Tema 5.- El Microtomo

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LA MICROTOMÍA INTRODUCCIÓN La Microtomía es la disciplina que se ocupa de la obtención de finos cortes seriados a partir de tejidos incluidos en bloques de parafina para su posterior estudio a microscopía óptica y/o electrónica, lo que la convierte en uno de los pilares básicos de las técnicas procedimentales de Anatomía Patológica. El microtomo (o micrótomo) es un aparato mecánico que permite la obtención de secciones de tejido de espesor micrométrico que pueden ser empleadas posteriormente para su estudio al microscopio. Los microtomos poseen cuchillas de metal y mecanismos para regular el grosor de los cortes y el avance de la muestra que se coloca en él. Se utilizan para estudiar secciones de tejidos potencialmente patológicos de los que se pretende obtener un diagnóstico. COMPONENTES DE UN MICROTOMO Aunque pueden variar de unos modelos a otros, los componentes fundamentales de un microtomo son: • Portabloques: en el que apoyamos el casete con la muestra. Avanza de forma discontinua sobre una cuchilla gracias a un mecanismo regulable de cremallera. Propiamente se denomina portabloques al dispositivo donde colocamos el material tisular sumergido en algún medio de inclusión, generalmente parafina. Los actuales portabloques llevan un sistema de pinzas que se adaptan a cualquier tipo de base o molde. A su vez, el portabloques lleva un sistema de orientación que permite conseguir la posición en paralelo entre el bloque y la cuchilla. • Portacuchillas: consiste en un dispositivo de fijación basado en una pinza que sujeta y orienta adecuadamente la cuchilla. Esta pinza permite variar el ángulo de inclinación de la cuchilla, así como su grado de aproximación al portabloques. • Mecanismo de avance del portabloques sobre la cuchilla: sistema mecánico o electrónico que proporciona cortes sucesivos de tejido a partir del bloque. Actualmente se consiguen cortes de hasta 1 µ. • Base: sirve para sustentar el microtomo a la mesa. • Caja: también llamada carcasa, aloja el mecanismo de engranajes de precisión y el mecanismo para seleccionar el espesor de la sección. • Manivela: está situada a la derecha del aparato; consiste en un volante con una manilla y un freno. En el volante hay una flecha pintada que indica la dirección en la que se debe mover la manivela. • Freno: es un tornillo que, accionándolo hacia afuera y/o girándolo sobre sí mismo un cuarto de vuelta, libera la manivela. • Manivela de recuperación: está situada a la izquierda del microtomo. Una vez utilizado el microtomo es conveniente hacerle volver a la posición de inicio. Para ello se acciona la manivela en sentido antihorario hasta que la base del brazo portabloques esté cercano a la caja de engranajes.

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TIPOS DE MICROTOMO MICROTOMO DE OSCILACIÓN, BALANCEO O DE CUCHILLA VIBRANTE Es un tipo de microtomo que hoy día se utiliza específicamente para el control de calidad de materiales en industria y en determinados tipos de estudios histológicos. Es el equipo ideal para aplicaciones de alta precisión en neurofisiología, neuropatología y patología experimental, ya sea para la realización con gran precisión de cortes de tejido previamente fijados a fin de realizar exámenes neuropatológicos, o para cortar tejidos en fresco, aunque también puede formar parte del sistema de corte del criostato. Posee un mecanismo de avance de tornillo y las secciones se obtienen por un sistema oscilatorio de palanca que realiza el portabloques sobre la cuchilla al bascular sobre ella apoyándose en un pivote intermedio, de tal forma que no permite obtener secciones seriadas. Es un sistema barato y simple.

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LA MICROTOMÍA MICROTOMO DE DESLIZAMIENTO Se basa en el deslizamiento, bien de la cuchilla, bien del portabloques, sobre unas guías metálicas, produciendo el corte al avanzar y retroceder. Existen tres tipos: 1. Microtomo Leitz o de portabloques deslizante: El portabloques se desliza sobre la cuchilla, la cual es estable. Es más inalterable y proporciona mejor calidad ya que, al estar fija la cuchilla, ésta no vibra.

2. Microtomo Reichert-Jung o de cuchilla móvil: La cuchilla se desliza sobre el portabloques, presentando una excesiva vibración.

3. Microtomo Tëtrander: Es un tipo de microtomo Reichert-Jung específico que se utiliza para obtener secciones macro o microscópicas de órganos completos.

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Ventajas de la Microtomía de Deslizamiento - Económica. - Escasas averías. - Regulación exacta de la presión de la cuchilla. - Las grandes dimensiones de la cuchilla permiten seccionar bloques tisulares de gran tamaño.
Inconvenientes de la Microtomía de Deslizamiento - Proceso de corte lento (los cortes se obtienen uno a uno). - Elevada propensión a accidentes. - Dificultad para obtener secciones de espesor inferior a 8 µ. - Se utiliza para efectuar secciones de tejido congelado y no deshidratado. MICROTOMO DE CONGELACIÓN Se utiliza para la realización de cortes de tejido congelado no deshidratado. El material se congela haciendo pasar por el interior del portabloques hueco una corriente de anhídrido carbónico. Este microtomo consta de una cuchilla que se desliza sobre una platina conectada a una botella de gas carbónico que asciende en cada corte las micras indicadas previamente (5, 10, 15, 20,…). Dando salida al gas carbónico se produce una disminución de la temperatura, congelando la pieza. Las láminas que se obtienen se quedan adheridas a la cuchilla, de la que se extraen pasando el dedo sobre ella e introduciéndolo acto seguido en un cristalizador con agua, donde los cortes se “pescan” mediante un portaobjetos que se introduce debajo de cada uno de ellos, extrayéndose del agua con ayuda de una aguja histológica y procurando que la lámina no se pliegue. Se utiliza cuando se necesitan secciones de gran espesor para un estudio simultáneo arquitectural e histoquímico, como en el caso de algunas técnicas para el sistema nervioso.


Inconvenientes de la Microtomía de Congelación - Depende de dióxido de carbono para la congelación. - Los cortes obtenidos tienen un espesor superior a 5 o 10 µ. - Dificultad para el estiramiento de las secciones.

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LA MICROTOMÍA ULTRAMICROTOMO Son los microtomos empleados para obtener cortes ultrafinos. Su base es la de un microtomo de rotación pero dotado de numerosas mejoras técnicas que permiten efectuar secciones más finas. Todos ellos tienen en común que la cuchilla está fija, siendo el portabloques el que se mueve. El avance del bloque es regulable y, por lo tanto, permite obtener cortes a partir de 0.01 µ. Existen dos tipos de ultramicrotomo: 1. Porter-Blum: con avance mecánico. 2. LKB o Reichert: el avance se debe a la dilatación térmica de una barra metálica maciza unida al portabloques. El ultramicrotomo suele incorporar los siguientes elementos: - Sistema de iluminación múltiple con luz incidente sobre el bloque, transiluminación de éste y campo oscuro. - Avance térmico o mecánico controlado por un procesador que permite el ajuste digital en pasos de 1 nm. - Platina portacuchillas regulable y apta para cuchillas de vidrio o diamante. - Sistema óptico con microscopio estereoscópico de visión tridimensional. - Movimiento del brazo regulable por motor. - Control para el avance macro y micrométrico y regulación de la amplitud y velocidad de movimiento del brazo.

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LA MICROTOMÍA MICROTOMO DE ROTACIÓN O MINOT Es el tipo de microtomo más utilizado en los laboratorios de Anatomía Patológica. El portabloques se coloca en posición vertical y se mueve arriba y abajo, delante del filo de la cuchilla; cuando el movimiento de rotación del brazo del microtomo se convierte en lineal se produce, además, el avance automático y constante del portabloques.


Ventajas de la Microtomía de Rotación - Sistema de cortes finos, semifinos y gruesos. - El gran peso del aparato y el sistema de movimiento le confieren gran precisión, permitiendo obtener secciones seriadas muy finas. - El desbastado y el tallado se pueden hacer de forma automática y manual. - Los portacuchillas pueden ser móviles o fijos. - Las cuchillas pueden ser desechables, estándar, de carburo de tungsteno, de vidrio o de diamante. - Presentan una pinza porta-casete para adaptar el bloque de parafina incorporada al cabezal del microtomo.
Inconvenientes de la Microtomía de Rotación - Elevado precio. - Sistema de avance muy complicado. - Imposibilidad de cortar órganos completos. CRIOSTATO Se trata de un microtomo introducido en una cámara frigorífica especial a una temperatura de entre –15 y –20 ºC, en la cual la congelación de la muestra se produce de forma instantánea mediante el enfriamiento con una placa a –60 ºC por circulación forzada de gas freón o nitrógeno líquido. Este sistema de microtomía consta por tanto de una serie de cámaras frías dentro de las cuales se localizan el microtomo propiamente dicho, la cuchilla, el portamuestras y el cubremuestras, permitiendo obtener cortes de entre 2 y 4 µ. La pieza se corta más firmemente cuanto menor sea la temperatura, aunque una temperatura excesivamente baja produce un enfriamiento excesivo de la pieza y la cuchilla bota sobre ella sin cortar. Para aumentar la temperatura de la pieza pasaremos un dedo sobre ella.

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LA MICROTOMÍA El uso del criostato se destina a cortes no fijados y no incluidos, de forma que los cortes que obtendremos no serán seriados, se recogen uno a uno y llevan un sistema de antienrollado (antiroll) incorporado consistente en una lámina de material plástico transparente montado sobre un eje y un pivote orientable en los tres ejes espaciales; esta lámina se aplica paralelamente a la superficie de la cuchilla y forma en ella un túnel en el que se introduce el corte. Gracias al antiroll, una vez que se tiene ya dentro del cono el corte, éste queda extendido y se extrae colocando el portaobjetos sobre la cuchilla sin tocarla. El corte se adhiere al portaobjetos por efecto de la diferencia de temperaturas.

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LA MICROTOMÍA El criostato se utiliza para procesar biopsias intraoperatorias y en estudios histoenzimáticos o inmunohistoquímicos que se practican sobre tejido congelado. En el caso de las biopsias intraoperatorias, siempre se hace otra muestra por inclusión en parafina y corte con microtomo de rotación; por su parte, las muestras de estudios especiales siempre son complementarias al procesado por inclusión en parafina.

Características técnicas del criostato Leica CM1900

CUCHILLAS DE MICROTOMO Las cuchillas de microtomo se fabrican en acero inoxidable y actualmente son desechables; podemos encontrarnos cuatro tipos de diseño: 1. Bicóncava: se utiliza para cortar bloques de parafina en el microtomo de balanceo y en el de rotación; su principal inconveniente es que vibran demasiado, pero si el tejido es blando se consiguen cortes excelentes. 2. Plano-cóncava: también denominadas A y B según sea mayor o menor la concavidad de la cara no aplanada. La A se emplea para cortar bloques de parafina en el microtomo de deslizamiento mientras que la B se utiliza sobre tejidos incluidos en celoidina. 3. Biplana con faceta: se emplean para cortar los tejidos congelados en microtomos de gas carbónico, o bien cuando trabajamos con un tejido muy duro.

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LA MICROTOMÍA 4. Biplana: también llamada en cuña o de tipo C, se utilizan para cortar bloques de parafina en microtomos Minot o tejidos congelados en el criostato. Es un tipo de cuchilla polivalente, por lo que se puede utilizar para casi cualquier tipo de tejido, razón por la cual se impone como la más frecuente en la práctica.

AFILADO, CONSERVACIÓN Y RENDIMIENTO DE LA CUCHILLA El filo de la cuchilla debe tener una calidad inmejorable, para lo cual podemos utilizar dos opciones: el afilado y el pulimentado. El afilado puede realizarse de forma manual o automática. En el primer caso necesitamos dos accesorios: un mango con tornillo que se inserta en el orificio situado en el borde de la cuchilla para tal fin, y un protector en forma de anilla semicircular para mantener, entre el filo y la superficie de afilado, un contacto homogéneo que evite irregularidades en el ángulo de bisel. Como superficie de afilado se utilizan diversas piedras naturales (amarilla de Bélgica), sintéticas (carborundo) o incluso una placa de vidrio a la que se añaden diversos abrasivos en forma de pasta (óxido de aluminio y derivados).

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LA MICROTOMÍA Los sistemas automáticos de afilado se basan en el empleo de máquinas de afilar provistas de piedras giratorias a las que se agregan abrasivos y aceites minerales. Desde los primitivos modelos en los que el ajuste se realizaba manualmente, se ha progresado hasta modernos instrumentos que permiten controlar y modificar exactamente el ángulo de bisel según las necesidades del caso (generalmente entre 15 y 80º).

El proceso de afilado de una cuchilla consta habitualmente de tres fases: 1. Afilado: se desgasta acero del filo para eliminar sus porciones dañadas (muescas y mellas). 2. Devastado: se eliminan las pequeñas irregularidades y partículas de acero levantadas tras el proceso anterior mediante piedras de grano más fino que giran a menor velocidad o mediante abrasivos. 3. Suavizado: cuya finalidad es perfeccionar el filo empleando una cinta o disco de cuero a la que se añade una grasa especial para suavizado. Tras realizar varios afilados manuales de una cuchilla es conveniente reacondicionar el ángulo de bisel; para ello, si no se dispone de un afilador automático de última generación, deberá enviarse la cuchilla a la casa comercial que la suministra. A fin de preservar el filo de las cuchillas durante el mayor tiempo posible, el desbastado de los bloques (eliminación de las capas de medio de inclusión que se interponen hasta alcanzar en su totalidad la superficie del tejido) debe realizarse con una cuchilla destinada especialmente a este menester o, en su defecto, con uno de los extremos de ésta, reservando la zona central para la confección de los cortes finos. Como regla general, no deben desbastarse bloques realizando cortes de espesor superior a entre 20 y 25 µ, pues de lo contrario el filo de la cuchilla se deteriora muy rápidamente. Otras precauciones convenientes para conservar en buen uso las cuchillas del microtomo son: - Mantenerlas siempre guardadas en su correspondiente caja. - Limpiar con xileno el filo de la misma antes y después de su uso. - Procurar no prestarlas, puesto que en la técnica de corte y en el mantenimiento de la cuchilla se siguen pautas muy personales.

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LA MICROTOMÍA En la actualidad se utilizan cuchillas desechables, lo que elimina las operaciones de afilado y pulido; son mucho más cómodas y prácticas y, a pesar de que su coste puede resultar muy alto, el ahorro es sustancial al eliminar aparatos como el afilador y el pulidor, simplificando y evitando posibles errores en la técnica de afilado que pueden repercutir en los cortes y, por tanto, en la calidad de la técnica. RENDIMIENTO DE LAS CUCHILLAS El rendimiento de las cuchillas dependerá de su filo y orientación. Así, cuanto más agudo y rectilíneo sea el filo, más finos y con menos mellas saldrán los cortes; por otro lado, la cuchilla debe incidir sobre la pieza formando un ángulo de entre 25 y 30º. TÉCNICAS DE CORTE DE BLOQUES DE PARAFINA CON MICROTOMO En Anatomía Patológica, la obtención de secciones adecuadas de tejido incluido en parafina es una de las labores de mayor trascendencia de entre las que debe realizar el técnico. Por lo común, y suponiendo un procesamiento histológico adecuado del tejido, la profundidad y exactitud del diagnóstico histopatológico que se realice sobre un determinado material depende fundamentalmente de la calidad y espesor de los cortes obtenidos en el microtomo. Para garantizar el proceso son necesarias tres condiciones básicas: 1. Contar con un microtomo moderno y con un adecuado mantenimiento. 2. Disponer de una cuchilla correctamente afilada. 3. Que el personal posea la formación y experiencia necesarias (la histotecnología clásica define la microtomía como un Arte). Esta condición resulta crucial, de tal forma que su incumplimiento provoca que numerosos servicios de Anatomía Patológica, dotados con el instrumental más avanzado, presenten serios problemas en cuestiones de calidad.

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LA MICROTOMÍA La confección de los cortes de bloques de parafina consta de seis maniobras: 1. Retallado y enfriado del bloque. 2. Fijación del portabloques. 3. Orientación del bloque. 4. Orientación de la cuchilla del microtomo. 5. Selección del espesor del corte. 6. Realización de las secciones. RETALLADO Y ENFRIADO DEL BLOQUE Retallar un bloque es eliminar el exceso de medio de inclusión existente en su periferia con la finalidad de disminuir la superficie total en contacto con la cuchilla. Mediante esta maniobra, que se realiza con una hoja de bisturí, se preserva el filo y se consigue que el bloque oponga solamente la resistencia al corte propia del tejido. A continuación, y antes de colocar el bloque sobre el microtomo, debe procederse a su enfriamiento para conseguir una consistencia óptima de la parafina. La temperatura ideal de la parafina en el momento de realizar los cortes se encuentra entre 5 y 10ºC, por lo que el enfriamiento más adecuado se obtiene almacenando los bloques en una cámara frigorífica a unos 4ºC. No deben colocarse los bloques a temperaturas inferiores a 0ºC, ya que la parafina y sus derivados sintéticos tienden a cristalizar, resquebrajándose el bloque y apareciendo artefactos en los tejidos. Durante el corte, y debido a la fricción, el bloque de parafina se va calentando y los cortes van empeorando su calidad de forma progresiva; esto se soluciona frotando la superficie de corte del bloque de parafina con un cubito de hielo. FIJACIÓN AL PORTABLOQUES Hoy en día, en la confección habitual de los bloques de parafina se emplean sistemas comerciales dotados de soportes plásticos (casetes) de forma paralelepipédica directamente adaptables a la pinza portabloques del microtomo.

El casete se coloca de forma vertical u horizontal en el portabloques. Si no se dispone de casetes, antes de iniciar el corte es imprescindible fijar el bloque de parafina a un soporte metálico de superficie estriada mediante parafina líquida que se deja solidificar.

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ORIENTACIÓN DEL BLOQUE Una vez colocado el bloque en el portabloques se hace descender el brazo del microtomo hasta que la cara inferior toque la cara interna de la cuchilla. En ese momento se comprueba el paralelismo entre ambas, restableciéndolo en caso necesario mediante los tornillos del portabloques.

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ORIENTACIÓN DE LA CUCHILLA Para orientar correctamente la cuchilla de un microtomo Minot hay que tener en cuenta que existen cuatro ángulos de control de la incidencia del bloque sobre la cuchilla: ángulo de inclinación (I), ángulo de arrastre (A), ángulo de corte (C) y ángulo libre (L).

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LA MICROTOMÍA El ángulo de inclinación es el formado por el plano que discurre por la cara inferior de la cuchilla y el plano de corte sobre el bloque; debe encontrarse entre 10 y 15º. El ángulo libre es el formado entre el plano que pasa por la faceta inferior de corte de la cuchilla y la superficie del bloque; su valor debe oscilar entre 5 y 8º. El ángulo de corte es el determinado por el plano que se apoya sobre la faceta superior del filo de la cuchilla y la superficie del bloque; su valor se sitúa en torno a los 60º. El ángulo de arrastre es el formado por el plano superior de la faceta de corte de la cuchilla y la perpendicular al plano del bloque; su valor es siempre el complementario al ángulo de corte (en torno a 30º). La cuchilla debe estar inclinada y atacar la pieza de forma que se consiga un corte plano y adherido al precedente; si el valor del ángulo de bisel de la cuchilla no se mantiene constante, es decir, si se modifica la aproximación de las dos facetas de corte del filo, todos los ángulos de control sobre la inclinación de la cuchilla pueden variar hasta hacer imposible la obtención de cortes. Una vez orientada la cuchilla sobre el bloque, se procede al desbastado. SELECCIÓN DEL ESPESOR DE LOS CORTES Antes de seleccionar el espesor de los cortes tenemos que desbastar el bloque; el desbastado es simplemente la eliminación de las capas de parafina que estén sobre el tejido, y termina cuando se obtiene corte de tejido en el corte de parafina. El desbastado se realiza mediante cortes sucesivos de 11 µ. Una vez desbastado el bloque, y teniendo en cuenta el tipo de tejido y la tinción a realizar, seleccionaremos un espesor de entre 4 y 6 µ. Los cortes menores de 4 µ son difíciles de obtener por la fragilidad de la lámina, pero son imprescindibles para estudiar patologías renales, linfoides y linfopoyéticas; para el estudio del SNC los cortes se realizarán en secciones de entre 10 y 20 µ.

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LA MICROTOMÍA Hay que tener en cuenta que el tejido incluido en parafina no puede ser seccionado a más de 20 µ de grosor, pues los cortes se arrollarían de forma irreversible. En caso de que sean necesarios estos cortes la inclusión se hará en celoidina. REALIZACIÓN DE LOS CORTES Una vez desbastado el bloque se cambia la cuchilla para iniciar un movimiento rítmico que se transmite al brazo del microtomo y genera una cinta continua de cortes. Este ritmo, así como la velocidad de corte, va a depender de la naturaleza del bloque y de la del tejido (la velocidad es inversamente proporcional a la dureza del tejido). Para evitar el fraccionamiento de las cintas del corte es conveniente sujetarlas con un pincel, el cual sirve a su vez para colocarlas sobre el portaobjetos.

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A continuación se pasa el corte de tejido hasta un baño con agua a una temperatura de entre 45 y 50ºC donde, gracias a las fuerzas de tensión superficial que se generan en la lámina de parafina y tejido al hacerla flotar sobre el líquido, se eliminan posibles pliegues. Hay que tener cuidado de que no se formen burbujas bajo la lámina, ya que son difíciles de eliminar. Un método adicional de estiramiento consiste en aplicar alcohol a 70º sobre el porta que utilizamos para trasladar el corte al baño de flotación, con lo que conseguimos que este corte ya esté prácticamente estirado al meterlo en el baño.

El procedimiento para recuperar los mejores cortes del baño se denomina coloquialmente “pesca” y consiste en introducir un portaobjetos en el baño hasta tocar la sección en uno de los lados del corte. Cuando empieza la adherencia de la sección sobre el cristal se extrae poco a poco el portaobjetos del baño, dejando drenar el agua por gravedad. Si la orientación o la disposición del corte no es la adecuada, éste se puede volver a reflotar y orientar. Al terminar el montaje de las preparaciones vaciamos el baño y eliminamos cualquier vestigio de contaminación con papel de filtro.

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Una vez montados los cortes sobre el porta, y antes de la tinción, las preparaciones deben ser secadas meticulosamente para evitar su desprendimiento. Esto se hace metiendo la preparación en la estufa a 60ºC durante 10/20 minutos, o a 37ºC durante 24 horas. Una temperatura elevada (valores próximos a 100ºC, como suelen hacer algunos técnicos de mayor edad) puede deteriorar de forma irreversible la mayor parte de los componentes bioquímicos y antígenos tisulares.

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LA MICROTOMÍA PROBLEMAS QUE PUEDEN SURGIR DURANTE EL CORTE Defectos Causas Soluciones Juego en las correderas del Engrasar correderas microtomo Fijar bien la cuchilla y el Soporte mal fijado portabloques Enfriamiento del Cortes de diferente grosor Portabloques caliente portabloques y el bloque Aumentar la inclinación de Inclinación incorrecta de la cuchilla aflojando los tornillos Cuchilla muy usada Cambiar la cuchilla Vibraciones en partes del Bloquear los tornillos del microtomo portacuchillas Reglar o hacer reglar el Juego en las correderas Cortes de espesor irregular microtomo Cambiar la cuchilla por una Vibraciones en la cuchilla menos alta o de cabeza más larga Las aristas del bloque no La cinta se curva Retallar el bloque son paralelas Cortar cerca de un foco de calor Los cortes se enrollan y no La temperatura ambiente es Reducir el espesor del corte forman tira baja o la parafina muy dura Disminuir la inclinación de la cuchilla Probar otra zona de la Cuchilla desafilada Los cortes están cuchilla comprimidos Temperatura ambiente alta Enfriar el bloque Disminuir la inclinación de Cuchilla muy inclinada la cuchilla Los cortes se resquebrajan y pulverizan Cortes muy finos Cortes más gruesos Tejido con sangre Cortar deprisa Probar otra zona de la Cuchilla mal pulimentada cuchilla Cortes con estrías Entre tira y tira limpiar el Presencia de polvo sobre el bisel con una gasa corte empapada en xilol

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LA MICROTOMÍA Los mayores problemas que plantea la obtención de secciones en el microtomo de rotación derivan de una inadecuada orientación de la cuchilla. Por lo general, a un técnico con suficiente experiencia le basta la simple observación de la superficie del bloque para reorientar la cuchilla si fuese necesario. Cuando el ángulo de inclinación es mayor de 15º, y por tanto el ángulo libre es superior a 8º y el de corte a 60º (cuchilla excesivamente perpendicular al bloque), el filo tiende a introducirse profundamente en la parafina del bloque, arrancando parte de ella e induciendo una fuerte vibración de la cuchilla. Todo ello origina pequeñas ondulaciones en la superficie del bloque y cortes de grosor muy irregular. Cuando el ángulo de inclinación es menor de 10º, el ángulo libre es negativo y el corte menor de 60º (cuchilla excesivamente paralela al bloque), el filo de la cuchilla no incide sobre la superficie del bloque, sino que la faceta inferior de corte se desliza sobre él. De esta forma no es posible obtener una sección hasta que el bloque ha avanzado lo suficiente como para salvar la faceta de corte de la cuchilla. Ello se traduce en la obtención de cortes discontinuos de gran espesor.

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LA MICROTOMÍA PROBLEMAS QUE PUEDEN SURGIR DURANTE LA EXTENSIÓN Defecto Causas Soluciones Uso de una cuchilla poco Rehacer los cortes en otra afilada zona de la cuchilla Agua de la extensión muy caliente, que hace que la parafina funda antes de que hayan desaparecido los Vigilar la temperatura del pliegues (40-45ºC) agua Los cortes no se despliegan Agua de la extensión demasiado fría, que hace que no se reblandezca la parafina Desbridar el corte (se cortan los bordes de la La pieza es dura y fibrosa preparación a nivel de los pliegues con un punzón) Aplanar bien los cortes Cortes insuficientemente antes de eliminar el líquido pegados de la extensión Presencia de burbujas Aire procedente del agua, debajo de los cortes durante su calentamiento, Usar agua hervida retenido debajo de los cortes durante el secado Usar portaobjetos Portaobjetos mal adecuados, pasados por desengrasados alcohol clorhídrico y bien lavados con agua Si la parafina sólo ha fundido por los bordes enfriará rápidamente, pues Los cortes no se adhieren se resquebraja. Soplar al portaobjetos o se sobre la preparación La parafina ha fundido despegan muy rápidamente durante la extensión Si la parafina ha fundido completamente el corte se ha perdido Secar rápidamente después del escurrido El corte ha sido mal Colodionar los aplanado portaobjetos con albúmina

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LA MICROTOMÍA MATERIAL INCLUIDO EN CELOIDINA La realización de secciones histológicas sobre material incluido en celoidina comprende varias operaciones sucesivas análogas a las referidas para tejidos incluidos en parafina, aunque con matices específicos. CONSERVACIÓN, TALLADO Y FIJACIÓN DE LOS BLOQUES A diferencia de los bloques de parafina, los de celoidina no conservan sus propiedades de consistencia y ductilidad en el ambiente habitual del laboratorio. Para su conservación y grado óptimo de dureza es necesario mantenerlos inmersos en alcohol etílico al 70%, lo que hace engorroso su manejo. Antes de fijarlos sobre el microtomo han de ser pegados sobre un portabloques de madera o vulcanita (roca volcánica porosa), ya que no es posible emplear para su confección las estaciones convencionales con casetes como portabloques estándar.

Para montar el bloque se cubre la superficie del portabloques con una cantidad adecuada de celoidina al 8% y se coloca sobre ella el bloque correctamente orientado, manteniendo durante unos minutos la presión. Se deja secar al aire y se coloca al menos 30 minutos más en etanol de 70º para conseguir un adecuado endurecimiento. Como en el caso de los bloques de parafina, es conveniente el retallado del bloque con una hoja de bisturí para eliminar el exceso de medio de inclusión en su periferia; sin embargo, no es necesario realizar un enfriamiento previo al corte. CARACTERÍSTICAS DEL MICROTOMO Por la especial manipulación que requiere el tejido incluido en celoidina es necesario realizar las secciones en un microtomo de deslizamiento, preferentemente de tipo Leitz. ORIENTACIÓN DE LA CUCHILLA Y DESBASTADO DEL BLOQUE En el microtomo de deslizamiento se consideran los mismos ángulos de influencia sobre el plano de corte que en el Minot. La variación de mayor trascendencia afecta exclusivamente al ángulo de inclinación de la cuchilla, que es plano-cóncava, formado por la cara inferior de ésta y la superficie del bloque. En este caso el ángulo pasa de oscilar entre 10 y 15º a ser ligeramente inferior a 15º, por lo que el ángulo libre decrece hasta situarse entre 0 y 5º.

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LA MICROTOMÍA Debido a la mayor dureza y rigidez de la celoidina en comparación con la parafina, en este tipo de microtomo la cuchilla suele estar dispuesta oblicuamente en el eje transversal del bloque, de forma que las secciones se realizan oblicuamente con una declinación de hasta 160º. El desbastado del bloque se realiza igual que en el caso de los bloques de parafina. OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE LOS CORTES Para obtener secciones adecuadas es imprescindible pincelar con etanol al 70% de forma continua tanto la cuchilla como la superficie del bloque, e incluso los propios cortes conforme se van obteniendo, para evitar su natural tendencia a enrollarse, facilitar su estiramiento y contribuir a mantener la más adecuada consistencia del bloque.

Los cortes se obtienen de uno en uno haciendo incidir el portabloques móvil sobre la cuchilla a través de su deslizamiento sobre las guías del microtomo. Se estiran directamente con el pincel mojado en etanol de 70º sobre la propia superficie de la cuchilla, donde quedan retenidos.

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LA MICROTOMÍA A continuación los cortes se hacen flotar en un baño de alcohol de 70º; la tinción se realiza habitualmente por flotación previa al montaje sobre el agente colorante deseado, pero se puede efectuar sobre el propio bloque antes del corte. MATERIAL CONGELADO La obtención de secciones histológicas a partir de material congelado es de sumo interés en biopsias intraoperatorias, que en la actualidad constituye la base del tratamiento quirúrgico en numerosos campos de la Oncología. Este hecho ha desplazado la responsabilidad de las decisiones desde el cirujano hacia el patólogo; por ello, para garantizar un diagnóstico en congelación que resulte prácticamente definitivo es imprescindible poseer una técnica adecuada de biopsia con secciones de una calidad equivalente a las de parafina. Por otra parte, en el diagnóstico morfológico es cada vez mayor el empleo de técnicas histoenzimáticas e inmunohistoquímicas para determinar tanto antígenos de superficie como actividad funcional. Estas técnicas requieren una preservación absoluta de la estructura de las proteínas y del fenotipo celular, por lo que se ha impuesto la necesidad de realizar anualmente miles de secciones en congelación como complemento del diagnóstico convencional. En teoría, las secciones histológicas sobre material fijado por congelación se pueden realizar con el microtomo de congelación clásico (de gas carbónico), pero en la práctica dicho instrumento ha sido desplazado por el criostato o criotomo, debido tanto a la gran delgadez de los cortes que se obtienen como a la mayor sencillez de su manejo. Sin embargo, el conocimiento de la técnica de corte con el microtomo de gas carbónico puede ser útil en caso de avería del criostato o, lo que es más frecuente, para obtener secciones gruesas (superiores a 20 µ) necesarias en histoquímica del sistema nervioso, en la cual es imprescindible poder seguir el recorrido de las prolongaciones neuronales el mayor trayecto posible. MICROTOMO DE CONGELACIÓN CLÁSICO CONGELACIÓN DEL BLOQUE El portabloques del microtomo de congelación está hueco y permite la circulación de gas carbónico procedente de una bombona de presión a su través, de forma que al expandirse en su interior se produce el enfriamiento progresivo de la superficie donde se coloca el tejido. Para facilitar el despegamiento posterior de éste, una vez realizados los cortes, es conveniente situar un papel de filtro húmedo entre el tejido y la superficie estriada del portabloques. A partir de ese momento se inicia el proceso de congelación, abriendo a pequeños intervalos la espita de la bombona de gas carbónico a presión; para conseguir un enfriamiento más rápido y homogéneo se sitúa sobre el portabloques una pequeña cazoleta que disminuye notablemente la cámara aérea que se va a enfriar y hacer recircular hacia el tejido parte del gas que sale por los orificios de expansión del portabloques.

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OBTENCIÓN DE LOS CORTES Tras el proceso de congelación se aproxima manualmente el tejido a la cuchilla empleando el sinfín del portabloques y se inicia el desbastado del tejido hasta obtener secciones que comprendan su superficie total. Si el tejido se ha congelado en exceso los cortes suelen ser difíciles y se astillan con facilidad; en este caso puede ser muy útil calentar la superficie del bloque pasando la yema del dedo. Si, por el contrario, el tejido no se ha enfriado suficientemente, tiende a ser machacado por la cuchilla y a desprenderse del portabloques; si esto pasara el tejido debe volver a ser congelado. Los cortes se realizan con un espesor próximo a 10 µ y en el preciso momento en el que el tejido comienza a deshelarse, lo que puede apreciarse con facilidad a simple vista. Esto es debido al calor por rozamiento producido por la cuchilla. CONFECCIÓN DE LAS PREPARACIONES Una vez obtenidos los cortes (no una tira, sino en secciones independientes), se recogen de la superficie de la cuchilla con un pincel y se hacen flotar en un baño de agua a 40º del que se pescan de forma similar a los cortes de parafina.

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LA MICROTOMÍA CRIOSTATO Por las especiales características técnicas de este instrumento, que, como ya sabemos, se trata de un microtomo de rotación situado en el interior de una cámara congeladora, es posible obtener secciones tisulares extremadamente delgadas; lo habitual es entre 4 y 6 µ, pero podemos obtener cortes de hasta 2 µ. CONGELACIÓN DEL MATERIAL Para la realización de técnicas histoenzimológicas o inmunohistoquímicas es imprescindible que el tejido no haya sido fijado y que su congelación no se haya realizado lentamente en la cámara fría del criostato, debido a la gran formación de cristales intratisulares de hielo que esta práctica provoca. Si el criostato dispone de sistema de congelación ultrarrápido (placa y contenedor para isopropano a –50ºC) puede utilizarse éste; en caso contrario, se empleará isopenteno enfriado en nitrógeno liquido hasta alcanzar esta temperatura.

De ambas formas se consigue que el tejido ya se encuentre suficientemente congelado cuando se coloque en la cámara de corte del microtomo; incluso puede ser necesario aguardar algún tiempo hasta que se alcance la temperatura idónea para efectuar los cortes, en torno a –20ºC. La realización de los cortes se facilita si antes de ser congelado el tejido se coloca en el interior de una gran gota de medio sintético como el OCT (10.24% alcohol de polivinilo, 4.26% polietilenglicol y 85.5% excipientes), engastando el material en este medio de imbibición. Además, el medio de imbibición actúa produciendo la fijación del tejido al portabloques del criostato e, incluso, puede actuar como agente congelante.

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REALIZACIÓN DE LAS SECCIONES Tras la congelación, el portabloques se sitúa en la pinza del criostato y se realiza la orientación de la cuchilla y del portabloques al igual que hacíamos con el microtomo de parafina. Si la temperatura de la cámara de corte no es suficientemente baja puede forzarse el mantenimiento de la congelación empleando algún nebulizador comercial de gas freón aplicado sobre la cuchilla, nunca directamente sobre la muestra para evitar el cuarteamiento y la génesis de artefactos sobre el tejido. La técnica de corte es muy similar a la de la parafina, obteniéndose cortes seriados. La única diferencia es la existencia en el criostato de un dispositivo antiroll, consistente en una delgada lámina de material plástico que, al apoyarse directamente sobre el filo de la cuchilla, impide el enrollamiento de los cortes sobre sí mismos. La mayor dificultad a la hora de obtener los cortes estriba precisamente en la regulación del avance del antiroll sobre la cuchilla: si es insuficiente, las secciones no se introducen entre el dispositivo y la cuchilla, y si es excesivo el bloque tropieza con él al oscilar sobre la cuchilla. Una vez obtenidos los cortes, se capturan directamente de la superficie de la cuchilla empleando el propio portaobjetos identificado con el mismo número que la muestra.

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SOLUCIONES ADHERENTES PARA PORTAOBJETOS Habitualmente los portaobjetos utilizados en Histopatología rutinaria tienen un tamaño de 7.6 x 2.5 cm y un espesor de entre 1 y 1.2 mm (hasta 1.7 mm de espesor los más gruesos; a espesores superiores es imposible identificar estructuras a 40x, ya que 1.7 mm es la distancia desde el objetivo de 40x al cubre). Antiguamente, los que se empleaban eran de vidrio liso en su totalidad, por lo que la identificación debía hacerse utilizando un lápiz de punta de diamante; este lápiz era causa de una elevada tasa de accidentes oculares por proyección e incrustación de partículas cristalinas durante el proceso de marcaje, por lo que en la actualidad se han generalizado los portaobjetos con una zona marginal de vidrio deslustrado (esmerilado) que permite la identificación con un simple lápiz de grafito. Para los procedimientos más rutinarios la adhesión del tejido al portaobjetos queda garantizada con el proceso de desengrasado anteriormente expuesto (problemas que pueden surgir durante la extensión); pero hoy en día se realizan numerosas técnicas histoquímicas de base inmunológica y de biología molecular sobre las preparaciones histológicas obtenidas en parafina, resinas plásticas o congelación. Como estas técnicas tienden a causar con gran frecuencia el desprendimiento progresivo de los cortes, es imprescindible impregnar los portaobjetos con sustancias fijadoras que dificulten este fenómeno. A tal fin, tradicionalmente se han venido utilizando sustancias naturales como la albúmina de huevo o diversas fórmulas de gelatina, aunque progresivamente están siendo sustituidas por otros agentes y fórmulas comerciales como las resinas araldita o la poli-L-lisina, que, si bien son de mayor costo, proporcionan la máxima adhesividad, imprescindible en Biología Molecular.

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LA MICROTOMÍA ALBÚMINA Constituye el adhesivo más clásico y barato, pues la fuente principal de albúmina no es otra que la clara de huevo. Por este motivo, sigue siendo el adhesivo de elección para las técnicas convencionales que requieren una adhesión más fuerte que la proporcionada por el secado de los portaobjetos (técnicas histoquímicas en general, salvo aquéllas que utilizan álcalis fuertes, como ciertas impregnaciones argénticas, en que son más recomendables las soluciones gelatinazas). La adhesión con albúmina es incompatible con las modernas técnicas inmunohistoquímicas que incorporan la metodología de la avidina-biotina. PNT DE LA SOLUCIÓN DE ALBÚMINA GLICERINADA DE MAYER REACTIVOS - 50 ml de clara de huevo recién extraída. - 50 ml de glicerol. - 1 g de salicilato sódico. - 1 ml de ácido clorhídrico 100%. - 1000 ml de etanol 96%. PROCEDIMIENTO 1. Preparar la solución de alcohol clorhídrico disolviendo 1 ml de ácido clorhídrico absoluto en 1000 ml de etanol de 96º. 2. Lavar los portaobjetos en la solución de alcohol-clorhídrico. 3. Preparar la solución albuminosa mezclando 50 ml de clara de huevo, 50 ml de glicerol y 1 g de salicilato sódico en agitador magnético. 4. Filtrar. 5. Impregnar los portaobjetos lavados con alcohol-clorhídrico con una fina película de solución albuminosa. 6. Dejar secar al aire. 7. Calentar en horno de desecación a 60ºC para coagular las proteínas. GELATINA Sustituye con gran ventaja a la albúmina en la impregnación argéntica e inmunohistoquímicas; aunque existen diversas formas de preparación, en la actualidad se está generalizando su empleo con la adición de alumbre de cromopotasio y otras sustancias que mejoran la adhesividad. PNT DE LA SOLUCIÓN DE GELATINA-ALUMBRE DE CROMOPOTASIO REACTIVOS 1. Solución A: - 4.5 g de gelatina molida. - 1000 ml de agua destilada. Calentar progresivamente hasta 75ºC en termoagitador y, tras la completa disolución de la gelatina, dejar enfriar hasta 50ºC.

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LA MICROTOMÍA 2. Solución B: - 38.5 ml de alumbre de cromopotasio {KCr(SO4)2·12H2O} - 1 ml de ftalato de dibutilo { C6H4(COOC4H9)2} - 0.1 g de merthiolate { C9H9HgNaO2S} PROCEDIMIENTO 1. Preparar la solución A. 2. Mezclar con la solución B. 3. Impregnar los portaobjetos lavados con alcohol-clorhídrico con la gelatina de alumbre de cromopotasio. RESINAS Y OTROS ADHESIVOS DE GRAN POTENCIA Las resinas acrílicas, tipo araldita o epoxi, proporcionan la máxima adhesión, aunque son de difícil manejo. Habitualmente se utiliza una solución de resina en acetona en proporción 1:10 que se aplica sobre el portaobjetos inmediatamente antes de su uso. La resina polimeriza a lo largo del proceso de hidratación proporcionando la adhesividad deseada. La poli-L-lisina constituye la base de todos los portaobjetos comercializados con el adhesivo incorporado. Proporciona una adhesividad excelente con una mínima impregnación por los colorantes y reactivos inmunoquímicos en general, por lo que es el agente de elección para técnicas inmunohistoquímicas combinadas con múltiples pasos y, sobre todo, para Biología Molecular, donde se requieren incubaciones prolongadas a una temperatura de 100ºC. ULTRAMICROTOMO ESPESOR DE LOS CORTES ULTRAFINOS La observación mediante microscopía electrónica exige un espesor de corte del orden de algunas decenas de nanómetros debido a la baja capacidad de penetración del haz de electrones. Por este motivo deben poder obtenerse cortes de grosor inferior a 1 µ, oscilando las secciones normales entre 30 y 120 nm. CUCHILLAS DEL ULTRAMICROTOMO Son fundamentales para la calidad del corte, ya que ésta depende principalmente del estado general de la cuchilla. Podemos distinguir dos tipos de cuchilla para ultramicrotomo: 1. Cuchillas de Vidrio: Son las que se emplean habitualmente debido a su bajo coste y a que son desechables. Su principal inconveniente es que se deterioran con facilidad y sólo sirven para un número limitado de cortes. El vidrio que se utiliza es un vidrio cuya cristalización se lleva a cabo en condiciones especiales de temperatura para evitar las tensiones intramoleculares del mismo para que, cuando este vidrio se rompa para fabricar la cuchilla, se dé origen a un filo muy nítido y cortante.

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LA MICROTOMÍA Este vidrio se obtiene de forma comercial en forma de barras de 40-50 cm de longitud y 4-5 cm de anchura, con una altura de 0.4-0.5 cm, y la cuchilla se fabrica en el laboratorio a la hora de usarlas. Podemos fabricarlas de dos formas: - A mano, rayándolas con un diamante y quebrándolas con tenazas especiales. Este método no se utiliza habitualmente porque es más dificultoso y porque sólo sirven las cuchillas que salgan con un filo desprovisto de irregularidades. - Con un instrumento que corta la barra de vidrio en paralelepípedos de superficie rectangular para seccionarlos posteriormente por su diagonal y obtener prismas de cristal dotados de un filo con ángulo de corte de 45º. El cuidado del filo es fundamental; su estado puede controlarse con la lupa binocular del ultramicrotomo, debiendo observarse como una línea brillante no aserrada en el fondo oscuro del campo. Cuando exista suciedad en el borde la limpieza se realizará con acetona concentrada. También podemos comprar cuchillas de vidrio ya cortadas. Su precio es mayor y podemos encontrar cuchillas con baño de flotación incorporado a continuación del filo.

2. Cuchillas de Diamante: Son de tipo multiuso y mucho más caras que las cuchillas de vidrio (unos 3.000 €/unidad). Su filo se obtiene mediante pulimentación, por lo que es algo más imperfecto que el de las cuchillas de vidrio. Se emplean sobre todo para cortar tejidos muy duros, como los tejidos que están calcificados o impregnados metálicamente, así como algunos tejidos no animales y diversos minerales. Antes de fijar la cuchilla al soporte del ultramicrotomo deberá colocarse sobre ella un pequeño baño de flotación para recoger los cortes (si no lo trae incorporado). Este baño puede realizarse con una cinta adhesiva (cinta plateada impermeable) que se coloca justamente sobre el filo de la cuchilla con el fin de obtener una balsa o pocillo junto a su cara interna. Se sellan los filos de la cinta con parafina, se coloca la cuchilla y se llena el pocillo con el líquido de flotación para recoger los cortes.

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LA MICROTOMÍA EMPLAZAMIENTO DEL ULTRAMICROTOMO Es una condición esencial. Debe estar en un lugar donde no se produzcan vibraciones, con temperatura constante y ausencia de corrientes de aire. Para facilitar esto, es importante que el aparato se sitúe sobre una mesa antivibraciones y protegido por una mampara. PREPARACIÓN DEL BLOQUE La inclusión definitiva del tejido en resina se presenta como un pequeño fragmento tisular de 1 mm3 inmerso en un cilindro de plástico; por tanto, es imprescindible ir tallando este cilindro hasta conseguir que el plástico que rodea de forma más inmediata al tejido quede en forma de pirámide truncada.

Esta maniobra es equivalente al desbastado de los bloques de parafina. Como condiciones para realizar un corte correcto destacamos las siguientes: - Es importante que la superficie tallada no tenga una amplitud superior a 1 mm2 en el metacrilato y a 0.5 mm2 para la resina epon. Si la superficie es mayor el corte saldrá vibrado de forma sistemática. - Si el corte sale vibrado a pesar de que la superficie sea la adecuada y el filo de la cuchilla esté bien, deberá revisarse la velocidad del brazo del ultramicrotomo para disminuirla al mínimo. ORIENTACIÓN DE LA CUCHILLA Es variable, dependiendo de que el bloque a cortar sea de metacrilato o de resina epon. En este segundo caso, el filo de la cuchilla ha de estar casi perpendicular al plano de corte (ángulo que forma la cuchilla con la vertical entre 3 y 5º). Si el bloque es de metacrilato, la inclinación de la cuchilla suele ser mayor, para facilitar la obtención de las secciones. Como líquido de flotación se utilizará agua acetonaza (5-10%) si el bloque es de epon o araldita, o una solución de cloruro de bario 0.5M si es de metacrilato, para prevenir en este último caso una excesiva hidratación de los cortes.

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LA MICROTOMÍA OBTENCIÓN DE CORTES SEMIFINOS Reciben también el nombre de cortes control, ya que sirven para seleccionar la zona que preferentemente se pretende observar en el corte ultrafino. Se trata de una sección de entre 0.5 y 1 µ de espesor que es teñida con una coloración estándar de microscopía óptica (generalmente azul de toluidina alcalino) o bien es observada directamente al microscopio de contraste de fase con la finalidad de comprobar previamente la naturaleza de las estructuras contenidas en el tejido. El mecanismo de obtención es análogo al de la obtención de los cortes ultrafinos. AZUL DE TOLUIDINA ALCALINO Se disuelven 0.5 g de azul de toluidina en 100 ml de borato sódico al 1% en agua destilada. Una vez seco el corte se le añaden unas gotas de esta solución colorante, colocando a continuación el porta sobre una llama o placa caliente hasta que comience a emitir vapores sin llevar a ebullición. Una vez teñido, el corte puede ser deshidratado, aclarado y montado. REALIZACIÓN DEL CORTE ULTRAFINO Las secciones ultrafinas deben tener un espesor de entre 30 y 90 nm, siendo suficiente para la mayoría de las aplicaciones un espesor de 80 nm. Una vez movilizada la cuchilla para situarla en una zona de filo virgen, y regulado el espesor deseado del corte, se procede a conectar el movimiento del brazo, obteniéndose una cinta de cortes que flotarán en el pocillo. SELECCIÓN DE LOS CORTES ULTRAFINOS En microscopía electrónica es posible apreciar el grosor de los cortes mediante un sistema bastante preciso que se basa en el fenómeno de interferencia de las ondas luminosas reflejadas por el corte y la superficie del líquido de flotación. Paradójicamente, esta observación no es posible en el caso de los cortes para microscopía óptica convencional; ello ocurre debido a que el corte es más delgado que la longitud de onda de la luz que lo atraviesa, por lo que se generan fenómenos de interferencia entre los rayos R reflejados por la superficie del líquido de flotación.

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LA MICROTOMÍA El mecanismo descrito anteriormente determina que, al iluminar el corte con una luz blanca de incidencia especial, se produzcan interferencias entre los rayos que refleja el tejido y el reflejado en la superficie del líquido flotador, lo que origina la aparición de una gama de colores que depende del grosor que posea el corte. Para poder observar los colores que reflejan los cortes son necesarios ciertos requisitos fundamentales: - El ángulo de incidencia de la luz sobre el tejido debe estar en torno a los 45º. - La luz debe proceder de una lámpara de hendidura (microscopio de bajo poder combinado con una fuente de luz de alta intensidad que puede enfocarse para alumbrar con un rayo delgado). - El líquido de flotación no debe estar iluminado directamente, con el fin de obtener un fondo oscuro donde contrasten los cortes. Así, cumpliendo estos requisitos, y en función del espesor de corte, tendremos los siguientes colores: