TP Ananou (Réparé)

Compte rendue de microbiologie alimentaire

Réalisé par :

Encadré par :

Nouha Zine Filali

Mrs Samir Ananou

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l’aérobiocontamination : A/Contrôle de l’aérobiocontamination

I/ Objectif : Les contrôles ont pour but de vérifier la conformité de l’environnement de travail aux prescriptions légales pour les locaux de productions aseptiques par la mise en place d’un contrôle systématique.

II/ Technique : On prépare des boites de pétris contenant de la gélose Gélose Trypticase soja (TSA)

Gélose Saboureaud avec chloramphénicol (SA)

N.B : * Gélose Trypticase -soja (TSA) : milieu qui permet le développement des moisissures, levures et bactéries. * Gélose Saboureaud avec chloramphénicol (SA) : milieu sélectif des moisissures et des levures. On ouvre les boites et on les laisse pendant 8h, l’une à l’extérieur et l’autre à l’intérieur pour analyser le nombre de germe qui se trouve dans le milieu

Sédimentation des microorganismes de l’air

Gélose

Incubation à 30°C pendant 72 Heure

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Remarque : On a besoin de 8H pour qu’il y est une sédimentation des microorganismes qui se trouve d’un mètre de distance (car les petites particules présentent une résistance prolonger dans l’air donc une vitesse de

chute lente).

III/Lecture :

Type de microorganismes mis en évidence Flore Totale (Milieu TSA)

Levure + Moisissure (Milieu SA)

Bactéries

Intérieur

Extérieur

58 UFC 70 UFC 60 UFC 76 UFC Moyenne =66 UFC 14 UFC 10 UFC 14 UFC 17 UFC Moyenne =14 UFC Moyenne = 52 UFC

82 UFC 110 UFC Moyenne =96 UFC

38 UFC 77 UFC Moyenne =57 UFC

Moyenne= 39 UFC

IV/Observation :  Milieu intérieur :

Milieu T.S.A : On obtient une valeur moyenne de M= 66 UFC. Milieu S.A : On obtient une valeur moyenne de M=14 UFC.  Milieu extérieur :

Milieu T.S.A : On obtient une valeur moyenne de M=96 UFC. Milieu S.A : On obtient une valeur moyenne de M=57 UFC. Les résultats obtenus nous ont permis de determiner le nombre de bactéries qui se trouvent dans chaque milieu (extérieur et intérieur).  Milieu intérieur :

3

M Bactéries =MFLORE TOTALE –MMOISISSURES +LEVURES M Bactéries =66-14=52 UFC.

 Milieu extérieur :

M Bactéries =MFLORE TOTALE –MMOISISSURES +LEVURES M Bactéries =96-57=39 UFC.

V/ Interprétation :  La flore totale :

Les microorganismes qui se trouvent dans le milieu extérieur est d’une moyenne de m = 96 UFC, par contre ceux qui se trouve dans l’intérieur ont une moyenne de m= 66 UFC. Donc le nombre des microorganismes du milieu extérieur est supérieur que ceux du milieu intérieur, ceci est due aux facteurs suivants : le vent, eau q ui circule apportant avec lui d’autre microorganismes …..

Alors que dans le milieu intérieur le vent est stagne plus, le facteur de nettoyage.  Levures et Moisissures :

Les moisissures et les levures qui se trouvent dans le milieu extérieur ont une moyenne de m = 57UFC, par contre ceux qui se trouve dans l’intérieur ont une moyenne de m= 14 UFC. Donc le nombre des moisissures et des levures du milieu extérieur est supérieur que ceux du milieu intérieur, ceci est due aux même facteurs qui ont été présentés par la flore totale c’est à dire le facteur du vent et du nettoyage.  Les bactéries :

Les bactéries qui se trouvent dans le milieu extérieur est d’une moyenne de m = 52 UFC, par contre ceux qui se trouve dans l’intérieur ont une moyenne de m= 39 UFC.

4

Donc le nombre des bactéries du milieu intérieur est supérieur que ceux du milieu extérieur, ceci est dû au facteur de l’humidité qui est élevé dans le milieu intérieur (à cause de la respiration, robinet…..) alors que le milieu extérieur présente une humidité plus faible selon le climat (notre manipulation s’est

déroulé dans un climat sec donc dans une humidité relativement faible).

Le pourcentage de survie des microorganismes :  Milieu intérieur :

a) Pourcentage des bactéries trouvées: 66

100 %

52

X X=

5∗ 66

X=79% b) Pourcentage des Levures et Moisissures trouvés : 66

100%

14

X X=

∗ 66

X = 21 %  Milieu extérieur :

a) Le pourcentage des bactéries trouvées: 96

100 %

39

X X=

39∗ 96

X =41% b) Le pourcentage des Levures et Moisissures trouvés :

5

96

100%

57

X X=

57∗ 96

X =59 % On a obtenue une estimation de survie pour les Moisissures et les Levures à l’intérieur de 21% alors qu’à l’extérieur, on a une estimation de 59% et pour les

bactéries on a eu 79% à l’intérieur par contre à l’extérieur on a eu 41% . Donc la multiplication et la survie des bactéries sont bien favorisées dans le milieu intérieur grâce à une augmentation d’humidité alors que la multiplication des moisissures et des levures sont favorisées dans le milieu extérieur qui présente une humidité plus faible.

VI / Discutions :  Résultats :

6

 Interprétation :

Dans nos résultats on a trouvé une moyenne pour la flore totale dans le milieu Trypticase soja de m= 66 UFC > 1 donc notre salle présente une contamination supérieur a celle représenté par ces chercheurs.

Référence : http://www.biotech-germande.com/wpcontent/uploads/file_uploads/32/040912.HAP.Chimio.AIR.pdf 

VII/ Conclusion : Il existe un besoin croissant d'un contrôle efficace de l'air dans

toutes les zones où des micro-organismes présents dans l'air sont susceptibles de contaminer ou d'affecter des produits et des procédés industriels. Le contrôle de l'air est donc particulièrement important pour toutes les entreprises qui produisent dans des zones de salles propres avec de l'air filtré. Il existe d’autre technique tel que l e contrôle actif de l'air avec des boîtes de sédimentation ou des géloses contact suppose l'utilisation d'un préleveur d'air pour le contrôle microbiologique afin de prélever physiquement un certain volume d'air prédéterminé et le faire passer sur la gélose.

7

B/ Prélèvement de Surface par écouvillonnage : I/ Objectif :

Prélèvement et analyse des microorganismes qui se trouve sur la surface par écouvillonnage. II/Technique :

 Afin de faciliter le prélèvement, on met l’écouvillon dans un tube contenant 3ml l’eau distillé stérile

Réalisation d’une dilution en série (Jusqu’à une dilution de 10-4)

Etalement de 50µl

Etalement de 50µl

Etalement de 50µl

Etalement de 50µl

Gélose TSA

Incubation pendant une nuit a 37°C

8

Afin d’analyser l’efficacité des désinfectants on essuie la surface soit par :  Eau distillé  Eau de javel (0 jours)  Eau de javel (8 jours)  Alcool (0 jours)  Alcool (8 jours)

III/Lecture :

Type de traitement

Solution mère

10-1

10-2

Témoin Eau distillé Eau de javel (0 jours) Eau de javel (8 jours)  Alcool (0 jours)  Alcool (8 jours)

incomptable 128

9

97

47

28

9

Incomptable

134

10-3

10-4

102

26

2,04.104  UFC/cm2

21

31

4,2.103  UFC/cm2 25,6 UFC/cm2

23

[M]

94 UFC/cm2 5,6 UFC/cm2

44

Signification des termes : Alcool (0jour) : Alcool récent. Alcool (8jour) : Alcool préparer il ya 8 jours. Eau de javel (0 jours) : Eau de javel récente. Eau de javel (8 jours) : Eau de javel préparer il ya 8 jours.

9

2,68.102UFC/cm2

Exemple de convertissement en UFC/cm2 : On sait que UFC/ml =

   ∗

 

é

Le nombre des microorganismes qui se trouvent dans une surface essuyée par l’eau de javel est:



Eau de Javel 0 jours :  

8∗

X =

,5

X = 2,56.103  UFC/ml X = 2,56.103  * 3 UFC/3ml X= 7,68 UFC /3ml X= 7,68 UFC /300cm2 X=

7,68 3

X= 25,6 UFC/cm2 

Eau de Javel 8 jours :  −

7∗

X =

,5

X =9,4.103  UFC/ml X = 9,4.103  * 3 UFC/3ml X= 28,2 UFC /3ml X= 28,2 UFC /300cm2 X=

8, 3

10

X= 94 UFC/cm2 IV/Observation : Dans le Témoin on obtient, une moyenne de m=2,04.104  UFC/cm2. Alors que dans la Solution d’eau distillé, on trouve une moyenne de m= 4,2.10 3UFC/cm2.

Par contre dans la Solution d’eau de Javel (0 jour), on obtient une moyenne de m= 25,6 UFC/cm2. Ainsi que dans la Solution d’eau de Javel (8 jours), on obtient une moyenne de m= 94UFC/cm2. Et pour la Solution d’Alcool 0 jour, on obtient une moyenne de m= 5,6 UFC/cm2. Et Enfin dans la Solution d’Alcool (8 jours), on obtient une moyenne de m= 2,68.102UFC/cm2.

V/ Interprétation : 

Comparaison des valeurs :

Les Microorganismes qui se trouvent dans le Témoin est d’une moyenne de m= 2,04.104  UFC/cm2 alors que dans la solution d’eau distillé est d’une moyenne de m=4,2.10 3UFC/cm2, donc la solution du témoin présente une valeur beaucoup plus grande que l’eau distillé car l’eau ne permet qu’une répartition des microorganismes.

La solution du témoin présente une valeur beaucoup plus grande que celle de l’Alcool et de l’eau de javel car, ces derniers sont des désinfectants qui vont permettre de

tuer et de détruire les Microorganismes. 

Efficacité des désinfectants :

Pourcentage de survie des microorganismes dans l’eau de javel :

11

2,04.104

Le témoin Eau de Javel (0 jour)

25,6 X1 =

100 % X1

5,6∗ ,.

X1=0,12% Le témoin

2,04. 10

100 %

94

X2

Eau de Javel (8 jours) X2 =

9∗ ,.

X2=0,46%

Pourcentage de survie des microorganismes dans l’alcool: 2,04. 10

Le témoin Alcool (0 jour)

5,6 X3 =

100 % X3

5,6∗ ,.

X3=0,027% Le témoin Alcool (8 jours) X4 =

2,04. 10

100 %

2,68.102

X4

,68.∗ ,.

X4=1,31% D’après les résultats obtenus  : L’eau de Javel (0 jour) présente un pourcentage de survie plus petit

que celui représenté par l’eau de Javel (8 jours) Donc l’eau de Javel (0 jour) est plus efficace que l’eau de Javel

12

(8 jours). Même chose pour l’alcool (0 jours) qui a un pourcentage de survie plus petit que l’Alcool (8 jours) L’eau de Javel (0 jour) présente un pourcentage de survie de inferieur

que celui d’Alcool (0 jour), donc l’alcool permet de détruire plus de microorganisme que l’eau de Javel et donc plus efficace.

Cependant L’eau de Javel (8 jours) présente un pourcentage de survie supérieur que celui d’Alcool (8 jours), donc l’eau de Javel (8 jours) permet de détruire plus de microorganisme que l’alcool (8 jours) et donc l’Alcool perd son efficacité plus rapidement que l’eau de Javel.

Recommandation : si on dispose une eau de javel récente et un alcool récent il faut mieux d’utiliser l’alcool récent pour désinfecter la surface, si non l’eau de javel serra plus efficace que l’alcool.

Remarque: Lors du nettoyage d’une surface par l’Alcool ou l’eau de  javel, ils vont permettre des réactions chimiques et des forces mécaniques sur la surface du travail se qui va causer la formation des lésions où il y aura la multiplication des biofilms.

Les 5 étapes du développement d'un biofilm sur une surface dure :

Étape 1 : attachement initial ; Étape 2 : attachement irréversible ;

13

Étape 3 : apparition et « maturation I » du biofilm ; Étape 4 maturation II ; Étape 5 : érosion et dispersion/Détachement. VI/ Discutions : 

Résultats :

14

Référence : http://nosobase.chu-lyon.fr/recommandations/areclin/2001_environnement_ARECLIN.pdf

 Interprétation :

Dans nos résultats on a obtenue une moyenne de 2,4 UFC/cm2 (en témoin) qui est inferieur de 5 présenté dans le premier secteur, donc notre salle est moins contaminée Alors que le 2ème, 3ème et le 4ème secteur présentent un résultat inferieur que notre salle donc ils sont moins contaminée que la notre.

VII/ Conclusion La surface présente un milieu de contamination le plus fréquent soit par contact, soit par sédimentation des microorganismes présents dans l’air Les bactéries ont le pouvoir d’adhérer et de se multiplier sur divers supports inertes tel que le sol, surfaces internes de canalisations d’eau ou de conduits d’air, matériel,

équipements... et peuvent ainsi former un biofilm, qui est facteur clé de la contamination microbiologique de l’environnement et de la contamination des produits alimentaires. Et donc il et bien recommandé de nettoyé la surface de travail par un alcool récent afin d’éliminer une grande charge microbienne et d’éviter toute contamination lors d’une

manipulation.

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C/ Analyse de produits végétaux crus : I/ Objectif : Analyse des Microorganismes qui se trouvent dans les végétaux et en particulier la laitue.

II/ Technique :

Dilution 10-1

On met le morceau de laitue + On découpe0, 4g

9ml d’eau physiologique stérile

de laitue

Dilution en Série 0,1ml

(Jusqu’à l’obtention d’une dilution 10-9)

Etalement de 0,1ml dans chaque boite de pétrie

TSA

MCA

MSA

Incubation à 37°C pendant 24H - 48H

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Signification des termes : T.S.A : milieu Trypticase de soja qui est utilisé pour les Flores mésophiles aérobies totaux (FMAT).

M.C.A : milieu Mc Conkey qui est sélectif pour les Entérobactéries. M.S.A : milieu de Chapman qui est sélectif pour les Staphylocoques. III/ Lecture :

Type de Type de traitement microorganismes 10-1 10-3 mis en évidence

Témoin Solution de lavage (eau) Eau de Javel

FMAT Staphylocoques Entérobactéries FMAT  Staphylocoques Entérobactéries FMAT  Staphylocoques Entérobactéries

34

[M] 10-5

10-7

10-9

en UFC/g

3

9 0

10

3

0 5 0

33

0 10

0

0 5

3 0 3

3. 108 0 1,34.106 1.109 0 3,3.103 3.104 0 5.102

Exemple de convertissement en UFC/g :    ∗

On sait que UFC/ml =

 

é

Le nombre des microorganismes qui se trouvent dans la laitue après son lavage par l’eau de javel : 

Les FMAT :  −

3∗

X =

,

X = 3.10 UFC/ml

17

On a

1ml

1g

X= 3. UFC/g

Donc 

Entérobactéries:

X =

 −

5∗

,

X =5.10  UFC/ml Et on a

1ml

Donc

1g

X= 5.UFC/g

IV/ Observation :  Les FMAT:

Dans le témoin la laitue représente une moyenne en FMAT de m= 3. 108 UFC/g. Dans la solution de lavage (eau) la laitue représente une moyenne en FMAT de m=1.109UFC/g. Dans l’eau de Javel la laitue représente une moyenne en FMAT de m= 3.104 UFC/g.  Staphylocoques :

Dans le témoin, l’eau et l’eau de javel la laitue, ne représente aucune teneur en Staphylocoques c'est-à-dire ils ont une moyenne de m= 0UFC/g.  Les Entérobactéries :

Dans le témoin, la laitue représente une moyenne en entérobactérie de m= 1,34. 106 UFC/g. Dans la solution de lavage (eau), la laitue représente une moyenne de m=3,3.103UFC/g. Dans l’eau de Javel, la laitue représente une moyenne de m= 5.102 UFC/g.

V/ Interprétation : D’après les résultats obtenus  on a:

18

1) Les FMATS : Le nombre de FMAT représenté dans la laitue après le lavage est plus grand que celui représenté par le témoin, donc l’eau permet d’apporter d’autres

microorganismes et la laitue, présente un milieu favorable à leur multiplication Alors que l’eau de javel présente une valeur inferieur à celle qui est représentée par le témoin et le lavage, chose qui est normale car l’eau de javel

est un désinfectant qui va permettre réduire la charge microbienne. 2) Les Staphylocoques : Dans le témoin, l’eau et l’eau de javel, la laitue ne représente aucune teneur en Staphylocoques c'est-à-dire que la laitue n’est pas contaminée par ces derniers. 3) Les Entérobactéries :

Le nombre des Entérobactéries représentés dans la laitue et le témoin est plus grand que celui représenté après le lavage, car les Entérobactéries ont été évacué par l’eau lors du lavage. Alors que l’eau de javel présente une valeur inferieur à celle qui est représentée par le témoin et le lavage, chose qui est normale car l’eau de javel

est un désinfectant qui permet de réduire la charge microbienne. 

Efficacité d’eau de javel  :

a) Pourcentage des FMAT trouvés après un lavage par l’eau de javel : 3.108

100 %

3.104

X X=

3. ∗ 3.

X=0,01% b) Pourcentage d’entérobactérie trouvée après un lavage par l’eau de  javel : 1,34.106 5.102

100 % X

19

X=

5. ∗ ,3.

X=0,03% D’après ces résultats obtenus on constate que l’eau de javel a permis de réduire une grande charge en FMAT par rapport aux entérobactéries Donc les Entérobactéries survivent plus que les FMAT.

Tableau représentatif de la Qualité microbiologique selon les normes Type de Bactéries

Témoin

Solution de lavage (eau) Eau de javel

FMAT Staphylocoques Entérobactéries FMAT Staphylocoques Entérobactéries FMAT Staphylocoques Entérobactéries

Qualité microbiologique Qualité selon Selon les normes le type de traitement Non satisfaisante Non satisfaisante Satisfaisante Non satisfaisante Non satisfaisante Non satisfaisante Satisfaisante Acceptable Satisfaisante Acceptable Satisfaisante Acceptable

 Témoin:

Les FMAT   représentent 3.108 UFC/g> 108 Les Staphylocoques représentent 0 UFC/g< 300 Les Entérobactéries représentent 1,34.106 UFC/g> 104

Non satisfaisante Satisfaisante Non Satisfaisante

Donc la laitue présente une qualité non satisfaisante lorsqu’elle ne subit aucun

traitement. 

Solution de lavage (eau) :

Les FMAT représentent 1.109 UFC/g> 108 Les Staphylocoques représentent 0 UFC/g< 300 Les Entérobactéries représentent 3,3.103 UFC/g