Transaminacion Informe Final

TRANSAMINACIÓN Baltazar González Chávez (1025715), Kimberly Navarro Vélez (1025088), Jezir Valencia Gómez (1023851) Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad del Valle, Cali – Colombia - 2011

RESUMEN La transaminación es una de las reacciones más importantes del catabolismo y de la biosíntesis de los aminoácidos, en donde el grupo amino de un aminoácido es transferido a la enzima, produciendo el correspondiente a-ceto ácido y la enzima aminada y finalmente el grupo amino es transferido al a-ceto ácido aceptor (ej. Alfa-cetoglutarato) formando el producto aminoácido (ej. Glutamato) y regenerando la enzima. En la práctica se quiso colocar en prueba la reacción de transaminacion, usando como sustratos alanina-α-cetoglutarato y a partir de la preparación de un extracto enzimático de corazón de res, la formación de los productos piruvato y glutamato; para lograr la máxima eficacia de la actividad enzimática, se le brindo a la enzima todas las condiciones necesarias para que funcionara y diera los productos esperados comprobando por medio de cromatografía de papel que la enzima era la alanina aminotransferasa por el desplazamiento de los aminoácidos al ser revelado con ninhidrina. Se observó una transaminación efectiva por parte de la alanina aminotransferasa presente en el extracto enzimático, esto se evidencia con la cromatografía de papel. Concluyendo a partir de los resultados que la enzima efectivamente convierte un a-cetoácido en un aminoácido en presencia de otro (a.g. Alanina- a-cetoglutarato  Piruvato – Glutamato). Palabras Claves: Transaminación, Alanina Aminotransferasa, Fosfato de piridoxal, Cromatografía, Metabolismo.

INTRODUCCIÓN: El catabolismo de los aminoácidos ocurre de manera diferente en plantas y animales. En las plantas, la capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico hace posible la síntesis de aminoácidos, y ante una alta concentración de estos, el almacenaje en proteínas de reserva, que de acuerdo a las necesidades metabólicas de la planta se usaran o acumularan más; sin embargo, en los animales tales macromoléculas de reserva no

existen, de modo que continuamente se deben sintetizar o ingerir a través de la dieta en forma de proteínas (Peretó et al, 2007). Cuando los aminoácidos obtenidos ya han cumplido su objetivo en el organismo, y hay un exceso de estos, son degradados. La degradación requiere inicialmente la eliminación del grupo α-amino; pero esta no es una reacción fortuita, por tanto, debe realizarse mediante moléculas intermediarias como las transaminasas, que transfieren el grupo amino al α-cetoglutarato para formar glutamato que en la mayoría de animales, será posteriormente desaminado mediante la enzima glutamato deshidrogenasa que utilizando NAD+ o NADP+ como agentes oxidantes libera amonio (NH4+), que a través del ciclo de la urea se eliminará del organismo (Berg et al, 2004); al extraer el grupo amino solo queda la estructura carbonada del aminoácido inicial que consecutivamente será transformada en glucosa o en acetylCoA, que intervendrán en reacciones glucogénicas o cetogénicas respectivamente (Peretó et al, 2007). Las transaminasas, también denominadas amino-transferasas o enzimas anapleróticas son las encargadas de las reacciones de transaminación (anapleróticas) que fueron descritas por primera vez por Braunstein & Kritzmann en 1938 que a su vez determinaron su carácter reversible. Todas las aminotransferasas contienen una coenzima de gran versatilidad, denominada fosfato de piridoxal (PLP por sus siglas en ingles); esta coenzima se enlaza a la enzima y al sustrato formando una base de Schiff. Este enlace es posible gracias al grupo aldehído que presenta, el cual acepta el grupo α-amino de los aminoácidos y se convierte en fosfato de piridoxamina (PMP) que transferirá el grupo amino a un 2-oxoácido y con esto se regenerará el PLP y se producirá un nuevo aminoácido (Nelson & Cox, 2005). Esta práctica de laboratorio tuvo como principal finalidad la demostración cualitativa de la transaminación entre alanina (Ala, A) y glutamato (GLU, Q) así como la identificación del ácido acético como inhibidor de la reacción y la comprensión de la importancia metabólica de este proceso.

METODOLOGÍA Se siguió el procedimiento mencionado en la guía de laboratorio de Biología Celular y Bioquímica II. Observada en el anexo 1.

RESULTADOS El corazón de res del cual se dispuso fue licuado y posteriormente llevado a centrifugación. El líquido resultante tenía una textura espesa y de color rojizo salmón.

(a)

(b)

Figura 1.Observacion del licuado y trasvaso de la preparación enzimática cruda. (a)Se observa la coloración rojo-salmón del preparado mientras se trasvasa en un tubo de centrifuga de 50 mL, (b) Medición del peso del tubo para centrifugación.

Luego de haber pesado los tubos de centrífuga con su respectivo licuado de corazón de res se procedió a centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 15 minutos. Pasado este tiempo, la sustancia de los tubos se estratificó en dos fases lo cual se puede observar en la Figura 2, una fase superior acuosa (sobrenadante) que contenía el extracto enzimático crudo y una inferior (precipitado). El extracto enzimático fue decantado en un tubo de ensayo y los sedimentos desechados.

. Figura 2. Resultado obtenido luego de centrifugar el licuado de corazón. Se observa las dos fases resultantes de la centrifugación del licuado de corazón de res, arriba la fase líquida que corresponde al extracto enzimático crudo, y abajo el sobrante que fue desechado.

Al realizar el punto 2 de los métodos, los tubos 1 y 2 presentaron unas particulas de color café claro flotando, a diferencia del tubo 3 que se mostró hialino (ver figura 3). A continuación se muestra el sobrenadante y el resultado de los tubos 1, 2 y 3, del punto 2 de la guÍa.

(a)

(b)

Figura 3. (a) Aspecto del tubo 1 luego del baño en ebullición, antes de la filtración, que muestra sedimentos café claro (b) Apariencia del tubo 2 (izquierda) que presenta partículas de coloración café claro, el tubo 3 (derecha) es incoloro y sin partículas suspendidas.

Al haber terminado los puntos 1 y 2 de la guía de métodos se procedió a realizar la cromatografía que duró 41:54 (min) los resultados obtenidos se pueden apreciar en la Figura 4, donde en la primera columna (izquierda a derecha), correspondiente al filtrado libre de proteínas del tubo 1, se observó una mancha oscura superior y otra muy leve por debajo de la primera, en la columna 2 (filtrado libre de proteínas del tubo 2) se observan dos manchas oscuras, en la columna 3 (Blanco) se observa una única mancha superior y por último, en la columna 4 (sustancia patrón) se observan dos manchas.

Figura 4. Cromatografía de los tubos 1, 2 y 3 con un patrón para comparación. Se observa las manchas correspondientes a la cromatografía, 1, 2, 3 y P corresponden a tubo 1, tubo 2, tubo 3 y Patrón respectivamente.

Posterior a esto se realizaron los cálculos del Rf (Formula I) de las manchas de los tubos 2 y Patrón para comparar, la Tabla 1 ilustra los datos recogidos.

Formula I

Tabla 1. Valores de los Rf obtenidos a partir de la cromatografía. La distancia recorrida por el solvente fue de 8.1 cm.

# Tubo Tubo 2 Patrón

Distancia Recorrida Ala (cm) 3,3 2,4

Distancia Recorrida Glu (cm) 1,1 1,5

Rf Ala

Rf Glu

0,407 0,419

0,135 0,185

DISCUSIÓN Para la práctica de transaminación, se preparó un extracto enzimático a partir de corazón de res. Inicialmente el corazón fue partido en pequeños trozos y se procedió a realizar el licuado agregando amortiguador de fosfatos que es de gran importancia ya que mantiene un pH estable para las proteínas globulares que son muy sensibles a los cambios brucos de pH. Posteriormente la mezcla homogenizada se centrifugó durante 15 minutos para obtener el extracto enzimático crudo (sobrenadante) y se descartaron los sedimentos celulares. Se prepararon 3 tubos de acuerdo a la metodología (anexo 1). En el tubo 1 se quiso inhibir la función enzimática de modo que se evitase la formación de piruvato y glutamato, para ello antes de agregar el extracto enzimático, se colocó el tubo en un baño de agua en ebullición durante 3 minutos, donde la temperatura modificó la estructura tridimensional de la enzima y junto con la adición de ácido acético que modifica el pH de la solución, y cambia la estructura de la proteína al desprotonar el grupo R de la cadena lateral, se logra una desnaturalización de la enzima y al ocurrirle esto, no se puede llevar a cabo la catálisis enzimática. (Badui 1999). Para el tubo No.2, se quería hacer que el extracto enzimático que contenía la enzima especifica de transaminacion, funcionara correctamente; para ello se le brindó los sustratos (alanina-α-cetoglutarato) y temperatura adecuada (37ºC) sabiendo que las enzimas son extremadamente selectivas y solo funcionaría la que cataliza la producción de piruvato y glutamato, conocida como alanina aminotransferasa o transaminasa glutamicopirúvica (GPT) (Bergmeyer & Horder, 1980). Después de 30 minutos de posible acción enzimática durante la incubación a 37ᵒC, al igual que en el tubo 1 se inhibe la acción enzimática mediante la adición de acido acético y la exposición a un baño en ebullición durante 3 minutos. Esto hace que las proteínas precipiten y puedan

ser filtradas quedando solo una solución libre de proteínas y posibles productos por la acción de la enzima. Por otra parte el tubo No. 3 fue tomado como blanco; pues éste fue sometido a las mismas condiciones que el tubo No. 2, pero sin contener el extracto enzimático, y en vez de este 1 mL de agua destilada, y aunque tenía los mismos sustratos que los otros dos tubos y también se obtuvo una solución libre de proteínas, el comportamiento fue diferente. Posteriormente se realizó una cromatografía como método para determinar cualitativamente la presencia de Acido Glutámico (Glu, E) como producto de la reacción entre el ácido α-cetoglutarato y la Alanina. Específicamente, se realizó una cromatografía de reparto en capa fina (TLC “Thin-Layer chromatography”) la cual consiste a groso modo en la distribución de los solutos (aminoácidos) sobre la fase estática de acuerdo a la afinidad con la fase móvil (Smith & Feinberg, 1966); para esta práctica, la fase estática fue papel Whatman que está hecho a base de celulosa; y como fase móvil se usó etanol, agua y amoniaco (80:10:10 respectivamente); también se utilizaron las sustancias citadas en la metodología (Anexo 1), realizando tres aplicaciones por cada punto para tener una concentración de aminoácidos adecuada, y se realizó el revelado con ninhidrina al 0,2% en acetona; que debido a su fuerte poder oxidante decarboxila y desamina al aminoácido, esta ninhidrina reducida reacciona con otra molécula de ninhidrina no reducida y con el amoniaco resultante de la desaminación formando un complejo violeta (Teijón,2005). En la Figura 4, las manchas correspondientes a la sustancia patrón indican la presencia de dos aminoácidos diferentes. La Alanina, un aminoácido no polar (hidrofóbico), esta característica le confiere una muy poca afinidad por el solvente de la cromatografía, lo que provoca un largo recorrido en el cromatograma (Smith & Feinberg, 1966); de modo que, la marca superior corresponde a este aminoácido. Por deducción, la marca inferior correspondería al Ácido Glutámico, sin embargo esta afirmación se apoya en el hecho de que este aminoácido es polar y debido a su gran afinidad con el solvente, recorrerá poca distancia y tendrá un Rf menor que el de la alanina, estos valores se confirman en la Tabla 1. En todas las columnas del cromatograma se pudo observar una mancha superior a la misma altura de la mancha de Alanina de la columna 4(P), de modo que las manchas de las columnas 1, 2 y 3 corresponden a la porción de Alanina que no fue transaminada. La columna 1 que contenía el filtrado libre de proteínas con control a tiempo 0, presentó una ligera mancha inferior que demuestra la formación de una leve transaminación; aunque se intento detener a tiempo 0 la reacción mediante la adición de ácido acético, se llevó a cabo; lo que nos dice que esta reacción tiende a suceder de manera espontánea; pues es una de las reacciones más comunes de un organismo vivo. En la columna 2 que corresponde al filtrado libre de proteínas sin inhibición inmediata, se observó una mancha inferior de coloración púrpura oscura que tiene un

Rf cercano al del Ácido Glutámico obtenido en la columna 4(P) (Tabla 1); por tanto, se puede afirmar que hubo una transaminación entre la Alanina y el Ác. Α-cetoglutárico, por medio de la alanina aminotransferasa, cuyo producto observado fue el Ácido Glutámico. En la columna 3 se aplicó una preparación sin extracto enzimático, lo cual claramente se comprueba al observar en la Figura 4 la ausencia de una mancha púrpura inferior y por ende la no realización de una transaminación. La reacción de Alanina + Ácido α-cetoglutárico no solo tiene como producto el Ácido Glutámico, sino también, Piruvato (Anexo 2). Este último no tuvo comprobación en la práctica de laboratorio, sin embargo, para detectar el Ácido Pirúvico existen varias pruebas; las más utilizadas son la prueba del Nitroprusiato de Sodio y la prueba del 2,4 Dinitrofenilhidracina, que dan positivo al reaccionar con el carbonilo 7 etonico del piruvato mostrando un anillo verde o azul y una coloración café-rojiza oscura respectivamente. Estas pruebas requieren que la preparación se encuentre a un pH ligeramente alcalino de 7.4, pues a este pH se inactiva la enzima piruvato descarboxilasa (Lozano & Campos, 2007) y se evita la formación oxalacetato, un intermediario implicado en la gluconeogenesis. El proceso de la transaminación es un proceso llevado a cabo por el metabolismo, más específicamente por el catabolismo del nitrógeno (de los aminoácidos).Este se da en el citosol de algunas células en algunas regiones de los animales, es llevado acabo para la síntesis de aminoácidos a partir de otros aminoácidos o de proteínas. Se basa en el transporte del grupo amino de un aminoácido a un α-cetoácido, así el aminoácido de partida se transforma en un α-cetoácido y el α-cetoácido de partida en un aminoácido. Esto se puede demostrar mediante la aparición de Glutamato a partir del αcetoglutarato presente en el sustrato ofrecido a la enzima transaminasa, para este caso la alanina aminotransferasa, que transporta mediante el piridoxal fosfato (derivado de la vitamina B6) que se encuentra en el sitio activo de la enzima (Muñoz y García. 1997), el grupo amino de la alanina a el α-cetoglutarato. Esta enzima es abundante en el hígado, corazón y músculo (Fuentes, 2003) por esto se utilizó el corazón de res. En algunas enfermedades a estos órganos, los procesos patológicos crean injuria tisular y liberación de estas enzimas al plasma, aumentando la concentración de las mismas, siendo utilizado esta medición de concentración de la enzima como indicador para diagnóstico y pronostico. Además de que la transaminación se da para la obtención de distintos aminoácidos, con unas excepciones como lo son lisina, prolina, hidrixiprolina y treonina, ocurre también como participante en los procesos de la obtención de energía, el ciclo de Krebs. Un ejemplo de esto es la valina, la cual al ser metabolizada da αcetoisovalerato, este a continuación es rápidamente convertido en succinil-CoA y utilizado en el ciclo de Krebs, sin posibilidad de volver a transaminarse.

En conclusión, la transaminación es una de las reacciones celulares más importantes y comúnmente realizadas en organismos animales, ya que a través de ella se pueden originar aminoácidos de los cuales haya deficiencia en el organismo y sean requeridos en alguna ruta metabólica; sin embargo, para que haya un proceso de transaminación efectivo, es necesario que el medio cumpla con la temperatura y acidez apropiadas a la enzima catalizadora. Además, como se observó en la práctica, la cromatografía es un excelente método para detectar una transaminación positiva.

BIBLIOGRAFIA     

   

Badui S. 1999. Quimica de los Alimentos. 3 ed. 5 reimpresión. Editorial Alhambra Mexicana. México. Berg J., Tymoczko J., Stryer L. Biochemistry. Sexta edición. Estados Unidos. W. H. Freeman and Company. 2004. Páginas: 656 – 661 Bergmeyer, H.U., and Horder, M. IFCC Methods for the Measurement of Catalytic Concentration of Enzymes, Part 3 IFCC Method For Alanine Aminotransferase, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 18, 521 Fuentes X. 2003. Codex de Ciencias de Laboratorio Clínico. Elsevier España. pp 740 Lozano A., Campos A., Guía No5: Reconocimiento de aldehídos y cetonas. Guía de Laboratorio de Química Orgánica. Bogotá, Colombia. Universidad Jorge Tadeo Lozano. 2007. Páginas : 3-6 Nelson D. and Cox M., Lehninger Principles of biochemistry Quinta edición. Madrid. W.H and Co, 2005. Páginas: Peretó J., Sendra R., Pamblanco M., Bañó, C. Fundamentos de Bioquímica. Primera edición. España. Universidad de Valencia, 2007. Paginas: 249, 296-297 Teijón J.M., Garrido A. Fundamentos de bioquímica structural. Primera edición. Argentina. Grupo editor Alfaomega, 2005. Páginas 67-68 Smith I., Feinberg J. Paper and thin layer chromatography and electrophoresis. En Journal of Chromatography. [En línea], 1966, Volumen 23, Pagina 185. [Citado Octubre 1 de 2011]. En línea: http://www.sciencedirect.com. bd.univalle.edu.co/science/article/pii/S0021967301986728

Anexos Anexo 1: Guía de laboratorio de biología celular y bioquímica II, práctica número 2, transaminación

Anexo 2. Reacción de la Alanina transaminasa como catalizador de la reacción entre alanina y ácido α-cetoglutárico produciendo Piruvato y Acido glutámico.

Alanina