Transporte Electronico

 

 

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA SANITARIA

LABORATORIO DE BIOQUIMICA HORA: 13:30 - 15:30 TEMA: TRANSPORTE ELECTRONICO: ESTUDIO DE LA ACCION ENZIMATICA DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA Y DE LACTATO DESHIDROGENASA

SEMESTRE: AREQUIPA –  PERÚ  PERÚ 

 

TRANSPORTE ELECTRONICO: ESTUDIO DE LA ACCION ENZIMATICA DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA Y DE LACTATO DESHIDROGENASA

OBJETIVO 1. Poner de manifiesto experimentalmente una de las etapas del metabolismo intermediario y la acción de oxido-reducción, haciendo uso de un aceptor de electrones comode el las azulenzimas de metileno. 2. Verificar la acción inhibitoria inhibitoria del malonato sobre la succinato deshidrogenasa y del cianuro a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial.

INTRODUCCIÓN Las transformaciones biológicas de sustratos comprenden procesos de oxidoreducción y transferencia de electrones a través de una serie de sistemas enzimáticos. En las oxido-reducciones se produce transferencia de electrones a partir de un dador hasta un aceptor. Algunas veces el transporte de electrones es realizado mediante la transferencia de átomos de hidrógeno o bien átomos de hidrógeno y un electrón. Las enzimas que realizan este tipo de reaccione son las deshidrogenasas pudiendo ser piridin (NAD, NADH) o flavina (FAD) dependientes; además existen los citocromos que son de naturaleza ferroporfirínica y se encuentran ordenados de acuerdo a su potencial de oxido reducción constituyendo la llamada "Cadena de Transporte Mitocondrial". Algunos compuestos orgánicos coloreados, al aceptar hidrógenos se convierten en leucoderivados. Tal es el caso del azul de metileno cuyo potencial de oxido-reducción es +0.01 y el 2,6-diclorofenolindofenol cuyo potencial de oxido-reducción es +0.22. La succinato deshidrogenasa (SHD) es enlace una flavoproteína unida de a hierro noyhémico. El metal tiene como finalidad actuar como para conservación energía desacoplar los dos equivalentes reductores del ion hidrogeno aceptado por la flavina y, finalmente estabilizar la forma semiquinoide de la flavina. Diversas sustancias pueden actuar inhibiendo los sistemas biológicos de oxidoreducción. Por ejemplo, el malonato actúa específicamente inhibiendo a la succinato deshidrogenasa por un mecanismo competitivo; por lo tanto la prueba experimental con azul de metileno será negativa, es decir no se decolora por no haber movilización de electrones. El cianuro, actúa impidiendo la reoxidación de los citocromos, pues se combina específicamente con el Fe++ de la citocromo oxidasa; por ello los citocromos  permanecen reducidos e incapaces de seguir actuando y se bloquea la respiración.

 

 

 

 

MATERIALES   Sucrosa

0.25 M   Succinato de sodio 0.1 M   Malonato de sodio 0.5 M   Buffer fosfato pH 7.4 0.1 M   Azul de metileno 0.05%   Aceite mineral 

Tubos de    Pipetas

ensayo

  Morteros   Centrífuga   Gradilla

PARTE EXPERIMENTAL METODO DE TRABAJO -Preparación del homogenizado. Colocar un mortero sobre hielo picado, luego pesar 10.0 g. de hígado, corazón o músculo de rata o de conejo; picarlo y colocarlo sobre el mortero. Añadir 90.0 ml de sucrosa 0.25 M la cual debe estar fría, homogenizar y luego centrifugar a 8000 rpm durante 10 min. Decantar el sobrenadante en un beaker y guardarlo e frío hasta su uso.

Figura 1: se utilizó hígado de un cuy para la experimentación

 

Prepare el siguiente sistema de tubos: Tubo N°

1

2

3

4

Succinato de sodio 0.1 Buffer fosfato pH 7.4 Malonato de sodio Cianuro de potasio 0.1 M Agua destilada

2.0 1.5

0.5 2.0 1.0

0.5 2.0 0.5 0.5

0.5 2.0 0.5 0.5

Azul de metileno 0.05% Extracto enzimático Aceite mineral

0.5 0.5 1.0

0.5 0.5 1.0

0.5 0.5 1.0

0.5 0.5 1.0

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA   Se

colocaron succinato de sodio a los tubos 2,3 y 4 ( el succinato es el sustrato)   Se tomaron cuatro tubos de ensayo a los cuales se les añade Buffer fosfato pH 7.5   luego se añadirá malonato de sodio solo al tubo de ensayo N° 3 (0.5)     colocamos un poco de aceite con la finalidad de que el medio se asemeje a la matriz mitocondrial, ya que representa a un sistema donde no hay oxigeno

El contenido de cada uno de los tubos se mezcla rápidamente antes de agregar el aceite mineral, el cual tiene la función de crear un medio libre de oxígeno. Llevar a baño maría a 37°C observar el decoloramiento de cada tubo cada 5 min. Discuta los resultados.

 

  CONCLUSIONES  

En el hígado se almacena glucógeno como material de reserva.   Al no a ver sustrato, no habrá reacción, y al no haber reacción no se producirán las moléculas reductoras entonces no se dará la cadena transportadora de electrones. Se demostró una de las etapas del metabolismo y la acción de de las enzimas de oxido-reducción, haciendo uso de un aceptor de electrones como el azul de metileno. inhibidora del malonato sobre la succinato deshidrogenasa   Se verifico la acción inhibidora y del cianuro a nivel de la cadena respiratoria r espiratoria mitocondrial.  

BIBLIOGRAFIA J ohn L. Tymoczko, Lubert Stryer)    Bioquímica (Jeremy M. Berg, John   Biología molecular del gen (James D. Watson, Tania A. Baker, Stephen P. Bell, Alexander Gann, Michael Levine, Richard Losick) 

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