Tp de systématique bactérienne

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

Université Ferhat Abbas Sétif

Faculté des sciences de la nature et de la vie

Département de Microbiologie

Travaux pratiques de systématique bactérienne

Table des matières

2. Purification des souches 3. Conservation des souches 4. Identification des souches purifiées 4. 1. Etude des caractères morphologique 4. 1. 1. Examen macroscopique 4. 1. 2. Aspect microscopique 4. 1. 2. 1. Observation à l’état frais 4. 1. 2. 2. Techniques de coloration simple : bleu de méthylène 4. 1. 2. 3. Techniques de coloration complexe : Coloration de Gram 4. 1. 2. 4. Techniques de colorations particulières : Coloration des spores : méthode au vert de Malachite 4. 1. 3. Etude des types respiratoires 4. 1. 3. 1. Culture en aérobiose 4. 1. 3. 2. Culture en anaérobiose 4. 1. 4. Etude des enzymes respiratoires terminales 4. 1. 4. 1. Recherche de l’oxydase 4. 1. 4. 2. Recherche de la catalase 4. 2. Etude des caractères biochimiques 4. 2. 1. Le métabolisme glucidique 4. 2. 2. Étude des différentes voies fermentatives intermédiaires 4. 2. 2. 1. Réaction au rouge de méthyle 4. 2. 2. 2. Réaction de Voges-Proskauer (Production d’acétoïne)

4. 2. 3. Production du gaz à partir du glucose 4. 2. 4. Recherche de β-galactosidase 4. 2. 5. Métabolisme des composés azotés 4. 2. 5. 1. Recherche de nitrate réductase 4. 2. 5. 2. Recherche de l’uréase 4. 2. 5. 3. Métabolisme protéique 4. 2. 5. 3. 1. Recherche des décarboxylases : Lysine décarboxylase (LDC), Ornithine décarboxylase (ODC) et Arginine dihydrolase (ADH) 4. 2. 5. 3. 2. Recherche du tryptophane désaminase (TDA) 4. 2. 5. 3. 4. Production d’indole 4. 2. 6. Métabolisme des molécules larges 4. 2. 6. 1. Recherche de lécithinase 4. 2. 6. 2. Recherche de lipase 4. 2. 6. 3. Recherche d’α-amylases 4. 2. 6. 4. Recherche des protéases 4. 2. 6. 4. 1. Recherche de la caséinase 4. 2. 6. 4. 2. Recherche de la gélatinase 4. 2. 6. 5. Recherche de citrate perméase 4. 2. 7. Autres tests 4. 2. 7. 1. Utilisation du mannitol 4. 2. 7. 2. Recherche d’hémolysines 4. 2. 7. 3. L’antibiogramme 4. 2. 7. 4. Systèmes d’identifications microbiennes commerciales : La galerie Api 20E 4. 2. 7. 5. Croissance sur milieu King (King A et King B):

Annexe Composition des milieux de cultures utilisées Colorants et réactifs utilisées

1. Isolement des souches 2. Purification des souches Après 24h d’incubation, les cultures sont purifiées. Celle-ci qui permet d’obtenir des cultures pures à partir de souches obtenues. La sélection est basée sur l’aspect macroscopique des colonies : la couleur, la forme, le diamètre, l’opacité… Un échantillon de chaque type de colonie est prélevé ensuite purifié par repiquage successif selon la méthode de stries (Austin, 1988). 3. Conservation des souches Les souches isolées sont conservées dans des tubes à essai contenant un milieu GN incliné (annexe 2). Les souches sont ensemencées sur la pente des tubes par la méthode des stries, puis incubées à 30°C pendant 24 heures. Les tubes dans lesquels il y a eu une croissance seront conservés à 4°C pour une durée de 4 à 6 semaines. Afin de pouvoir toujours disposer de souches viables, la réactivation doit se faire tous les mois (Marchal et Bourdon, 1982). 4. Identification des souches purifiées L’identification

des

isolats

est

basée

sur

leurs

caractéristiques

morphologiques,

physiologiques et biochimiques (Coloration de Gram, détermination de la température d’incubation, catalase, croissance dans NaCl, croissance en anaérobiose, test de VogesProskauer et de rouge de Méthyle, Croissance à pH 5.7, la fermentation des carbohydrates, l’hydrolyse de l’amidon, utilisation du citrate, la formation d’indole, formation du dihydroxyacetone, déamination du phénylalanine, hydrolyse de caséine, dégradation de tyrosine, hydrolyse de gélatine, jaune d'œuf lécithines) et sur les systèmes d’identification rapides (galerie API 20E). 4. 1. Etude des caractères morphologique Cette étude est basée sur des observations macroscopiques et microscopiques (x100) permettant de différencier le type de Gram, les coques, les bacilles ainsi que la disposition des cellules.

4. 1. 1. Examen macroscopique L’observation de l’aspect macroscopique des colonies permet d’effectuer une première caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de l’identification. D’après les auteurs Thoma et al. (1970), les éléments d’identification macroscopiques sont : -

La forme des colonies : rondes, irrégulières,…etc.

-

La taille des colonies par la mesure du diamètre : pinctiformes ou non pinctiformes.

-

La chromogénése : couleur de la colonie.

-

L’élévation : convexe, concave, plate.

-

L’opacité : opaque, translucide ou transparente.

-

La surface : lisse, rugueuse, sèche, dentelée,…etc.

4. 1. 2. Aspect microscopique 4. 1. 2. 1. Observation à l’état frais Ce test permet de déterminer la forme, l’arrangement et la mobilité des bactéries. Il consiste en l’observation d’une goutte de suspension bactérienne, préparée avec de l’eau physiologique et placée entre lame et lamelle. L’observation se fait sur microscope photonique. a) 1. Mode opératoire -Déposer une goutte d'une culture en milieu liquide sur une lame de verre. -Recouvrir la goutte d'une lamelle couvre objet (la culture ne doit pas déborder les contours de la lamelle). -Luter la lame avec de la paraffine fondue. -Observer immédiatement au microscope (objectif x40, condenseur non relevé au maximum, diaphragme non complètement ouvert). -Après observation jeter immédiatement la lame dans un bocal contenant de l'eau de Javel. a) 2. Observation au microscope Elle se fait en lumière blanche, éclairage direct de la préparation (grossissement : objectif x 40).

4. 1. 2. 2. Techniques de coloration simple : bleu de méthylène b) 1. Technique -Faire un frottis des bactéries sur une lame propre et sèche : avec une anse on étale doucement un peu de suspension bactérienne sur le milieu de la lame. -Sécher. -Fixer à l’alcool et rincer à l’eau, ou fixer à la flamme en passant la lame trois fois dans la flamme du bec Bunsen réglé en flamme éclairante (virole fermée). -Recouvrir d’une solution de bleu de méthylène pendant une minute. Rincer et sécher entre deux papiers-filtres. Eliminer l’humidité résiduelle au-dessus de la veilleuse du bec Bunsen. b) 2. Observation A l’immersion (grossissement : objectif x 100). En lumière blanche. 4. 1. 2. 3. Techniques de coloration complexe : Coloration de Gram C'est une double coloration qui nous permet de connaître la forme, l'arrangement, la pureté ainsi que la nature biochimique de la paroi des cellules purifiées. Cette coloration permet de classer les bactéries selon leur capacité à fixer le cristal violet. Celles qui possèdent une enveloppe externe sont décolorées lors du lavage à l’éthanol (Gram-), alors que celles qui n’en possèdent pas vont retenir le colorant (Gram+) (Perry, 2004). La consistance et la valeur de la coloration de Gram correspond à des différences biochimiques entre la paroi des bactéries Gram positif et les bactéries Gram négatif (Marchal et Bourdon, 1982). Technique : - Préparer et fixer un frottis bactérien à la chaleur du bec Bunsen. - Recouvrir au violet de Gentiane pendant 1min. Eliminer l'excès par l'eau courante; - Ajouter du Lugol : deux bains de 45 secondes, jeter l'excès par l'eau courante; - Traiter à l'alcool 95° pendant 30 secondes, puis rinçage à l'eau; - Recolorer à la Fuschine pendant 1à 2 minutes, rinçage à l'eau puis séchage; L'observation se fait en ajoutant de l'huile à immersion .Les bactéries Gram positif se colorent en violet alors que les Gram négatif se colorent en rose.

4. 1. 2. 4. Techniques de colorations particulières : Coloration des spores : méthode au vert de Malachite Le but : Permet la mise en évidence des spores dans les bactéries. La Technique : · Faire un frottis des bactéries sur une lame propre et sèche ; · Sécher le frottis ; · Fixer à l’alcool puis rincé à l’eau, ou à la flamme en passant trois fois dans la flamme (ou au-dessus du bec) ; · Colorer avec une solution de vert Malachite à 5% pendant 10 minutes ; · Rincer à l’eau distillée ; · Colorer à la safranine ou au mercurochrome à 5% pendant 1 minute ; · Rincer à l’eau distillée ; · Sécher. Observation de la préparation : Observer le frottis à l’immersion (objectif ×100). 4. 1. 3. Etude des types respiratoires 4. 1. 3. 1. Culture en aérobiose Principe: Les microorganismes aérobies peuvent être cultivés sur milieu gélosé incliné en tubes ou en boites de Pétri. L’ensemencement s’effectue en surface par stries (ou étalement au râteau dans les boites). La culture se développe en surface. Cette technique permet d’étudier la morphologie coloniale mais ne permet pas d’obtenir une grande quantité de culture. La culture en tubes de milieu liquide bouchés coton cardé ne permet qu’ne aérobiose incomplète. On l’utilise dans le cas où le rendement de culture importe peu (Guiraud et Galzy, 1980). - Incubation à 30°C pendant 24 heures. 4. 1. 3. 2. Culture en anaérobiose Principe: Une anaérobiose partielle avec atmosphère enrichie en CO2 peut être facilement réalisée en utilisant un récipient fermé dans lequel on place une bougie allumée à côté des boites de Pétri

ou des tubes de milieux. Le récipient est fermé et la bougie s’éteint au bout de quelques instants en ayant consommé de l’oxygène et libéré du gaz carbonique (Guiraud et Galzy, 1980). - Incubation à 30°C pendant 24 heures. Lecture: Lorsqu’il y a une croissance, en dit ; la bactérie est anaérobie. 4. 1. 4. Etude des enzymes respiratoires terminales 4. 1. 4. 1. Recherche de l’oxydase Principe Ce test permet la détection de la phénylène-diamine-oxydase ou le cytochrome oxydase; enzyme entrant dans divers couples d'oxydoréduction. Agissant sur un substrat incolore, cet enzyme entraîne la formation d'une semi-quinone rouge. Cette dernière, très instable, s'oxyde rapidement pour donner un composé noirâtre (Marchal et Bourdon, 1982). La technique Sur un papier filtre stérile, déposer un disque d'oxydase imprégné de diméthyl-para-phénylène diamine. Humidifier le disque avec quelques gouttes d'eau distillée stérile. Un excès d'eau peut nuire à la lecture. À l'aide d'un cure-dent prendre la bactérie à identifier (culture de 18-24heures) et la déposer sur le disque. Lecture: Apparition d'une coloration violette immédiatement : la souche est dite oxydase positive. 4. 1. 4. 2. Recherche de la catalase Principe: La catalase est un enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène (H2O2) avec dégagement d'oxygène selon la réaction suivante (Marchal et Bourdon, 1982) :

Technique: Sur une lame et à l’aide d’une pipette Pasteur, on dépose une colonie bactérienne à laquelle on ajoute de l'eau oxygénée (à 10 volumes). Lecture: Catalase+ : effervescence. Catalase - : pas d'effervescence. 4. 2. Etude des caractères biochimiques Grâce à cette étude, il est possible de connaître certaines caractéristiques du métabolisme des bactéries isolées. Les tests biochimiques permettent donc de vérifier si la bactérie a un métabolisme oxydatif ou fermentatif, s’il y a formation d’un acide à la suite de l’utilisation d’un hydrate de carbone (ex : glucose, arabinose, sorbitol ...), si un composé particulier est utilisé comme seule source de carbone (ex : citrate, malonate ...), si un acide aminé peut être transformé (ex : arginine, lysine, tryptophane ...), si un enzyme particulier est présent (ex : oxydase, catalase, pectinase ...) ou si des molécules complexes sont dégradées (ex : gélatine, amidon ...). 4. 2. 1. Le métabolisme glucidique Le milieu utilisé est le milieu Hugh et Leifson (annexe 2) de couleur vert, Ce milieu permet de déterminer la voie d'attaque des glucides, comme par exemple le glucose. Milieu de type MEVAG : Milieu d'Étude de la Voie d'Attaque des Glucides. L'acidification ou non des glucides : glucose, arabinose et xylose suffisent généralement pour l'identification. Principe De l'étude du métabolisme énergétique il découle que un glucide peut être catabolisé par voie respiratoire ou par voie fermentative. Le milieu de Hugh et Leifson permet de distinguer entre les deux processus. La dégradation d'un glucide s'accompagne généralement d'une acidification du milieu : - lors des respirations le glucide est oxydé en CO2, par le dioxygène (ou un autre oxydant minéral) ; - lors des fermentations le glucide est oxydé en acides, alcools, qui sont libérés dans le milieu qu'ils acidifient sensiblement. Toutes les voies fermentaires ne sont cependant pas également acidifiantes.

Le milieu de Hugh et Leifson contient un indicateur de pH, le bleu de bromothymol, qui prend une couleur jaune en milieu acide. Technique - Régénérer le milieu au bain-marie bouillant. Ramener à 45-50°C. - Ajouter aseptiquement le glucide étudié (glucose, arabinose, xylose, maltose, galactose, saccharose, cellobiose et trehalose) pour obtenir une concentration finale de 1%. - Agiter (l'agitation doit être douce pour éviter l'entrée d'air) et laisser le milieu se solidifier (en le passant sous l'eau froide par exemple). - Ensemencer par piqûre centrale les deux tubes de Hugh et Leifson, l'un sera recouvert d'une couche d'environ 1-1.5cm d'épaisseur de vaseline stérile, - Deux tubes non ensemencés, l'un additionné de vaseline stérile l'autre sans vaseline qui seront utilisés comme témoins, - Ne pas revisser à fond le bouchon. - Incuber les tubes ensemences et les témoins à l'étuve à 30°C pendant 24 à 48 heures. Lecture: Bactéries fermentatives: virage au jaune du tube avec vaseline. Bactéries oxydatives : virage au jaune du tube sans vaseline. Bactéries oxydatives fermentatives: virage au jaune des tubes avec et sans vaseline. 4. 2. 2. Étude des différentes voies fermentatives intermédiaires Principe Cette étude permet d’effectuer une différenciation entre la fermentation des acides mixtes (réaction rouge de méthyle : RM) et butylène glycolique (réaction Voges-Proskauer, VP). Ces deux réactions ont un intérêt différent, mais elles peuvent être effectuées sur le même milieu et le plus souvent, se vérifiant mutuellement, une souche à RM+ est habituellement VP- et vice versa. 4. 2. 2. 1. Réaction au rouge de méthyle : elle consiste à mettre en évidence l’acidification finale d’un milieu glucosé par la fermentation du glucose, cette acidification provoque le virage du rouge de méthyle (rouge à un pH ≤ 5; jaune pH ≥ 5.8).

4. 2. 2. 2. Réaction de Voges-Proskauer (Production d’acétoïne) : certaines bactéries sont capables de produire de l’acétyl-méthyl carbinol, soit à partir de deux molécules d’acide pyruvique, soit, le plus souvent au cours de la fermentation de 2-3 butyléne glycolique.

En présence d’une base forte l’acétoïne donne une coloration rouge au milieu oxygéné (oxydation en diacétyle). Le diacétyle formé réagit avec le groupement guanidine α de

- naphtol pour donner un

composé rouge.

Technique : Une colonie de la souche à étudier est ensemencée sur le milieu Clark et Lubs puis incuber à 30°C pendant 24 à 48 heures. Après l’incubation, diviser le milieu dans deux tubes stériles, verser quelques gouttes de VP I et quelques gouttes de VP II dans l’un des tubes, et dans l’autre, ajouter quelques gouttes de réactif RM (rouge de méthyle). Lecture: Test VP: Coloration rouge: VP+. Coloration jaunâtre: VP-. Test RM: Coloration rouge: RM+. Coloration jaunâtre : RM-. 4. 2. 3. Production du gaz à partir du glucose Un milieu liquide (le bouillon nutritif) additionné de 0.004 % de rouge de phénol et 10% du glucose stérile avec éventuellement une cloche de Durham. Inoculer le milieu et incuber pendant 24h.

4. 2. 4. Recherche de β-galactosidase Principe: Pour dégrader activement le lactose, les microorganismes doivent posséder deux enzymes ; la perméase et β-galactosidase. L’épreuve ONPG permet de mettre en évidence la β-galactosidase qui dégrade l’ONPG soit l’orthonitrophényl- β-D- galactopyranoside qui possède une structure analogue au lactose. Le lactose est formé de deux molécules de glucose et de galactose, tandis que l’ONPG est composé d’une molécule d’orthonitrophényl liée à un galactose. L’hydrolyse de l’ONPG (composé incolore) libère l’orthonitrophényl qui est responsable de la coloration jaunâtre de milieu, Ce processus se fait selon la réaction illustrée dans la figure 7.

Fig. 7 : Réaction d’hydrolyse de l’ONPG (Marchal et Bourdon, 1982).

Technique: - Préparer une suspension dense d'une culture bactérienne à étudier dans un tube à essai stérile contenant 0.5ml d'eau physiologique, puis y ajouter un disque ONPG. - incuber au bain Marie à 37°C pendant 24 heures. Lecture: La lecture se fait à des intervalles de temps différents : après 15mn, 30mn, 1 heure, 6 heures et 24 heures. Le test ONPG est positif lorsque la suspension bactérienne se colore en jaune citron.

- Utilisation des sucres TSI (gélose au glucose, lactose, saccharose): Principe: Cette méthode permet de mettre en évidence d’une part, la fermentation du glucose (avec ou sans dégagement de gaz), du lactose, du saccharose et d’autre part, la production d'hydrogène de sulfate (H2S). C'est un milieu incliné dont le glucose présent dan le culot, est attaqué par voie fermentative entraînant une acidification du milieu avec production ou non de gaz. Sur la pente, le lactose et le saccharose seront alors oxydés et fermentés. La production du H2S se manifeste par un noircissement du culot (Marchal et Bourdon, 1982). Technique: Une colonie est ensemencée en réalisant une piqûre centrale dans le culot et des stries serrés sur la pente. Remettre le bouchon du tube sans le revisser. Incubation à 30°C pendant 24 heures. Lecture: Lactose-saccharose positif : pente virant au jaune; Glucose positif: culot jaune; H2S positive: noircissement du milieu dans la zone joignant la pente et le culot. Production de gaz : présence de bulles de gaz dans le culot. 4. 2. 5. Métabolisme des composés azotés 4. 2. 5. 1. Recherche de nitrate réductase Principe: L'étude de la réduction des nitrates se fait par la mise en évidence des nitrites formés. Ces derniers en milieu acétique ou sulfurique, donnent une coloration rose. L’enzyme nitrate réductase B catalyse la réaction des nitrates en nitrites (réduction assimilatrice) (Marchal et Bourdon, 1982).

Les nitrates peuvent aller également jusqu’au stade azote (N2). Dans ce cas, on doit compléter par l'épreuve de Zoo Bell, épreuve qui consiste à ajouter de la poudre de zinc au milieu: - si le zinc réduit les nitrates encore présents en nitrites, la coloration rose apparaît et la réaction est négative (bactéries sans nitrate réductase). - si au contraire, la teinte du milieu reste inchangée, le stade nitrite a été dépassé donc les bactéries possédant un nitrate réductase très active (Marchal et Bourdon, 1982). Technique: A une culture en bouillon nitraté de 24 à 48h d'incubation à 30°C, on ajoute cinq gouttes de réactif de Griess. Après agitation, la lecture est immédiate. Lecture: - coloration rose ou rouge: nitrates réduits en nitrites (nitrate réductase positive NR+). - milieu restant incolore: ajouter un peu de poudre de zinc (réducteurs des nitrates) ; agitation, inclinaison du tube de culture en position presque à l'horizontale et attendre cinq minutes avant la lecture: - si le milieu devient alors rose ou rouge, il reste des nitrates, donc ces derniers n'ont pas été -

réduits par la bactérie: nitrate réductase négative NR . - si le milieu reste incolore, il ne reste plus de nitrates, les bactéries les ont réduit au-delà du +

stade nitrites: nitrate réductase positive NR .

4. 2. 5. 2. Recherche de l’uréase Principe: Toutes les bactéries hydrolysent l'urée grâce à la réaction suivante:

Seule, une uréase très active aboutit finalement à la réaction :

Le CO2 et le NH3 se combinent en donnant le carbonate d'ammonium:

Carbonate d'ammonium. Le carbonate d'ammonium alcalinise le milieu (Marchal et Bourdon, 1982). Technique: La recherche de l’uréase se fait selon le procédé : Dans les tubes d’urée agar, et à l’aide d’une anse stérile, on ensemence des colonies de la souche test âgée de 24h, on incube à 30°C pendant 24 heures. Lecture: La lecture s’effectue comme suit : - L’uréase est positive s’il y a virage de couleur du jaune vers le rouge violacé ou vers le rose rouge. - L’uréase est dite négative s’il n’y a pas de changement de couleur.

4. 2. 5. 3. Métabolisme protéique 4. 2. 5. 3. 1. Recherche des décarboxylases : Lysine décarboxylase (LDC), Ornithine décarboxylase (ODC) et Arginine dihydrolase (ADH) Principe: Les décarboxylases ou carboxylases, scindent les acides aminés entraînant la formation de l'amine correspondant avec la libération de CO2 suivant la réaction :

Il s'agit d'enzymes induites dont la synthèse est favorisée par un pH acide (pH =3.5-5.5) et des conditions d'anaérobiose (Marchal et al. ,1982). Les décarboxylases sont:

Technique: Le test est réalisé avec le milieu Moeller réparti dans 4 tubes à hémolyse différents: 1- le premier tube constitue le témoin. Il contient essentiellement du glucose en petite quantité et du pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH. 2- les trois autres tubes contiennent en plus du milieu témoins, un des trois acides aminés suivants : Arginine, Lysine ou Ornithine. 3- après ensemencement, 1ml de vaseline stérile est ajouté dans chaque tube et le tout sera incubé à 30°C pendant 24 à 48h.

La lecture: - la réaction est positive lorsque le témoin vire au jaune (acidification du milieu due à l'utilisation du glucose). Les tubes contenant l'acide aminé restent violet (phénomène due à l'alcalinisation). - la réaction est négative lorsque les tubes contenant l'acide aminé et le témoin virent au jaune (acidification). 4. 2. 5. 3. 2. Recherche du tryptophane désaminase (TDA) Principe: La désaminase agit sur le L- tryptophane en donnant l'acide pyruvique. Ce dernier donne avec le perchlorure de fer (Fe Cl3) une coloration brune (Marchal et Bourdon, 1982). Technique : Ensemencer le milieu urée-indole (0.5ml) d'une suspension bactérienne dense. Incuber à 30°C pendant 24 heures. Lecture: Après l’ajouter de quelques gouttes du réactif TDA, si : - Une coloration brun foncé: TDA positive. - Une coloration brun clair (du réactif): TDA négative. 4. 2. 5. 3. 4. Production d’indole Le test indole sert à déterminer si la bactérie produit de l’indole à partir du tryptophane (acide aminé).

À l’aide d’une anse à inoculer stérile, inoculer le milieu de culture liquide indole (voir annexe 2) avec la bactérie à identifier (culture de 18-24heures). Incuber à 26oC pour 48 heures. À la suite de l’incubation, ajouter 3 gouttes du réactif de Kovac (bioMérieux) sous la hotte chimique. Lecture: Après agitation: - Anneau rouge vermillon en surface : indole positif. - Anneau brunâtre (couleur du réactif): indole négatif. 4. 2. 6. Métabolisme des molécules larges 4. 2. 6. 1. Recherche de lécithinase De

nombreux

micro-organismes

peuvent

hydrolyser

les

phospholipides,

et

tout

particulièrement la phosphatidylcholine (ou lécithine). La prolifération de ces microorganismes dans des aliments riches en lipides (lait et dérivés, jaune d'œuf, viandes) est à l'origine d'altérations de ces aliments. La recherche et l'identification des bactéries lipolytiques ont un intérêt tout particulier en microbiologie alimentaire. Principe La lécithine purifiée étant très coûteuse on utilise comme source de lécithine le jaune d'oeuf, jaune d'œuf qui est incorporé dans une gélose ordinaire. La présence d'autres lipides, et la formation de complexes lipoprotéiques, rendent la lecture délicate. Deux protéines peuvent être recherchées :

-La lipoprotéinase: qui dégrade les protéines des complexes lipoprotéiques, ce qui augmenterait la solubilité des phospholipides contenus dans ces complexes. On observe d'un point de vue technique une clarification de la gélose autour de la strie d'ensemencement. Composition du milieu Gélose Trypticase-Soja additionnée de jaune d'œuf stérile dilué au 1/2 en eau physiologique (concentration finale 10% soit 2,5 ml pour 25 ml de milieu). Technique Faire une strie à la surface du milieu, ou éventuellement des touches. Incuber pendant 24 h ou plus à 37°C. La lecture La présence d’éclairage entourant les colonies se traduit par une réaction positive (Présence de lécithine). 4. 2. 6. 2. Recherche de lipase De nombreuses bactéries douées d’activité lipolytique et estérasique. Les graisses sont décomposées en acides gras et glycérol par une enzyme appelée la lipase (figure. 1). Les lipases sont un groupe de divers enzymes qui catalysent l'hydrolyse des liaisons ester dans les triacylglycerides, montrant l'activité sur une grande variété de substrats. Dans les systèmes non aqueux, les lipases catalysent la réaction renversée, c.-à-d. la synthése d’ester et la transesterification, et elles peut également des réactions directes de stéréosélective et régioselective (Ruiz et al., 2002).

Fig. 8: Hydrolyse de graisse par la lipase

La technique Une gélose en boite de Pétri, additionnée de tween 80 à 16ml/l (monoléate de sorbitol), est ensemencée en piqure (ou par spots) à partir d’une culture en milieu solide de la souche à étudier. Incuber 24-48h à 37°C. Après incubation, les colonies de souches lipase (+) sont entourées d’un halo opaque formé suite à la précipitation d’acides gras issus de la lipolyse. 4. 2. 6. 3. Recherche d’α-amylases L'amidon, est un polymère de l'amylose (polymère linéaire des molécules de glucose liées par liaisons 1,4-glycosidique) et de l'amylopectine (polymère embranché des molécules de glucose liées par des liaisons 1.4- et 1,6-glycosidique). Une chaîne se compose de quelques cent à quelques mille unités de glucose qui forment une structure hélicoïdale en laquelle de l'iode peut être emprisonné. Les bactéries qui produisent l'amylase (amyloglucosidase) peuvent hydrolyser l'amidon en polysaccharides plus courts (dextrines) et finalement en disaccharides et monosaccharides (figure 9). (Madigan et al., 1999).

Fig. 9: Hydrolyse d'amidon par l'amylase (Madigan et al., 1999).

La technique 1. Verser 14 ml du milieu agar à l'amidon stérile dans une boîte de Pétri 2. Laisser l'agar solidifier 3. Marquer le plat d'agar à l’amidon avec le nom de la bactérie à inoculer 4. Strier une baisse culture bactérienne sur le plat d'agar à l'amidon 5. Incuber inversé au 30° C pendant 48 heures 6. Quand les colonies sont évidentes, inonder le plat avec la solution de Lugol 7. Laisser l'iode réagir pendant au moins 1 minute 8. Verser outre de l'iode du plat 9. Laver le plat avec l’eau distillé. 4. 2. 6. 4. Recherche des protéases Les enzymes protéolytiques catalysent l'hydrolyse des protéines dans de plus petits fragments peptidiques et acides aminés. Les liaisons sont cassées par l'addition de l'eau entre les groupes adjacents carboxyliques et amines (figure 10).

Fig. 10: Hydrolyse de protéine par la protéase (Madigan et al., 1999).

4. 2. 6. 4. 1. Recherche de la caséinase La caséine est un mélange des phosphoprotéines (un polymère complexe des acides aminés essentiels) trouvées en lait de vache jusqu'au degré environ de 2.5% en poids. Il existe en lait comme sel hydrosoluble de calcium d'une phosphoprotéine et peut être hydrolysée par une série d'enzymes appelées caséinase. (Madigan et al., 1999). La technique Mélanger 1 g d'agar suspendu dans 50 ml d’H2O au lait écrémé en poudre de 5 g suspendu dans 50 ml d’H2O pour faire 100 ml "agar de lait écrémé" ; pH = 7.2. Autoclave et couler les boites. 1. Verser 14 ml de milieu agar au lait écrémé stérile dans une boîte de Pétri 2. Laisser l'agar solidifier 3. Marquer le plat d'agar avec le nom de la bactérie à inoculer

4. Inoculer les plats avec une strie d'inoculum 5. Incuber les plats inversés à30°C pour 48 h 6. Quand les colonies sont évidentes inspecter les plats pour assurer les zones claires autour et au-dessous des colonies caséinase-positives. 4. 2. 6. 4. 2. Recherche de la gélatinase Les bactéries qui ont une activité protéolytiques forte, produisent en général une gélatinase. La gélatinase ou collagénase est une protéase qui hydrolyse le collagène en acides aminés ou en peptides. L'hydrolyse ou la liquéfaction de gélatine est montrée par un test dans lequel l'organisme se développe dans un milieu nutritif a solidifié par la gélatine. La technique Un milieu à la gélatine (annexe 2) est préparé, stériliser à l’autoclave et réparti dans les tubes à essais. Ensemencer le milieu par piqure centrale après refroidissement et incuber pendant 24-48h à 30°C. - Enlever les tubes de gélatine nutritive de l'incubateur et les placer dans le réfrigérateur à 4°C pendant 30 minutes ou dans un bain de glace pendant 3 à 5 minutes. - Notifier si la surface du milieu est liquide ou gel. Si la gélatine nutritive est liquide, ceci indique que la gélatine a été hydrolysée par la bactérie. Si aucune hydrolyse ne se produisait, le milieu demeurera un gel. 4. 2. 6. 5. Recherche de citrate perméase Principe

Le milieu utilisé est le citrate de Simmons (annexe 2), qui ne contient que le citrate comme seule source de carbone. Seules les bactéries possédant une enzyme citrate perméase seront donc capables de se développer sur ce milieu.

L'utilisation de citrate provoque l'alcalinisation du milieu (Marchal et Bourdon, 1982).

Technique La pente du milieu est ensemencée d'une suspension bactérienne, par stries longitudinales au moyen d'une anse. Les tubes sont légèrement fermés. L'incubation se fait à 30°C pendant 3 à 5 jours. L’observation a lieu chaque jour. Lecture: La croissance de la bactérie sur le milieu indique que cette dernière possède du citrate perméase. Cependant s’il n’y a pas de développement, la bactérie ne possède pas cette enzyme. 4. 2. 7. Autres tests 4. 2. 7. 1. Utilisation du mannitol Un tube contient le milieu bouillon du mannitol avec le rouge de phénol (annexe 2) est inoculer avec la souche bactérienne et est incuber pendant 24h à 30°C. Lorsque le milieu vire en jaune, on dit que la bactérie est mannitol positif. 4. 2. 7. 2. Recherche d’hémolysines L’agar de sang (annexe 2) (BA) contient des nutriments généraux et 5% de sang de mouton. Il est utile pour la croissance d’organisme fastidieux et pour la détermination des capacités hémolytique. Certaines bactéries produisent des exoenzymes qui lysent les globules rouges et dégradent l’hémoglobine; les hémolysines. Il existe différents types d’hémolysines. Les Beta hémolysines lyse les globules rouges et dégradent l’hémoglobine complètement. Ceci résulte en une zone d’éclaircissement complète. De tels résultats se disent une hémolyse-β. La technique 1. Faire un striage pour colonies simple de votre inconnu sur une gélose de sang. 2. Incuber à 37oC jusqu'à la prochaine session de labo. 3. Examiner le patron d’hémolyse.

Lecture -Eclairage entoure les colonies : hémolyse β -Pas d’éclairage entoure les colonies : pas d’hémolyse 4. 2. 7. 3. L’antibiogramme Antibiogramme standard par la méthode des disques L’antibiogramme définit in vitro la sensibilité des bactéries pathogènes. On utilise largement la méthode des disques, qui permet de voir le diamètre d’inhibition de croissance autour des disques imprégnés d’antibiotiques. Cette méthode standardisée donne de bons résultats en pratique. Elle peut être complétée par des méthodes plus sophistiquées telles que la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) et des concentrations minimales bactéricides. On définit ainsi un phénotype de résistance naturel ou acquis. (Berche, 2003). 3. 2. 7. 3. 1. Matériel par groupe · Disques de celluloses imprégnées d’antibiotique Les antibiotiques utilisés sont : Pénicilline (Pen) 6μg, kanamycine (K) 30µg, triméthoprime (Tri) 25µg, gentamycine (GEN) 120μg, érythromycine (Ery) 15µg, vancomycine (VA) 5mcg, chloramphénicol (Cmp) 30μg, tétracyclines (TE) 30µg, ampicilline (AM) 10µg, et bacitracine (B) 10µg. Cet antibiogramme est réalisé pour les deux souches 1 et 2 qui ont donné un résultat positif. · Boite de pétri + de gélose · Culture microbienne en suspension · Râteau ou écouvillons 3. 2. 7. 3. 2. Mode opératoire Préparation de l’inoculum : -A partir d’une culture jeune de 18 à 24 h, préparer une suspension de 1 à 2 colonies dans 2 ml de MH et incuber pendant 3 à 5 h -Ajuster l’opacité équivalente à celle produite par le tube 0,5 de la gamme de Mc Farland (concentration de 106 bac/ml ou 106 CFU/ml) Dilution : On réalise une dilution au 1/100.

Ensemencement : · Couler la gélose dans une boite de pétri · Laisser prendre en masse · Prélever 2 ou 3 gouttes de la suspension bactrienne, les déposer à la surface de la gélose les étaler avec un râteau · S’assurer que la surface de la gélose est bien séchée (10 à 15 mn), et y déposer les disques de celluloses imprégnées d’antibiotique correspondant à l’aide des distributeurs ou à la pince en appuyant légèrement · Placer la boite de pétri à basse température +4°C pendant 15 à 30mn afin de permettre aux antibiotiques de diffuser dans la gélose avant que les bactéries ne commencent à se multiplier · Retirer la boites du réfrigérateur et la placer dans l’incubateur, à la température optimale de la croissance du germe à étudier (37 °C) pendent 24 h. 3. 2. 7. 3. 3. Lectures des résultats L’activité de chaque antibiotique sera appréciée, par le diamètre de l’auréole d’inhibition provoqué autour du disque. La culture bactérienne s’arrête lorsqu’elle rencontre une concentration égale à sa CMI. La mesure du diamètre d’inhibition reflète donc la valeur de la CMI de l’antibiotique. 4. 2. 7. 5. Systèmes d’identifications microbiennes commerciales : La galerie Api 20E Cette bande test API-20E (de bioMerieux, Inc.) qui est utilisée pour identifier les bacilles Gram négatifs entériques possède 20 compartiments de test déshydraté séparés. Une suspension bactérienne est utilisée pour réhydrater chacun des puits. Certains des puits auront des changements de couleur résultants des différences de pH. D’autres produisent des sousproduits qui doivent être identifiés avec des réactifs. Un numéro de profil est déterminé d’après la série de tests + et -, qui permet d’identifier l’espèce. Buts de cet exercice: Apprendre comment faire et interpréter la technique de multi test miniaturisé pour l’identification bactérienne. Préparer une suspension de la bactérie dans une éprouvette de saline 1. Inoculer une grosse colonie (diamètre de 2-3mm) de la bactérie dans une solution de 0.85% NaCl, vous assurant que la suspension est homogène sans agrégats de bactéries qui flottent.

Inoculer la bande API 2. En tenant la bande à un léger angle avec le dessus de la table, vous allez maintenant inoculer la suspension bactérienne dans chacun des puits avec une pipette pasteur stérile. 3. Toucher l’extrémité de la pipette sur le côté de la cupule permettant au fluide de pénétrer dans le puits par l’action capillaire tout en appliquant une pression légère sur le bulbe. Ceci devrait prévenir la formation de bulles dans les puits. Chaque puits doit être rempli jusqu’au cou (voir diagramme).

Fig. 11 : Ensemencement de la galerie API 20E.

4. Remplir le tube et la section de la cupule des tubes [CIT], [VP] et [GEL]. 5. Suite à l’inoculation, remplir complètement la section de la cupule des microtubes ADH, LDC, ODC, H2S et URE avec de l’huile minérale. Incuber la bande dans sa chambre 6. Remplir le bas de la chambre avec juste assez d’eau pour remplir les indentations. 7. Placer la bande dans ce réservoir du bas. 8. Placer le dessus de la chambre d’incubation sur le bas et étiquetée là. 9. Placer la bande à 37o C. Interprétation: 1. Ajouter les réactifs appropriés aux compartiments: 1 goutte de réactif de Kovac à l’IND (faire la lecture dans les minutes qui suivent) 1 goutte de réactif de Barritt A et B au VP (une réaction positive peut prendre jusqu'à 10 minutes) 1 goutte de Fe Cl3 au TDA 2. Faire la lecture de tous les autres tests, tel que dans le tableau, sans l’ajout de réactifs. 3. Noter les résultats et comparer les réactions positives avec le tableau de différentiation. Croissance sur milieu King (King A et King B):

Principe: Les milieux King A et King B permettent la différenciation entre les espèces de Pseudomonas par la mise en évidence de leurs pigments spécifiques. La production des pigments est favorisée par la composition du milieu (Marchal et Bourdon, 1982). Technique: Ensemencer un tube de milieu King A et un tube de milieu King B en réalisant des stries médianes à la surface de la pente ; replacer les capsules des tubes sans les revisser. Incuber à 30°C pendant 4 jours. Lecture: King A : ce milieu favorise la production de pyocyanine, pigment permettant l'identification de Pseudomonas aerugenosa. Les cultures typiques sont colorées en bleu-vert. King B: ce milieu favorise la synthèse de la pyoverdine, pigment vert fluorescent produit par Pseudomonas

aerugenosa

et

d’autres

Pseudomonas

(Pseudomonas

fluorescens,

Pseudomonas putida). La pyoverdine se manifeste par une coloration vert fluorescent du milieu de culture.

Composition des milieux de cultures utilisées 1. Bouillon de l’indole -K2HPO4…………………………………………………………………………………3,13g -L- Tryptophane………………………………………………………………….……..1g -NaCl………………………………………………………………………………..…...1g -KH2PO4…………………………………………………………………………......….0,27g -Eau distillée…………………………………………………………………………….200ml pH 7,2 ± 0,2 à 25°C 2. Bouillon De Mannitol -Peptone pancréatique de caséine…………………………………………...………….10g -D-Mannitol…………………………………………………………………..…………5g -NaCl…………………………………………………………………………..………...5g -Rouge de phénol………………………………………………………………………..0.018g -Eau distillé.…………………………………………………………………….……….1000ml pH = 7,2 ± 0,2 à 25°C 3. Bouillon de nitrate -Peptone de caséine…………………………………………………………….......…..5g -Extrait de bœuf……………………………………………………………………..…3g -Nitrate de potassium (KNO3)………………………………………………………....1g -Eau distillé…….……………………………………………………...………..……...1000ml pH 7,2 ± 0,2 à 25°C 4. Bouillon de trypticase de soja -Peptone de caséine (pancréatique)…………………………………………...………..17g -Peptone de soja………………………………………………………………...………3g -NaCl…………………………………………………………………...……………….5g -K2HPO4……………………………………………………………………….………..2.5g -Glucose…………………………………………………………………………………2.5g

pH = 7,3 ± 0,2 à 25°C 5. Bouillon nutritive -Extrait de viande………………………………………………………………………3g -Peptone………………………………………………………………………………...5g -Extrait de levure…………………………………………………………...…………..2g -NaCl…………………………………………………………………………..………..1g -Eau distillée……………………………………………………………………………1000ml pH 7,4 ± 0,2 à 25°C 6. Citrate de Simmons -Magnesium sulfate MgSO4…………………………………………………………….0,2g -Ammonium dihydrogéne phosphate (NH4) H2PO4……………….………………….1g -Phosphate dipotassium K2HPO4……………………………………………………...1g -Citrate de Sodium ou acétate de sodium …………………………………….……….2g -Chlorure de sodium (NaCl)……………………………………………………………5g -Agar……………………………………………………………………………………15g -Bromothymol blue…………………………………………………..…………………0,08g -Eau distillé……………………………………………………………………...……...1000ml pH 6,9 ± 0,2 à 25°C 7. Gélatine nutritive -Gélatine.......................................................................................................................120g -Peptone pancréatique de gélatine................................................................................5g -Extrait de bœuf………………………………………………………………………….3g -Eau distillée………………………………………………………………………….….1000ml pH 7,2 ± 0,2 à 25°C 8. Gélose au lait -Lait écrémer……………………………………………………………..1 g dans 50 ml d’H2O -Gélose nutritive………………………………………………………....5 g dans 50 ml d’H2O pH 7,2 ± 0,2 à 25°C

9. Gélose au sang -Sang du cheval………………………………………….………………………………5ml -Gélose nutritive…………………………………………………………….…………..100ml pH 7,3 ± 0,2 à 25°C 10. Gélose d'amidon -KNO3…………………………………………………………………………….……..0.5g -K2HPO4………………………………………………………………………………...1g -MgSO4. 7H2O………………………………………………………...………………..0.2g -CaCl2………………………………………………………………………...…………0.1g -FeCl3……………………………………………………………………………..……..traces -Amidon de pommes de terre…………………………………………………...……..10g -Agar……………………………………………………………………………….……15g -Eau distillé……………………………………………………………………….……..1000ml pH 7,2 ± 0,2 à 25°C 11. Gélose de Mueller Hinton Biomérieux -Infusion de viande bœuf ………………………………………………….…………...300g -Bio-Case…………………………………………………………………………...…...17,5g -Amidon ……………………………………………………………………...…………1.5g -Agar ……………………………………………………………………….…………...17g -Eau distillé……………………………………………………………………..……….1000ml pH 7,3 ± 0,2 à 25°C 12. Gélose nutritive -Agar…………………………………………………………………………………….15g -Extrait de viande………………………………………………………………………3g -Peptone…………………………………………………………………………………5g -Extrait de levure…………………………………………………………...…………..2g -NaCl……………………………………………………………………………..……..1g -Eau distillée……………………………………………………………………………1000ml

pH 7,4 ± 0,2 à 25°C 13. Gélose PDA -Infusion de pomme de terre ………………………………………………………..….100g -Dextrose ………………………………………………………………………….……20g -Agar-agar ……………………………………………………………………….……..15g -Eau distillée …………………………………………………………………………...1000ml pH 4,5 ± 0,2 à 25°C 14. Milieu Clark et Lubs -Peptone trypsique de viande…………………………………………………………..6g -Glucose…………………………………………………………………………….…...5g -K2HPO4………………………………………………………………………………...5g -Eau distillée……………………………………………...……………………………..1000ml pH 7 ± 0,2 à 25°C 15. Milieu Hugh et Leifson -Extrait de levures……………………………………………………………………....1g -Peptone pancréatique de caséine……………………………………………………...2g -NaCl……………………………………………………………………………….…...5g -K2HPO4………………………………………………………………………….……..0,3g -Agar…………………………………………………………………………………….3g -Bleu de bromothymol (solution aqueuse à 0,2g %)…………………………..………15mL -Eau distillé…………………………………………………………...……………..….1000ml pH 7,1 ± 0,2 à 25°C 16. Milieu de lécithine -Bouillon Trypticase-Soja...........................................................................................10ml -Jaune d’œuf...............................................................................................................1ml -NaCl (5%)..................................................................................................................0.2ml -Agar……………………………………………………………………….……………1.5g -Eau distillé……………………………………………………………………………..100ml

pH 7,6 ± 0,2 à 25°C 17. Milieu minimum M63 -KH2PO4 ....................................................................................................................68.0g -(NH4)2SO4 ................................................................................................................10.0g -FeSO4·7H2O..............................................................................................................2.5mg -Solution de carbohydrate..........................................................................................10.0mL -MgSO4·7H2O............................................................................................................1.0mL -Eau distillée…………………………………………...……………...………………..1000ml pH 7,0 ± 0,2 à 25°C Solution de carbohydrate: -Carbohydrate............................................................................................................20.0g -Eau distillée…………………………………………………...……………...………..1000ml Solution d’MgSO4·7H2O: -MgSO4·7H2O...........................................................................................................24.65g -Eau distillée…………………………………………………...……...………………..1000ml 18. Urée agar -Urée…………………………………………………………………………………….20g -Agar………………………………………………………………………….…………15g -NaCl………………………………………………………………………....………….5g -KH2PO4……………………………………………………………………..………….2g -Peptone……………………………………………………………………….………...1g -Glucose……………………………………………………………………...………….1g -Rouge de phénol…………………………………………………….………………….0,012g -Eau distillé…………...…………………………………………………………..…….1000ml pH 6,8 ± 0,2 à 25°C

Colorants et réactifs utilisées 1. Coloration simple -Bleu de méthylène……………………………………………………………………...2mg -Eau distillé……...………………………………………………………………………1000ml 2. Coloration de Gram 1. Crystal violet……………………………………………………………...………….2,5 g/L 2. Iodine…………………………………………………………………………...…….1g Iodure de potassium (KI)……………………………………………………………….2g Dissoudre l'iodine dans l’iodure de potassiumavant d'ajouter l'eau distillée Eau distillée……………………………………………………………..………………300 ml 3. Alcool éthylique 95%.............................................................................................750 ml Acétone……………………………………………………………………...…………..250 ml 4. Fuchsine basique (solution saturée dans alcool éthylique 95%)………..………….100 ml Eau distillée……………………………………………………………………….…….900 ml 3. Coloration des spores -Vert de Malachite………………………………………………………….…………...5g -Eau distillé…………………………………………………………….………………..100ml 4. Réactif de catalase -Eau oxygénée H2O2…………………….………………………………………………3% 5. Réactif de l’oxydase -Diméthyle-para-phénylène diamine…………...………………………………………1% 6. Réactifs du Barritt (VP) Réactif 1: Alpha- Naphtol, 5% : -Alpha-Naphtol…………………………………………………………………………50g -Ethanol…………………………………………………………………………………1000ml Réactif 2: Hydroxyde de potassium (KOH), 40% : -Hydroxyde de potassium………………………………………………….…………40g

-L'eau distillé…………………………………………………………………..………1000ml 7. Réactif du RM -Le rouge de méthyle……………...…………………………………………………….0.15mg -Eau distillé…...………………………………………………………………………...1000ml 8. Réactif de Kovac -N-amyle ou isoamyle alcool……………………………………………………….…..150ml -Acide hydrochlorique concentré………………………………………………...…….50ml -p-diméthylaminobenzaldéhyde…………………………………………………...…...10g 9. Réactif de Griess : -Réactif 1: -Acide parasulfanilique…………………………………………………………………0,8 g -Acide acétique……………………………………………………..…………………..100ml -Réactif 2: -α - naphtylamine ……………………………………………….……………………...0,5 g -(ou mieux diméthyl-a naphtylamine…………………………………………………..0,6g -Acide acétique 5 N …………………………………………………………………….100ml 10. Réactif de Zoo Bell Poudre de Zinc 11. Réactif du TDA -Chlorure de fer (Fe Cl3)………………………………………………………………..10g -Eau distillé……………………………………………………………………………..100ml