TESIS-recubrim.d-biopolime-carvac-sorbatos.pdf

TESIS de Maestría en TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS RECUBRIMIENTOS ELABORADOS A PARTIR DE BIOPOLÍMEROS PARA EL SOPORTE DE SUSTANCIAS CON ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA: CARVACROL Y SORBATOS Tesista: Ing. Sofía Miramont

Director: Dra. Lía Noemí Gerschenson Codirector: Dra. Silvia Karina Flores

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 2012 1

 AGRADECIMIENTOS  Principalmente debo agradecer a dos personas en particular que sin su ayuda este trabajo no hubiera sido posible, A la Dra. Lía Noemí Gerschenson agradezco infinitamente por haberme dado la  posibilidad de integrar su grupo de investigación. Por ayudarme con los lineamientos para el desarrollo de la tesis, por brindarme su experiencia y conocimiento en el tema y por su esfuerzo y dedicación en la corrección de este trabajo. A la Dra. Silvia Karina Flores por su constante y paciente seguimiento durante el desarrollo del presente trabajo. Por guiarme en las tareas de campo, que sin su apoyo hubiese resultado dificultosa su implementación. Además de agradecerle por transmitirme todo su conocimiento en el tema y por su tiempo invertido en la corrección de este trabajo.

Al Departamento de Industrias de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires por facilitar el uso de sus instalaciones. En general a todos aquellos que directa o indirectamente hicieron su aporte para que  pueda cumplir con este objetivo.

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 ÍNDICE GENERAL  ÍNDICE GENERAL 1

INTRODUCCION .................................................................................. ..................................... ..................................................................... ........................ 9 1.1

Antecedentes de recubrimientos comestibles co mestibles ....................................................... .......................................... ............. 12

1.1.1 Recubrimientos comestibles a base de biopolímeros y sus propiedades funcionales ........................................................................................ ........................................... ......................................................................... ............................ 13 1.1.2 Procedimientos de obtención de recubrimientos a base de biopolímeros ........ 15 1.2

Componentes de los recubrimientos recu brimientos ..................................................................... ......................................... ............................ 16

1.2.1 Almidón ...................................................................................... ......................................... ................................................................... ...................... 17 1.2.1.1

Características químicas y físicas ....................................... ............................................................. ...................... 17

1.2.1.2

Gelatinización ................................................ ........................................................................................... ........................................... 21

1.2.1.3

Características y propiedades del almidón de mandioca .......................... 23

1.2.2

Celulosa e hidroxipropil metilcelulosa ............................................................. 24

1.2.2.1

La celulosa y su modificación ...................................... .................................................................. ............................ 24

1.2.2.2

Hidroxipropil metilcelulosa y sus propiedades propi edades funcionales func ionales ..................... 27

1.2.3 Mezcla de polisacáridos polisa cáridos y sus su s características ............................................ ................................................... ....... 28 1.2.4 Los plastificantes y el glicerol .......................................................................... ..................................... ..................................... 30 1.2.5 Antimicrobianos ............................................................................................... .......................................................... ..................................... 32

1.3

1.2.5.1

Ácido sórbico y sorbatos .......................................................................... ............................................................. ............. 33

1.2.5.2

Carvacrol .................................................................................................. 35

Propiedades físicas de los recubrimientos ............................................................ ...................................... ...................... 39

1.3.1 Cristalinidad ..................................................................................................... 39 1.3.2 Color ..................................................................................... ........................................ ......................................................................... ............................ 42 1.3.3 Transparencia y opacidad ................................................................................. .......................................................................... ....... 46 1.3.4 Solubilidad .................................................................................. ..................................... ................................................................... ...................... 48 1.3.5 Propiedades mecánicas ..................................................................................... .......................................... ........................................... 48 1.3.6 Propiedades de barrera...................................................................................... 49

2

1.4

Propiedades antimicrobianas de los recubrimientos recubri mientos ............................................. 50

1.5

Objetivos del trabajo de tesis ................................................................................ ..................................... ........................................... 52

MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... .......................................... ........................................... 53 2.1

Proceso general genera l de elaboración elabo ración de los recubrimientos ......................................... .................................. ....... 53 3

2.1.1 Materiales ......................................................................................................... 53 2.1.2 Procedimiento de obtención de los recubrimientos .......................................... 53 2.2

Descripción del diseño experimental .................................................................... 56

2.3

Ensayos fisicoquímicos ........................................................................................ 57

2.3.1 Microscopía óptica ........................................................................................... 57 2.3.2 Cristalografía de rayos X .................................................................................. 57 2.3.3 Color ................................................................................................................. 57 2.3.4 Transparencia y opacidad ................................................................................. 58 2.3.5 Solubilidad en agua .......................................................................................... 59 2.3.6 Propiedades mecánicas ..................................................................................... 60 2.3.7 Permeabilidad al vapor de agua (PVA) ............................................................ 61 2.4

Ensayos microbiológicos ...................................................................................... 63

2.4.1 Preparación del inóculo .................................................................................... 63 2.4.2 Recuento de células viables .............................................................................. 63 2.4.3 Ensayo de zona de inhibición ........................................................................... 64 2.4.4 Ensayo de barrera antimicrobiana .................................................................... 64 2.5 3

Análisis estadístico ............................................................................................... 65

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ........................................................ 68 3.1

Influencia de las condiciones de proceso ............................................................. 68

3.1.1 Propiedades físico-químicas ............................................................................. 68 3.1.1.1

Cristalografía de rayos X .......................................................................... 68

3.1.1.2

Color ......................................................................................................... 69

3.1.1.3

Transparencia y Opacidad ........................................................................ 72

3.1.1.4

Solubilidad ................................................................................................ 75

3.1.1.5

Propiedades mecánicas ............................................................................. 76

3.1.2 Consideraciones finales sobre las condiciones de proceso ............................... 78 3.2

Influencia de la concentración de antimicrobianos .............................................. 79

3.2.1 Respuestas observadas ...................................................................................... 79 3.2.1.1

Color ......................................................................................................... 82

3.2.1.2

Propiedades mecánicas ............................................................................. 84

3.2.1.3

Solubilidad ................................................................................................ 86 4

3.2.1.4

Permeabilidad al vapor de agua (PVA) .................................................... 87

3.2.1.5

Ensayo de zona de inhibición ................................................................... 88

3.2.1.6

Ensayo de barrera ..................................................................................... 90

3.2.2 Optimización de la formulación ....................................................................... 92 4

CONCLUSIONES ........................................................................................................ 96

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BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................ 100

 ÍNDICE  DE FIGURAS 

Figura 1.1: Estructura molecular de la amilosa .................................................................... 18 Figura 1.2: Estructura molecular de la amilopectina ............................................................ 19 Figura 1.3: Estructura conformacional de la amilopectina ................................................... 19 Figura 1.4: Estructura del gránulo de almidón ..................................................................... 20 Figura 1.5: Evolución de los gránulos de almidón de maíz a lo largo del proceso de gelatinización ........................................................................................................................ 22 Figura 1.6: Estructura química del polímero lineal de celulosa ........................................... 25 Figura 1.7: Estructura química de hidroxipropil metilcelulosa ............................................ 28 Figura 1.8: Modelos esquemáticos de geles formados por mezcla binaria de polisacáridos. (a) Red hinchada, (b) red de interpenetración, (c) red de fase separada y (d) red acoplada (Morris, 2007). ...................................................................................................................... 29 Figura 1.9: Estructura molecular del glicerol ....................................................................... 31 Figura 1.10: Estructura química del ácido sórbico ............................................................... 33 Figura 1.11: Estructura química del sorbato de potasio ....................................................... 33 Figura 1.12: Estructura química: a) carvacrol y b) timol (Davidson y col., 2000)............... 36 Figura 1.13: Diagrama esquemático de la cristalización de amilopectina (las dobles hélices de amilopectina se representan como rectángulos). ............................................................. 39 Figura 1.14: Patrones de difracción A, B, C y V de los almidones nativos ......................... 40 Figura 1.15: Empaquetamientos de las dobles hélices de amilopectina: estructura A (izquierda) y estructura B (derecha). .................................................................................... 41 Figura 1.16: Difractómetro de dos círculos .......................................................................... 42 5

Figura 1.17: Diagramas de color: diagrama de cromaticidad de CIE 1931 mostrando no uniformidad de espaciado de tonos únicos rojo, amarillo y azul (adaptado de MacDougall D. B. 2001) ........................................................................................................................... 44 Figura 1.18: Diagrama CIELab que muestra la relación de color rojo/verde (a* +/-) y amarillo/azul (b* +/-), luminosidad L*, saturación C* y ángulo de tono h* (adaptado de MacDougall , 2001) .............................................................................................................. 45 Figura 1.19: Instrumento de medición del color por reflectancia: partes de un espectrofotómetro (adaptado de Brimelow y Joshi , 2001) ................................................. 45 Figura 2.1: Esquema de elaboración de películas................................................................. 55 Figura 2.2: Mordazas neumáticas utilizadas en los ensayos de tracción de las películas .... 61 Figura 2.3: Celda de acrílico, a) Vista frontal y b) Vista superior ....................................... 61 Figura 3.1: Perfiles de rayos X para sistemas emulsionados a baja cizalla (BC) y alta cizalla (AC) ...................................................................................................................................... 69 Figura 3.2: Sistema CIELAB, que representa la escala de colores según los parámetros L*, a* y b* .................................................................................................................................. 71 Figura 3.3: A: película AC; B: película BC ......................................................................... 71 Figura 3.4: Espectro de absorbancia para sistemas emulsionados a baja cizalla (BC) ........ 72 Figura 3.5: Espectro de absorbancia para sistemas emulsionados a alta cizalla (AC) ......... 73 Figura 3.6: Observación microscópica de las soluciones formadoras de películas. Panel A: emulsificación a baja cizalla. Panel B: emulsificación a alta cizalla. Se incluye una barra de 50 µm de longitud en ambos paneles. Magnificación: 100X ............................................... 74 Figura 3.7: Solubilidad para sistemas emulsionados a baja cizalla (BC) y alta cizalla (AC)  .............................................................................................................................................. 76 Figura 3.8: Esfuerzo vs deformación película BC ................................................................ 77 Figura 3.9: Esfuerzo vs deformación película AC ............................................................... 78 Figura 3.10: Superficie de respuesta correspondiente al parámetro de color L*. ................ 83 Figura 3.11: Superficie de respuesta correspondiente al parámetro de color b*. ................. 83 Figura 3.12: Superficie de respuesta correspondiente al parámetro de color índice de amarillo (YI). ........................................................................................................................ 84 Figura 3.13: Superficie de respuesta correspondiente al esfuerzo a la ruptura (σr ). ............ 85

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Figura 3.14: Variación de la deformación a ruptura con el contenido de carvacrol (carv)  para distintos valores constantes de sorbato de potasio (KS) ............................................... 85 Figura 3.15: Variación de la solubilidad con el contenido de sorbato de potasio (KS) para distintos valores constantes de carvacrol (carv) ................................................................... 87 Figura 3.16: Superficie de respuesta correspondiente a la formación de zonas de inhibición (cm) sobre agar inoculado con Z. bailii ................................................................................ 90 Figura 3.17: Zonas de inhibición desarrolladas contra Z. bailii por las películas Control (C), Sist. 1 (KS: 0,28% - Carv.: 0,33%), Sist. 2 (KS: 0,28% - Carv.: 0,78 %) y Sist. 11 (KS: 0,30% - Carv.: 0,55 %). ........................................................................................................ 90 Figura 3.18: Esfuerzo vs deformación película óptima ........................................................ 93 Figura 3.19: Crecimiento de Z. bailii a diferentes tiempos de incubación para el sistema óptimo. N: UFC/g a tiempo t; N0: UFC/g a tiempo 0 .......................................................... 94 Figura 3.20: Zona de inhibición para el sistema óptimo ...................................................... 95

 Í  NDICE DE TABLAS 

Tabla 1.1: Actividad antimicrobiana de aceites esenciales .................................................. 37 Tabla 1.2: Concentraciones mínimas inhibitorias (%v/v) de aceites esenciales seleccionados de hierbas y especias contra bacterias y levaduras seleccionadas en agar. Adaptado de Hammer y col. (1999a) ......................................................................................................... 38 Tabla 2.1: Diseño de superficie de respuesta (RSM) para el estudio de la influencia de la concentración de sorbato de potasio (KS) y carvacrol (carv). .............................................. 56 Tabla 2.2: Niveles de codificación y concentraciones correspondientes de sorbato de  potasio y de carvacrol utilizadas en el diseño experimental 2 (Influencia de la concentración de antimicrobianos) .............................................................................................................. 66 Tabla 3.1: Parámetros de color para sistemas emulsionados a baja cizalla (BC) y alta cizalla (AC) ...................................................................................................................................... 70 Tabla 3.2: Absorbancia, transmitancia y opacidad de películas de almidón de mandioca... 74 Tabla 3.3: Esfuerzo a la ruptura, deformación y módulo elástico para sistemas ................. 77

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Tabla 3.4: Diseño experimental. Valores de parámetros de color (L*, a*, b*, YI), Deformación (ԑr ), Esfuerzo (σr ), permeabilidad al vapor de agua (PVA) y diámetro de inhibición (DI), variando concentraciones de antimicrobianos sorbato de potasio (KS) y carvacrol (Carv) .................................................................................................................... 80 Tabla 3.5: Coeficientes correspondientes a cada término de la ecuación de ajuste de segundo grado para los parámetros estudiados: solubilidad, deformación (ԑr ), esfuerzo (σr ), color (YI, L*, b*, a*), permeabilidad (log PVA) y diámetro de inhibición (DI). ................ 81 Tabla 3.6: Crecimiento de Z. bailii a diferentes tiempos de incubación. ............................. 91 Tabla 3.7: Optimización de las respuestas de las películas. ................................................. 92 Tabla 3.8: Ensayos fisicoquímicos para sistema óptimo ...................................................... 93

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CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

1

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El desarrollo de nuevas metodologías de preservación de alimentos, a fin de obtener alimentos inocuos y mejorados en sus características nutricionales y organolépticas, es un área de investigación de constante interés y permanente avance. Entre las tecnologías emergentes para la optimización de la preservación de alimentos surge como novedosa alternativa el empleo de películas o recubrimientos autosoportados comestibles que puedan impartir propiedades funcionales específicas al alimento. Esta tecnología responde a: •

el interés de los consumidores en alimentos saludables, de alta

calidad, convenientes y seguros. •

la toma de conciencia colectiva en cuanto al cuidado del medio

ambiente, y la necesidad de contar con materiales biodegradables y/o reciclables que reduzcan las consecuencias ambientales de los envases sintéticos. •

la capacidad de estas películas para contribuir a la solución de

 problemas relacionados con la apariencia, conservación y almacenamiento de ciertos alimentos. •

la gran disponibilidad, carácter de recurso renovable y costo

relativamente bajo de las materias primas utilizadas en su elaboración. Las películas comestibles, pueden usarse para soportar aditivos, tales como antimicrobianos, usándose así para impartir un efecto funcional altamente localizado (Flores y col., 2007a; Giannakopoulos y Guilbert, 1986) o producir la liberación gradual del antimicrobiano al alimento (Chang, 2000). Es de destacar que las condiciones de formación de las películas y la composición de las mismas, afectan la migración de estos aditivos antimicrobianos, comprometiendo su efectividad (Flores y col., 2007b). Se ha estudiado a las películas comestibles como soporte de natamicina y sorbato de potasio, para aplicación en superficie (Flores y col., 2007a y b; Franssen y col., 2002), para la liberación prolongada 9

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN de lisozima y nisina (Buonocore y col., 2003; Sanjurjo y col., 2006), para desarrollar  películas soporte de sorbato o benzoato (Chen y col., 1996; Famá y col., 2005; Flores y col., 2007a y b) y para la lenta liberación de propilparabeno (Chung, y col., 2001). En general, se desea que estas películas sean totalmente neutras con respecto al color y olor del alimento. También pueden usarse como portadoras de agentes antioxidantes o nutrientes tales como vitaminas y minerales. (Flores y col., 2007a). En los casos de películas comestibles usadas como soporte de antimicrobianos, existe escasa información sistemática con referencia a la influencia de los cambios de formulación en las propiedades fisicoquímicas y mecánicas de las películas y en la actividad y difusividad del antimicrobiano soportado. De acuerdo a lo antedicho, se destaca la importancia de la obtención de dicha información sobre las propiedades de películas comestibles útiles para aumentar la calidad de los alimentos, contribuyendo a la optimización de su obtención y comportamiento. Dicha información contribuirá a  profundizar el conocimiento en el desarrollo des arrollo de estos materiales. Para la formulación de las películas comestibles, pueden emplearse almidones, derivados de celulosa, quitosano, gomas, proteínas del suero láctico, concentrados de  proteína de soja como así también grasas y aceites (Phan y col., 2009; 2 009; Chillo y col., 2008). En general, se hace indispensable el uso de plastificantes como glicerol o sorbitol, a fin de  proporcionar la flexibilidad y extensibilidad deseada a dichas películas (Fernández Cervera y col., 2004). Los recubrimientos o películas comestibles pueden también ayudar a controlar la migración de la humedad, gases y lípidos (Guilbert y Biquet, 1996), contribuyendo así a  prolongar la vida útil y a exaltar la calidad global de los alimentos (Franssen y Krochta, 2003). En cuanto a la organización supramolecular de las películas, se puede inferir que su cohesividad está ligada a la química y estructura del polímero, naturaleza del solvente usado, composición de la película y condiciones de proceso de formación. En general, se requieren polímeros de cadena larga para dar matrices con adecuada fuerza cohesiva por depósito a partir de un solvente adecuado (Krochta y col., 1994).

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CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN Por la naturaleza hidrofílica de los biopolímeros como el almidón, las propiedades de barrera de las películas comestibles al vapor de agua son pobres. Sin embargo, estos  polisacáridos dan origen a películas con baja permeabilidad al oxígeno por lo cual pueden  proveer protección efectiva contra la oxidación de lípidos y otros componentes alimenticios (Flores, 2006). Por otra parte, también se ha informado que la modificación de la composición de películas con base en polisacáridos y proteínas, por incorporación de quitosano (Xu y col., 2005), de gomas (Chaisawang y Suphantharika, 2005), de metilcelulosa (Peressini y col., 2003), de lípidos (García y col., 2000) afectan las  propiedades de permeabilidad, permeabil idad, mecánicas y de solubilidad de dichas películas. El sorbato de potasio es considerado como un aditivo GRAS (generalmente reconocido como seguro), y es uno de los antimicrobianos más comúnmente empleados en la industria alimenticia. Posee acción contra hongos, levaduras y algunas bacterias. La incorporación de sorbato de potasio a la formulación de películas comestibles ha sido  propuesta como modo de disminuir el deterioro superficial por contaminación microbiana (Cagri y col., 2001; Flores y col., 2009) Se ha encontrado que los aceites esenciales de las especies del género Origanum  presentan actividad contra bacterias gram negativas como Salmonella typhimurium,  Escherichia coli,  Klebsiella pneumoniae, Yersinia enterocolitica y  Enterobacter cloacae y

las gram positivas como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,  Listeria monocytogenes y  Bacillus subtilis. Tienen además capacidad antifúngica sobre Cándida albicans, C.tropicalis, Torulopsis glabrata,  Aspergillus niger , Geotrichum y  Rhodotorula;

 pero no contra  Pseudomona aeruginosa (Arcila Lozano y col., 2004). Los aceites esenciales son mezclas naturales muy complejas que pueden contener cerca de 20 a 60 componentes en concentraciones muy diferentes. Se caracterizan por dos o tres componentes principales en concentraciones bastantes elevadas (20–70 %) en comparación con otros componentes presentes en cantidades traza. Por ejemplo, Bakkali y col. (2007) informaron que el carvacrol (30 %) y el timol (27 %) eran los principales componentes del aceite esencial de Origanum compactum. De acuerdo con Davidson y col. (2000), el efecto inhibitorio de los aceites esenciales podría explicarse por interacciones de sus componentes, tales como los 11

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN fenólicos, con la membrana celular de los microorganismos y, a menudo, está relacionado con la hidrofobicidad de los compuestos. Por ejemplo, se reportó que el aceite esencial de orégano induce la alteración de la permeabilidad de membranas de los microorganismos con la consiguiente fuga de protones, fosfatos y potasio. Ben Arfa y col. (2006) han informado que los compuestos fenólicos carvacrol y timol poseen una fuerte actividad antimicrobiana. De acuerdo a Burt (2004), el carvacrol posee actividad contra bacterias, hongos y levaduras. Davidson y col. (2000), también reportaron actividad inhibitoria del crecimiento de Candida albicans por parte del carvacrol (1,2%, p/p).

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A partir de los años 70, los polímeros petroquímicos, han sido el material más extensamente usado para embalar debido a su alto rendimiento y su bajo precio (Callegarin y Quezada-Gallo, 1997). Sin embargo, los serios problemas ambientales asociados al uso de materiales no biodegradables han impulsado a los científicos a buscar nuevos materiales alternativos biodegradables (Petersson y Stading, 2005). Los recubrimientos comestibles fueron usados por cientos de años. Por ejemplo, la cera ha sido aplicada a los cítricos para retrasar su deshidratación desde el siglo XII en China (Debeaufort y col., 1998). La yuba, también conocida como piel de soja o nata de soja, elaborada a partir de soja, esencialmente un film de proteína, era usada para conservar el aspecto de algunos productos alimenticios en Asia en el siglo XV (Debeaufort y col., 1998; Han y Gennadios, 2005). En el siglo XVI las grasas fueron usadas para cubrir cortes de carne con el fin de prevenir el encogimiento. La grasa de cerdo o cera fue usada para cubrir la fruta y otros productos alimenticios en Inglaterra (Miller and Krochta, 1997). Más tarde, en el siglo XIX, las películas de gelatina gelatina fueron usadas para cubrir carnes y la sacarosa fue escogida como un recubrimiento comestible protector, sobre almendras y avellanas, para prevenir la oxidación y la rancidez (Debeaufort y col., 1998). Recubrimientos de cera sobre frutas y verduras, recubrimientos de zeína sobre caramelos y de azúcar sobre almendras son los ejemplos comerciales más comunes de 12

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN recubrimientos comestibles. Éteres de celulosa (carboximetil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa y metilcelulosa) han sido usados como ingredientes en recubrimientos para frutas, verduras, carnes, almendras, productos de confitería, panadería, granos y otro  productos agrícolas (Han y Gennadios, 2005).

1.1.1 Recubrimientos comestibles a base de biopolímeros y sus propiedades funcionales

Las investigaciones realizadas han mostrado que estos recubrimientos no pueden reemplazar los materiales de empaquetamiento tradicionales pues sus propiedades no son equivalentes a las de aquellos. Sin embargo, pueden constituirse en uno de los factores de estrés a aplicar en la preservación de alimentos. Sus atributos funcionales hacen que esto sea posible, ayudando a afrontar los desafíos inherentes a la producción, distribución y almacenamiento de alimentos nutritivos, seguros, de alta calidad, estables y económicos (Campos y col., 2011; Flores, 2007). Asimismo, pueden desarrollar una función complementaria de barrera por su baja permeabilidad al oxígeno, permitiendo usar envases tradicionales de menor espesor, contribuyendo así a disminuir los problemas ambientales generados por estos últimos. Estos recubrimientos pueden: •

Soportar aditivos alimentarios:  pueden ser usados para incorporar agentes

antimicrobianos, antioxidantes y otros, en localizaciones específicas de los alimentos. Así, se puede conseguir exaltar una propiedad funcional en forma localizada sin elevar excesivamente la concentración general del aditivo en el alimento. •

Retardar la migración de humedad: la velocidad de transferencia de

humedad entre un alimento y la atmósfera que lo rodea puede ser reducida si el producto entero es recubierto por una película. Un ejemplo típico es el uso de ceras para recubrir frutas y vegetales •

Retardar la migración de aceites y grasas: películas basadas en polímeros

hidrofílicos, son altamente impermeables a grasas y aceites, atributo deseable cuando el 13

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN alimento está destinado a ser freído en aceite. Algunas películas tienen la capacidad de retardar la absorción del aceite hacia el interior del alimento y, por lo tanto, mejoraría su calidad nutricional y organoléptica. •

Retener compuestos volátiles del flavor: películas basadas en hidrocoloides

 pueden desarrollar este efecto. •

Retardar el transporte de gases (O2, CO 2): un modo primario de deterioro de

muchos alimentos involucra la oxidación de lípidos, vitaminas, componentes del  flavor  o  pigmentos. Tal es el caso de las nueces cuya vida útil aumenta si se recubren con una  película impermeable al oxígeno. Las películas también disminuyen la velocidad de la respiración aeróbica de frutas frescas y vegetales. •

Retardar el transporte de solutos: las coberturas comestibles pueden

mantener una alta concentración de distintos compuestos sobre la superficie del alimento colaborando a su concentración en la interfase de interés. Ello ha servido, por ejemplo, para mantener altas concentraciones de sorbato de potasio en la superficie de alimentos modelo, retardando el crecimiento microbiano. O también puede utilizarse esta propiedad para minimizar la difusión de solutos hacia el interior del alimento, en la deshidratación osmótica. •

Mejorar las propiedades mecánicas frente al manipuleo e impartir integridad

estructural adicional a los alimentos: el refuerzo de la estructura por una película comestible podría mejorar la integridad durante el procesamiento, almacenamiento y/o distribución. En general, se requiere la neutralidad de los mismos, o sea que su aplicación no modifique el sabor, olor y otras características organolépticas del alimento

14

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN 1.1.2 Procedimientos de obtención de recubrimientos a base de biopolímeros

Algunas técnicas de aplicación para la obtención de recubrimientos, se detallan a continuación (Flores, 2007): •

Inmersión: utilizado especialmente en alimentos de forma irregular que

requieren una cobertura uniforme. Luego de la inmersión, el material excedente se deja drenar del producto y, finalmente, se seca o se deja solidificar (lípidos). •

Aplicación por atomización ( spraying ): se puede lograr un espesor más

delgado y uniforme que con la técnica anterior. Por otro lado, es más adecuado para  productos que necesiten ser recubiertos sólo en una de sus caras o en uno de sus lados. •

Otros: las coberturas en forma líquida pueden aplicarse con pinceles,

cepillos, rodillos, o directamente vertidos sobre la superficie del alimento. En todos los casos se requiere de aplicadores adecuados. En el caso de desear obtener un recubrimiento autosoportado o película, por ejemplo, para fines de caracterización o envoltura de un alimento, existen tres técnicas  principales informadas en bibliografía: •

Casteo (casting ): es simple, permite controlar el espesor del film, ya que se

utilizan superficies planas. Pueden emplearse esparcidores de la solución de origen, o directamente volcarse la porción del sistema de origen en el molde. Involucra una etapa de secado que permite eliminar el exceso de solvente. •

Prensado: se coloca la suspensión entre dos placas y mediante una prensa se

le aplica una dada presión en caliente. Luego se deja enfriar y secar retirando la placa superior. •

Laminado: se genera la película en forma de lámina en una calandra.

Las propiedades de las películas comestibles dependen de los materiales que forman la película y sobre todo de su cohesión estructural. Aditivos como plastificantes, 15

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN antimicrobianos, antioxidantes son utilizados para modificar las propiedades funcionales de las películas. Las películas comestibles son muy hidrofílicas lo que puede limitar su aplicación. Por ello, se ha tratado de mejorar su resistencia a la humedad y las propiedades de barrera al agua combinándolas con lípidos (Han y col. 2006). Estas películas pueden servir para controlar la maduración de frutas y hortalizas debido a su adecuada barrera a los gases fijos. De hecho, el uso de recubrimientos con zeína ya ha sido informado en tomates, con retraso en los cambios de color, peso y firmeza (Debeaufort y col., 1998). Se ha encontrado que las  películas comestibles son muy eficientes en la reducción de la oxidación de lípidos. La composición y las propiedades funcionales de películas y recubrimientos deben responder a la aplicación específica, tipo de producto alimenticio y principales mecanismos de deterioro (Guilbert, 2005).

1.2

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Muchos biopolímeros han sido usados para formular películas y recubrimientos comestibles, por ejemplo, polisacáridos, proteínas, lípidos o sus mezclas (Debeaufort y col., 1998). Las ceras y aceites (ejemplo: parafina, cera de abejas) son usadas como recubrimientos sobre naranjas, limones, manzanas, peras; ellas crean una barrera realmente eficiente al agua y pueden prevenir la pérdida de peso (Ochoa y col., 2011). Los  polisacáridos usados en películas o recubrimientos incluyen, por ejemplo, la celulosa y sus derivados, el almidón, las pectinas y gomas (Flores y col., 2007a). Han sido usadas  proteínas provenientes de origen vegetal y animal, incluyendo gluten de trigo (Kayserilioglu y col., 2001), proteína de soja, zeína (Lai y Padua, 1997; Lai y col., 1997) y  proteína de la leche (Letender y col., 2002). Los lípidos y sus derivados son principalmente usados en películas o recubrimientos para mejorar sus propiedades de barrera a la humedad (García y col., 2000b). Entre los polímeros naturales, el almidón ha sido considerado como uno de los más  prometedores candidatos para futuros materiales debido a una atractiva combinación entre 16

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN  precio, disponibilidad y termoplasticidad (Lai y Padua, 1997; Mali y col., 2005a). El almidón ha sido utilizado en la fabricación de bolsas de residuos en conjunto con polímeros derivados del petróleo. También se ha usado para fabricar artículos descartables de servicios de alimentos por ejemplo, cubiertos, platos, tazas (Lai y col., 1997).

Los almidones son polímeros que se utilizan para numerosas aplicaciones en la industria alimenticia y sus propiedades funcionales dependen del origen (trigo, maíz, papa, mandioca) pero también son afectados por otros factores como modificaciones químicas. En esta sección se describirán las características generales del almidón, de la hidroxipropil metilcelulosa (HPMC) y del glicerol por ser los componentes base de las  películas estudiadas en el presente trabajo. Asimismo, se detallarán las características del sorbato de potasio y del carvacrol usados como agentes antimicrobianos.

1.2.1 Almidón

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Los almidones son polisacáridos de reserva alimenticia predominante en las plantas. Fisiológicamente son sustancias de reserva. Se encuentran principalmente en los granos de cereales, tubérculos, frutas y en varias legumbres. En los tejidos vegetales, los almidones están presentes en forma de gránulos intracelulares compactos con estructura y tamaño característico según la planta de la cual  provienen. El diámetro de los mismos está comprendido entre los 2 a 130 micrones. Estas características particulares sirven para identificar la procedencia del almidón. El almidón está compuesto por dos tipos de moléculas: •

Amilosa: normalmente representa un 20-30% del total.

•

Amilopectina: normalmente en un 70-80% del total. 17

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN Ambos son polímeros de unidades de α-D-glucosa. Los pesos moleculares de estas moléculas dependen de la fuente y de la muestra específica que se tome, pero las moléculas de amilopectina son más grandes que las de amilosa. Independientemente de sus tamaños, cada molécula de amilosa o amilopectina tiene sólo un extremo reductor (en el carbono 1). Existen algunos almidones, como el almidón de maíz cereo, que contienen solamente amilopectina mientras que, en el otro extremo, están los almidones de maíz ricos en amilosa los cuales contienen alrededor de 52-75% de amilosa (Fanelli, 2009).

Amilosa

La amilosa es un polímero de residuos de D-glucosa unidos por enlaces α-1,4 (figura 1.1). El grado de polimerización (número de unidades de glucosa por molécula) va desde 500 a 2000. Las largas cadenas de amilosa se asocian entre sí (Fanelli, 2009).

Figura 1.1: Estructura molecular de la amilosa

Amilopectina

Las cadenas de amilopectina, al igual que las de amilosa, están formadas por unidades de glucosa con uniones glicosídicas α-1,4. Presentan ramificaciones que consisten en cadenas laterales con uniones α-1,6. Dichas cadenas son relativamente cortas y se  presentan a intervalos de 20 a 30 residuos de glucosa, lo cual constituyen alrededor del 45% del total de enlaces (figura 1.2). El grado de polimerización va desde 104 a 105. La estructura conformacional, visualizada mediante estudios enzimáticos, es de tipo árbol 18

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN como puede verse en la figura 1.3. Las moléculas se orientan radialmente y a medida que el radio aumenta, también lo hace el número de ramificaciones. (Fanelli, 2009)

Figura 1.2: Estructura molecular de la amilopectina

Figura 1.3: Estructura conformacional de la amilopectina

Gránulo de almidón

El gránulo de almidón está formado por capas concéntricas o anillos de crecimiento. En cada capa las moléculas de amilosa y amilopectina se encuentran entremezcladas y dispuestas de manera radial. Cuando es posible, las moléculas lineales de amilosa y las cadenas laterales externas de la amilopectina se unen a través de puentes de hidrógeno formando micelas (áreas cristalinas). Estas micelas son las responsables de mantener el gránulo unido, permitiendo así el hinchamiento en lugar de la completa ruptura del gránulo y solubilización de las moléculas, durante el calentamiento de la suspensión acuosa. A lo largo de una cadena lineal, o en las ramificaciones externas de la amilopectina, pueden existir varias zonas cristalinas, producto de distintas asociaciones intermoleculares locales. Entre estas zonas micelares existen zonas amorfas (figura 1.4).

19

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

Figura 1.4: Estructura del gránulo de almidón

El acoplamiento de la posición axial-ecuatorial de las unidades α- D-glucopiranosilo con enlaces α-1,4 en las cadenas de amilosa, da a las moléculas una forma de hélice o espiral con giro a la derecha. El interior de la hélice contiene sólo átomos de hidrógeno y es, por lo tanto, lipofílico, mientras que los grupos hidroxilo están situados en el exterior de la hélice. Cada hélice tiene seis unidades de α-D-glucosa por vuelta. Cuando 2 hélices se asocian forman una estructura de doble hélice. En el centro de dicha estructura queda un canal abierto que permite que se formen complejos con otras moléculas. Así, una molécula de tri-ioduro se compleja con seis unidades de glucosa en una vuelta de hélice. Se genera entonces una peculiar resonancia eléctrica que da lugar a una coloración azul. Por lo tanto, cuando se agrega solución de I2 a una dispersión de almidón se forma un complejo de color azul. (Fanelli, 2009). Los gránulos de almidón que no han sufrido tratamiento térmico presentan  birrefringencia, lo cual indica un alto grado de orden interno. La birrefringencia es la habilidad de refractar la luz en dos direcciones. Bajo la luz polarizada, los gránulos  presentan una marcada cruz de interferencia que atraviesa el hilium. La pérdida de  birrefringencia indica la pérdida del orden molecular en las zonas cristalinas, micelares, y se usa como criterio de gelatinización. Los gránulos de cada especie de almidón tienen tamaños, formas y superficies característicos.

20

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN �������

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Los almidones cumplen un papel importante en la tecnología alimenticia, debido a sus propiedades fisicoquímicas y funcionales, además de su bajo costo. Se usan como agentes espesantes, para aumentar la viscosidad de salsas, estabilizantes de geles y emulsiones, enturbiadores, glaseantes, ligantes y agentes de relleno (favoreciendo la retención de agua) y gelificantes. Estas funciones se deben a sus propiedades hidrocoloidales. Los gránulos de almidón son prácticamente insolubles en agua fría, pero cuando se exponen a altas temperaturas en presencia de agua, éstos se hinchan debido al alto porcentaje de agua sorbida. De este modo aumenta la viscosidad de la suspensión de almidón, porque los gránulos hinchados se adhieren entre sí. (Fanelli, 2009) Los almidones comienzan a gelatinizar a temperaturas entre 60 a 70° C, dependiendo de cada almidón específico. La pérdida de birrefringencia se puede utilizar como indicador de la temperatura de inicio de la gelatinización, puesto que la misma ocurre cuando comienza el hinchamiento del gránulo. A continuación se muestra la evolución de los gránulos de almidón de maíz a lo largo del proceso de gelatinización (5% almidón-95% agua) en la figura 1.5 (Fanelli, 2009).

21

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN 30 οC

Sorción superficial de agua.

40 οC

60 οC

Continúa la sorción superficial, el

Se sorbe mayor cantidad de agua,

agua puede penetrar el gránulo y los

los gránulos hinchados se rompen.

gránulos se hinchan.  ο

 ο

90 C

 ο

70 C

65 C

Se puede alcanzar el grado Continúa la sorción, ruptura de La amilosa comienza a salir del óptimo

de

gelatinización. uniones internas, salida de amilosa gránulo formando una dispersión

Cercano a esta temperatura se

hacia fuera del gránulo, quedando

coloidal fuera de éste y abre la

alcanza el pico máximo de

gránulos dañados.

estructura

viscosidad.

superficial

granular.

Continúa ingresando agua.

Figura 1.5: Evolución de los gránulos de almidón de maíz a lo largo del proceso de gelatinización

El conjunto de cambios descriptos da lugar a un producto amorfo. Los factores que influyen en la gelatinización son el tipo y la concentración de almidón, la agitación, la  presencia de proteínas, lípidos, sal, azúcar y otros componentes potencialmente presentes y el pH. La velocidad de enfriamiento también afecta las características del producto final. Durante el almacenamiento de productos conteniendo almidón gelatinizado, la amilosa tiende a cristalizar y la amilopectina a recristalizar (retrogradación del almidón)

22

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN dando lugar a un producto parcialmente cristalino y con una textura mucho más rígida (Fanelli, 2009).

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La mandioca o tapioca o yuca es un tubérculo originario de un arbusto perenne ( Manihot esculenta) que se cultiva en los países tropicales de América, África y Asia. Pertenece a la familia de las Euforbiáceas y comprende más de 7000 especies distribuidas  por las regiones cálidas de todo el mundo. Este tubérculo presenta un tejido de color  blanco, recubierto por una corteza de color pardo o marrón oscuro y de aspecto leñoso. Dado su bajo contenido proteico respecto al de los cereales, no logró expandirse en su consumo. Históricamente lo han consumido los sectores de menores ingresos y ocupa un lugar secundario en el comercio internacional. La fécula de mandioca, principal derivado industrial, se emplea como aglutinante  para la fabricación de alimentos; aventaja a otros almidones por su proceso de gelatinización más rápido. Es utilizada como materia prima para productos cárnicos,  panificados, helados, dulces, jaleas y aderezos. El almidón de mandioca es más simple de extraer que el de maíz, ya que sus tubérculos contienen muy poca cantidad de proteínas, grasas, etc. Si la extracción se hace correctamente, se logra un almidón muy blanco y puro. Los gránulos de almidón de mandioca tienen una forma cónica- truncada. El tamaño de los mismos exhibe una amplia variación, entre 4-40 µm. Presenta muy bajo contenido de lípidos y de fósforo. El contenido de amilosa se encuentra en un rango de 20-27% similar al de otros almidones; aproximadamente el 40 % del total de amilosa es soluble. Entre los diferentes almidones de tubérculos, la mandioca presenta la más baja temperatura de gelatinización. Esta temperatura va desde los 50-73ºC. La viscosidad es una propiedad importante en los almidones en la que están basadas algunas aplicaciones. El almidón de mandioca presenta alta viscosidad comparando con otros almidones de tubérculos y de cereales; las características de viscosidad están 23

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN influenciadas por las diferentes variedades, factores ambientales, rangos de calentamiento, otros ingredientes presentes en el sistema, etc. En lo que respecta al poder de hinchamiento de los granos, su valor es medio comparado con almidón de papa y cereales. La solubilidad es más alta (25 al 40%) que la de almidones de tubérculos y esta propiedad puede ser atribuida en parte al alto poder de hinchamiento sufrido en la gelatinización. La alta claridad de estos almidones hace que sea muy útil en la industria alimenticia y también en la textil. El almidón de mandioca tiene fuerzas asociativas más débiles comparadas a las de los cereales y esto hace que tenga mayor claridad. Otra propiedad muy importante en aplicaciones alimenticias es la estabilidad que es definida por la retrogradación de las moléculas de almidón; en este sentido, el almidón de mandioca tiene una buena estabilidad comparada con almidones de cereales. La digestibilidad es alta y mayor al 60%. Las propiedades del almidón de mandioca revelan que puede ser utilizado en diferentes productos alimenticios. Primero, su sabor suave es una ventaja por sobre el de los cereales que es más fuerte por la presencia de lípidos. La temperatura de gelatinización es muy baja, inferior a la mayoría de los almidones de cereales y otros almidones de tubérculos y raíces. La alta viscosidad es muy útil en productos que requieren cuerpo. Así, el almidón de mandioca tiene muchas propiedades deseables que lo hacen muy útil en la industria alimenticia. Sin embargo no se usa en algunos alimentos por su poca estabilidad a la congelación y descongelación (Moorthy, 2004).

1.2.2 Celulosa e hidroxipropil metilcelulosa

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La celulosa es la sustancia orgánica más abundante en la naturaleza (Bovey y Winslow, 1981). Por lo tanto, no sorprende que la humanidad haya hecho uso de la celulosa desde tiempos inmemoriales con distintos fines tales como obtener papel, en la construcción y, últimamente, como una fuente de bioenergía. Estas aplicaciones conciernen tanto a la celulosa en su estado natural o modificada, física o químicamente. 24

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN La celulosa es el principal componente de las paredes celulares de plantas y algas verdes. Este biopolímero se presenta en la madera en un 40 – 50%, 80% en fibras de lino y 90% en las fibras de algodón (Marchessault y Sundararajan, 1983). La purificación comercial de la celulosa se realiza a partir de las fibras de algodón y de la pulpa de madera, en el primer caso por el alto contenido en este polisacárido y en el segundo, por la accesibilidad de este recurso. En su estado natural, la celulosa es difícil de purificar ya que es insoluble en los solventes comerciales. Así, el aislamiento de la celulosa en su forma  pura incluye tratamiento alcalino para la remoción de ceras, proteínas y ligninas. Las pulpas destinadas a la obtención de éteres de celulosa sufren pasos de extracción alcalina adicionales para remover polisacáridos de bajo peso molecular llamados hemicelulosas y aumentar la fracción de la celulosa pura (Coffey y col., 1995). Químicamente difiere del almidón simplemente por tener uniones β-1,4 en lugar de α-1,4, siendo su monómero la glucosa. Este pequeño cambio se traduce en una gran diferencia en sus propiedades funcionales. La celulosa es un poliacetal de 4-O-β-Dglucopiranosil-D-glucosa ya que la unidad básica consiste de dos unidades de glucosa unidas por unión β-1,4 (Coffey y col., 1995). La configuración β-1,4 da como resultado una estructura lineal y rígida para el polímero (figura 1.6). La relativa abundancia de grupos hidroxilo y la tendencia a formar puentes hidrógeno tanto intra como intercatenarios es la causa de la formación de agregados lineales los cuales contribuyen a la rigidez de las  paredes celulares y a la relativa insolubilidad de la celulosa en los solventes comunes,  particularmente el agua.

Figura 1.6: Estructura química del polímero lineal de celulosa

25

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN Es posible mejorar las propiedades de la celulosa a través de modificaciones que  pueden ser físicas o químicas. Una de las modificaciones físicas más comunes consiste en hacer atravesar una pasta de celulosa por tamices de pequeños orificios bajo condiciones de gran esfuerzo de corte y altas presiones diferenciales (Coffey y col., 1995). Así se obtienen las celulosas microfibriladas las cuales tienen mayor capacidad de retención de agua y son menos propensas a la precipitación. Por modificaciones físicas también se obtiene la celulosa microcristalina que es producida tratando a la celulosa natural con ácido clorhídrico para disolver las regiones amorfas del polisacárido, persistiendo solamente las regiones cristalinas. Estas celulosas generan soluciones donde la viscosidad no varía con el  pH o la temperatura (Brownsey y Redout, 1985). Si bien existen numerosos derivados obtenidos por modificaciones químicas de la celulosa natural, sólo unos pocos éteres de celulosa han encontrado aplicación en la industria alimentaria. Los derivados más comúnmente usados son la carboximetilcelulosa, metilcelulosa, e hidroxipropilmetilcelulosa. Estos dos últimos son empleados debido a la capacidad de formar geles termorreversibles y por sus propiedades interfaciales (Kobayashi y col. 1999; Sarkar y Walker, 1995). Aunque la variedad de éteres de celulosa es amplia, todos ellos son obtenidos esencialmente de igual forma (Kondo, 1993). El proceso de  producción puede ser dividido en tres etapas: obtención del álcali de celulosa, alquilación o hidroxialquilación y purificación final del producto. El peso molecular de estos polímeros se manifiesta en la viscosidad de sus soluciones. Así, a medida que el peso molecular disminuye, la viscosidad disminuye. Para estos derivados de celulosa, por lo tanto, el peso molecular es una importante información (Coffey y col., 1995). Además de los sustituyentes presentes en el esqueleto carbonado de celulosa y la viscosidad de sus soluciones, normalmente medidas a concentraciones de 1 o 2% p/v, estos  productos se caracterizan por el grado de sustitución (DS) y la sustitución molar (MS). Cada unidad de anhidroglucosa en la molécula de celulosa tiene tres grupos hidroxilos disponibles para la derivatización. De esta manera, si los tres grupos fueran sustituidos el  producto tendría un DS igual a 3. Si un número promedio de dos sobre tres hidroxilos totales hubieran reaccionado, entonces el DS sería 2 y así sucesivamente. El término DS se 26

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN relaciona con aquellos sustituyentes que bloquean los grupos hidroxilos reactivos. Los sustituyentes que permiten el crecimiento posterior de la cadena son caracterizados por la sustitución molar (MS). Es decir, el DS define el número de grupos hidroxilos por unidad de glucosa anhidra en donde el átomo de hidrógeno es reemplazado y MS representa el número promedio de grupos de óxido de propileno por unidad de glucosa anhidra (Nahringbauer, 1995). La derivatización de los grupos hidroxilo reactivos con óxido de  propileno genera a su vez sitios hidroxilo disponibles para posteriores reacciones. De esta manera, la reacción continúa con la extensión de la cadena.

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La hidroxipropil metilcelulosa (HPMC) es un derivado de celulosa que presenta en su cadena grupos metilo e hidroxipropilos (figura 1.7). Para este compuesto existen  posibilidades de distinto peso molecular, viscosidad, grado de sustitución (DS) y sustitución molar (MS). A lo largo de la cadena de celulosa, los grupos metilos constituyen zonas hidrofóbicas mientras que los grupos hydroxipropilos son más hidrofílicos. La presencia de estos substituyentes le confiere a la HPMC posibilidades de comportarse como surfactante. La utilidad de los éteres no iónicos de celulosa se basa, fundamentalmente, en cuatro atributos: son espesantes eficientes, presentan actividad superficial, tienen la habilidad de formar películas interfaciales y la capacidad de formar geles termorreversibles. Las interacciones hidrofóbicas son responsables de la formación de los geles de HPMC durante el calentamiento (Sarkar, 1979). A medida que la temperatura aumenta, las moléculas adsorben energía traslacional y pierden gradualmente su hidratación, resultando en una menor viscosidad. Tienen lugar las interacciones polímero-polímero, debido a interacciones entre los grupos hidrofóbicos, causando así opacidad en la solución y una red infinita que provoca un aumento brusco en la viscosidad y la turbidez si la concentración es relativamente alta (Sarkar y Walker, 1995).

27

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

Figura 1.7: Estructura química de hidroxipropil metilcelulosa

.

La HPMC es empleada en una gran gama de productos alimenticios. Los productos  basados en proteínas frecuentemente necesitan estabilizantes para prolongar su vida útil durante el almacenamiento a temperatura ambiente o en refrigeración y estos polisacáridos  pueden ser agregados para lograr este objetivo (Coffey y col., 1995). En productos fritos, se utiliza también como un ingrediente rebozador ya que tienen la capacidad de impedir la  pérdida de humedad durante la cocción por formar un gel alrededor del alimento y simultáneamente bloquean la absorción de aceite. Tiene aplicación como espesante y como ligante de agua reduciendo la sinéresis en alimentos fluidos como salsas, sopas y jarabes. Puede proveer además estabilidad contra la coalescencia de gotas en emulsiones durante el almacenamiento. Akiyama y col. (2005) indicaron que una buena habilidad espesante del  polímero, la formación de un film elástico y su adsorción a la interfase aceite-agua son los factores responsables de su contribución a la estabilidad de las emulsiones aceite-agua.

1.2.3 Mezcla de polisacáridos y sus características

El objetivo de mezclar polímeros con diversas estructuras físicas y químicas, compatibles parcialmente o totalmente incompatibles, en proporciones adecuadas, en general se debe a la búsqueda de la optimización de las propiedades de los componentes,  para dar un producto final que tenga propiedades más deseables o costo menor que los de los componentes individuales, o, en algunos casos, para producir nuevos materiales para fines específicos (Cazacu y col., 2005). En el caso de los polisacáridos, las interacciones

28

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN  polímero - polímero o polímero - solvente determinarán las propiedades del sistema resultante. En los casos de geles binarios de polisacáridos, pueden ser propuestos cuatro modelos esquemáticos de la red del gel. Aunque simples, estos modelos constituyen la base  para establecer ciertas relaciones entre el gel mixto y sus componentes. Estos modelos de geles han sido denominados como: redes hinchadas, redes de interpenetración, redes de fase separada y redes acopladas (Figura 1.8).

a)

b)

c)

d)

Figura 1.8: Modelos esquemáticos de geles formados por mezcla binaria de polisacáridos. (a) Red hinchada, (b) red de interpenetración, (c) red de fase separada y (d) red acoplada (Morris, 2007).

•

Redes hinchadas:

este tipo de gel se da en mezclas de un polisacárido

gelante y otro no gelante, o las mezclas de dos polisacáridos gelantes bajo condiciones donde sólo uno de los polímeros es inducido a formar gel. Los polímeros no gelantes se considera que residen dentro e hinchan la red de gel. Este tipo de estructura sólo es  probable que ocurra si la tasa de des-mezclado de los dos polisacáridos es baja en comparación con la tasa de gelación, tal que el polímero no gelificante se distribuya  bastante uniformemente dentro de la red de gel. •

Redes de interpenetración: 

se considera que constan de dos redes de

espacio de llenado independientes que se interpenetran una con la otra. Verdaderas redes de interpenetración a nivel molecular son poco probables debido a la tendencia de los 29

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN  polisacáridos a formar fase separada. Sin embargo, para mezclas de polisacáridos cargados y no cargados puede ser inhibida la separación de fase. •

Redes de fase separadas: 

una solución diluida bajo condiciones de

equilibrio ha mostrado que, polisacáridos incluso químicamente muy similares, presentarán fases separadas. Algunos ejemplos incluyen amilosa y amilopectina, pectinas y hemicelulosas. Si la concentración de almidón es suficientemente alta entonces, cuando se enfrían, los geles de amilosa dan lugar a una red de amilosa interpenetrante a través de los gránulos hinchados. Esto puede considerarse como un gel compuesto con los gránulos actuando como partículas de relleno reforzando la red de amilosa. Esto es un ejemplo de un gel de fase separada porque la amilopectina todavía en gran medida está contenida en los restos de los gránulos hinchados. •

Redes acopladas: 

están formadas por mezclas de polisacáridos bajo

condiciones donde los componentes individuales por si solos no forman gel, pero las mezclas sí lo hacen. Los mecanismos para gelación son aún controvertidos pero hay evidencia considerable en todos los casos de que algún tipo de enlace intermolecular entre los dos polisacáridos contribuye a la formación de una red permanente.

1.2.4 Los plastificantes y el glicerol

Además del componente de naturaleza polimérica y de alto peso molecular (matriz), otro componente importante de las películas comestibles son los plastificantes. Estos son moléculas pequeñas de bajo peso molecular, de baja volatilidad y con una naturaleza química similar a la del polímero formador de recubrimiento. Se usan para mejorar la flexibilidad y la funcionalidad de los recubrimientos. Generalmente se requieren plastificantes como el glicerol en las formulaciones a  base de polisacáridos y de proteínas, para aumentar la flexibilidad de los recubrimientos al aumentar el volumen libre o la movilidad molecular de los polímeros ya que reducen los enlaces hidrógeno internos entre las cadenas de polímeros. Los plastificantes afectan la capacidad de atracción de agua del sistema y generalmente suelen aumentar la 30

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN  permeabilidad al oxigeno de los recubrimientos comestibles (McHugh y Krochta, 1994; Sothornvit y Krochta, 2000). Dentro de los agentes plastificantes utilizados más frecuentemente se encuentran: glicerol, polietilénglicol, sorbitol, aceites, ácidos grasos, ceras, etc., siendo el glicerol uno de los más utilizados. El glicerol es un compuesto químico, también llamado glicerina. Es un líquido viscoso, sin olor ni color y ampliamente usado en la industria farmacéutica. El glicerol  posee tres grupos hidroxilos que son responsables de su solubilidad en agua y su naturaleza higroscópica (figura 1.9). Es el componente central de algunos lípidos. El glicerol es ligeramente dulce y de baja toxicidad.

Figura 1.9: Estructura molecular del glicerol

Gracias a la presencia de grupos –OH en su estructura, el glicerol es capaz de vincularse a través de puentes de hidrógeno con las cadenas de almidón, impidiendo el completo ordenamiento de las mismas debido a que se interpone entre éstas. El efecto global del reemplazo de interacciones polímero-polímero por interacciones plastificante polímero es la reducción de la rigidez de las películas.

El tamaño molecular, la

configuración y el número total de grupos hidroxilo funcionales del plastificante, como así también su compatibilidad con el polímero, afectan el tipo y cantidad de interacciones entre el plastificante y las cadenas poliméricas (Yang y Paulson, 2000).

31

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN 1.2.5 Antimicrobianos

La calidad y la seguridad son objetivos primordiales de la industria de los alimentos. Debido a la preferencia de los consumidores por alimentos frescos y mínimamente  procesados (Pranoto y Col., 2005), se han planteado nuevos desafíos. En particular, el control de las enfermedades causadas por microorganismos (hongos, bacterias y levaduras) ha originado la búsqueda de nuevos compuestos que eviten la contaminación de los alimentos durante la manipulación y el almacenamiento (Badawy y col., 2009). Los agentes antimicrobianos como el ácido benzoico, ácido sórbico y parte de sus sales (sorbato sódico, sorbato potásico y sorbato cálcico), ácido propiónico, ácido láctico, nisina y lisozima han sido incorporados en matrices comestibles, con el fin de evitar el crecimiento superficial de hongos, bacterias y levaduras en los alimentos. Los aceites esenciales que, generalmente, poseen notables propiedades antimicrobianas también pueden soportarse en estas matrices. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios realizados sobre las propiedades antimicrobianas de los aceites esenciales se han centrado en microorganismos patógenos para el hombre, así como en aquellos  presentes en los alimentos, bien por su implicancia en toxicoinfecciones alimentarias, bien  por su capacidad de alterar las propiedades organolépticas y de conservación de los alimentos. Diversos estudios determinan que los aceites procedentes de: clavo, canela, mostaza, orégano, romero y tomillo son los que poseen actividad antimicrobiana más acentuada (Burt, 2004). Los aceites esenciales se caracterizan por ser una mezcla compleja de varios compuestos aromáticos: hidrocarburos (compuestos terpénicos), alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres y fenoles. Ejemplo de ellos son el cinamaldehido obtenido de la canela, el eugenol obtenido del clavo de olor, el carvacrol obtenido a partir del orégano, el cineol obtenido del eucalipto, el timol obtenido del tomillo, entre otros. Generalmente,

los

aceites

esenciales

que

poseen

notables

propiedades

antimicrobianas, contienen un alto porcentaje de compuestos fenólicos como el carvacrol, el timol y el eugenol. El carvacrol (componente mayoritario del orégano) y el timol 32

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN (procedente del tomillo) son capaces, dependiendo de la concentración de inclusión, de desintegrar la membrana externa de las bacterias Gram negativas E. coli y S. tiphimurium. En estudios realizados con extractos de canela, tomillo, clavo y orégano se ha podido demostrar la actividad frente a Clostridium perfringens (Deans, 1995; Huerta, 2007; Mitch, 2004). Para S. enteritidis, los mejores resultados se obtuvieron con aceites de mostaza, clavo, tomillo, orégano y canela

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El ácido sórbico o ácido 2,4-hexadienoico es un compuesto orgánico natural empleado como conservante alimentario en su forma de sales (ejemplo: sorbato de potasio). La razón principal es su falta de toxicidad, además de que su uso no aporta sabores ni aromas extraños al alimento. La fórmula química del ácido sórbico se puede observar en la figura 1.10, mientras que la del sorbato de potasio en la figura 1.11:

Figura 1.10: Estructura química del á cido sórbico

Figura 1.11: Estructura química del sorbato de potasio

El ácido sórbico es poco soluble en agua a temperatura ambiente (0,16 g/100 g). En aceites es ligeramente más soluble (0,5-1 g/100 g). Presenta un punto de fusión entre 132135°C. Las sales del ácido sórbico son muy utilizadas ya que son más estables y solubles que el ácido. El sorbato potásico es muy utilizado, tiene un peso molecular de 150,22 g/mol y es el más soluble: 138 g en 100 g de agua a temperatura ambiente (Cubero, 2003). 33

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN El ácido sórbico y sus sales se emplean como agentes fungistáticos, inhibiendo ciertas enzimas en la célula microbiana como la enolasa y lactodeshidrogenasa y también otras del ciclo de Krebs. Muchas enzimas son inactivadas al formarse enlaces covalentes entre los grupos sulfhídricos (SH) y los dobles enlaces del ácido sórbico. Su acción se debe a la forma no disociada de la molécula, ya que es ésta la que atraviesa la membrana celular del microorganismo y actúa en su interior. A pH 3,5 el 40% del ácido sórbico presente,  penetra en la célula y a pH 7, sólo el 1%. Se mantiene activo frente a la catalasa y oxidasa y esto permite su acción contra microorganismos catalasa positivos como levaduras, mohos y bacterias de este tipo. Su acción es más global contra hongos y levaduras. Las bacterias tienen un comportamiento diferente y sólo se ven parcialmente afectadas. En un orden de mayor a menor, el efecto antimicrobiano del sórbico sería: aerobias estrictas en primer lugar, seguidas por catalasa positivas que se ven más inhibidas que las catalasa negativas y, por último, encontraríamos a las bacterias lácticas y los clostridios. Se emplea contra contaminantes aeróbicos en los alimentos fermentados o acidificados, siendo eficaz a concentraciones de ácido no disociado de 0,03 a 0,01% m/m. Es efectivo contra Salmonella a concentraciones de 0,1% m/m, pero la velocidad de inactivación depende del acidificante, del sustrato y de la temperatura de almacenamiento (Cubero, 2003). Se utiliza en margarinas, productos lácteos, verduras fermentadas, bebidas, dulces y repostería. En Estados Unidos, los sorbatos (nombre dado al ácido sórbico y sus sales) se consideran GRAS (generalmente reconocido como seguro). La OMS ha fijado la ingesta diaria admisible para ácido sórbico en un valor de 25 mg/kg de peso corporal por día. La no toxicidad de los sorbatos fue establecida en pruebas en las cuales los compuestos fueron suministrados a diversas especies animales para la determinación de toxicidad aguda, así como su influencia en el metabolismo, carcinogenicidad y teratogenicidad después de la exposición a corto o largo plazo. En general, estos estudios demostraron la inocuidad relativa de sorbatos y su superioridad relativa en la seguridad en comparación con otros aditivos químicos (Jarret, 2005).

34

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN �������

���������

Desde tiempos remotos, las especias y las hierbas se han añadido a alimentos como condimento, debido a sus propiedades aromáticas. En el desarrollo de películas comestibles y recubrimientos antimicrobianos, los aceites esenciales de hierbas y especias han sido ampliamente utilizados (Du y col., 2009; Sánchez-González y col., 2011). Los aceites esenciales (EO) son líquidos aceitosos aromáticos obtenidos de material vegetal: flores, brotes, semillas, hojas, ramas, cortezas, hierbas, madera, frutos y raíces. Los componentes principales son sustancias fenólicas, que se cree que serían las responsables de las propiedades antimicrobianas. Muchos de estos EOs son compuestos seguros clasificados como GRAS. Hay abundante evidencia científica en relación con la eficacia de los EOs de muchas hierbas, especias y sus componentes como antimicrobianos, antifúngicos y antivirales. Ejemplos de tales plantas son casia, clavo de olor, ajo, salvia, orégano, pimienta, tomillo, romero, hierba luisa, escutelaria y suspensa forsythia (Burt, 2004). El orégano (Origanum vulgare L. ) es una planta herbácea originaria de las regiones mediterráneas y ha sido usada como planta medicinal, haciendo uso de sus propiedades antimicrobianas, antioxidantes y antifúngicas (Elgayyar y col., 2001; Puertas-Mejia y col., 2002; Sokovic y col., 2002). Los componentes primarios de los aceites esenciales del orégano son el carvacrol [5-isopropil-2-metilfenol] y el timol [2-isopropil-5-metilfenol)], representados en la figura 1.12:

35

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN b)

a)

Figura 1.12: Estructura química: a) carvacrol y b) timol (Davidson y col., 2000)

Algunos EOs de especias, son altos inhibidores de microorganismos patógenos. El fraccionamiento y aplicación prolongada de los aceites esenciales ayuda a mejorar el nivel de actividad en algunos casos. La actividad antimicrobiana de los EOs se puede atribuir a su contenido de estructuras terpenoides que, debido a su carácter lipofílico, actúan mediante la interrupción de la integridad de la membrana citoplasmática de los microorganismos, la que pierde así su alta impermeabilidad para los protones y otros iones. Las funciones de la membrana quedan comprometidas, no sólo como barrera, sino también como una matriz  para las enzimas y como un transductor de energía (Campos y col., 2011). En la tabla 1.1. se puede observar algunas aplicaciones de aceites esenciales. Se ha probado que el carvacrol, es el compuesto antifúngico con actividad más importante. Katayama y Nagai (1960) probaron la efectividad del Carvacrol y Timol contra  Bacillus subtilis , Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus,  Pseudomonas aeruginosa,  Proteus y  Escherichia coli y encontraron inhibición en todos los microorganismos en

diluciones tan bajas como 1:2000. El aceite esencial de orégano tuvo la mayor actividad de un número de aceites esenciales testeados contra hongos y bacterias. Kim y col. (1995) evaluó la actividad antibacteriana de aceites esenciales contra  E. coli, E. coli O157:H7, la Salmonella typhimurium, L. monocytogenes, y Vibrio vulnificus en 5, 10, 15, y el 20 % de

dilución. El Carvacrol mostró la mayor actividad bactericida a 250 µg/ml contra S. typhimurium y V. vulnificus. Beuchat (1976) también mostró que el orégano y tomillo eran

 bactericidas contra Vibrio parahaemolyticus al 0.5 % como especias y como aceites esenciales a un nivel de 100 µg/ml. 36

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN En la tabla 1.2 se observan las concentraciones mínimas inhibitorias (%v/v) de aceites esenciales seleccionados de hierbas y especias contra bacterias y levaduras en agar (Hammer y col., 1999a), siendo uno de los más efectivos el extraído del orégano.

Tabla 1.1: Actividad antimicrobiana de aceites esenciales Especie

Modo de

Actividad antibacteriana

aplicación

Actividad antifúngica

Orégano y menta

Aceite esencial

 Aspergillus ochraceus

Orégano

Aceite esencial o

Candida albicans

carvacrol Orégano y Timol

Orégano, Cilantro y Albahaca

Aceite esencial o

Staphylococcus pneumoniae

carvacrol

 R36A, Bacillus cereus

Aceite esencial

 Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus,  Escherichia coli, Yersina enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa,Lactobacillus  plantarum

37

 Aspergillus niger

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN Tabla 1.2: Concentraciones mínimas inhibitorias (%v/v) de aceites esenciales seleccionados de hierbas y especias contra bacterias y levaduras seleccionadas en agar. Adaptado de Hammer y col (1999a)

 Especie

Enterococus

 E.coli

 faecalis

Pseudomonas

 Salmonella

aeruginosa

Typhimurium

 S. aureus

Cándida albicans

Albahaca

>2.0

0,5

>2.0

2

2

0,5

Pimienta

1

>2.0

>2.0

>2.0

>2.0

>2.0

Clavo

0,5

0,25

>2.0

>2.0

02,5

0,12

Cilantro

0,25

0,25

>2.0

1

0,25

0,25

Hinojo

>2.0

0,5

>2.0

1

0,25

0,5

Jengibre

>2.0

>2.0

>2.0

>2.0

>2.0

>2.0

Cáscara de

0,12

0,06

1

0,25

0,06

0,06

0,25

0,12

2

0,12

0,12

0,12

2

0,5

>2.0

1

1

0,5

>2.0

1

>2.0

>2.0

1

1

Salvia

2

0,5

>2.0

2

1

0,5

Menta verde

2

0,25

>2.0

0,5

0,25

0,12

Árbol de Té

2

0,25

>2.0

0,5

0,5

0,5

>2.0

0,5

>2.0

0,5

2

0,25

negra

limón Orégano Menta Romero

Tomillo

Distintos autores evaluaron las actividades antimicrobianas frente a  E. coli  O157: H7 de varios EOs (el orégano, la canela y el limón) y de los compuestos activos de los aceites (carvacrol, cinamaldehído y citral) incorporados en películas comestibles de alginato-puré de manzana, mostrando que el carvacrol exhibía la mayor actividad 38

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN antimicrobiana seguido por aceite de orégano, el citral, el aceite de hierba de limón, cinamaldehído y el aceite de canela (Campos y col., 2011).

1.3

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1.3.1 Cristalinidad

Como se mencionó, el almidón es un material semi-cristalino. El esquema de la figura 1.13 representa el proceso de cristalización de la amilopectina. El proceso se inicia con la formación de láminas cristalinas compuesta por dobles hélices de cadenas cortas de amilopectina (representado por las cajas rectangulares). Luego, el conjunto de dobles hélice forma racimos cristalinos (Delville y col., 2003).

Figura 1.13: Diagrama esquemático de la cristalización de amilopectina (las dobles hélices de amilopectina se representan como rectángulos).

La estructura cristalina de las películas de almidón puede ser identificada a través de su patrón de difracción de rayos X. La figura 1.14 muestra los cuatro principales tipos de patrones de difracción de los almidones nativos: A, B, C y V (Liu, 2005). 39

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

Cereales

Tubérculos Tubérculos

semillas

Complejos de amilosa helicoidal

Angulo de reflexión (2θ) Figura 1.14: Patrones de difracción A, B, C y V de los almidones nativos

El patrón de difracción de rayos X refleja los diferentes tipos de empaquetamiento de las dobles hélices de la amilopectina. La estructura tipo A tiene un arreglo de dobles hélices densamente empaquetado, mientras que la estructura tipo B consiste en un empaquetamiento más abierto con una mayor cantidad de agua inter-helicoidal (figura 1.15). En general, los almidones de tubérculos presentan una estructura cristalina tipo B. La introducción de otros compuestos en preparaciones de almidón puede interrumpir las conformaciones de doble hélice del almidón, formando cadenas estables simples de tipo hélices, de conformación V. La conformación V es el resultado, por ejemplo, de complejos formados entre la amilosa y sustancias tales como ácidos grasos alifáticos, tensioactivos, emulsionantes, n-alcoholes, glicerol, sulfóxido de dimetilo. Cuando los lípidos polares y la amilosa están presentes, las estructuras tipo V pueden resultar de la gelatinización, tanto durante el calentamiento como el enfriamiento (Flores y col, 2007a).

40

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

Figura 1.15: Empaquetamientos de las dobles hélices de amilopectina: estructura A (izquierda) y estructura B (derecha).

Las dobles hélices helicoidales en cada estructura son muy similares. Las regiones cristalinas están predominantemente localizadas en las capas duras del gránulo y están compuestas por láminas cristalinas las cuales forman la columna estructural del gránulo. La cristalinidad de las películas de almidón depende del tipo de almidón y de las condiciones de transformación, tales como las condiciones de secado (velocidad y temperatura), del contenido de humedad de las películas y temperatura de almacenamiento (Mali y col., 2002). Se ha estudiado el efecto de distintas condiciones en la cristalinidad. El aumento en contenido de agua, aumenta el grado de cristalinidad y la cinética de la cristalización, mientras que un mayor contenido de glicerol ralentiza la cinética de la cristalización (Delville y col., 2003). La cristalinidad de las películas de almidón se incrementa con el tiempo de almacenamiento (Mali y col., 2002) por el fenómeno de retrogradación del almidón. La formación de cristales pueden actuar como “cross-linking” de la estructura, generando tensiones internas (Delville y col., 2003). Por lo tanto, mientras aumenta la cristalinidad de una matriz, su deformabilidad disminuye drásticamente y la resistencia a la tracción y el módulo de elasticidad aumentan.

41

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN La estructura cristalina de las películas de almidón se analiza a menudo con un difractómetro usando rayos X. Este difractómetro se denomina Difractómetro de Polvo,  posee una geometría de tipo Bragg-Brentano en el que, el contador electrónico puede formar un ángulo variable (2θ = 3º-110º) con el haz incidente de rayos X. Cuando la muestra gira un ángulo θ el contador gira 2θ, este movimiento es el que hace que el difractómetro se denomine “Difractómetro de dos círculos”. En un difractómetro comercial la muestra se sitúa en el centro de eje del goniómetro de precisión, cuya velocidad angular está sincronizada en la relación anterior 2:1 con el detector (figura 1.16).

Figura 1.16: Difractómetro de dos círculos

.

1.3.2 Color

Muy a menudo, el primer juicio sobre la calidad de un alimento depende de sus diversas características organolépticas tales como el color, la estructura de superficie y la forma. El color, en particular, es un importante atributo sensorial. Se puede definir como una percepción visual que se genera en el cerebro al interpretar las señales nerviosas que le envían los fotorreceptores de la retina del ojo y que a su vez interpretan y distinguen las distintas longitudes de onda que captan de la parte visible del espectro electromagnético (MacDougall, 2001). 42

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN El ojo humano percibe la luz visible (380 nm a 780 nm) y aprecia tres características: el tono o tipo de color, que corresponde a la dominancia de unas radiaciones a determinadas longitudes de onda sobre otras (rojo, amarillo, azul); la saturación o pureza, que describe el grado en que el color se separa del gris neutro y se acerca a un color puro del espectro (más rojo o menos rojo según la cantidad de gris presente en el color); la luminosidad o claridad, que es la cantidad de luz reflejada o trasmitida por un objeto dentro de un mismo tono y saturación (brillante, luminoso). La medida del color está normalizada a nivel internacional desde la reunión de la Comissión Internationale de l´Eclairage (CIE) celebrada en Paris en 1931. Este sistema se  basa en la posibilidad de reconstruir cualquier estímulo coloreado mediante una mezcla de cantidades adecuadas de tres estímulos fundamentales de color. La CIE estableció colores fundamentales el rojo, el verde y el azul y se designaron como X, Y, Z. Por lo tanto cualquier diferencia de color se manifestará como un ∆X, ∆Y, ∆Z, diferentes de cero, donde ∆X, ∆Y, ∆Z son las diferencias entre cada uno de los valores en cuestión. Para representar gráficamente los valores cromáticos, las coordenadas X, Y, Z de la CIE se pueden transformar en coordenadas cromáticas:

 x =

 y =

 z  =

 X 

+ Y  + Z  Y 

+ Y  + Z   Z 

+ Y  + Z 

1.1

1.2

1.3

Dado que x +  y +  z   = 1, es posible determinar el color mediante dos coordenadas de cromaticidad, por ejemplo, x e y (figura 1.17).

43

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

 Verde

 y  Amarillo

Rojo

 Azul

 x

Figura 1.17: Diagramas de color: diagrama de cromaticidad de CIE 1931 mostrando no uniformidad de espaciado de tonos únicos rojo, amarillo y azul (adaptado de M acDougall D. B. 2001)

Se han propuesto muchas modificaciones de este sistema, una de las más conocidas es el sistema Hunter (L a b) y los más recientes y oficialmente reconocidos como internacionales CIELab y CIELuv. Por diferentes causas, ha sido el CIELab (CIE L* a* b*) el que se ha impuesto y expresa la luminosidad L* (claro u obscuro); a* (del color rojo positivo al verde negativo) y  b* (del color amarillo positivo al azul negativo) indicando la orientación del color (figura 1.18).

44

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN Blanco

 Amarillo

 Verde

Rojo  Azul

Negro

Figura 1.18: Diagrama CIELab que muestra la relación de color rojo/verde (a* +/-) y amarillo/azul (b* +/-), luminosidad L*, saturación C* y ángulo de tono h* (adaptado de MacDougall , 2001)

.

Figura 1.19: Instrumento de medición del color por reflectancia: partes de un espectrofotómetro (adaptado de Brimelow y Joshi , 2001)

El espectrofotómetro de reflectancia (figura 1.19) trabaja midiendo la proporción de la luz reflejada de una muestra respecto a la de una referencia conocida. Se toman medidas, a través de una esfera de integración en muchos puntos en toda la gama visible del espectro electromagnético, es decir, entre 380nm y 700nm. La reflectancia es calculada por medio de la relación de proporción y viene expresada como porcentaje. Por lo tanto, lo que refleja 45

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN un difusor perfecto tendrá un reflectancia del 100 %. Durante el análisis de medidas, sin embargo, la reflectancia generalmente se expresa como una fracción. Un mosaico blanco ideal, tiene un valor de 1. Por el contrario, una muestra negra, que absorbe toda la luz incidente, tendrá un reflectancia de 0 % ó 0 (Brimelow y Joshi, 2001). Las películas que contienen monosacáridos como fructosa, manosa y glucosa, son de color amarillo, con el grado de color dependiendo de la concentración de los azúcares usada (Zhang y Han, 2006b).

1.3.3 Transparencia y opacidad

La transparencia u opacidad y el brillo, se encuentran entre las propiedades ópticas más importantes a la hora de evaluar el impacto directo sobre la apreciación del color y aspecto de un producto recubierto (Hutchings, 1999). Un material presenta transparencia cuando deja pasar fácilmente la luz. La transparencia es una propiedad óptica de la materia, que tiene diversos grados. Se dice, en cambio, que un material es translúcido cuando deja pasar la luz de manera que las formas se hacen irreconocibles (no se observan nítidamente los objetos), y que es opaco cuando no deja pasar apreciablemente la luz. Generalmente, se dice que un material es transparente cuando es transparente a la luz visible. Para aplicaciones técnicas, se estudia la transparencia u opacidad a la radiación infrarroja, a la luz ultravioleta, a los rayos X, a los rayos gamma u otros tipos de radiación. Según la mecánica cuántica, un material será transparente a cierta longitud de onda cuando en su esquema de niveles de energía no haya ninguna diferencia de energía que corresponda con esa longitud de onda. La transparencia se cuantifica como transmitancia, porcentaje de intensidad lumínica que atraviesa la muestra. Para esto se utiliza un colorímetro o un espectrofotómetro.

46

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN La función de opacidad generalmente envuelve tanto la frecuencia de la luz que interacciona con el objeto como la temperatura de dicho objeto, es importante recalcar que existen diferentes funciones de opacidad para diferentes objetos para diferentes condiciones físicas. Matemáticamente la función de opacidad se representa con

; implícitamente

cada función lleva consigo el mecanismo físico que se quiere estudiar. Según la mecánica cuántica, un material será opaco a cierta longitud de onda cuando en su esquema de niveles de energía haya alguna diferencia de energía que corresponda con esa longitud de onda. Así, los metales son opacos (y reflejan la luz) porque sus bandas de energía son tan anchas que cualquier color del espectro visible puede ser absorbido y remitido. La apariencia de las películas comestibles depende del hidrocoloide utilizado y de los aditivos añadidos. Las películas de almidón puro, sin aditivos, son generalmente incoloras y transparentes. Estudios realizados por Sánchez y col. (2010), sobre el efecto antioxidante del ácido ferúlico y vitamina E en películas a base de caseinato sódico, mostraron que la presencia de ácido ferúlico, implica una mayor opacidad y menor brillo con respecto al film control, consecuencia de una estructura más rugosa que da lugar a una mayor dispersión de luz. La vitamina E ejerce un efecto contrario, a mayor concentración de vitamina E, menor rugosidad y mayor transparencia y brillo. En películas realizadas a partir de quitosano con el agregado de aceites esenciales (tomillo y romero), Arce (2011) observó que su transparencia se redujo a medida que se les incorporaron aceites esenciales. Películas realizadas a base de hidroxipropil metilcelulosa a las que se les incorporó aceite esencial de árbol de té, mostraron una disminución del brillo y de su transparencia (Bagán y col., 2009).

47

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN 1.3.4 Solubilidad

La solubilidad es la medida o magnitud que indica la cantidad máxima de soluto que  puede disolverse en una cantidad determinada de solvente, a una temperatura dada. Esta propiedad es de gran importancia para determinar la funcionalidad de la  película comestible. La resistencia al agua de películas comestibles portadoras de antimicrobianos es deseable para mantener la integridad de la película si la misma debe utilizarse para la conservación de alimentos de humedad intermedia a alta (Ozdemir y Floros, 2007). Una  película antimicrobiana con pobre resistencia al agua se disuelve rápidamente en contacto con altos contenidos de humedad, determinando que la película libere el agente antimicrobiano (Ozdemir y Floros, 2007). Sin embargo, estas coberturas podrían utilizarse en alimento listos para consumir donde es deseable un alto porcentaje de solubilidad en la  boca. Famá y col. (2007), estudiaron la influencia del agregado de polvo de ajo en recubrimientos biodegradables a base de almidón de mandioca, observando que el agregado de ajo modifica las propiedades fisicoquímicas de las películas, conduciendo a aumentos en la permeabilidad al vapor de agua y solubilidad en agua, sin que se obtengan diferencias significativas en el contenido de humedad. Baruk (2008) estudió la solubilidad en agua de películas elaboradas con almidón modificado de plátano y con quitosano a temperaturas de 25ºC y 80ºC. A 25ºC se obtuvieron valores menores en comparación con los obtenidos a 80ºC, evidenciando así el efecto de la temperatura en la solubilidad.

1.3.5 Propiedades mecánicas

Las películas de almidón se caracterizan a menudo a través de ensayos de tracción, de los cuales se obtienen distintas propiedades mecánicas, por ejemplo el esfuerzo tensil de 48

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN la película, su deformación, el módulo elástico. El esfuerzo se calcula dividiendo la fuerza necesaria para fracturar la película por la sección transversal de la película (Phan y col., 2005). El valor de deformación representa la flexibilidad de la película y se define como el  porcentaje del cambio en la longitud de la muestra respecto a la longitud libre original. El valor del módulo elástico, también conocido como módulo de Young, se calcula partir de la  pendiente lineal inicial de la curva esfuerzo - deformación. Cuantos más altos son los valores del módulo de las películas, mayor carácter sólido de las mismas (Mali y col., 2005a). Estas propiedades se evalúan de acuerdo a lo sugerido por la norma ASTM D882-91 (ASTM, 1991). El equipo usado para ello es la Máquina Universal de Testeo. Durante los últimos años, se ha estudiado ampliamente, el efecto de los  plastificantes en las propiedades mecánicas de películas preparadas a partir de almidón, amilosa, amilopectina y mezclas de almidones y otros biopolímeros (Myllarinen y col., 2002). Por lo general, la presencia de plastificantes aumenta los valores de deformación y disminuye el esfuerzo y el módulo elástico. Esto se debe a que los plastificantes pueden aumentar el volumen libre en la fase amorfa y reducen la interacción entre las cadenas de almidón del polímero. Sin embargo, un efecto anti-plastificante se encontró cuando la concentración del plastificante estaba por debajo de un nivel crítico (Godbillot y col., 2006).

1.3.6 Propiedades de barrera

La permeabilidad de vapor de agua es una medida de la facilidad con que un material puede ser penetrado por vapor de agua. La norma ASTM E96-00 define a la  permeabilidad como la tasa de transmisión de vapor de agua a través de una unidad de área de material plano con espesor inducido por una diferencia de presión de vapor entre dos superficies específicas, bajo condiciones de humedad y temperatura definidas (Krochta y col, 1994).

49

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN La permeabilidad al vapor de agua (PVA) es una de las propiedades más importantes en el desempeño como barrera de las películas biopoliméricas. Indica la capacidad de las películas para el control del transporte de vapor de agua entre un sistema alimenticio y sus alrededores. El método más común utilizado para medir PVA es conocido como “Método de la Copa” (Gennadios y col., 1994). En este método una celda de acrílico se llena con una cierta cantidad de agua destilada o desecante y se cubre con una muestra de película. El almacenamiento en ambiente de humedad relativa y temperatura controlada,  permite evaluar el cambio de peso de la copa para determinar la velocidad de transmisión de vapor de agua (VTVA). La PVA se calcula en base a la VTVA, el espesor de la película y la diferencia de presión parcial de vapor de agua entre el interior y el exterior de la copa (Zhang y Han, 2006). En general, las películas de polisacáridos no son buena barrera al vapor de agua  pues las moléculas de agua interactúan con los grupos hidroxilo de los biopolímeros, afectando la PVA (Del Nobile y col., 2002). Además, el espesor de las películas hidrofílicas se incrementa con la sorción de agua, afectando la determinación de la PVA (Gennadios y col., 1994). La permeabilidad al oxígeno es otra propiedad muy importante. Las películas de  biopolímeros, por lo general, tienen buenas propiedades de barrera al O2 en condiciones de  baja humedad (Guilbert, 2000). La permeabilidad al O2  de películas comestibles es comparable con la de polietileno de baja densidad.

1.4

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Muchos antimicrobianos se proponen para ser utilizados en la formulación de  películas y recubrimientos comestibles con el fin de inhibir la flora de deterioro y para disminuir el riesgo de agentes patógenos. Habitualmente se utilizan compuestos generalmente reconocidos como seguros (GRAS) y existe una tendencia a seleccionar los antimicrobianos de fuentes naturales con el fin de satisfacer la demanda de los consumidores por alimentos saludables que sean libres de aditivos químicos. Los antimicrobianos más comúnmente utilizados son los ácidos orgánicos, el polisacárido 50

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN quitosano, algunos polipéptidos como la nisina, el sistema de la lactoperoxidasa y algunos extractos de plantas y sus aceites esenciales, entre otros. Para la selección de un antimicrobiano, debe ser considerada la eficacia contra el tipo de microorganismo de interés y las posibles interacciones entre los antimicrobianos y otros componentes de los alimentos presentes. Estas interacciones pueden modificar la actividad del antimicrobiano y las características de la matriz siendo estos factores importantes para el desarrollo de las películas y recubrimientos a base de biopolímeros (Campos y col., 2011). En el desarrollo de matrices comestibles con actividad antimicrobiana, los aceites esenciales de hierbas y especias han sido ampliamente utilizados. Sin embargo algunas desventajas son su inestabilidad química y reducida solubilidad en agua. En general, los niveles de EOs necesarios para inhibir el crecimiento microbiano son más altos en los alimentos que en los medios de cultivo. Esto es, en parte, debido a las interacciones entre los compuestos activos y algunos componentes de la matriz de los alimentos como las  proteínas y las grasas. Por el contrario, existe información acerca de que la adición de hidratos de carbono parecería no tener efecto sobre la acción inhibitoria de los EOs en caldos de cultivo. Por lo tanto, la incorporación de EOs a formulaciones de matrices comestibles puede ser un método novedoso para mejorar la estabilidad de EOs siempre que se pueda segurar su biodisponibilidad. (Campos y col., 2011). Se han realizado numerosos estudios para establecer la efectividad de los antimicrobianos en recubrimientos. La elección del método depende del propósito del ensayo, la naturaleza de los antimicrobianos y las características del objetivo que se quiera cumplir, entre otros. El ensayo de difusión en agar o test de zona de inhibición se aplica  para comprobar si el componente antimicrobiano está disponible en la matriz comestible  para actuar como agente antimicrobiano. En este ensayo, la difusión de los antimicrobianos depende del tamaño, la forma y la polaridad de la molécula que difunde, la composición química de la matriz y el medio receptor. El test de superficie o de barrera es otro ensayo que se realiza con frecuencia y consiste en evaluar el crecimiento de una población microbiana inoculada en la superficie del recubrimiento antimicrobiano en contacto con un medio semisólido que actúa como 51

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN modelo de un producto alimenticio determinado o, directamente, en contacto con un alimento. Los resultados obtenidos informan la capacidad de barrera frente a una contaminación externa. Para algunas aplicaciones, una rápida liberación de antimicrobianos es necesaria  para controlar el crecimiento microbiano en los alimentos. Por el contrario, en otras aplicaciones, se requiere una liberación lenta a fin de asegurar un cierto nivel de retención en superficie como control de la contaminación externa. La determinación de la tasa de liberación junto con la evaluación de la actividad antimicrobiana a través del tiempo ayudan a optimizar el desarrollo de dichos recubrimientos (Campos y col., 2011).

1.5

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Objetivo General: Profundizar el conocimiento sobre el desarrollo de recubrimientos elaborados en base a biopolímeros a fin de generar innovaciones tecnológicas significativas en el área del procesamiento industrial de alimentos.

Objetivos Específicos: •

Desarrollar recubrimientos comestibles autosoportados (películas) a base de

almidón de mandioca e hidroxipropil metilcelulosa, las cuales incluyan sorbato de potasio y carvacrol. •

Caracterizar los materiales desarrollados a partir de la determinación de su

acción antimicrobiana y de sus propiedades mecánicas y fisicoquímicas. •

Analizar la influencia de la composición sobre las características de los

materiales desarrollados y su efecto en potenciales aplicaciones industriales de los mismos.

52

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS

2

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2.1

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2.1.1 Materiales

Para conformar la matriz de las películas se utilizó almidón de mandioca (Bernesa S.A., Argentina), hidroxipropil metilcelulosa o HPMC (Methocel premium® K4M, Dow Chemical, USA) y glicerol (Sintorgan®, Argentina). Los antimicrobianos utilizados en la formulación de las películas fueron carvacrol y sorbato de potasio o KS (Sigma®, USA).

2.1.2 Procedimiento de obtención de los recubrimientos

Se prepararon 300 g de cada sistema de acuerdo al siguiente procedimiento: 1)

Mezcla de almidón de mandioca, glicerol, sorbato de potasio y agua

destilada (1/3 de la cantidad necesaria para integrar 300 g del sistema). La misma se colocó en un recipiente sobre un agitador magnético a 25°C durante 12 minutos, con el fin de humectar los gránulos de almidón. 2)

Mezcla constituida por agua destilada (2/3 de la cantidad necesaria para

integrar 300 g del sistema) y HPMC. Con la

finalidad de lograr una mezcla bien

humectada, se colocó el agua en un recipiente sobre un agitador magnético provisto de una  platina de calefacción y se agregó lentamente la HPMC a 25°C. Una vez mezclados los componentes, se incrementó la temperatura de la mezcla, a una velocidad de 4,2 °C/ min hasta alcanzar los 84°C a fin de lograr la hidratación de la HPMC, dando lugar a un sistema viscoso.

53

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS Luego, las dos mezclas se contactaron, la temperatura global descendió a 75 °C. Posteriormente se continuó calentando a una velocidad de 4,2 °C/min hasta alcanzar los 93 °C con el objetivo de lograr la gelatinización del almidón y la homogenización del sistema global. Posteriormente se agregó carvacrol en la cantidad adecuada y se procedió a la emulsificación durante 2 min mediante un equipo emulsificador Ultraturrax (IKA, Alemania) a velocidades de 6500 rpm o 21500 rpm. Se eliminaron las burbujas mediante centrifugación (centrífuga, Eppendorf, Alemania) durante 5 minutos a 500 rpm y a 25°C. Alícuotas (20g) de la solución formadora de película fueron dispensadas sobre  placas de Petri de poliestireno de 8,8 cm de diámetro. El secado se realizó a 35ºC durante 24 horas en una cámara con convección forzada de aire. Una vez constituidas, las películas fueron equilibradas en atmósfera de humedad relativa 57,7% a 25ºC previo a su caracterización. En la figura 2.1 se detalla el esquema del proceso de obtención de las películas de almidón de mandioca.

54

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS Humectación mezcla 1

Humectación mezcla 2

g 1/3 cantidad para 300 g de sistema Agua: T: 25°C Almidón t: 12 min Glicerol Agitador magnético Sorbato de potasio

Agua: 2/3 cantidad para 300 g de sistema HPMC Ti: 25°C Tf: 84°C t: 20 min Agitador magnético

Homogenización

Mezcla 1 + mezcla 2 Ti: 75 °C Tf: 93°C Agitador magnético

Emulsificación

Carvacrol Emulsificador Ultraturrax t: 2 min vel: 6.500 ó 21.500 rpm

Centrifugación

T: 25°C t: 5 min vel: 500 rpm

Casteo

Placa de petri Peso: 20g

Secado de películas

T: 35 °C t: 24hs

Estabilización

T: 25°C HR: 57,7%

Figura 2.1: Esquema de elaboración de películas.

55

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS

2.2

����������� ��� ������ ������������

Se realizaron dos diseños experimentales:

1.

Diseño experimental para el estudio de la influencia de las condiciones de

 proceso. En este caso se trabajó con sistemas de igual composición y se varió la velocidad de emulsificación (6500 y 21500 rpm). La composición en g/100g de sistema fue: almidón 2,67; HPMC 0,67; glicerol 1,70; KS 0,300; carvacrol 0,100 y agua destilada 94,69. 2.

Diseño experimental para el estudio de la influencia de la concentración de

antimicrobianos. Para esta parte del trabajo se utilizó un diseñó experimental basado en la metodología estadística de superficie de respuesta (RSM). Del análisis de los resultados del  primer diseño se seleccionó una velocidad de emulsificación de 21500 rpm con criterios a explicar más adelante. Se estudiaron sistemas con diferentes concentraciones de KS y carvacrol, conteniendo en g/100g de sistema, 2,67 de almidón, 0,67 de HPMC, 1,70 de glicerol y la cantidad de agua necesaria para completar 100 g de sistema en conjunto con las cantidades de KS y carvacrol detalladas en la tabla 2.1.

Tabla 2.1: Diseño de superficie de respuesta (RSM) para el estudio de la influencia de la concentración de sorbato de potasio (KS) y carvacrol (carv). Sistema

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

KS

0,275

0,275

0,325

0,325

0,300

0,300

0,300

0,250

0,350

0,300 0,300

Carv

0,325

0,775

0,325

0,2775

0,550

0,100

1,000

0,550

0,550

0,550

56

11

0,550

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS

2.3

������� ��������������

2.3.1 Microscopía óptica

El estudio de microscopia óptica se realizó utilizando un microscopio óptico Zeiss Axioskop 2 Plus (Zeiss, Alemania). La solución formadora de películas fue dispensada sobre un porta objetos y observada directamente en el microscopio. Las observaciones fueron realizadas con un aumento de 100X.

2.3.2 Cristalografía de rayos X

Se utilizó un difractómetro Philips X-ray con goniómetro vertical (radiación Cu K α, λ=1,542 Å). Las determinaciones fueron realizadas a 40 kV y 30 mA. Las películas fueron

montadas sobre un portamuestras de vidrio y colocadas en el contenedor del equipo. La intensidad de los rayos X fue registrada con un contador de centelleo en un rango de ángulo de dispersión (2θ) de 6-33° utilizando una velocidad de barrido de 1 °/min.

2.3.3 Color

Para la determinación de color se utilizó un Colorímetro Minolta CM-508d (Tokio, Japón) siendo el diámetro de abertura de 1,5 cm. El colorímetro fue calibrado con placas  blanco y negro patrones. Para la medición fue seleccionado el iluminante D-65 y el ángulo del observador fue de 2º. Los discos de película de diámetro aproximadamente igual a 8,8 cm fueron apoyados sobre la placa blanca patrón (Trezza y Krochta, 2000) y se eliminaron eventuales burbujas de aire presionando levemente el espécimen. Las determinaciones de color fueron hechas en tres posiciones sobre la superficie de cada una de tres películas.

57

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS Los parámetros medidos correspondieron al sistema CIE Lab, en el cual L* indica luminosidad (0 corresponde a negro y 100 corresponde a blanco), los valores positivos de a* indican rojo y los negativos, verde y valores positivos de b* indican amarillo mientras que los negativos indican azul. Asimismo, se calculó la diferencia de color:

∆E = [(L*-L0*)2 + (a*-a0*)2 + (b*-b0*)2]1/2

2.1

siendo L*,a*, b* los valores correspondientes a las películas de interés y L0*, a0*,  b0*, los valores de referencia elegidos. El índice de amarillo (YI, yellow index) se evaluó de acuerdo a la norma ASTM D1925 (1988) y el índice de color (CI) se determinó con la siguiente ecuación (MurilloMartínez y col, 2010):

CI= (a*1000) / (L*b*)

2.2

Valores de CI entre -40 y -20 corresponden al rango del color que va desde violeta a verde oscuro; valores entre -20 y -2 corresponden a muestras con colores entre verde oscuro y amarillo verdoso; valores entre -2 y +2 indican color verde amarillento. Por otra parte, CI entre +2 y +20 corresponden a muestras de color amarillo pálido a naranja intenso y entre +20 y +40 indican color desde naranja intenso a rojo oscuro.

2.3.4 Transparencia y opacidad

Las propiedades de barrera a la luz de las películas fueron medidos en longitudes de onda seleccionadas entre 400 y 800 nm, utilizando un espectrofotómetro UV-160 (Shimadzu, Japón) de acuerdo a Fang y col. (2002). La transmitancia de las películas se

58

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS obtuvo a partir de la absorbancia medida a 600 nm (Shiku y col, 2004) y utilizando la siguiente ecuación:

A600 / xo = - logT600 / x

2.3

donde A600 es la absorbancia a 600 nm, T600 es la transmitancia a 600 nm, y x 0 es el espesor de la película (mm). Un alto valor de transmitancia implicará alta transparencia; por el contrario, un valor bajo significará baja transparencia. La opacidad se calculó mediante un procedimiento de integración del área bajo la curva del espectro de absorbancia de la película, entre 400 y 800 nm. La opacidad es expresada en unidades de absorbancia (UA) por nm (Hewage y Vithanarachchi, 2008).

2.3.5 Solubilidad en agua

El porcentaje inicial de materia seca fue determinado por secado de discos de  películas de 2 cm de diámetro en una estufa de vacío a 100 ºC, durante 24 horas. Paralelamente, otros discos fueron cortados, pesados y sumergidos en 50 ml de agua destilada, durante 24 horas a 25 ºC. Las películas remanentes fueron recuperadas por filtración y secadas (100 ºC en estufa de vacío, durante 24 horas) a fin de determinar la masa seca no solubilizada. La solubilidad es definida como el porcentaje de masa seca de la película que es solubilizada en agua destilada en condiciones estandarizadas y se calcula de la siguiente manera:

Solubilida d (% ) =

59

m si − m sf  × 100 m si

2.4

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS donde msi es la masa seca inicial y msf  es la masa seca final. La determinación se hizo por triplicado y empleando la ecuación 2.4.

2.3.6 Propiedades mecánicas

Se realizaron ensayos de tracción utilizando una máquina universal de testeo (Instron testing machine, model 3345, Instron Corp., USA), provista de una celda de carga de 100 N. La geometría de las muestras fue rectangular (6 x 60 mm), la separación inicial entre las mordazas neumáticas fue de 20 mm y la velocidad de movimiento vertical de la mordaza superior fue de 50 mm/min (figura 2.2). Las determinaciones experimentales fueron realizadas a partir de nueve replicados. A partir de los datos de fuerza (F, N) versus desplazamiento (D, mm), se calculó el esfuerzo (σ = F/A, siendo A la sección de las muestras; MPa); y la deformación (ε = D/L0, siendo L0 la longitud inicial de las muestras), parámetros que permitieron obtener las curvas de esfuerzo (MPa) versus deformación. De ellas se pudo calcular el esfuerzo a ruptura (σr ) y la deformación a ruptura (εr ). El Módulo Elástico (Ec, MPa) fue evaluado a partir de la zona inicial de la curva de esfuerzo verdadero (σT = σ (1+ ε)) versus deformación verdadera (εT = Ln [L / L0]; siendo L = D + L0). Para ello se ajustaron los datos a la siguiente ecuación exponencial (Chillo y col, 2008):

( ) =  Ec ⋅ ε  T  ⋅ exp (− ε  T  ⋅ K )

σ  T  ε  T 

donde K es una constante de ajuste del modelo.

60

2.5

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS

Figura 2.2: Mordazas neumáticas utilizadas en los ensayos de tracción de las películas

2.3.7 Permeabilidad al vapor de agua (PVA)

La permeabilidad al vapor de agua de las películas fue determinada gravimétricamente, a 25ºC, adaptando el procedimiento recomendado por la norma ASTM E96-00 (2000). Para realizar el ensayo de permeabilidad se utilizaron celdas de acrílico con las siguientes dimensiones: 4,4 cm de diámetro interno, 8,4 cm de diámetro externo, resultando en un área expuesta de 15,205 cm2. La profundidad de las celdas fue de 3,5 cm (figura 2.3) y las películas se colocaron entre el cuerpo principal de la celda y su tapa.

b)

a)

Figura 2.3: Celda de acrílico, a) Vista frontal y b) Vista superior

.

61

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS Las celdas conteniendo CaCl2 (Anedra, Argentina) en su interior, y manteniendo un espacio de cabeza de 10 mm entre el desecante y la película, poseían una presión parcial de vapor de agua ≅ 0 Pa. La hermeticidad del cierre de las celdas, se aseguró aplicando grasa de vacío a las planchas de goma adheridas en la tapa y el cuerpo principal de la celda, así como mediante cuatro tornillos equidistantes. La celda fue ubicada en una cámara de humedad y temperatura controlada (Ibertest, España) ajustada a 25ºC y 70% de H.R. (presión parcial de vapor de agua ≅  2288 Pa). Luego de, aproximadamente, 12 horas se alcanzó el estado estacionario y se comenzaron a registrar los incrementos de peso de las celdas. Se registró el cambio de peso dos veces al día (9 y 17 horas) durante tres días. Utilizando un ajuste por regresión lineal de los datos de variación de peso versus el tiempo, se calculó la velocidad de trasmisión de vapor de agua (VTVA) según la ecuación 2.6:

VTVA =

G t ×

2.6

donde G es el cambio de peso del material en gramos, t   es el tiempo trascurrido en horas y A es el área de película expuesta en m2. Luego, se obtuvo la permeabilidad al vapor de agua utilizando las ecuaciones 2.7 y 2.8:

 P ´=

VTVA

2.7

∆ p

donde  P ’ es la permeanza,  ∆p  es la diferencia de presión de vapor de agua en la cámara y VTVA es la velocidad de trasmisión de vapor de agua.

 PVA = P ´×e

62

2.8

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS donde  PVA  es la permeabilidad al vapor de agua,  P’   es la permeanza y e es el espesor del material. Para dichos cálculos se determinó el espesor de las películas utilizando un espesímetro digital (Mitutoyo, Japón). Una vez obtenido el valor de PVA, se efectuó la corrección recomendada por Gennadios y col, (1994). Todos los ensayos fueron realizados, al menos, por triplicado.

2.4

������� ���������������

2.4.1 Preparación del inóculo

El microorganismos utilizado fue Zygosaccharomyces bailii (NRRL 7256), levadura deteriorativa conocida por su resistencia a varios factores de estrés (descenso de pH, depresión de aw, etc) de acuerdo a Sofos (2000). El inóculo de  Zygosaccharomyces bailii  NRRL 7256 fue preparado transfiriendo una ansada de la cepa pura a tubos conteniendo 10 ml de caldo Saboureaud (Biokar, Francia) de composición glucosa (40g/l); extracto de levaduras (10g/l) y peptona de carne (10g/l). El caldo inoculado se incubó con agitación a 25°C durante 24 horas, resultando dicho tiempo suficiente para que el cultivo alcanzase la fase estacionaria. El recuento del inóculo inicial fue de, aproximadamente, 106 UFC/ml.

2.4.2 Recuento de células viables

Se determinó la viabilidad de las células por recuento en placa aplicando siembra en superficie y rastrillado sobre agar Saboureaud (Biokar, Francia). Las placas fueron luego incubadas a 25ºC por 5 días.

63

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS Las colonias formadas se informan como el número de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) o como el número de unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/g), según corresponda. La siembra en superficie se realizó con 0,1ml del inóculo y para cada una de las diluciones evaluadas.

2.4.3 Ensayo de zona de inhibición

Con el objeto de evaluar la capacidad de migración del antimicrobiano y su actividad como tal, se implementó el ensayo de zona de inhibición. Para la realización del ensayo, 15 ml del medio de cultivo se dispensaron en placa. Sobre cada placa se colocó 1ml del inóculo, se distribuyó el mismo y se retiró el excedente. El sistema se secó en estufa a 7ºC. Posteriormente, discos de película de 1cm de diámetro de cada uno de los sistemas estudiados (con y sin antimicrobiano), se colocaron en contacto con el agar en forma estéril y se almacenaron 48 hs a 7ºC. Luego, se incubaron a 25ºC durante 24 hs. El efecto antimicrobiano se determinó observando la existencia de zonas de inhibición en el área de contacto, así como alrededor de los discos. Se informa el diámetro (cm) de la zona de inhibición observada.

2.4.4 Ensayo de barrera antimicrobiana

Con el objeto de estudiar la capacidad de las películas conteniendo antimicrobianos (sorbato de potasio y carvacrol) para prevenir la contaminación externa, se prepararon  placas de Petri de 9 cm de diámetro esterilizadas y conteniendo 8ml de agar Saboureaud; el aw  del medio se deprimió a un valor de 0.980 mediante la adición de glucosa y el pH se ajustó a 4,5 con ácido cítrico (5,2 mol/L) para simular un alimento modelo de aw  y pH controlado. Se apoyaron discos de 1cm de diámetro de películas con y sin antimicrobianos, cortados y pesados asépticamente, sobre el medio. A continuación, los discos se sembraron 64

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS con 10 µl de un inóculo de Z. bailii conteniendo, aproximadamente, 6,5x106 UFC / ml y se incubó los sistemas a 25 °C, durante 48 h. A tiempos seleccionados, se tomaron muestras de tres discos y cada uno de ellos fue suspendido en 1 ml de agua peptona (Biokar Diagnóstico, Francia) contenida en tubos de vidrio (16 x 100 mm). Los microorganismos fueron resuspendidos mediante agitación durante 2 minutos a 2500 RPM con un Vórtex (Ika Works Inc., USA). A continuación, se  prepararon diluciones seriadas en agua peptona para el recuento de células viables como se explicó más arriba, siendo expresado dicho recuento como UFC/g de película. Las determinaciones se realizaron por triplicado.

2.5  �������� �����������

Para evaluar la influencia de la concentración de antimicrobianos tanto en las  propiedades físicas como antimicrobianas, se trabajó a partir de la metodología de superficie de respuesta (RSM), la cual es un conjunto de técnicas matemáticas y estadísticas  para el modelado y análisis de situaciones en las cuales existe interés en una o varias respuestas que se encuentran influenciadas por varias variables, siendo el objetivo la optimización de dichas respuestas. Para la obtención de los datos experimentales, se utilizó un diseño compuesto central (DCC) en relación a la concentración de sorbato de potasio (0,250-0,350%) y de carvacrol (0,100-1,000%). Los niveles codificados de sorbato de potasio y de carvacrol y sus correspondientes concentraciones, se informan en la tabla 2.2.

65

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 2.2: Niveles de codificación y concentraciones correspondientes de sorbato de potasio y de carvacrol utilizadas en el diseño experimental 2 (Influencia de la concentración de antimicrobianos) Nivel

Sorbato de potasio (%)

Carvacrol (%)

-2

0,250

0,100

-1

0,275

0,325

0

0,300

0,550

1

0,325

0,775

2

0,350

1,000

El punto central del diseño (0,0) se repitió tres veces para evaluar la reproducibilidad del método. El efecto de las dos variables independientes en las propiedades de las películas se modeló utilizando una ecuación de segundo orden:

Y = β 0 + β 1 X 1 + β 2 X 2 + β 11 X 2 1 + β22X2 2 + β12X1X2

2.9

en la cual Y es el valor de la respuesta para cada parámetro ensayado, X 1 es el nivel de sorbato de potasio y X2 es el nivel de carvacrol, β0 es un valor constante que indica la altura del hiperplano, β1 y β2 son los coeficientes de los términos lineales, β11 y β22 son los coeficientes de los términos de segundo grado y β12  es el coeficiente del término de interacción. El ajuste de los datos experimentales al modelo permitió calcular los coeficientes correspondientes a cada término de la ecuación. Se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) a fin de determinar la adecuidad de la ecuación (1) a través de los estadísticos R 2 (coeficiente de determinación) y p (falta de ajuste). Para el ajuste del modelo, determinación de superficies de respuesta y optimización de la formulación de las películas, fue utilizado el utilitario Statgraphics Plus para

66

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS Windows, versión 3.0, 1997 (Manugistics, Inc., U.S.A). Para otros cálculos estadísticos se usó el mismo utilitario.

67

CAPÍTULO 3: ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

3

 �������� � ��������� �� ����������

3.1

���������� �� ��� ����������� �� �������

3.1.1 Propiedades físico-químicas

�������

�������������� �� ����� �

Los cuatro principales tipos de patrones de difracción de los almidones nativos son: A, B, C y V, como se mencionó previamente (Liu, 2005). En general, los almidones de tubérculos presentan una estructura cristalina tipo B. Estos diferentes arreglos cristalinos  pueden ser evaluados por difracción de rayos X. El análisis de cristalinidad de este trabajo reveló una estructura de carácter  predominantemente amorfo en las películas, tanto aquéllas que fueron sometidas a baja velocidad de emulsificación o cizalla (películas BC, 6500 rpm) como las realizadas a alta velocidad de emulsificación o cizalla (películas AC, 21500 rpm). No se observaron (figura 3.1), en ambos casos, picos agudos característicos del almidón nativo en el patrón de difracción de rayos X. Se concluye entonces que la cristalinidad de las películas no estaría influenciada por la velocidad de emulsificación utilizada sino que dependería de la composición del sistema (almidón, HPMC, glicerol, KS y carvacrol) y del proceso de obtención de las películas que involucra la gelatinización del almidón. Flores y col. (2007a), en películas de almidón con y sin sorbato de potasio y diferentes métodos de  preparación, observaron que las películas sin sorbato de potasio mostraron una mayor cristalinidad, que se evidenció en el patrón de difracción de rayos X por presentar mayor cantidad de picos agudos y una estructura cristalina tipo B-V probablemente debido a la  presencia de glicerol. Sin embargo las películas con sorbato de potasio no presentaron estos  picos, por el efecto plastificante ejercido por el antimicrobiano y el impedimento al desarrollo de cristalización durante la retrogradación, por interactuar el sorbato con las 68

CAPÍTULO 3: ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS cadenas poliméricas, dificultando su alineación y/o por que podría interferir en el empaquetamiento de la amilosa. Los perfiles de rayos X informados por Flores y col. (2007a) en presencia de sorbato son análogos a los observados en el presente trabajo. Por otra parte, Espinel (2009) usando concentraciones semejantes a las de este trabajo de almidón, HPMC, glicerol y KS también informó una característica amorfa de las matrices comestibles obtenidas.

600 ��

500

��    )  . 400    A  .    U    (    d   a 300    d    i   s   n   e    t   n    I 200

100 0 3

6

9

12

15

18

21

24

27

30

2θ

Figura 3.1: Perfiles de rayos X para sistemas emulsionados a baja cizalla (BC) y alta cizalla (AC)

3.1.1.2 Color

La tabla 3.1, resume los parámetros de color (L*,a*,b*,YI, ∆E y CI) de las películas correspondientes a los sistemas BC (baja cizalla, 6500 rpm) y AC (alta cizalla, 21500 rpm). Salvo en el caso de CI, los parámetros de color estudiados presentaron diferencias significativas entre ambas muestras lo que nos permite realizar algunas afirmaciones: Parámetro L*: Se puede observar en la tabla 3.1 que la muestra AC, presentó un valor levemente mayor al de la muestra BC, siendo ambos valores cercanos a 100 (máxima luminosidad), lo cual es deseable ya que implica que las películas permitieron visualizar el fondo blanco contra el cual fueron apoyadas durante la medición y, por lo tanto, se infiere 69

CAPÍTULO 3: ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS que las características visuales de un alimento que haya sido recubierto con estas películas no sufrirá modificaciones. Parámetro a*: En el estudio de este parámetro encontramos que ambos sistemas  presentaron magnitudes negativas de pequeño modulo. Ello corresponde a una componente de color ligeramente verde no apreciable visualmente. El módulo de a* para las películas AC fue menor que para las BC. Parámetro b*: en ambos sistemas este parámetro presentó valores entre 3,5-4, indicando un color ligeramente amarillo. Las películas AC presentaron un valor ligeramente menor de este parámetro. Pará metro YI: Este parámetro confirma el punto anterior, dado que las películas a las que se le aplicó mayor velocidad de emulsificación (AC) presentaron un menor valor de YI. Parámetro ∆E: El valor de ∆E se utiliza para estudiar la similitud de color respecto al patrón (placa blanca). El valor más pequeño (2,7) correspondió a las películas AC, mostrando así que estas películas fueron las más parecidas al valor patrón. CI: El índice de color calculado indica que el color de ambas películas se encuentra en el rango entre verde oscuro (-20) y amarillo verdoso (-2). Estos valores están dentro del rango de las películas estudiadas por Murillo-Martínez y col. (2010) en base a proteínas y  polisacáridos y también conformadas a partir de emulsiones.

Tabla 3.1: Parámetros de color para sistemas emulsionados a baja cizalla (BC) y alta cizalla (AC) Parámetros de Color Sistema

L*

a*

b*

YI

∆E

CI

BC

88,9 ± 0,3

-1,48 ± 0,05

4,0 ± 0,2

7,0 ± 0,3

3,4 ± 0,3

-4,2 ± 0,3 a

AC

89,5 ± 0,3

-1,32 ± 0,03

3,5 ± 0,1

6,1 ± 0,2

2,7 ± 0,3

-4,2 ± 0,2 a

Letras iguales en la misma columna indican ausencia de diferencias significativas (p