Transfer de Embrioni Pentru Bovine

TEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA VACĂ

CUPRINS BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE................................1 1.1. Importanţa transferului de embrioni.............................................................................1 1.1.1. Importanţa zooeconomică....................................................................................1 1.1.2. Importanţa ştiinţifică............................................................................................2 BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA VACĂ........................................3 2.1. Selecţia şi pregătirea vacilor donatoare........................................................................4 2.2. Selecţia şi pregătirea vacilor primitoare (receptoare)..................................................4 2.3. Sincronizarea estrului şi ovulaţiei la vacile donatoare şi primitoare............................4 2.4. Inducerea poliovulaţiei şi însămânţarea artificială a vacilor donatoare.......................5 2.5. Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaţiei...................................................6 2.6. Fecundarea ovocitelor..................................................................................................9 2.7. Recoltarea embrionilor.................................................................................................9 2.8. Căutarea şi aprecierea calităţii embrionilor................................................................12 2.9. Conservarea şi deconservarea embrionilor................................................................14 2.10. Decongelarea embrionilor şi înlăturarea crioprotectorului.....................................15 2.11. Transferul embrionilor............................................................................................16 BIBLIOGRAFIE.......................................................................................................................18

BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE

1.1. Importanţa transferului de embrioni Importanţa transferului de embrioni poate fi zooeconomică şi ştiinţifică. Importanţa zooeconomică.

Lucrările de selecţie şi ameliorare a efectivelor de animale sunt limitate de numărul redus de produşi care se obţin de la o femelă în cursul vieţii sexuale şi de intervalul dintre generaţii. Transferul de embrioni dă posibilitatea folosirii cu eficienţă crescută a rezervelor de ovocite de la animalele de înaltă valoare zootehnică numite donatoare, prin provocarea maturării şi eliberării mai multor gameţi femeli (poliovulaţie) cu obţinerea unui număr mai mare de produşi de la aceeaşi femelă prin transferul embrionilor în uterul femelelor receptoare. Astfel, în decursul vieţii sexuale este valorificată doar o infimă parte din rezerva de ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexuală. De exemplu, vaca începe perioada genitală cu o rezervă de circa 150000 de ovocite ( în ambele ovare), rezervă care diminuă la circa 21000 la vârsta de 2-3 ani şi la circa 2500 la 12-14 ani. Numărul de ovocite eliberate în întreaga viaţă sexuală nu depăşeşte 50, din care în condiţii normale rezultă maxim 10-12 viţei. Prin asigurarea numărului corespunzător de

animale primitoare, de la vacile donatoare se pot obţine, în medie 3-4 viţei pe an, fiind cunoscute cazuri când în condiţii de supraovulaţie, de la o vacă donatoare s-au obţinut 30-35 viţei. Transferul de embrioni se practică şi pentru scurtarea intervalului dintre generaţii. Prin instalarea gestaţiei, femela intră în repaus productiv (sub raportul procreerii) pe întreaga durată a gestaţiei. În cazul practicării transferului de embrioni, produşii de concepţie sunt transferaţi în alte organisme, ceea ce dă posibilitatea obţinerii de noi produşi de la aceeaşi femelă în intervalul de timp în care în mod normal, ar fi trebuit să fie gestantă. Mai mult, în prezent se pot obţine gameţi şi de la tineretul femel prepuber prin provocarea prin mijloace hormonale a maturării şi expulzării ovocitelor, care vor fi apoi transferate în uterul femelelor receptoare. Scurtându-se mult intervalul dintre generaţii, se accelerează ameliorarea efectivelor de animale. Transferul de embrioni reduce considerabil costurile de transport, carantină şi eventualele restricţii sanitar-veterinare în comerţul cu animale, prin conservarea prin congelare a embrionilor. Totodată, prin practicarea transferului de embrioni, se pot obţine produşi de la femelele valoroase dar cu diverse afecţiuni genitale incompatibile cu menţinerea gestaţiei sau cu parturiţia. De asemenea, prin transferul de embrioni se reduce intervalul de timp necesar creării de noi rase de animale cu însuşiri morfoproductive performante care pot forma linii de femele consangvine în vederea folosirii lor la încrucişări industriale. În sinteză, în practica de producţie, transferul de embrioni se aplică pentru rezolvarea următoarelor probleme: - reproducerea accelerată a animalelor de prăsilă, de calitate superioară, a raselor rare, a animalelor din rezerva genetică a purtătoarelor unor însuşiri valoroase (producţii ridicate, capacitate de utilizare intensă a furajelor, prolificitate mare, longevitate productivă, rezistenţă la anumiţi factori nefavorabili etc.); - obţinerea unui număr mare de descendenţi de la femelele cu producţii ridicate şi cu durată prelungită de exploatare, în vederea creării de familii cu aceste însuşiri; - raţionalizarea importului şi exportului animalelor valoroase, ca urmare a transportului embrionilor congelaţi, înlăturându-se astfel barierele sanitarveterinare şi înlesnirea aclimatizării materialului importat, dezvoltarea lui embrionară având loc în organismul primitoarelor; - obţinerea de embrioni liberi de leucoză cu posibilitatea transferului acestora femelelor leuco-negative; - crearea unor bănci de embrioni în vederea păstrării raţionale a rezervelor genetice, ceea ce este mai economic decât întreţinerea unor efective numeroase din rezerva genetică. Importanţa ştiinţifică

Transferul de embrioni reprezintă o biotehnologie prin intermediul căreia se poate efectua, în condiţii optime, un aprofundat studiu ştiinţific al proceselor intime legate de fecundaţie şi de influenţele maternă şi paternă asupra produsului de concepţie. Totodată, poate fi studiată dezvoltarea embrionară la animale, diversele abateri de la dezvoltarea normală, cauzele şi factorii care generează mortalitatea embrionară. Produşii obţinuţi prin transferul de embrioni permit studierea influenţelor factorilor genetici şi ai mediului extern asupra dezvoltării embrionilor, ereditatea grupelor sanguine, obţinerea de animale „mozaic de gene“, a concentrării mai multor caractere pe acelaşi individ, a instituirii unei profilaxii şi terapeutici genetice pentru unele boli de metabolism. Pe aceeaşi linie, transferul de embrioni reprezintă baza unei noi generaţii de biotehnici care derivă din aceasta sau îi sunt asociate: bisecţia embrionilor, sexajul, fecundaţia „in vitro“ clonarea, transferul de gene, iar ingineria genetică foloseşte ca verigă importantă, în metodologie, această biotehnologie.

Micromanipularea şi microchirurgia ovocitelor şi a embrionilor permit desfăşurarea unei cercetări ştiinţifice interesante, şi obţinerea din punct de vedere practic a unor înalte performanţe în reuşita transferului de embrioni, prin transferul jumătăţilor de embrioni. Sexul embrionului poate fi precizat cu multă acurateţe, baza investigaţiei fiind dată de transferul embrionilor. Reproducerea, fără contribuţia genetică a partenerului, se poate realiza prin ginogeneză, fiind deja obţinuţi primii şoareci homozigoţi, (Groza I., 1996). Aspecte similare ridică androgeneza în care se poate induce bispermia, adică pătrunderea în ovul a doi spermatozoizi, cu retragerea ulterioară a pronucleului femel şi în consecinţă diviziunea va continua numai în zona masculină (Groza I., 1996).

BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA VACĂ

La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie de reproducţie larg răspândită în lume. Tehnicile de lucru sunt foarte bine stăpânite, astfel încât această modernă biotehnologie poate fi extinsă la aproape toate fermele de creşterea vacilor din lume. Astfel, în Europa se obţin anual circa 100000 de produşi prin transfer de embrioni, iar pe plan mondial circa 300000 de produşi, extinderea biotehnologiei fiind limitată de costurile destul de ridicate. Transferul de embrioni constituie, totodată, baza unei noi generaţii de biotehnici, care derivă din aceasta sau îi sunt asociate, cum ar fi: bisecţia embrionilor, sexajul, fecundaţia ,,in vitro“, clonarea, transferul de gene. Transferul de embrioni presupune parcurgerea următoarelor etape (fig. 1): selecţia şi pregătirea vacilor donatoare; selecţia şi pregătirea vacilor primitoare (receptoare); sincronizarea estrului şi ovulaţiei la vacile donatoare şi primitoare; inducerea poliovulaţiei şi însămânţarea artificială a vacilor donatoare; recoltarea embrionilor; conservarea embrionilor; transferul embrionilor.

Fig. 10 Schema transferului de embrioni la animale

2.1. Selecţia şi pregătirea vacilor donatoare Vacile donatoare de embrioni trebuie să întrunească la cel mai înalt nivel caracterele zootehnice care interesează. De aceea, când se face selecţia donatoarelor, se are în vedere evaluarea următoarelor criterii: performanţa reproductivă, superioritatea genetică şi valoarea produsului obţinut prin transfer embrionar. Vaca donatoare va fi mai performantă reproductiv atunci când vârsta se situează între 3 şi 10 ani, a născut anual câte un viţel, a rămas gestantă în maxim două cicluri sexuale, ciclurile de călduri au o succesiune fiziologică şi nu a avut antecedente ginecologice (distocii, retenţii placentare, infecţii genitale etc.). Practic, criteriile care se au în vedere sunt: o stare ginecologică perfectă, intervalul dintre parturiţie şi primul estru să fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturiţie însămânţarea fecundă să fie mai redus de 80 zile iar indicele de gestaţie să fie mai mic de 1,5. Superioritatea genetică constă într-un ritm superior de creştere, înainte şi după înţărcare şi un randament ridicat la sacrificare. În cazul vacilor de lapte, însuşirile cu heritabilitate ridicată se referă la producţia de lapte, procentul de grăsime din lapte şi conformaţia corporală.

Vacile donatoare trebuie să fie sănătoase, ele suportând mai multe intervenţii de supraovulare şi recoltare de embrioni. O atenţie deosebită trebuie să se acorde alimentaţiei raţionale a acestei categorii de vaci. 2.2. Selecţia şi pregătirea vacilor primitoare (receptoare) Vacile receptoare de embrioni trebuie să fie sănătoase, fără afecţiuni ginecologice, să aibă aceeaşi talie cu donatoarele, să fie apte să nască descendenţi cu aceeaşi greutate la naştere ca donatoarele, avându-se în vedere că gestaţia constituie un fenomen morfofiziologic complex ce presupune eforturi suplimentare deosebite din partea organismului matern. Cele mai bune rezultate se obţin atunci când transferul de embrioni se face la tineretul femel în vârstă de 18-20 de luni. 2.3. Sincronizarea estrului şi ovulaţiei la vacile donatoare şi primitoare Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare şi receptoare de embrioni se poate realiza pe cale naturală sau medicamentoasă. În cazul sincronizării femelelor prin mijloace naturale se urmăresc, în lotul receptoarelor femelele care în mod spontan manifestă estrul în acelaşi timp cu donatoarele. Principalul dezavantaj constă în fapul că sunt necesare multe animale receptoare în aşteptare. Această modalitate de sincronizare s-a practicat în perioada de început a transferului de embrioni, când s-au folosit pentru transfer embrionii proaspăt recoltaţi. În această situaţie, în aceeaşi unitate trebuia să fie şi vaci donatoare şi receptoare, iar transferul embrionilor trebuia să se realizeze întrun timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare). Sincronizarea estrului prin mijloace medicamentoase se bazează pe faptul că se urmăresc succesiv două-trei cicluri de călduri la vacile donatoare şi se stabileşte durata ciclului. În acest fel se poate calcula data apariţiei ciclului care interesează în transferul de embrioni. În funcţie de data previzibilă, se acţionează prin tratamente hormonale asupra unui grup de femele primitoare în vederea inducerii căldurilor, sincronizate cu căldurile naturale ale donatoarei. În acest caz se acţionează asupra donatoarei numai în ceea ce priveşte inducerea poliovulaţiei. Sincronizarea medicamentoasă a ciclului estral al femelelor donatoare şi receptoare de embrioni se realizează pe două căi: blocarea eliberării hormonilor gonadotropi sau prin inducerea luteolizei. Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor sintetice care prin retroacţiune îşi exercită efectul negativ asupra hipotalamusului, diminuând nivelul hormonilor gonadotropi. (Vezi capitolul „Sincronizarea estrului“). 2.4. Inducerea poliovulaţiei şi însămânţarea artificială a vacilor donatoare Provocarea eliberării concomitente la aceeaşi perioadă de călduri a unui număr sporit de ovocite decât cel caracteristic speciei se numeşte poliovulaţie (supraovulaţie, superovulaţie) si este asigurata prin multiple scheme de tratament. Tratamentele actuale aplicabile in „vitro“ se sprijină pe cunoaşterea mecanismelor foliculogenezei, a efectului tonic al hormonilor gonadotropi (FSH, LH) care intervin îndeosebi în ultima fază a creşterii şi maturării foliculare. Potenţialul ovarian de foliculi terţiari (cu antrum) rămâne relativ constant (însă variabil cu individul) de la vârsta de două luni până la 12 ani (Nibart M., 1991). Fiziologic, la vacă, un singur folicul ajunge la maturitate în preajma ovulaţiei, în timp ce, în timpul unui ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenerează. Injecţia unui hormon cu activitate de FSH împiedică atrezia unor foliculi şi stimulează dezvoltarea şi maturarea simultană a mai multor foliculi terţiari, în cursul aceluiaşi ciclu estral. În prezent, două scheme clasice de tratament poliovulator sunt aplicate, ambele bazate pe efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul gonadotrop de iapă gestantă, liofilizat şi standardizat - PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) denumit şi Ecvin

Chorionic Gonadotropin (ECG), produs de celulele corionice ale iepei gestante si hormonul de stimulare foliculară (FSH) extras din hipofiza anterioară. PMSG se extrage din serul sanguin al iepei gestante şi are o dublă activitate: de tip FSH şi LH, raportul FSH/LH variază de la 1/1 la 1/5 (Saumande J., 1987). Perioada de înjumătăţire destul de lungă - 120 ore - a acestui hormone determină o uşurinţă în folosire, o singură injecţie de 2000-2500 U.I. i.m. fiind eficientă în provocarea poliovulaţiei. La douătrei zile de la injectarea PMSG se administrează i.m. o doză de 500-750 μg prostaglandină F2α, căldurile apărând la circa 48-60 de ore de la injectarea prostaglandinei. Folosirea PMSG antrenează şi unele efecte negative traduse prin creşterea foliculară şi secreţia ridicată de estradiol şi după descărcarea preovulatorie de LH. Acest efect negativ poate fi contracarat prin injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima sau cea de a doua însămânţare artificială (de ex. Neutra -PMSG intervet). Fecundarea ovocitelor se face, de regulă, prin însămânţarea artificială a vacilor la un interval de 12 ore de la începutul estrului cu repetare la 8-12 ore interval. FSH – se prepară din extractele purificate parţial, provenite din hipofiza mamiferelor în principal de suine - care conţine FSH şi LH. Conţinutul în cei doi hormoni şi raportul dintre aceştia variază cu lotul. Perioada de înjumătăţire foarte scurtă (circa 70 minute a acestui hormon necesită injectarea lui bicotidian timp de 4 zile, în vederea menţinerii unui nivel sanguin suficient de ridicat. Funcţie de preparatul comercial, raportul dintre FSH şi LH, de regulă variază de la 1 la 0,5. Dozele totale care se administrează, în vederea producerii poliovulaţiei, variază de la 28 mg la viţelele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injecţiile făcându-se în ritm descrescător, intramuscular sau subcutanat. Preparatele care conţin aceşti hormoni au denumiri care diferă cu unitatea producătoare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov, Ovagen, Pluset etc. Ca şi cealaltă schemă de tratament, injectarea prostaglandinei F2α, în doză de 500-750 μg se face la 48-72 de ore de la începerea tratamentului, estrul apărând la circa 50-60 ore de la injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor se face prin însămânţarea artificială a femelelor supraovulate de două ori, la 12 şi 24 ore de la apariţia estrului. 2.5. Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaţiei Preparatele medicamentoase care conţin hormoni gonadotropi sunt injectate în faza luteală a unui ciclu natural sau indus, cel mai frecvent între ziua a 9-a şi a 13-a. Două zile după injecţia de PMSG sau concomitent cu a 5-a injecţie de FSH, se injectează un analog de PGF2α (de ex. 0,5-1 mg Cloprostenol) care are efect luteolitic permiţând ovulaţiile (fig.2 şi 3).

Fig. 2 Scheme de inducere a poliovulaţiei la vacile donatoare de embrioni (după M. Thibier şi M. Nibart, 1991) O altă schemă de tratament constă în utilizarea progestinelor pe cale orală, parenterală, intravaginal sau implant subcutanat timp de 9-12 zile. Progestinele blochează axul hipotalamo-hipofizo-ovarian, prin neeliberarea de FSH dar mai ales de LH. Cât timp receptorii axului hipotalamo-hipofizar se găsesc sub acţiunea temporară a progestinelor, femela nu va manifesta estru şi nici nu va ovula. După suprimarea terapiei cu progestine, se produce o descărcare rapidă, compensatoare de Gn-RH, ceea ce va determina, în decurs de 57 zile, intrarea în călduri ovulatorii a femelelor tratate. În cursul unui astfel de tratament de blocare a ciclului se poate injecta hormonul de stimulare (FSH-p) bicotidian, în ritm descrescător începând cu a 6-a zi de la blocarea ciclului, concomitent cu o injecţie intramusculară de PGF2α.

Fig. 3 Scheme de inducere a poliovulaţiei la vacile donatoare de embrioni (după I.C.P.C.B. Baloteşti) În cazul întrebuinţării preparatelor hormonale pe bază de PMSG, acestea se injectează, împreună cu o doză de prostaglandină F 2α, în a 6-a - a 7-a zi de la introducerea implantelor, pesariilor etc., urmată de injectarea unei doze de anti PMSG concomitent cu a 2-a însămânţare artificială (fig. 2 şi fig. 3). O schemă mai simplă de provocare a poliovulaţiei constă în începerea tratamentului cu hormoni gonadotropi în a 15-a, a 16-a zi a ciclului estral la viţele şi în a 16-a, a 17-a zi a ciclului sexual la vaci, însă numărul de embrioni obţinuţi este mult mai redus. Rezultate bune în provocarea poliovulaţiei s-au obţinut prin injectarea unei doze de Gn-RH la vacile poliovulate înainte de prima însămânţare artificială sau concomitent cu aceasta, în vederea grupării ovulaţiilor.

Prin provocarea poliovulaţiei se pot obţine de circa 8-10 ori mai mulţi embrioni, decât în cazul recuperării unui singur ou de la femelele nesupuse tratamentului poliovulator (foto 1).

Foto 1 Ovare superovulate Există o variaţie mare în ceea ce priveşte răspunsul la tratamentul poliovulator, din partea vacilor. Această variaţie pronunţată se datorează hormonului utilizat, purităţii acestuia şi de specificul individual al femelelor. Cercetările au relevat faptul că circa 10- 20% dintre vaci nu răspund la tratamentul poliovulator, alte 20-25% răspund slab la un astfelde tratament (1-3 embrioni transferabili pe vacă tratată) şi doar 30-40% dintre vaci au un răspuns ideal la tratamentul de superovulaţie furnizând 7-12 embrioni/vacă/tratament iar 5-10% dintre femelele tratate furnizează mai mult de 20 de embrioni. În prezent, stimularea ovariană pare a fi atins un anumit plafon întrucât, se colectează, în medie 9-10 embrioni (limite între 0-50), iar cel al embrionilor viabili este de 5-6 (limite între 0-30), din care 3 congelabili (Nibart, Thibier, Chouke 1988). În ceea ce priveşte repetarea tratamentelor de superovulaţie la aceeaşi donatoare, s-a constatat că tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor luni sau a mai multor ani. Producţia totală de embrioni de la aceeaşi donatoare depinde de aceasta şi de ritmul de colectare . Este necesar un interval de cel puţin 60 de zile după fătare în vederea începerii tratamentului poliovulator. Unii cercetători constată o reducere a numărului de embrioni transferabili o dată cu repetarea tratamentului cu PMSG, fapt ce se explică prin formarea în organismul femelei tratate a anticorpilor anti- PMSG şi reducerea categoriilor de foliculi sensibili la stimulare. Pentru a se Evita acest efect negativ, repetarea tratamentului trebuie să se facă la un interval de 54-60 de zile şi să se intercaleze tratamentele pe bază de PMSG şi FSH-p. Rezultatele tratamentelor de superovulare sunt influenţate de vârsta femelelor, rasă, mascul, sezon, nivelul producţiei de lapte, starea generală, etc. De regulă, viţelele produc un embrion viabil mai puţin decât vacile adulte.

2.6. Fecundarea ovocitelor Ovocitele sunt fecundate în urma însămânţării naturale sau artificiale. De regulă, se efectuează două însămânţări artificiale la interval de 12-24 de ore de la începutul căldurilor observate clinic sau, sistematic, după 56 şi 72 de ore de la injecţia cu PGF 2α, sau după 36 şi 48 de ore de la retragerea implantelor sau pesariilor. 2.7. Recoltarea embrionilor Embrionii sunt colectaţi atunci când se găsesc în cornul uterin, după ieşirea lor din oviduct (între zilele 4-5). Din motive sanitare şi de congelare se preferă colectarea embrionilor încă incluşi în zona lor pelucidă (ies în a 9-a zi). Cel mai frecvent, colectarea se realizează între zilele 6-8 după fecundaţie, de regulă în ziua a 7-a. Recoltarea embrionilor se face chirurgical şi nechirurgical. Mult timp, metoda chirurgicală a fost singura utilizată. Tehnica operatorie presupunea parcurgerea a două etape: laparotomia, cu exteriorizarea aparatului genital în plagă şi recoltarea propriu-zisă a embrionilor prin spălarea cu un lichid cu o compoziţie specială, a oviductelor (după un interval de timp mai mic de 3 zile după însămânţare) sau a coarnelor uterine (după un interval de timp mai mare de 4 zile de la însămânţare). În prezent, metoda chirurgicală de recuperare a embrionilor la vacă este abandonată, datorită inconvenientelor pe care le prezintă. Astăzi, este generalizată metoda nechirurgicală de prelevare a embrionilor, a cărei principiu constă în spălarea coarnelor uterine cu un mediu special preparat, spălare care se realizează în condiţii de asepsie în a 7-a zi de la însămânţare. Tehnica nechirurgicală de colectare a embrionilor s-a perfecţionat continuu, firme specializate produc pe scară industrială mediul de recoltare, congelare, decongelare şi întreaga aparatură necesară recoltării şi transferului embrionilor. Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun mai multe operaţii: contenţia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei şi a regiunii perivulvare, identificarea prezenţei corpilor galbeni pe ovar, introducerea lichidului de spălare în lumenul coarnelor uterine, spălarea acestora, recuperarea lichidului împreună cu embrionii, identificarea şi recuperarea embrionilor din lichidul recuperat şi supus decantării şi aprecierea morfologică a acestora. În condiţii de fermă, recoltarea embrionilor se face la locul unde se găseşte femela donatoare,dupa contentia adecvata. Pentru a suprima durerea, se practică anestezia epidurală cu 4-6 ml procaină 2% sau cu 10 ml ludocaină 1%, care blochează nervii coccidieni şi ultimele perechi de nervi sacrali (S 3, S4, S5). Acul se introduce între prima şi a doua vertebră coccigiană sau între ultima vertebra sacrală şi prima vertebră coccigiană, anestezia instalându-se după circa 10-15 minute şi durează în jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada, anusul, rectul, vulva, vaginul şi uterul. Se introduce, cu precauţiile de rigoare, mâna în rect, acesta se videază de conţinut, apoi se apreciază răspunsul femelei la tratamentul poliovulator, palpându-se cu atenţie ambele ovare şi numărâdu-se corpii galbeni (foto 19). În cazul în care răspunsul la tratamentul de superovulare este pozitiv, se procedează cu precauţie la introducerea cateterului de tip Folley cu două sau trei căi, prin conductul cervical până în cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se introduce pe lumenul acestuia un mandren (tijă metalică), care se menţine până se ajunge în lumenul cornului uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8 cm de la bifurcaţia coarnelor uterine, pe unul dintre acestea, apoi se introduce de la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer în scopul fixării cateterului şi pentru a împiedica refularea din cervix a lichidului de spălare. Vasul din sticlă, ce conţine lichidul de spălare se suspendă la 1,5 m de la sol şi, prin cădere, acesta ajunge prin calea de admisie a cateterului în coarnele uterine. Irigarea acestora se face continuu, calea de evacuare a lichidului este conectată, printr-un tub de plastic, la vasul de colectare a mediului recuperat (de spălare). Recuperarea lichidului de spălare se face prin calea de admisie (în cazul cateterului cu două căi la care s-a adaptat o piesă în forma literei y)

prevăzut cu canal de admisie şi evacuare al lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind conectată la un filtru de colectare a cărui orificii au un diametru de 75 μm, care are rolul de reţinere a embrionilor, lichidul ce traversează filtrul fiind colectat într-un recipient situat sub filtru. Mediul folosit la spălarea unui corn uterin se foloseşte la spălarea, în acelaşi mod, a celui de-al doilea corn uterin. Cantitatea de mediu care se foloseşte pentru spălarea unui corn uterin este de 300-500 ml, efectuânduse irigări repetate şi un masaj transrectal permanent al cornului uterin perfuzat. Există diverse sonde de recuperare a embrionilor, imaginate de diverşi cercetători, care se bazează pe acelaşi principiu constructiv . Între momentul recuperării embrionilor şi cel al inoculări lor în uterul receptoarelor, zigoţii trebuie să fie menţinuţi în viaţă în condiţii speciale şi să fie manipulaţi în cele mai bune condiţii tehnice şi igienice. În ultimii ani s-a generalizat folosirea unei soluţii tampon fosfat PBS – (Fosfat bufferet salin) pentru spălarea coarnelor uterine şi pentru păstrarea embrionilor recuperaţi.

Foto 2 Recoltarea embrionilor prin metoda nechirurgicală

Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune osmotică de 290 miliosmoli şi conţine multe săruri minerale, glucoză şi proteină (albumină bovină serică, 2-4 g/l, sau ser de viţel fetal decomplementat 10%. Toate mediile, soluţiile, serurile, enzimele şi substanţele crioprotectoare care vin în contact cu embrionii trebuie să fie sterile. Tot materialul care nu se aruncă (sonde colectoare, filtre, recipienţi din sticlă, sonde de transfer, etc.) care necesită a fi sterilizate, se spală cu o soluţie de detergent netoxic, se clăteşte în apă distilată, se usucă şi se înveleşte în hârtie în vederea sterilizării. Alegerea metodei de sterilizare depinde de natura materialului (căldură uscată, căldură umedă, substanţe antiseptice, vapori de formol etc.). Rezultatele recuperării embrionilor depind în cea mai mare măsură de abilitatea şi antrenamentul operatorului. Proporţia embrionilor recuperaţi, oscilează în medie, între 60-70% comparativ cu numărul de corpi galbeni identificaţi pe ambele ovare. După colectarea embrionilor se injectează donatoarei o doză de PGF 2α, care are rolul de a liza corpii galbeni, evitându-se astfel gestaţia multiplă. 2.8. Căutarea şi aprecierea calităţii embrionilor După prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este lăsat timp de 20-30 minute pentru decantare. Se îndepărtează supernatantul iar stratul inferior în care se regăsesc şi embrionii recoltaţi, se transferă într-o placă Petri cadrilată cu diametrul de 10 cm, (foto 20) sau se agită în mediu din filtrul colector şi se toarnă în placa Petri. Recipientele de recoltare a mediului ca şi filtrul folosit la recuperarea embrionilor se clătesc de două trei ori. Examenul embrionilor în lichidul recoltat trebuie să se facă în cele mai bune condiţii de asepsie, curăţenie şi la o temperatură constantă a laboratorului 20 o-25o). Embrionii bovinelor au un diametru de 150-190 microni, zona pelucidă având o grosime de 12-15 μm. Pentru identificarea embrionilor, se examinează la o stereolupă (grosisment 30-60 uneori 80-200) fiecare pătrat de la nivelul plăcii Petri. O dată identificaţi, embrionii sunt transferaţi cu ajutorul unei seringi de aspirare, la care s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipetă, în plăci Petri mai mici, cu diametrul de 5 cm în care se găseşte mediul de spălare la care s-a adăugat 20% albumină serică bovină (BSA). Operaţiunea se repetă de 3-5 ori, embrionii fiind transferaţi dintr-o plăcuţă în alta, schimbându-se de fiecare data pipeta de aspirare. În cazul în care embrionii sunt destinaţi exportului, aceştia sunt trecuţi prin zece astfel de băi de spălare. Amestecul crioprotectorului cu mediul de conservare (PBS ±40% BSA sau 10-20% ser de viţel fetal) provoacă o creştere a presiunii osmotice. Pentru a reduce şocul osmotic, embrionii sunt trecuţi succesiv şi pe câte o durată de 5 - 10 minute în două-trei băi cu mediu de conservare cu o concentraţie crescândă în crioprotector: glicerol 0,7 M şi apoi 1,4 M, DMSO sau etilen glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5 M. Această trecere a embrionilor în mediul de conservare cu adaos de crioprotector se face la o temperatură cuprinsă între+20oC şi +30oC. După ultima baie, adică în momentul în care este atinsă concentraţia finală în crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5 M), embrionii sunt condiţionaţi pentru congelare, fie în fiole de sticlă de 1,2 ml, fie în paiete de polipropilen de 0,25 ml (de tip paiete fine folosite la conservarea spermei). Paietele sunt identificate individual. Există bancuri de identificare ce permit pe de o parte închiderea ermetică a paietei şi care poartă (sunt inscripţionate) toate informaţiile necesare. Pentru fiecare paietă trebuie să se menţioneze: identificarea donatoarei, rasa, data colectării, numărul de embrioni, centrul de producţie. Procedura de umplere a paietelor comportă trei compartimente lichide separate de bulele de aer. Aceasta limitează orice risc de pierdere a embrionilor în momentul manipulărilor efectuate cu umplerea sau evacuarea conţinutului paietelor.

Embrionii sunt încadraţi în mai multe categorii calitative: excelent, bun, acceptabil, inferior, degenerat, ovocit nefecundat. În cursul examenului sub stereolupă la un grosisment mai mic de 80, embrionul este întors cu ajutorul unei micropipete de sticlă în vederea aprecierii morfologiei sale din toate unghiurile, unele imperfecţiuni putând scăpa observaţiei în anumite poziţii ale embrionului. Zona pelucidă garantează protecţia embrionului, motiv pentru care ea trebuie să fie perfect integră, fără fisuri şi perfect sferică. Gradul de dezvoltare embrionară în raport cu ziua colectării este principalul factor luat în considerare. Embrionii care prezintă o întârziere în dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt eliminaţi. Embrionii colectaţi în a şaptea zi de la debutul estrului trebuie să se găsească în stadiul de morulă compactă/blastocist. Embrionii care conţin 16 celule sau mai puţin, nu se reţin pentru transfer sau congelare, fiind într-o întârziere mare a dezvoltării. În stadiul de morulă compactă, limitele celulare sunt mai puţin distincte întrucât blastomerele sunt strâns legate între ele şi dau un aspect de mure. Prezenţa câtorva celule detaşate, în spaţiul perivitelin nu constituie un motiv de eliminare întrucât majoritatea blastomerelor formează o masă sferică fără opacitate marcantă. În stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, butonul embrionar, trofoblastul) trebuie să fie vizibile şi să prezinte contururi bine delimitate. Prezenţa blastomerelor în spaţiul perivitelin şi a unor granulaţii la suprafaţa celulelor pot fi observate. Aceste anomalii asociate unei întârzieri în dezvoltare, absenţei contururilor celulare sau unei opacităţi marcante ale blastomerelor constituie criteriu de eliminare a embrionilor. Embrionii a căror aspect este îndoielnic sunt conservaţi una-două ore apoi vor fi examinaţi din nou. Excelent este considerat embrionul perfect ca aspect morphologic şi corespunzător vârstei (foto 3).

Foto 3 Embrioni buni pentru transfer Embrionul bun calitativ prezintă unele imperfecţiuni: zona pelucidă ovală, dimensiuni mai mici ale embrionului, întârziere în dezvoltare cu o zi, puţine celule extrudate, mici. Embrionul acceptabil este cel care este bine conturat, însă prezintă unele anormalităţi: un număr moderat de celule excluse, dimensiuni mai mici, unele degenerări şi întârzierea cu o zi. Embrionul inferior prezintă diverse degradări considerabile: celule veziculate, variabilitate

mare în ceea ce priveşte dimensiunile celulelor, întârzierea în dezvoltare cu două zile, absenţa compactării. Embrionul degenerat prezintă degenerări evidente, iar ovocitele nefecundate sunt cele care prezintă structură simplă a gametului femel, fără celulele rezultate din segmentare (Seidel F.G. şi colab.,1991). 2.9. Conservarea şi deconservarea embrionilor Embrionii pot fi conservaţi câteva ore „in vitro“ la 20 oC într-un mediu de conservare: PBS adiţionat cu 4 g/l albumină serică bovină, sau cu 10% ser de viţel fetal decomplementat. În acest mediu, embrionii sunt menţinuţi până când sunt transferaţi la receptoare. În cazul în care transferul nu se realizează în 6-8 ore de la recoltare, se recomandă congelarea prin refrigerare a embrionilor, la o temperatură de 0o-4oC într-un mediu de conservare identic. În acest fel embrionii pot fi conservaţi una-două zile fără ca viabilitatea să fie afectată. Conservarea de lungă durată a embrionilor – congelarea - rămâne cea mai avantajoasă metodă de menţinere pentru un interval de timp practic nelimitat a viabilităţii embrionilor. Pentru aceasta, embrionii, trebuie să fie menţinuţi în stare solidă, în azot lichid, la temperatura de circa -196oC. La temperaturi mai scăzute de -100oC, metabolismul celular este complet blocat, singura problemă mai dificilă constând în atingerea acestor temperaturi fără a omorî embrionii. În timpul congelării, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea gheţii intracelulare şi concentraţia salină ridicată. Pentru a preîntâmpina efectul negativ al acestor doi factori, metoda de răcire constă în deshidratarea parţială a celulelor şi evitarea şocului produs de concentraţiile ridicate în săruri prin utilizarea unui Crioprotector, în general glicerol cu o concentraţie de 1,5 M (sau 10% în volum) în mediul de congelare. Ca agenţi crioprotectori se mai pot folosi: dimetilsulfoxid (DMSO), etilen-glicol, glicerol, propilen-glicol. În prezent sunt numeroase aparate programabile (freezere) care permit realizarea unei curbe optimale de răcire. Substanţele crioprotectoare (în general polialcooli) sunt capabile să pătrundă uşor în celule printr-o simplă difuziune (osmoză), întârziind formarea cristalelor de gheaţă prin coborârea punctului de îngheţ. Totodată, substanţele crioprotectoare limitează efectele negative ale concentraţiei saline ridicate, înlocuind o parte din apa intracelulară atrasă prin creşterea presiunii osmotice extracelulare. Alţi compuşi pot avea un rol protector faţă de membranele celulare (hidraţi de carbon, polivinilpirolidon), (Baril şi colab., 1993). Viteza de coborâre a temperaturii are importanţă mare în protejarea viabilităţii embrionilor. Mediul care conţine embrionii (extracelular) este mai bogat în apă decât mediul celular. Prin coborârea temperaturii, primele cristale de gheaţă se produc mai întâi în mediul extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a concentraţiei în soluţie a fracţiunii necristalizate. Această concentraţie salină ridicată va provoca ieşirea unei părţi din apa celulară, reducând în acest fel formarea gheţii intracelulare. Dacă ritmul de răcire este prea rapid, apa intracelulară nu poate ieşi în cantitate suficientă, cristalele de gheaţă se formează în cantitate mare în interiorul celulelor şi aceste cristale îşi măresc talia lor în timpul congelării şi decongelării distrugând structurile celulare. În cazul în care ritmul de răcire este lent, deshidratarea progresivă a celulelor antrenează o creştere importantă a concentraţiei în electroliţi, în mediul celular, modificând proprietăţile fizico-chimice (efectul soluţiei), consecinţa fiind totdeauna pierderea viabilităţii celulelor. Astfel, integritatea celulelor vii după congelare este strâns legată de dinamica apei intracelulare în timpul răcirii şi deci de viteza de congelare. În cazul embrionilor, ritmul de răcire trebuie să corespundă pentru toate tipurile de cellule care-l compun. Rezultatele cercetărilor întreprinse pentru clarificarea aspectelor referitoare la ritmul de congelare confirmă faptul că acesta trebuie să se desfăşoare în două etape diferite: o congelare lentă, în două trepte: la început 4oC/min până la –6 –7oC şi 0,3-0,6oC/min între –7oC şi –30 –35oC, apoi o congelare rapidă (bruscă) de la -35oC până la temperatura de păstrare -196oC.

Timpul de aşteptare al embrionilor din momentul recoltării şi până la începerea congelării, nu trebuie să depăşească două-trei ore. Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevede următoarele:  alegerea embrionilor  calitate excelent sau bun;  timp de la recoltare până la începerea congelării: două-trei ore;  introducerea embrionilor în mediul de congelare la temperature laboratorului (20oC);  introducerea embrionilor în paiete identificate (mediu, bulă de aer, embrioni +mediu, bulă de aer, mediu);  răcirea până la -6oC sau -7oC cu o viteză de 4oC/minut;  inducerea cristalizării (palier 5-10 minute);  răcirea până la –30oC sau –35oC cu o viteză de 0,3 - 0,6oC/minut;  introducerea paietelor ce conţin embrionii, direct în azot lichid şi stocarea lor (196oC). Paietele se vor păstra în permanenţă în azot lichid până în momentul transferului la femelele receptoare. Durata stocării embrionilor în azot lichid nu influenţează supravieţuirea ulterioară a acestora. 2.10.

Decongelarea embrionilor şi înlăturarea crioprotectorului Embrionii congelaţi la -35oC nu sunt decât parţial deshidrataţi, o anumită cantitate de gheaţă se formează inevitabil în celule, în momentul imersiei în azot lichid (-196 oC). Pentru a se evita ca prin decongelare să se producă o creştere a acestor mici cristale de gheaţă care să distrugă celulele, decongelarea trebuie să se facă în timp, cât mai repede posibil (circa 2000oC/minut). Pentru aceasta, paietele se scot repede din containerul cu azot lichid şi se introduc direct într-o baie de apă la 37 oC, unde se menţin circa 30 de secunde. Imediat după decongelare, înlăturarea rapidă a crioprotectorului este indispensabilă supravieţuirii embrionilor. Totuşi, celulele care conţin o concentraţie ridicată de crioprotector nu trebuie să fie introduse direct într-un mediu izotonic, întrucât diferenţa mare de presiune osmotică va provoca pătrunderea prea rapidă a apei în celulă, ceea ce va risca să explodeze. De aceea, este necesară o îndepărtare progresivă a crioprotectorului astfel încât ieşirea acestuia şi pătrunderea apei în celulă să fie compatibile cu permeabilitatea membranei celulare. Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizează o rehidratare lentă a celulelor embrionare. Diluţia crioprotectorului pe etape constă în trecerea succesivă a embrionilor prin băi cu concentraţii descrescânde în crioprotector (de ex: etilen glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M şi 0 M). Menţinerea embrionilor în fiecare baie este de 5-10 minute. În acest caz concentraţia mediului în crioprotector este inversă celei din perioada congelării. După înlăturarea lichidului de răcire, calitatea embrionilor poate fi apreciată printr-un examen morfologic efectuat cu ajutorul unei stereolupe (grosisment x80). În urma examenului morfologic, de regulă sunt eliminaţi ca necorespunzători calitativ, 10-30% dintre embrionii decongelaţi. Diluţia crioprotectorului prin folosirea unui mediu care conţine sucroză are la bază accelerarea ieşirii acestuia din celule. Molecula de sucroză având o greutate moleculară mare (344) nu pătrunde în celule prin simplă difuziune; prezenţa sa în mediu crează o mărire a presiunii osmotice din mediul extracelular, ceea ce va determina o difuziune accelerată a crioprotectorului din celule. Pentru aceasta, embrionii decongelaţi sunt introduşi direct într-o soluţie de PBS care conţine 0,25-0,5 M sucroză, apoi în două-trei băi succesive de PBS înainte de examinare şi transfer. Se poate realiza retragerea crioprotectorului prin intermediul

sucrozei, direct în interiorul paietei. Pentru aceasta, în momentul introducerii embrionilor în paiete pentru congelare, alternanţa diverselor medii din paietă este: la mijloc embrionul în mediu PBS+ etilenglicol 1,5 M, înconjurat de bule de aer şi apoi la exterior PBS+sucroză 0,25 M. După decongelare paieta se scutură în vederea amestecării mediilor pe bază de etilen glicol şi cele pe bază de manoză, ceea ce va permite difuzia crioprotectorului în afara celulei în câteva minute. Embrionii sunt transferaţi fără selecţie prealabilă, împreună cu conţinutul paietei direct în uterul femelelor receptoare. Această metodă mai necesită unele verificări. Nivelul supravieţuirii embrionilor după decongelare este condiţionat de mai mulţi factori: stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor înainte de congelare, femela donatoare etc. Embrionii transferaţi în stadiul de morulă realizează o proporţie de supravieţuire „in vitro“ mai redusă (64%), comparativ cu cei transferaţi în stadiul de blastocist (81%), (Martinez şi colab., 1985). Congelarea nu trebuie aplicată decât embrionilor de bună calitate, caz în care procentul de supravieţuire după transfer fiind uşor inferior (10%) faţă de nivelul supravieţuirii obţinut după transfer direct, fără congelare. Originea genetică a donatoarei pare a avea un rol însemnat asupra aptitudinii embrionului de a fi congelat. Acelaşi efect denumit şi „efectul donatoarei“ a fost demonstrat prin faptul că procentul de supravieţuire a embrionilor congelaţi în aceleaşi condiţii poate varia de la 0 la 78% în raport cu donatoarea. 2.11.

Transferul embrionilor O atenţie deosebită va fi acordată selecţiei femelelor receptoare, întrucât condiţionează în mare parte rezultatele după transfer. Aşa cum s-a menţionat în capitolul anterior, receptoarele trebuie să aibă o activitate sexuală ciclică, să fie bine dezvoltate corporal, fără afecţiuni ale tractusului genital. Alegerea receptoarelor poate porni de la viţele în vârstă de 18 luni cu condiţia atingerii a cel puţin 2/3 din greutatea corporală a adultului. Transferul embrionilor se face cu foarte bune rezultate şi la vaci adulte în vârstă de 3-6 ani dacă funcţia de reproducţie s-a desfăşurat normal. Examenul femelelor receptoare se completează cu aprecierea ultimului estru, care trebuie să aibă loc între parametrii fiziologici (comportament sexual, calitatea mucusului cervical, starea de sănătate a conductului vestibulo-vaginal şi al orificiului vaginal al cervixului). Pregătirea receptoarelor constă într-o sincronizare cât mai perfectă a ciclului sexual cu cel al femelei donatoare. Se pot folosi femele receptoare, fie în călduri naturale fie în călduri induse printr-un tratament de control al ciclurilor sexuale (vezi cele menţionate anterior). O atenţie specială se va acorda depistării ciclurilor (dimineaţa, prânz, seara) apoi se determină momentul exact al începutului estrului. Înaintea transferului propriu-zis se face un examen transrectal al ovarelor pentru a identifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul embrionului se va face în vârful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafaţa căruia este prezent corpul galben. Rezultate bune s-au obţinut şi prin depunerea embrionului la circa 10 cm de la bifurcaţia coarnelor uterine în lumenul cornului uterin ipsilateral ovarului cu corp galben. Înainte şi imediat după transfer se va evita orice stres: vaccinări, tratamente antiparazitare, ecornări, lotizări, tuberculinări, recoltări de sânge etc. Se va evita schimbarea bruscă a regimului alimentar: de exemplu introducerea masei verzi primăvara 4 săptămâni după transfer. Variaţiile climatice determină o creştere a mortalităţii embrionilor după transfer. În cazul folosirii embrionilor proaspeţi, receptoarele se ţin într-un grajd curat şi cât mai aproape de donatoare. Transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare se realizează prin două metode: chirurgical şi nechirurgical. Transferul chirurgical s-a aplicat în perioada de început şi a constat în deschiderea cavităţii abdominale (pe linia albă sau în flanc), exteriorizarea cornului uterin şi depunerea embrionului pe cornul uterin corespunzător ovarului cu corp galben prin puncţionarea

peretelui acestuia. Este o metodă laborioasă, costisitoare, traumatizantă pentru femele, ceea ce a condus la abandonarea ei. Metoda actuală care dă cele mai concludente rezultate este cea nechirurgicală. Această metodă foloseşte calea vagin-cervix, asemănător însămânţării artificiale. Pentru transfer se foloseşte un pistolet tip Cassou în care se introduce paieta cu embrionul deconservat sau proaspăt recoltat. Pentru a se evita contaminarea învelişului din material plastic al pistoletului Cassou pe timpul traversării conductului vestibulo-vaginal, se fixează un al doilea înveliş din material plastic care este secţionat pe toată lungimea sa. După ce pistoletul ajunge în lumenul cervical, acest înveliş protector se retrage. Pentru a învinge rezisteanţa cervixului (în această fază cervixul fiind închis) se folosesc uneori dilatatoare. La circa 10 cm de bifurcaţie, pe cornul uterin corespunzător ovarului ce conţine corpul galben, se depune embrionul, asemănător însămânţării artificiale. Această metodă este exclusiv folosită în present. Traversarea cervixului trebuie să se realizeze cu mare precauţie în vederea evitării lezionării mucoasei acestuia. În vederea relaxării cervixului, a evitării contracţiilor organelor genitale se efectuează anestezia epidurală cu 4-6 ml procaină 2%, sau alte preparate medicamentoase cu efect similar.

BIBLIOGRAFIE

1. Aughtry, S.D., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p 3-4 2. Baril, G. şi colab., 1993 - Manuel de formation pour l'insémination artificielle ches les ovins et les caprins. Etude FAO, Roma. 3. Baril, G. şi colab, 1993 - Manuel de formation practique pour la transplantation embryonnaire chez la brebis et la chevre. Etude FAO, Roma. 4. Bogdan, Al. şi colab., 1981 - Reproducţia animalelor de fermă. Edit.Scrisul românesc, Craiova 5. Bogdan, Al. şi colab.,1984,1985 - Fertilitatea, natalitatea şi prolificitatea în zootehnie, vol I şi II, Edit Dacia, Cluj-Napoca 6. Boitor, I., 1979 - Endocrinologia reproducţiei la animalele de fermă. Edit. Ceres, Bucureşti 7. Bunaciu, P., 1977 - Însămânţarea artificială a găinilor de reproducţie întreţinute în baterii. Rev. de creştere a animalelor, nr. 10

8. Cârlan, M., 1982 - Sincronizarea căldurilor şi ovulaţiei la taurine. Redacţia de propagandă tehnică agricolă, Bucureşti 9. Confederat Margareta, 1998 - Cercetări cu privire la influenţa alimentaţiei asupra supravieţuirii embrionilor la caprine în condiţiile efectuării transferului de embrioni. Teză de doctorat, Univ. Agron. şi de Med. Vet., Iaşi 10. Drugociu, G. şi colab., 1977 - Patologia reproducţiei şi clinică obstetricală. Edit. Did. şi Ped., Bucureşti 11. Dumitrescu, I. şi colab., 1976 - Reproducţia la bovine. Edit Ceres, Bucureşti 12. Dumitrescu, I. şi colab., 1978 - Însămânţările artificiale la animale. Edit. Ceres, Bucureşti 13. Dumitrescu, I., 1987 - Reproducţia la cabaline. Edit. Ceres, Bucureşti 14. Elsden Peter, R., 1987 - Manual for embryo transfer, 6599 Country Rd. 29C,