Tehnici de Microscopie Electronica

Tehnici de microscopie electronica

•

•

• •

•

•

•

Primul microscop electronic a fost construit în 1931 de către inginerii germani Ernst Ruska şi Max Knoll. Knoll. Acesta era bazat pe ideile şi descoperirile fizicianului francez Louis de Broglie. Broglie. Deşi primitiv şi nepotrivit utilizărilor practice, instrumentul era capabil să mărească obiectele de patru sute de ori. Reinhold Rudenberg, Rudenberg, directorul de cercetări al companiei Siemens Siemens,, a patentat microscopul electronic în 1931, deşi Siemens nu făcea cercetări în domeniul microscoapelor electronice la acea vreme. În 1937 Siemens a început să-i să-i finanţeze pe Ruska şi pe Bodo von Borries pentru Borries pentru dezvoltarea unui microscop electronic. Siemens l-a l-a angajat şi pe fratele lui Ruska, Helmut să lucreze la aplicaţii, în particular cu specimene biologice.  În acelaşi deceniu, Manfred von Ardenne a Ardenne a inventat microscopul electronic cu scanare şi un microscop electronic universal. Siemens a început producţia comercială a microscopului electronic cu transmisie în 1939, dar până atunci primul microscop electronic cu utilizare practică fusese construit la Universitatea Toronto în Toronto în 1938 1938,, de către Eli Franklin Burton şi studenţii Cecil Hall, James Hillier şi Hillier şi Albert Prebus. Deşi microscoapele electronice moderne pot mări obiectele de până la două milioane de ori, toate se bazează pe prototipul prototipul lui  lui Ruska. Microscopul electronic este nelipsit în multe laboratoare. Cercetătorii îl folosesc pentru a examina material biologic (cum ar fi microorganisme şi celule celule), ), diferite molecule mari, molecule  mari, probe de biopsie medicală, metale şi structuri cristaline cristaline,, şi caracteristicile caracteristicile diferitelor suprafeţe. Microscopul electronic este folosit extensiv pentru inspecţia şi asigurarea calităţii în industrie, inclusiv, în mod deosebit, în fabricarea dispozitivelor semiconductoare. Cel mai puternic microscop din lume a fost anunţat la inceputul lui 2008 2008[5] [5].. Transmission electron aberration-corrected microscope, prescurtat "TEAM" atinge rezoluţia de 0,5 Ångström, in jur de 1 milion de ori mai mica mica decât diametrul unui fir de păr. ME a insemnat o revolutie a tehnicii de investigare a organismelor vii la nivel ultrastructural, celular si molecular.

PRINCIPII GENERALE Microscopul fotonic (optic) si cel electronic au o organizare similara. In cazul ME sursa de lumina este inlocuita cu un filament ce emite electroni, lentilele de sticla sunt inlocuite de campuri magnetice sau electromagnetice, iar un ecran fluorescent inlocuieste ochiul uman in vizualizarea directa. • Un microscop electronic este un tip de microscop   care foloseşte electroni microscop electroni   pentru a ilumina specimenul şi şi   a crea o imagine mărită a acestuia. PRINCIPIUL DE FUNCTIONARE • Microscopul electronic se bazează pe proprietatea electronilor de a fi deviaţi deviaţi   de un câmp electrostatic sau electromagnetic. electromagnetic. • Dacă se plasează un filament într-un tub cu vid, după   ce filamentul se  încalzeşte, după  încalzeşte,   el va emite electroni ce pot fi acceleraţi acceleraţi prin  prin intermediul unei diferenţe de diferenţe  de potenţial potenţial.. • Fluxul de electroni astfel realizat are proprietăţi similare luminii, prezintă proprietăţi proprietăţi corpusculare  corpusculare şi vibratorii şi  vibratorii,,  însă lungimea  însă lungimea de undă este undă este mult mai mică in mică in comparaţie cu comparaţie cu lumina albă. albă. •

•

1- sursa fascicul cu electroni

•

2- lentila condensator

•

3- bobina magnetica cu rol de obiectiv

•

4- bobina magnetica proiectoare

•

5- planul obiectului

•

1- catod (filament tungsten)

•

6- imagine intermediara

•

•

7-imagine finala

2- circuit de incalzire a filamentului

•

8- luneta de observare a imaginii finale

•

3- anod

•

4- tensiune

9- conexiuni cu pompe de vid

•

5- iris de camp ptr orientare fascicul de electroni

•

6- traiectoria unui electron fara iris de camp

•

7-traiectoria unui electron cu modulare

•

Tipuri de microscoape electronice 1. Microscopul electronic cu transmisie (MET) •

•

• •

•

Implica o rază de electroni la tensiune tensiune înaltă  înaltă emisă de un catod catod (de  (de regulă filament de tungsten tungsten)) şi focalizată de lentile electrostatice şi electromagnetice.. Raza de electroni, care a fost transmisă printr -un electromagnetice -un specimen parţial transparent pentru electroni, electroni, transportă informaţie despre structura internă a specimenului . Variaţia spaţială a acestei informaţii ("imaginea") este apoi mărită de o serie de lentile electromagnetice până când este înregistrată la coliziunea cu un ecran fluorescent, placă fotografică, sau senzor de lumină. Imaginea detectată de senzor poate fi afişată în timp real pe un monitor sau transmisă pe loc unui calculator. Se realizează producerea unor imagini cu rezoluţie suficient de bună pentru a evidenţia atomi de carbon carbon în  în diamante diamante,, aflaţi la distanţe de doar 0.89 ångströmi ångströmi (89  (89 picometri picometri)) unii de alţii şi atomi din silicon silicon la  la distanţe de 0.78 ångströmi (78 picometri), mărind de 50 de milioane de ori. Capacitatea de a determina poziţiile atomilor în cadrul materialelor a făcut din acest tip de microscop o unealtă importantă pentru cercetarea şi dezvoltarea dezvoltarea din domeniul nanotehnologiilor.

2. Microscopul electronic cu scanare (MES)

M i c r o s c o p e l ec ec t r o n i c d e b a l e i aj aj ( S EM E M /E /E S E    – EDAX)  – QUA NTA NTA 200 Marire: m axim 1 000 000 0 00X. X. M i c r o s c o p e l ec ec t r o n i c d e b a l ei ei a  – j   TESLA B S 301 Marire: 30 000X.

Spre deosebire de MET, MET, unde raza de electroni la tensiune înaltă î naltă formează imaginea specimenului, microscopul electronic cu scanare produce imagini prin detecţia electronilor secundari, secundari, cu energie scăzută, emisi de pe suprafaţa specimenului datorită excitării acestuia de către raza principală de electroni. electroni.  În MES, raza de electroni parcurge întreg specimenul, specimenul, detectorii construind o imagine prin maparea semnalelor detectate la poziţia razei.

3. Microscopul electronic cu reflexie (MER) • aceas această tă tehni tehnică că impl implic ică ă raze raze de electr electroni oni inc incid ident ente e pe o suprafaţă dar în loc să folosească electronii transmişi sau cei secundari, se detectează raza reflectată.

4.

Microscopul electronic cu scanare şi transmisie (MEST) MEST combină înalta rezoluţie a MET cu funcţionalităţile MES, permiţând folosirea unei game de tehnici de analiză imposibil de atins cu MET convenţionale.

 Aplicaţii • • • •

In ingineria materialelor si medicina/biologie Este un instrument ideal pentru studiul structurilor submicroscopice celulare, al unor constituienţi chimici celulari sau macromolecule, datorita puterii mari de rezoluţie Se pot studia structurile din cristale si cele biologice Permit studiul in relief al structurilor biologice (scaning) util in lamurirea aramnjamentelor moleculare ale membranelor plasmatice si citoplasmatice.

IN STUDIILE BIOLOGICE TIPURILE DE INFORMATII CARE SE POT OBTINE PRIN MICROSCOPIE ELECTRONICA

- gradul de inrudire genetica dintre organisme;

- biosinteza de proteine si structurile implicate in acest proces; - structura si configuratia macromoleculelor proteice; - configuratia moleculara a acizilor nucleici si nucleici si stabilirea greutatii lor moleculare; - procese de filtrare prin pri n membrana; - transportul ionic in celule;

PRELUCRAREA PROBELOR PENTRU STUDIUL ELECTRONO-MICROSCOPIC ETAPE PENTRU STUDIUL ELECTRONO-MICROSCOPIC  AL PROBELOR PROBELOR BIOLOGICE BIOLOGICE

• • • • • • • •

Prelevarea materialului Fixarea Deshidratarea Incl Includ uder erea ea in raşi raşini ni sint sintet etic ice e Secţionarea Etalarea sec secţiunilor  Observarea Fotografierea

Conditia esentiala obtinerii unor rezultate corecte este ca probele de material biologic sa fie prelevate numai din organisme vii care nu au suferit actiunea unor factori stresanti sau din culturi celulare proaspete si direct din mediul in care au crescut concomitent cu prelevarea pieselor de tesut se realizeaza si o prefixare a materialului respectiv. - Cu ajutorul a 2 lame de ras noi, noi , bine degresate, se confectioneaza cubulete cu latura de 1mm. - Fragmentele se intorduc intr-un flacon cu fixator racit la +4°C. FIXAREA - Reprezinta conservarea structurilor biologice cat mai aproape de starea lor functionala vie. Tipul de fixator, procedeul folosit la fixare si durata diferitelor etape ale procesului de fixare depind nu numai de materialul biologic ci si de scopul urmarit in cadrul studiului intreprins.

•

Pentru fixare se folosesc:

•

a. Metode fizice: deshidratarea inerta cu alcool;

•

b. Metode chimice: folosesc proprietatile unor reactivi care blocheaza rapid metabolismul celular, inclusiv activitatile enzimatice.

SPALAREA PROBELOR •

 - Opreste procesul de fixare si indeparteaza excesul de fixator

•

- Se spala tesuturile timp de 5-20 min cu aceeasi solutie tampon care a fost folosita la prepararea fixatorului.

Imagini obţinute electrono-microscopic electrono -microscopic

S al a l m o n e l la la t y p h i m u r i u m  

Fotografie obţinută prin microscopie electronică a speciei Leptospira interrogans izolată din rinichii bolnavilor de leptospiroză

Mycobacterium tuberculosis Microscopie electronică Sursa: CDC/ Dr. Ray Butler; Butler; Janice Carr 

Bacillus anthracis sub acţiunea penicilinei

E. coli în faza de diviziune. 128000x

Secţiune frunză de ferigă X 1,000 Proteus mirabilis Microscopie electronică Sursa: Visuals Unlimited/Corbis

Purice marire 86x

Cap de ţânţar X 200

Ebola Virus, Virus,

Virusul gripei aviare (avian-flu-virus)