Trabajo final de aceites esenciales de molle - Fitoquímica 2013-I

UNIV U VERS SIDAD D NA ACIONAL AG GRAR RIA LA L MO OLIN NA

Potenciaal biociida de los P l aceiites eseencialess extraaídos de d las hojas dee Schinuus mollle L. 17 753 (A Anacard diaceaee)  Eduarddo Anton nio Molinnari Novvoa  Marcoos Miguel Retamoozo Ram mos

Profeesor: Ferm mín Hum mberto Arévalo A O Ortiz Traabajo finaal del currso de Fiitoquímicca Miiércoles 17 1 de juliio -201 13-

Agradecimientos El presente trabajo no hubiera podido llegar a buen puerto, si no fuera gracias a la constante asesoría del profesor del curso, Mg. Sc. Fermín Arévalo, y a la ayuda imprescindible de la técnica del laboratorio Q-6, Sra. Maura Rodríguez. Además, es pertinente mencionar a los profesores de microbiología, Dres. Gutiérrez, Villena y Zúñiga; por facilitar y apoyar la línea de investigación microbiológica: a todos ellos, muchas gracias. Finalmente, un enorme agradecimiento a Alexandra Florián, estudiante afiliada al Laboratorio de Ecología Microbiana “Marino Tabusso”, por el enorme apoyo logístico en la elaboración de las pruebas. Sin su ayuda, nada de esto hubiera sido posible. Por su amistad y complicidad, le dedicamos este trabajo.

Resumen Debido a la alta demanda de productos naturales, y la creciente desconfianza hacia sus pares sintéticos, se buscó una alternativa a los químicos tradicionales a partir de un insumo obtenido de una planta nativa. Es por eso que se probó la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales del molle andino (Schinus molle) en diferentes cepas microbianas. Se encontró que su efectividad es alta comparada con otros antibióticos comúnmente usados. Para ello, La extracción de los aceites se realizó por medio del arrastre de vapor y con equipo Clevenger. Si bien el primer método es más barato y simple que el primero, con el equipo Clevenger se obtuvo mayor cantidad de aceite. El aceite extraído fue deshidratado con sales anhidras de sodio. Además, se cultivó cepas de Escherichia coli en agar nutritivo y se evaluó la efectividad imbuyendo las regiones experimentales con el aceite, su efectividad cualitativamente respecto a los controles. Adicionalmente, se hizo una pequeña prueba para medir el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae, la cual también se ve afectada por el efecto antibiótico del extracto. Finalmente, se realizó un breve estudio de mercado donde se analiza el potencial del molle como biocida, valorando su uso, comparándolo con los precios de otras alternativas, y explicando, brevemente, la

factibilidad de la introducción de los aceites esenciales en la industria nacional.

Introducción A lo largo del siglo XX, la química sintética ha logrado grandes avances en la creación de compuestos, orgánicos o inorgánicos, que inhiben la proliferación de bacterias. Sin embargo, en la actualidad, como parte de un fenómeno de cambio de actitud hacia lo ecológico y natural, (Arellano Cruz, 1998), se busca en la actualidad productos cuyo impacto sobre el ambiente sea menor, tenga un origen natural y con pocas modificaciones industriales, que se fabrique a partir de insumos locales, y que permita restituir a los pobladores parte de la ganancia, como parte de una política “verde” de “precio justo”. Esta corriente, que puede ser denominada “mayordomía” (Gonzales M., 1998), es parte de una ética ambiental cuya aspiración es el sostén de la humanidad, sin perjucio, y más bien con promoción, del ambiente natural; que hunde sus raíces en concepciones renovadas de la occidentalidad cristiana (entendida según es expresada por Miró Quesada Cantuarias, 1981). Este trabajo pretende responder, de manera integral, a todas las demandas de esta mayordomía o stewardship (Chapin, Kofinas, & Folke, 2009), con el empleo de un insumo nativo para la elaboración de productos funcionales, efectivos y que tienen un mínimo impacto sobre el medio ambiente. Por esto, busca dar a conocer las bondades y ventajas de los aceites esenciales extraídos de las hojas del molle andino, especie

nativa de Sudamérica y abundante en nuestro país. Se trabajó con los órganos foliares, por lo que es, en potencia, una fuente renovable y amigable del medio ambiente, que está muy acorde a las tendencias modernas. Tendencias que han sido reconocidas por el Estado Peruano desde el 2004, con la creación de las instituciones ambientales (Ley N° 28245). Sobre la caracterización taxonómica del molle. El “molle” Schinus molle L. (Linnaeus, 1753) es una planta de la Familia Anacardiaceae. Esta Familia se caracteriza por estar conformada por plantas arbóreas o arbustivas, rara vez lianas; con hojas de filotaxis alterna, compuestas y imparipinnadas. En algunos géneros, la hoja se simplifica hasta ser trifoliolada o simple. Los foliolos son opuestos, sub opuestos o alternos; enteros o aserrados. Sus flores son normalmente bisexuales, aunque existen especies con flores imperfectas, actinomorfas, inconspicuas, dispuestas en panículas o inflorescencias racemosas paniculoides, que pueden alcanzar longitudes muy largas, con respecto al tamaño de la flor, que es siempre pentámera. Esta posee en su verticilo externo un juego de sépalos (de tres a cinco) que en algunos casos son acrescentes y persistentes. En el segundo verticilo, los pétalos, si los hubiera, son cinco, libres o basalmente unidos al receptáculo. Los estambres son cinco o diez, dispuestos en uno o dos

verticilos, respectivamente, casi siempre libres, con filamentos delgados y anteras con dehiscencia longitudinal. Con un anillo intraestaminal, aunque algunas veces puede ser extraestaminal. El ovario es súpero, unilocular, con un número de carpelos que oscila, normalmente, entre uno y cinco, aunque pueden llegar a ser hasta 12. Pocas veces el gineceo es apocárpico, si lo fuera, el pistilo es libre. Los estilos son correspondiente al número de carpelos, y si estos están unidos, los primero también lo estarán, separándose solo en los estigmas. Los frutos son drupas o sámaras drupáceas, con mesocarpo seco o carnoso, y con el endocarpo pétreo. Las semillas poseen un embrión curvo, exalbuminado. Las especies son fuertemente entomófilas, particularmente melitófilas, protóginas, autoincompatibles, que requieren de sol para causar la dehiscencia de los estambres. Esta familia es marcadamente tropical, tiene importancia económica por sus especies de madera noble y frutos comestibles (como es el caso del mango o la nuez de cajú). Esta familia es una rósida, perteneciente a un clado de gran importancia económica y cultural, hecho que se nota en esta familia (Stevens, 2013). En general, las rósidas poseen una gran diversidad bioquímica (Panhwar, 2005).

La especie Schinus molle L., 1753; fue descrita en el documento que inauguró la nomenclatura binomial y en la actualidad se considera la especie tipo del género Schinus (Linnaeus, 1753). Se caracteriza por tener un porte arbóreo, con copa redondeada, de hojas compuestas, con foliolos alternos, finos y levemente aserrados. Presenta ritidoma en la corteza. Esta especie es sumamente versátil, lo que lo ha llevado a convertirse en una plaga en otros lugares del mundo (Elfers, 1988). Es rico en resinas, que le confieren un olor característico, que es usado como repelente de insectos (Conabio, 2005). Estas características poseen potencial como reemplazo a otros compuestos funcionalmente afines, como las piretrinas (Casida, 1980), con la ventaja de una menor persistencia (Gan, Lee, Liu, Haver, & Kabashima, 2005). Además, ya se usan tradicionalmente para esos fines, como otras anacardiáceas (Villavicencio-Nieto & Pérez-Escandón, 2010; Bhat, Hegde, & Hegde, 2012). Sobre los métodos de extracción. Para la extracción de aceites esenciales, se emplearon métodos que aprovecharon la volatilidad de los compuestos, para extraerlos por medio de vapor de agua. El primero de ellos, el de arrastre de vapor, consiste en vaporizar agua pura de un recipiente, con el traslado subsecuente de vapor de agua hacia otro que contenga la muestra a trabajar. La temperatura hará que los compuestos

volátiles salgan de las células, y sean arrastrados por el vapor hasta un refrigerante, que permitirá colectar, condensadas, las fases líquidas. Estas se depositan en una pera de decantación, para permitir la separación de las partes acuosa y oleosa. Finalmente, se extrae la parte acuosa primero; quedando la parte oleosa lista para ser recuperada al final (UNAM, 2013), [Figura 1, tomada de UNAM, loc. cit.].

Respecto al otro método de destilación, la hidrodestilación con el sistema de Clevenger, se basa en la diferencia de densidades, y en el uso de un reflujo continuo para la recuperación de aceites en el sistema de asas de Clevenger. En este, la muestra se hace hervir, y los vapores son

recogidos, refrigerados y reflujados, almacenando la parte oleosa en un asa (UNAM, 2013) [Figura 2, tomada de íbid.]

Sobre los aceites esenciales y su potencial antimicrobiano. En general, muchas investigaciones se han hecho sobre el potencial de los aceites esenciales en las ciencias médicas. Se ha probado, sobre todo, con fines antimicrobianos (Tomczykowa, Tomczyk, Jakoniuk, & Tryniszewska, 2008; Soković, Glamočlija, Marin, Brkić, & van Griensven, 2010; Hammer, Carson, & Riley, 1999). Los aceites esenciales del molle han sido objeto de diversas investigaciones, muchas de ellas para determinar

su composición: abundancia de compuestos terpénicos, como el limoneno, sobre todo triterpenos; pero ausencia de taninos o flavonoides (Zahed, Hosni, Ben Brahim, & Sebei, 2011; Rossini, Menéndez, Dellacassa, & Moyna, 2011). Además, existe evidencia de su efecto citotóxico sobre células tumorales (Díaz, Quesada, Brenes, Aguilar, & Cicció, 2008). Estudios anteriores confirman la efectividad del extracto para inhibir el crecimiento de Gram-positivas (Deveci, Sukan, Tuzun, & Hames Kocabas, 2010). Además, se ha encontrado propiedades neurotóxicas y antidepresivas (Machado, y otros, 2008; Machado, y otros, 2007). También se ha evaluado al molle en su efectividad contra Staphylococcus aureus (Cruz-Carrillo, Rodríguez N., & Rodríguez, 2010); amen de muchos otros efectos atribuidos (Catiana Zampini, Cudmani, & Isla, 2007). Aún más, se ha estudiado el efecto del extracto etanólico a nivel subcutáneo (Bras, Domínguez, Minetti, & Ferrero, 2007). Por ello, fue el objetivo de los autores corroborar la abundante bibliografía, al tiempo de presentar las ventajas mercadotécnicas del uso del aceite de molle como antibiótico. Metodología y resultados Se recogió hojas apicales de los árboles de molle de la Universidad Nacional Agraria La Molina, las cuales se secaron para la extracción por arrastre de vapor y para la extracción por medio del sistema de

Clevenger. Se trabajó con 150 g de materia seca en cada caso. Al separar los aceites de la fase acuosa, se tuvo cuidado para evitar la emulsión de la muestra, decantándola gota por gota. Finalmente, se extrajo de ambos métodos los aceites, se mezclaron, y se secaron químicamente con una sal de sulfato de sodio anhidra. Así, la turbidez que caracteriza a los aceites recién extraídos dio paso a una diafanía amarillenta: se había logrado extraer, casi puro, el aceite esencial de molle. Se obtuvo un aproximado de 1 mL por el método de arrastre de vapor, y casi 2 mL por la hidrodestilación de Clevenger. Para la evaluación de antibiosis bacteriana, se cultivó en una placa de agar diferentes concentraciones celulares por litro de cepas de E. coli del Laboratorio de Ecología Microbiana “Marino Tabusso” [Figura 3]. Desde la parte superior, y en sentido horario, se observa la siembra de una concentración de 10-5, 10-6, 10-6 (con la aplicación del aceite esencial), 10-6 y 10-6 (sin aceite esencial aplicado) unidades formadoras de colonias. Se incubó la placa a 37 °C por tres días, según bibliografía (Gutiérrez-Correa, Moreno, Ramos, & Villena, 2011). El aceite se aplicó, por recomendación del personal, con suaves pinceladas antes de la siembra. Se trabajó con una emulsión en agua destilada al 50%, obtenida por agitación y la adición de una gota del detergente para pruebas biológicas Tween 80.

Como see puede obbservar claaramente, la áreas sin s aceite eesencial ap plicado formaronn coloniaas bacteriaanas, mieentras quee la pressencia de aceite esencial de molle inhibió, i cllaramente, la prolifeeración dee E. coli. Figgura 3 

Para la prueba p de proliferación de Saccharom S myces cereevisiae, see aplicó sobre la placa de agar nutriitivo, una película de aceite, tratando de que esta sea lo más homogénea h a posible.. Luego, se s sembróó por pun nción la cepa, a una u concenntración de d 10-6 UF FC. Como se observva en la fiigura 4, al cabo de ocho horas, la l proliferración ceelular se vio inhib bida en comparaación al coontrol.

Figgura 4, a la izzq., sin aceite e; a la derechaa, con aceite. 

Los resuultados cooncuerdan plenamen nte con laa bibliogrrafía, por lo que entendem mos que effectivamente este prroducto tiene potencial. Estudio de mercaado. La factibilidad fa d de la inntroduccióón del aceite de molle paasa por laa posibiliddad de forrmar planttaciones qque sirvan n como fuente dee materia prima p (estto es, la hojas). Com mo su fenoología perrmite la extraccióón de hojaas durantee todo el año, a y la taasa de reggeneración n foliar, según Fllores (com municaciónn personaal) es de aproximad a damente un u mes, se puedee una coleecta cada 15 días, atacando a e dosel aalto y el bajo, el b de El rendim manera alternada. a miento ess de aproxximadameente 100 mL m por cada 6,55 kg de hoojas secass, lo que se traducce en casi 15 kg dee hojas frescas. Se indiccó que un u árbol alcanza la l madurrez en paara ser transplanntado a loos treinta centímetrros, lo quue representa cinco meses desde la siembra en viveroo (CONAB BIO, 19977). A eso, hay quee sumar tres añoss de crecim miento haasta la altu ura funcioonal de 2 m, tamañ ño en el que el foollaje alcannza su voolumen fin nal (Floress, comuniccación perrsonal). Se puedee obtener más de 15 1 kg de hojas h frescas por árrbol, aunq que por

motivos de ajuste financiero se tomará que cada árbol produce, durante cada mes, 30 kg; lo que se traduce en 200 mL de aceite. Esto, aplicado a toda la plantación, representa 20 L de aceite mensual. El aceite de ricino tiene un precio aproximado de 400 € por tonelada, según consultas a un proveedor turco. Considerando que la densidad del aceite de ricino es de 0,9619 kg/L (Wassner, s/d), se tiene que por el precio indicado se compra, aproximadamente, 1040 L a 400 €, sin incluir fletes ni transporte. Esto es 1 L a 2,6 €. Según el Banco de la Nación, con un tipo de cambio de 3,43 PEN/EUR; tenemos que cada litro puede llegar a costar hasta S/. 8,90. Con cien árboles correctamente manejados, se puede obtener hasta 2140 soles anuales; considerando el precio de un producto a todas luces inferior. Si a eso, se le agrega un valor adicional, proveniente de la producción orgánica y la Marca País; el precio aumentará (Weinberger Villarán, 2009). Si establecemos este a un valor de 30 soles el litro, la ganancia anual llega hasta los 7200 soles, con un costo de mantenimiento anual de, aproximadamente, 760 soles; y un costo de introducción de 1610 soles, aproximadamente. En base a lo detallado, y utilizando un documento base modificado (Deutsche Gesellschaft für Technische Zusammenarbeit, 2007), se presenta el siguiente cuadro de costos, de la página siguiente. Se hace para una plantación de cien árboles.

3

Nº Jornales

25

12

Unit. S/.

24

25

36

Subtotal

Mano de Obra

Desmonte 3 1 12

12

48

85

Trazo y marcación 2

PREPARACIÓN DEL TERRENO

Hoyación PLANTACIÓN 12

Descripción

Cordel

Transporte

m

Unidad

Costo de insumos Cantidad

1

Servicio

Unit. S/.

20

20

Subtotal

20

93,48 20

Descripción

46

Unit. S/.

3

5

Vida útil / años

16

20

18,4

54,4

Subtotal

20

54,4

159,4

COSTO TOTAL

Zapapicos 2

60

5

Costo de maquinaria y equipo

Serrucho 1

85

135

5

27

32

5

59

173,48

24

61

Pala 1

Carretilla

62

24,48

1

18,48

Transporte de plantones y abono

0,18

6 100

5

50

5

6 Abono 0,5

0,5

3

12 6 10

100

5

0,5 12 Plantones

Plantones

Baldes 3

Distribución de plantones 0,5 12

12

Kg

Abonamiento 12

12

Tijera de mango largo 1

Tijera de podar 1

Machete 1

Barreta 1

240

180

95

15

30

10

10

10

5

10

24

18

9,5

3

3

57,5

18

15,5

3

51

477,5

243

150

Rafia

Sacos

3

1

50

pieza

pieza

rollo

pieza

6

2

1

1

6

6

1

50

30

6

1

194

24

0

96

120

Mochila 1

17

1

126

1

Agua

Recalce 120

36

12

0,18

90

10

Kg

3

48

200

L

12

Abono

30

4

294

Plantación

Riego

LABORES CULTURALES

Cercado

60 Biol

6

12 36

12

5 12

0,5

Abonamiento y remoción 3 24

Podas

Control fitosanitario 12

Canasta

1

1609,88

12

Manta

7

150,9

500

10

5

700

pieza

Destilador

100

802,48 Modificado de Deutsche Gesellschaft für Technische Zusammenarbeit, 2007

Galones

63

2

607

12

24

144

180

Limpieza COSECHA Y POST COSECHA 12

12

12

12

Recolección y ensacado

1

2

Almacenamiento 49,5

Selección

Costo total de producción

Conclusiones y recomendaciones El aceite de hojas de molle posee efectividad antibiótica, y posee potencial como para iniciar una experiencia empresarial. Se sugiere estudios específicos de fenología y de viabilidad económica para poder establecer, en el futuro, una industria de aceites de origen natural y nacional, para la elaboración de antibióticos industriales y medicinales de bajo impacto ecológico.

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