tincion de hongos

Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

Equipo 8: Alatriste Solano Edgar, Colín Castro Julieta, Cruz Hernández Carlos, Merino González Carlos Alberto

Características tintoriales de los hongos

HONGOS Son heterótrofos (quimioorganotrofos), se alimentan de materia orgánica. Son eucariotas, presentan núcleo diferenciado con membrana bien organizada. Presentan una pared celular formada por polisacáridos, polipéptidos y quitina.

Se tienen hongos pluricelulares y unicelulares La estructura fúngica (pluricelular) consta de un complejo llamado talo o micelio, que a su vez esta constituido por múltiples filamentos o hifas.

Los hongos (levaduras) son microscópicos, poseen forma redonda, estos se reproducen por gemación

Estructura de los Hongos Las hifas son tubos de longitud variable formadas por una pared celular rígida, en la que fluye protoplasma. Las hifas no constan de células, sino de compartimientos

Estructura de la célula fúngica Poseen: Núcleo con doble membrana Nucléolo Mitocondrias Retículo endoplásmico Vacuolas Ribosomas Aparato de Golgi Inclusiones cristalinas (ergosterol)

Pared celular La pared es un exoesqueleto rígido que protege a la célula y condiciona la nutrición absortiva ya que no permite la endocitosis. Algunos hongos unicelulares producen cápsulas constituidas por polisacáridos mucilaginosos con apacidadinmunógena y acción antifagocitaria.

Composición de la pared celular Esta formada por capas de polisacáridos Glucanos (polímeros β-1,6, ramificados de glucosa) Mananos(polímeros α –1,6, ramificados de manosa) Polímeros de glucosamina Proteínas Lípidos (ergosterol) Quitina (polímero β-1,4 de N-acetilglucosamina)

Quitina

Ergosterol H HO

H

Tinciones simples

Safranina Útil para el estudio de cultivos y productos biológicos líquidos. Los elementos fúngicos se tiñen de color rojo intenso, y el resto del campo toma un tono incoloro o rosa pálido.

Rhizopuz sp.

Penicillium sp.

Aspergillussp.

Azul de algodón El azul de lactofenol tiene tres funciones importantes a la hora de observar hongos del tipo mohos obtenidos por aislamiento o de medios inoculados. El fenol destruye la flora acompañante.

El acido láctico conserva las estructuras fungicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior del fúngico generando una película por así llamarlo protectora,

Es útil para realizar el examen directo de cultivos, ya que es una técnica rápida que permite visualizar perfectamente las estructuras fúngicas. El colorante es fuertemente ácido y se usa para la tinción directa de micelio micólico, el cual toma un delicado color azul claro.

Composición: • Alcohol metílico • Azul de algodón acetico • Agua destilada 250 mL • Alcohol al 96% • Xilol

Microsporiumcanis

Paracoccidioides brasiliensis Hongo dimórfico; Se visualiza macroconidia en forma de “timón de barco”

Rhizopus sp

Rhizopusstolonifer

Scedosporiumapiospermum

Anaranjado de Acridina Se utiliza para la detección de bacterias y hongos en muestras clínicas Puede utilizarse un microscopio con accesorios fluorescentes como el de ReichertZetopan. El microscopio ordinario puede equiparse con filtros para filtración fluorescente (BG12, de 4mm de espesor). Se colocan filtros amarillos de modo de barreras filtrantes.

Fundamento: El pigmento se intercala en el ácido nucleico (nativo y desnaturalizado). Con pH neutro, las bacterias, los hongos y el material celular se tiñen de naranja rojizo. Con pH ácido, las bacterias y los hongos se mantienen de color naranja rojizo, pero el material de fondo se tiñe de amarillo verdoso

Composición: Alcohol absoluto Ácido acético Anaranjado de acridina Buffer de fosfatos Cloruro de calcio

Tinción de ascosporas de Sowerbyellarhenana en naranja de acridina

Mucor mucedo.

Candidaalbicans

Tinción con Eritrocina. Útil para la observación de gránulos causados por:

• Nocardia • Madurella grisea • M. mycetomatis Tinción de Eritrocina en M. mycetomatis

Solución de eritrocina. Reactivos utilizados:

• Eritrocina de Grübler 0.20g • Naranja G 1g • Agua destilada 100mL Granos de micetoma por Nocardiasp. Grano teñido con eritocina

Tinciones diferenciales:

Son técnicas que utilizan dos o más colorantes y/o principios activos.

Tinción de Gram Tinción diferencial Se emplea para teñir: Productos biológicos líquidos Exudados de lesiones Macerados de biopsias Todos los hongos son positivos a la coloración de Gram, excepto Cryptococcus neoformans.

El decolorante alcohol acetona disuelve a los lípidos de la pared impidiendo la retención del cristal violeta en los organismos Gram negativos Se forma un complejo: lugol-cristal-violeta-ribonucleato de magnesio Esta técnica se basa en las diferencias en el punto isoeléctrico

Blastomycesbraziliensis

Aspergillus fumigatus

Candidaalbicans

Pityrosporum folliculitis

Histoplasmafarciminosum

Tinción Ziehl-Neelsen (Ácido-Alcohol-Resistentes) Es el procedimiento utilizado para colorear aquellos organismos que son difíciles de colorear con colorantes básicos, porque se muestran impermeables a la coloración El contenido lipídico de estos organismos esta compuesto principalmente por ceras y fosfolípidos que alcanzan hasta un 40 % de su peso seco total

La ácido-alcohol-resistencia es la capacidad de ciertos materiales biológicos para formar complejos con algunos colorantes y que luego de la exposición al alcohol-ácido no ocurre decoloración Se cree que el ácido micólico es responsable de ácidoalcohol-resistencia Util en algunos microorganismos ácido resistentes como N. Asteroides, N. Brasiliensis y otros actinomicetes.

El calentamiento ablanda ceras permitiendo la entrada del colorante

El calentamiento es por emisión de vapores La técnica de Kinyoun permite la tinción sin la necesidad de calentamiento Adición de nigrosina

Rhodococcusequi

Actinomycesisraelii

Técnica de Schiff La tinción PAS (periodicacid-Schiff) es uno de los métodos químicos más empleados en histología.

En la tinción PAS se trata el material con ácido peryódico, que oxida los 1,2-glicoles formándose grupos aldehído en los glucanos y mananos de las paredes celulares de los hongos Con el reactivo de Schiff, los aldehídos reaccionan dando un color rojo luminoso

Los filamentos fúngicos, conidias y esporas aparecen rojos o rosas intensos

El cemento de algunos granos en los micetomas adquiere un color amarillo naranja El citoplasma que es verde en general adquiere un tinte rosa

Permite la detección de hongos en muestras de tejido

Mucor sp.

Candidiasis

Aspergillus sp.

Coccidioides immitis

Tinción de Giemsa y Wright Utilizada para levaduras intracelulares, que generalmente se encuentran dentro de los macrófagos o monocitos Forma un halo alrededor de la pared celular Citoplasma se tiñe de azul celeste Un polo se tiñe de azul oscuro (media luna)

Hystoplasmacapsulatum

Pneumocystisjiroveci

Tinciones especiales

Tinción negativa con tinta china Fundamento: Este método es ideal para observar inclusiones refráctiles que no se tiñen fácilmente, tales como gránulos de azufre, ácido poli-B-hidroxibutirico, esporas o capsulas, debido a que las partículas de carbón empleadas están cargadas negativamente y son repelidas por la carga negativa de la pared y delimitan una silueta mayor que el tamaño real de la bacteria

Esta tinción especial para visualizar a Cryptococcusneoformans La tinta china se emplea en una dilución de 1:2 con agua destilada (suspensión de coloidal de carbón o nigrosina) La técnica consiste en colocar una gota del producto biológico por examinar y una gota de tinta china separados por 3 mm

Tinción con tinta china para observar la cápsula de C. neoformans.

La cápsula aparece como un halo claro y nítido en torno a una levadura redonda, delimitado por las partículas de carbón en suspensión coloidal de la tinta china, exhibiendo un nítido contraste.

Tinción de Esporas Tinción de ascas y ascoposras de todos los hongos, y especialmente útil cuando, se trata de visualizar levaduras en los Hemiascomycetes, ya que con las tinciones habituales es muy difícil distinguir sus formas sexuales. Reactivos Verde de malaquita se tiñe la espora Safranina se tiñe la célula vegetativa Las ascas y ascasporas se tiñen de color verde, en tanto que las levaduras toman coloración roja

Ascosporas de Daldiniaconcentrica

Tinción de Gomori-Grocott (Metenamina de plata) Fundamento: Entre las coloraciones especiales para hongos, la plata-metenaminas de Gomori. La reacción tintorial esta basada en que presencia de acido crómico, los grupos hidroxilo de lo polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos; estos a su vez, reducen el complejo nitrato- plata metenamina produciendo la coloración café a negra, debido de la plata reducida en los lugares de localización de los aldehídos

Imagen histológica, tinción con Gomori-Grocott (tinción con plata) mostrando esférulas en diferentes estados de maduración.

Tinción de Gomori-Grocott Con esta técnica los hongos se tiñen de color negro al igual que una bacterias; la mucina adquiere un color gris oscuro; las partes internas del micelio, rosa oro; el fondo aparece de color verde claro Reactivos Ácido crómico.- Oxidación de grupos hidroxilo de los polisacáridos de pared celular Bisulfito de sodio.- Buffer Metamina-nitrato de plata.- Producción de color café a negro en la pared Cloruro de oro.- Colorante de contraste en la pared Verde brillante.- Colorante de fondo en la preparación

Blanco de carcoflour Fundamento: El calcofloúr es un flourocromo que se une a polisacáridos con los enlaces beta 1-3 y beta 1-4 presentes en polímeros tales como celulosa y la quitina. El colorante fluorece cuando se expone a una fuente de luz ultravioleta de onda corta o capaz de producir la luz azul (longitud de onda 410-450 nm). Es un método de alta sensibilidad para definir claramente los elementos micoticos con microscopio de fluorescencia Reactivos Calcoflour blanco M2R (polysciences) Azul de Evans

Negro de clorazol E Fundamento: Es un colorante que permite visualizar rápidamente y nítidamente las estructuras micoticas uniéndose especialmente a la quitina. Tiene la desventaja de degradarse con la luz, por lo requiere mantenerse en oscuridad. Además debe prepararse mensualmente. Las preparaciones con la muestra deben leerse al mismo día de la realización, ya que el colorante se precipita con el tiempo y al secarse. Clorazol E DMSO KOH al 7%

Helvellalacunosa en L4 C (negro de clorazol)

Procedimientos

Azul algodón-lactofenol (colonias de Hongos) Poner en un portaobjetos limpio sobre una superficie iluminada y transparente o en su defecto sobre una hoja blanca Poner una gota pequeña de azul de algodón lactofenol en el centro del portaobjetos Tomar un fragmento de la colonia mediante una asa Montar la preparación depositando suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos Sellar con esmalte incoloro

Tinción con eritrosina Fijar con alcohol metílico por 10 min Cubrir con eritrosina por 15 min Lavar ligeramente con agua de la llave Hacer pasar rápidamente alcohol al 70 % y se deja secar Pasar por alcohol absoluto durante 5 minutos y dejar secar Poner xilol por 15 min y dejar secar Montar en bálsamo de Canadá

Tinción con azul algodón acético Fijar con alcohol metílico, cubriendo el portaobjetos y se deja evaporar Cubrir la preparación con azul de algodón acético por 20 min, calentando hasta la emisión de vapores Lavar rápidamente con agua Pasar por alcohol al 96 % y secar Pasar por Xilol hasta que transparente la preparación Montar en bálsamo de Canadá

Tinción de ZiehlNeelsen para Actinomyces La preparación se llena con fucsina fenificada a emisión de vapores por 3 minutos Decolorar con alcohol-ácido y se lava con agua Cubrir la preparación con azul de metileno durante 1 min y se deja escurrir Se deja secar y se observa a 10X y 40X

Tinción ZiehlNeelsen modificada La preparación se llena con fucsina fenificada a emisión de vapores por 5 minutos Decolorar con alcohol-ácido y se lava con agua Cubrir la preparación con azul de metileno durante 2 min y se deja escurrir Colocar una gota de nigrosina en el extremo del portaobjetos y se extiende como si fuera un frotis sanguíneo en capa fina, se deja secar y se observa a 10X y 40X

Tinción Gram

Tinción de Wright No es necesario fijar el frotis Coloque el portaobjetos completamente horizontal sobre una superficie adecuada que deje libre la mayoría de sus bordes y cúbralo con el colorante Después de 3 min agregue solución buffer de fosfatos o agua destilada en la misma cantidad que la del colorante, mezcle la solución, aplique una corriente de aire sobre la mezcla mediante una pipeta Después de 5 min enjuague con agua de la llave Deje secar y lea al microscopio en seco débil, seco fuerte y a inmersión

Referencias bibliográficas. Guzman Arenas Roberto, “Micología médica”., Editorial McGraw-Hill, 2ª. Edición; México, 2004. Capitulo 34 pag 299305 RubenLopezMartinez, Micología Médica Procedimiento para el diagnostico de laboratorio, Ed. Trillas, México 2006 Capitulo 10 Pag.149-158 F.J. Baker, Manual de Técnicas de Micología Médica Editorial Acribia, S.A Zaragoza España 1998 pag. 18-20; 4041 Dr. Norman F. Connan; Micología; Editorial Interamericana S.A de C.V 3ra Edición México 1972 pag. 557-569 Lynch, M; Raphael, S. Métodos de Laboratorio. Editorial Interamericana. 2º edición. México. 1987. Tomo II pag. 523-530 MURRAY, G. Microbiología Médica. Edit. El Manual Moderno. 3º edición México D.F. 1997 pag 175-182