cele de L. ivanovii fonneaza a zona mai larga de ~-hemoliza, care dupa 36-48 are ia aspect de dubla sau chiar tripla hemoliza. Culturile de L. monocytogenes pe medii solide degaja miros caracteristic de lapte acidulat. In mediile semisolide, cum este agarul 3%0, dupa insamantare prin intepare ~i incubare la temperatura camerei, L. monocytogenes cre~te sub forma unei umbrele la 3-5 mm de suprafata agarului dovedind 0 mobilitate marcanta. In mediile lichide aspectul culturii difera dupa tipul demediu folosit: in bulion peptonat - aspect unifonn, iar in bulion glucozat sau triptozat - aspect floconos. Dupa incubare prelungita se fonneaza un depozit dens ~i aderent, care, prin agitare, se ridica sub fonna de tirbu~on. 688

30.6A.6. Caractere microscopice Listeriile sunt bacili scurti, drepti sau incurbati, de multe ori cu f0TI11acocobaci lara sau cocala, cu capete rotunjite ~i dimensiuni de 0,5-2 I1mlungimelO,4-08 11mgrosime, in prelevatele patologice apar fie extracelulare, fie fagocitate, proM certa a listeriozei. Frotiul direct din lichidul cefalorahidian poate evidentia cocobacili gram-pozitivi izolati, in perechi sau inlanturi scurte. In culturile tinere, incubate la 35°-37°C, domina fonnele scurte, cocobacilare. in timp ce in culturile vechi apare polimorfismul, deseori cu forme filamentoase lungi de 6-20 11masemanatoare lactobacililor. Gem1enii din culturi in faza "S" pot fi dispu~i pe frotiu izolati, grupati in palisade sau perechi, in V sau Y asemanator corinebacteriilor; in faza "R" apar mai frecvent cocobacili dispu~i inlan!Uri scurte de 3-5 elemente. Se coloreaza gram-pozitiv pe frotiurile efectuate din culturi tin ere ~i pot fi gramnegativi in culturi vechi. La 0 decolorare prelungita (3-5 min.) peste 50% din germeni. chiar ~ei proveniti din culturi tinere, pot deveni gram-negativi. In primoculturile din prelevate patologice cu flora mixta, L. monocytogenes este relativ u~or confundata cu Erysipelothrix rhusiopathiae. atat ca morfologie a coloniilor, cat ~i microscopica. Listeriile sunt mobile prin flageli subtenninali in numar de 2-4, mai abundenti ~i peritrichi in cazul cultivarii la temperatura camerei, 18°-22°C. Cocobacilii sunt neflagelati sau monoflagelati prin cultivare 37°C sau la 4°C. Sunt necapsulate ~i nesporulate. 121

30.6A.7. Teste preliminare Pentru diferentierea genului Listeria de alte genuri asemanatoare testeaza: cre~terea facultativ anaeroba, mobilitatea in preparat umed sau in coloana de agar l110alea culturii temperatura call1erei, cre~terea tel11peraturi intre 2° ~i 42°C, producerea de oxidaza, catalaza, ureaza, H2S in l11ediulTSI, fermentarea glucozei (Tabel 30-13). 121

121

Tab!!llli 3(M 3 Diferentierea

genului Listeria de a1ti germeni gram-pozitivi nesporulati

Caracteristici revendicate spp. Catalaza pozitivii Cata]aza

Lactobacillus Genuri excluse Rothia Ervsipelothrix Corynebacteriul7l Kurthia

30.6A.8. Teste definitive Identificarea pana nivel de specie este deosebit de il11portanta deoarece toale listeriile pot contal11ina alimentele, dar numai L. monocytogenes are sel11nificatie clinidi ~i excePtional L. ivanovii sau L. seeligeri. 121

689

Identificarea speciilor de Listeria se bazeaza pe urmatoarele caractere fenotipice: hemoliza ~i testul CAMP, reducerea nitratilor, spectrul de fennentare a carbohidratilor $i patogenitatea experimentala (Tabel 30-14). Tabe11l130-14

Diferentierea

agar-sfmge

"

--.., -~ -d-o-r. ..::: :::: +b + .., ::! d s+ d~ -lI2c; -.~ '+ :::: -' c--::i;;;·S -d + + + ? ...j .., ...j 5+ ·5 5 S 6bS -+b ND; lI2b, ND, 4ab; lI2b; lI2a, ::! ~ .~ pe .;:: ~ ~ ..s ~6a, ~ 7 Manozid D-Manitol S. alireliS ~ 4d,4e; 4b,4c, la ~oarece

'--'>, c'"++-or..;: ++ ";:"" lI2a,

.::;

-:::: .., ~s::' ND 4c; 6a,6b;

speciilor din genul Listeria

'"L. iVGnovii 6b L. grayi 4b,4d;

8 Simboluri: + = > 90% din tulpini pozitive; d = 11-89% tulpini pozitive; - = > 90% din tulpini negative- s = reactie slab pozitiva; ? = rezultate incerte; ND = nedenumit; S = specific. in mod obi~nuit zona larga sau zone multiple de hemoliza .

• Hemoliza este esentiala pentru diferentierea L. monocytogenes de L. inocua da torita stransei inrudiri a celor doua specii $i suprapunerii multor caractere fenotipice. Numai trei specii, L. monocytogenes, L. ivanovii ~i L. seeligeri, sunt hemolitice. Listeriamonocytogenes $i L. seeligeri produc zone inguste de hemoliza, care, de cele 690

mai multe ori, nu depa~esc marginile coloniei, fiind necesara deplasarea coloniei pentru a vizua1iza hemoliza, in timp ce L. ivanovii produce 0 zona larga de hemoliza dubla sau tripla. Testul CAMP, care poate evidentia cIar caracterele hemolitice, este practicat prin insamantarea Staphylococcus aureus ~i Rhodococcus equi sub forma de striuri Intr-o singura directie pe placa cu agar-sange, iar tulpinile de Listeria perpendicular fata de traiectoriile S. aureus ~i R. equi, tara a Ie atinge insa. Hemoliza tulpinilor de L. 7710110cytogenes ~iL. seeligeri este mai exacerbata in apropierea striului de S. aureus, iar pentru L. ivanovii numai in apropierea striului de R. equL Modificarea testului CAMP cIasic, prin utilizarea unui disc impregnat cu ~-]izina stafilococica, poate de asemenea sa evidentieze exacerbarea hemolizei la L. monocytogenes . • Fermentarea carbohidratilor. Unnare~te producerea de acid din D-manitol, L-ramnoza, D-xiloza, riboza ~i cx-metil-D-manozid. Listeria monocytogenes produce de regula acid din L-ramnoza ~i cx-metil-D-manozid tara a ataca celelalte zaharuri mentionate; rareori tulpini de L. monocytogenes sunt L-ramnoza negative. Galeria API, oferita de firma bioMerieux, diferentiaza speciile de Listeria pe baza a 10 teste miniaturizate, inclusiv hemoliza . • Testarea patogenita{ii. Uzual identificarea speciilor de Listeria pe baza aspectului hemolizei ~i caractere10r biochimice este suficienta. Aproape toate tulpinile de L. monocytogenes izolate in laboratorul clinic sunt virulente in laboratoare specializate pot fi efectuate unnatoarele teste de patogenitate: picatura din cultura in bulion de L. monocytogenes in varsta de (i) Testul Anton: 24 ore, inoculata in sacul conjunctivalla iepure sau la cobai, detennina dupa 24-36 ore o conjunctivWi purulenta. (ii) Soarecii imunocompromi~i, injectati intraperitoneal cu tulpini virulente de L. monocytogenes sau L. ivanovii, mor in interval de trei zile. Cei interesati de amanunte privind aceste metode de patogenitate experimental a pot cbnsulta bibliografia recomandata.

0

(iii) Inocularea pe membrana chorioalantoidiana a oului embrionat. Tipuri. Diferentierea tulpinilor de L. monocytogenes este importanta in epidemiologia listeriozei umane. Markeri epidemiologici of era: serotiparea, lizotiparea ~i metodele de tipare moleculara. Serotiparea. Tulpinile de L. monocytogenes sunt impartite in 13 serovaruri (tabel 30-14) prin reactia de aglutinare cu seruri de iepure adsorbite, pe baza antigenelor somatice (0) ~i flagelare (H), insa 0 parte din antigenele serotipabile sunt comune ~i altor specii de Listeria: L. innocua, L. seeligeri ~i L. welshil11eri (tabel 30-14). Capacitatea discriminatorie a serovarurilor de L. monocytogenes este insuficienta pentru practica epidemiologica, deoarece peste 90% din tulpinile implicate in infectii umane ~i animale apartin serovaruri1or lI2a, lI2b ~i 4b, cea mai mare proportie de tulpini din serovarul 4b fiind izolata din infectii umane. Identificarea serovarurilor orienteaza insa selectarea metodelor de tip are mo1eculara. Lizotiparea. Lizovarurile de L. 11l0nocytogenes au 0 mare capacitate discriminatorie, foarte utila pentru studiullisteriozei umane sau pentru identificarea surselor de infectie in izbucnirile epidemice. Izolarea aceluia~i lizovar de la bolnavi, cat ~i dintr-un aliment 691

--~---

-------------------------

suspectat eonfim1a transmiterea listeriozei pe cale alimentara. Totu~i, un numar relatiy redus de tulpini, mai ales din serovarurile 1/2 ~i 3 nu pot fi lizotipate ~i neeesita un set aditional de fagi. Electroforeza enzimatidi multiloculara (MEE) poate examina, prin migrarea electroforetica a enzimelor constitutive, 10-20 locusuri enzimatice pentru fiecare tulpina in parte, dovedindu-se utila in diferentierea tulpinilor de L. monocytogenes. Fiecare varianta de migrare a unei enzime este determinata de 0 alela unicil. Tulpinile sunt individualizate printr-o serie de valori numerice pentru alelele examinate (tip electroforetie). Metoda ~i-a gasit aplicare in investigatiile epidemiologice, atat pentru izbucnirile epidemice, cat ~i pentru cazurile sporadice. Metoda poate fi de asemenea utilizata In studii taxonomice pentru diferentierea speciilor de Listeria. Dintre metodele bazate pe studiul acizilor nucleici rezultate bune au dat: configuratiile de mierorestrictie ADN, configuratiile de macrorestrictie ale ADN ~iprofilul de amplificare enzimaticil aleatorie a ADN-ului.

BIBLIOGRAFIE CATIMEL, B., ROCOURT, J.: Listeria. Protocole des traveaux pratiques. Institut Pasteur, Paris. pp. 1-3:2 (1994). GEORGE, M.S., LUND, B.M., BROCKIEHURST, T.F.: The effect of pH and temperature on initiation of growth of Listeria 11l00lOcytogenes(1988). Left. Appl. Microbiol. 6:153. GILCHRIST, M.J.R.: Laboratory Diagnosis ofInfectious Diseases. Principle and Practice. Springer Verlag. Berlin, vol. 2, pp. 353-359 (1988). KLINGER, J.D.: Isolation of Listeria: A review of procedures future prospects (1988). Infection 16 Supp!. 2:S98. MCLAUCHLIN, J., JONES, D.: Erysipelothris and Listeria. In L. Collier, A. Balows. M. Sussman (eds.): Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, 9-th edn. Arnold, London, vol. 2, pp. 683-708 (1998). POP, A.M.: Genul Listeria. in V. BlIbie, N, Pozsgi (editori): Bacteriologic Medicali'l, Editura Medicala. Bucure$ti, vol. 2, pp. 593-600 (1985). SEELIGER, H.P.R., JONES, D.: Listeria. in P.H.A. Sneath, N.S. Mair, E. Sharpe (eds.): Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9-th edn., Williams and Wilkins Co., Baltimore, vol. 2, pp. 1235-1245 (1986). SWAMINATHAN, B., ROCOURT~ 1., BILIE, J.: Listeria. in P.R. Murray, EJ. Baron, M.A. Pfaller et a1. (eds.): Manual of Clinical Microbiology, 6-th edn., A.S.M. Press, Washington D.C., pp. 341-348.

30.6B. ERYSIPELOTHRIX (CARMEN PANZARU) Definitie ~i consideratii taxonomice. Erysipelothrix reune~te bacilli fini cu tendinta de a fom1a filamente. Imobili. Nesporulati. Gam-pozitivi, dar se decoloreaza u~or. Facultativ anaerobi, cre~terea Ie este favorizata in atmosfera cu 5-10% CO2, Catalazo- ~i oxidazo-negativi. Au activitate fermentativa slaM: produc acid dar nu ~igaz din glucoza ~i alti earbohidrati. In mediul TSI produc H2S . Continutul in G+C al ADN-ului este de 36-40 mol%. 692

Secventierea ARNr 16S demonstreaza inrudirea cu micoplasmele, in timp ce structura peretelui bacterian sugereaza asemanarea cu clostridiile ~i actinomicetele. Bergey's Manual 2000 clasifica genul Erysipelotlzrix in clasa Mollicutes ~i propune faGenul are 2 specii ~i 26 de serotipuri: Erysipelotlzrix milia Erysipelotlzriclzaceae. 12, 15-17, 19, 21 ~i tipul N), E. tOllsillarul7l (3, 7, rlzusiopatlziae (la, 1b, 2a, 4-6,8,9,11, 10, 14,20,22,23). Serotipurile 13 ~i 18 sunt distincte ~ireprezinta 0 genomospecie, inca nenumita, iar serotipul 26 ultimul descris, a fost numit ,,N strains". Cu interes medical este E. rlzusiopatlziae, specie larg raspandita. Gazde naturale sunt vertebrate (porci, ovine, cabaline, bovine, pe~ti, pasari) ~i nevertebrate (musca domestica, crustacee). Eliminata cu dejectele, prezenta in mucusu1 pe~tilor ~i rezistenta in mediul extern, contamineaza ~i persista in apele de suprafata, apele reziduale de la abatoare sau fenne, in sol. intre anima1e se transmite pe cale orala. Produsele de came, pe~te - afumate ori saramurate - vehiculeaza eficient bacteria. Principalul rezervor de agent infectios este porculla care E. rlzusiopatlziae determina rujetul, 0 infeqie sistemica. La om infeqia cu E. rlzusiopatlziae este mai frecvent profesionala, contractata de veterinari, macelari, pescari, fermieri prin intepaturi ~i abraziuni tegumentare. Au fost comunicate infectii dupa mu~caturi de pisica. Manifestarile bolii sunt functie de receptivitatea gazdei. Cea mai frecventa esteforma cutanata, erizipeloidul Rosenbach, 0 dennita acuta, care evolueaza in jurul portii de intrare ca un placard ro~u-violaceu cu margini bine delimitate ~i extensie centripeta. Durerea locala este discreta ori absenta. Pacien!ii pot acuza prurit, arsura ~i tensiune localaresimtita eventual ~iin articulatiile vecine. Rar infectia evolueaza sistemic cu artrite, fasciita necrozanta, endocardita, infarct cerebral. EndocardiHi poate surveni pe valve native sau protezate, fie proteze de tip Starr Edwards, fie porcine. Infectia sistemica survine la pacienti aflati sub terapie imunosupresiva (e.g., corticoterapie) sau cu status imun compromis (cancer, diabet, alcoolism, LED, HIV infectati ~.a.). E. tOl1sillarum a fost izolat de pe amigdalele porcilor sanato~i. Poate determina endocardite la caini. Caractere microscopice ~i de cultivare. Pe frotiurile din cultura in forma S, apare ca bacili gram-pozitivi fini, 0,8-2,5 flm 1ungime/0,2-0,4 flm grosime, dispu~i izola!i, in perechi unghiulare, scurte lanturi sau gramezi; in fonna de cultura R predomina formele filamentoase lungi. Se decoloreaza u~or, ~ide aceea poate aparea gram-negativ cu poniuni gram-pozitive, ceea ce da fonnelor filamentoase aspect moniliforn1. Cultivarea este favorizata de utilizarea medii lor imbogatite cu sange ~i in atmosfera de CO2, Pe agar infuzie de cord cu 5% sange (berbec, iepure), dupa 24-48 ore de incubare la 37°C in atmosfera cu CO" formeaza colonii S mici de 0,1-0,5 mm diametru, rotunde, convexe, stralucitoare, tranS-parente. Coloniile R sunt mai mari, mai turtite, cu suprafata neregulata ~imargini fimbriate. Sunt a-hemolitice, mai ales in zona de cre~tere confluenta, albastrii sau cu sc1ipiri verzui sub iluminare oblica. Izolare, identificare, sensibilitatea la antibiotice. Erysipelotlzrix rlzusiopathiae poate fi izolat din probe biopsice de la nivelul zonei active a ariei de celulita sau In hemoculturi. Probele biopsice trebuie imbogatite prin incubare la 37°C in bulion glucozat ~i atmosfera cu 5-10% CO) pana la 10 zile cu repicari pe agar-sange la fiecare 24 ore. Cultiva bine pe mediile comerciale, ~i in sistemele automate de hemocultura. Primo693

culturile din prelevatele stadiului acut al erizipeloidului ~i hemoculturile sunt dominate de forma S. Disocierea S-R este frecventa in subculturi, in timp Cevariata R-S, posibila, este mai rara. Identificarea prezumtiva a Erysipelothrix rhusiopathiae se bazeaza pe: caracterele morfotinctoriale ~i de cultivare, absenta catalazei, oxidazei ~i producerea de H2S. Poate fi confundat cu Arcanobacterium haemolyticum, A. pyogenes, Listeria monocitogenes, dar to ate aceste spedi sunt B-hemolitice (atentie la A. haenwlyticum care la 24 de ore formeaza zona slaM de hemoliza) ~i nu produc HoS. in plus pentru diferentierea de Listeria monocitogenes pledeaza rezistenta la neomiclna ~i catalaza-negativa caracteristice Erysipelothrix rhusiopathiae. Este foarte importanta evidentierea producerii de H2S ~i pentru diferentierea fata de Lactobacillus spp (bacii gram-pozitiv, catalazo-negativ, imobil). Pentru identificarea definitiva utilizam 0 galerie mai larga de teste. E. rhusiopathiae utilizeaza citratul prezent in plasma citratata ~i de aceea aparent produce coagulaza. Activitatea nu este observata pe plasma oxalatata sau cu EDTA. Este slab fem1entativ, produce acid din glucoza, galactoza, fructoza, lactoza, maltoza ~iN-acetilglucozamina. Nu produce indol ~i acetoina, nu reduce nitratii la nitriti. Cele doua specii ale genului sunt asemanatoare fenotipic; diferentierea este realizata prin capacitatea E. tonsillarum de a produce acid din zaharoza. E. rhusiopathiae poate fi identificat in sistemul API Coryne (bioMerieux, Marcy ['Etoile, France) ~i RapID CB-Plus. Metode moleculare de tip are ~i identificare: electroforeza enzimatica multiloculara, RFLP, secventierea ARNr l6S, capabile sa identifice pattern-un de la A-I; PCR ce permite identificarea E. rhusiopathiae ori E. tonsillarum din tesut animal in 5 ore. E. rhusiopathiae este natural rezistent la vancomicina, teicoplanina, neomicina; sensibil la penicilina, cefalosporine (cefotaxim, ceftriaxona, cefazolin), imipenem, piperacilin, c1indamicina, florochinolone (enrofloxacina, danofloxacina, ciprofloxacina). BIBLIOGRAFIE TAKAHASHI, T., T. FUJISAWA et al (1992): DNA relatdness among Erysipelothrix rllllsiopathiae strainsrepresenting all Iwenty/three serovars and Erysipelothrix tonsil/arulIl. Jm. J. Syst. Rae/erial. 42:469. TAKAHASHI, T., T. FUJISAWA et al (1992): Erysipelothrix /o/lSillarum sp. novo isolated from tonsils of apparently health pigs. Jnt. J. Syst. Bacteriol. 37:166. GARRITY, G. M., J. G. HOLT (200): An overview of the road map to the manual New York: Bergey's Mannual Trust. TALAN, D.A., D.M. CITRON ct al (1999): Bacteriologic analysis of infected dog and cat bites. N. Engl J. raed. 340:285-292. DUNBAR, S. A., J. E. CLARRIDGE (2000): Potenrial errors in recognition of Erysipelothrix rhusiopa/hiae. J. Clin.Microbiol. 38: 1302-1304.

694

31. IDENTIFICAREA BACILILOR GRAM-NEGATIVI AEROBI GLUCOZO-FERMENTATIVI 31.1. IDENTIFICAREA BACTERIACEAE

FAMILIEI

ENTERO-

3 I. I. I. 3 I. I .2. 3 I. 1.3. 3 I .1.4.

Minidefinitie Consideratii taxonomice Habitat ~i implicatii in patologie Obtinerea culturii pure a enterobacteriilor la izolarea din prelevate contaminate 3 I .1.5. Caractere de cultivare 3 1.1.6. Teste biochimice definitive

prelimillare

versus

3 I. I. 7. Tipizarea antigenica ~i aite teste de identificare definitiva a entrobacteriaceelor 31.1.8. Tehnici alterne, neconventionale identificare a enterobacteriaceelor

de

31.1 A. ldentificarea genului EscherichiaShigella 31.1 A.l. Minidefinitii 31.1A.2. Consideratii taxonomice 31.1A.3. Habitat ~i implicatii in patologie 31.1A.4. Obtinerea culturii pure 31.1 A.5. Caractere de cultivare 31.1A.6. Identificarea 3 1.1A. 7. Identificarea

preiiminara de certitudine

31.1 A.8. Tiparea 31.1A.9. Metode neconventiollale de depistare ~i identificare a genului EscherchiaShigella 31.1B. Idemijicarea gellului Salmonella 31.1B. I. Minidefinitie 31.1 B.2. Consideratii taxonomice ~i nomen cIatura 31.1B.3. 31. I B.4. 31.IB.5. 31.1B.6. 3I.1B.7. 31.1B.8.

Habitat ~i implicatii in vatologie Obtinerea culturii pure Caractere microscopice Caractere de cultivare Identificarea preliminara Identificarea de certiturHne

3I.1B.9. Metode detectare vate

alterne (neconventionale) de a salmonelelor direct in prele-

31.1 C. ldelltijicarea gellului Yersinia 31. I C. I. Minidefinitie 3 1.1C.2. Consideratii taxonomice 3 I. I C.3. Habitat ~i implicatii in patologie 31.1 C.4. Obtinerea culturii pure necesarii tificarii 31.1 C.5. Caractere de cultivare

iden-

3 1.1C.6. 3I.1C.7. 31.1 C.8. 31.1 C.9.

Caractere microscopice Teste preliminare Teste definitive Detectarea yersiniilor prin metode neconventionale direct in prelevat 31.1 D. Idelltijicarea enterobacteriA-ceelol' co//{lipOllat patogene 31.1E.ldelltijicarea ellterobacteria-ceelor oca:,iollal patogelle 31.2. IDENTIFICAREA FAMILIEI VIBRIONACEAE 3 I .2A. ldelltijicarea vibriolli/or 3 I .2A.l. Minidefinitii 31.2A.2. Consideratii taxonomice 31.2A.3. Habitat ~i implicatii in patologie 31.2A.4. Obtinerea cuIturii pure 31.2A.5. Caractere de cultivare 31.2A.6. Caractere microscopice 31.2A.7. Teste preliminare 31.2A.8. Teste definitive 31.2B. Idelltijicarea taxollomica 31.2B.l. Minidefinitie 31.2B.2. Consideratii taxonomice 31.2B.3. Habitat ~i implicatii in patologie 31.2B.4. Obtinerea culturii pure 31.2B.5. Caractere de cultivare 31.2B.6. Caractere microscopice 3 1.2B. 7. Teste preliminare 31.2B.8. Teste definitive 31.2C. ldelltijicarea gellului plesiolllOllaS

31.1. IDENTIFICAREA FAMILIEI ENTEROBACTERIACEAE (MARIAN NEGUT)

31.1.1. Minidefinitie Familia Enterobacteric:ceae reune~te baeili gram-negativi, nesporulati, mobili grin flageli peritriehi sau imobili: Nepretentio~i nutritiv, erese pe medii eu peptona in prezenta bilei. Fennenteaza glueoza, sant oxidazo-negativi, pro due eatalaza ~iredue nitratii in nitriti. 695

31.1.2. Consideratii taxonomice Familia Enterobacteriaceae reune~te In prezent 44 genuri, dintre care 25 au fost implicate semnificativ In patologia umana. In tabelul 31-1 este redata lista genurilor ~i speciilor dupa Manualullui Bergey de Bacteriologie sistematica (edi!ia III/2004). TobelIl13]·! Familia Enterobacteriaeae: grupe taxonomice (Garrity M.G .. Bell A.J., Lilburn G.T. In : Taxonomic outline of the prokaryotes - Bergey's Manual of Systematic Bacteriology - Sec. Ed. Springer N.Y., 2004)

-

7

I

- Numar Genul Specii davisae tarda freundii 12 16 473110 ---- nasoniae americana alvei cloacae 28 herl11annii agarolyticus fitopatogen pneumoniae cu importanla specii medicaIa agglomerans neteri diversus sakazakii rhinosclerol11atis -- taylorae al11alonaticus vulneris cryocrescens gergoviae aerogenes lapagei fergusonii

696

- - coli ascorbata - ozaenae oxytoca

(continuare)

TabeluI3/-/

--

I

-

- specii medicaJa Genul 7 alcalifaciens 612 enterica 2 9 morganii marcescens ----- otvseos oroteus adecarboxvlata agglomerans 8 3 46I11 shigelJoides fitopatogen vulgaris dysenteriae 0 ntiiSpeciiNumar grim pestis cu importania rubidaea sonnei mirabilis oenneri flexneri richardii arizonae enteritidis stuartii . choleraesuis tvohimurium --- Jiquefaciens enterocolitica pseudotuberculosis rettgeri rustigianii boydii bongori qumovorans typhi myxofaciens paratyphi plymuthica

697

__

iiiiil

•• _~ •,_ •••__

~--~~~~-_-,.,,""""'c,,",';±,,~

,"',,="'.,;m;; •• ,ffi ••"' •• rr!~"'"'..••..••.....

Multe genuri cuprind specii noi, descrise ori reconsiderate ca apartenenta la aceste grupari taxonomice in ultimul deceniu. Majoritatea nu au inca 0 semnificatie medicala bine definita. Genurile Escherichia ~iShigella au fost redefinite iar Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Citrobacter au fost extinse cu un numar considerabil de specii. Genul Salmonella a fost extins la opt specii: Salmonella enterica (cu 7 subspecii), S. bongori. S. Cholerasuis, S. arizonae, S. poratyphi, S. typhi, S. typhimurium. Pentru a evita confuziile detenninate de frecventele modificari taxonomice in cadrul acestui gen, sugeram pastrarea nomenclaturii propuse de Centrul International OMS - Paris care exista in practica de mai multi ani in tara noastra. Denumirea lizovarurilor cuprinde denumirea speciei, a serovarului ~i a lizovarului conform schemei de tipizare. Din pacate, aceasta nomenclatura dictata de complexitatea taxonomica a enterobacteriaceelor creeaza dificultati la interpret area buletinelor de analiza de catre practicienii familiarizati cu denumirile vechi.

31.1.3. Habitat ~i implicatii in patologie Enterobacteriaceele sunt omnipr.ezente in microbiota intestinala a animalelor ~i omului: fecalele contin peste 10\0 enterobacterii/g. Pe aceasta cale se raspandesc larg in mediul ambiant: sol, ape, plante ~i animale. Specii din genurile Escherichia, Klebsiella. Enterobacter, Serratia, Proteus sunt curent prezente in mediile naturale participfmd in ecosisteme de reciclare biologicii. Unele specii de Salmonella (ser. Typhi, ser. Paratyphi) ~iShigella au un cadru ecologic limitat fiind intalnite numai la om ~iocazional, din aceea~i sursa, in ape de suprafata ~i sol. Cu putine excep!ii, enterobacteriaceele intalnite la om au reputatia de patogeni intestinali, fiind pretutindeni in lume agentul etiologic cel mai frecvent al sindromului diareic infec!ios. Genurile Salmonella, Yersinia, Shigella ~i unele patotipuri de E. coli sunt recunoscute ca "patogeni intestinali recunoscu!i", izolarea lor fiind intotdeauna etiologic semnificativa. In tabelul 31-2 este prezentata comparativ frecventa implicarii in infectii umane. localizate ~i generalizate, a principalelor genuri de Enterobacteriaceae. In timp ce shigelele sunt patogeni intestinali prin excelenta, rareori implicali in alte tipuri de imbolnaviri, Serratia, Morganella ~i Proteus sunt patogeni exclusiv extraintestinali. Rarele tulburari disbiotice, rezultat al unei antibioticoterapii excesive ori colonizari anomlale, nu sunt semnificative clinic pentru a Ie acorda statut de "patogeni intestinali". La Escherichia coli sunt astazi definite mai multe patotipuri diareigene in raport cu modul de agresiune asupra enterocitelor (vezi 31.1A). Factori genetici bine cunoscuti determina comportamente patogenice diferite la aceasta specie modificand astfel statutul de "saprofit" comensal al acestei grupari. Studii multiple releva, de asemenea, rolul dominant al enterobacteriaceelor in infectiile tractusului urinal'. Intre acestea Escherichia este cel mai frecvent in cauza fiind urmata de Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus mirabilis, Citrobacter spp. ~i Serratia marcescens. 698

Tabelul31-2

-,-

Implicatii ale enterobacteriaceelor in patologia umana"

-

+++ + -±-++±±+-Respirator -+±Alteleb +++d -;+ + +++ +++ ++ ++ +++ sistemiee Gruparea Genitourinar Intestinal Salmoneloze sistemice

+++, ++pestis Infeetii loealizate Y. Infeqii

a Simboluri: +++ = freevent sau forma uzuala de manifestare; ++ = ocazional sau forma posibila de manifestare; + = rar; ± = posibiI; - = nesemnalat. b Localiz1iri musculo-scheletice (artrite, osteite, abeese), piodelmite etc. , Schigellaflexlleri este semnalata drept cauza a unor keratite d YersiniiIe diareigene: Y. enterocolitica. Y. pseudotuberculosis. rar Y.ji-ederiksenii e La gazde imunoeompromise infeepii eu Y. pselidotuberculosis, Y. emerocolitica pot evolua baeteriemie.

In infectii nosocomiale musculo-scheletale ~i cutanate, Escherichia coli Serratia spp. ~i Enterobacter spp. ocupa incidenta imediata dupa stafilococi ~i pseudomonade. Cel putin 0 treime din pneumonii ~i infectiile cavitatilor conexe tractusului respirator superior sunt determinate de asemenea de Enterobacteriaceae. Salmonella typhi ~i paratyphi ca ~i Yersinia pestis determina Intotdeauna infectii grave septicemice, dar frecventa lor a devenit extrem de restransa. Au devenit Insa frecvente bacteriemiile ~i septicemiile determinate de celelalte Enterobacteriaceae. In primul rand Escherichia, Enterobacter ~i Klebsiella. In tabelul 31-3 este prezentata 0 ierarhizare, dupa criteriul patogenitatii, a enterobacteriaceelor frecvent izolate In laboratorul clinic. Prima categorie cuprinde enterobacterii cu semnificatie clinica ori de cate ori sunt izolate. Semnificatia clinic a a enterobacteriilor etichetate "conditionat patogene" sau "ocazional patogene" trebuie argumentata confonn criteriilor precizate In Capitolele 1, 9, 11-19. 699

ne onat ne onal

T{[bellil 3 J-3

Categorii de patogenitate la Enterobacteriaceae Cedecea --Hajilia -Enterobactere Salmonella Categoria --Gruparea Citrobacter din Certa inchise. cavitati taxonomica Semnificatia etiologica hemoculturi. colcC(ii neabcedate) necontaminate (Iichid in cefalorahidian. prelevate Izolate semnificativ prelevate -Pantoea Xenorhabdus Leminorella Tatumella Yokenella Serratia - -Kluyvera Yersinia decat intestinala urinara) (fenotipurile diareigene ~i uropatogene de sau E. coli) I

31.1.4. Obtinerea culturii pure a enterobacteriilor la izolarea din prelevatecontaminate a fast detaliata in Capitolul19. 31.1.5. Caractere

de cultivare

Definitoriu, enterobacteriaceele sunt organisme facultativ anaerobe, care cresc peste noapte la 35°-37°C pe medii nutritive simple. Tabelul 31-4 sintetizeaza principalele caractere de cultivare ale aces tor organisme pe mediile Tara inhibitori, lichide ~i agarizate. T{[bellil3]-4

Caracterele de cultivare ale enterobacteriaceelor pe medii nutritive simple (incubare 24 ore la 35°-37°C) Tulbure unifonna Aspecte aleori culturii Fonna"R" inel val ~idepozitII rara depozit. In Limpede grade diferite, oricomune tulbure cu Aspecte particulare Forma "S"

700

-------------Tabelul 3] -4 (continuare)

,$'

(frecvcnte la cu tunde, bombate, cu maragini mucos •Depind Colonii mucoide de mm, rocoroune ale~i4-5 culturii rotunde, Colonii Fonna "R" de 2-3 mm, late, Similare fonnei borobate, Colonii de 2-3 rom, Klebsiella ~ireguEscherichia) late tendin(a laAspecte confluare, aspect Ca pe agarul nutritiv. mgoasa suprafa(a marginile plate, ~i marginile neregude tipul hematiilor Aspecte particulare Fomla "S" hemolizii • Proteus) •Colonii Cre~tere pigmentatea invaziva: in jurul centrice se dezvolta (caracteristica zone de migrare pentrucolonici genul COll-

a

Pigment ro~u (Serratia spp.), galben (Enterobacter spp, Xenorhabdus spp.), brull (Xenorhabdus spp.).

31.1.6. Teste biochimice preliminare versus definitive Necesitatea definirii ~i identifidirii impresionantului numar de entitati taxonomice incluse in familia Enterobacteriaceae - 28 genuri ~i peste 100 de specii cu interes medical - a determinat a importanta largire a gamei de teste biochimice. Tabelul 31-5 reda, intr-o forma restransa la 25 de teste, a schema de incadrare a izolatelor din prelevate umane in genurile de interes medical. Mediile, reactivii ~i citirea testelor respective sunt pre zen tate in Capitolele 39, 40 pre cum ~i in instructiunile producatorilor. In fig. 31-1 schematizam metodologia identificarii biochimice respectiv posibilitati Ie de utilizare a sistemelor conventionale, sistemelor multi test ~i a celor microtest. • Sistemele conven{ionale asociaza teste in baterii variabile ca extindere in functie de practica laboratoarelor. Volumul marede munca ~imateriale necesitate de seturile din ce in ce mai extinse s-au dovedit prohibitive pentru multe laboratoare. In sistemele conventionale curente operam fie cu scheme reduse (fiabilitate discutabila) accesibile ~i laboratoarelor clinice, fie cu scheme largite practicate in centre zona Ie ori de referinta (costuri relativ ridicate). Sistemele conventionale ram an insa "referinta" pentru toate celelalte sisteme test exoenzimatice. • Sistemele multi test, asocierea mai multor teste in acela~i volum reactiv, au cunoscut a larga raspfmdire datorita un or avantaje economice de necontestat. Din multitudinea de variante propuse, la noi in tara, cel mai mult sunt folosite asocierile TSI (Triple Sugar Iron) Cll MIU (Mobilitate, Indol, Uree) ori cu MILF (Mobilitate, Indol, Lizina, Fenilalanina). 701

:1

oN

-.J

.-

N,," ~ - ".~,._. _.--_.~---

Tabellll31-5 Familia Enterobacteriaceae: identificarea biochimica a prin

'is ~ ,-

:.:::

'r;: c

'-e"

'§

"" l:::-

>e"

~

Scheme de tipare fagicii §i bacteriocinicii au fost utilizate, de asemenea, pentL C. divers us. Citrobacter amalonaticus nu este sensibilia bacteriofagi ~i nici nu produ:;: bacteriocine. Rezistotipia se poate efectua cu antibiotice fata de care genul Citrobacter este > general sensibil: aminoglicozide, cefalosporine din generatiile II ~iIII ~itluorochinolon;: Celelalte specii de Citrobactel; sporadic izolate, nu au inca dezvoltate scheme c;: tipizare.

2. Genul Klebsiella Minidefinitie. Genul Klebsiella este 0 grupare de Enterobacteriaceae imobi];: incapsulate, care fermenteaza glucoza cu producere de mari cantitati de gaz (exceptie j.' rhinoscleromatis). Pe mediile gelozate simple sau slab selective cre~te repede forman: deobicei colonii mucoide. Fermenteaza majoritatea zaharurilor (exceptie dulcitolul) ~iprcduce acetoina din glucoza (reactia Voges-Proskauer pozitiva). Speciile Intalnite frecyer:: in patologia umana cresc pe medii Ie cu citrat (Simmons), produc lizindecarboxilaza 3 ureaza. Nu produce H,S ~i fenilalanindeaminaza. Taxonomic genuleste alcatuit din 10 specii. Diferentiere a patru dintre aceste:: printr-un set minim de teste biochimice este prezentata In tabeluI3l-2l. Diferentele major;: constau in producerea de indol: K. oxytoca. Klebsiella ozenae este singura specie malon::: negativa. Cat prive~te K. rhinoscleromatis sediferentiaza net de celelalte specii prir incapacitatea ei de a produce indol, acetoina, ureaza, ornitin decarboxilazl".. lizindecarboxilaza ~i ~-galactozidaza. Importanta in patologie. Klebsiella pneumonise ~i K. oxytoca sunt cele TIE frecvente enterobacteriacee In infectiile nosocomiale. Ambele specii au fost izolate dir bronhopneumonii, infectii urinare, enetrite, mai ales la copii, ~ipost operator In complic::( septice generalizate ori localizate. Septicemiile cu Klebsiella au un prognostic sever. 740

Tabelul31-21

Diferentierea biochimica a speciilor de Klebsiella (procente reactii pozitive dupa Farmer, ] 995) Ornitin80 100 103 40 98 99 09 90 99 0 50Lizin990 decarboxidecarboxilaza Malon atIndol 98 95. 95 9ONPG 33 Ureaza 98 laza

Voges-

Klebsiella rhinoscleromatis ~i K. ozenae sunt exceptional de rar IntaInite In patologia specifidi ORL in tara noastra. Celelalte specii: au fost ocazional semnalate In patologia umana. Identificarea preliminara se bazeaza pe caracterele de cultivare ~i reactiile matebolice, pe asocierea de medii multi test ISI ~i MILF (tabelele 19-7 ~i 31-6). Pe mediile de izolare gelozate simple Klebsiella dezvolta In 24 ore la 37°C colonii mari de 2-3 mm, rotunde, bombate, umede cu aspect mucoid. Acest aspect se accentuiaza la 48 ore dind diametrul coloniilor atinge 3-4 mm ~iapare 0 evidenta tendinta la conf1uare. Pe mediile slab selective coloniile sunt lactozo-pozitive ~ipastreaza caracterul mucoid. Frecvent Klebsiella se dezvolta ~i pe mediile moderat selective, ADCL, SS, XLD. Coloniile pe aceste medii sunt caracteristic lactozii/xiloza-pozitive la 48 ore Insa caracterul mucoid este mai putin pregnant ca pe celelalte medii. Reactiile metabolice pe mediile TSI ~i MILF permit 0 diferentiere clara a speciilor de Klesbiella. fiind posibila chiar 0 diferentiere a celor doua specii Intalnite frecvent la am: K. pneumoniae ~iK. oxytoca. Ambele specii produc mari cantitati de gaz din glucoza, nu produc H2S in mediul TSI ~i fermenteaza repede lactoza/zaharoza; sunt imobile (caracteristica importanta ce separa genul Klebsiella de Enterobacte/; Hafhia ~i Serratia), produc lizindecarboxilaza ~i nu produc fenilalanideaminaza. Klebsiella oxytoca produce indol, caracter unic ce 0 diferentiaza de K. pneumoniae. Identificarea definitiva ldentificarea biochimidi comporta un set largit de minimum 20 caractere testate conventional sau in sisteme microtest. lncadrarea in specie se poate face coroborfmd reactiile setului restrans din tabelul31-21 ori pe setullargit. Setullargit permite elucidarea unoI' situatii confuze de diferentiere fata de posibile tulpini de Enterobacter imobile. Tzparea serologidi se practica in laboratoare specializate dupa schema Kauffman ~i Orscov. lncadrarea intr-un serovar "K" se.poate face prin aglutinare, coaglutinare ori, mai convenabil, prin latex aglutinare. 741

-~

~~

.~~!

Prin oricare din aceste metode incadrarea este laborioasa ~i pretentioasa datorita numarului mare de serovaruri, 77, ~i a inrudirilor antigenice frecvente dintre serovaruri. Tiparea bacteriofagidi. Exista mai multe scheme regionale ori autohtone. In Institutul Cantacuzino se folose~te 0 schema combinata Slopek-Milch adirionata cu 0 schema autohtona preconizata de Popovici et. al. Tiparea bacteriofagica este mai accesibila, mai simpla ~i toto data mai avantajoasa economic. Rezistotipia trebuie sa ia in considerarie rezistenra inalta ~imultipla a genului Klebsiella la antibiotice. In principiu sunt active pe Klebsiella: cefalosporinele din generaria a III-a, floxacinele, colimicina ~igentamicina. Tiparea prin mijloace genetice. Stabilirea spectrului plasmidic, indeosebi la tulpinile din mediul spitalicesc, este una din modalitatile curente de tipare laKlebsiella. Identificarea ~istudiul plasmidelor de virulenta a fost mentionata ca fiind utila ~iin estimari de activitate patogena.

3. Genul Enterobacter Minidefinitie: 0 grupare de Enterobacteriaceae mobile, care, cu exceptia E. agglomerans, fermenteaza glucoza cu mari cantitari de gaz lactoza (~-galactozidaza pozitiv), ramnoza ~i sorbitolul. Produce acetilmetilcarbinol, (reacrie Voges-Proskauer pozitiva) ~i ornitindecarboxilaza. Nu produce indol, H2S ~ifenilalanideaminaza. Taxonomic, genul Enterobacter cuprinde 16 specii, insa dintre acestea numai doua se intalnesc frecvent in infectii spitalice~ti, iar alte 7 au fast izolate ocazional din procese patologice de la om. In tabelul 31-22 este prezentata a schema restransa de teste biochimice prin care putem diferenria principalele specii intalnite la am. Tabelli/3J·22

Diferelltierea biochimicii a speclilor de

(procente reactii pozitive dupii Farmer, '2 .5 N •... < '" •• §c.::95 ''0 'd 'K c100 N 1 100 78 94 9 9 8 0 60 100 21 00 70 0 93 96 1 9 87 0 3 9 1 99 75 30 20 3 0 0 9 0N 7 99 0~ 97 65 75 ,97 18 98 g 96 7 91 2 100 55 98 25 95 ". ~..c:: ~ ~ g E '2 ~.g ~ :~ ~ •... '0= 0= CIl

'K

,0= 0= 'd 0"0 ::J 0= 90 00 98

]~ Cl

"Produc pigment galben

742

"0

C3

Intalnite la om

Ellterobacter

1995) ,d

Identificarea preliminara a genu1ui Enterobacter 0 facem ca pentru toate grupele descrise pana acum pe baza caractere10r de cultivare pe mediile nutritive simple ~i slab selective ~i printr-un set minim de teste biochimice cuprinse in asocierea TSI-MILF. Pe mediile simple toate speciile de Enterobacter se dezvolta repede form and in 24 ie ore la 37°C colonii mari de 2-3 mm, rotunde, tipice "S". Unele tulpini de E. agglomerans ietermina colonii rugoase "conopidiforme". Enterobacter sakazakii ~i E. agglomerans ;roduc constant, in 2-4 zile, un pigment galben caracteristic. Pe mediile slab selective : l}loniilesunt mari, lactozo-pozitive. Enterobacter aerogenes poate fonna colonii lactozo::')zitive, mari, asemanatoare cu cele de la Klebsiella. In principiu, genul Enterobacter nu iezvolta colonii pe mediiIe moderat selective. Speciile de Enterobacter fermenteaza glucoza cu fom1are de gaz (exceptie fac TJ.ele biovaruri de E. agglomerans), nu produc H2S, fermenteaza lactoza/zaharoza, sunt :::'.obile,nu produc indol ~ifenilalanideaminaza, iar lizindecarboxilaza au numai doua dintre specii (E. aerogenes Si E. gergoviae). Identificarea definitiva este in primul rand exoenzomatica ~ibazatii pe seturi largite de teste (Tabe1ul 31-5). Un set minim de teste utile pentru diferentierea speciilor de Enterobacter este prezentat in tabelul 31-22. Pentru speciile de interes medical au fost propuse scheme de tipare serologica, biochimica ~igenetica. Identificarea spectrului plasmidic a devenit una din tipizarile frecvent utilizate in investigarea infectiilor spitalice~ti produse'de E. aerogenes Si E. cloacae. Alte metode de tipare genetic a au fost sporadic utilizate. Rezistotipia poate fi de asemeni '.Hila,speciile de Enterobacter avand sensibilitati variate la floxacine, cefalosporine din generatia a III-a ~i aminoglicozide.

4. Genul Hafnia Minidefinitie: Genu1 Hafnia, constituit dintr-o singura specie, H alvei, este 0 grupare de enterobacterii mobile, care produc gaz din glucoza, lizin- ~i omitindecarboxilaza ~i l3-galactozidaza; nu produc H2S, indol, ureazii ~i fenilalanideaminaza. Activitatea fennentativa, decarboxilazica ~i mobilitatea sunt mai active la 30°C. De~i izolata relativ frecvent de la om din materiile fecale, enteropatogenitatea acestei enterobacterii este inca discutata. Posibila imp1icare in trahebron~ite post-intubatie ori in infectiile tractusului urinar plaseaza Hafnia mai degraba in categoria patogenilor ocazionali. Identificarea preliminara se bazeaza deopotriva pe caracteristicile de cultivare ~i exoenzimatice. Hafnia se dezvolta cu u~urinta pe mediile uzuale (mai rapid 1a 30°C) detenninand colonii tip ice "S", mai rar "R". Pe medii Ie moderate ~i slab selective se comporta ca 0 enterobacterie 1actozo-negativa. De obicei produce cantitati mici de gaz din glucoza, nu fermenteaza lactoza/zaharoza ~i nu produce H2S. Pe me diu 1 MILF este anindologena. imobi1a uneori 1a 37°C, dar mobila 1a 30°C, decarboxileaza lizina ~i nu produce feniIa1anideaminaza. Lizindecarboxilaza pozitiva ~iabsenta producerii de indol accentueaza proportia de identificari gre~ite ca Salmonella. 743

Prin oricare din aceste metode incadrarea este laborioasa ~i pretentioasa datoriti'o numarului mare de serovaruri, 77, ~i a inrudirilor antigenice frecvente dintre serovaruri. Tiparea bacteriofagica. Exista mai multe scheme regionale ori autohtone. In Institutul Cantacuzino se folose~te 0 schema combinata Slopek-Milch aditionata cu 0 schema autohtona preconizata de Popovici et. al. Tiparea bacteriofagica este mai accesibila. mai simpla ~i totodata mai avantajoasa economic. Rezistotipia trebuie sa ia in consideratie rezistenta inalta ~imultipla a genului Klebsiella la antibiotice. In principiu sunt active pe Klebsiella: cefalosporinele din generatia a III-a, floxacinele, colimicina ~igentamicina. Tiparea prin mijloace genetice. Stabilirea spectrului plasmidic, indeosebi la tulpinile din mediul spitalicesc, este una din modalitatile curente de tipare la Klebsiella. Identificarea ~istudiul plasmidelor de virulenta a fost mentionata ca fiind utila ~iin estimari de activitate patogena.

3. Genul Enterobacter Minidefinitie: 0 grupare de Enterobacteriaceae mobile, care, cu exceptia E. agglomerans, fermenteaza glucoza cu mari cantitati de gaz lactoza (~-galactozidaza pozitiv), ramnoza ~i sorbitolul. Produce acetilmeti1carbinol, (reactie Voges-Proskauer pozitiva) ~i omitindecarboxilaza. Nu produce indol, H2S ~ifenilalanideaminaza. Taxonomic, genul Enterobacter cuprinde 16 specii, insa dintre acestea numai doua se intalnese freevent in infectii spitaliee~ti, iar alte 7 au fost izolate ocazional din procese patologice de la om .. In tabelul 31-22 este prezentata 0 schema restransa de teste biochimice prin care put em diferentia principalele specii intalnite la om. Tabelul31-22

DiCerentierea biochimica a speclilor de Ellterobacter

intalnite la om

(procentereaqii pozitivedupa Farmer, 1995)

ta

.,d

..c; '"

,'" 0 98 "0 ,'" N 0 :::J '£ ~ 9000

"Produc pigment galben

742

'"

'2

0

Identificarea preliminadi a genului Enterobacter 0 facem ca pentru toate grupele :~scrise panii acum pe baza caracterelor de cultivare pe mediile nutritive simple ~i slab ,dective ~iprintr-un set minim de teste biochimice cuprinse In asocierea TSI-MJLF. Pe mediile simple toate speciile de Enterobacter se dezvoltii repede formand in 24 :~ ore la 37°C colonii mari de 2-3 mm, rotunde, tipice ,,s". Uneletulpini deE. agglomerans --:eterminiicolonii rugoase "conopidiforme". Enterobacter sakazakii ~i E. agglomerans :roduc constant, In 2-4 zile, un pigment galben caracteristic. Pe mediile slab selective 2Jloniile sunt mari, lactozo-pozitive. Enterobacter aerogenes poate forma colonii lactozopozitive, mari, asemaniitoare cu cele de la Klebsiella. In principiu, genul Enterobacter nu dezvoltii colonii pe mediile moderat selective. Speciile de Enterobacter fermenteazii glucoza cu fOffilare de gaz (exceptie fac unele biovaruri de E. agglomerans), nu produc H2S, fermenteazii lactoza/zaharoza, sunt mobile, nu produc indol ~ifenilalanideaminaza, iar lizindecarboxilaza au numai doua dintre specii (E. aerogenes $i E. gergoviae). Identificarea definitiva este in primul rand exoenzomaticii ~ibazatii pe seturi liirgite de teste (Tabelul 31-5). Un set minim de teste utile pentro diferentierea speciilor de Enterobacter este prezentat in tabeluI31-22. Pentru speciile de interes medical au fost propuse scheme de tipare serologica, biochimica ~igenetica. Identificarea spectrului plasmidic a devenit una din tipizarile frecvent utilizate In investigarea infectiilor spitalice~ti produse 'de E. aerogenes $i E. cloacae. Alte metode de tipare geneticii au fost sporadic utilizate. Rezistotipia po ate fi de asemeni utilii, speciile de Enterobacter avand sensibilitiiti variate la floxacine, cefalosporine din generatia a III-a ~i aminoglicozide.

4. GenulHafnia Minidefinitie: Genul Hafnia, constituit dintr-o singurii specie, H alvei, este 0 grupare de enterobacterii mobile, care produc gaz din glucoza, lizin- ~i ornitindecarboxilazii ~i f3-galactozidazii; nu produc HzS, indol, ureazii ~i fenilalanideaminazii. Activitatea fermentativa, decarboxilazicii ~i mobilitatea sunt mai active la 30°C. De~i izolatii relativ frecvent de la om din materiile fecale, enteropatogenitatea acestei enterobacterii este incii discutatii. Posibila implicare in trahebron~ite post-intubatie ori in infectiile tractusului urinar plaseazii Hafnia mai degrabii in categoria patogenilor ocazionali. Identificarea preliminara se bazeaza deopotrivii pe caracteristicile de cultivare ~i exoenzimatice. Hafnia se dezvoltii cu u~urintii pe mediile uzuale (mai rapid la 30°C) determinand colonii tipice ,,s", mai rar "R". Pe mediile moderate ~i slab selective se comporta ca 0 enterobacterie lactozo-negativii. De obicei produce cantitiiti mici de gaz din glucoza, nu fermenteaza lactozalzaharoza ~i nu produce H2S. Pe mediul MILF este anindologena, imobila uneori la 3rC, dar mobilii la 30°C, decarboxileazii lizina ~i nu produce fenilalanideaminazii. Lizindecarboxilaza pozitivii ~iabsenta producerii de indol accentueaza proportia de identificari gre~ite ca Salmonella. 743

Identificarea definitiva. Investigarea exoenzimatidi prin setul extins de teste biochimice (tabelul 31-5) 0 facem pentru a elimina confuziile atat cu Salmonella, cat $i cu alte genuri, genetic $i fenotipic apropiate, ca Enterobacter ~i Serratia. Pe baza a 60 de factori antigenici ,,0" ~i 34 "H" a fost dezvoltata 0 schema de serotipie care are insa schema de tipare fagica, incercata, a fost abandonata din lipsa de o utilizare restransa. sensibilitate (peste 20% din tu1pini netipabi1e).

°

5. Genul Serratia

°

Minidefinitie: grupare de enterobacteriacee mobile, care se dezvolta luxuriant pe mediile simple ~i slab ori moderat selective. Metabolic, Serratia produce cantitati mici de gaz din glucoza (5. marcescens este frecvent agazogena), produce decarboxilaze, dezoxiribonucleaze, proteaze, lipaze, fem1enteaza lactoza tardiv (este insii prompt ~-galactozidaza pozitivii), nu produce indol, H2S ~i fenilalanideaminaza. Testul VogesProskauer este pozitiv. Taxonomic genul include in prezent 12 entitii!i cu rang de specie $i dintre acestea 10 au fost izolate din procese infec!ioase la om. in tabelul31-23 este prezentat un set restrans de teste biochimice care diferentiazii principalele specii cu interes medical. Tabelul

3 J-23

Diferentierea speciilor de Serratia (procentc reaclii pozitive dupa Farmer.

,jc'£0'§

••'0 ~ ""0)~ >C. '" .5 '.:1 :s -e 0"0 N 100 3099 94 0 U C 0 75 40 79 100 97 30 100 100 0 50 50 0 95 88 51::lU8 0 0 95 0(; 0 99 :::0 98 55 ';( 99 4 3 :0 :: 0'£ l .L.. ll:> Q.. ..•. ll:> 1:1' I:l::I

~

"-~ ~~§~.~~~ti~Sa

'~~~~ ~~~e ~-.0:§ ~'~s~~ ~~.gE:a ~

>-:Cl..I:) ,...I:)::"""',::::'""::iaEO