TECNICAS DE TINCIONES HISTOLOGICAS

Antes de hablar de tinciones histológicas debemos conocer cual es el proceso de preparación de un tejido histológico Se deben seguir los siguientes pasos: OBTENCIÓN DE LA PIEZA - Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadáver. Para histología normal es necesario que se trate de un cadáver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesión, por lo menos el órgano que se quiere estudiar. - Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico histopatológico. - Piezas operadas: los tejidos que han sido extraídos de las intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores u órganos inflamados, también pueden darnos material de investigación pero, como en el caso anterior, sólo servirán para anatomía patológica.

FIJACIÓN La fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima.

Fijación de la muestra. Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan para tal fin. Cualidades que debe tener un fijador: 1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis, desintegración, etc.). 2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar. 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo. 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.). 5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella. 6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales. 7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos. Manera de actuar de los fijadores Varía con la composición o naturaleza de los mismos: coagulando las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro). La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración ulterior de los tejidos (recuérdese que éstos, en su mayoría, son reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molécula de hidrógeno con su cromóforo). Fijadores químicos Son los más utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitución. FIJADORES SIMPLES: a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos. b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.

c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.). d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien estructuras celulares. e) Bicromato de potasio al 3-5%. FIJADORES COMPUESTOS: En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética. b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética. c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética. e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico. FIJADORES FÍSICOS: 1. Desecación. 2. Calor seco. 3. Calor húmedo. 4. Frío. 5. Congelación y desecación. DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA Deshidratación Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación creciente.

Se dispone una lámina en un cassette de deshidratación.

Deshidratación en alcoholes sucesivos. Impregnación por un disolvente de la parafina (aclaración) Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol (este último es el que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratación no ha sido bien lograda y debemos repetir el baño de alcohol absoluto cerciorándonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de toluol no debe enturbiarlo.

Penetración de la parafina Se sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina.

Penetración de la parafina a 56-58ºC. Inclusión definitiva o formación del bloque En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera.

Barras de Leuckart A los 15-30 minutos la parafina se habrá solidificado completamente, recortamos los bloques en forma de pirámide cuadrangular truncada, lo adherimos a un taquito de madera mediante una espátula calentada con la llama de un mechero y ya podemos realizar los cortes con el micrótomo.

Factura del taco para cortar.

OBTENCIÓN DE CORTES

El objeto de la inclusión que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrótomos son instrumentos de gran precisión que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones. Consideraremos cuatro tipos de micrótomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelación, y el crióstato o criótomo. - Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guías especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos. - Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.

Corte en micrótomo tipo Minot.

- Tipo congelación: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelación colocado debajo de la platina que utiliza la expansión brusca del anhídrido carbónico contenido en un cilindro con el cual se comunica.

- Crióstato: consta de un micrótomo tipo Minot incluido en una cámara de congelación. El volante de inercia que controla la realización del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance están situados dentro de la cámara fría (normalmente a -20º C). Pese a la disposición horizontal de la cuchilla, la obtención de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema antienrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los modelos más modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, así como enfriar rápidamente la muestra a -60º C gracias a la existencia de una placa de congelación instantánea. Frente al micrótomo convencional de congelación, el crióstato posee la gran ventaja de permitir la obtención de cortes mucho más delgados (por lo general de 4 µm y, en manos experimentadas, hasta 2 µm).

Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrótomo, en agua tibia contenida en un cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos, previamente desengrasados, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histológica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuación se lo levanta.

COLORACIÓN Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloración. Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos. Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solución colorante.

Batería de Coloración H&E. MONTAJE Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro. La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. La aclaración se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo le confiere un índice de refracción semejante al del vidrio. Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto. Se deja secar unas horas antes de su observación al microscopio.

DIAGRAMA DE TECNICA HISTOLOGICA

A continuación veremos cuales son los tistintos ripos de tinsiones que existen en la histología. Tipos de tinciones Existen múltiples métodos de tinción histológica, unos generales y otros específicos, que permiten poner de manifiesto tanto la topografía tisular, como tipos celulares concretos, determinados orgánulos o estructuras intracelulares. Las tinciones histológicas propiamente dichas utilizan colorantes, la mayor parte de ellos derivados de la industria textil, que se eligen en función de su capacidad de interaccionar con los diferentes constituyentes de los tejidos. Técnicas de tinción más complejas como las histoenzimáticas o inmunocitoquímicas se basan en el empleo de sustratos, lectinas, anticuerpos, etc. ¿Que es un colorante? Un colorante es una molécula que tiene la capacidad de absorber radiaciones electromagnéticas dentro de la región del espectro visible es decir entre 400 y 650 nm. Los colorantes que absorben todas las radiaciones entre estos márgenes, no transmiten ningún tipo de luz y se ven por lo tanto de color negro. Aquellos colorantes que absorben una franja más estrecha, transmiten un color determinado. Por ejemplo el ácido pícrico absorbe predominantemente la luz azul-violeta del final del espectro visible, dando como resultado una luz transmitida de color amarillo. ¿Cuándo se habla de un buen método de tinción? Un buen método de tinci²n es aquel que cuando se reproduce da un alto porcentaje de Éxito con resultados equiparables. Todos lo métodos de tinci²n requieren siempre una adapataci²n o modificaci²n para ser utilizados correctamente. Para reproducir un método de tinción hay que utilizar siempre reactivos, colorantes y agua destilada de calidad y preparar las soluciones colorantes en material de vidrio extremadamente limpio. Conviene tener presente que la técnica de tinci²n en sí misma no es una técnica aislada sino que forma parte integral de todo el proceso histol²gico. Los protocolos de tinción deben escribirse de forma concisa, anotando de forma muy precisa indicando claramente todos los pasos necesarios para preparar todas las soluciones empleadas, tiempos de actuación, temperatura, condiciones, etc... ¿Puede la fijación interaccionar con la técnica de tinción? Los diferentes fijadores interactúan de forma diferente sobre las moléculas que componen los tejidos produciendo modificaciones. En un mismo tejido, los colorantes se comportan de forma diferente en funci²n del grado de fijación y de la naturaleza del fijador utilizado. Por ejemplo, se conoce que tanto la formalina como el tetroxido de osmio inducen basofilia en los tejidos, mientras que las soluciones colorantes a base de

dicromato inducen acidofilia. En comparación con la formalina, el fijador de Carnoy incrementa la avidez del tejido por los colorantes, mientras que el fijador de Zenker disminuye el grado de coloraci²n. ¿Que es una tinción progresiva y una tinción regresiva? Una tinción progresiva es aquella en las que los cortes histológicos se sumergen en la solución colorante durante el tiempo necesario hasta que adquieren el grado de tinción deseada. Cuanto más tiempo están los cortes en la solución colorante, más fuerte es la tinción. Una tinción regresiva es aquella en la que los cortes se "sobretiñen" dejándolos en la solución colorante durante un tiempo excesivo y posteriormente se procede a retirar el exceso de colorante (proceso que se llama "diferenciación") mediante tratamiento con una solución ácida o alcohólica. En este caso se ajusta el tiempo de diferenciación. ¿Qué diferencia hay entre una tinción física y una tinción química? En una tinción física, el colorante se disuelve en el sustrato. Por ejemplo el Sudán III se disuelve en las grasas, y es empleado para demostrar gotas lipídicas. En una tinción química, el colorante interacciona químicamente con el sustrato a través de fuerzas de van der Waals, puentes de hidrógeno, enlaces covalentes o enlaces electrostáticos. ¿Qué es una tinción directa y una indirecta? En una tinción directa el colorante interacciona directamente con el sustrato. En una tinción indirecta se hace interaccionar en primer lugar a una sustancia química denominada "mordiente" con el sustrato la cual permite la posterior interacción del colorante. Usualmente los mordientes son sales, hidróxidos o alumbres de metales bivalentes o trivalentes. ¿Qué es una tinción tricromía? Las tinciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante, o múltiples cuando se usan dos o más colorantes. En una tinción tricromía se emplean tres colorantes, cada uno de ellos con unas particularidades, de tal manera que se consigue teñir con colores diferentes, estructuras diferentes, permitiendo así su rápida identificación en el microscopio. ¿Qué es una tinción supra vital? Es aquella que se realiza sobre células frescas, recién obtenidas, con objeto de realizar una observación de las estructuras teñidas con las células vivas. Por ejemplo, se puede teñir las mitocondrias de células vivas con el colorante Verde Jano y observarlas con el microscopio mientras las células permanecen vivas.

¿Qué es una tinción vital? Es aquel procedimiento por el cual un colorante no-tóxico, como el Carmín de litio o el Azul Tripán, se inyecta en un organismo vivo para estudiar procesos vitales de células capaces de acumularlo por pinocitosis o fagocitosis. ¿En qué consiste una tinción negativa? Esta forma de tinción se basa en que el colorante no-tiñe la estructura que se desea estudiar, de tal forma que la morfología externa o los contornos de esa estructura quedan delimitados por el propio colorante que se encuentra a su alrededor. ¿Qué es una tinción de cortes "en flotación"? Usualmente los cortes histológicos se montan sobre portaobjetos antes de ser teñidos lo cual facilita su manipulación. Sin embargo en ocasiones, sobre todo cuando se utilizan cortes gruesos de 30-50 micras, obtenidos con un criostato o con un vibratomo, conviene realizar determinado tipo de tinciones "en flotación". Para ello los cortes de tejido se mantienen sumergidos (en flotación) en el interior de la solución colorante lo cual permite la accesibilidad del colorante por ambas superficies. Este tipo de técnica es poco común cuando se utilizan colorantes pero es habitual cuando se realizan técnicas de tinción histoenzimáticas o inmunocitoquímicas. ¿Qué es una tinción en placa? Es aquella que se realiza utilizando placas de cultivo celulares. Es decir, la tinción se realiza sobre células que se han mantenido vivas en condiciones in vitro. ¿En qué consiste una tinción "en bloque"? En ocasiones, en algunos tipos de impregnaciones metálicas, técnicas de Golgi, etc... Conviene realizar la tinción no sobre cortes histológicos sino sobre la pieza o bloque de tejido. Para ello el bloque de tejido se sumerge en la solución colorante durante un tiempo determinado. Los resultados finales no se pueden valorar, sin embargo, hasta que no se han confeccionado los cortes y se realiza la observación microscópica. ¿Qué es una tinción para microscopía electrónica? Para la observación de los cortes ultra finos con el microscopio electrónico de transmisión, es preciso "contrastar" los cortes con objeto de incrementar las diferencias de densidad electrónica de las diferentes partes de la muestra. Para ello se recurre al empleo de sales de metales pesados como uranio, wolframio o plomo.

¿Qué es una tinción histoenzimática? El objetivo de una tinción histoenzimática es detectar la presencia de un enzima. Para ello se recurre a una serie de reacciones químicas que demuestran la presencia del producto de la activida de enzimática. ¿Qué es una tinción inmunocitoquímica? Las tinciones inmunocitoquímicas o inmunohistoquímica pretenden detectar la presencia de una molécula con características antigénicas. Para ello se recurre al empleo de anticuerpos que interaccionan directamente con los antígenos. Estos anticuerpos pueden estar marcados con una sustancia fluorescente y en este caso se trata de una tinción de inmunofluorescencia.

TECNICAS DE TINCIONES HISTOLOGICAS

Hematoxilina-eosina La hematoxilina es un colorante catiónico mientras que la eosina es un colorante aniónico perteneciente a los xantenos. Se teñirán los núcleos de azul, citoplasmas en rosa, músculo en tonos rojizos a rosados fucsia, glóbulos rojos en naranja o rojo y la fibrina en rosa intenso. 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

5º- Lavar en H2O-2min.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

6º-Eosina alcohólica-1min.

3º- Lavar en H2O destilada.

7º-Deshidratar. Alcohol de 70º Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol.

4º- Hematoxilina-5min.

8º- Montaje.

Giemsa La técnica radica en la disociación controlada de las sales de eosinato que ocurre al insolubilizar la mezcla del giemsa por disolución en H2O destilada; la eosina así liberada colorea el componente extracelular y determinadas extructuras acidófilas; y los derivados de azur, las estructuras de carácter basófilo. La cromatina nuclear adopta una tinción azul violeta. 1º- Desparafinar. Estufa durante 30 min. a 60ºC Sumergimos en xilol durnate 10 o 15 min.

7º- Alcohol de 96º- 2-3 pases rápidos.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º -5min. Alcohol 70º -5min.

8º- Alcohol isopropílico -3 min.

3º- Lavar en H2O destilada.

9º - Alcohol isopropílico -3 min.

4º- Solución Giemsa al 20 %- 45 min.

10º- Xilol.

5º -Lavar con agua corriente 5 - 10min.

11º- Montar.

6º-Alcohol 70º - 2-3 pases rápidos

Gram Permite la observación de bacterias, pero no su identificación específica. Permite observar su morfología, e incluso si una vez teñidos son gram + ó gram - ó ácido alcohol resistentes. Tiñe los organismos Gram+ de azul negruzco, Gram- de rojo y el fondo rosa. SOLUCIONES: 1.- Solución Cristal Violeta: -Cristal violeta-------------------------------------------2 gr. - Alcohol96º -------------------------------------------20 ml - Agua destilada --------------------------------------78 ml

2.- Solución Lugol: - Yodo ----------------------------------------------1.5 gr. - Yodato potásico ---------------------------------3 gr. - Agua destilada --------------------------------450 ml 4.- Solución Fucsina básica al 0.5 % : - Fucsina básica---------------------------------------3.- Solución de Eter – Acetona : 0.5 gr. - Etil-éter ( concentrado ) ------------------------------125 ml - Alcohol95º ---------------------------------------------5 - Acetona--------------------------------------------------375 ml. ml - Agua destilada ---------------------------------------95 ml 5.- Solución de ácido pícrico acetona : 6.- Solución Acetona xilol: -Ácido pícrico------------------------------------------------0.1 -Acetona --------------------------------------------50 ml gr. - Xilol -------------------------------------------------50 ml - Acetona---------------------------------------------------100 ml

TÉCNICA: 1.- Desparafinar e hidratar. 8.- Lavar en agua corriente 9.- Sumergir en acetona para que empiece la diferenciación, y continuarla 2.- Solución cristal violeta ( filtrado ) - 2 con la solución de acetona-ácido min. pícrico, hasta que los cortes estén amarillo-rosado. 3.- Lavar rápidamente con agua 10.- Lavar rápidamente en acetona. corriente. 4.- Solución Lugol -1 min. 11.- Lavar en solución acetona-xilol. 5.- Lavar en agua corriente. 12.- Aclara con xilol 6.- Decolorar con solución éter-acetona, gota a gota, hasta que no suelte más 13.- Montar. color. 7.- Solución Fucsina básica ( filtrada ) - 3 min.

Tricromico de Masson Es una técnica para la coloración de fibras colágenas y elásticas. Se observan tres colores distintos; tejido conjuntivo de verde, tejido muscular de verde pardo, eritrocitos de rojizo, núcleos azul negro y citoplasma y fibras musculares rosa. 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

7º- Ácido fosfomolíbdico 5 min.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

8º- Ácido fosfomolíbdico 5 min.

3º- Lavar en H2O destilada.

9º- Verde luz 5-7 min.

4º- Hematoxilina de Weigert 5 min.

10º-Deshidratar. Alcohol de 70º Alcohol de 96º. Xilol.

5º- Lavar con agua corriente 10 min.

11º- Montaje.

6º- Fucsina de Ponceau 5 min.

Tinción para reticulina 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

11º- Lavar con agua destilada 1-2 pases.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

12º- Formol al 10 % -5 min.

3º- Lavar en H2O destilada.

13º- Lavar con agua destilada 1-2 pases.

4º- Permanganato potásico al 1% -1 min. 14º- Cloruro de oro al 0.2%-2 min. 5º- Lavar con agua destilada 1-2 pases

15º Lavar con agua destilada 1-2 pases.

6º- Metabisulfito potásico al 2% - 1 min. 16º Metabisulfito potásico al 2%-2 min. 7º- Lavar con agua destilada 1-2 pases

17º- Tiosulfato sódico al 2%-- 1 min.

8º - Alumbre férrico al 2% - 2 min.

18º- Lavar con agua corriente 5 min.

19º-Deshidratar. Alcohol de 70º 9º- Lavar con agua destilada -1-2 pases. Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol. 10º- Reactivo de Wilder - 2 min.

20º- Montaje. RESULTADOS: Reticulina: negro. Núcleos: grisáceo.

Colágena: púrpura grisáceo.

PAS Se usa como técnica de rutina para observar las membranas basales que separan el tejido epitelial del corión. Tiñe los núcleos de color azul, el glucógeno de color púrpura y el material PAS + (polisacáridos simples, mucopolisacáridos neutros, mucoproteínas, glucoproteínas y glucolípidos) rojo rosa. SOLUCIONES: 1 .- Ácido periódico al 0.5 %

2.- Hematoxilina de Mayer

3.- Ácido sulfuroso :

4.- Reactivo de Shiff

- Metabisulfito sódico al 10 % ------------------ - Fucsina básica ----------------------------------6 ml. 1 gr. - Ácido hidroclórico 1N al 10 % ---------------- - Metabisulfito sódico anhidro -----------------5 ml 1 gr. - Agua destilada -------------------------------- - Agua destilada ----------------------------------100 ml 200 ml - Ácido hidroclórico 1 N ------------------------20 ml Hervir el agua destilada, añadir la fucsina básica, agitar y enfriar a 50ºC. Filtrar y añadir ácido hidroclórico, enfriar a 25ºC Añadir metabisulfito sódico. Ésta solución está lista para usarse cuando se torna casi incolora, lo cual puede llevar hasta 2 días, en un lugar oscuro. TÉCNICA: 1.- Desparafinar e hidratar.

7.- Hematoxilina de Mayer ------------ 10 min.

2.- Ácido periódico al 5 % --------------5 min.

8.- Lavar con agua corriente -----------5 min.

3.- Lavar en agua corriente--------------5 min.

9.- Deshidratar.

4.- Reactivo de Shiff --------------------- 15 min.

10.- Aclarar con xilol.

5.- Bisulfito sódico al 2 % ------------------5 11.- Montar. min. 6.- Lavar en agua corriente --------------5 min.

Elástica de Van Gieson

Es una técnica para la coloración de fibras colágenas y elásticas. El colágeno parece que capta un colorante ácido. Tiñe el colágeno de rojo, núcleos y fibras elásticas de negro y citoplasma de amarillo.

1.- Hematoxilina de Verhoeff:

SOLUCIONES: 2.- Solución de Picrofucsina:

- Hematoxilina alcohólica:

- Fucsina ácida al 1 % ---------------------------1.3 ml

Hematoxilina ------------------------------------10 gr. - Ácido pícrico a saturación ---------------------9.7 ml Alcohol96º -------------------------------------100 ml -Cloruro férrico al 10 %: Cloruro férrico ----------------------------------10 gr. Agua destilada ---------------------------------100 ml - Yoduro potásico al 10 %: Yoduro potásico --------------------------------10 gr. Agua destilada ---------------------------------100 ml - Alcohol 50º TÉCNICA: 1.- Desparafinar e hidratar 2.- Hematoxilina de Verhoeff ---------30 min. 3.- Lavar ----------------------------------1 pase 4.- Cloruro férrico al 1 % ---------------1 pase

6.- Picrofucsina -------------------1 pase 7.- Deshidratar 8.- Aclara con xilol 9.- Montar

5.- Lavado en agua corriente ---------1 pase

Azul Alcian SOLUCIÓN: Azul alcian---------- 1 gr. Acido acético------- 3 c.c Agua destilada----- 97 c.c TÉCNICA 1-. Desparafinar. Estufa durante 30 min. a 60ºC Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

3º- Lavar en H2O destilada.

4-. Hematoxilina de Harris 10 min.

5º- Lavar con agua corriente 10 min.

6º - Azul alcian al 2% - 10 min. 7º-Deshidratar. Alcohol de 70º Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol. 8º- Montaje.

Grocott Para la tinción de hongos (candida, aspergillus…). 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min. 3º- Lavar en H2O destilada

10º- Lavar con agua destilada 6 pases.

11º- Cloruro de oro al 0.2 % - 2-5 min. 12º Lavar con agua destilada 5 min.

4º- Solución de ácido crómico al 4% - 1 hora

13º- Tiosulfato sódico al 2% - 2-5 min.

5º- Lavar en agua corriente 5 min.

14º- Lavar con agua corriente

6º Bisulfito sódico al 1% - 1 min.

15º- Solución verde luz al 1% - 30-40 seg.

7º- Lavar agua corriente 5 min. 8º- Lavar con agua destilada 3-4 pases 9º- Solución argéntica de trabajo: En estufa 60º--------------------------------- 1 hora En microondas (descongelación) -------- 1-2 min.

16º-Deshidratar. Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol. 17º- Montaje.

Hierro coloidal 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

7º- Mezcla ferrocianuro-clorhídrico 20 min.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

8º- Lavar con agua corriente -5 min.

3º- Lavar en H2O destilada.

9º- Lavar en agua destilada 3-4 pases.

4º- Solución acética 3 min.

10º- Si se desea se puede contrastar con: Van Gieson 10 min. Rojo neutro 10 min.

11º-Deshidratar. Alcohol de 70º 5º - Solución de trabajo de Hierro coloidal 1 Alcohol de 96º. hora. Alcohol absoluto. Xilol. 6º- Solución acética 4 lavados ( 3 min./lavado )

12º- Montaje.

Mucicarmin de Mayer Las mucinas o mucoproteínas son proteínas con H.C. en una proporción superior al 4 %. La técnica del mucicarmín de Mayer sirve para identificar globalmente las mucinas, pero no reconoce su naturaleza bioquímica. 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

6º - Solución diluida de mucicarmín ( 1:4 ) 30 min.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

7º - Lavar con agua corriente 10 min.

3º- Lavar en H2O destilada.

8º-Deshidratar. Alcohol de 70º Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol.

4º- Teñir con Hematoxilina de Weigert 10 9º- Montaje. min. 5º - Lavar con agua corriente 3 min.

Hemalumbre de Mayer 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

5º-Lavar con agua corriente 5 min.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

6º Contracolorear ( si se quiere ) con hematoxilina-eosina u otro colorante.

3º- Lavar en H2O destilada.

7º-Deshidratar. Alcohol de 70º Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol.

4º- Colorear con hemalumbre de Mayer de 8º- Montaje. 5 -10 min.

Orceina ORCEINA (fibras elásticas, virus, hepatitis, cobre) 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

7º- Solución de Orceína --1:30 h. en estufa.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

8º - Lavar en agua corriente y dejar secar.

3º- Lavar en H2O destilada

9º - Alcohol clorhídrico al 1% ---- 1 pase

4º- Permanganato potásico ----10 min.

10º- Deshidratar a partir de alcohol absoluto.

5º - Ácido oxálico al 2 % - 1 pase

11º- Xilol

6º- Lavar en agua corriente

12º- Montar

Perls 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

6º - Hematoxilina de Mayer -10 min.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

7º- Lavar en agua corriente hasta que vire.

3º- Lavar en H2O destilada.

8º- Eosina 1 pase.

4º - Reactivo de perls 30 min.

9º-Deshidratar. Alcohol de 70º Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol.

5º - Lavar con agua corriente 5 min.

10º- Montaje.

RESULTADOS: Hierro: azul.

Rojo congo 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

7º- Lavar en agua corriente - 5 min.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

8º- Yoduro potásico --3-4 min.

3º- Lavar en H2O destilada.

9º- Lavar con agua corriente.

10º-Deshidratar. Alcohol de 70º 4º- Hematoxilina de Carazzi o de Weigert 10 Alcohol de 96º. min. Alcohol absoluto. Xilol. 5º- Lavar en agua corriente - 10 min. 11º- Montaje. 6º- Solución Rojo Congo - 10 min. (en el momento del uso se cogen 8 ml de rojo congo y se mezclan con 2 ml de glicerina. Filtrar)

Plata metenamina o Hexamina 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min. 3º- Lavar en H2O destilada. 4º- Ácido per yódico al 0.5 % - 15 min. 5º- Solución de Ag-Metenamina: . En estufa - 60 min. (controlar la tinción hasta que alcance un color tabaco y comprobar al microscopio que se han teñido los glomérulos)

9º- Tiosulfato sódico o hiposulfito sódico 5 min.

10º- Lavar en agua destilada. 11º- Hematoxilina de Mayer 10 min. 12º- Lavar en agua corriente

13º- Eosina - 3 min.

.En microondas - 1-2 min. (descongelación)

6º-Lavar en agua corriente

7º- Cloruro de oro al 0.2 % -- 2 min. 8º- Lavar en agua destilada.

14º-Deshidratar. Alcohol de 70º Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol. 15º- Montaje.

Sudan III 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

5º- Lavar con agua corriente.

2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.

6º- Hematoxilina o carmín (para el contraste)--5-10 min.

3º- Lavar en H2O destilada.

7º- Lavar en agua corriente 5 min.

4º Sudan III + 40 gotas de rojo escarlata - 8º- Montaje en glicerina levulosa, 24 horas. gelatina, etc. RESULTADO: Las grasas neutras se tiñen.

Violeta de Cresilo 1º- Desparafinado. Estufa durante 30 min.a 60º. Sumergimos en xilol durante 10-15 min.

4º- Violeta de cresilo 0.1% entre 20-30 min.

2º-Deshidratación. Alcohol absoluto durante 5 min. Alcohol 96º 5 min. Alcohol 70º 5 min.

5º- Lavar en agua corriente.

3º- Lavar en H2O destilada.

6º- Montar en medio acuoso.

Tinción de Semifinos

Contraste de Ultrafinos

Verde de Metilo - Pironina

Se trata de una solución de Verde de Metilo asociada con Pironina G según TarfKurnick. Colorante Histológico. Empleado para la investigación histológica del ácido nucleico contenido en los tejidos, así como para demostrar la presencia de células de la serie linfática y células plasmáticas. También es útil en la identificación de células plasmáticas y RNA en secciones de tejidos y preparaciones citológicas.

Mucicarmin

Mucicarmín Concentrada Biopur Acética de Tartrazina Biopur Colorante Histológico. Usado en la identificación de sitios de tumores primarios, ayudando a la distinción de células escamosas indiferenciadas mucina-negativas de los adenocarcinomas mucina-positivos. RESULTADOS La cápsula de los criptococos (hongos) se tiñe de rosa oscuro. La tartrazina tiñe el citoplasma de amarillo.

Ziehl

Fucsina Básica

Decolorante Azul de Metileno Método tradicional para la detección del bacilo tuberculoso. Para empleo con esputo, concentrado o por extensión directa, líquido cefalorraquídeo u otros fluidos corporales, incluyendo orina cateterizada y material homogeneizado de tejidos.

Shorr – Coloracion del Papanicolaou

Coloración de Papanicolaou

Se trata de una técnica citológica compuesta por 3 soluciones: Hematoxilina Biopur Colorante nuclear. Las características y recomendaciones para el uso de Hematoxilina Biopur fueron expuestas en la sección anterior. Rogamos referirse a la misma para información adicional.

OG Biopur Se trata de una solución alcohólica de ácido fosfotúngstico y Orange G. El ácido fosfotúngstico acidifica la solución y aumenta la unión del Orange G a zonas citoplasmáticas densas.

EA Biopur Se trata de una solución alcohólica, fotoestable que elimina los problemas causados por las tradicionales e inestables fórmulas numeradas EA-36/50/65/etc. No requiere filtración. Listo para usar. Tiñe selectivamente el citoplasma de células que tuvieron actividad metabólica poco antes de la recolección de la muestra. Tiñe de rosa a rojo las células escamosas superficiales, cilios, nucleolo y eritrocitos.

Feulgen

Técnica utilizada en histología para teñir selectivamente el DNA de las células. Esta técnica consiste en la hidrolización del DNA mediante una dilución débil de ácido clorhídrico que libera las bases púricas, quedando libres los radicales aldehídos de las pentosas, y en la coloración con leucofuscina, que pone de manifiesto los grupos aldehído.

Tincion Fluorescente

PARA LA TINCIÓN FLUORESCENTE Solución de Auramina Solución 1 Manipular la auramina con guantes, debe evitarse todo contacto porque es cancerígena - Auramina 0,1 g - Etanol 95% 10 ml Disolver la auramina en el etanol Solución 2 - Cristales de fenol 3 g - Agua destilada 87 ml Disolver los cristales de fenol en el agua. Mezclar las soluciones 1 y 2. Guardar el colorante así preparado en una botella color ámbar bien tapada, alejada del calor y de la luz. Rotular con el nombre Solución de Auramina-O y las fechas de preparación y vencimiento. Almacenar a temperatura ambiente no más de 3 meses. No filtrar con papel. Puede detectarser alguna turbidez que no afecta la coloración. Solución decolorante - Ácido clorhídrico 0,5 ml - Etanol 70% c.s.p. 100 ml Agregar siempre el ácido al alcohol, suavemente, y no al revés porque la temperatura de la solución aumenta explosivamente. Rotular la botella con el nombre del reactivo y con las fechas de preparación y vencimiento. Almacenar a temperatura ambiente. Colorantes de contraste Pueden usarse solución de permanganato de potasio o solución de naranja de acridina. Solución de Permanganato de potasio − Permanganato de potasio 0,5 g − Agua destilada 100 ml Disolver y guardar en una botella color ámbar bien tapada. Rotular con el nombre y las fechas de preparación y vencimiento. Almacenar a temperatura ambiente no más de 3 meses.

Solución de naranja de acridina − Fosfato dibásico de sodio anhidro 0,01 g − Agua destilada 100 ml − Naranja de acridina 0,01 g Disolver el fosfato de sodio en agua destilada. Agregar el naranja de acridina y disolver. Guardar el colorante así preparado en una botella color ámbar bien tapada alejada del calor y de la luz. Rotular con el nombre y las fechas de preparación y vencimiento. Almacenar a temperatura ambiente no más de 3 meses.

REFERENCIAS

Horobin RW, Kiernan JA (2002) Conn's Biological Stains. A Handbook of Dyes Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine. 10th ed. Oxford: BIOS. ISBN 185996-099-5 http://elprofedebiolo.blogspot.mx/2010/01/tecnicas-de-tincion.html http://es.scribd.com/doc/15606061/Tarea-4-tincion http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n http://html.rincondelvago.com/histoquimica.html http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/5-histoquimica.php http://www.bu.edu/histology/m/append02.htm http://www.uam.es/departamentos/medicina/patologia/Tecnicas.htm http://www.uv.es/histomed/practicas/04-adip/04-adip.htm Penney DP, Powers JM, Frank M, Churukian C (2002) analysis and testing of Biological Stains - the Biological Stain Commission Procedures. Biotechnic & Histochemistry 77: 237-275.