Terminado Glucosa Isomerasa

 

 

 

INDICE

 

INTRODUCCION

 

 

I.

JUSTIFICACION

 

II.

MARCO TEORICO 2.1.

ENZIMA GLUCOSA ISOMERASA 2.1.1. Historia El proceso puramente químico de la isomerización de glucosa a fructosa con catalizadores técnicos a altos valores de pH fue un fracaso. Se forman productos colaterales coloreados oscuros y de mal sabor, cuya separación sería demasiado cara. En 1957 se descubrió la xilosa isomerasa, que aparte de xilosa a xilulosa también puede isomerizar glucosa a fructosa. Puesto que la actividad

colateral

representa

una

variante

intersante

económicamente, al enzima se denomina hoy principalmente glucosa isomerasa. La glucosa isomerasa es una enzima intracelular y se origina a partir de microorganismos diferen diferentes, tes, por ejemplo, de Streptomyces.

En 1960 se patentó en Estados Unidos el correspondiente proceso enzimático. En 1966, unos investigadores japoneses en la ciudad de Chiba describieron un proceso industrial que utiliza la glucosa isomerasa soluble. En el proceso de isomerización de la glucosa se obtiene como producto una mezcla de glucosa y fructosa. Esta mezcla puede usarse en lugar de la sacarosa cristalina como jarabe, puesto que su capacidad edulcorante es muy grande.

En Estados Unidos, la Clinton Corn Procesing Company empezó en 1967 la producción de jarabe de glucosa-fructosa mediante una glucosa isomerasa soluble. Este jarabe contenía inicialmente, sin embargo, sólo un 15% de fructosa. Además, pronto quedó claro que el proceso de la glucosa isomerasa sólo puede ser rentable económicamente económicam ente sólo si se utiliza de nuevo la cara enzima. Por surte, la glucosa isomerasa es una enzima ideal para la inmovilización. Es estable a altas temperaturas, y puesto que tanto el sustrato (glucosa) como el producto (fructosa) son moléculas muy pequeñas, hay pocos problemas de difusión si la enzima inmovilizada se empaqueta en columnas. Las moléculas de glucosa y fructosa no llevan carga eléctrica, por lo que la glucosa isomerasa podría unirse a un derivado

 

de celulosa cargado como material portador; de lo contrario, el sustrato y el producto “permanecerían pegados" electrostáticamente

al portador. En 1968 la Clinton Corn Procesing Company llevó a cabo un proceso discontinuo con una enzima inmovilizada, que liberó un 42% de fructosa. En 1972 consiguió desarrollar un sistema que trabaja continuamente con glucosa isomerasa inmovilizada. inmovilizada. Esta próspera solución tecnológica por sí sola no bastaba, sin embargo, para el reconocimiento del procedimiento era decisiva la situación del mercado. En los años 1960 el precio del azúcar era de 15 a 20 centavos por kilogramo. El jarabe de fructosa no podía producirse más barato en ningún caso. En ese momento prevalecían también las desventajas del proceso enzimático. Además de la fuerza de los prejuicios, era importante un acercamiento a la industria: se tuvo que desarrollar un sistema complicado de filtros de presión y un aparato para la separación del metal pesado cobalto, que se utilizó como estabilizador estabilizad or de la enzima. Pero en noviembre de 1974 aumentó el precio del azúcar a 1 dólar y 25 centavos el kilogramo. El proceso de la isomerasa se hizo muy atractivo de la noche a la mañana. Al mismo tiempo, la compañía danesa Novo Industry A/S inmovilizó un preparado de glucosa isomerasa que era más batato, sin adición de cobalto y soportando la presión en grandes reactores industriales, por lo que no era nada raro encontrarlos en columnas de siete metros de altura. En 1976, solamente en Estados Unidos se produjeron 750 t de glucosa isomerasa y con ellas 800000 t de jarabe de fructosa al 42%. Puesto que el precio del azúcar a finales de 1976 cayó de nuevo a 15 centavos por kilogramo, se estableció y se impulsó el nuevo proceso ya exitoso. El jarabe de fructosa al 42% se produjo a precios menores que la sacarosa. En 1978 se dio otro paso adelante. Mediante los nuevos procedimientos de separación se obtuvo un

 

 jarabe de de fructosa al 55%. Era solam solamente ente un 15 a 25% más caro qu que e el jarabe al 42%. Para bebidas ácidas, como la Coca-Cola (valor de pH de 4.0), fue necesario un jarabe con al menos un 55% de fructosa f ructosa para remplazar a la sacarosa. Con ello tuvo éxito en un mercado importante el aumento masivo del jarabe de fructosa.  Actualmente, la producci producción ón mundial asciende a aproximada aproximadamente mente 100000 toneladas de glucosa isomerasa al año. Se producen nueve a diez millones de toneladas de jarabe de fructosa. En Estados Unidos se prefiere utilizar jarabe de fructosa en las bebidas. La glucosa isomerasa hoy se obtiene e inmoviliza sobre todo a partir de Streptomyces. Para ello se presentan principalmente las células

bacterianas muertas, que aún está completamente intacta. A menudo se conectan unas con otras en una red mediante glutaraldialdehído glutaraldial dehído y así se estabiliza. Enormemente interesante es la fructosa para productores de alimentos: se capta más rápido que otros azucares y por tanto es ideal para bebidas deportivas. Aumenta el sabor a fruta y también a chocolate, y enmascara el gusto amargo de las sustancias sustitutas del azúcar. La fructosa reduce el punto de congelación en los helados y así los hace más blandos, más cremosos y agradablemente “sabrosos”. De acuerdo con las pruebas clínicas, los diabéticos

pueden controlar su nivel de glucosa mucho mejor con alimentos que contienen fructosa que con los que contienen sacarosa o almidón. 2.1.2. Descripcion La isomerasa de glucosa es una enzima que cataliza la reacción de isomerización de D-glucosa a D-fructosa; D-xilosa a D-xilulosa, respectivamente. La primera reacción in vitro, mientras que la segunda reacción ocurre in vivo (Bhosale et al.,1996). Los ejemplos de microorganismos productores de indicaciones geográficas y sus rendimientos se presentan en Cuadro 2.1. Dado que la enzima realiza la reacción de isomerización de glucosa a fructosa,se ha utilizado para la producción de JMAF (Antrim, et al., 1979; Rehm y Reed, 1982).

 

La producción de JMAF se realiza en tres pasos. En primer lugar, la amilasa se utiliza para almidón licuado. En segundo lugar, el almidón está

esconcariado

por

amiloglucosidasa

y

una

enzima

desmbrantadora.. Finalmente, usando GI, la glucosa se convierte en desmbrantadora fructosa. Producto obtenido al final de estos pasos es un jarabe de maíz con un endulzado considerablecapacidad superior a la sacarosa (Bhosale et al., 1996). La producción de JMAF es el área de uso más dominante de la indicación geográfica. 107toneladas de JMAF esproducidos utilizando indicaciones geográficas inmovilizadas al año. DuPont Industrial Biosciences (anteriormenteGenencor) y Novozymes A/S son los principales productores de isomerasa de glucosa inmovilizados(DiCosimo inmoviliz ados(DiCosimo et al., 2013).  Figura 1. Reacciones Reacciones enzimáticas enzimáticas catalizadas catalizadas por GI.

 Fuente: Las indicaciones indicaciones geográficas geográficas también también se utilizan para la producción producción de etanol al mejorar la conversión conversión de azúcares de biomasa celulósica (Wang et al., 1980-a; Chandrakant y Bisaria, 2000).

Cuando la hemicelulosa de la biomasa celulósica se despolimeriza, azúcares de pentosa como la D-xilosa que no pueden ser utilizados por levaduras comunes se producen (Wang et al., 1980-b). En 1980, se utilizaron diferentes formas de isomerasis de glucosa para convertir D-xilosa a Dxilulosa y la fermentación de D-xilulosa a etanol se logró utilizando Schizosaccharomyces pombe y Kluyveromyces lactis (Wang et al., 1980-a).

 

La caracterización de GI fue lograda por Marshall y Kooi por primera vez en 1957 con enzima isomerizante D-glucosa obtenida de Pseudomonas hydrophila. Eso se dijo que la enzima utiliza D-xilosa como sustrato, pero también fue capaz de utilizar D-glucosa como una alternativa con un valor de 160 veces mayor Km. En el proceso de producción de GI, se requería utilizar medios que contenían xilosa y la reacción se logró con el arsenato.

2.1.3. Temperatur Temperatura a y pH óptimos

La Glucosa Isomerasa tiene una temperatura óptima que oscila entre 60 y 80°C, que aumenta en presencia de cobalto (Blacklow, et al. 1988). Enzimas obtenidas de terófilos como Streptomyces spp., Bacillus

spp.,

Actinoplanes

Thermustermosulfurogenes

exhiben

missouriensis mayor

estabilidad

y a

temperaturas más altas que los mesófilos como Lactobacillus y Escherichia spp. PH óptimo de GI oscila entre 7.0-9.0 (Bhosale et al., 1996).

2.1.4. Estudios sobr sobre e el Me Mecanismo canismo de Reacción y los Si Sitios tios Activos

Se creía que el mecanismo catalítico de la isomerasa de xilosa implicaba catálisis de base general dirigida por histidina (Carrell et al., 1989). Posteriormente se evaluo los estudios cristaltodopicos de rayos X de enzimas (Henrick et al., 1989; Farberet al., 1989; Collyer and Blow, 1990; Collyer et al., 1990) obtenidos de Arthrobacter o Streptomyces y propiedades bioquímicas de las enzimas termofílicas expresada por el gen xilosa mutageneizado dirigido por el sitio que se obtuvo de Clostridium thermosulfurogenes, se sugirió un mecanismo alternativo (Lee, etal., 1990-a).Xylose issomerasa (XI) convierte aldosas en cetosa en tres pasos (Figura 2.3) (Kovalevsky et al., 2010). El primer paso incluye la unión enzimática desustrato y la abertura del anillo del sustrato. El segundo paso es la isomerizació n del sustrato que se cree que procede por el mecanismo isomerización de cambio de hidruro asistido por iones metálicos.

 

Finalmente se produce el cierre y liberación del anillo del producto (Henrick et al., 1989; Farber etal., 1989; Collyer and Blow, 1990; Collyer et al., 1990; Lee, et al., 1990-a). en lugar dede la reacción de apertura del anillo, el paso determinante de la velocidad es el paso de isomerización (Lee, et al.,1990-a). Dado que la diferencia entre Dglucosa y D-xilosa es causada por un CH 2OH en la posición C-6 en la configuración atómica, este grupo adicional es que se cree que es la razón de las diferencias en la afinidad de sustrato entre la glucosa y xilosa (Mengshiaoet al., 1991).

 Figura 2. Reacción de interconversión interconversión de D-glucosa D-glucosa a D-fructosa. D-fructosa. (1) apertura del anillo (2)isomerización (3) cierre del anillo

 Fuente: (Kovalevsky (Kovalevsky et al., 2010). 2010).

2.1.5. Estructura de la isomerasa de glucosa Dependiendo del microorganismo, las Glucosas Isomerasas varían de 44 a 191 kDa en peso molecular y tienen dos o cuatro sub unidades unidas por bonos no covalentes. En algunos casos también se producen, forma de recorte de IG (Chauthaiwale et al., 1984). Glucosa isomerasa obtenida de Thermus thermopilus es un homotador que consta de cuatro subunidades idénticas (monómero). Una subunidad de GI tiene 387 aminoácidos en el 44000 Da (Dekker, 1991). (1994) declaró que las estructur estructura a de los tetrámeros y el dimer estaban activos, mientras que la forma monómero de la enzima Inactivo. La estructura 3D de la isomerasa de xilosa obtenida de Thermus thermophilus es figura 3. Hay dos dominios en los

 

monómeros de la estructura tetramrica. Cada monómero consta de diez -hebras, 16 -hélices y cinco 310 hélices.

Dominio I (residuos 1 a 321) se pliega como contactos de 8 barriles y de dominio II (residuos 322 a 387) Dominio I (Chang et al., 1999).La enzima se activa mediante la formación de homotésmeros seguida de dos enlaces ion a cada sitio activo de cuatro monómeros (Janis et al., 2008). Uso de cristalografía de rayos X junto con la técnica de difracción de neutrones, sitios vinculantes de IG obtenidos de Streptomyces rubiginosus fue examinado por Kovalevsky et al. (2010). Requisito de dos cationes metálicos divalentes de GI para actividad y los sitios relacionados fueron nombrados de acuerdo a su afinidad con los iones. El sitio metálico que tenía afinidad con los iones Mg+2, Mn+2, Co+2, Cd+2 y Pb +2 fue llamado M1; mientras que el sitio de metal que mostró una afinidad más amplia por los iones divalentes fue llamado M2. El sitio activo de unión de metales de la IG nativa se presenta en la Figura 4 (Kovalev ( Kovalevsky sky et al., 2010).

 Figura 3. Estructura 3D de la xilosa isomerasa obtenida de Thermus thermophilus. Las cadenas de proteínas se colorean desde el terminal N hasta el terminal C usando un gradiente de color del arco iris (espectral).

 Fuente: (Kovalevsky (Kovalevsky et et al., 2010)

 

 

Figura 4. El El sitio activo de unión de metales de la IG nativa

 Fuente: (Kovalevsky (Kovalevsky et et al., 2010).

2.1.6. PROPIEDADES DE LA ENZIMA GLUCOSA ISOMERASA Las propiedades enzimáticas y fisicoquímicas de la GI provienen de varios organismos que han sido ampliamente estudiados. El conocimiento de las propiedades específicas de la enzima, como su estabilidad, la especificidad del sustrato y el requisito de iones metálicos es importante para evitar su inactivación y evaluar su idoneidad para la aplicación en la producción de HFCS. E s pe pecifi cifi cida cidad d de sus tra tratto

La capacidad de la enzima para isomerizar una amplia variedad de sustratos tales como pentosas, hexosas, alcoholes de azúcar y fosfatos f osfatos de azúcar, fueron investigado investigados. s.  Aunque la especifici especificidad dad hacia el sustrato de la enzima de diferentes fuentes cambia; la enzima fue capaz de utilizar Dribosa, L-arabinosa, L-ramnosa, D-alosa y 2-desoxiglucosa, así como sustratos más comunes, D-glucosa y D-xilosa. La isomerización máxima se obtuvo con los sustratos que tienen grupos hidroxilo en los carbonos 3 y 4 en la posición ecuatorial, como la glucosa y xilosa. La relación de conversión

 

D-glucosa a D-fructosa catalizada por GI de varios organismos en forma soluble o inmovilizada estaban en el rango de 26 a 59%. Los valores de K m de la enzima para Dglucosa y D-xilosa estaba en el rango de 0.086 a 0.920 M, y 0.005 a 0,093 M, respectiva respectivamente. mente. Requisito de iones metálicos e inhibidores GI requiere un catión divalente como Mg2+, Co+2 o Mn2+, o una combinación de estos cationes, para una actividad máxima.  Aunque tanto Mg2+  como Co+2  son esenciales para la actividad, juegan roles diferentes. Mientras que Mg 2+  es superior a Co+2  como activador, Co+2  es responsable de la estabilización de la enzima para realizar la conformación ordenada, especialmente la estructura cuaternaria de la enzima. Ligandos de iones metálicos directos en GI de Bacillus coagulans. Se ha reportado de la presencia de cuatro iones de Co+2  por cada tetrámero de GI de Streptomyces griseofuscus. La actividad catalítica de GI fue inhibida por metales tales como Ag+1, Hg+2, Cu+2, Zn+2  y Ni +2 y, en cierta medida, por Ca+2. Otros inhibidores conocidos de GI son xilitol, arabitol, sorbitol, manitol, lyxose y Tris. E s tructura de s ubunida ubunidad d

Las constantes de sedimentación y los pesos moleculares de GI varían de 7.55 a 11.45 y de 52,000 a 191,000, respectivamente. La estructura de la subunidad y la composición de aminoácidos de GI revelan que es un tetrámero o un dímero de similar o idénticas subunidades asociadas con enlaces no covalentes y carece de enlaces disulfuro entre cadenas. El IG extracelular del Bacillus sp., es un trímero. Se ha reportado la existencia de isoenzimas de GI de Streptomyces phaechromogenes.

Las

isoenzimas

difieren

en

sus

aminoácidos N-terminal y en los patrones peptídicos de la asimilación asimilació n con tripsina, Achromobacter proteasa I y bromuro de cianógeno. Cada una de las isoenzimas eran un tetrámero de subunidades no idénticas.

 

El efecto de los desnaturaliza desnaturalizantes ntes como la urea, el clorhidrato de guanidina, dodecil sulfato de sodio y calor sobre la actividad de GI de Arthrobacter y Streptomyces spp. fueron investigados. La disociación y el desarrollo del GI tetramérico de Streptomyces sp. cepa NCIM 2730 reveló que el tetrámero y el dímero son las especies activas mientras que el monómero es inactivo. La aparición de un intermediario parecido a un glóbulo fundido en el camino plegable del GI se demostró por primera vez. La estructura terciaria intacta en lugar de la estructura secundaria es responsable de la actividad biológica de GI.

 Fig. 5 Mecanismo Mecanismo de acción acción de IG. (a) cis-Enediol. cis-Enediol. (b) Transferenc Transferencia ia de  protones. (c) Cambio de hidruro. Las cajas indican los átomos de hidrógeno que se transfieren estereoespecíficamen estereoespecíficamente. te.  

 Fuente: (MICROBIOLOG (MICROBIOLOGICAL ICAL REVIEWS REVIEWS (1996))

 

Temperatur Temperat ura a y pH óptimos

La temperatura óptima de GI varía de 60 a 80°C y aumenta en presencia de Co2+. El rango de pH óptimo de IG, generalmente está entre pH 7.0 y 9.0. La enzima de Lactobacillus brevis tiene un pH óptimo más bajo (entre 6 y 7), que es deseable para aplicaciones comerciales de IG. Las enzimas de Streptomyces spp., Bacillus spp., Actinoplanes missouriensis, missouriensi s, y Thermus thermosulfurogen thermosulfurogenes es son estables a altas temperaturas, pero la de Lactobacillus y Escherichia spp. son menos estables. E s tu tudio dio d de e s itios act activos ivos

Las identidades de los aminoácidos involucrados en o cerca del sitio activo del GI se descifró con modificadores químicos específicos del grupo y por cristalografía de rayos X. Evidencia de histidina esencial y se han presentado residuos de carboxilato en GI. El entorno estructural del aminoácido funcional ha sido determinado por modificación química y posterior mapeo de péptidos diferenciales en el GI. Se reconoce que el GI cataliza la isomerización de la glucosa, así como de la xilosa. Sin embargo, si las reacciones ocurren en el mismo sitio o en dos sitios diferentes no se conocía. La presencia de un único sitio activo para la isomerización de glucosa y xilosa se demostró usando un método de cinética de reacción.

2.1.7. ISOMERIZACION ENZIMATICA VERSUS ISOMERIZACION QUIMICA La conversión química de glucosa en fructosa se conoce desde hace 100 años y constituye una de las reacciones colectivas conocidas como la transformación Lobry de Bruyn Alberda van Ekenstein. Estas reacciones generalmente se llevan a cabo a pH y temperatura elevados. La posibilidad de producir fructosa químicamente a partir de glucosa ha sido estudiada por Barker et al. (12) La reacción es inespecífica y conduce a la formación de azúcares no metabolizables como la psicosa y otros productos coloreados indeseables. Es difícil

 

alcanzar una concentración de fructosa de más del 40% por este método.  Además, la fructosa producid producida a quí químicamente micamente tiene sabores y d dulzura ulzura reducida, que no se puede remediar fácilmente. Por lo tanto, no se puede usar comercialmente. Por otro lado, la conversión enzimática de glucosa en fructosa ofrece varias ventajas, como (i) especificidad de la reacción, (ii) requerimiento de condiciones ambientales de pH y temperatura, y (iii) no formación de productos secundarios. Por lo tanto, se prefiere la conversión enzimática a la isomerización química de glucosa a fructosa, y hoy el proceso que involucra IG ha experimentado una expansión considerable en el mercado industrial.

2.1.8. IMPORTANCIA DE LA GLUCOSA ISOMERASA

La gIucosa isomerasa (Sweetzyme) sirve como un modelo interesante para estudiar relaciones de estructura y función mediante técnicas avanzadas de ingeniería bioquímica y genética.  Además de su importancia académica académica,, ha recibido una mayor atención por parte de las industrias por su uso en la producción de JMAF y por su posible aplicación en la producción de etanol a partir de hemicelul hemicelulosas. osas.

2.1.9. ORGANISMOS DE FUENTE La enzima glucosa isomerasa está ampliamente distribuido en procariotas procariot as

(Tabla 1). Después de su descubrimie descubrimiento nto en

Pseudomonas hydrophila, se descubrió que una gran cantidad de bacterias y actinomicetos producen IG que está activo en ausencia de arseniato. Entre las bacterias del ácido heterolactico, Lactobacillus brevis produjo el mayor rendimiento de enzima. La enzima era activa a pH bajo pero inestable a alta temperatura y por lo tanto no era adecuada para la explotación económica. Los informes sobre la secreción extracelular de GI no son comunes. Se ha informado que el GI extracelular es producido por Streptomyces

 

glaucescens y S. flavogriseus , por lo que la lliberación iberación de la enzima enzima de las células se atribuyó a un cambio en la permeabilidad de la pared celular y la lisis parcial de las células. Las xilosa isomerasas extracelulares extracelu lares de Chainia sp. y un Bacillus sp. Alcalotérm Alcalotérmico. ico. se han purificado hasta la homogeneidad mediante técnicas de purificación convencionales tales como filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y electroforesis en gel de poliacrilamida preparativa. Además de Streptomyces spp., Varias especies de Bacillus son buenos productores de IG. Se ha documentado la aparición de IG en algunas levaduras como Candida utilis y Candida boidinii . Aspergillus oryzae es el único hongo que posee actividad gastrointestinal. Se ha informado de la existencia de IG en la malta de cebada

y el germen de trigo . Los organismos que son

comercialmente importantes como productores de IG se enumeran en la Tabla 2. Dado que GI es un tema de gran importancia comercial, gran parte de la información sobre nuevos organismos productores y procesos desarrollados se encuentra en forma de patentes. TABLA 1. ORGANISMOS PRODUCTORAS DE GLUCOSA AMILASA

ESPECIES  Actinomycess olivocinereus,  Actinomyce olivocinereus, A. phaechromogenes phaechromogenes  Actinoplanes missouriensis missouriensis  Aerobacterr aerogenes, A. clocacae,  Aerobacte clocacae, A. levanicum levanicum  Arthrobacter spp.  Bacillus stearothermophilus, stearothermophilus, B. megabacterium megabacterium,, B. coagulans  Bifidobacterium spp.  Brevibacterium incertian, B. pentosoaminoacidicum  Brevibacterium pentosoaminoacidicum Chainia spp. Corynebacterium Corynebacte rium helvolum  Flavobacterium  Flavobacter ium arborescens, arborescens, F. devorans devorans  Lactobacilius brevis, brevis, L. buchneri, buchneri, L. fermenti, fermenti, L. mannitopoeus, L. gayonii, gayonii,  L. plantarum, L. pentosus pentosus  Luconostoc mesenteroides mesenteroides  Microbispora rosea rosea  Microellobosporia  Microellobospor ia flavea  Micromonopora coerula coerula  Mycobacterium  Mycobacter ium spp.  Nocardia asteroids. asteroids. N. corallia, N dassonvillei. dassonvillei.  Paracolabacterium  Paracolabacte rium aerogenoides aerogenoides  Pseudonocardia  Pseudonocard ia spp.  Pseudomonas hydrophila Sarcina spp.

 

 

Staphylococcus biblia, S. flavovirens, S. echinatus Staphylococcus Streptococcuss achromogenes, S. phaeochromogenes, Streptococcu phaeochromogenes, S. fracliae, f racliae, S. reseochromogenes, S. olivaceus. Streptomyces olivochromogenes, S. venezaelie, S. wedmorensis Streptosporangium algum, S. oulgare Thermopolyspora Thermopolysp ora spp. Thermus spp.  Xanthomonas spp. spp.  Zymonomas mobilis mobilis  Fuente: SNEHALATA H. (1996). Molecular and Industrial Aspects of Glucose  Isomerase.

TABLA 2. PRODUCTORES COMERCIALES DE GI ORGANISMO

  Actinoplanes Missousriensis



  Bacilus coagulans

NOMBRE COMERCIAL

FABRICANTE

Maxazyme

Gist Brocades and  Anheuser-Busch Inc.

Sweetzyme a  Optisweet

Novo- Nordisk b  Miles Kali-Chemie

Spezyme Swetase

Reynolds Tobacco Miles Laboratories Inc.



  Streptomyces rubiginosus



  Streptomyces Phaechromogenes



  Arthrobacter sp.



  Streptomyces olivaceus



a: Organismo más usado industrialmente  b: Empresa más más conocida

 Fuente: SNEHALATA SNEHALATA H. (1996). Molecular Molecular and Industrial Aspects Aspects of Glucose Glucose Isomerase. Isomerase. 

 

2.1.10. PRODUCCION PRODUCCION DE GLUCOSA ISOMERASA El costo de producción de la enzima es un factor importante en la evaluación de su idoneidad para la aplicación industrial. Se han realizado intensos esfuerzos para optimizar los parámetros de fermentación para la producción de IG con el fin de desarrollar tecnología económicamente viable. La investigación se centra en tres aspectos principales: (1) mejora de los rendimientos de GI, (2) optimización del medio de fermentación con especial referencia al reemplazo de xilosa por un sustituto más barato y la eliminación del requerimiento de iones Co2+, y (3) inmovilización inmoviliz ación de la enzima. Mejora del rendimiento

Los rendimientos de GI de varios organismos productores potentes -1

se enumeran en la Tabla 3; oscilan entre 1,000 y 35,000 U.litro . Se logró una mejora adicional en el rendimiento y las propiedades de la enzima mediante la mejora de la cepa, usando mutagénesis convencional convencion al o tecnología de ADN recombinante. Varias cepas de importancia comercial fueron sometidas a mutagénesis para producir niveles elevados de enzima o para la producción constitutiva de enzima. Se obtuvo un aumento del 60% en el nivel de enzima mutagenizando Streptomyces wedmorensis con etilenimina y N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina. La irradiación UV de Streptomyces olivochromogenes dio como resultado una cepa mutante con un 70% de actividad incrementada. Se obtuvo un mutante constitutivo de Bacillus coagulans con el doble de actividad del progenitor seleccionando los mutantes en función de su resistencia a la 2-desoxiglucosa. Lee ha informado sobre dos mutantes constitutivos de mayor rendimiento que muestran sus mayores rendimientos en lactosa, y uno de ellos muestra una mayor actividad en glucosa que en xilosa. Se aisló una serie de mutantes constitutivos y de alto rendimiento GI mediante la aplicación de múltiples irradiaciones UV a Streptomyces acidodurans. Uno de los mutantes producidos por la mutagénesis de metanosulfonato de etilo produjo 1.500 U ml21 cuando se cultivó solo con glucosa, mientras

 

que el progenitor produjo 10 U ml21 en condiciones similares. La mejora de la cepa por manipulación genética se describe en una sección posterior.

TABLA 3. Producción de GI por diferentes organismos

Condiciones Óptimas Temp (°C) pH

Organismo

Rendimiento (U/litro)

  Actinoplanes missouriensis

2,500 –  35.200

75

7.0

  Bacillus licheniformis

10,500

70

NA a 

  Streptomuces wedmorensis

560 - 2500

70

7.2

4,800 –  11,440

60

7.5







  Streptomyces olivochromogenes



a: No aclarado Fuente: SNEHALATA H. (1996). Molecular and Industrial Aspects of Glucose Isomerase.

Optimización

del

medio

de

fermentación 

El IG generalmente se produce por fermentación aireada sumergida. La optimización del medio de fermentación se ha estudiado ampliamente con el fin de desarrollar una tecnología de fermentación económicamente económicamen te viable para la producción de IG.

 

Los esfuerzos de investigación se dirigieron principalmente a: el reemplazo de xilosa por otro inductor económico; evaluación del efecto de fuentes de nitrógeno más baratas en el rendimiento de la enzima; optimización del pH y la temperatura para la producción máxima de enzimas; y sustitución de iones Co2+  por otros iones metálicos divalentes en el medio de fermentación. No existe una composición concreta de medio para la mejor producción de la enzima a partir de diferentes microorganismos. Cada organismo o cepa requiere sus propias condiciones especiales para

la

producción

máxima

de

enzimas.

Inmovilizacion de la glucosa isomerasa

En relación con la enzima nativa, la glucosa isomerasa inmovilizada tiene muchas ventajas tales como una mejor termoestabilidad, reducción de costos debido a la reutilización de enzimas y proceso continuo en producción industrial. El mayor mercado para IG fue por su forma inmovilizada (Bhosale et al., 1996). Desde la inmovilización de glucosa Se desarrolló la isomerasa (Takasaki, 1965), la técnica de inmovilización gastrointestinal ha sido un tema de gran interés. Varios métodos para inmovilizar GI han sido descritos. Se han utilizado varios materiales de soporte para diferentes niveles de glucosa isomerasas. Se utilizaron diferentes agentes químicos para reticular covalentemente materiales de soporte con enzima o enzimas entre sí (Antrim, 1979; Muller-Schulte, 1990; Pawar, 1994; Schafhauser, 1992).  Además de la inmovil inmovilización ización de enzimas libres de células, la inmovilización de células enteras es otra forma importante de GI inmovilizado. Debido a que GI es una enzima intracelular, la inmovilización de células enteras puede ser la mejor manera de utilizar GI con reducción de costo y menos daño enzimático.

 

Sin embargo, la inmovilización de células enteras tiene un menor carga enzimática que la inmovilización enzimática libre de células que resulta en una menor productividad en producción industrial.  Algunas propiedad propiedades es bio bioquímicas químicas de GI pueden cambiar después de la inmovilización, como cambio óptimo de pH, aumento de la temperatura de reacción y mejor termoestabilidad. termoestabilidad. 2.1.11. APLICACIONES APLICACIONES DE LA ENZIMA GLUCOSA ISOMERASA Producción de jarabe de maíz alto en fructosa

El desarrollo del mercado en la producción de HFCS fue marcado por una aceptación gradual de HFCS y del HFCS enriquecido (55% de fructosa) como sustitutos de la sacarosa por los productores de refrescos. La materia prima más común utilizada para la producción de HFCS en los Estados Unidos es la maicena fabricada por el proceso de molienda húmeda. La producción de HFCS a partir de almidón comprende tres procesos principales: (i) licuefacción de almidón por α-amilasa, (ii) sacarificación del

almidón por la acción combinada de amiloglucosidasa y una enzima desramificadora, y (iii) isomerización de glucosa por GI. El producto final es un jarabe de maíz que contiene una mezcla de glucosa y fructosa y por lo tanto con mayor capacidad edulcorante que la de sacarosa. Otras fuentes de almidón como el trigo, la tapioca y el arroz se utilizan para menor extensión en otras partes del mundo. Los subproductos de la industria de molienda de maíz es importante para decidir la economía de la producción de HFCS. El consumo mundial anual Se estima que el HFCS alcanzó los 10 millones de toneladas (peso seco) en 1995 (deRaadt et al., 1994). En la actualidad, el HFCS es casi por completo el reemplazó de la sacarosa en los Estados Unidos, y solo una moderada tasa de crecimiento (3 a 4%) se espera, en su producción a nivel mundial.

 

Ventajas del jarabe de maíz alto en fructosa como edulcorante

La creciente demanda de azúcar refinada, junto con su alto costo de producción y conocimiento de los efectos adversos de sacarosa e invertir el consumo de azúcar en la salud humana, requirió la búsqueda de sustitutos aceptables de la sacarosa. Una gran cantidad de edulcorantes artificial no clorhidrato y no carbohidrato, como sacarina, ciclamato, acesulfamo-K, aspartamo, y thaumatin han sido descubiertos y descartados sobre la base de problemas de salud u otros inconvenientes. Incorporación de aspartamo en refrescos los hace menos dulces después de un almacenamiento prolongado, porque el aspartamo se hidroliza lentamente a pH bajo. La taumatina, un edulcorante proteico ideal, es 2,000 veces más dulce que la sacarosa pero tiene un sabor distintivo y desagradable sabor. HFCS, una mezcla de equilibrio de glucosa y fructosa (1: 1) es 1.3 veces más dulce que la sacarosa y 1.7 veces más dulce que la glucosa, la capacidad edulcorante de la glucosa es del 70 al 75% que el de la sacarosa, mientras que la fructosa es dos veces más dulce que la sacarosa (Barker, 1976). El HFCS se fabrica a partir de una sustancia totalmente no dulce, llamada almidón. El precio del HFCS es 10 a 20% más bajo que la sacarosa sobre la base de su poder edulcorante. La industria alimentaria prefiere el HFCS, ya que no plantea el problema de la cristalización como es el caso de la sacarosa. Además, la D-fructosa juega un papel importante como edulcorante diabético. porque solo es reabsorbido lentamente por el estómago y no influye en el nivel de glucosa en sangre. Los principales usos de Los HFCS se encuentran en bebidas, repostería, conservas e industrias de confitería. Enriquecimiento de fructosa

La principal aplicación de JMAF es el endulzamiento de bebidas. Una concentración de 55% de JMAF coincide con la dulzura de sacarosa y permite una sustitución del 100%. Su precio es del 10 al 20%. más bajo que el precio de la sacarosa,

 

basado en el poder edulcorante. UN 42% de concentración de JMAF se utiliza en la cocción, lácteos e industrias de confitería y para preparar conservas, mermeladas, gelatina y salsa de tomate. Sin embargo, su aplicación en estas industrias está limitado por algunos de los inconvenientes inherentes al JMAF; su naturaleza higroscópica y viscosa, tendencia al oscurecimiento e incapacidad para cristalizar. En los procesos comerciales, 42% de fructosa generalmente se produce en la mezcla de equilibrio; esta necesita ser enriquecido para sus principales aplicaciones. El método más reciente para enriquecer fructosa implica la complejación de fructosa mediante la adición de compuestos de borato durante la isomerización isomerizaci ón (Takasaki, 1971). El grado de enriquecimi enriquecimiento ento dependía de la concentración de glucosa y la cantidad de borato añadido. Este método resultó en la producción de  jarabes que contenían contenían 80% de fructosa. Sin embargo, el costo de remoción y recuperación de borato evitó el éxito económico de este proceso. La conversión completa más directo de glucosa a fructosa siempre ha sido el sueño de las industrias de molienda y refinación de maíz. Otra ruta para aumentar el rendimiento de fructosa usando Dglucose era producir una concentración de equilibrio sobre impulso transitorio de productos (Schray, 1971). Otro enfoque para producir 55% de fructosa es aumentar la temperatura de isomerización a más de 70°C (Antrim, 1979) conduce a un aumento en la concentración de JMAF en un 50% o más. Las exclusiones moleculares resinosas han sido usadas para aumentar la concentración de fructosa. Un jarabe que contiene más del 90% de fructosa se obtuvo formando complejos de fructosa-oxianionicas con germanate. Las técnicas de cromatográfica moderna con resinas de intercambio iónico son las mejores para separando fructosa de glucosa. Un jarabe que contiene 95% de fructosa está en el mercado en Francia y se vende en forma cristalina.

Disminución del pH de isomerización

 

El pH óptimo para la isomerización está entre 7.0 y 9.0. La actividad de la enzima disminuye rápidamente a valores de pH más bajos. El pH bajo es preferible por la estabilidad del monosacárido y para la compatibilidad del proceso con sacarificación de almidón por α-amilasa. La materia prima

más común utilizado para la producción de JMAF es almidón de maíz fabricado por molienda húmeda de maíz. Licuefacción y sacarificación del almidón implica la participación de α-amilasa, glucoamilasa y enzima de

desramificación, las cuales tienen un pH óptimo en el rango de 4.5 a 6.2, mientras que para la isomerasa está entre pH 7.0 y 8.0. Un gran ahorro en costos será posible si los dos procesos pueden realizarse simultáneamente al mismo pH en un solo reactor. La isomerización a pH bajo es ventajosa porque reduce la formación de los compuestos carbonílicos coloreados en temperaturas más altas y pueden conducir a menores costos de intercambio iónico y purificación de carbono. El IG de Thermus aquaticus, es activo a pH 3.5 y está completamente activo a pH 5.5. El término "proceso uni-pH" implica un proceso en el que la licuefacción, sacarificación e isomerización

son

llevados

a

cabo

al

mismo

pH,

preferiblemente a un pH de 4.5 a 5.0, que es el pH óptimo para amilasa y amiloglucosidasa. La presencia de Ca+2 es un requisito previo para la acción de la amilasa mientras que Ca+2 es un inhibidor de GI. La glucosa isomerasa estable al ácido son resistentes a la inhibición por Ca+2 son útiles en un proceso uni-pH. Una IG de un Thermoanaerobacter sp. fue caracterizado con vistas a desarrollar un proceso de un solo paso para producción de edulcorantes. La combinación de sacarificación e isomerización es un desarrollo ideal en el progreso de la producción de JMAF, y es probable que esté en funcionamiento una vez que sea estable al ácido, termoestable, y tolerante a Ca2+. Estas especificaciones se encontrarán ya sea por cribado o por ingeniería de proteínas de las existentes enzimas utilizadas para la producción comercial de JMAF.