tempeh

UNIVERSIDADE FEDERAL DE TOCANTINS

PRODUÇÃO DE TEMPEH ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO

Mauren Cristine Agustini da Silveira

Gurupi-2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DE TOCANTINS

PRODUÇÃO DE TEMPEH ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO

Trabalho acadêmico da disciplina Processos Fermentativos ministrada pelo professor Sidnei Borgignon no 5º Período do curso Engenharia de Biotecnologia e Bioprocessos na Universidade Federal de Tocantins Campus Gurupi, Tocantins

Mauren Cristine Agustini da Silveira

Gurupi, 2011

Resumo

Os processos fermentativos são explorados a fim de otimizar sistemas de produção de vários produtos biológicos que poderiam ser obtidos por reações químicas e/ou físicas de alto custo e tempo. Além disso, alguns produtos, como enzimas, só poderiam ser conseguidos isoladamente na sua forma reativa através da fermentação por microrganismos. A fermentação em estado sólido é amplamente usada por reaproveitar resíduos industriais, ter necessidade de pouca água, reduzida produção de dejetos, menor custo na produção de metabólitos por quantidade produzida, diminuir o espaço operacional e o índice de contaminação devido à baixa umidade. O tipo de fermentador no caso de substratos sólidos dependerá do microrganismo a ser usado. E o microrganismo a ser escolhido depende do produto que se quer obter. Mas como a umidade na fermentação sólida é baixa, os fungos filamentosos crescem com mais facilidade, pois bactérias são inibidas quando a atividade da água é inferior a 0,95 e os fungos filamentosos e leveduras podem crescer a uma atividade de água de aproximadamente 0,7. Neste trabalho será explanado o processo de obtenção de Tempeh; um alimento originalmente indonésio a base de soja fermentada por  Rhizopus oligosporus,

que mantém as isoflavonas da soja, biotransforma antibióticos e permite que

algumas poucas bactérias contaminantes produzam por associação pequenas quantidades de vitamina B12, protegendo o organismo contra oxidantes, diarréias, doenças crônicas degenerativas, aumentando a digestabilidade, prevenindo contra o câncer e adicionando nutrientes essenciais. No final, será proposto um modelo experimental laboratorial para a produção de Tempeh a partir da FES.

Fermentação em Estado Sólido

A fermentação em estado sólido é também chamada de: fermentação em substrato sólido, em meio semi-sólido ou fermentação semi-sólida (FES, FSS, FMS).

Todo processo fermentativo que envolva substrato sólido na ausência de água livre, mas em quantidade suficiente o bastante para garantir a manutenção da cultura de microrganismos dentro ou sobre esse substrato que pode ser apenas a base para aderência de microrganismos ou o próprio meio nutricional é um processo fermentativo em estado sólido. Este processo se dá na presença de oxigênio, podendo ser controlada a sua entrada e saída, assim como a pressão atmosférica e a umidade. Qualquer microrganismo poderá ser usado para este tipo de fermentação, porém, sabe-se que fungos filamentosos são mais adaptáveis a baixa atividade da água (0,7) que bactérias (acima de 0,95). A maioria dos artigos publicados com relação à FES está em escala de laboratório. Isso porque o escalonamento do processo para indústria requer planejamento do controle e monitoração das variáveis do sistema. Com uma quantidade de água reduzida há baixa condutividade térmica e baixa capacidade térmica do ar o que impossibilita a remoção ideal de calor produzida pelo crescimento do microrganismo. Um exemplo observado foi o da ol igosporus em caracterização de diferentes biorreatores em escala industrial para o Rhizopus oligosporus

farelo de soja que demonstrou um gradiente de temperatura de 3ºC.cm o que pode impedir seu crescimento podendo até causar sua morte (NETO et al., 2009). Apesar destas dificuldades, o custo da produção em FES tem demonstrado ser até três vezes menores que em Fermentação Submersa como no caso da produção do etanol de segunda geração a partir da celulose. Hoje em dia o uso da FES é utilizada em escala industrial no Japão para a produção do Koji, Sake e Miso. Esta técnica foi sendo aperfeiçoada desde a utilização de bambus para a modelagem até a utilização de microprocessadores e sensores eletrônicos. Também no Japão há produção em média escala de pectinases pela FES que está sendo copiada pelos EUA e Cuba. E a França está modernizando sua produção sobre pectinases e queijos pela FES. No quadro abaixo há uma comparação entre uso da FES e uso da Fermentação em Substrato Líquido.

FATOR

Fermentação em Substrato Líquido

Fermentação em Substrato Sólido

Substratos

Substratos solúveis (açúcares)

Substratos de polímeros insolúveis ou sólidos

Condições assépticas

Esterilização e controle asséptico por calor

Tratamento por vapor, sem condições assépticas

Água

Alto volume de água consumido e efluente

Limitado consume de água. Baixa atividade de água. Sem efluentes

Metabolismo

Fácil controle de temperatura

Baixa capacidade de transferência de calor

Aeração(O2)

Limitação de O2 solúvel. Requer alto nível de ar.

Fácil aeração e alta superfície de troca entre ar e substrato

Controle de pH

Fácil controle de pH

Aspersão no substrato sólido

Agitação mecânica

Boa homogeneização

Preferencialmente condição estática

Escalonamento

Equipamentos industriais disponívies

Ainda precisa de engenheiros e designers de equipamentos

Inoculação

Fácil inoculação, processo contínuo

Inoculação por esporos, batelada

Contaminação

Risco de contaminação por algumas bactérias

Risco de contaminação baixa por fungos

Consideração energética

Alta energia consumida

Baixa energia consumida

Volume de equipamentos

Grande volume e grande custo em tecnologia

Pequeno volume e pequeno custo em equipamentos

Efluente e poluição

Alto volume de poluição de efluentes

Não há efluentes, poluição baixa

Concentração sobre produto

30-80 g/l

100/300 g/l

(Raimbault, Laboratoire de Biotechnologie Microbienne Tropicale, France, 1988)

Substratos de fermentação em estado sólido

Os substratos utilizados na fermentação sólida têm duas funções: suporte para os microrganismos e fonte de nutriente. Na maioria das FES o substrato é o suporte e a fonte de nutriente. Como exemplo pode-se citar o Tempeh, em que se utilizam os grãos de soja que serão parcialmente usados pelo  Rhizopus oligosporus para seu crescimento e biotransformação de antibióticos e vitaminas. Um exemplo de suporte é a produção de esporos pelo  Aspergillus niger  usando o sabugo de milho como suporte e tendo como nutriente a solução de sacarose que umedece o sabugo. Os substratos devem ter características físicas que aumentem o rendimento do processo. Sabe-se que quanto maior a área de contato entre o microrganismo, nutrientes, ar e a água, mais rápida e mais completa será a biotransformação. Portanto, substratos que apresentem porosidade maior ou que sejam mais particulados (granulometria) são melhores. Conforme o microrganismo vai crescendo ao redor do substrato, transformando-o, absorvendo-o e eventualmente ocorrendo morte de parte de sua divisão, vai se formando uma massa a que se dá o nome de biomassa. Quando o substrato é o suporte no processo FES, a biomassa é tão intrinsecamente ligada ao substrato que é impossível separá-los para uma análise profunda sem comprometer o produto final. Uma forma de caracterizar a biomassa usando fungos filamentosos é envolver o substrato com um filtro de membrana e retirar o micélio após seu crescimento para verificar seu peso. Este método só é usado para calibrar indiretamente a determinação da biomassa, não podendo ser usado na FES, pois compromete a produção requerida (RAIMBRAULT, 1988).

Medida da biomassa através do metabolismo

RESPIRAÇÃO O consumo de oxigênio e liberação do gás carbônico é decorrente da respiração aeróbica do microrganismo que deriva diretamente proporcional ao seu crescimento dentro do meio.

Portanto essa atividade metabólica pode ser usada para estimar a síntese da biomassa. Como os compostos de carbono são metabolizados durante a fermentação, são convertidos em biomassa e dióxido de carbono. Durante a formação da biomassa a tendência é a taxa do dióxido de carbono diminuir. A soma da biomassa produzida pela unidade de gás metabolizado é constante durante a fermentação. Abaixo está o gráfico da cinética da evolução de CO2 e O2 durante o crescimento de  Rhizopus em Cassava (RAIMBAULT, 1988).

PRODUÇÃO ENZIMÁTICA EXTRACELULAR OU METABOLISMO PRIMÁRIO Esta atividade metabólica pode ser associada ao crescimento da biomassa. Vários estudos têm demonstrado que a quantidade de produção enzimática de certas enzimas está diretamente proporcional à formação da biomassa. Como exemplo, temos a produção da alfa amilase pelo  Aspergillus oryzae

(OKAZAKI, 1980), lactase pelo  Agaricus bisporus (WOOD,1979) e

ácidos orgânicos (cítrico, fumárico, acético e lático) pelo Rhizopus (SOCCOL,1992).

Medida da biomassa através de componentes específicos

PROTEÍNAS A maior parte da biomassa é constituída por proteínas. Ao longo do crescimento da biomassa o valor das proteínas é constante (RAIMBAULT et al., 1980). ÁCIDOS NUCLEICOS A produção de ácidos nucléicos aumenta até a estabilização do crescimento da biomassa. Este procedimento para determinação da biomassa pode ser feito apenas em substratos que não tiverem ácidos nucléicos dispersos no meio (BAIRACHARYA E MUDGETT, 1980).

GLUCOSAMINA A glucosamina está presente na parede celular de muitos fungos. Este método não pode ser usado se houver glucosamina no substrato. Os fungos contem entre 67 e 126 mg de glucosamina por g de biomassa (SHARMA et al., 1977).

ERGOSTEROL Existe uma relação diretamente proporcional entre a quantidade de glucosamina e ergosterol, que é o esteróide fúngico. Obviamente, ergosterol é um fator de crescimento fúngico que faz com que as paredes das hifas continuem crescendo. Quando não existe ergosterol, o crescimento do fungo é inibido (RAIMBAULT, 1998).

MEDIDA FÍSICA DA BIOMASSA

Condutividade Elétrica

Existe uma diferença na condutividade elétrica entre o substrato e a biomassa. Essa diferença se dá pela troca de íons entre o meio do substrato e o crescimento da biomassa. Há uma correlação entre a pressão da água superficial e a produção de proteínas (PEÑALOZA, 1991).

Temperatura e Calor Transferido A cada Mol de CO2 produzido pela oxidação de carboidratos são emitidos 673 Kcal. O substrato sólido tem uma capacidade de transferência de calor limitada. A geração do calor está diretamente proporcional a produção de CO2 que é proporcional a formação da biomassa. (RAIMBAULT, 1980).

Controle do pH e Risco de Contaminação A FES promove mudanças constantes do meio pela assimilação dos nutrientes de acordo com o microrganismo utilizado. Uma destas mudanças é o pH que oscila dependendo da secreção de ácidos orgânicos ou hidrólise da uréia, por exemplo. Aspergillus,  Rhizopus e Penicillium sp.

costumam deixar o meio com pH em torno de 3.0. Já Trichoderma, Sporotrichum e

Pleurotus sp.

costumam deixar o meio entre 4.0 e 5.0. O pH pode ser controlado usando

diferentes concentrações de sal de amônia e uréia sobre o substrato. No substrato Cassava usando Aspergillus niger , foi possível observar a variação de pH de acordo com a assimilação de substâncias. Nos primeiros estágios o pH aumenta assim que a uréia foi hidrolisada. Nos próximos estágios de crescimento rápido o pH diminui com o aumento da taxa de assimilação da amônia e volta a aumentar na fase de crescimento estacionário (RAIMBAULT, 1980).

Oxigenação A aeração da FES é importante em quatro processos: I Manter a condição aeróbica II Liberação do dióxido de carbono III Regular a temperatura do substrato

IV Regular a umidade Como em FES o substrato e o microrganismo estão diretamente em contato com o ar, há uma facilidade em controlar a indução da reação metabólica pela mudança de temperatura, calor desprendido e umidade. Todo o comportamento bioquímico ou metabólico pode ser alterado através da mudança de oxigenação da FES (AURIA et al., 1990; SAUCEDO-CASTAÑEDA et al., 1990). 1990).

Medida da Atividade da Água A atividade da água é um fator limitante na contaminação e indicador da manutenção do metabolismo. Há muitas maneiras de se observar a atividade da água durante a FES: diretamente por manometria, medida relativa da umidade, medida da pressão capilar, medida da pressão osmótica e calorimetria (GUILBERT, 1988).

As características bioquímicas do substrato determinam qual o produto final como observado na tabela abaixo.

Materiais

Produção de

Celulose, hemicelulose e lignina

Compostos orgânicos

Farelo e palha de trigo, farinha e farelo de soja, farinha de mandioca, palha e quirera de arroz, melaço e bagaço de cana

Enzimas

Sorgo, polpa de beterraba, grits de milho, bagaço de maça, de uva, quirera de arroz, melaço de cana

Álcool

Resíduos de banana, farinha, resíduos sólidos do processamento de mandioca, espiga de milho, bagaço de laranja, cana-de-açúcar, bagaço de cana, melaço, vinhaça, farelo e palha de trigo, grão-de-bico, beterraba, polpa de café, polpa de batata doce, arroz cozido e folha de maple

Enriquecimento protéico

Bagaço de cana, água de maceração de milho, lactose, sacarose e farelo de trigo

Antibióticos

Grãos de milho, alfafa e aveia, grãos de sorgo, soja, trigo, amendoim, milho e arroz

Verificação de produção de toxinas

Farelo de trigo, beterraba, bagaço de cana e melaço

Ácidos orgânicos

Soja (hamanatto, tempeh, miso, natto, shoyu), pasta de amendoim (ontjom), peixe (katsuobushi) e mandioca (gari, kokonte, lafun) Sacarose, polpa de beterraba e grãos de argila

Alimentos e condimentos orientais e africanos

Cinética de processos (Diaz, Universidade Federal de Pelotas)

As macromoléculas celulose, pectina, lignocelulose e fibras conferem a propriedade sólida ao substrato. Como fonte de energia tem-se o carbono, açúcares, ácidos orgânicos e lipídeos que serão absorvidos e convertidos pelos microrganismos. Os substratos amiláceos (arroz, trigo, centeio, cevada, milho, mandioca) são fermentados entre 25 e 60% de umidade inicial e os substratos celulósicos (palhas, cascas, bagaço, farelos) podem ter uma umidade inicial de 60 a 80% sem que haja água livre (SOCCOL, 1992). A umidade relativa depende do nível máximo de retenção de água do substrato ou suporte (LONSANE et al., 1985) suportando também pressões osmóticas elevadas (BEUCHAT, 1983). Leveduras e bactérias não suportam estes meios. A FES é constituída por um meio trifásico: (sólido-líquido-gasoso). Neste meio, a fase sólida está intrinsecamente ligada à fase líquida. A água pode estar ligada fracamente ao sólido ou sendo adsorvida pelo sólido. A fase sólida é então constituída pelo suporte, pela água que fornece os nutrientes e pela fonte de energia. A essa fase podem ser adicionadas vitaminas, sais e mais fontes de carbono dependendo da exigência do microrganismo ou do metabolismo que proporciona o produto. A fonte de carbono são polímeros vegetais de alto peso molecular. A degradação dessas macromoléculas necessita da síntese de várias enzimas pelos fungos filamentosos (amilases, celulases, pectinases, xilanases, cafeinases, proteases) (SOCCOL, 1992). Para os microrganismos terem o acesso aos nutrientes de forma mais rápida, os substratos são previamente tratados física e quimicamente. Os tratamentos podem ser: esterilização para diminuir ou eliminar possíveis contaminantes; esmagamento, moagem, quebra ou peneiramento, dependendo da técnica e produto requerido; embebição para regular o teor de umidade inicial; vaporização ou aquecimento para a água penetrar no substrato; hidrólise ácida ou alcalina para facilitar a ação enzimática; adição de agente sequestrante para retirada de íons metálicos que podem diminuir o rendimento do processo; suplementação de nutrientes e correção do pH para adequar às condições de crescimento do microrganismo (DIAZ, UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS). Quanto à esterilidade do processo em FES, o próprio meio em que se vai realizar a técnica faz com que haja uma seleção natural dos microrganismos, impedindo ou limitando contaminantes. Sendo assim, ao fazer a esterilização do substrato, a correção do pH e a

manutenção da temperatura e umidade ideais bastam para impedir contaminantes (PANDEY et al., 2000). O maior problema encontrado no escalonamento ou reprodução de um mesmo processo é o da heterogeneidade do substrato. Essa heterogeneidade pode ser por várias razões: não uniformidade da estrutura do substrato, variabilidade entre as bateladas de substratos, dificultando a reprodutibilidade do processo ou dificuldade da mistura da massa sólida na fermentação que compacta o substrato fazendo com que haja crescimento desproporcional de microrganismos, gradientes diferentes de temperatura, pH e misturas. Tudo isto impossibilita a obtenção de amostras representativas (RAIMBAULT, 1988). A maior parte de processos de FES é empregada na produção de alimentos fermentados

Produto

Microorganismo

Materiais

Natto

Bacillus natto 

Soja

Tempeh

Rhizopus oligosporus 

Soja

Queijo

Penicillium roqueforti 

Trigo

Massa de pão

Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus sanfrancisco 

Trigo

Saquê

Aspergillus oryzae, A. kawachii 

Arroz, cevada

Missô

A. oryzae 

Soja, arroz

Shoyu

A. sojae 

Soja, trigo (Diaz, Universidade Federal de Pelotas)

Como pode ser observado na tabela acima os produtos obtidos dependem tanto do substrato utilizado como do microrganismo.

Microrganismos utilizados em FES

Os meios sólidos são imitações do habitah dos fungos filamentosos (solo). Seus desenvolvimentos se dão pelas hifas aéreas ramificadas. Fungos filamentosos são facilmente adaptáveis e manipuláveis (COSTA, 1996). Eles produzem diversos tipos de enzimas e várias cepas distintas podem produzir a mesma enzima (PANDEY, 1992). Fungos são organismos eucarióticos não fotossintéticos que, com algumas exceções, possuem parede celular. Podem ser unicelulares ou multicelulares e macroscópicos. Todos os fungos se nutrem através da absorção. Fungos multicelulares microscópicos são os filamentosos e os unicelulares microscópicos são as leveduras. A reprodução dos fungos se dá pelos esporos que na presença de água, absorve, aumenta de tamanho e forma um tubo germinal que se alonga na extremidade distal formando as hifas. Estas hifas vão se ramificar formando micélio. Parte das hifas penetra no substrato digerindo-o e absorvendo-o. Essa parte do micélio é chamada de vegetatitvo. A parte que se estende para o ar é chamada de reprodutiva e produz os esporos. Cada espécie tem no micélio reprodutivo características diferentes que permitem sua identificação. Os esporos podem estar contidos numa membrana ou livres. Quando estão contidos numa membrana são chamados de esporangiósporos. Quando nascem livres são os conidiósporos. Altos valores de atividade da água favorecem a germinação de esporos e crescimento micelial, enquanto valores baixos estimulam a esporulação (PANDEY, 1992).

Evolution of the specific growth rate ( ) and of the germination time ( ) as a function of the initial water activity of the medium (RAIMBAULT, 1980).

Fungos filamentosos produzem hifas septadas ou cenocíticas. Nos fungos com parede celular há produção de hifas septadas que podem conter dentro de cada septo um núcleo ou vários núcleos. Nos fungos sem parede celular o protoplasma corre livremente nos filamentos formados pelas hifas, que são denominados então de cenocíticas (NEDER, 1992).

Fungo do gênero  Rhizopus

São fungos considerados verdadeiros do filo Eumycophyta e grupo dos ficomicetos. Apresentam hifas não septadas, bolor negro na parte superior e crescem melhor a temperatura de 35ºC. Fungos deste gênero produzem em FES trinta e cinco vezes mais enzima

amiloglucosidade que em FS. Também é usado para produção de Tempeh, proteases, ácidos (L) + lático e fumárico, pectinases (SOCCOL, 1994) e enzimas amilolíticas (SPIER, 2005). As hifas do micélio fúngico penetram na parede celular da soja liberando enzimas hidrolíticas que quebram as moléculas grandes em menores e passam a ser absorvidas pelas hifas como nutriente (SUNDBERG et al., 1976).

Durante essa hidrólise são quebrados também substâncias que poderiam causar danos ao organismo como o tanino e a cafeína. Rhizopus tem a capacidade de degradar 87% de cafeína e 65% de tanino (PANDEY et al., 2000).  Rhizopus

são responsáveis pela produção de glicosamina e ergosterol. O ergosterol foi

encontrado em micélios de Rhizopus em FES na proporção de 2-24 microgramas por mg de biomassa, dependendo da condição da cultura, aeração e composição do substrato (NOUT et al., 1987). Além do hormônio liberado pelo fungo, há a manutenção do fitormonio da soja, a isoflavona, que é degradada apenas uma parte insignificativa de sua concentração na soja durante o processo de fabricação do tempeh. A isoflavona tem uma semelhança muito próxima ao estrogênio humano, reconhecidamente preventivo contra o câncer.

Por outro lado, o gênero Rhizopus sob FES em soja deixa de produzir a enzima fitase após 72 horas de incubação e temperatura superior a 37ºC. Com isso é liberado no meio o ácido fítico que é tóxico tanto ao fungo quanto ao organismo humano, dando ao produto formado uma coloração amarelada o que indica que está impróprio para o consumo (MORENO et al., 1999).

Fermentadores

Praticamente todos os estudos em FES usam sistema em batelada onde o meio é adicionado ao reator ocorrendo a inoculação do substrato e a incubação por um determinado período de tempo. O produto pode ser extraído com água, solução tampão ou solvente ou secando-se e armazenando diretamente. Mas na obtenção de ácido cítrico é usado o processo semicontínuo, na obtenção do ácido giberélico é usado o processo por batelada alimentada e para obtenção de enzimas fúngicas é usado o processo contínuo. Ao nível laboratorial são usados frascos de Fernbach, Roux, Erlenmeyer. Mesmo a indústria usa o frasco de Fernbach para produção de esporos. Ao nível médio ou industrial o uso das bandejas de Koji é escolhido pela facilidade de contato como ar, manuseio e economia de espaço. Podem ser empilhadas deixando um espaço entre elas para o crescimento do micélio e a passagem do ar forçada, ou não. As bandejas ainda podem ser perfuradas para melhorar a troca de gases.

As esteiras rolantes são grandes esteiras perfuradas que se movimentam num sistema onde são inoculadas e passam por um período de incubação com ar úmido circulante num sistema semi-automático. É uma variação das bandejas de Koji onde o manuseio é limitado. Os tanques circulares são rotatórios e tem 7 metros de diâmetro com um agitador helicoidal dentro de uma câmara com condições de temperatura e pressão controladas. A cada batelada podem processar de 2 a 3 toneladas de meio de cultura. Todo processo é automático. No tambor rotativo há uma variedade no número de pás internas e a esterilização do substrato e seu resfriamento é realizado diretamente dentro do tambor. A rotação pode variar de 1 a 180 rpm. O fermentador tipo coluna é muito usado em pesquisas tendo uma capacidade de 8 a 10 kg de cultura por batelada. Tem de 2 a 40 cm de diâmetro por 20 a180 cm de altura.

Tempeh

O Tempeh é um alimento feito de soja fermentada inoculado inicialmente por fungos do gênero  Aspergillus na China. A mais antiga publicação sobre o Tempeh data do século XVI pelo povo Javanês. Na Indonésia passou-se a processar o Tempeh, mas como o clima é diferente, eles adaptaram a fabricação com a inoculação de  Rhizopus oligosporus ou  R. oryzae.

Seu processamento é por fermentação em estado sólido. Seguindo este conceito, primeiro deve-se quebrar os grãos para aumentar a superfície de contato entre os esporos, o ar e a água, depois fazer a assepsia dos grãos de soja no ácido acético 0,9 mol a um pH 3.1 por 16 horas a 25ºC. Cozidas a 90ºC por 30 minutos, arrefecidas a 25ºC e guardados em sacos de poliestireno perfurado (15X15 cm). Os esporos de  Rhizopus oligosporus são inoculados a uma taxa de 1x109 esporos/L e os sacos inoculados são incubados incubados a 32-34ºCpor 32-34ºC por até 50 horas (REYES-MORENO et al., 2004). A temperatura da FES aumenta muito durante o processo, por isso aconselha-se diminuir a temperatura de incubação após a 12º hora para 28-30ºC, caso contrário o meio poderá chegar a 38ºC que é inviável para o fungo cultivado. Isso pode ser exemplificado no gráfico abaixo.

O resultado é uma massa carnuda, branca, com parte dos grãos de soja visíveis com gosto que lembra o de castanhas. Neste caso, os sacos plásticos perfurados imitam as bandejas, em escala menor. Com a fermentação da soja pelo  Rhizopus as alterações metabólicas na soja podem ser pesquisadas. Muitos fatores anti nutricionais são eliminados da soja crua e outros componentes são acrescidos, como observado nas tabelas abaixo.

(Journal of American Science. Abou-Arab, 2011)

O ácido fítico é produzido quando a temperatura excede a ideal e quando o meio passa a ficar saturado pelo pH com o tempo. Ocorre então a inibição da fitase e o ácido é liberado para o meio. Ele dá ao Tempeh uma coloração amarelada e os povos orientais gostam mais do gosto deste Tempeh tardio do que do fresco. Por ser tóxico ao organismo o procedimento de deixar o Tempeh mais dois dias na estufa foi proibido por lei na Indonésia, mas em vários lugares há a produção clandestina do produto

Alterações de nitrogênio e proteínas na semente crua, durante o processo e no produto (tempeh)

(Journal of American Science. Abou-Arab, 2011)

Alterações no pH, densidade, absorção de água e solubilidade na semente crua, durante o processo e no produto (tempeh)

(Journal of American Science. Abou-Arab, 2011) WAI = Weight of sediment -------------------------Weight of dry solids WSI % = Weight of dissolved solids in supernatant X 100 -----------------------------------------------Weight of dry solids

Alterações nas concentrações de aminoácidos na semente crua, durante o processo e no produto (tempeh)

(Journal of American Science. Abou-Arab, 2011)

(Journal of American Science. Abou-Arab, 2011) Amino acid score (%) = mg of *EAA in 1 g of test protein X 100 ------------------------------------------mg of EAA in 1 g of **reference protein * Essential amino acids ** EAA (1985) FAO/WHO

Conclusão

O processo FES tem vantagens econômicas e ambientais sobre outros processos de biotransformação por usar uma quantidade de água reduzida e minimizar a quantidade de dejetos, diminuída taxa de contaminação, reduzido custo sobre quantidade produzida. Apesar destas vantagens, o processo esbarra na dificuldade da obtenção de dados gráficos para o escalonamento. Estes dados são baseados em previsão de temperatura, pH, umidade, absorção de água, solubilidade. O motivo é que como o processo usa pouca água, pouco calor é transferido e não há homogeneidade do meio. Para a produção de tempeh o processo mostra-se útil por agregar valor nutricional a um alimento e ao mesmo tempo conservar compostos benéficos e eliminar os compostos tóxicos.

Proposta de produção de tempeh em laboratório

Materiais e métodos

Soja

Bacia de plástico retangular 20x30cm Bandeja inox 25x35cm Incubadora Microondas Becker 500ml Triturador ou martelo oligospor us Esporos de Rhizopus oligosporus

Sacos plásticos perfurados 10x15 cm

Procedimento

Pesar 500g de soja em um becker. Triturar em pedaços não muito pequenos com triturador ou martelo. Preparar uma solução de ácido acético 0,9 mol pH 3,1. Cobrir os grãos com a solução. Deixar por 16 horas a 25ºC. Enxaguar os grãos. Recolocar no Becker. Em um microondas, aquecer a temperatura não superior a 90ºC. por 30 minutos. Arrefecer a 25ºC. oligos porus. Colocar a soja em sacos de 10x15 perfurados. Incubar nas Inocular com Rizopus oligosporus

primeiras 12 horas a 30ºC. Diminuir até as próximas 42 horas para 28ºC. Verificar a temperatura interna do fermentado constantemente (a cada 8 horas) para certificar – se se que a temperatura interna não exceda os 35ºC. Retirar da incubadora e manter em geladeira a 4ºC, ou congelado para eventuais testes.

Bibliografia Ferreira, Renata; Determinação de soja em alimentos, 2006 Diaz, Patrícia; Universidade federal de Pelotas Raimbault, Maurice; General and microbiological aspects of solid substrate fermentation, 1998 Spier, Michele; Produção de enzimas amilolíticas fúngicas alfa amilase e amiloglucosidase por fermentação no estado sólido, 2005

Moreno, C; Solid state fermentation process for producing chickpea (Cicer arietinum L) tempeh flour. Physicochemical

and nutritional characteristics of the product, 2004

Fadahunsi, I;The Effect of Soaking, Boiling and Fermentation with Rhizopus oligosporus on the Water Soluble Vitamin Content of Bambara Groundnut, 2009 Neto et al.; Automação de reatores de fermentação sólida para produção de enzimas, 2009 Pandey et al.; 2000 Pradana, Imanda et al.; Comparation Treatment Method for Industrial Tempeh Waste by Constructed Wetland and Activated Sludge, 2011 Jurus, Alan et al.; Penetration of Rhizopus oligosporus into Soybeans in Tempeh, 1976