Testovi Za Ispitivanje Funkcije Bubrega(3)

Predavanja Iz Klinič Kliničke Hemije

Testovi Testovi Za Ispitiva Ispitivanje nje Funkcije Funkcije Bubrega Prof dr Violeta Dopsaj Farmaceutski fakultet Univerziteta Univerziteta u Beogradu 2009/2010

Dijagnostika Bolesti Bubrega

Najvažnije funkcije bubrega: 1) izlu čivanje organizmu nepotrebnih sastojaka, 2) stvaranje urina 3) regulacija homeostaze homeostaze elektrolita i vode, 4) endokrina funkcija Poremećaj u bilo kom homeostaznom mehanizmu dovodi do oštećenja funkcija bubrega što može dovesti do bolesti bubrega Klasifikacija na akutne i hronične bolesti bubrega na osnovu: anam an amne neze ze i klini kliničke slike laborator laboratorijsk ijskih ih analiza analiza i različitih itih dija dijagn gnos osti tičkih postupaka postupaka (rtg, ultrazv ultrazvuk, uk, biopsija biopsija bubrega, bubrega, itd)   

Dijagnostika Bolesti Bubrega

Najvažnije funkcije bubrega: 1) izlu čivanje organizmu nepotrebnih sastojaka, 2) stvaranje urina 3) regulacija homeostaze homeostaze elektrolita i vode, 4) endokrina funkcija Poremećaj u bilo kom homeostaznom mehanizmu dovodi do oštećenja funkcija bubrega što može dovesti do bolesti bubrega Klasifikacija na akutne i hronične bolesti bubrega na osnovu: anam an amne neze ze i klini kliničke slike laborator laboratorijsk ijskih ih analiza analiza i različitih itih dija dijagn gnos osti tičkih postupaka postupaka (rtg, ultrazv ultrazvuk, uk, biopsija biopsija bubrega, bubrega, itd)   

Sasatav krvi i urina odražava ne samo razne funkcionalne bolesti bubrega nego i razne sistemske bolesti Laboratorijska procena bolesti bubrega:

1. Odreñivanje koncentracije neproteinskih azotnih jedinjenja 2. Odreñivanje stepena glomerularne filtracije 3. Procena kapaciteta sekrecije endogenih i egzogenih jedinjenja 4. Procena kapaciteta reapsopcije vode i elektrolita Opšti laboratorijski "profil bubrega“  

 

Odreñivanje biohemijskih analiza u serumu Ureja, kreatinin, natrijum, kalijum, hloridi, fosfor, ukupan kalcijum, glukoza, mokraćna kiselina, ukupni proteini Kompletna krvna slika sa sedimentacijom Kvalitativ Kvalitativni ni rutinski rutinski pregled pregled urina urina

Urin je uzorak izbora za isključivanje i rano otkrivanje bolesti bubrega

Neproteinska azotna jedinjenja Ureja, kreatinin, kreatin, mokra ćna kiselina, amonijak (+ amino-kiseline)

NPN (non protein nitrogen) n itrogen) termin nastao u ranom stadijumu razvoja kliničke hemije kada je uklanjanje proteina iz uzorka pre izvoñenja analize bilo obavezno (protein-free filtrate) Kvantifikacija neproteinskog azota odreñivala se nakon prevoñenja azota u amonijak, a zatim u Nessler-ovoj Nessler-ovoj reakciji žuto obojenje UREJA

Ureja je glavni metabolički proizvod katabolizma proteina (75% NPN) Nakon sinteze u jetri putem krvi dospeva do bubrega gde se filtrira u glomerulima, 40-70% ureje se reapsorbuje pasivnom difuzijom u tubulima, što zavisi od od brzine protoka urina urina i hidratacije. hidratacije. 10% se izlučuje preko GIT i kože

Krebs-Henseleit ciklus sinteze ureje u jetri iz NH 3 NH4+ + CO2

karbamil-fosfat-sintetaza N-acetil glutaminska kis (koenzim) 2 ATP

KARBAMIL-FOSFAT

ornitin-karbamil transferaza KARBAMIL-FOSFAT + ORNITIN

CITRULIN sintetaza argininćilibarne kiseline

CITRULIN + ASPARAGINSKA KISELINA ARGININ-ĆILIBARNA KISELINA

ARGININ-ĆILIBARNA KISELINA ATP, arginin-sukcinat dehidrogenaza

ARGININ + FUMARNA KISELINA

arginaza ARGININ

UREJA + ORNITIN

ORNITIN + KARBAMIL-FOSFAT

IZOUREJA

UREJA

SUMARNA REAKCIJA

NH3 + iz glutaminske kis

NH3 + HCO3iz asparaginske kis

3 ATP

UREJA + 2 H2O

Ureja, Azotemije

Koncentracija ureje u serumu odre ñena je količinom proteina u ishrani, kataboličkim stanjem organizma, i funkcijom i perfuzijom bubrega BUN (blood urea nitrogen) stari naziv, Urea nitrogen (ispravan naziv) Azotemija – povišena koncentracija ureje u krvi Uremija (uremijski sindrom) – veoma visoke koncentracije ureje u krvi kod bolesti bubrega Prerenalna azotemija izazvana je smanjenim protokom krvi kroz bubrege, manje krvi je u bubrezima, pa se manje ureje filtrira Uzroci: kongestivna srčana insuficijencija, hemoragija, dehidratacija, šok, visokoproteinska ishrana, povećan katabolizam proteina (groznica, stres, terapija kortikosteroidima, GIT hemoragije), i drugi faktori koji značajno smanjuju volumen krvi

Azotemije Postrenalna azotemija nastaje kada postoji obstrukcija za

isticanje urina kroz mokraćnu bešiku ili uretru (nefrolitijaza, prostatizam, tumori genitourinarnog trakta), ili jaka infekcija. Veći porast ureje u serumu od kreatinina zbog pritiska urina na tubul i difuzije preostale ureje iz tubula u krv Snižena koncentracija ureje u krvi u periodu sniženog unosa

proteina ishranom, povećana sinteza proteina (u kasnoj trudnoći i ranom detinjstvu), teška oboljenja jetre

Razlikovanje azotemija

Normalan odnos serumske koncentracije ureje i kreatinina Ureja/Kreatinin indeks = 10:1 do 20:1 Prerenalna azotemija

povišena koncentracja serumske ureje, kreatinin normalan Povišen ureja/kreatinin indeks Postrenalna azotemija

Povišen ureja/kreatinin indeks sa povišenim serumskim kreatininom Snižen ureja/kreatinin indeks kod smanjene sinteze ureje (smanjen unos protena, akutna tubulska nekroza, teška bolest jetre)

Uzroci abnormalne koncentracija ureje u krvi

Uzroci povišene koncentracija ureje u krvi Prerenalni: kongestivna srčana oboljenja, šok, hemoragija, povećan katabolizam proteina, dehidratacija, terapija kortikosteroidima Renalni: Akutne i hronične bubrežne bolesti,

glomerulonefritis

Postrenalni: Obstrukcija u urinarnom traktu

Uzroci snižene koncentracije ureje u krvi Smanjen unos proteina hranom, teška bolest jetre, intenzivno povraćanje i diareja, trudnoća

Odreñivanje Ureje

Serum (najčešće se koristi), urin, plazma Uzeti u obzir uticaj visokoproteinskog unosa proteina hranom (ne koristiti uzorak nakon unošenja hrane) Preporučuje se nehemolizovani uzorak Ureja se razlaže pod uticajem bakterija u urinu, pa se uzorak urina treba čuvati u frižideru, i podesiti pH0,5 mmol/l) i piruvata (>0,9 mmol/l) Adsorbovani kreatinin eluira se alkalnim pikratom 3. Jaffe/kinetička metoda, najviše se koristi u rutini, jeftina, brza

Kinetička Reakcija Na Automatu Mikroprocesor omogućava merenje apsorbancije u toku perioda od 16 do 120 sec Reakcionim vremenom uklonjen uticaj brzih i sporih hromogena Brzi nekreatinski hromogeni reaguju u toku prvih 20 sec od dodavanja reagensa Spori nekreatininski hromogeni reaguju posle 80 sec Vreme od 20-80 sec pripisuje se stvaranju kreatinin kompleksa

α keto kiseline i cefalosorini se ne mogu ukloniti iz reakcije i povećavaju rezultat Nije potrebna deproteinizacija jer u kineti čkoj reakciji proteini kao spori hromogeni ne utiču na rezultat

4. 3,5-dinitrobenzoeva kiselina (DNBA) OHKREATININ + DNBA

KOMPLEKS (PURPURNO ROZE BOJE) NA 560 nm

Suva hemija (refleksiona spektrofotometrija), samo serum Nema interferenata, ali boja nije stabilna kao sa pikratom 5. Kratinin-amidohidrolaza (kratinaza, kreatinin hidrolaza) KREATININ-AMIDOHIDROLAZA KREATININ + H2O

KREATIN CK

KREATIN + ATP

KREATIN-FOSFAT + ADP PIRUVAT-KINAZA ADP + FOSFOENOLPIRUVAT ATP + PIRUVAT LDH + PIRUVAT NADH + H NAD+ + LAKTAT

Samo serum, bez šire primene 6. Kreatinin-iminohidrolaza (kreatinin deaminaza) KREATININ-IMINOHIDROLAZA KREATININ

NH3: GLDH,

N-METILHIDANTOIN + NH3

amonijačnom elektrodom, kolorimetrijski-korigovati za endogeni NH3

Kodak-Ectachem slajd tehnologija (bromfenol plavo na 670nm) Samo serum, treba odrediti serumski NH3 7. Kreatinin-amidohidrolaza KREATININ-AMIDOHIDROLAZA KREATININ + H2O KREATIN KREATININ-AMIDOHIDROLAZA KREATIN + H2O SARKOZIN + UREA SARKOZIN-OKSIDAZA SARKOZIN + O2 GLICIN + FORMALDEHID + H 2O2 PEROKSIDAZA H2O2 + BOJA OKSIDOVANI HROMOFOR + H2O

Druga generacija Kodak sistema (bez iminohidrolaze) Serum, urin 8. HPLC (posle eluacije u Jaffe reakciji ili na 200 nm) 9. HPLC i gasna hromatografija Masena spektrometrija je visoko specifična i referentna-definitivna metoda za kreatinin 17

Za odreñivanje kreatinina može se koristiti Serum, plazma, 7 dana na 4 °C Ne koristiti ikterične i hemolizovane uzorke, smanjuju rezultat Urin (razblaženje do konc. kreatinina od 300 do 600 µmol/L) 2-3 dana na 25 °C, 5 dana na 4 °C Referentne vrednosti

Zbog veće mogućnosti slučajne greške navesti metodu i standardno odstupanje metode (do 15 µmol/L) Primena različitih metoda dovodi do razlika 10-25 µmol/L Serum, Jaffe metod: muškarci 53 - 106 µmol/L; žene 44 - 97 µmol/L Urin/24 h:

muškarci I7.1 – 17.7 mmol/L; žene 5.3 – 15.9 mmol/L

GFR (eng. glomerular filtration rate) Stepen glomerularne filtracije

GFR (eng. glomerular filtration rate) – Stepen glomerularne filtracije predstavlja volumen plazme koja se filtrira u glomerulima u  jedinici vremena Odreñuje se indirektno merenjem ekskrecije supstance u urinu koja se filtrira u glomerulima, u tubulima se ne reapsorbuje i ne sekretuje, tj potpuno se izlučuje urinom GFR = V/t V = Ms/Cs (Ms-masa filtrirane supstance, Cs-koncentracija u serumu) Ms = Us x Vu (Vu-volumen urina, Us-koncentracija u urinu) GFR (mL/min) =Curin x Vurin Cserum x t

t – vreme sakupljanja urina (min)

KLIRENS TESTOVI

(eng: clearance-čišćenje) Klirens supstance predstavlja volumen plazme iz koje je supstanca uklonjena u jedinici vremena Odreñivanje klirensa supstance predstavlja merenje ekskrecije supstance u urinu koja se kompletno filtrira iz krvi u glomerulima, ne sekretuje se, ne reapsorbuje i ne metabolizuje u tubulima bubrega Ove osobine imaju inulin, ureja, kreatinin Klirens testovi služe za procenu GFR Klirens inulina

Inulin je polisaharid MM 51kDa, nije fiziološka supstanca (nema ga normalno u krvi) Inulin se potpuno filtrira u glomerulima a ne reapsorbije u tubulima

KLIRENS INULINA I UREJE

25 mL 10% inulina se aplikuje se intravenski a zatim se nastavlja davanje 500 mL 1.5% rastvora, brzinom 4 mL/min Klirens inulina zavisi samo od volumena glomerularnog filtrata (120-130 mL/min) p-aminohipurat se koristio za odreñivanje glomerularne filtracije i tubularne sekrecije Korišćenje ovih supstanci za klirens je skupo, dugo traje, teško za aplikaciju, više se ne koriste Klirens ureje

Prvi klirens test koji se danas se više ne koristi zbog osobine ureje da se oko 40% reapsorbuje u tubulima Danas se koristi samo klirens kreatinina

KLIRENS KREATININA

Serumski kreatinin i ekskrecija u urinu funkcija su miši ćne mase i ne zavise od unosa proteina i elektrolita Kreatinin se ne reapsorbuje u tubulima, ali se 7-10 % sekretuje u tubulima, što je veoma važno kada je < 10 mL/min, jer je vrednost lažno uvećana Koncentracija kreatinina u serumu značajno raste tek kada je glomerularna filtracija na 50% normalne vrednosti

Koncentracija kreatinina u krvi je indirektno proporcionalna klirensu kreatinina, tj koncentracija kreatinina u krvi raste dok GFR opada kod bolesti bubrega Ref 

23

KLIRENS KREATININA

Izračunavanje klirensa kreatinina je standardni metod za odreñivanje GFR Klirens Cr =

koncentracija kreatinina (urin) x zapremina urina (mL/24h) x 1.73 koncentracija kreatina (serum) x t (1440 min/24h) A

1.73 – prosečna površina tela (m 2) A – aktuelna površina tela izračunata iz visine i težine log A = (0.425 log W) + (0.725 log H) – 2.144 W-telesna masa u kg, H-telesna visina u cm (Izračunavanje iz nomograma za odre ñivanje površine tela)

Zbog načina izvoñenja ukupan koeficijent varijacije 10% (idealno) jer se 2 puta odreñuje kreatinin (serum+urin) i merenja diureze, ali može biti veći 2-3 puta kod nemotivisanih pacijenata CV iz dana u dan za ponavljajuća odreñivanja čak 25%

Klirens Kreatinina: interferencije Klirens kreatinina pod uticajem je različitih bioloških i

analitičkih faktora (analitički postupak, tubularna sekrecija kreatinina, mišićna masa, sakupljanje urina, lipemija, ikterus, hemoliza itd) Lekovi koji interferiraju sa tubularnom sekrecijom kreatinina:

salicilati, cimetidin, trimetoprim, spirinolakton, amilorid (klirens kreatinina je lažno nizak a GFR ostaje normalna) Supstance koje lažno povećavaju serumski kreatinin (do 20%): glukoza,

askorbinska kiselina, mokraćna kiselina, acetoacetat, cefalosporini Kreatinin klirens se smanjuje sa godinama (6.5 mL/min za svaku dekadu života, posle 20-god) Referentne vrednosti za klirens kreatinina

Muškarci: 97 – 137 mL/min (na 1.73 m2) Žene: 88 - 128 mL/min (na 1.73 m2)

Kako prevazići greške u odreñivanju klirensa kreatinina? Više od 25 formula uključilo je kreatinin u serumu, telesnu masu, pol, starost i rasu u izračunavanje klirensa 1. Cockroft–Gaultova formula Predikcija klirensa kreatinina za odrasle

Klirens kreatinina (mL/min) = 140 – starost (godine) x telesna masa (kg) 0.814 x Ckreatinin (serum) (µmol/L) Za žene korekcioni faktor 0.85 (15% manja TM u proseku) Od velike važnosti zbog doziranja lekova (na pr aminoglikozidi)

eGFR (eng, estimated glomerular filtration rate) 2. MDRD formula (Modification of Diet in Renal Disease) GFR(mL/min/1.73m2)=186 x x (kreatinin serum (µmol/L) x 0.011312)-1.154 x (godine života)-0.203 x 0.742 (za žene) i x 1.212 (za crnu rasu) Formula se aplikuje na računar i izračunava automatski iz kreatinina u serumu i godina života pacijenta Rezultati se izražavaju kao:

eGFR60 mL/min/1.73m2 Vrednosti eGFR ispod 60 mL/min upućuje na sakupljanje 24h urina i standardno odreñivanje klirensa kreatinina 5 stadijuma hronične bubrežne insuficijencije:

1.GFR>90 ml/min; 2.GFR izmeñu 60-89 ml/min; 3.GFR izmeñu 30-50 ml/min; 4.GFR izmeñu 15-29 ml/min; i 5.GFR 420 µmol/L, žene > 360 µmol/L Povećanje koncentracije dovodi do taloženja slobodne MK ili njenih soli: - u zglobovima (urički artritis, giht) - u bubrezima (urički bubreg) - obrazovanje konkremenata Uzroci za pojavu hiperurikemije: - povećana biosinteza mokraćne kiseline - smanjeno izlučivanje mokraćne kiseline putem bubrega

Izlučivanje mokraćne kiseline

Sekundarna hiperurikemija Smanjeno renalno izlučivanje mokraćne kiseline

1. Hronične bolesti bubrega - poremećena tubularna sekrecija mokra ćne kiseline 2. Acidoza (laktatna, ketoacidoza) - mlečna kiselina i ketokiseline kompetiraju sa mokra ćnom kiselinom za transportni sistem za izlučivanje mokraćne kiseline u tubulima 3. Povećana koncentracija alkohola u krvi – povećava se koncentracija laktata 4. Uticaj lekova: diuretici (tiazid, furosemid), salicilna kiselina, tuberkulostatici (pirazinamid, izonijazid) - inhibiraju renalno izlučivanje mokraćne kiseline 5. Trovanja (olovo, berilijum)

PROTEINURIJE – proteini u urinu

Podela na osnovu mehanizma koji dovode do pozitivnog nalaza Funkcionalne Proteinurije

fizičko vežbanje trudnoća ortostatska proteinurija (15-20 % zdravih muškaraca) Organske proteinurije udružene sa drugim bolestima i bolestima bubrega • • •

Glomerulske proteinurije: > 3 g/ 24 h

Nefrotski sindrom, uglavnom albumin u urinu i hipoalbuminemija Tubulske proteinurije (1 – 3 g/24 h)

β2-, α1-, mikroglobulin

Kvantitativno ispitivanje propustljivosti glomerulske membrane Molekuli velike MM ne prolaze kroz glomerulski fileter,dok se molekuli male MM slobodno filtriraju u glomerulima a zatim reapsorbuju i katabolizuju u tubulskim ćelijama Pojava značajne količine proteina u urinu ima veliki kini čki značaj i ukazuje na renalno oboljenje Klasifikacija proteinurija na: glomerulske  tubulske   ‫״‬overflow‫( ״‬Bence-Jones proteini, mioglobinurija) – filtracija velike količine proteina male MM koji se poja čano stvaraju zbog patološkog procesa ne mogu se reapsorbovati zbog ograni čenog kapaciteta reapsorpcije u tubulima

Tamm-horsfall protein je mukoprotein velike MM, sekretuje se u distalnim tubulima i sabirnim cevčicama, izlučuje se 40 mg/24h

Prerenalne Proteinurije

• Groznica i toksična stanja (najčešća, jednostavne etiologije) • Venska kongestija kod oboljenja srca (najčešće zbog intraabdominalne kompresije renalnih vena) • Renalna hipoksija kod dehidratacije, šoka, teške acidoze, akutne dekompenzacije srca, jake anemije • Smanjen protok krvi kroz bubrege što dovodi do hipoksičnih renalnih promena i tubulske nekroze bubrega • Hipertenzija (umerena i jaka hronična hipertenzija, maligna hipertenzija, eklampsija) • Miksedem • Bence - Jones proteini

Bence-jones Proteinuruja

Paraproteini koji nastaju usled greške u sintezi lakih i teških lanaca imunoglobulina, male MM, izlučuju se urinom i uz normalnu glomerularnu filtraciju, kao "overflow" zbog pojačane sinteze Paraproteinemije se javljaju kod: 1. Multiplog mijeloma 2. Krio i makro - globulinemija 3. Benigne monoklonske gamapatije (benigna proliferacija B limfocita) Prisustvo BJ proteina u urinu, koji su laki lanci paraproteina MM 22 kDa, indikacija su prisustva mijeloma (u oko 20% slučajeva) Ekskrecija BJ proteina (nekoliko grama dnevno) može dovesti do degeneracije tubularnih ćelija zbog reapsorpcije velike količine proteina, i nastanka mijelomskog bubrega i nefrotskog sindroma

Kvalitativni testovi za dokazivanje prisustva BJ proteina u urinu obuhvataju klasični test zagrevanja i Bradshaw test Pozitivan kvalitativan test osnov je za izvoñenje elektroforeze proteina iz koncentrovanog urina i imunofiksacije Kvantifikacija ekskrecije BJ proteina radi se samo kod pacijenata kod kojih je dokazano prisustvo lakih lanaca, tj kod multiplog mijeloma Renalne Proteinurije

• Primarna oboljenja bubrega • Glomerulonefritis • Nefrotski sindrom, primarni i sekundarni • Destrukcija renalnog parenhima: tumor, infekcija, infarkt Postrenalne proteinurije - proteini se pojavljuju urinu nakon što urin proñe

bubrege, često udružene sa hematurijom • Infekcije bubrežne karlice ili uretera • Cistitis • Uretritis ili prostatistis

Ispitivanje proteinurija

Pozitivan nalaz proteina iz prvog jutarnjeg urina dobijen test trakama potvrñuje se testom sa sulfosalicilnom kiselinom Nakon potvrñenih pozitivnih proteina u urinu (kvalitativan test) radi se kvantifikacija proteina u urinu odreñivanjem proteina iz 24h urina ili indeks proteini/kreatinin iz jutarnjeg urina (odrediti i ukupne proteine u serumu) Pre daljeg ispitivanja funkcije bubrega treba isključiti: ektrarenalne uzroke proteinurije (groznica, povišena tel. temp., jako fizičko vežbanje) ortostatsku proteinuriju Proteinurija dokazana kvantitativnim testom indikacija je za ultrazvuk bubrega i opšte biohemijske testove za ispitivanje renalne funkcije 



Ukoliko su rezultati normalni, a proteinurija je manja od 0.5 g/24h nema potrebe za dalje isitivanje, pacijent se dalje samo prati Proteinurija veća od 0.5 g/24h uz abnormalne rezultate biohemijskih testova zahteva dalje ispitivanje (odrediti tip proteinurije) Tip proteinurije može se odrediti elektroforezom iz koncentrovanog uzorka urina: • Tubulska proteinurija ima dominantno proteine male MM koji su filtrirani ali se ne mogu reapsorbovati • Paraproteini i BJ proteini • Glomerulska proteinurija Proteinurija veća od 2 g/24h je uvek patološka i najčešće ukazuje na glomerulsko oboljenje

Biopsija bubraga je zlatni standard

Ispitivanje funkcije tubula Reñe se izvode od testova za ispitivanje funkcije glomerula

Pojava glukozurije sa normalnom koncentracijom glukoze u krvi kod: • Renalne glukozurije (izolovano oštećenje proksimalnih tubula) • Fankonijev sindrom (nasledno generalizovano oštećenje tubula) Test reapsorpcije bikarbonata u proksimalnim tubulima (kod sumnje na proksimalnu renalnu tubularnu acidozu) Test žeñi za ispitivanje distalnih tubula (sposobnost koncentrovanja urina) Test acidifikacije (distalna renalna tubularna acidoza) Aminoacidurija (hromatografija)

Test koncentrisanja urina-test že ñi Za ispitivanje sposobnosti distalnih tubula da koncentrišu urin

15 sati pre testa pacijent relativno miruje i ne unosi tečnost,  jede suvu hranu bez svežeg voća i povrća Ujutru, sakupljaju se 3 uzorka urina na svakih sat vremena U uslovima dehidratacije kod zdravih, maksimalna je sekrecija ADH, osmolalnost urina je 3x veća od osmolalnosti plazme (286 mOsm/kg) Bar u jednom uzorku urina kod zdravih relativna gustina u mora biti ≥1.025 (850 mOsm/kg) Kod smanjene renalne funkcije 5.8 2. pH krvi normalan Oralno davanje 0.1 g/kg TM NH4Cl Merenje pH urina na sat vremena 4-8h (na pH-metru):

Ako je pH > 5.4 u svim odreñivanjima

Dg: Tip1 RTA