Test Presencia-Ausencia para Indicadores de Contaminacion Fecall PDF

 

  UNIVERSIDAD NACIONAL “PEDRO RUIZ GALLO”  

Facultad de Ciencias Biológicas ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÒGICAS Departamento Académico de Biología

Escuela Profesional: Ciencias Biológicas

Asignatura: Microbiología Acuática

Integrantes: -  Moreno Tafur Carlos -  Sandoval Flores José -  Diaz Valdera Alex -  Infante Requejo Cesar

Semestre: 2020-I

Tarea: Test Presencia-Ausencia para indicadores de contaminación fecal  

 – 

Lambayeque  Septiembre 2020

 

INDICE I.  Introducción...................................................................................................... ......................................................................................................................... ................... 3  II.  Objetivos .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. 3  2.1. 

Objetivo general .......................................................................................................... .......................................................................................................... 3 

2.2. Objetivos específicos .......................................................................... ........................................................................................................ .............................. 3  III.  Fundamento teórico ............................................................................................................ ............................................................................................................ 3  IV.  Materiales y Métodos .............................................................. .......................................................................................................... ............................................ 4  4.1. 

Materiales............................................................................................................. ..................................................................................................................... ........ 4 

4.2. 

Metodología ................................................................................................................. ................................................................................................................. 5 

4.2.1.  Prueba Presuntiva para coliformes totales .............................. ............................................................... ................................. 5  4.2.2.  Prueba confirmativa para coliformes totales............................................................ 5  4.2.3. 

Prueba para coliformes termotolerantes................................................................... ................................................................... 6 

4.2.4. 

Prueba presuntiva para  Enteroc  Enterococcus occus ....................................................................... ...................................................................... 7 

V.  Resultados e interpretación ....... ............................................................................. ......................................................................................... ................... 9  5.1.  Resultados ............................................................................................................................ ............................................................................................................................ 9  5.2.  Interpretación .......................................................................... ...................................................................................................................... ............................................ 9  VI.  Conclusiones ...................................................................................................................... 10  VII. Recomendaciones .............................................................................................................. 10  VIII. Referencias bibliográficas ........ .............................................................................. ....................................................................................... ................. 10  IX.  Anexos ............................................................... ................................................................................................................................ ................................................................. 11  9.1. 

En que aspectos se diferencia este método con el de NMP .................................... 11 

9.2.¿Qué características observa en el video cuando los resultados de P-A son positivos?   12  9.3. 

¿Cuáles son las ventajas del método? ............................ ...................................................................... .......................................... 12 

 

I. 

Introducción El aumento del uso del agua para diferentes fines y el crecimiento de la población a nivel mundial han contribuido al incremento de los niveles de contaminación de los sistemas acuáticos. La contaminación de estos ecosistemas es una problemática que se presenta en la actualidad, debido al constante vertimiento de desechos domésticos e industriales que constituyen una fuente de deterioro del medio ambiente. El control de la calidad microbiológica del agua de consumo y de vertido, requiere de análisis dirigidos a determinar la presencia de microorganismos patógenos. La alternativa para realizar un control fiable, económico y rápido de la calidad microbiológica del agua es el uso de indicadores de contaminación fecal. Entre los indicadores de contaminación fecal más utilizados se encuentran los coliformes totales y termotolerantes,  Escherichia coli  y enterococos. El método de presencia-ausencia, es una simplificación del test de NMP y  puede ser usado como base cualitativa de otros indicadores: clostridios, Pseudomonas, coliformes termotolerantes, termotolerantes, debido a que el test de NMP es usado como base cualitativa, además para el caso de coliformes consta de una fase presuntiva donde se siembran 100 ml de muestra de caldo P/A (triple concentrado). Luego de la incubación a 35°C por 24 a 48 horas, las condiciones de acidez por fermentación de la lactosa dan un color amarillo distintivo y por agitación el gas produce espuma. El método de Presencia-Ausencia de coliformes es cualitativo y utiliza mayor volumen de muestra, característica que lo diferencia del método del NMP

II. 

Objetivos 2.1. 

Objetivo general   Determinar la presencia o ausencia de coliformes totales, termotolerantes y

•

enterococos de aguas de consumo humano.

2.2. 

Objetivos específicos   Aprender a utilizar la técnica del test de presencia o Ausencia

•

III. 

Fundamento teórico Una de las formas más sensible y específicas de asegurar la calidad higiénica del agua para consumo humano es determinando los organismos indicadores de contaminación fecal. El principal indicador es  Escherichia coli  y las bacterias coliformes termotolerantes. Sin embargo, para realizar una identificación completa de  E. coli  se requiere de tiempo, diversos medios de cultivo y  principalmente equipo especializado además de un costo relativamente elevado, lo cual resulta muy complicado o económicamente inaccesible para un uso rutinario en laboratorios pequeños pequeños (Méndez, 2004). Para coliformes, el método P/A es el mejor en cuanto a sensibilidad (escasez de falsos negativos con respecto al total de positivos) positi vos) estando muy por encima de los dos medios más universales. Otras de las bacterias utilizadas como indicadoras de contaminación fecal son aquellas del género  Enterococcus   las cuales se encuentran presentes en heces de humanos y animales. Estas bacterias son más

 

 persistentes en el ambiente que E. coli y los coliformes termotolerantes, por lo que  pueden ser utilizados como buenos indicadores de la calidad microbiológica de agua para consumo humano (Microkit, 2019). El tiempo extenso que es requerido para realizar los métodos de detección de enterococos y coliformes en agua agua como en los análisis del Número Más Probable (NMP) y Filtración de Membrana (FM)) los cuales eran tediosos en su manipulación (9 tubos la primera, aparato de filtración la segunda) y los resultados obtenidos en Coliformes implicaban un alto porcentaje de resultados falsamente negativos, esto ha impulsado al desarrollo de pruebas rápidas, uno de estos métodos está basado en el uso de compuestos cromogénicos que son adicionados a medios de cultivo convencionales. Las sustancias cromogénicas son modificadas por enzimas o metabolitos bacterianos y después de esta modificación se da un cambio de color o fluorescencia perceptible. Estos métodos, llamados de presencia-ausencia (P-A), poseen substratos enzimáticos específicos que permiten identificar la bacteria que se busca. Para la determinación de enterococos se ha desarrollado una prueba presencia-ausencia que utiliza un substrato indicador el cual fluorece cuando es metabolizado por los enterococos, además esta prueba es altamente sensible, específica y fácilmente detectable con lámparas de luz ultravioleta. La ausencia o presencia de los coliformes y enterococos en el agua define su potabilidad. Al ser organismos indicadores de contaminación fecal. (Ortiz, 2001) Una de las ventajas del método de Presencia/Ausencia, es su mayor sensibilidad ya que el porcentaje de falsos negativos se reduce considerablemente, además el método es el muy cómodo de inocular y más simple de interpretar por lo que no necesita de mucha infraestructura y equipo de laboratorio capacitado para su aplicación y además se evita una cantidad de pasos que pueden hacer más tediosos los trabajos de identificación. Algunas de las limitaciones en el uso de este método es la poca especificidad ya que si el resultado es   positivo se debe confirmar aislando en placa o identificando colonias aisladas. Otra de las limitaciones es la estabilidad del medio P-A la cual puede ser de algunos cuantos meses (Carrillo y Lozano, 2008).

IV. 

Materiales y Métodos 4.1. 

Materiales   Muestra de agua de pozo   Un frasco con 25 ml de medio P-A triple concentrado con campana de

• •

Durham y tapa rosca   Un tubo de 150 x 15 nm con caldo verde brillante bilis con campana de Durham

•

  Un tubo de 150 x 15 nm con caldo EC con campana de Durham   Un tubo de 150 x 15 nm con caldo enterococo enterococo   Probeta de 100 ml esterilizada

•

• •

  Pipeta de 10 y 1 ml   Marcador de vidrio

•

•

 

4.2. 

Metodología 4.2.1.  Prueba Presuntiva para coliformes totales •

  Medir 75 ml de la muestra de agua de pozo, llevar al frasco con medio P-A triple concentrado. concentrado.

•

  Homogenizar, tapar e incubar a 35°C durante 24 a 48 horas en

•

  Evaluar el crecimiento y producción de gas.

aerobiosis.

Presencia de turbidez y espuma

4.2.2.  Prueba confirmativa para coliformes totales •

  Sembrar 1 a 3 asadas en un tubo con caldo verde brillante bilis, con el inoculo procedente de la siembra del caldo P-A.

•

  Se procedió a incubar a 35°C por 48 horas ± 3 en la estufa.

 

 

Presencia de turbidez y gas

4.2.3.  Prueba para coliformes termotolerantes •

  Del caldo P-A se sembró 1 a 3 asadas en un tubo con caldo EC

•

  Se incubo a 44,5°C por 24 horas en Baño de agua

 

 

4.2.4.  Prueba presuntiva para  Enteroco  Enterococcus ccus  •

  Del caldo P-A, se siembra 1-3 asadas en caldo enterococo

•

  Se incubo por 24 horas a 35°C

•

  Para confirmar la presencia de enterococos se debe de sembrar en agar enterococo, enterococo, siendo incubado a 35°C 35°C por 24 horas en la estufa y luego observar microscópicamente después de la incubación.

 

 

Presencia de colonias con  brillo metálico ( Enterococcus  Enterococcus )  –   Lactosa (-)

 

V. 

Resultados e interpretación 5.1. 

Resultados Al culminar la presente práctica se cumplió con los objetivos los cuales eran aprender a utilizar la técnica del test de presencia-ausencia y determinar la  presencia o ausencia de coliformes totales, termotolerantes termotolerantes y enterococos enterococos de aguas de consumo humano, a continuación, se mostrará lo siguientes resultados obtenidos: CRECIMIENTO

Frasco con medio

TURBIDEZ

POSITIVO

POSITIVO

P-A

PRESENCIA DE

VIRAJE

GAS

COLOR

POSITIVO

POSITIVO

(Presencia

de

DE

(color lila claro)

espuma) Caldo verde  brillante bilis

POSITIVO

POSITIVO

POSITIVOS

NEGATIVO

Caldo EC

POSITIVO

POSITIVO (con

POSITIVOS

 NEGATIVO  NEGATI VO

sedimento en el

(burbujas de gas)

fondo) Agar ENDO

POSITIVO

(Cocos  NEGATI  NEGATIVO VO

POSITIVO

POSITIVO

Gram +; Catalasa (+),

(Color

disposición

colonias

en

cadenas cortas de 2 y

con

 brillo metalico)

4)

5.2. 

de

Interpretación La presencia de gas, turbidez y viraje de color en el medio P-A, indica que existen coliformes, ya que estos son fermentadores fermentadores de lactosa produciendo estas características al medio. Por otro lado, la l a presencia de turbidez y gas en el caldo verde brillante bilis y caldo EC, indica la presenc presencia ia de coliformes.

 

La presencia de gas y brillo metálico en la placa con agar ENDO, indican la  presencia de de Enterococcus, presentando colonias colonias grandes grandes con pequeños pequeños bordes irregulares, siendo lactosa negativos.

VI. 

Conclusiones La presencia de gas, turbidez y viraje de color en los medios indican que existe coliformes en ese medio y según los requisitos de calidad de agua apta para el consumo humano establecidos en el Reglamento de la Calidad del Agua para el Consumo Humano DS N° 031-2010-SA, de la Dirección General de Salud Ambiental, Ministerio de Salud Lima  –  Perú  Perú, en el Artículo 60° Parámetros Microbiológicos y Otros Microorganismos, indica que toda agua destinada para el consumo humano, como se indica en el Anexo I, debe estar extenta de: Bacterias coliformes totales y termotolerantess y Eschirichia coli, siendo no aptas para el consumo humano termotolerante

VII.  Recomendaciones Siendo estudiadas estas aguas y al no ser apta para el consumo humano, se debe hervir  previamente o desinfectada desinfectada con bajas concentracion concentraciones es de cloro antes antes de ser ser utilizadas  para su consumo. consumo.

VIII.  Referencias bibliográficas Carrillo, E. y Lozano, A. (2008). Validación del Método de Detección de Coliformes Totales y Fecales en Agua Potable Utilizando Agar Chromocult . [Tesis de pregrado, Pontificia Universidad Javeriana].

https://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis203.pdf Laboratorios

Microkit

(2019)

Medios

de

Cultivo.

https://www.medioscultivo.com/ficokit-cianokit-mycokit/ Méndez, R. (2004).  Desarrollo y Validación de una Prueba de Fácil Aplicación Apli cación  para Determinación de Enterococos en Agua de Consumo Humano. [Tesis

de pregrado, Universidad de San Carlos de Guatemala]. https://bibliotecaGuatemala]. https://bibliotecafarmacia.usac.edu.gt/Tesis/QB778.pdf   Ortiz, B. (2001). Desarrollo de una metodología sencilla para establecer la  presencia de coliformes en agua de consumo consumo humano y su correlación correlación con el

método

de

fermentación

de

Tubos

Múltiples

https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/5212128.pdf  

(NMP).

 

UTEC Contenidos. (28 de abril de 2020). Análisis Microbiológico - Método  presencia/ausencia de Coliformes - Etapa presuntiva [[Archivo Archivo de Video]. YouTube.  https://www.youtube.com/watch?v=Qgw-GSLw6_8 YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=Qgw-GSLw6_8 UTEC Contenidos. (28 de abril de 2020). Análisis Microbiológico - Método  presencia/ausencia de Coliformes - Etapa confirmativa [Archivo de Video]. YouTube.  YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=Qgw-GSLw6_8 https://www.youtube.com/watch?v=Qgw-GSLw6_8

IX. 

Anexos 9.1. 

En que aspectos se diferencia este método con el de NMP La diferencia es que el método del Numero Más Probable (NMP) es una  prueba cuantitativa ya que nos indica el número de Unidades Formadoras de Colonias y es un método más complejo de realizar que requiere de mayor tiempo y material de laboratorio. Por el contrario, el método d del el test Presencia-Ausencia (P-A) es una prueba cualitativa porque solo nos indica si hay o no hay la presencia de coliformes en la muestra de agua mediante un cambio de color. Por lo que es mucho más rápida de realizar, además de que este último método se utiliza mayor cantidad de muestra y es más sensible debido a que tiene muchos menos falsos negativos que el método del NMP. Técnicas

Parámetros

Técnica del Numero Técnica de teste más probable  presencia o ausencia (NMP) (cualitativa) (cuantitativa)

Exactitud

Si

No

Precisión

Si

No

Especificidad

Si

Si

Límite de detección

Si

Si

Límite de cuantificación

Si

No

Linealidad

Si

No

 

9.2. 

¿Qué características observa en el video cuando los resultados de PA son positivos? Se observa que el medio P-A cambia de color lila a intenso a lila muy claro, con presencia de espuma, lo cual indica presencia pre sencia de coliformes, siendo estas bacterias fermentadoras de lactosa produciendo gas.

9.3. 

¿Cuáles son las ventajas del método? Una de las ventajas del método de Presencia/Ausencia, es su mayor sensibilidad ya que el porcentaje de falsos negativos se reduce considerablemente, además el método es el muy cómodo de inocular y más simple de interpretar por lo que no necesita de mucha infraestructura y equipo de laboratorio capacitado para su aplicación y además se evita una cantidad de pasos que pueden hacer más tediosos los trabajos de identificación.