Toxoplasma Gondii - Biologia Molecular

Laboratorio de Parasitología Molecular. El laboratorio se estableció en el IIB-INTECH en el año 2002. Básicamente realizamos estudios de biología molecular y celular de Toxoplasma gondii y Neospora caninum. Ambos son parásitos intracelulares obligados, muy cercanos evolutivamente, pertenecientes al phylum Apicomplexa. Toxoplasma es el agente causal de la toxoplasmosis, una infección animal y humana ampliamente distribuida, con porcentajes de infección que varían desde el 25 al 90% según la región y costumbres. Este protozoo se replica en una enorme variedad de células y órganos, causando encefalitis, neumonía, micoarditis, problemas oculares y defectos en los recién nacidos con infección congénita. En individuos inmunocompetentes con infección adquirida la infección es generalmente asintomática, y el parásito permanece en forma crónica, enquistado en los tejidos, de por vida. Sin embargo, en individuos inmunodeprimidos, tales como portadores de HIV o pacientes con leucemia congénita, la infección puede reactivarse a su forma activa, produciendo encefalitis y cuadros pulmonares, muchas veces letales. La toxoplasmosis es también causa de abortos en ovejas y cabras, con su consecuente pérdidas económicas en la actividad ganadera. Neospora caninum es el agente causal de la neosporosis. Este presenta un ciclo de vida que incluye a los canidos como el hospedador definitivo, y a otros mamíferos, entre ellos los bovinos, como hospedadores intermediarios. La neosporosis presenta un importante impacto en la producción de carne y leche bovina, dado que los animales infectados se ven afectados por los consecuentes abortos, reposición de vientres por eliminación de seropositivos y el intervalo parto-concepción.

Integrantes Directores:

Miembros actuales:

Sergio O. Angel Investigador CONICET Prof. UNSAM sangel () intech.gov.ar

Carolina Dalmasso, Becaria CONICET Verónica Coceres, Becaria CONICET Maria J. Figueras, Becaria CONICET Lis Alomar, Becaria ANPCyT Maximiliano de Napoli, Becario CONICET Alvaro Nieto, Tesinista de Licenciatura, Becario CIC Silvina Bogado, Tesinista de Licenciatura Gustavo Ortiz, Tesinista de Licenciatura Agustina Ganuza, Tec. Univ. Quim.

Maria M. Corvi Investigadora CONICET Prof. UNSAM mcorvi () intech.gov.ar

Líneas de investigación Identificación de proteínas relevantes en la diferenciación de estos parásitos. Un aspecto importante en la patogénesis de la toxoplasmosis es la transición de la forma de taquizoito a la forma de división lenta (o nula) de bradizoito. Si bien se han definido claramente los aspectos morfológicos para ambos estadíos, se sabe muy poco de los mecanismos y señales que disparan dicha conversión. In vitro, la diferenciación de taquizoito a bradizoito puede ser inducida por exposición de los parásitos a estrés, incluyendo el bloqueo de la cadena respiratoria. Nosotros demostramos que la proteína Hsp90 trasloca al núcleo durante la diferenciación a bradizoito y que un inhibidor de la misma, bloquea la diferenciación. También observamos que una chaperona de la familia de las "small heat shock" denominada Hsp28, tiene localización mitocondrial y solo se expresa en el estadio de taquizoito. Nuestros objetivos es determinar el rol biológico de estas proteínas durante la diferenciación.

Mecanismos epigenéticos (histonas y el código de histona) y regulación de la expresión génica de estos parásitos. Un aspecto a destacar durante la diferenciación de T. gondii es que un número grande de genes están sometidos a regulación génica. Del análisis in silico del genoma de T. gondii se pudo comprobar en forma general la existencia de factores de transcripción asociados al complejo transcripcional de pre-inicio. Sin embargo, resulto sorpresivo la falta de factores de transcripción específicas en estos parásitos Resulta paradójico que dado el complejo ciclo de vida de estos organismos, no se encuentren evidencias de factores de transcripción para una regulación fina de la expresión diferencial de genes. Si bien esto podría estar indicando la presencia de factores de transcripción irreconocibles debido a una alta divergencia en su secuencia primaria respecto a los ya conocidos en otras especies, un aspecto importante en la regulación de la transcripción de genes asociados a desarrollo puede estar dado por mecanismos epigeneticos. En T. gondii existen todas las familias de histonas y enzimas intervinientes en el remodelado de la cromatina conocidas en eucariotas superiores. De hecho se observa una patrón de modificaciones postraduccionales de las histonas H4 y H3 de los genes de T. gondii diferencial según el estadio (Saksouk y col., 2005). Nosotros pudimos comprobar que también existe una asociación del tipo de variante de histonas H2As y H2B y la cromatina activa. Nuestro objetivo es determinar la composición del nucleosoma en ambos estadios, elrol de las H2A y H2B variantes en la regulación de la expresión génica e identificación de proteínas asociadas a estas variantes.

Estudio de proteínas relacionadas a la invasión de la célula hospedadora y movimiento de deslizamiento. Los parásitos Apicomplexas emplean un sistema inusual de movimiento denominado deslizamiento. Este incluye una batería de proteínas de membrana plasmática, actina, miosinas, proteínas localizadas en un sistema de membranas interno (IMC), este último localizado a lo largo del parásito, y microtubulos subpeliculares, las cuales se ensamblan para generar el movimiento y la invasión a la célula hospedera. Entre ellas identificamos a la proteína de la familia de la small heat shock denominada Hsp20 que se localiza en el IMC. Nuestro objetivo es el de determinar el rol biológico de esta chaperona.

Importancia de la palmitoilación proteica en el parasito Toxoplasma gondii. La palmitoilación proteica es la adición post-traduccional del ácido graso de 16 carbonos, palmitato, generalmente (aunque no exclusivamente) a un residuo de cisteína mediante una enlace lábil tioester. La palmitoilación aumenta la hidrofobicidad de la proteína modificada, modificando su distribución subcelular o actividad. Dada la importancia de la palmitoilación proteica en otros sistemas celulares y la escasa información de esta modificación post-traduccional en T. gondii, es que proponemos que la palmitoilación proteica jugaría un papel importante en la biología de este parasito. En este proyecto, nuestro objetivo general es el de establecer el papel de la palmitoilación proteica en T. gondii e identificar las proteínas afectadas por esta modificación post-traduccional.

Rol de palmitoil acil-transferasas específicas de T.gondii. Distinto a lo que ocurre con otras formas de lipidación como son la miristoilación y la prenilación, la palmitoilación es una modificación reversible que permite regular ya sea la localización o la actividad de la proteína modificada. Esta modificación post-traduccional se lleva a cabo mediante una familia de enzimas conocidas como palmitoil aciltransferasas. Dado que recientemente hemos detectado en nuestro laboratorio que la palmitoilación proteica es una modificación operante en T. gondii y debido a la poca información sobre las enzimas que la llevan a cabo esta modificación post-traduccional, es que proponemos investigar el papel que juegan estas proteínas en la biología de T. gondii.

A. Taquizoitos de Toxoplasma gondii en movimiento, seguidos por su rastro circular mediante epifluorescencia. B. La incubación con anticuerpos contra proteínas del IMC bloquean su movimiento.

Hsp20-YFP

mCherryFP-α-TubA1

Merge

Estudio de co-localización de las proteínas Hsp20 y tubulina de Toxoplasma gondii en parásitos intracelulares genéticamente modificados para expresarlas asociadas a proteína fluorescente verde (Hsp20-YFP) y a proteína roja (mCherryFP-α-tubulina).

Publicaciones recientes 1. de Miguel N, Braun N, Bepperling A, Kriehuber T, Kastenmüller A, Weinkauf S, Buchner J, Angel SO and Haslbeck M. Structural and Functional Diversity in the Family of Small Heat Shock Proteins from the Parasite Toxoplasma gondii. BBA-Mol Cell Res, en prensa 2. Dalmasso MC, Onyango DO, Naguleswaran A, Sullivan Jr. WJ; Angel SO. Toxoplasma H2A Variants Reveal Novel Insights into Nucleosome Composition and Functions for this Histone Family. J Mol Biol, 392:33-47, 2009 3. de Miguel N, Lebrun M, Heaslip A, Hu K, Beckers CJ, Matrajt M, Dubremetz JF, Angel SO. Toxoplasma gondii Hsp20 is a stripe-arranged chaperone like protein associated with the outer leaflet of the inner membrane complex. Biol Cell,100:479-489, 2008. 4. Kostiuk MA, Corvi MM, Keller BO, Plummer G, Prescher JA, Hangauer MJ, Bertozzi CR, Rajaiah G, Falck JR and Berthiaume LG. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azidopalmitate analogue. FASEB J,22: 721-732, 2008. 5. Sullivan WJ, Naguleswaran A, Angel SO. Histones and histone modifications in protozoan parasites. Cell Microbiol 8 : 1850-1861, 2006. 6. Dalmasso MC, Echeverria PC, Zappia MP, Hellman U, Dubremetz JF Angel SO. Toxoplasma gondii has two lineages of histones 2b (H2B) with different expression profiles. Mol Biochem Parasitol 148:103-107, 2006. 7. Vilas GL, Corvi MM, Plummer GA, Seime A, Lambkin G and Berthiaume LG. Post-translational myristoylation of caspase-activated p21-activated proteinkinase 2 (PAK2) potentiates late apoptotic events. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103: 6542-6547, 2006. 8. de Miguel N, Echeverria PC, Angel SO. Differential Subcellular Localization of Members from Toxoplasma gondii Small Heat Shock Protein (sHsp) Family.Eukaryotic cell 4:1990-1997, 2005. 9. Echeverria, PC, Matrajt M, Harb OS, Zappia MP, Costas MA, Roos DS, Dubremetz JF and Angel SO. Toxoplasma gondii Hsp90 is a potential drug target whose expression and subcellular localization are developmentally regulated. J Mol Biol350: 723-734, 2005. 10. Hu K, Roos DS, Angel SO and Murray JM. Variability and heritability of cell division pathways in Toxoplasma gondii. J Cell Sci 117: 5697-5705, 2004. 11. Bruno S, Duschak VG, Ledesma B, Ferella M, Andersson B, Guarnera EA, Angel SO. Identification and characterization of serine proteinase inhibitors fromNeospora caninum. Mol Biochem Parasitol136:101-107, 2004. 12. Navarro-Lerida I, Corvi MM, Alvarez Barrientos A, Gavilanes F, Berthiaume LG and Rodriguez-Crespo I. Palmitoylation of inducible NOS at Cys3 is required for proper intracellular traffic and nitric oxide synthesis. J.Biol.Chem. 279: 55682-55689, 2004. 13. Clemente M, de Miguel N, Lia V, Matrajt M and Angel SO. Structure analysis of two Toxoplasma gondii and Neospora caninum satellite DNA families and evolution of their common monomeric sequence. J Mol Evol 58:557-567. 14. Corvi MM, Soltys C-L and Berthiaume LG. Regulation of mitochondrial carbamoyl-phosphate synthetase 1 activity by active site fatty acylation. J.Biol.Chem. 276:45704-45712, 2001.

Subsidios 1. 2. 3. 4. 5. 6.

2009 NIAID, 1R01AI083162-01, por 4 años, U$S 461176 2009 ANPCyT, PICT 07-00691, por 3 años, $ 228.936 2009 AM, SC08/006, por 2 años, $18000 2009 AM, SC08/046, por 2 años, $18000 2008 ANPCyT, PICT 06-069, por 2 años, $ 25.000 2007ANPCyT, PICT 05-34415, por 3 años. $ 280.000.

Link: http://www.iib.unsam.edu.ar/web/parasitologia2.php