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FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES AMBIENTALES

“

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES EN PLANTAS CUANTIFICACIÓN SOMETIDAS A ESTRÉS ABIÓTICO”

Cristóbal, Josué; Gálvez Cuadros, Gian Marco; Orrego, Erick; Quinte, Terry; Quenaya, Ivan; Matamoros, Sergio.

Docente: Blgo. Armando Vélez Azañero

2016

INTRODUCCION:

El estrés ambiental es una fuerte restricción para el aumento de la productividad y de la extensión de los cultivos. Se estima que únicamente un 10% de la superficie de tierra arable se encuentra libre de estrés (Benavides. 2002). Cerca del 20% de la tierra presenta algún tipo de deficiencia o toxicidad mineral. El 26% es afectada por estrés de sequía y 15% por temperatura (Blum, 1988); incluso bajo condiciones de producción protegida, como el uso de invernaderos y túneles, donde también se presentan eventos de estrés biótico o abiótico que disminuye la productividad. El estrés es un estado en el que la planta no puede desarrollarse de manera óptima debido a un factor externo que ejerce una influencia negativa sobre esta, generándose una serie de cambios y reacciones. Estos cambios pueden ser dichos cambios reversibles o permanentes, aun si la condición de estrés es temporal es normal que la vitalidad de la planta se vea reducida mientras se realizan los ajuste para la nueva situación (Benavides. 2002) Este es un concepto relativo ya que una determinada situación medioambiental puede resultar estresante para una especie y no para otras (Hernández), esto se debe a que debido a la inmovilidad las plantas de diferentes especies han desarrollan diferentes mecanismos de defensa de acuerdo a su medio. Uno de estos mecanismos para reducir dejar de estar en estres es la movilización decarbohidratos a las vacuolas con la finalidad reducir el área de interaccion de los solutos y evitar la perdida excesiva de agua, sin embargo cada uno de los solutos requiere de transportadores muchas veces específicos y estructuras que le permitan realizar este cambio fisiológico y bioquímico. (Velez. 2015), las moléculas que se van a encargar de esto son las proteinas que se encuentran en el medio celular que van a ir aumentando enconcetracion a medida que aumenta el nivel de estrés. El objetivo de esrta practica es determinar cuantitativamente la concentración de proteinas totales

METODOLOGIA Y MATERIALES MATERIALES:

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Centrifuga HENTTICH zentrifugen Reactivo de Biuret Estándar de Proteínas Totales Agua Destilada Pipetas de 1mL Gradillas Tubo de ensayo 10 mL Papel filtro Mortero Soporte Universal Espectofotometro Pizetas Embudo Plantas Plantas de tomate Cloruro de sodio Micropipeta Axygen Balanza

METODOS: EXPERIENCIA N. 1

1. Se retiró una planta de cada cultivo (Control y Tratamiento) sin romper las raíces. 2. Se lavaron cuidadosamente, se pesó y se colocó al mortero. 3. Se hizo un homogenizado con 10mL de agua hasta conseguir una muestra liquida. 4. Se colocó en la centrifuga a 5000 rpm por 10 minutos y se almaceno el sobrenadante. EXPERIENCIA N.2 1. Se rotuló dos tubos de ensayo: Control y muestra 2. Se colocó 0.5mL de cada homogenizado y luego se agregó 1mL de reactivo de Biuret a cada uno. Reposando por 10 minutos. 3. Control de Muestra Se colocó 0.5 de agua destilada Se agregó 1mL de reactivo de Biuret 4. Control de Biuret 5. Se realizo la lectura de la absorbancia a 595nn 6. Se uso la curva de calibración para calcular la concentración de proteínas expresadas en ug de proteínas/g de peso húmedo, para esto se preparó una batería de tubos con estándares entre 1000 y 3000ug de proteínas totales

RESULTADOS a) Relación tratamiento y control de proteínas - Obtuvimos las absorbancias de plantas que estaban sometidas a un estado salino. MUESTRA

CONTROL DE PROTEINAS 0.482 0.346 0.414 0.375 Tabla 1. Resultados de tratamiento y control de proteínas. Usamos el programa R Project para obtener resultados de Pearson “r” y el índice de confianza “P” de este experimento.

muestra control Muestra 1 -1 control -1 1 Tabla 2. Resultados de Pearson, obtenido de las absorbancias de proteínas. Como podemos ver en la tabla 2. Obtuvimos que r = -1, entonces decimos que existe una correlación negativa perfecta. El índice indica una dependencia total entre las dos variables llamada relación inversa: cuando una de ellas aumenta, la otra disminuye en proporción constante. Con respecto al índice de confianza, no pudimos obtener ningún resultado, entonces tuvimos que usar un artificio que consistió en elevar al cuadrado y duplicar las absorbancias de cada muestra y cada control. Después de hacer los artificios, usamos “shapiro” para obtener los resultados.

Índice de confianza Muestra 0.02386 control 0.02386 Tabla 3. Resultados de índice de confianza. De acuerdo a estos resultados, podemos decir que hipótesis nula se rechaza. En el diagrama de cajas podremos observar la variación que hay para cada tratamiento con respecto a la media.

b) Relación glucosa  – proteínas glucosa Proteínas 0.060 0.482 0.064 0.414 Tabla 4. Resultados de Absorbancias. En la tabla 5, existe una correlación positiva perfecta. El índice indica una dependencia total entre las dos variables denominada relación directa: cuando una de ellas aumenta, la otra también lo hace en proporción constante.

Muestra control

muestra 1 1

control 1 1

Tabla 5. Resultados de Pearson. Para el índice de Pearson, se tuvo que hacer un artificio ya que no obtuvimos respuesta alguna, es por eso que elevamos al cuadrado los tratamientos y así tenemos los datos que requerimos. En este caso, la hipótesis nula es rechaza, ya que tenemos un resultados que está bien estadísticamente hablando por que esta debajo de 0.05.

Índice de confianza Proteínas 0.02386 glucosa 0.02386 Tabla 6. Datos obtenidos de los resultados de glucosa y proteínas DISCUSIONE El aumento de proteínas contrastado con el control estaría relacionado directamente con el medio salino al que se expuso la planta de tomate, existiendo precedentes según el estudio de (Leticia Fuentes, Amalia Domínguez, A.R. Mesa y S. Gonzáles, 2008) expresan que la acumulación de determinados metabolitos y los cambios en la actividad de enzimas antioxidantes, como la catalasa y la peroxidasa, pueden relacionarse con las potencialidades de una planta para contrarrestar el efecto nocivo de la salinidad en los diferentes procesos fisiológicos y morfológicos, en su presente trabajo se determinó los contenidos de proteínas y carbohidratos totales en callos obtenidos a partir de tres explantes de Stylosanthes guianensis CIAT-184, cultivados en medio MS a diferentes concentraciones de (0.25, 50, 75 y 100 mM). (Sestak y col, 1971) el análisis del crecimiento es el primer paso a considerar para cualquier estudio posterior de productividad en plantas. También (Coombs y Hall, 1985) comenta que para la medición del crecimiento se utilizan valores de peso de la planta (seco o húmedo) área foliar o incluso cantidad de proteínas en la hoja o su contenido de clorofila. De todos estos parámetros de crecimiento, el peso seco relativo refleja de forma más conveniente la cantidad de tejido producido y acumulado por la planta, debido a que el peso húmedo depende de las condiciones hídricas. Por otro lado (Dell Amico y col, 1998) se refieren que el incremento de materia seca en plantas de tomate sometidas a estrés salino está relacionado directamente con un incremento en la síntesis de descomposición que intervienen en los mecanismos permitiendo tolerar el estrés salino y la disminución del contenido de agua en las células. Coincidiendo, los autores (Ben y col, 1989) aislaron y caracterizaron estas proteínas en cítricos y tomate. (Viegas y col, 1999) supondría que en la raíz existe mayor cantidad de sus proteínas estructurales y reguladoras, aun cuando se sabe que en las hojas se sintetizan una serie de proteínas en respuesta al estrés salino como señala (Singh y col, 1985). En condiciones de salinidad las plantas usan mecanismos para su ajuste osmótico una proporción de sus fotoasimilatos, incrementando así su potencial osmótico interno. (Balibrea y col, 1996). Sin embargo (Lópes, 2011) expresa que las proteínas solubles en las plantas tienen una función importante en diversos mecanismos celulares importantes, como metabolitos, iones de transporte y la respuesta al estrés abiótico y biótico. Respaldado (Prioul, 2006) expone que la acumulación de solutos durante el estrés salino comprende azucares tales como glucosa, fructuosa, sacarosa, trehalosa y sorbitol; además de azucares alcohol manitol, sorbitol, aminoácidos prolina y aminas como betaina, glicina y poliamidas que se acumulan bajo estrés como osmolitos para mantener la turgencia celular y para

estabilizar proteínas de la célula mediante el mecanismo de ajuste osmótico. El ajuste osmótico consiste en una disminución del potencial osmótico en los tejidos vegetales lo que permite la entrada del agua e impide la disminución de la turgencia; se origina a través de la biosíntesis de osmolitos orgánicos de bajo peso molecular y por el aumento de iones (Cushman, 2001). La organogénesis es un proceso altamente consumidor de energía, la cual se obtiene a partir de la degradación del almidón, ya que se producen intermediarios glicolíticos que pueden ser catabolizados para producir gran cantidad de ATP. Los estudios realizados en diferentes especies como : Nicotiana tabacum (Thorpe, Joy y Leung, 1986), Manihot sculenta (Stam, 1987) y Humulus lupulus (Fortes y Pais, 2000) han demostrado este hecho. También (Xiong y Zhu, 2002) evidencian que encontraron cambios en la expresión génica de plantas sometidas a diferentes factores abióticos. En este sentido, mientras que determinados procesos que implican una síntesis activa de proteínas (como la división celular) son afectados total o parcialmente por el estrés osmótico debido a la presencia de cloruro de sodio en el medio. Otro grupo importante de proteínas podrían ser sobre expresadas, entre estas se encuentran las enzimas antioxidantes como mecanismo para eliminar los radicales libres del oxígeno, cuyos niveles son exacerbados bajo el efecto del estrés salino (Hernández, Jiménez, Mullineaux y Sevilla, 2000), así como enzimas ATPasas, transportadores proteicos de iones y acuaproteínas para mantener la homeostasis iónica intracelular (Xiong y Zhu, 2002). Indagando frente a otras especies (Pessarakli, 1994) precisa que la tolerancia a salinidad en la germinación de muchas especies no está consistentemente relacionada a la tolerancia durante la emergencia, crecimiento vegetativo, floración y fructificación. Así, por ejemplo, betarraga, cebada y algodón cultivos tipificados como de alta tolerancia a las sales, son relativamente sensibles durante la germinación y en el estado de plántula. Otras especies como el maíz, arvejas y habas son más sensibles durante estados más avanzados de desarrollo. La presencia de sales en el medio disminuye el potencial hídrico, provocando una menor disponibilidad de agua para las semillas, de manera que estas deben generar suficiente potencial osmótico para mejorar el estatus hídrico en los embriones y permitir su crecimiento. (Jones, 1986). Estudios en los cuales trataron semillas de diversos cultivares de  L. esculentum a concentraciones crecientes de NaCl, demostraron que el porcentaje de germinación disminuye con el aumento de la salinidad, y a la vez se prolonga el periodo de germinación  (Cuartero y FernándezMuñoz, 1999). En cuanto a la tolerancia a salinidad entre distintas especies, investigaciones que evaluaron 20 accesiones de L. peruvianum, 2 accesiones de L.  pimpinellifolium y 6 de L. esculentum empleando NaCl, reportaron que tres de las veinte accesiones de L. peruvianum fueron más tolerantes a la salinidad, al presentar éstas una mejor germinación y crecimiento de la plúmula/radícula hasta una CE de 10,2 dS/m, mientras que el resto de las accesiones mostraron efectos perjudiciales, y por lo tanto una menor tolerancia, a niveles de CE superiores a 4,95 dS/m (Srinivas, 2001). Estos resultados indican la existencia de potencial genético para tolerancia a salinidad en el germoplasma silvestre de Lycopersicon.

CONCLUCIONES -

Las concentraciones de salinidad inducen a una clorosis. El incremento de salinidad produce crecimiento de raíces segundarias y ensanchamiento del tallo. Genera un aumento de proteínas que permiten el ingreso de mayor cantidad agua.

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Se rechaza la hipótesis nula, ya que la variable con la que se está trabajando tiene afinidad en el desarrollo del problema.

CUESTIONARIO 1. Los aminoácidos se suelen designar mediante símbolos de tres letras. Recientemente se ha adoptado también un conjunto de símbolos de una letra para facilitar la comparación de las secuencias aminoácidas de las proteína homólogas.

Aminoácidos con grupos R no polares o hidrofóbicos. Existen 8 aminoácidos que contienen grupos R no polares o hidrofóbicos. Aquí se encuentran la alanina, la leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptófano y la metionina. Estos aminoácidos son menos solubles en el agua que los aminoácidos con grupos R polares. El menos hidrófobo de esta clase de aminoácidos es la alanina, la cual se halla casi en la línea fronteriza entre los aminoácidos no polares y los que poseen grupos R polares.

Aminoácidos con grupos R polares sin carga. Estos aminoácidos son relativamente más solubles en el agua que los aminoácidos anteriores. Sus grupos R contienen grupos funcionales polares, neutros que pueden establecer enlaces de hidrógeno con el agua. La polaridad de la serina, la treonina y la tirosina se debe a sus grupos hidroxilos; la de la aspargina y la glutamina, a sus grupos amídicos y de la cistina a la presencia del grupo sulfhidrilo (-SH). La glicola, a veces se clasifica como una aminoácido no polar. La cistina y la tirosina poseen las funciones mas polares de esta clase de aminoácidos, sus grupos tilo e hidroxilo fenólico tienden a perder mucho más fácilmente protones por ionización que los grupos R de otros aminoácidos de esta clase.

Aminoácidos con grupo R con carga positiva Los aminoácidos en los que los grupos R poseen carga positiva neta a PH 7, poseen todos seis átomos de carbono. Aquí se encuentran la lisina, la arginina y la histidina. Esta última tiene propiedades límite. A pH 6 más del 50 % de las moléculas de la histidina, poseen un grupo R cargado positivamente, pero a pH 7 menos del 10 % de las moléculas poseen carga positiva.

Aminoácidos con grupos R con carga negativa. Los dos miembros de esta clase son los ácidos aspártico y glutámico, cada uno de los cuales posee un segundo grupo carboxilo que se halla completamente ionizado y por tanto cargado negativamente a pH 6 y 7. Lehninger L. (1990)

2. Sólo en una ocasión se había encontrado anteriormente un aminoácido distinto de los 20 conocidos que, combinados de forma diferente, forman todas las proteínas existentes en la Tierra, base de la vida. Los aminoácidos se definen como compuestos químicos que tienen un grupo amínico y otro carboxílico unidos a un mismo átomo de carbono.El aminoácido hallado en Groenlandia, denominado AIB, no existe en la Tierra excepto en algunas pocas muestras microbianas purificadas en laboratorio, explica Bada, de la Universidad de California en San Diego, quien no duda de su origen extraterrestre. "El

pedazo de hielo perforado del que ha sido extraído tiene cuatro millones de años de antigüedad y hemos tenido que procesar 10 kilos de hielo para encontrar una millonésima de gramo de AIB", dice. El aminoácido fue descubierto el pasado mes de diciembre en una muestra perforada en 1992. En 1952 se ocuparon de comprobar esta teoría dos investigadores: Urey y Miller de la Universidad de Chicago, demostraron que algunos compuestos orgánicos esenciales para la vida pudieron formarse de sustancias simples, en las condiciones de la atmósfera primitiva y un constante bombardeo eléctrico, lograron hacer aparecer una sustancia anaranjada que contenía compuestos orgánicos, especialmente aminoácidos, las moléculas que componen la vida. Según la hipótesis heterotrófica demostrada en parte por los experimentos de Urey y Miller, existieron condiciones especiales en la Tierra primitiva que transformaron sustancias simples en otras muy complejas como son los aminoácidos. Los aminoácidos, compuestos org ánicos formados en es a atmós fera tan especial,  s eg uramente fuer on arras trados por el vapor de ag ua conver tido en lluvia hacia lag os, mares y océanos, constituyendo un líquido rico en c ompues tos org ánicos que fue denominado “caldo primitivo”.

Seguramente en los cuerpos de agua más pequeños, pudieron encontrarse varios aminoácidos y formar cadenas, polipéticos o proteínas y de la misma manera formar otros compuestos orgánicos. A su vez estas moléculas grandes se agruparon al azar en conglomerados o enjambres moleculares constituyendo formas diversas llamadas precelulares. Entre estas formas variadas existieron algunas de características más ventajosas que aumentaron su tamaño y complejidad a expensas de las menos eficientes. Oparin llamó coacervados a muchos de estos tipos precelulares que adquirieron la forma de pequeñas gotas proteicas rodeadas de una película de agua. Rivera, A. (1994) Leguizamón, R. (2001) 3. Se podría decir que una de las funciones más importantes sería que las proteínas pueden modificar agentes físicos y químicos (metales pesados). Además, algunas proteínas mantienen el equilibrio hosmótico y actúan con otros sistemas amortiguadores para mantener constante el pH del medio interno. En las plantas, la elicitina actúa como anticuerpo contra un grupo reducido de parásitos, los cuales afectan también a los hongos. Los parásitos necrófilos (microparásitos que presentan especializaciones en determinadas especies e huéspedes y causan la muerte de organismos heridos), actúan a través de enzimas (proteínas) alterando al metabolismo de huéspedes. 4. No, Solo está presente si hay mas de una cadena polipeptídica. Con varias cadenas polipeptídicas, la estructura cuaternaria representa su interconexión y organización. Por ejemplo, la hemoglobina, una proteína con cuatro polipéptidos, dos alfa-globinas y dos beta globinas. Raisman, J. (1998)

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