Técnicas de Laboratorio de Bioquímica Clínica (I)

1. Técnicas de laboratorio de bioquímica clínica (I) 1. Introducción 2. Técnicas espectrométricas a) Conceptos básicos b) Principales técnicas c) Espectrofotómetro 3. Espectrometría de absorción molecular 4. Espectrometría de absorción atómica 5. Espectrometría de emisión atómica 6. Espectrometría de luminiscencia a) Fotoluminisciencia b) Quimioluminiscencia 7. Espectrometría de dispersión a) Nefelometría b) Turbidimetría 8. Refractometría 9. Fotometría de reflectancia. Química seca


1. Introducción La bioquímica clínica es la rama de la salud que estudia los procesos metabólicos y moleculares que tienen lugar en nuestro organismo, tanto en estados de salud como de enfermedad. Las muestras biológicas mediante métodos químicos y bioquímicos, nos determinan las magnitudes bioquímicas tanto en estado de salud como de enfermedad; y estas magnitudes bioquímicas son valores cuantitativos de los procesos metabólicos; es decir: del estado clínico del paciente. Los valores alterados frente a los normales nos indican cambios fisiológicos, enfermedad patología, y respuesta a un tratamiento. Desde que empezamos a utilizar un método bioquímico a una muestra biológica, se le denomina pruebas bioquímicas. Nos dan información sobre la prevención, el diagnóstico, la evolución o pronóstico de una enfermedad. Así como el seguimiento mediante un tratamiento a esa enfermedad.

2. Técnicas espectrométricas Estas técnicas utilizan radiaciones electromagnéticas (REM) para la determinación de los parámetros bioquímicos. Las REM son formas de energía que cuando inciden sobre una muestra, ocurre algo que se va a poder analizar. Estos son distintos fenómenos, y nos aportan información cuantitativa y cualitativa del analito o parámetro que se quiere estudiar. Las principales REM para la bioquímica clínica son: • Luz visible (VIS) (300-700 nm) • Luz ultravioleta (UV) • Luz infrarroja (IR) Por este motivo, las técnicas espectrométricas también se denominan espectrofotométricas, dado que también se mueven en el rango de la luz. La espectrofotometría es el estudio del espectro de la luz.

a) Conceptos básicos

La energía se manifiesta de múltiples formas, entre ellas la REM, que se puede describir como radiaciones electromagnéticas formadas por partículas de energía o fotones, o como ondas (estas últimas formadas por campos electromagnéticos perpendiculares entre sí definidas por diversos parámetros (Amplitud, longitud de onda, frecuencia) y que al incidir sobre una muestra va a hacer que ocurra algo. En bioquímica clínica destacaremos su función para realizar estudios cuantitativos (UV-Visible) y cualitativos (infrarrojo) del analito. Las magnitudes que definen las ondas electromagnéticas son: • Amplitud (A): Desde el punto base hasta la zona más alta de la cresta de la onda, y se mide en unidades de longitud. • Longitud de onda: Distancia entre dos puntos iguales de una onda, y se mide también en unidades de longitud. • Frecuencia (v): el nº de ondas que se producen en un segundo. s-1 o Hz. Nota: La longitud de onda y la frecuencia son inversamente proporcionales. La energía de un fotón es igual a la constante de Plank por la frecuencia. E= h x v La frecuencia es la velocidad de la luz partido por la longitud de onda. E= h x C/ƛ Esta ecuación nos dice que el espectro electromagnético a energías mas grandes la longitud de onda será más pequeña, y en cambio será al revés. El espectro electromagnético se puede representar tanto para espectro 0 - 1000000 como para la energía, comenzando el valor más grande a la izquierda. Al conjunto de las REM se las representa en un espectro electromagnético ordenado en regiones según la longitud de onda.

b) Principales técnicas Cuando las REM inciden sobre una muestra tenían lugar distintos procesos que podían medirse. Los principales fenómenos que ocurren y tienen importancia en la bioquímica son: • Transmisión: Algo se absorbe pero atraviesa la muestra y transmite. • Emisión: Después de dar energía a una partícula que está en un estado fundamental y pasa a un nivel superior en el cual está inestable, esta partícula tiende a volver a su estado fundamental, y para ello tiene q desprenderse energía y vuelve a su estado fundamental. Fenómenos de fluorescencia, fosforescencia. Emisión molecular y atómica. • Absorción: La cantidad de haz que atraviesa la muestra. Absorción molecular y atómica. • Dispersión: Tiene lugar cuando hay partículas en suspensión, entonces el haz de luz choca con esa partícula, y al chocar el haz ya no pasa a través de ella al ser un sólido. El haz se dispersa en todas las direcciones. Turbidimetría y nefelometría. • Reflexión: Mide el efecto rebote y el ángulo de salida. Fotometría de reflectancia.

• Refracción: Cuando un haz de luz viaja en el vacío o aire y atraviesa un medio cambiando. Refractometría. • Difracción: Difracta el rayo desde una rejilla antes de entrar a la muestra, o al salir. La difracción del haz en varias direcciones, Esto también se da en partículas en suspensión. Dependiendo del fenómeno que se produzca, tenemos distintas técnicas espectrométricas para determinar esos fenómenos.

c) El espectrofotómetro Los equipos para determinar los distintos fenómenos que se pueden producir, tienen diseños diferentes, pero varios elementos en común. Haz de luz

Fuente de radiación

Monocromador

selector de longitud de onda

Sistema de registro y lectura

Cubeta

Rendija de entrada

Rendija de salida

• Fuente de radiación: Va a producir un haz de luz. • Rejilla de entrada: Por donde entra el haz • Monocromador: Selector de longitud de onda, y puede ser: - Prisma: Mediante giros selecciona la longitud de onda. Coge todo el rango. - Filtros: Son sólo los seleccionados.

Los espectrofotómetros pueden ser: • Haz sencillo: Una cubeta de blanco y luego una de muestra. • Doble haz: Presenta un cristal en la rendija de salida para una difracción en dos cubetas, al blanco y a la cubeta. En el blanco irá la sustancia que no quiero medir. Ej.: Si quiero medir la glucosa, tenemos que añadir un reactivo para que se forme un producto y es el que se pueda medir. Por tanto el blanco sería el reactivo con agua destilada y la muestra reactivo con suero.

3. Espectrometría de absorción molecular

Es una técnica que se basa en la capacidad de las moléculas de absorber una parte de radiación que recibe. Cada sustancia (molécula) absorbe a una longitud de onda característica, por lo que se puede identificar una molécula gracias a su longitud de onda. El análisis de la técnica de espectrometría de absorción molecular puede ser de dos maneras, cuantitativo o cualitativo: • Cualitativo: Nos dice lo que hay pero no cuánto hay. Esto se produce cuando hay una técnica de infrarrojo, y se realiza en bioquímica para los cálculos renales. • Cuantitativo: Tiene lugar cuando estudiamos la zona UV-V (ultravioleta visible) porque es donde se cumple la ecuación de Lambert-Beer. Una molécula está compuesta por átomos que están unidos por orbitales de enlace que comparten electrones. Cuando una molécula absorbe una REM pasa a un estado excitado o de mayor energía.

Aquí arriba se produce un cambio en los enlaces y en el movimiento de los electrones. Es decir, que cambia su estructura global, y se producen las llamadas transiciones. Estas transiciones a su vez dependen del tipo de enlace que haya entre los átomos de las moléculas y también de si la energía absorbida es suficiente para que se produzca esta transición. Así, una molécula tiene la capacidad de absorber REM a distintas longitudes de onda, a aquellas que tienen la capacidad de que la energía sea igual a la necesaria para que una molécula pase del estado fundamental al estado excitado o de nivel más alto de energía. Las REM del ultravioleta visible son de elevada energía, y estas REM son las que ayudan a producir estas transiciones. Las REM del infrarrojo no tienen ya tanta energía, por lo que sólo son capaces de producir vibraciones. Las REM del ultravioleta visible son las que producen esas transiciones. Solamente si se aplica una radiación entre el uv y el visible va a ser capaz de pasar a otro estado. Cuando utilizamos la zona del infrarrojo en bioquímica es para decir si hay o no algo, no para cuantificar. Para medir la absorción de energía radiante de una molécula, se usan la transmitancia y la absorbancia. El espectrofotómetro calcula siempre la intensidad de luz absorbida por la muestra. Sabiendo que la intensidad de luz transmitida (Io) partida por la Intensidad de luz incidente (It) es la transmitancia. Esta tiene un valor entre 0-100% o 0-1. ¿Qué significa que la transmitancia es 0? Que la absorción ha sido total. Por el contrario, si se trasmite el 100% significará que se ha transmitido todo y no ha habido absorción.

Esto indica que la transmitancia disminuye exponencialmente al aumentar la concentración de la muestra.

100 75 50 25 0

La transmitancia y la absorbancia tienen una relación lineal. A medida que disminuye la transmitancia, va a aumentar la absorbancia. La absorbancia tiene de 0-2,5. Entre la absorbancia y la concentración existe una relación directa, por lo que a más concentración, más absorbancia.

La Ley de Lambert-Beer nos indica que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración, siguiendo una linealidad. En el momento que se irrumpe esa linealidad deja de cumplirse la ley. A su vez nos relaciona la intensidad de luz incidente y la intensidad luz transmitida cuando un rayo de luz atraviesa una longitud l de un medio que va a absorber.

Las posibles desviaciones en la linealidad de la representación absorbancia-concentración puede ser por dos motivos: • Alteraciones en el aparato: Cubeta (sucia), detector (no le llega bien el haz) • Sustancias dentro de una muestra: interferentes La absorbancia es igual al logaritmo de la inversa de la transmitancia: Si expresamos la transmitancia en %, la absorbancia es: Los espectrofotómetros miden físicamente la transmitancia y efectúan un cálculo matemático o el anterior cálculo matemático para obtener los valores de absorbancia. Al estudiar las absorbancias para un rango de longitudes de onda, obtenemos un espectro de absorción. Este es un conjunto de bandas (transiciones electrónicas) que indican la cantidad de luz absorbida por una sustancia a diferentes valores de longitudes de onda y este espectro de absorción es característico de cada sustancia.

La mayoría de las determinaciones del laboratorio clínico-biomédico se hacen midiendo la absorbancia de moléculas que están a baja concentración. Beer estudió cómo se comportaba la luz al atravesar una disolución coloreada, y basándose en los experimentos de Lambert, enunció la ley de Lambert-Beer, que nos permite calcular la concentración de un analito determinando su absorbancia.

La ley de Lambert-Beer nos relaciona la intensidad de luz incidente y la intensidad luz transmitida cuando un rayo atraviesa una longitud de un medio que absorbe. (cuando un rayo de luz atraviesa una longitud l de un medio que va a absorber) y esto se relaciona así:

La intensidad de luz incidente es igual a la intensidad de luz incidente donde l es la longitud de muestra que atraviesa el rayo, que normalmente es siempre 1 cm. K es un coeficiente de absorción que depende de la naturaleza de la sustancia.

It = Io x e-a’ *c *l

Para disoluciones diluidas (que en realidad es lo que a la bioquímica le interesa debido a las concentraciones tan pequeñas (nm) y no lo vemos), hacemos unos cálculos:

- C: concentración de la disolución - a: va a seguir siendo un coeficiente de absorción y va a depender de la naturaleza de la sustancia.

Cuando la concentración [ ]se expresa en mol/l, la “a” se escribe con el signo epsilon E(de roberto) y sus unidades son (l/mol*cm) y se denomina coeficiente de extinción o de absorción molar. Es característico de cada sustancia y depende de las características del espectrofotómetro.

Se definen dos grupos de enlaces en bioquímica: • Grupo cromóforo: Enlaces químicos que absorben radiación en la zona UV-visible. Estos contienen dobles enlaces. C=C; C=O; N=O. • Grupo auxocromos: Este grupo no absorbe luz en esa zona, pero provocan un desplazamiento de la longitud de onda que hace que un grupo cromóforo pueda absorber. Al medir una molécula en una muestra, nos podemos encontrar con interferencias o con posibles absorbancias del disolvente, reactivo…

Por este motivo, antes de medir nuestra molécula, hay que hacer medidas de lo que no queremos medir (cubeta, etc). Estas absorbancias que no queremos medir se denominan blancos. Estos blancos establecen una línea basa sobre la que se aplica la ley de Lambert-Beer, por lo que en realidad esta ley debería ser de la siguiente manera:

A= E*c*l + n; siendo n la absorbancia de los blancos, no nos interesa.

Para relacionar la absorbancia de un analito con la concentración del analito, se requiere aplicar un procedimiento para calibrar la técnica aplicada. Para relacionar la absorbancia con la concentración del analito hay que aplicar un procedimiento para calibrar la técnica aplicada. Puede ser mediante: • Factor de calibración: Con este patrón se puede determinar la concentración de otra disolución de la misma sustancia usando un factor de calibración.

Cm= K * Am - Ab Cm= Concentración de la muestra K= factor de calibración, que es igual a la concentración patrón entre la absorbancia patrón (Cp/Ap) Am= Absorbancia de la muestra Ab= Absorbancia del blanco