Técnicas Analíticas de Contaminantes Químicos Aplicaciones Toxic

Subido por:

Libros de Ingeniería Química y más

https://www.facebook.com/pages/InterfaseIQ/146073555478947?ref=bookmarks

Si te gusta este libro y tienes la posibilidad, cómpralo para apoyar al autor.

TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTAMINANTES QUÍMICOS

Miguel Ángel Sogorb Sánchez Eugenio Vilanova Gisbert

TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTAMINANTES QUÍMICOS Aplicaciones toxicológicas, medioambientales y alimentarias

© Miguel Ángel Sogorb Sánchez y Eugenio Vilanova Gisbert, 2004

Reservados todos los derechos. «No está permitida la reproducción total o parcial de este libro, ni su tratamiento informático, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, por fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de los titulares del Copyright».

Ediciones Díaz de Santos, S. A. E-mail: [email protected] Internet://http:www.diazdesantos.es/ediciones

ISBN: 84-7978-662-0 Depósito legal: M. 45.611-2004 Diseño de Cubierta: Ángel Calvete Fotocomposición e Impresión: Fernández Ciudad, S. L. Encuadernación: Rústica-Hilo, S. L. Printed in Spain - Impreso en España

Índice general

Prólogo ...........................................................................................................

XI

Presentación de los autores ..........................................................................

XIII

PARTE I TRATAMIENTOS PREVIOS DE LA MUESTRA 1. Etapas de un análisis cuantitativo ........................................................ 1.1. 1.2. 1.3. 1.4.

3

Algunos términos muy comunes .................................................. Resolución de un problema analítico ........................................... Factores que condicionan la elección de un método analítico ..... Muestreo .......................................................................................

3 4 7 8

2. Preparación de muestras .......................................................................

11

2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7.

Solubilización y tratamientos previos .......................................... Concepto y necesidad de extracción ............................................ Extracción líquido-líquido ........................................................... Extracción Soxhlet ....................................................................... Extracción por fluidos supercríticos ............................................. Extracción en fase sólida .............................................................. Microextracción en fase sólida .....................................................

12 16 17 20 22 27 37

PARTE II TÉCNICAS DE VALORACIÓN 3. Métodos de análisis por valoración ......................................................

45

3.1. Aspectos generales de los métodos volumétricos ........................ 3.2. Valoraciones ácido-base ...............................................................

46 47

VII

VIII

•• •• ••

Índice general

3.3. 3.4. 3.5. 3.6.

Aplicaciones de las valoraciones ácido-base ............................... Valoraciones de precipitación ...................................................... Valoraciones por formación de complejos ................................... Métodos gravimétricos ................................................................

49 51 55 59

PARTE III TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 4. Técnicas espectroscópicas ..................................................................... 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8.

67

Introducción a las técnicas espectroscópicas ............................... La radiación electromagnética ..................................................... Teoría de la absorción molecular ................................................. Instrumentos ópticos en medidas de absorbancia ........................ Especies moleculares que absorben radiación visible y ultravioleta. Transmitancia, absorbancia y ley de Lambert-Beer .................... Espectroscopía de fluorescencia .................................................. Espectroscopía de infrarrojos ......................................................

68 68 73 76 81 85 87 92

5. Espectroscopía atómica .........................................................................

97

5.1. 5.2. 5.3. 5.4.

Espectros de absorción y emisión atómica .................................. Metodología de la espectroscopía de absorción atómica ............. Técnicas especiales de absorción atómica ................................... Metodología de emisión atómica .................................................

97 99 110 112

PARTE IV TÉCNICAS DE SEPARACIÓN 6. Introducción a la cromatografía .......................................................... 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5.

117

Cromatografía, experimentos cromatográficos sencillos ............. Desarrollo histórico de la cromatografía ..................................... Algunos términos elementales empleados en cromatografía ....... Clasificación de las técnicas cromatográficas .............................. Parámetros en cromatografía .......................................................

117 121 123 124 126

7. Tipos de cromatografía de líquidos ......................................................

135

7.1. Tipos de cromatografía de líquidos .............................................. 7.2. Cromatografía de líquidos de adsorción en fase normal .............. 7.3. Cromatografía de líquidos de adsorción en fase reversa .............

135 138 142

Índice general

7.4. 7.5. 7.6. 7.7. 7.8. 7.9. 7.10.

•• •• ••

IX

Cromatografía de líquidos de intercambio iónico ....................... Cromatografía de líquidos de exclusión molecular ..................... Cromatografía de líquidos quiral ................................................. Cromatografía de líquidos de afinidad ......................................... Gradientes en cromatografía de líquidos ..................................... Efecto de la temperatura sobre la cromatografía de líquidos ....... Tamaño de partícula de la fase estacionaria .................................

147 152 154 156 157 160 161

8. Cromatografía en capa fina ..................................................................

163

8.1. 8.2. 8.3. 8.4. 8.5.

Principios generales de cromatografía en capa fina ..................... Desarrollos bidimensionales de cromatografía en capa fina ....... Detección de analitos en cromatografía de capa fina .................. Aplicaciones de la cromatografía en capa fina ............................ Cromatografía en capa fina de alta resolución .............................

163 167 168 169 171

9. Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) ......................

173

9.1. Componentes básicos de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución ........................................................................................ 9.2. El sistema de impulsión de la fase móvil ..................................... 9.3. Columnas ..................................................................................... 9.4. Inyectores ..................................................................................... 9.5. Detectores .................................................................................... 9.6. Identificación de analitos en HPLC ............................................. 9.7. Cuantificación de analitos en HPLC ............................................ 9.8. Cursos de HPLC en internet ........................................................

174 177 181 183 187 196 196 197

10. Cromatografía de gases (GC) ...............................................................

199

10.1. 10.2. 10.3. 10.4. 10.5.

Conceptos básicos en cromatografía de gases ............................. Columnas en cromatografía de gases ........................................... Inyectores y modos de inyección ................................................. Temperatura en cromatografía de gases ....................................... Detectores en cromatografía de gases ..........................................

199 204 207 214 218

11. Electroforesis capilar (CE) ....................................................................

225

Características generales y aplicaciones de la electroforesis capilar. El equipo de electroforesis capilar ............................................... Fundamentos físico-químicos de la electroforesis capilar ........... Sistema de introducción de muestra ............................................ Detectores de electroforesis capilar ............................................. Modos de separación en electroforesis capilar ............................ Identificación de analitos por electroforesis capilar .................... Selección del método electroforético apropiado ..........................

225 226 229 231 233 234 244 244

11.1. 11.2. 11.3. 11.4. 11.5. 11.6. 11.7. 11.8.

X

•• •• ••

Índice general

PARTE V ESPECTROMETRÍA DE MASAS 12. Espectrometría de masas (MS) ............................................................. 12.1. 12.2. 12.3. 12.4. 12.5. 12.6. 12.7. 12.8.

El espectrómetro de masas ........................................................... Los espectros de masas ................................................................ Fuentes de ionización .................................................................. Analizadores ................................................................................ Detectores .................................................................................... Espectrómetros de masas en tándem (MS-MS) ........................... Modos de detección de m/z ......................................................... Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) .................................................................................. 12.9. Cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS) .................................................. 12.10. Plasma acoplado inductivamente acoplado a espectrometría de masas (ICP-MS) ........................................................................... 12.11. Espectrometría de masas en internet ............................................

247 248 249 252 260 264 265 267 268 271 272 278

PARTE VI QUÍMICA ANALÍTICA Y CALIDAD 13. La calidad en los laboratorios de Química Analítica .........................

283

Aproximación genérica al concepto de calidad ........................... Calidad en Química Analítica ...................................................... Normas ISO-25 sobre calidad en los laboratorios ....................... Buenas prácticas de laboratorio ................................................... Acreditación de los laboratorios analíticos ..................................

283 284 285 286 289

ANEXO 1: Problemas y ejercicios ................................................................

291

ANEXO 2: Soluciones a los problemas y ejercicios .....................................

299

ANEXO 3: Bibliografía complementaria y páginas web relacionadas ......

303

13.1. 13.2. 13.3. 13.4. 13.5.

Prólogo

Es un gran placer y al mismo tiempo un privilegio el que se me haya invitado a escribir el prólogo de este libro de técnicas analíticas de contaminantes químicos enfocado a las aplicaciones toxicológicas, medioambientales y alimentarias. Lo primero porque me ha permitido reencontrarme, aunque a vuela pluma, con unos contenidos muy bien estructurados y escritos de tal forma que facilitan su comprensión. Lo segundo, por el hecho de que los autores pensaran en este compañero de «fatigas toxicológicas» para llevarlo a cabo. Asumida y aceptada de buen grado mi condición de prologuista, he de ejercer como tal, y he pensado que esta actividad requiere un análisis del libro bajo dos aspectos fundamentales: sus contenidos y los autores que los han elaborado. Respecto a lo primero he de decir que está muy bien estructurado por módulos y abarca toda la metodología que debe de estar presente en un laboratorio de toxicología aplicada a diferentes campos para desarrollar un trabajo riguroso y eficaz. Además, está escrito con un lenguaje sencillo, sin perder rigurosidad en sus términos, lo que permitirá sin duda facilitar su comprensión y uso a aquellas personas a las que está destinado, y que según indican los autores son los estudiantes de pre y postgrado. En estos tiempos en que el uso de los libros por parte de los estudiantes está en mínimos, esta obra, a buen seguro, contribuirá a que algunos de ellos, inmersos en los diferentes campos de la Toxicología, puedan darse cuenta de que están ante una obra que merece su atención y, sobre todo, que les va a facilitar el conocimiento de toda una serie de técnicas de análisis que son usadas habitualmente en Toxicología. En relación a los autores, ambos son excelentes docentes e investigadores en Toxicología, lo que les permite tener una visión directa y real de las necesidades de conocimiento en el manejo de las técnicas de análisis como complemento para su labor diaria. Esta complementariedad de las técnicas instrumentales no exime de la neceXI

XII

•• •• ••

Prólogo

sidad de conocerlas en profundidad y, con absoluta seguridad, el estudio y lectura del texto que me honro en prologar lo va a conseguir a muchos más niveles de los que pretenden los autores, lo cual sinceramente deseo y auguro. MANUEL LÓPEZ-RIVADULLA Catedrático de Toxicología. Universidad de Santiago de Compostela, marzo 2004.

Presentación de los autores

Probablemente estás utilizando este libro porque te interesa su contenido y por lo tanto no necesitas más justificaciones. No obstante, pretendemos expresar la finalidad que nos llevó a escribirlo. Este libro está dirigido a estudiantes pre y postgraduados que, no siendo especialistas en Química Analítica, necesiten comprender de una forma elemental y lo más sencilla posible los fundamentos y aplicaciones de las técnicas analíticas más utilizadas en la determinación de contaminantes químicos. El libro se concibió con el objeto de ser práctico y útil para estudiantes de una gran variedad de disciplinas, destacando entre ellas la Toxicología y las Ciencias Ambientales. No obstante, su uso puede extenderse hacia otros campos como la tecnología de los alimentos, higiene laboral, sanitarios, etc. En definitiva, se destina a aquellos que pretenden introducirse en los problemas del control de contaminantes químicos, que van a ser usuarios de sistemas analíticos, o que simplemente generan muestras que han de enviar a laboratorios especializados, deseando conocer previamente las posibilidades, el poder y el valor de las técnicas analíticas que tienen a su disposición para resolver sus problemas de control. Existen excelentes tratados de Química Analítica, así como numerosos, exhaustivos y voluminosos libros sobre cada una de las técnicas instrumentales analíticas disponibles. Sin embargo, pensamos en escribir este libro al observar que nuestros estudiantes de Ciencias Ambientales tenían dificultades para disponer en un solo libro de la información básica necesaria para comprender los fundamentos y aplicaciones de las técnicas analíticas más utilizadas. No obstante, como ya ha quedado dicho, el libro pretende ser útil en todos los campos donde se requiera la determinación de contaminantes químicos. El libro se concentra especialmente en aquellas técnicas analíticas más utilizadas en controles de contaminantes en muestras ambientales, en alimentos, aguas y productos industriales, con especial énfasis en las técnicas cromatográficas, en todas sus facetas y con todos sus sistemas de detección. El libro también contiene un amplio capítulo dedicado a la espectrometría de masas, con especial atención a las posibilidades de XIII

XIV

•• •• ••

Presentación de los autores

aplicación acoplada a diferentes técnicas de separación y a determinaciones multielementales. Somos conscientes de que a veces es necesario aplicar técnicas no instrumentales más sencillas, y es por ello que también hemos dedicado un capítulo a técnicas de valoración, especialmente a métodos volumétricos. Además, tampoco olvidamos los procedimientos de preparación de muestras, especialmente en lo referente a las diferentes técnicas de extracción de analitos que es necesario aplicar a la muestra antes de proceder a las determinaciones instrumentales. Finalmente, deseamos expresar nuestro más sincero y profundo agradecimiento al Profesor Vicente Hernandis Martínez (Catedrático de Química Analítica de la Universidad de Alicante) por las sugerencias recibidas para mejorar el manuscrito original.

Dr. MIGUEL ÁNGEL SOGORB SÁNCHEZ

Profesor EUGENIO VILANOVA GISBERT

Profesor Colaborador del Área de Toxicología Universidad Miguel Hernández de Elche

Catedrático de Toxicología Universidad Miguel Hernández de Elche

PARTE

Tratamientos previos de la muestra

I

Etapas de un análisis cuantitativo

1

CONTENIDO 1.1. Algunos términos muy comunes 1.2. Resolución de un problema analítico 1.3. Factores que condicionan la elección de un método analítico 1.4. Muestreo

1.1. ALGUNOS TÉRMINOS MUY COMUNES A lo largo de este libro se manejarán una serie de términos muy utilizados en Química Analítica y que son comunes a todas las técnicas analíticas. A continuación se definen estos términos: QUÍMICA ANALÍTICA: Rama de la química que se dedica a reconocer substancias y determinar los diferentes constituyentes de mezclas (analítica cualitativa), así como a determinar las cantidades de cada uno de los componentes de dichas mezclas (analítica cuantitativa). MUESTRA PROBLEMA o MUESTRA: Material sobre el que se hace el análisis. Por ejemplo, un volumen de agua donde se desea conocer la concentración de plaguicidas, una muestra de sangre donde se desea determinar concentración de Hg2+, etc. ANALITO: Componente de la muestra que se desea analizar. En los casos anteriores los analitos serían plaguicidas y el catión Hg2+. MATRIZ: Medio físico que contiene el analito. Agua y sangre en los ejemplos anteriores. MUESTRA BLANCO o BLANCO: Muestra que no contiene analito pero con la misma matriz que la muestra problema. Una muestra blanco en los casos anteriores sería agua sin plaguicidas y sangre de un individuo no expuesto a Hg2+. 3

4

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

ENSAYO o ANÁLISIS: Conjunto de acciones aplicadas sobre la muestra para determinar la cantidad de analito. MUESTRA PATRÓN ó PATRÓN: Es una muestra de analito de concentración conocida. La muestra patrón no está necesariamente en la misma matriz que la muestra problema. Los patrones se utilizan para calibrar la respuesta de los instrumentos. Definiremos términos algo más específicos (propios de cada técnica) a medida que se estudie cada una de ellas.

1.2. RESOLUCIÓN DE UN PROBLEMA ANALÍTICO Cuando se plantea un problema analítico hay una secuencia de etapas que deben seguirse para solucionarlo. Todas estas etapas están en cierto modo relacionadas entre sí; se comentan a continuación y se presentan de manera esquemática en la Figura 1.1.

Definir la información que se necesita Seleccionar un método analítico Determinar la cantidad de muestra necesaria Obtener una muestra representativa Preparar la muestra en la forma apropiada para el análisis Eliminar posibles interferencias Calibrar los instrumentos mediante patrones de medida Medición de una propiedad del analito Cálculo de resultados Interpretación de los resultados

FIGURA 1.1. Etapas de un análisis químico.

Definir la información que se necesita. En primer lugar se debe definir la información que se necesita para resolver el problema. En realidad, se debe definir qué analito debemos determinar. La definición del analito a determinar no suele ser un pro-

Etapas de un análisis cuantitativo

•• •• ••

5

blema en muestras inorgánicas (agua, tierra, lodos, etc.). Sin embargo, con xenobióticos orgánicos en muestras de tejidos biológicos, se debe considerar el metabolismo de los mismos. Por ejemplo, si se sospecha que un animal ha muerto por intoxicación con un insecticida organofosforado, se debe tener en cuenta que estos compuestos sufren una rápida biotransformación y que, probablemente, no encontraremos el compuesto original en las vísceras. Deberemos considerar que los analitos a determinar son los metabolitos del insecticida sospechoso de causar la muerte. Seleccionar un método analítico. Tras definir la información que se desea obtener, se debe elegir un método analítico apropiado para obtener dicha información. La elección del método analítico vendrá condicionada por el tipo de información a obtener (analito a determinar) y por las disponibilidades del laboratorio. Por ejemplo, si se desea determinar la concentración de Ca2+ de una disolución, podremos aplicar (entre otros) métodos volumétricos, cromatografía líquida de intercambio iónico y métodos de espectroscopia de emisión fluorescente con indicadores apropiados. Los dos últimos casos requieren equipamiento muy específico y caro que podría no estar disponible, por lo que la disponibilidad condicionará la elección de la técnica. Determinar la cantidad de muestra necesaria para el análisis. La cantidad de muestra necesaria para realizar el análisis irá en función del método elegido. Así, por ejemplo, si en el caso anterior se opta por el método de emisión fluorescente, probablemente un volumen de entre 1 y 4 mL sea suficiente para realizar el análisis. Sin embargo, el método volumétrico requerirá un mínimo de 25-50 mL de muestra. Obtener una muestra representativa. Una vez abordadas y solucionadas las etapas anteriores, deberemos elegir una muestra representativa de la materia que deseemos analizar. Discutiremos este problema más adelante en la sección dedicada al muestreo. Preparar la muestra en la forma apropiada para el análisis. Cuando dispongamos de nuestra muestra representativa, deberemos someterla a unos tratamientos que la coloquen en un estado apropiado para el análisis. En la mayoría de los casos la muestra no estará en un estado físico o en una matriz apropiada para ser directamente analizada. Por ejemplo, si la muestra es un sólido, habrá que disolverla en un disolvente apropiado. Si la muestra está en una disolución acuosa, tendremos que extraer el analito a un disolvente volátil antes de inyectarlo en un cromatógrafo de gases. En algunos casos, tendremos que transformar el analito en una especie química diferente para que adquiera propiedades físico-químicas aptas para el análisis (más volatilidad, más carga eléctrica, etc.). De cómo preparar la muestra para el análisis hablaremos en detalle en un capítulo posterior. No obstante, algunas características básicas que deben cumplir las operaciones de preparación de muestra son: 1. La preparación de la muestra debe realizarse sin perder ningún analito. 2. La preparación de la muestra debe transformar el analito en la forma química más apropiada para el análisis.

6

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

3. La preparación de la muestra debe, si es necesario, incluir la eliminación de interferentes en la matriz. 4. La preparación de la muestra debe hacerse sin añadir ningún nuevo interferente. En la preparación de la muestra se debe considerar la posibilidad de diluirla o concentrarla para obtener una concentración de analito dentro del intervalo óptimo del método de análisis utilizado. Eliminar posibles interferencias. Si el método elegido no es específico del analito que queremos determinar, antes de realizar el análisis deberemos eliminar posibles interferencias. Es decir, eliminar de la muestra otros componentes diferentes del analito de interés capaces de falsear los resultados de nuestro análisis. Por ejemplo, la determinación del Ca2+ por métodos volumétricos puede también ser afectada por otros cationes divalentes. En este caso se deberán aplicar los tratamientos necesarios para eliminar otros cationes divalentes o, por lo menos, estar seguros de que están presentes en la disolución a una concentración muy inferior a la del calcio y por tanto que no causarán interferencias significativas. Calibrar los instrumentos de medida mediante patrones de medida. Normalmente los métodos analíticos se basan en la medida de una propiedad física del analito. La señal que ofrezcan los aparatos encargados de medir esta propiedad (detectores) han de correlacionar con la concentración de analito. Decimos que «calibramos los aparatos de medida» cuando el método se aplica a disoluciones patrón, de concentración conocida, para establecer dichas correlaciones. Medición de una propiedad física del analito. Para finalizar el proceso analítico deberemos aplicar el método seleccionado y previamente calibrado a la muestra problema. Como se ha indicado, el método se basará en la medida de una propiedad física del analito. La propiedad depende de la naturaleza del método. Así, los métodos gravimétricos están basados en la determinación de la masa del analito, mientras que los volumétricos lo están en la determinación del volumen de una disolución de concentración conocida que es capaz de reaccionar completamente con el analito. Los métodos espectroscópicos están basados en el estudio de las interacciones entre la materia y la radiación electromagnética. Otras propiedades físicas que son determinadas por métodos analíticos son: relación masa / carga, conductividad térmica, número de emisiones radioactivas, calor de reacción, velocidad de reacción, índice de refracción, etc. Cálculo de los resultados. Finalmente, deberemos hacer los cálculos necesarios para correlacionar los valores de la magnitud física medida con los resultados de los patrones de concentración conocida y así obtener la concentración del analito en la muestra problema. Los cálculos a realizar estarán de acuerdo con los tratamientos previos que haya sufrido la muestra (diluciones, concentraciones, etc). Interpretación de los resultados. La interpretación de los resultados no siempre será responsabilidad del analista. Podrán intervenir otros profesionales (toxicólogos,

Etapas de un análisis cuantitativo

•• •• ••

7

técnicos ambientales, higienistas laborales, profesionales sanitarios, etc.) para determinar las implicaciones reales del valor analítico obtenido dentro del contexto del problema concreto que se estudie en cada caso.

1.3. FACTORES QUE CONDICIONAN LA ELECCIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO Además de la disponibilidad de la técnica en el laboratorio, en la elección del método también van a influir otros factores como: 1) Precisión y exactitud. Precisión y exactitud suelen utilizarse erróneamente como sinónimos cuando no lo son. Se considera que un método es preciso cuando sucesivos análisis de una misma muestra producen valores distribuidos alrededor de uno central. En cambio, el método se considera exacto cuando existe una concordancia entre el valor obtenido y el real. Las diferencias entre exactitud y precisión quedan esquematizadas en la Figura 1.2.

Buena precisión Poca exactitud

Buena precisión Buena exactitud

Poca precisión Poca exactitud

Poca precisión Buena exactitud

FIGURA 1.2. Diferencias entre precisión y exactitud.

2) Especificidad. Es la capacidad del método para determinar exclusivamente el componente que nos interesa sin afectarse por la presencia de otras substancias contenidas en la matriz. Así, la determinación volumétrica de Ca2+ no es específica de este elemento, mientras que la determinación por cromatografía iónica es específica de cada ion, ya que todos los cationes se separaran en una columna y llegan separados al detector. 3) Reproducibilidad. El método elegido ha de ser reproducible. Es decir, que cuando se repita el análisis en momentos (e incluso laboratorios) diferentes ofrezca siempre el mismo resultado. 4) Límite de detección. Es la concentración de analito que origina una señal igual a la media de la señal ofrecida por una muestra blanco más dos veces la desviación estándar de dicha señal. Se trata, pues, de la concentración más baja de analito que

8

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

puede detectarse, aunque no puede estimarse su concentración con exactitud. En un principio, el método será mejor en términos de sensibilidad cuanto menor sea el límite de detección. Sin embargo, un método puede tener un límite de detección mayor que otro y ser igualmente apropiado si las concentraciones del analito a determinar están en ambos casos muy por encima del límite de detección. Es decir, que un método con límite de detección 1 μM sería igual de apropiado que un método con límite de detección 1 nM si el analito a determinar estuviera a concentraciones iguales o superiores a unidades de mM. 5) Límite de cuantificación. Es la concentración de analito que origina una señal igual a la media de la señal ofrecida por una muestra blanco más diez veces la desviación estándar de dicha señal. Algunas definiciones reducen el límite de cuantificación fijando en cinco el factor que multiplica la desviación estándar de las señales del blanco. En cualquier caso, el límite de cuantificación será la concentración más baja de analito que puede, no solo detectarse, sino también cuantificarse con exactitud.

1.4. MUESTREO Supongamos que en una planta de procesado de mineral se recibe un cargamento de varias toneladas de roca, de la que necesitamos conocer el contenido medio del mineral de nuestro interés para planificar el proceso de extracción y refinado. ¿Cómo realizar las determinaciones? Supongamos que deseamos determinar la cantidad de petróleo en toda una playa afectada por un vertido. ¿Cómo realizar las determinaciones? Supongamos que un agricultor desea conocer el nivel de residuo de plaguicida en las hortalizas de toda su plantación antes de sacarlas al mercado. ¿Cómo realizar las determinaciones? En todos estos casos, la única manera de responder sin margen de error a las preguntas planteadas sería analizar todo el cargamento de rocas recibido, toda la arena de la playa y todas las hortalizas de la plantación, lo que obviamente es inviable. Por lo tanto, deberemos seleccionar un número limitado de muestras, para realizar los análisis y extrapolar los resultados al total de toneladas de roca recibida, al total de superficie de arena de playa o al total de la producción de hortaliza recolectada. Estos son tres problemas típicos que involucran fundamentos de los métodos de muestreo. Decidir cómo obtener una muestra para el análisis depende de: 1) El tamaño del lote. 2) El estado físico de la fracción de muestra a analizar, por ejemplo, un sólido cristalino, un líquido homogéneo, un gas. 3) Las características químicas del material a analizar, ya que el muestreo no debe alterar o destruir la identidad o cantidad del analito antes del análisis propiamente dicho.

Etapas de un análisis cuantitativo

•• •• ••

9

Las dos metas a lograr en el muestreo son asegurarse de que las muestras son representativas de la substancia a analizar y de que son homogéneas.

Muestras representativas Casi todos los materiales (con la excepción de pequeños volúmenes de líquidos o gases) son heterogéneos en su composición. Por ejemplo, un sólido heterogéneo puede estar compuesto de partículas de diferente tamaño, y cada partícula contener concentraciones diferentes de analito. Imaginemos que el transporte que trae las rocas para analizar su contenido de mineral se descarga durante 8 horas utilizando una cinta transportadora. La Figura 1.3 muestra la variación de contenido de mineral a lo largo del tiempo. La línea continua nos indica una medida en continuo del contenido de metal en un punto fijo a lo largo de la cinta transportadora. La línea discontinua horizontal nos muestra el valor medio obtenido de dicho análisis continuo que es de 0.57%. ¿Qué hubiera ocurrido si se hubiesen tomado 8 muestras al azar de manera discontinua en los puntos marcados con flechas? El valor medio obtenido hubiera sido de alrededor de 0.41%. Si por el contrario el mismo número de muestras se hubiera obtenido en intervalos regulares (por ejemplo cada hora), el valor medio obtenido hubiera sido 0.54%, valor mucho más cercano al real.

% Mineral

1.0

0.5

0.0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Tiempo (h) de funcionamiento de la cinta transportadora

FIGURA 1.3. Contenido real de mineral frente a los tiempos de muestreo.

La regla general para tomar muestras de una gran cantidad de producto de una corriente continua es: El muestreo se ha de realizar en intervalos regulares y debe ser fijo en forma y método. Cuando no se dispone de una corriente continua de suministro de material los muestreos se realizan aplicando el método de apilar y dividir en cuartos. Este mé-

10

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

todo conlleva dividir en cuartos el material. Se toman muestras de cada uno de los cuatro cuartos. Estas muestras se muelen y se apilan en un montón cónico, el cual se alisa y se divide de nuevo en cuartos, eligiendo aleatoriamente dos cuartos opuestos. Este material se vuelve a homogeneizar y a apilar de manera idéntica. El procedimiento se repite tantas veces como sea necesario para obtener una muestra del tamaño adecuado para trabajar en el laboratorio. Si el muestreo se ha de realizar en un área muy extensa, se debe realizar en puntos espaciados regularmente. Cuando el muestreo se puede realizar en más de una etapa, se pueden lograr resultados más precisos obteniendo más muestras donde la concentración de analito sea más alta. Si queremos determinar qué parte de la playa ha resultado más afectada por el vertido, deberemos hacer el primer muestreo tomando muestras de toda la superficie de arena espaciada en partes iguales. En el laboratorio se determinará que zona del terreno presenta unos mayores niveles de contaminación. En esta zona se realizará un nuevo muestreo descartando el área menos contaminada y concentrándose en la zona más afectada. De esta manera obtendremos un resultado más exacto de la contaminación de la zona más afectada.

2

Preparación de muestras

CONTENIDO 2.1. Solubilización y tratamientos previos 2.1.1. Disolución de muestras sólidas 2.1.2. Digestión 2.1.3. Desproteinización 2.1.4. Digestión y disolución asistida por microondas 2.1.5. Digestión y disolución asistida por ultrasonidos 2.2. Concepto y necesidad de extracción 2.3. Extracción líquido-líquido 2.4. Extracción Soxhlet 2.5. Extracción por fluidos supercríticos (SFE) 2.5.1. Fluidos supercríticos 2.5.2. Fluidos supercríticos utilizados en procesos de extracción 2.5.3. Instrumentación en SFE 2.5.4. Modos de SFE 2.5.5. Aplicaciones de SFE 2.6. Extracción en fase sólida (SPE) 2.6.1. Ejemplo de una separación en SPE 2.6.2. Algunos parámetros empleados en SPE 2.6.3. Solvatación de columnas SPE 2.6.4. Interacciones polares en SPE 2.6.5. Interacciones apolares en SPE 2.6.6. Interacciones iónicas en SPE 2.6.7. Interacciones múltiples en SPE 2.6.8. Fases estacionales en SPE 2.7. Microextracción en fase sólida 2.7.1. Microextracción en fase sólida con jeringa 2.7.2. Microextracción en fase sólida en soporte de barra magnética

11

12

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

A menudo un analito no se encuentra en el estado apropiado para la determinación. Es por ello que debe sufrir algún tipo de transformación que lo deje en un estado sobre el que sí se pueda aplicar una técnica apropiada de identificación y cuantificación. Estas transformaciones suelen ser disoluciones o digestiones, que implican el paso de la muestra de estado sólido a estado líquido. Otra situación se da cuando se pretende aislar el analito de la mayoría de los componentes de la matriz; en este caso, hablaremos de extracción. A continuación se comentarán las diferentes modalidades de disolución, digestión y extracción.

2.1. SOLUBILIZACIÓN Y TRATAMIENTOS PREVIOS 2.1.1. Disolución de muestras sólidas Si la muestra es sólida y es necesario que esté líquida, para el ensayo se ha de preparar una disolución homogénea. La forma más sencilla de hacerlo es disolviendo el sólido en el disolvente apropiado. La disolución puede facilitarse calentando y agitando, lo que aumenta la velocidad de transferencia de masa. Los ultrasonidos aumentan mucho la eficacia de la agitación. Se hablará en detalle de la disolución asistida por ultrasonidos en la sección 2.1.5 de este capítulo. Algunas muestras líquidas pueden necesitar disolverse en un disolvente diferente del empleado en la disolución inicial, la técnica encargada de este cambio de disolvente es la extracción líquido-líquido (véase apartado 2.3).

2.1.2. Digestión Cuando una parte o la totalidad de la muestra no se disuelve, se requieren procesos más enérgicos. Estos procesos se denominan digestiones y consisten en poner el sólido en disolución con ayuda de ácidos o bases de diferente fuerza, agentes oxidantes o enzimas. Distinguiremos cuatro tipos de digestión: 1) Digestión por vía húmeda; 2) Digestión por vía seca (calcinación o incineración); 3) Digestión por fusión; y, 4) Digestión enzimática o proteolítica. En todos los casos, la elección del método de digestión apropiado requerirá un conocimiento previo de las propiedades químicas de la muestra. Una complicación a tener en cuenta es que, durante la digestión, algún componente de la muestra podría transformarse en un derivado volátil y perderse durante el proceso, en cuyo caso se deberá realizar en recipientes herméticos apropiados para este fin. Todos los métodos que se presentan en la Tabla 2.1 se conocen como digestiones por vía húmeda. Dicha Tabla muestra algunas de las mezclas de digestión utilizadas junto a su aplicación.

Preparación de muestras

•• •• ••

13

TABLA 2.1. Reactivos utilizados para digestiones Disolución

Propiedades

Uso

Clorhídrico (38% p/p)

—

Metales que se oxiden más fácilmente que el hidrógeno

Nítrico (70% p/p)

Oxidante

Metales que no reaccionan con HCI; sustancias orgánicas oxidadas (Ag+, Hg2+, Pb2+, …)

Fluorhídrico (49% p/p)

Forma fluoruros estables

Sílice y silicatos; utilizado en combinación con otros ácidos

Perclórico (70% p/p)

Oxidante fuerte

Metales (¡NO PUEDE SER UTILIZADO CON AGENTES REDUCTORES!)

Sulfúrico (98,3% p/p)

Alto punto de ebullición (≈ 340 °C)

Metales; destruye la materia orgánica

Hidróxido sódico

Base fuerte

Aluminio y óxidos de Sn, Pb, Zn, Cr

La calcinación o incineración, es un método que se clasifica como de digestión por vía seca, se puede llevar a cabo calentando la muestra en hornos eléctricos llamados «muflas» o en hornos microondas como los que se describen más adelante (sección 2.1.4). La calcinación destruye la materia orgánica conservando la inorgánica. Es corriente que se combinen sistemas de digestión secos y húmedos, es decir, que se trate la muestra con alguna mezcla de digestión como las que se muestran en la Tabla 2.1 al tiempo que se calienta en mufla o microondas. Si la digestión no disuelve la muestra, un método todavía más drástico es el de la fusión. La fusión implica calentar el sólido con 10 a 20 veces su peso de un fundente. Un fundente es un agente sólido a temperatura ambiente que posee propiedades químicas de oxidante, ácido o base fuerte. El fundente formará una disolución homogénea (un fundido) cuando se calienta con la muestra. Al enfriar el fundido, solidificará formando un sólido homogéneo que, a menudo, puede ser fácilmente disuelto en disolventes comunes. La Tabla 2.2 expone algunos de los fundentes más utilizados. Las digestiones proteolíticas o enzimáticas se aplican sobre muestras biológicas. Consisten en el tratamiento de los tejidos con enzimas como β-glucoronidasa, arilsulfatasa, tripsina o subtilisina.

14

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

TABLA 2.2. Reactivos para la digestión por fusión Fundente

Propiedades

Uso

Carbonato sódico

Básico

Silicatos, sulfatos insolubles

Hidróxido sódico

Básico

Óxidos y sulfuros; minerales de Sn, Zn, Cr, Zr

Peróxido sódico

Alcalino y oxidante

Minerales de Sb, Sn, Mo, V, Cr; acero cromado

Pirosulfato potásico

Ácido

Óxidos de Fe, Co, Ni, Cr, Ti, W, Al; aceros

2.1.3. Desproteinización A veces se requiere la desproteinización de la muestra. Esto se consigue fácilmente tratando el material biológico con reactivos precipitantes de proteínas y centrifugando. Los dos reactivos más utilizados en desproteinizaciones son el sulfato amónico y el ácido tricloroacético. También se utiliza a veces el tungstato sódico y el cloruro de aluminio.

2.1.4. Digestión y disolución asistida por microondas Los hornos microondas han supuesto un gran avance en la reproducibilidad y velocidad de las digestiones y de las disoluciones con ácidos. Las muestras se colocan en los recipientes de digestión (Figura 2.1), que están hechos del polímero de Teflón denominado Teflón PFA (perfluoroalkoxietileno). El punto de ebullición del Teflón PFA (306 °C) es notablemente superior al de otros polímeros de Teflón. También se suele utilizar Teflón porque, además de ser suficientemente resistente es transparente a la radiación de microondas típicamente utilizada (2450 MHz). El calentamiento por microondas deriva del campo electromagnético asociado a la radiación de microondas. Dicho campo tiende a hacer que roten las moléculas de agua, que migren los iones y que se muevan los electrones de los materiales metálicos. En esta situación, las moléculas de agua tienden a frenar sus rotaciones chocando con las moléculas circundantes, lo que ocasiona el calentamiento del líquido. En los metales, la resistencia del flujo de electrones tiende a calentarlos rápidamente. En el caso de minerales, rocas o suelos es el contacto con el líquido que los rodea lo que origina el calentamiento.

Preparación de muestras

15

Válvula de presión

Recipiente de digestión

Sonda de temperatura

•• •• ••

FIGURA 2.1. Recipiente de digestión por microondas. Los sensores de presión y temperatura detienen la digestión si se superan los valores de seguridad establecidos.

Las limitaciones de la digestión por microondas derivan de los límites de presión y temperatura de los recipientes y de la muestra. Así, el teflón no puede utilizarse con ácido fosfórico o sulfúrico porque sus puntos de ebullición son superiores a los de fusión del propio Teflón. En estos casos se utilizarán recipientes de sílice, que a su vez no deberán ser utilizados con ácido fluorhídrico. La digestión por microondas de metales presenta problemas especiales. Por ejemplo, la partícula de muestra puede alcanzar temperaturas tan altas que derrita el contenedor. Otro de los problemas es que algunos metales producen hidrógeno en contacto con ácidos; ello obliga a tener una válvula de despresurización para eliminar los gases que se generan. Otra dificultad es que los metales pueden hacer saltar chispas cuando chocan entre sí, lo cual es muy peligroso en el caso de que se haya generado hidrógeno. Es por ello que el oxígeno del recipiente debe ser eliminado (generalmente burbujeando nitrógeno) antes de empezar la digestión, para así eliminar el riesgo de explosión.

2.1.5. Digestión y disolución asistida por ultrasonidos Cuando un sólido se disuelve en un líquido, el analito se separa de la superficie del sólido por difusión. Dado que la difusión es un proceso lento, el proceso de disolución se acelera si aumentamos la velocidad de difusión; bien calentando la mezcla,

16

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

bien agitando (por ejemplo con una barra magnética). Un sistema mucho más eficaz de agitación que el de la barra magnética es el de la agitación por ultrasonidos. Los ultrasonidos son vibraciones sonoras superiores al nivel auditivo humano. Las vibraciones agitan la disolución produciendo burbujas microscópicas que se dilatan y contraen. Estas burbujas pueden alcanzar un tamaño crítico por encima del cual explotan, produciendo durante un breve intervalo de tiempo altas temperaturas (~ 5000 K) y presiones (> 1000 atm). Además de agitar la disolución, las burbujas pueden romper una superficie sólida y formar grietas microscópicas que ayudarán a romper el sólido. Como muestra la Figura 2.2 existen dos configuraciones básicas del instrumental utilizado en la digestión por ultrasonidos. En la Figura 2.2A se muestra que es posible sumergir directamente la sonda generadora de ultrasonidos dentro de la disolución; mientras que la Figura 2.2B muestra como el generador de ultrasonidos puede también estar acoplado a un recipiente que se llena de líquido y donde se sumerge la muestra. En este caso, el líquido acopla la energía del ultrasonido a la muestra.

Transductor

Fluido de acoplamiento

Sonda de ultrasonidos Muestra Sonda de ultrasonidos Muestra (A)

Transductor (B)

FIGURA 2.2. Posibles configuraciones en la digestión asistida por ultrasonidos.

2.2. CONCEPTO Y NECESIDAD DE EXTRACCIÓN Como ya se ha comentado normalmente las muestras a analizar que se reciben en un laboratorio no están en la forma apropiada para realizar directamente el análisis. A veces la muestra no está en el disolvente apropiado. Así, por ejemplo, la técnica de cromatografía de gases requiere que el analito esté en un disolvente volátil y, por lo tanto, no podremos determinar por esta técnica residuos de plaguicidas en una mues-

Preparación de muestras

•• •• ••

17

tra acuosa sin pasar esos residuos a un disolvente apropiado. La matriz sólida tampoco suele ser apropiada. Por ejemplo, si se desea determinar el contenido en nicotina de una muestra de tabaco, habremos de conseguir que la nicotina pase de la hoja de tabaco (estado sólido) a una disolución sobre la que aplicar la técnica apropiada. En todos estos casos, será necesario aplicar técnicas que «extraigan» el analito de la matriz en que se encuentre y lo coloquen en una matriz apropiada para la realización del análisis. El conjunto de técnicas analíticas que «extraen» analitos de una matriz para pasarlo a otra se denomina técnicas de extracción. Si la técnica de extracción «extrae» el analito a una nueva matriz cuyo volumen final es menor que el de la matriz original se habrá también obtenido una concentración. Esto puede ser muy conveniente si la concentración del analito en la muestra está cercana o por debajo del límite de detección. A veces también la concentración es el único motivo de la aplicación de alguna técnica de extracción.

2.3. EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO Si ponemos en contacto una disolución acuosa con un disolvente orgánico inmiscible en agua se formarán dos fases bien diferenciadas. En la parte inferior del recipiente se posará el líquido con mayor densidad, mientras que la capa superior corresponderá al líquido de menor densidad. Los analitos que estén en cualquiera de las dos fases (acuosa u orgánica) se repartirán entre ambas según su solubilidad relativa. Cuando se alcance el equilibrio tenderemos que: Aac  Aorg [Aorg] K = ——— [Aac] Donde [Aorg] es la concentración del analito en la fase orgánica, mientras que [Aac] es la concentración del analito en la fase acuosa. La relación entre ambas concentraciones (K) se denomina constante de reparto. La Figura 2.3 representa un proceso de extracción líquido-líquido. Inicialmente se parte de una matriz que contiene el analito a extraer (generalmente se trata de una matriz acuosa). A esta matriz se le adiciona un volumen de disolvente orgánico en el que el analito es más soluble. Se agita la mezcla para poner en contacto la matriz acuosa con el disolvente orgánico. En este momento, los analitos pasarán al disolvente orgánico, ya que su solubilidad es mayor en este medio. Tras la agitación se dejará reposar la mezcla para separar ambas fases y obtendremos la matriz acuosa y el disolvente orgánico que contiene la mayoría de las moléculas de analito. Como ambas fases son inmiscibles, será fácil separar ambas capas de disolvente y habremos extraído el analito desde la matriz original hasta el disolvente orgánico.

18

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

adición de disolvente orgánico

disolvente orgánico agitación

disolvente orgánico

matriz acuosa

FIGURA 2.3. Representación de una extracción líquido-líquido.

Si la diferencia de solubilidad de un analito en los dos disolventes es muy alta, ocurrirá que, cuando se alcance el equilibrio, la mayor parte de las moléculas de analito habrán pasado a la fase donde la solubilidad sea mayor. Es decir, el analito se habrá «extraído» del disolvente donde tenga menor solubilidad para pasar al disolvente donde su solubilidad sea mayor. La extracción de analitos puede darse desde matriz acuosa hasta disolvente orgánico o en sentido inverso. Sin embargo, la mayoría de moléculas orgánicas de interés ambiental son más solubles en fase orgánica que en acuosa, por lo que el sentido de la extracción es el que se muestra en la Figura 2.3. Experimentalmente, las extracciones líquido-líquido se puede conseguir mezclando los dos disolventes en diversos recipientes. No obstante, los embudos de decantación (como el que se muestra en la Figura 2.4) son los dispositivos más utilizados, sobre todo cuando se manejan volúmenes grandes (mayores de 50 mL). La extracción se realiza mezclando en el embudo ambos disolventes y agitando vigorosamente para poner en contacto ambas fases. Tras el periodo de agitación, se espera con el embudo en reposo a que se separen los dos componentes y se recoge el que sea de interés utilizando la llave de la parte inferior. La fase que no contiene el analito es eliminada. El proceso se puede repetir tantas veces como sea necesario. Para que la extracción líquido-líquido sea efectiva, la diferencia de solubilidad ha de ser de como mínimo un orden de magnitud. Ello permite que el analito se pueda extraer sobre un volumen de disolvente menor que el de la muestra original, obteniendo así, además, una concentración del compuesto a determinar. Si la diferencia de solubilidad es inferior a un orden de magnitud, la eficacia de la extracción podría no ser suficiente. No obstante, la eficacia se podría mejorar; bien aumentando el vo-

Preparación de muestras

•• •• ••

19

FIGURA 2.4. Embudo de decantación.

lumen de disolvente de extracción o bien haciendo extracciones repetidas y uniendo los diferentes extractos obtenidos. Habitualmente el disolvente en el que se obtendrá el analito de interés será el orgánico. Los disolventes orgánicos son más volátiles que los acuosos y, por tanto, será fácil reducir el volumen del extracto evaporando el disolvente calentandolo, en una corriente de N2 o aplicando vacío. Las extracciones líquido-líquido siguen un modelo matemático definido. Así, la concentración remanente en una disolución acuosa del analito A después de n extracciones con un disolvente orgánico es: Vac [Aac]n = —————— Vorg × K + Vac

(

n

)

× [Aac]0

donde, [Aac]n es la concentración de A remanente en la disolución acuosa de volumen Vac después de n extracciones con un volumen de disolvente orgánico Vorg. El parámetro [Aac]0 representa la concentración inicial de analito en la disolución acuosa y K es la constante de reparto del proceso. La principal conclusión que se extrae de esta ecuación es que la eficacia de la extracción es mayor si se realizan varias extracciones con pequeños volúmenes de di-

20

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

solvente que si se realiza una sola extracción con el mismo volumen total de disolvente. Imaginemos que queremos extraer el xenobiótico A contenido en 100 mL de disolución acuosa con un volumen total de disolvente de 200 mL. Supongamos que el coeficiente de reparto (K) es 2. Aplicando la ecuación, veremos que si realizamos una extracción con los 200 mL de disolvente permanecerá en la disolución acuosa el 20% de A. Si realizamos 2 extracciones con 100 mL el porcentaje de xenobiótico no extraído disminuye al 11%, al 6.25% tras 4 extracciones con 50 mL de disolvente, al 5.2% tras 5 extracciones de 40 mL y al 3.4% tras 10 extracciones con 20 mL de disolvente. La extracción líquido-líquido suele ser muy útil en la determinación de xenobióticos en Toxicología, Ciencias Ambientales y Farmacología, ya que estos son mucho más solubles en disolventes orgánicos que en disoluciones acuosas.

2.4. EXTRACCIÓN SOXHLET La extracción Soxhlet es un proceso de extracción de analitos desde una matriz sólida a una matriz líquida. La Figura 2.5 muestra el dispositivo experimental utilizado en las extracciones Soxhlet. El matraz inferior se calienta y evapora el disolvente, que pasa a través de la derivación exterior al condensador. Cuando el disolvente condensa, cae gota a gota en el depósito interior, donde se encuentra el sólido sobre el que se ha de realizar la extracción. El disolvente caliente contacta con el sólido y empieza a producirse la transferencia de masa hasta el líquido. El disolvente condensado se acumula en el receptáculo interior del extractor y, cuando el nivel alcanza el de la válvula interior, el líquido es succionado y devuelto al matraz inferior. El matraz inferior continúa calentándose y el disolvente es destilado de nuevo, repitiéndose así el proceso durante el tiempo necesario, normalmente varias horas, lo que da lugar a decenas de ciclos de extracción con el mismo disolvente. Dado que el punto de ebullición del analito siempre será superior al del disolvente empleado, el disolvente destilado no contiene cantidades importantes de este, con lo que nunca se alcanzará el límite de solubilidad del analito en el depósito interior y, por lo tanto, la transferencia de masa desde el sólido hasta el disolvente se estará produciendo hasta que prácticamente desaparezca de la matriz. La extracción Soxhlet es un proceso muy eficaz de extracción sólido-líquido. La eficacia del sistema se justifica con las mismas consideraciones sobre multiextracción comentadas para el caso de la extracción líquido-líquido. La principal desventaja de este sistema de extracción es que requiere grandes volúmenes de disolvente y es un proceso muy lento. Para obtener una extracción cuan-

Preparación de muestras

•• •• ••

21

Entrada refrigerante Condensador

Salida refrigerante

Circuito de subida del disolvente evaporado Válvula sifón Lugar para el depósito del sólido a extraer

Matraz con disolvente

FIGURA 2.5. Extractor Soxhlet.

titativa suele ser necesario extender el proceso a varias horas. Actualmente existen procesos alternativos de extracción más rápidos e igualmente eficaces, por lo que la extracción Soxhlet está en desuso para ciertas aplicaciones. No obstante, dada su alta eficacia, todavía es un método de referencia que se utiliza para contrastar resultados de extracciones con otro tipo de métodos.

Puede ver una animación sobre el funcionamiento de un extractor Soxhlet en: http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/animations/sox.mov (Página activada en julio de 2004.)

22

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

2.5. EXTRACCIÓN CON FLUIDOS SUPERCRÍTICOS (SFE) 2.5.1. Fluidos supercríticos Cualquier sustancia pura presenta un diagrama de fases como el de la Figura 2.6. En él es posible identificar un punto triple y un punto crítico. Sobre la curva de presión de vapor (AB), coexisten una fase líquida y una fase gaseosa. Cuando se disminuyen presión y temperatura la curva termina en el punto triple (A), en el que la fase sólida, líquida y gaseosa se encuentran en equilibrio. Si por el contrario aumentamos presión y temperatura, la curva de presión de vapor finaliza en el punto crítico (B). De este modo se puede definir un fluido supercrítico como una sustancia sometida a temperaturas y presiones superiores a su punto crítico. En el caso del CO2 el punto crítico se alcanza a 31.2 °C y 73.8 bar. El punto crítico es aquel por encima del cual coexisten las fases liquida y gaseosa de una determinada substancia y, por lo tanto, no es posible distinguir entre ambos estados.

Presión

La densidad de los fluidos supercríticos es del mismo orden que la de los líquidos, lo que les hace capaces de disolver analitos de matrices sólidas. La viscosidad es próxima a la de un gas, lo que favorece la difusión, y dado que la tensión superficial es muy baja, los fluidos supercríticos pueden penetrar en materiales sólidos de baja porosidad. Todas estas propiedades hacen que los fluidos supercríticos sean altamente eficaces como agentes extractores.

Región supercrítica Sólido

Líquido B

A

Gas

Punto crítico

Punto triple Temperatura

FIGURA 2.6. Diagrama de fases de una sustancia pura.

2.5.2. Fluidos supercríticos utilizados en procesos de extracción De entre todos los fluidos que es posible elegir a la hora de realizar una extracción en condiciones supercríticas, el CO2 ha sido el más empleado por ser el que presen-

Preparación de muestras

•• •• ••

23

ta mayores ventajas. Las ventajas del CO2 como fluido supercrítico son: a) tiene un punto crítico fácil de alcanzar; b) no es ni tóxico ni explosivo ni inflamable; c) es químicamente inerte; d) se puede obtener con gran pureza a un precio económico. En términos generales, el CO2 es un excelente agente extractante de especies poco polares como alcanos y terpenos y un buen extractor de especie moderadamente polares como hidrocarburos policíclicos aromáticos, PCBs, aldehídos, ésteres, alcoholes, plaguicidas y grasas. Por el contrario, el CO2 no suele conseguir extracciones cuantitativas de analitos polares o muy polares. Para la extracción de analitos más polares podrían emplearse otros fluidos como NH3 y H2O. El principal problema que presenta el amoníaco es que, además de no ser totalmente inerte con los materiales del extractor, es un gas tóxico. El N2O es otro fluido utilizado que presenta el inconveniente de ser explosivo. Por ello, para la extracción de los analitos más polares se aumenta la polaridad del CO2 mediante la adición de otro fluido que actúa como modificador. Los modificadores pueden introducirse en el sistema mezclados con el fluido extractor, o bien mediante la simple inyección del modificador en estado líquido sobre la muestra antes de empezar la extracción. El modificador más empleado es el metanol, aunque se pueden emplear otros compuestos orgánicos como alcoholes, ácidos orgánicos, cloruro de metileno y disulfuro de carbono.

2.5.3. Instrumentación en SFE Los componentes necesarios para realizar una extracción supercrítica se muestran en la Figura 2.7. El fluido se almacena en una bala de gases (1) y entra en la cámara o cartucho de extracción (4) impulsado por una bomba (2) que le suministra la presión requerida. La válvula (3) permitirá abrir o cerrar el paso del fluido. La temperatura también habrá de ser controlada, por lo que la cámara de extracción se encuentra dentro de un bloque calefactor (5). La válvula de salida (6) abre o cierra el paso del fluido por el restrictor capilar (7) hasta el vial de recogida (8).

5 1

2

4 3

7 6

8

FIGURA 2.7. Esquema de un extractor de fluidos supercríticos.

24

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Cartuchos de extracción Los cartuchos de extracción (Figura 2.8) han de seleccionarse de manera que la muestra ocupe casi todo el volumen del mismo. La celda o cámara de extracción ha de ser lo suficientemente fuerte como para soportar presiones y temperaturas de hasta 500 atm y 250 °C. Los materiales del cartucho han de ser químicamente inertes al fluido y a la muestra. Los cartuchos de extracción están hechos de acero inoxidable, aunque también los hay de materiales poliméricos. Para evitar que se produzcan obstrucciones del capilar restrictor a la entrada y a la salida de la cámara de extracción se colocan filtros.

Filtro

Cámara de extracción

Filtro

FIGURA 2.8. Cartucho de extracción y filtros.

Restrictores El restrictor es uno de los elementos más importantes en un extractor de fluidos supercríticos. Su adecuado funcionamiento es un factor fundamental para la obtención de buenas extracciones. Generalmente son capilares de sílice o metálicos con un final rizado. Un restrictor lineal es un tubo capilar que limita el flujo del fluido al despresurizarse hasta la presión atmosférica. La Figura 2.9 muestra algunos tipos de restrictores.

FIGURA 2.9. Diversos tipos de restrictores.

Métodos de recogida del extracto a) Trampa líquida. Es la forma más sencilla. Consiste en introducir la salida del restrictor en un vial que contiene un pequeño volumen de un disolvente líquido. El

Preparación de muestras

•• •• ••

25

analito queda atrapado en el disolvente, mientras que el fluido descomprimido pasa a la atmósfera. b) Trampa criogénica. En este tipo de trampa, la superficie se enfría criogénicamente con una fuente de enfriamiento externo (CO2 o N2 líquido). Los analitos quedan atrapados en la superficie enfriada para luego ser lavados con un disolvente con objeto de someterlos a posterior análisis. c) Fase sólida adsorbente. A menudo se trata de una fase sólida empleada en cromatografía. El material proporciona dos mecanismos de atrapamiento: atrapamiento criogénico y adsorción. Los analitos son atrapados después de lavarse la fase sólida con una pequeña cantidad de disolvente orgánico. Para mezclas de varios analitos con diferentes polaridades es preciso el empleo de mezclas de diferente materiales cromatográficos.

2.5.4. Modos de SFE Las técnicas de SFE se clasifican según el modo de recogida del analito a la salida del extractor (on-line u off-line), o según el modo en que se realiza el paso del fluido por el cartucho de extracción (dinámico o estático). a) Extracción dinámica. El modo de extracción dinámico consiste en que el fluido pasa constantemente por el cartucho de extracción a un flujo determinado. Para operar en modo dinámico, las válvulas 3 y 6 de la Figura 2.7 deben estar abiertas durante todo el proceso. b) Extracción estática. Consiste en el llenado de la cámara de extracción durante un tiempo y con una cierta cantidad de fluido supercrítico. Para ello se abre la válvula 3 mientras 6 está cerrada (Figura 2.7), esto permite el llenado de la cámara de extracción. Cuando esto ocurre se cierra la válvula 3 y se aplica presión y temperatura para alcanzar las condiciones de extracción. Transcurrido el tiempo de extracción se abre la válvula 6 y se recoge el fluido y el analito extraído. El modo estático presenta la ventaja de que no se precisa tanta cantidad de fluido para llevar a cabo la extracción, además de que permite utilizar modificadores de manera más sencilla. c) Extracción on-line. Consiste en el acoplamiento, a través de una interfase, de la salida de los analitos con un sistema de detección analítico (habitualmente un cromatógrafo de gases). La principal ventaja es la eliminación de la manipulación de la muestra y el principal inconveniente es que se requiere una interfase adecuada. d) Extracción off-line. Esta forma de extracción requiere una instrumentación más sencilla y permite, una vez obtenido el extracto, separarlo y posteriormente analizarlo mediante cualquier otra técnica analítica.

26

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

2.5.5. Aplicaciones de la SFE Se pueden distinguir varios campos en los que la SFE se ha aplicado con buenos rendimientos: 1) Muestras biológicas. Es posible extraer grasas, plaguicidas, PCBs, hidrocarburos policíclicos aromáticos, vitaminas, así como compuestos responsables del sabor y del aroma en carnes, pescados, piel de limón, canela. El CO2 es el fluido más utilizado. TABLA 2.3. Algunas aplicaciones de la SFE Material procesado

Producto extraído

Disolventes

Granos de café

Cafeína

CO2/H2O

Flores de lúpulo

Extracto de lúpulo

CO2

Tabaco

Nicotina

CO2

Yema de huevo

Colesterol

CO2

Especies y plantas aromáticas

Aceites esenciales

CO2

Tejidos biológicos

Lípidos

CO2

Madera

Lignina

Alcoholes

Granos oleaginosos

Aceite

CO2

Carbón activado, catalizadores

Contaminantes

CO2

Suelos, sedimentos fluviales

Pesticidas

CO2

Disoluciones acuosas

Fenoles

CO2

Disoluciones de polímeros

Poliestireno

CO2/surfactante

Disoluciones acuosas de proteínas

BSA

CO2/surfactante

Componentes electrónicos, fibras ópticas

Grasas

CO2

Alquitrán

Fracciones aromáticas

Tolueno

Petróleo

Fracciones pesadas

Pentano

Preparación de muestras

•• •• ••

27

2) Sedimentos, tierras, hojas de plantas y polvo. Es posible la extracción de triacina, plaguicidas, PCBs. Para estas aplicaciones es necesario recurrir al N2O o bien aumentar la polaridad del CO2 con modificadores. 3) Papel, serrín y rocas sedimentarias. En estos materiales se ha aplicado extracción supercrítica para la obtención de dibenzodioxinas cloradas, dibenzofuranos, antraquinona e hidrocarburos del aceite. En estos casos se emplea CO2 como fluido extractor. 4) Aditivos de polímeros. La SFE se utiliza para extraer los aditivos añadidos a estos materiales (estabilizantes, antioxidantes, plastificantes, etc.). La Tabla 2.3 presenta algunas otras aplicaciones donde la SFE ha obtenido buenos resultados.

2.6. EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPE) La abreviatura habitual utilizada para la técnica de extracción en fase sólida es SPE, proveniente de «solid phase extraction». Esta técnica se aplica pasando una disolución que contiene analito(s) sobre una fase sólida (o fase estacionaria) que lo(s) adsorbe específicamente. La fase sólida suele estar compactada en el fondo de una pequeña columna (3-20 mL) de plástico como la que se muestra en la Figura 2.10. Después de la adsorción, los analitos se eluyen con una pequeña cantidad de otro disolvente extractor, con el que interaccionan más fuertemente que con la fase estacionaria. Por tanto, la SPE no solo consigue un cambio de matriz del analito, sino que reduce el volumen de la muestra. Las extracciones en fase sólida con minicolumnas se asemejan a un proceso de cromatografía líquida en columna abierta a pequeña escala. De hecho algunos de los

Fase sólida

FIGURA 2.10. Minicolumna de SPE.

28

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

términos empleados en estos procesos y, que describiremos en este apartado, son similares a los empleados en cromatografía. Sin embargo, la SPE no puede ser considerado como un proceso cromatográfico en el sentido de que obtenga separaciones de diferentes moléculas. La SPE separa «grupos» de moléculas con propiedades químicas similares. Por ejemplo, una técnica de SPE podrá separar todas las moléculas de plaguicidas presentes en una muestra de agua de las moléculas disueltas con propiedades químicas (carga y polaridad) diferentes a las de plaguicidas. La separación e identificación de las diferentes moléculas de plaguicidas, inicialmente aisladas en la extracción, deberá realizarse posteriormente por cromatografía de gases. Las fases sólidas que se emplean en SPE son similares a las utilizadas en cromatografía líquida. La fase estacionaria es sílice modificada químicamente con diferentes grupos químicos. Estos grupos que modifican las cadenas de sílice son los que condicionan las propiedades químicas a la fase estacionaria y los responsables de la separación. La sílice modificada es estable entre pH 2 y 7.5, si bien el rango de estabilidad con el pH puede considerarse entre 2 y 11 puesto que la fase estacionaria solo está en contacto con la disolución acuosa unos pocos minutos. Además, las fases estacionarias son compatibles con casi todos los disolventes orgánicos. Las diferentes fases estacionarias se clasifican según el tipo de interacción que tengan con el analito. Las interacciones son consecuencia de sus propiedades químicas y básicamente son de tres tipos: interacciones polares, interacciones no polares e interacciones de intercambio iónico. Está última clase se subdivide en intercambio aniónico e intercambio catiónico.

2.6.1. Ejemplo de una separación en SPE La Figura 2.11 esquematiza un proceso de separación ideal en SPE. La muestra contiene los analitos de interés (1) y dos grupos de analitos (2 y 3) que deben ser separados del primero. La muestra se deposita inicialmente en lo alto de la columna (Figura 2.11A) y entra dentro de la fase estacionaria (Figura 2.11B) bien por gravedad o bien aplicando vacío. El adsorbente retiene fuertemente el analito de interés y solo ligeramente 3, mientras que 2 no es retenido y llega al fondo de la columna con la matriz. Tras pasar la muestra por la columna se lava con un disolvente que fuerza la elución de 3 sin interaccionar con 1 (Figura 2.11C). Finalmente, un pequeño volumen de un segundo disolvente (Figura 2.11D) interacciona específicamente con 1, eluyéndolo de la columna y obteniendo la separación de 2 y 3, al tiempo que una concentración del analito.

2.6.2. Algunos parámetros empleados en SPE Volumen muerto: es el volumen necesario para llenar todos los poros y espacios de la fase estacionaria.

Preparación de muestras

Disolvente 1

A

B

C

•• •• ••

29

Disolvente 2

D

FIGURA 2.11. Proceso de separación en SPE. Analito 1 = ; Analito 2 = ; Analito 3 = .

Retención: es el fenómeno que causa la inmovilización de las moléculas del analito debido a la atracción entre estas y el adsorberte. La retención ocurre cuando las moléculas de analito tienen más afinidad por la fase estacionaria que por la matriz en la que están. La retención debería ser lo suficientemente fuerte, para que un volumen de fase móvil 20 veces superior al volumen muerto no eluya una cantidad significativa de analito. La Figura 2.12 esquematiza el concepto de retención. La retención es ideal cuando tras la adición de una parte de muestra, el analito interacciona con la fase estacionaria y se retiene fuertemente en la parte alta de la misma (Figura 2.12A); ello permite la adición posterior de más analito que ocupa los centros activos inmediatamente contiguos a los lugares donde quedaron retenidas las primeras moléculas de analito (Figura 2.12B). En cambio, se considera una retención pobre (Figura 2.12C) si, tras la adición de la muestra, el analito no interacciona con la fase estacionaria con la suficiente firmeza y se distribuye de manera desigual a lo largo de la superficie del adsorbente. Elución: es el proceso por el cual un analito se suelta del adsorbente al que estaba unido. La elución ocurre cuando el analito tiene más afinidad por el eluyente que por la fase estacionaria. Una elución es apropiada cuando no requiere más de cinco veces el volumen muerto de la columna. La Figura 2.13 esquematiza el concepto de elución. La elución se considera apropiada (Figura 2.13A) cuando el eluyente es

30

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

A

B

C

FIGURA 2.12. Retención en un proceso de SPE. disolvente 2 disolvente 1

A

disolvente 2

B

FIGURA 2.13. Elución en un proceso de SPE.

efectivo rompiendo las interacciones entre el analito y la fase estacionaria, y consigue que todas las moléculas de analito salgan del interior de la columna con un mínimo volumen de disolvente. En cambio la elución no es apropiada (Figura 2.13B) cuando el eluyente no es capaz de romper eficazmente las interacciones entre analito y fase estacionaria. Ello implica la necesidad de volúmenes de elución grandes y, por tanto, dilución del analito. Capacidad: es la masa total de analito que puede quedar fuertemente retenidas en condiciones ideales, por una cantidad de adsorbente.

Preparación de muestras

•• •• ••

31

Selectividad: es la capacidad del adsorbente para discriminar entre el analito y los otros componentes de la matriz. La Figura 2.14 esquematiza procesos de SPE selectivos y no selectivos. En el proceso no selectivo todas las especies son retenidas y la extracción no es específica. Es decir, se conseguirá cambiar la matriz de los analitos, pero no se conseguirá una purificación de los mismos como se ilustra en la Figura 2.11. En cambio, cuando la retención es selectiva solo uno de los analitos (el 1 en la Figura 2.14) es retenido y, así, separado de los analitos no retenidos. Podríamos decir que la columna empleada en la Figura 2.14 es más selectiva que la empleada en la Figura 2.11, ya que esta última retuvo parcialmente las moléculas de tipo 3, mientras que la columna de la Figura 2.14 no lo hizo. Retención no selectiva

Retención selectiva

FIGURA 2.14. Procesos no selectivos de SPE. Analito 1 = ; Analito 2 = ; Analito 3 = .

2.6.3. Solvatación de columnas SPE La solvatación es un proceso previo al paso de la muestra por la columna de SPE. En la mayoría de los casos es absolutamente necesario, antes de iniciar la extracción, para asegurar la eficacia y la reproducibilidad de esta. La solvatación consiste en pasar por la fase estacionaria un pequeño volumen de disolvente de polaridad intermedia entre el agua y el disolvente orgánico que se utilizará como eluyente. Metanol y acetonitrilo son los disolventes más empleados en la solvatación de columnas de SPE, aunque determinados protocolos también recomiendan etanol o tetrahidrofurano. La Figura 2.15 esquematiza una fase estacionaria (denominada C8) de una columna de SPE no solvatada interaccionando con una muestra que contiene analitos. La zona que corresponde a la sílice (átomos de Si unidos entre sí por átomos de O) es de marcado carácter polar. A continuación veremos una zona apolar donde se asentarán las cadenas de octilo. Estas cadenas están en un desorden aparente que impide exponer los centros activos de unión a los analitos. Además, como la muestra es

32

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

muestra (acuosa)

medio apolar

O

O

O

O

O

O O

O

O medio polar

= Si

O=O

=C

=H

FIGURA 2.15. Estructura molecular de una columna C8 de SPE no solvatada. muestra (acuosa)

O

O

O

O

polaridad intermedia (metano, acetonitrilo, …) medio polar

O

O

= Si

O

O

O

O=O

=C

=H

FIGURA 2.16. Estructura molecular de una columna C8 de SPE solvatada.

acuosa, no se producirá una buena interacción entre los analitos y los centros activos de unión. En consecuencia, la eficacia de la extracción será baja y el proceso probablemente sea poco reproducible.

Preparación de muestras

•• •• ••

33

¿Qué ocurre en la fase estacionaria de una columna de SPE tras la solvatación? El proceso se representa en la Figura 2.16. La capa de agente solvatante creará una zona de polaridad intermedia que permitirá a las cadenas de octilo desplegarse en el medio de una manera ordenada. Ello provocará el aumento de los centros activos de la fase estacionaria que podrán interaccionar con el analito, aumentando así la eficacia y la reproducibilidad de la extracción.

2.6.4. Interacciones polares en SPE Las interacciones polares que se dan en la SPE incluyen puentes de hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo y otras interacciones entre átomos del analito y los grupos polares de la fase estacionaria. La retención de analitos por interacciones polares se facilita mediante disolventes no polares. Por otra parte, la elución de analitos desde adsorbentes polares se facilita mediante disolventes polares con alta fuerza iónica. La Figura 2.17 muestra ejemplos de fases estacionarias polares junto con las interacciones que se dan con los analitos. En toda la Figura 2.17, el fondo gris representa un ambiente más apolar que el fondo blanco.

2.6.5. Interacciones apolares en SPE Las interacciones no polares son aquellas que ocurren entre los enlaces carbono-hidrógeno del adsorbente y los enlaces carbono-hidrógeno de los analitos. La retención de analitos por interacciones no polares se facilita por disolventes polares. La elución de analitos desde adsorbentes no polares se facilita con disolventes con suficiente carácter apolar como para romper las interacciones no polares entre analito y adsorbente. La Figura 2.18 muestra ejemplos de fases estacionarias polares con las interacciones que se dan con los analitos. En toda la Figura 2.18 el fondo gris representa un ambiente más apolar que el fondo blanco.

2.6.6. Interacciones iónicas en SPE Las interacciones iónicas ocurren entre moléculas de analito con cargas opuestas a las del adsorbente. Para que se de el intercambio iónico se deben cumplir dos condiciones: 1) La matriz y el disolvente deben estar a un pH donde analito y adsorbente estén cargados. 2) La matriz y el disolvente no deben contener altas concentraciones de iones de la misma carga que el analito.

34

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

RETENCIÓN: facilitada por disolventes apolares

ELUCIÓN: facilitada por disolventes polares

Si CIANOPROPIL

Si C O

N

N

C

H

OH

H

H N

N Si

Si

AMINO

H

H

O

H OH H

H O

O Si

SÍLICE

Si H N

H

NH2

FIGURA 2.17. Ejemplos de interacciones polares en SPE.

Los grupos iónicos pueden estar cargados o no dependiendo del pH. Así, el número de moléculas con grupos con carga positiva (por ejemplo grupos amino) incrementa a pH inferiores al valor del pKa, y disminuye a pH superiores al pKa. El número de moléculas con grupos con carga negativa (por ejemplo ácidos carboxílicos) incrementa a pH superiores al valor del pKa, y disminuye a pH inferiores al pKa. Todo lo anterior, indica que un cambio de pH que induzca la neutralización de la carga del analito o del adsorbente conducirá a la ruptura de las interacciones iónicas. La fuerza iónica también juega un papel importante en las separaciones SPE de intercambio iónico. La fuerza iónica es una medida de la concentración total de iones presentes en el medio. La retención del analito en la fase estacionaria será función

Preparación de muestras

Si

35

ELUCIÓN: facilitada por disolventes no polares

Si

FENILO

CICLOHEXILO

C8

C18

RETENCIÓN: facilitada por disolventes polares

•• •• ••

Si

Si

Si

Si

Si

Si

FIGURA 2.18. Ejemplos de interacciones apolares en SPE.

del número de otras especies iónicas presentes en la matriz y disolvente capaces de competir por los grupos cargados del adsorbente. Así, bajas fuerzas iónicas promueven la retención del analito, mientras que altas fuerzas iónicas facilitan la elución. La Figura 2.19 muestra ejemplos de fases estacionarias de intercambio iónico, junto con las interacciones que se dan con los analitos. También se muestra como forzar la elución de los analitos mediante cambios de pH y fuerza iónica.

•• •• ••

36

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

ELUCIÓN: Facilitada por disolventes: (A) de alta fuerza iónica (B) a pH donde el adsorbente sea neutro (C) a pH donde el analito sea neutro (D) presencia de contraión selectivo

RETENCIÓN: facilitada por disolventes: (A) de baja fuerza iónica (B) a pH donde adsorbente está cargado (C) a pH donde el analito está cargado (D) ausencia de contraión selectivo A

A

SULFONILPROPIL

+ Na

Na Si –

Si

H3N

R

Na

+

Na – Na

+ Na

+

Na

+

+

+ H3N

Na

R

+

B

B CARBOXIMETIL

Si

CO2

-

+ H3N

+ R

H3N Si

R

COOH

pH = 2; elución por neutralización del adsorbente

pH = 6

C

C – OH

AMINO

SO3

+

SO3

+

Si

+ H3N

Si

– O2C

+ H3N

HOOC

R

R pH = 2; elución por neutralización del analito D

AMINO

D – OH Si

+ H3N

Si

+ H3N

–

– O2C

O2C R

SO3

R

–

elución por un contraión selectivo

FIGURA 2.19. Ejemplos de interacciones iónincas en SPE.

2.6.7. Interacciones múltiples en SPE A menudo, la retención de un analito se da por acción de más de uno de los mecanismos comentados anteriormente. La Figura 2.20 muestra la ciclohexilamina retenida en un adsorbente de ácido bencenosulfónico por una interacción iónica con el

Preparación de muestras

•• •• ••

37

– SO3 + NH3 Si

FIGURA 2.20. Un ejemplo de interacciones múltiples en SPE.

grupo ácido y por una interacción no polar con el anillo bencénico. Cuando se da un mecanismo múltiple de retención, es necesario vencer todas las fuerzas de retención para forzar la elución del analito.

2.6.8. Fases estacionarias en SPE La Tabla 2.4 muestra la estructura química de algunos de los adsorbentes más utilizados en SPE. Puede observarse que para las interacciones polares se utilizan grupos ciano e hidroxilo unidos a cadenas alifáticas cortas (3-4 carbonos) o incluso sílice no derivatizada, cuyos grupos Si-OH confieren un carácter altamente polar. Para las interacciones apolares se usan grupos de cadenas alifáticas hidrocarbonadas, siendo las más comunes las de 18 (C18), 8 (C8) y 2 (C2) carbonos o anillos cíclicos alifáticos (ciclohexano) y aromáticos (benceno). Las interacciones de intercambio iónico de tipo catiónico fuerte se dan con grupos fenil o alquil sulfónicos (-SO3–), mientras que las de tipo catiónico débil se deben a grupos carboxilo (-COO–). Las interacciones de intercambio aniónico se basan en grupos de amonio cuaternario. En todos los casos el soporte de la fase estacionaria es sílice, al que se le unen los grupos funcionales orgánicos que confieren una propiedad determinada (afinidad por grupos polares, apolares, carga positiva o carga negativa).

2.7. MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPME) 2.7.1. Microextracción en fase sólida con jeringa La microextracción en fase sólida (SPME) es una técnica de extracción sólido-líquido o sólido-gas que elimina totalmente el uso de disolventes, puede ser utilizada para concentrar y extraer compuestos de un amplio rango de pesos moleculares y polaridades. La unidad de SPME (Figura 2.21) es reutilizable y versátil, y consiste en una fibra de sílice fundida y revestida con el material adsorbente. La fibra está unida a un émbolo de acero inoxidable con un mango de protección.

38

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

TABLA 2.4. Estructura química de algunas fases estacionarias muy utilizadas en SPE

Intercambio catiónico fuerte

INTERACCIONES DE

INTERCAMBIO IÓNICO

INTERACCIONES NO POLARES

INTERACCIONES POLARES

Nombre

Abreviatura

Fórmula

Cianopropil

CN

Si

CH2CH2CH2CN

Diol

2OH

Si

CH2CH2CH2OCH2CHCH2 HO OH

Aminopropil

NH2

Si

CH2CH2CH2NH2

N-propiletilendiamina

PSA

Si

CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2

Sílice

Si

Si

OH

Octadodecil

C18

Si

C18H37

Octil

C8

Si

C8H17

Etil

C2

Si

C2H5

Ciclohexil

CH

Si

Fenil

PH

Si

Bencenosulfonilpropil

SCX

Si

CH2CH2CH2

Sulfonilpropil

PRS

Si

CH2CH2CH2SO3–

SO3–

Preparación de muestras

•• •• ••

39

TABLA 2.4. Estructura química de algunas fases estacionarias muy utilizadas en SPE. (Continuación)

Intercambio catiónico débil Intercambio aniónico

INTERACCIONES DE

INTERCAMBIO IÓNICO

Nombre

Abreviatura

Fórmula

Carboximetil

CBA

Si

CH2COO–

Dietilaminopropil

DEA

Si

+ CH2CH2CH2N(CH2CH3)2 H

Trimetilaminopropil

SAX

Si

CH2CH2CH2NH2

Émbolo

Fibra de sílice recubierta

FIGURA 2.21. Unidad de extracción de SPME.

Algunas de las aplicaciones de SPME más utilizadas son: análisis de contaminantes orgánicos de agua, análisis de sabores de alimentos, análisis forense, análisis de alcohol en sangre y drogas en orina. Los pasos de operación de SPME son:

40

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

1) Extracción de la muestra 1) Pasar la aguja retraída a través del séptum del vial que contiene la muestra. 2) Oprimir el émbolo para exponer la fibra a la muestra (los analitos se absorben en la fibra en un lapso de tiempo que va de 2 a 15 minutos). 3) Retraer la fibra dentro de la aguja y sacarla del vial. 2) Análisis en GC 1) Insertar la aguja en el puerto de inyección de un cromatógrafo de gases. 2) Oprimir el émbolo exponiendo la fibra caliente al inyector para desorber los analitos dentro de la columna. Existen dos tipos diferentes de recubrimientos en SPME. El más utilizado es el grupo de recubrimientos que extrae los analitos mediante un proceso de adsorción. Algunos recubrimientos muy utilizados son el dimetilpolisiloxano y el poliacrilato. El proceso de adsorción es no competitivo, por lo que, para un tiempo de extracción y temperatura constantes, la cantidad de analito axtraido es linealmente dependiente de su concentración inicial en la matriz. Estos tipos de recubrimientos son muy útiles para extraer compuestos de polaridad media y baja. Un segundo tipo de recubrimientos incluye los formados por mezclas de dimetilpolisiloxano y divinilbenceno, o Carbowax™ y divinilbenceno, o Carboxen™ y divinilbenceno. Estas sustancias extraen los analitos mediante un proceso competitivo, es decir, que un analito de alta afinidad puede desplazar a otro con una afinidad menor. Este grupo de recubrimientos es útil para la extracción de analitos de alta polaridad, que tienen una baja afinidad por los recubrimientos del primer tipo. El principal inconveniente de la SPME es su falta de robustez, ya que la fibra de sílice puede doblarse o romperse con facilidad si no se maneja con las debidas precauciones.

2.7.2. Microextracción en fase sólida en soporte de barra magnética Esta técnica es una variante de la SPME. Parece más eficaz que la anterior, aunque requiere un equipo instrumental algo más complicado (un equipo de desorción térmica). Consiste en recubrir una barra de agitación magnética (como las utilizadas para preparar disoluciones) con el mismo material adsorbente que recubre el capilar de sílice fundida en SPME. El proceso consta de las siguientes etapas: 1) Añadir barra magnética al vial que contiene la muestra. 2) Agitar 1 hora. 3) Retirar con pinzas la barra magnética.

Preparación de muestras

4) 5) 6) 7)

•• •• ••

41

Lavar la barra con agua destilada. Secar. Transferir la barra a un tubo de desorción térmica. Extraer el analito por desorción térmica y analizarlo por cromatografía de gases.

El sistema presenta una excelente reproducibilidad y un límite de detección del orden de partes por trillón (ppt). El incremento de sensibilidad del método se debe a que en esta ocasión la fibra adsorbente no está estática dentro de la disolución, sino que es agitada magnéticamente dentro de ella, con lo cual los analitos incrementan sus posibilidades de entrar en contacto con el material adsorbente.

PARTE

Técnicas de valoración

II

Métodos de análisis por valoración

3

CONTENIDO 3.1. Aspectos generales de los métodos volumétricos 3.2. Valoración ácido-base 3.3. Aplicaciones de las valoraciones ácido-base 3.4. Valoración de precipitación 3.5. Valoraciones por formación de complejos 3.6. Métodos gravimétricos 3.6.1. Métodos gravimétricos de precipitación 3.6.2. Métodos gravimétricos de volatilización

Este libro analiza las técnicas de análisis ambiental más utilizadas actualmente. Como se verá más adelante, existen diversas técnicas instrumentales muy poderosas que permiten la separación e identificación inequívoca de analitos. No obstante, muchas de ellas requieren grandes y costosos equipos y técnicos analistas con una preparación específica. Existe un conjunto de técnicas analíticas que se caracteriza por: 1) ser fáciles de aplicar, 2) no requerir grandes equipamientos técnicos, y 3) ser relativamente específicas. Estas son las denominadas técnicas de análisis por valoración y estos son tres de los motivos por los que los análisis por valoración todavía tienen un amplio campo de aplicación dentro de los laboratorios de análisis químico, por lo cual este libro no podía dejar de tratarlos. Así pues, antes de entrar en técnicas de análisis mucho más complejas, dedicaremos este capítulo a los denominados métodos de análisis por valoración. Los métodos de análisis por valoración comprenden un grupo de procedimientos cuantitativos que se basan en la medición de la cantidad de reactivo de concentración conocida que es necesario para reaccionar completamente con un analito. Existen tres tipos de valoraciones: a) valoración volumétrica, que mide el volumen consu45

46

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

mido de una disolución; b) valoración gravimétrica, que mide la masa de un reactivo generado o consumido; c) valoración coulombimétrica, donde el «reactivo» que reacciona con el analito es una corriente eléctrica constante de magnitud conocida; en esta técnica se mide el tiempo requerido para completar la reacción electroquímica. Los métodos de valoración se usan ampliamente en los análisis de rutina debido a que son rápidos, adecuados, exactos y se pueden automatizar fácilmente.

3.1. ASPECTOS GENERALES DE LOS MÉTODOS VÓLUMÉTRICOS En el análisis volumétrico se utiliza una disolución patrón (o valorante) de concentración conocida. La valoración se lleva a cabo añadiendo lentamente la disolución patrón sobre la disolución problema hasta que la reacción se complete. En una valoración, el punto de equivalencia se alcanza cuando la cantidad de patrón agregado es químicamente equivalente a la cantidad de analito presente en la muestra. Por ejemplo, en la valoración de iones cloruro con nitrato de plata, el punto de equivalencia se alcanza cuando se añade a la disolución un número de moles de plata equivalente al de moles de cloruro. Sin embargo, en la valoración de ácido sulfúrico con hidróxido sódico, el punto de equivalencia se alcanza después de añadir 2 moles de hidróxido sódico por mol de ácido sulfúrico. Algunas veces, es necesario añadir un exceso de disolución patrón y valorar el exceso por retrovaloración con un segundo reactivo patrón. En este caso, el punto de equivalencia corresponde al punto en el que la cantidad del segundo reactivo patrón es químicamente equivalente al exceso añadido del primer patrón. El punto de equivalencia de una valoración es un punto teórico que no puede determinarse experimentalmente, solo podemos estimar su posición observando un cambio físico asociado a la condición de equivalencia. A este cambio se le conoce como punto final de la valoración. La diferencia de volumen o masa entre el punto de equivalencia y el punto final es el error de la valoración. Para detectar los puntos de equivalencia se suelen añadir indicadores a las disoluciones que contienen el analito a valorar. En el punto de equivalencia se producen cambios en la apariencia de la disolución como: aparición o desaparición de color, cambio de color, aparición de turbidez, etc. Estos cambios indican que el punto de equivalencia se ha alcanzado. Puede ver una animación sobre el punto de equivalencia en una valoración ácido-base en: http://ull.chemistry.uakron.edu/genobc/animations/titration.mov (Página activa en julio de 2004.)

Métodos de análisis por valoración

•• •• ••

47

Un patrón primario es un compuesto de pureza elevada que sirve como material de referencia en métodos volumétricos y gravimétricos. La exactitud del método suele depender de las propiedades de este compuesto. Los requisitos exigibles a un patrón primario son: 1. Máxima pureza (se debe contar con métodos para confirmar su pureza). 2. Estabilidad atmosférica. 3. Ausencia de agua de hidratación (para evitar que cambie la composición del sólido con las variaciones en la humedad relativa). 4. Fácil adquisición. 5. Económico. 6. Suficiente solubilidad en el medio de valoración. 7. Peso molecular razonablemente grande (para disminuir los errores asociados con la pesada). 8. Reacción rápida y unívoca con el analito. 9. Reacción completa con el analito (para que se visualice satisfactoriamente el punto final). 10. Reacción selectiva con el analito. Son muy pocos los compuestos que cumplen estos requisitos, por lo que solo se dispone de un número limitado de patrones primarios. Con los patrones primarios se preparan disoluciones patrón; la disolución patrón ideal debería ser estable, de modo que solo sea necesario establecer su concentración una vez.

Métodos para preparar las disoluciones patrón Para preparar la disolución patrón se suelen emplear dos métodos: 1) Método directo: donde una cantidad pesada de patrón primario se disuelve en el disolvente adecuado y a la concentración apropiada. 2) Estandarización. En este caso el reactivo patrón que se utilizará en la valoración, se usa en primer lugar para valorar una concentración conocida de analito y así establecer de manera precisa la concentración de la disolución.

3.2. VALORACIONES ÁCIDO-BASE Las disoluciones patrón de ácidos y bases fuertes se usan ampliamente para determinar analitos que por sí mismos son ácidos o bases o que se pueden convertir en estas especies. Las disoluciones patrón que se emplean en las valoraciones ácido-base son disoluciones de ácidos o bases fuertes ya que reaccionan más completamente con un

48

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

analito que las especies débiles, de manera que se obtienen puntos finales más definidos. Las disoluciones patrón de ácidos se preparan por disolución de HCl, HClO4 o H2SO4 concentrados. El HNO3 rara vez se utiliza, debido a que sus propiedades oxidantes podrían dar lugar a reacciones colaterales indeseables. Las disoluciones patrón alcalinas se preparan a partir de NaOH o KOH y ocasionalmente Ba(OH)2. Indicadores de las valoraciones ácido-base Muchas substancias presentan colores que dependen del pH. Algunas de estas substancias se usan como indicadores. Un indicador ácido-base es un ácido orgánico o una base orgánica débil cuya forma disociada tiene un color diferente al de su ácido o base conjugados. Así, el siguiente equilibrio describe el comportamiento de un indicador ácido típico (HIn): HIn + H2O ←→ In– + H3O+

color ácido

color básico

En este caso, la disociación del indicador se acompaña de cambios en su estructura interna y un cambio de color asociado. El equilibrio de un indicador básico (In) sería: In + H2O ←→ InH+ + OH–

color básico

color ácido

El ojo humano es poco capaz de captar diferencias de color en disoluciones que contienen una mezcla de In- y InH, en particular cuando la relación [In-]/[InH] es más de 10 o menos de 0.1. Como consecuencia, para el observador, el color de una disolución con un indicador típico cambia rápidamente para las relaciones de concentración que están entre 10 y 0.1. A valores mayores de 10 o menores de 0.1 el color parecerá prácticamente constante. Por lo tanto: intervalo de pH del indicador = pKa ± 1 Así, por ejemplo, un indicador con una constante de disociación de 1 × 10–5 (pKa =5) muestra un típico cambio de color cuando el pH de la disolución cambia de 4 a 6. Existen indicadores ácido-base para cualquier intervalo de pH. La Tabla 3.1 muestra los más utilizados:

•• •• ••

Métodos de análisis por valoración

49

TABLA 3.1. Indicadores ácido-base más importantes Intervalo de pH

Cambio de color 1

Tipo de indicador 2

1.2-2.8 8.0-9.6

R-Am Am-B

1

Amarillo de metilo

2.9-4

R-Am

2

Naranja de metilo

3.1-4.4

R-N

2

Verde de bromocresol

3.8-5.4

Am-B

1

Rojo de metilo

4.2-6.3

R-Am

2

Púrpura de bromocresol

5.2-6.8

Am-P

1

Azul de bromotinol

6.2-7.6

Am-A

1

Rojo fenol

6.8-8.4

Am-R

1

Púrpura de cresol

7.6-9.2

Am-P

1

Fenolftaleína

8.3-10

I-R

1

Timolftaleína

9.3-10.5

I-A

1

10-12

I-Am

2

Nombre

Azul de timol

Amarillo de alizarina GG 1 2

A = Azul; I = Incoloro; N = Anaranjado; P = Púrpura; R = Rojo; Am = Amarillo. (1) HIn + H2O ↔ H3O+ + In–; (2) In + H2O ↔ InH+ + OH– .

3.3. APLICACIONES DE LAS VALORACIONES ÁCIDO-BASE Las valoraciones ácido-base se utilizan para determinar gran cantidad de especies inorgánicas, orgánicas y biológicas que poseen propiedades ácidas o básicas. Igualmente, existen numerosas aplicaciones en las que un analito se transforma, mediante un tratamiento adecuado, en un ácido o una base que posteriormente se valora con el patrón apropiado. Hay dos formas de determinar el punto final de las valoraciones ácido-base. La primera está basada en el uso de indicadores. En la segunda, el punto final es una medida potenciométrica en la que el potencial que se mide es proporcional al pH.

50

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Varios elementos importantes en los sistemas orgánicos y biológicos se pueden determinar adecuadamente con métodos cuya etapa final incluye una valoración ácidobase. Los elementos susceptibles de ser determinados son en su mayoría no metales como carbono, nitrógeno, cloro, bromo, flúor y otras especies menos comunes. El tratamiento previo transforma el elemento en un compuesto ácido o base inorgánico que luego es valorado. La Tabla 3.2 muestra varios elementos analizables mediante valoraciones ácido-base. No obstante, a continuación comentamos detalladamente algunos ejemplos. TABLA 3.2. Análisis de elementos basados en valoraciones ácido-base

Elemento

Transformado en:

Productos de absorción o precipitación

N

NH3

NH3 (g) + H3O+ → NH4+ + H2O

Exceso de HCl con NaOH

S

SO2

SO2 (g) + H2O2 → H2SO4

NaOH

C

CO2

CO2 (g) + Ba(OH)2 → BaCO3 (s) + H2O

Exceso de Ba(OH)2 con HCl

Cl (Br)

HCl

HCl (g) + H2O → Cl– + H3O+

NaOH

F

SiF4

SiF4 (g) + H2O → H2SiF6

NaOH

Valoración

Nitrógeno Este elemento se encuentra en una gran variedad de substancias: aminoácidos, proteínas, fármacos, fertilizantes, explosivos, suelos, aguas potables, colorantes. El método Kjeldahl es el método utilizado para la determinación de nitrógeno orgánico, no requiere un equipo especial y se adapta fácilmente al análisis rutinario de muchas muestras. Este es el método utilizado normalmente para determinar el contenido de proteína de una muestra de cereales, carnes y otros materiales biológicos. Como la mayoría de proteínas contiene el mismo porcentaje de nitrógeno, el resultado obtenido de la valoración, multiplicado por un factor adecuado (6.25 para carnes, 6.38 para lácteos, 5.70 para cereales) permite calcular el porcentaje de proteína de la muestra. No obstante, el método Kjeldahl puede utilizarse también para determinar nitrógeno en otras muestras. En el método Kjeldahl, la muestra se descompone en caliente con ácido sulfúrico concentrado para convertir el nitrógeno en ion amonio. La disolución resultante se enfría, se diluye y alcaliniza. La alcalinización produce la liberación de amoníaco,

Métodos de análisis por valoración

•• •• ••

51

que destila al ser calentado. El amoníaco destilado se recoge en disolución ácida y finalmente se cuantifica por valoración ácido-base. El factor determinante de este método es la descomposición de la muestra con sulfúrico, el cual oxida carbono e hidrógeno a dióxido de carbono y agua. La transformación del nitrógeno depende del estado de la muestra original. El nitrógeno amínico (—NR2) y amídico (—CO—NR2) se transforma cuantitativamente en ion amonio. Por el contrario, el nitrógeno de los grupos nitro (—NO2), azo (—N=N—) y azoxi (—N—N+(O–—) se transforma en nitrógeno elemental u óxidos de nitrógeno que se liberan al ambiente. Esta pérdida puede evitarse tratando previamente la muestra con un agente reductor para formar productos que se comporten como el nitrógeno amínico y amídico. Azufre El azufre contenido en material orgánico y biológico se puede determinar por combustión de la muestra en corriente de oxígeno. El SO2 formado durante la combustión se recoge por destilación en una disolución diluida de H2O2. Al mezclar ambos compuestos se genera ácido sulfúrico según la reacción: SO2(g) + H2O2 → H2SO4 Posteriormente el ácido sulfúrico se valora con un patrón básico. Sales de amonio Las sales de amonio se determinan por conversión a amoníaco mediante una base fuerte y posterior destilación. El amoníaco se recoge y se valora igual que en el método Kjeldahl. Nitratos y nitritos Los iones nitrito y nitrato se reducen a amonio con una aleación Devarda (50% de Cu + 45% de Al + 5% de Zn). La aleación se añade a una disolución fuertemente alcalina que transforma el amonio generado en amoníaco. El amoníaco formado se destila después de que se haya completado la reacción. También se emplea aleación de Arnd (60% de Cu + 40% de Mg) como agente reductor.

3.4. VALORACIONES DE PRECIPITACIÓN La valoración de precipitación se basa en reacciones que forman compuestos iónicos de baja solubilidad. Sin embargo, la lenta velocidad a la que se forman la mayoría de los precipitados ocasiona que solo se pueda disponer de unos cuantos agentes precipitantes que tengan aplicación en este tipo de valoraciones. El nitrato de plata es el

52

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

reactivo precipitante más importante, y uno de los más utilizados en la determinación de halogenuros, aniones como SCN–, CN–, CNO–, mercaptanos, ácidos grasos y varios aniones inorgánicos divalentes. Los métodos de valoración que se basan en el empleo de nitrato de plata se conocen como métodos argentométricos. La Tabla 3.3 muestra varios métodos típicos de valoración argentométrica.

TABLA 3.3. Métodos típicos de precipitación argentométrica Sustancia determinada

Punto final

Observaciones

AsO43– ; Br– ; I– ; CNO– ; SCN–

Volhard

No es necesario separar la sal de plata

CO42– ; Cr42– ; CN– ; Cl– ; C2O42– ; PO43– ; S2– ; NCN2–

Volhard

Es necesario separar la sal de plata antes de la retrovaloración del exceso de Ag+

BH4–

Volhard modificado

Valorar el exceso de Ag+ según: BH4– + 8 Ag+ + 8 OH– → 8 Ag (s) + H2BO32– + 5 H2O

Epóxido

Volhard

Valoración con exceso de Cl– tras la hidrohalogenación

K+

Volhard modificado

Precipitar el K+ con un exceso conocido de B(C6H5)4– añadir un exceso de Ag+ para precipitar el AgB(C6H5)4 (s) y retrovalorar el exceso

Br– ; Cl–

2 Ag+ + CrO42– → Ag2CrO4 (s) (rojo)

En disolución neutra

Br– ; Cl– ; I– ; SeO42–

Indicador de adsorción

V(OH)4+

Electroanalítico

Valoración directa con Ag+

Zn2+

Volhard modificado

Precipitación como ZnHg(SCN)4 , filtrar, disolver en ácido, añadir exceso de Ag+, retrovalorar el exceso de Ag+

F–

Volhard modificado

Precipitación como PbClF, filtrar, disolver en ácido, añadir exceso de Ag+, retrovalorar el exceso de Ag+

Métodos de análisis por valoración

•• •• ••

53

Los puntos finales producidos por un indicador químico consisten en un cambio de color y, ocasionalmente, en la aparición de turbidez en la disolución que se está valorando. Los requisitos que debe reunir un indicador para valoraciones de precipitación son similares a los requeridos en las valoraciones ácido-base. Los tres indicadores más utilizados en valoraciones argentométricas son: Ion cromato; el método de Mohr El cromato de sodio puede servir como indicador en las determinaciones argentométricas de iones cloruro, bromuro y cianuro, ya que al reaccionar con el ion plata forma un precipitado de cromato de plata (Ag2CrO4) de color rojo ladrillo. Las reacciones que se producen al aplicar el método de Mohr en la determinación de cloruros son: Ag+ + Cl– → ↓AgCl (s) blanco

2 Ag+ + CrO42– → ↓AgCrO4 (s) rojo

Al inicio de la valoración, los iones plata reaccionan con el cloruro presente en la disolución formando cloruro de plata, que precipita enturbiando la disolución con un color blanquecino. Tras neutralizar todos los iones Cl–, la Ag+ reacciona con el ion cromato (indicador), formándose cromato de plata que precipita tiñendo la disolución de rojo. La valoración debe realizarse a un pH entre 7 y 10, ya que en disoluciones más ácidas se forma ácido crómico y la concentración de ion cromato es demasiado baja. Indicador de adsorción; el método de Fajans Un indicador de adsorción es un compuesto orgánico que tiende a adsorberse sobre la superficie de un sólido durante la valoración por precipitación. La adsorción (o desorción) ocurre cerca del punto de equivalencia, dando como resultado un cambio de color. La estructura química de la fluoresceína presenta tres grupos ionizables (Figura 3.1). En disolución acuosa, el compuesto se disocia formando iones fluoresceinato, que poseen carga negativa y son de color verde amarillento. En las primeras etapas de la valoración de ion cloruro con nitrato de plata, las partículas coloidales de cloruro de plata están cargadas negativamente debido a la adsorción del exceso de iones cloruro. Los aniones de fluoresceína son repelidos de la

54

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

O

HO

COOH

FIGURA 3.1. Estructura química de la fluoresceína.

superficie de las partículas coloidales por repulsión electrostática, originando el color verde amarillento de la disolución propio del ión fluoresceinato. Más allá del punto de equivalencia, las partículas de cloruro de plata adsorben el exceso de iones plata y adquieren carga positiva, por lo que los iones fluoresceinato son atraídos hacia la capa que rodea las partículas de cloruro de plata. El resultado es la formación de fluoresceinato de plata de color rojo.

Hierro (III); el método de Volhard En el método de Vollhard, los iones plata se valoran (precipitan) con una disolución patrón de tiocianato. El indicador de la valoración es el hierro (III), ya que un ligero exceso de ion tiocianato vuelve roja la disolución al formarse tiocianato férrico. A continuación se muestran las reacciones que se dan en la valoración de cloruros por el método de Volhard: Ag+ + Cl– → ↓AgCl (s) blanco

SCN + Ag → ↓AgSCN (s) –

+

blanco

Fe3+ + SCN– → Fe(SCN)2+ rojo

El método de Volhard necesita que la disolución sea muy ácida para evitar la precipitación del Fe (III) como óxido hidratado.

En primer lugar se añade nitrato de plata para causar la precipitación de los cloruros. Es difícil distinguir el momento exacto en que deja de aparecer precipitado blanco, por lo que se añade un pequeño exceso de nitrato de plata. A continuación se valora el exceso de plata añadido con tiocianato, que continúa precipitando la plata. Co-

Métodos de análisis por valoración

•• •• ••

55

noceremos el momento exacto en que acaba la precipitación de AgSCN porque el primer exceso de SCN– causará un fuerte color rojo al reaccionar con el indicador (Fe3+) y aparecer el Fe(SCN). Los moles de cloruro presentes en la disolución corresponderán con la diferencia entre los moles de plata añadidos en la primera valoración y los moles de tiocianato añadidos en la segunda valoración.

3.5. VALORACIONES POR FORMACIÓN DE COMPLEJOS Los reactivos que forman complejos se utilizan ampliamente en la valoración de cationes. Los más empleados son los compuestos orgánicos, que tienen varios grupos donadores de electrones capaces de formar numerosos enlaces covalentes con iones metálicos. La mayoría de los iones metálicos reaccionan con donadores de pares de electrones formando compuestos de coordinación o complejos. La especie donadora, o ligando, debe tener por lo menos un par de electrones no compartidos para formar el enlace. El agua, el amoníaco y los iones halogenuro son ligandos inorgánicos comunes. El número de enlaces covalentes que tiende a formar un catión con los donadores de electrones corresponde a su número de coordinación. Los números de coordinación más comunes son dos, cuatro y seis. La especie que se forma como resultado de la coordinación puede no tener carga o tenerla positiva o negativa. Así, el Cu (II), cuyo número de coordinación es 4, forma un complejo catiónico con el amoníaco (Cu(NH3)4+), un complejo neutro con glicina (Cu(NH2CH2COO)2), y un complejo aniónico con el ion cloruro (CuCl42–). Los métodos de valoración que se basan en la formación de complejos se utilizan fundamentalmente con una clase particular de compuestos de coordinación denominados quelatos. Un quelato se produce cuando un ion metálico se coordina con dos o más grupos donadores de un solo ligando, formando un anillo heterocíclico de cinco o seis miembros. La Figura 3.2 muestra la estructura del quelato formado entre cobre y glicina:

O NH2 O Cu2+ + 2 H

C H

C

C

O O

O

C + 2 H+

Cu

OH H2 C

N H2

N H2

FIGURA 3.2. Ion cobre quelado por glicina.

CH2

56

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Un ligando que solo tiene un grupo donador disponible, como el amoníaco, se denomina unidentado; en tanto que los que tienen dos grupos disponibles, como la glicina, se denominan bidentados. También existen tri-, tetra-, penta- y hexadentados. Los ligandos multidentados (en especial los que cuentan con 4 o 6 grupos donadores) tienen dos ventajas sobre los unidentados: 1) en general, reaccionan mejor con los cationes y, por lo tanto, dan puntos finales más definidos; y 2) comúnmente reaccionan con iones metálicos en una sola etapa, mientras que la formación de complejos con ligandos unidentados implica la formación de dos o más especies intermedias.

Valoraciones con ácido etilendiamintetraacético (EDTA) La molécula de ácido etilendiamintetraacético (EDTA) es un ligando con seis sitios posibles para unirse a un ion metálico: los cuatro grupos carboxilo y los grupos amino, cada uno de estos últimos con un par de electrones no compartido (Figura 3.3). HO O C

CH2 N

HO O C

CH2

CH2

CH2

CH2

CO O H

CH2

CO O H

N

FIGURA 3.3. Estructura de una molécula de EDTA. Los puntos representan los electrones desapareados.

Las disoluciones de EDTA son muy valiosas como valorantes gracias a que, con independencia de la carga del catión, el reactivo se combina con los iones metálicos en relación 1:1. En la Figura 3.4 se representa la formación de complejos de plata y aluminio con EDTA. Los complejos resultantes tienen respectivamente 3 y 1 carga negativa. Ag+ + Y4–

AgY3–

Al3+ + Y4–

AlY–

FIGURA 3.4. Formación de complejos entre el EDTA (Y–4) y los iones Ag+ y Al3+.

El EDTA es un reactivo excepcional, no solo porque forma quelatos con todos los cationes, sino también porque la mayoría de estos quelatos son tan estables como para servir de base para un método de valoración. Esta gran estabilidad proviene de los distintos sitios complejantes dentro de la molécula, los cuales le confieren una estructura en forma de jaula (Figura 3.5), en la que el catión se encierra y aísla de manera efectiva de las moléculas de disolvente.

Métodos de análisis por valoración

•• •• ••

57

O C OO C

H2 CH2 C

O

N

CH2

N

CH2

Metal O O

C

C H2 O

CH2 C O

FIGURA 3.5. Estructura del quelato entre un metal y EDTA.

Las valoraciones con EDTA se pueden realizar por: a) Valoración directa. Aproximadamente 40 cationes pueden determinarse por valoración directa usando indicadores específicos de cationes metálicos. b) Valoración por retroceso. Son útiles para la determinación de cationes que forman complejos estables con el EDTA y para los cuales no se dispone de un indicador adecuado. El método también es aplicable para cationes que reaccionan lentamente con el EDTA. A la disolución que contiene el analito se agrega un exceso conocido de disolución patrón de EDTA. Cuando se considera que la reacción se ha completado, el exceso de EDTA se valora por retroceso con una disolución patrón de magnesio o zinc (metales para los que si existen buenos indicadores). La cantidad de analito será igual a la cantidad de EDTA utilizada menos el Mg o el Zn empleados en neutralizar el exceso de EDTA. c) Métodos de desplazamiento. En las valoraciones por desplazamiento, se añade a la disolución de analito un exceso no medido de la disolución que contiene el complejo Mg-EDTA o Zn-EDTA. Si el analito forma un complejo más estable que el de magnesio o zinc, tiene lugar la siguiente reacción de desplazamiento: MgY2– + M2+  MY2– + Mg2+ donde M2+ representa el catión que se analiza. El magnesio o zinc liberado se valora entonces con una disolución patrón de EDTA. La cantidad de analito será igual a la diferencia entre el complejo MgY2+ añadido y el EDTA necesario para valorar el Mg2+ desplazado.

58

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Indicadores para las valoraciones con EDTA El negro de eriocromo T es un indicador de iones metálicos ampliamente utilizado en las valoraciones de varios cationes comunes. Este compuesto contiene un grupo ácido sulfónico, así como dos grupos fenólicos que se disocian parcialmente dependiendo del pH (Figura 3.6). SO3– O2N OH N N OH

FIGURA 3.6. Estructura del negro de eriocromo T.

El negro de eriocromo T presenta varios colores dependiendo de si está unido o no a un metal y del pH de la disolución. Así, a pH 7, el indicador compleja el metal a determinar adquiriendo la disolución un color rojo. Al añadir EDTA, el metal se disocia del negro de eriocromo y se compleja con el EDTA; cuando el indicador ha perdido todas las moléculas de analito, la disolución adquiere color azul. Aplicaciones de las valoraciones con EDTA Las valoraciones complejométricas con EDTA se han empleado para la valoración de prácticamente todos los cationes metálicos, excepto los metales alcalinos. A primera vista podría parecer que el reactivo carece de selectividad. No obstante, regulando el pH se pueden controlar considerablemente las interferencias. Así, por ejemplo, generalmente es posible valorar cationes trivalentes en presencia de especies divalentes manteniendo el pH cercano a 1. A este pH, los quelatos divalentes no se forman, mientras que los trivalentes se forman de manera cuantitativa. Algunas veces es posible eliminar interferencias con un catión, en particular, añadiendo a la disolución un agente enmascarante. Un agente enmascarante es un agente acomplejante auxiliar que reacciona de manera selectiva con un componente de la disolución y así evita que interfiera en el análisis. Por ejemplo, el ion cianuro se emplea a menudo como agente enmascarante para permitir la valoración de iones calcio y magnesio en presencia de otros iones como cadmio, cobalto, cobre, níquel,

Métodos de análisis por valoración

•• •• ••

59

zinc y paladio. Todos estos iones forman complejos de cianuro lo bastante estables como para impedir su reacción con el EDTA. Determinación de la dureza del agua La «dureza» del agua se define como la cantidad total de cationes multivalentes de la muestra. La determinación de la dureza es una prueba analítica útil, que proporciona una medida de la calidad del agua para uso doméstico o industrial. La prueba es de particular importancia en la industria, gracias a que el calentamiento del agua dura precipita el carbonato de calcio que obtura calderas y tuberías. La dureza del agua se determina valorando la muestra con EDTA después de haber ajustado el pH a 10. Un indicador para el ion magnesio puede servir como indicador en las valoraciones de la dureza del agua, ya que el magnesio forma el complejo de EDTA menos estable de todos los cationes multivalentes de las muestras de agua y, por lo tanto, no se valora hasta que se ha añadido suficiente reactivo para complejar los demás cationes de la muestra.

3.6. MÉTODOS GRAVIMÉTRICOS Los métodos gravimétricos se basan en la medición de masa. Hay dos tipos de métodos gravimétricos: A) Métodos de precipitación. En los métodos de precipitación el analito es convertido en un compuesto poco soluble que precipita. El precipitado se filtra, se lava, se convierte mediante un tratamiento térmico en un producto de composición conocida y finalmente se pesa. Un método gravimétrico de precipitación es el recomendado para medir la cantidad de calcio en aguas naturales. Método para establecer la cantidad de calcio en aguas naturales. (Recomendado por Asociation of Official Analytical Chemists). Se agrega exceso de ácido oxálico a un volumen de muestra. La adición posterior de NH3 hace que todo el calcio precipite como oxalato de calcio: Ca2+ (ac) + C2O42– (ac) → ↓CaC2O4 (s) El precipitado se transfiere a un crisol, se seca y calcina al rojo vivo. Esto convierte cuantitativamente el precipitado en óxido de calcio. CaC2O4 (s) → ↓CaO (s) + ↑CO (g) + ↑CO2 (g) El crisol con el precipitado se enfría, se seca y por pesada se determina la masa de óxido de calcio.

60

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

B) Métodos de volatilización. En los métodos de volatilización el analito o sus productos de descomposición se volatilizan a una temperatura adecuada. El producto volátil se recoge, se pesa, o, alternativamente, se determina de manera indirecta la masa de producto por la pérdida de masa de la muestra. El método utilizado para la determinación del contenido de bicarbonato sódico en antiácidos es un método gravimétrico de volatilización. Método para determinar el contenido de bicarbonato sódico en tabletas antiácidas. Una muestra de tabletas molidas se pesa y trata con ácido sulfúrico diluido para convertir el carbonato ácido de sodio en dióxido de carbono, agua y sulfato ácido de sodio: NaHCO3 (ac) + H2SO4 (ac) → ↑CO2 (g) + H2O + NaHSO4 (ac) Esta reacción se lleva a cabo en un matraz conectado a un tubo de absorción que se ha pesado previamente y que contiene material absorbente que retiene selectivamente el CO2 evaporado. La masa de CO2 recuperado permitirá determinar la cantidad de bicarbonato sódico, ya que el número de moles de CO2 liberado será igual al número de moles de NaHCO3 presente inicialmente en la disolución.

3.6.1. Métodos gravimétricos de precipitación Además de especificidad y selectividad, las propiedades que deben reunir los reactivos precipitantes son similares a las de los patrones empleados en métodos volumétricos. Además, los precipitados que se forman deben ser: 1. Fácilmente filtrables y lavables, para poder eliminar contaminantes. 2. De baja solubilidad, para que las pérdidas en lavados sean despreciables. 3. Tener una composición conocida después de secar o calcinar. Aplicaciones de los métodos gravimétricos Se han desarrollado métodos gravimétricos para la mayor parte de cationes y aniones inorgánicos, así como para especies neutras como agua, dióxido de azufre, dióxido de carbono y yodo. También pueden determinarse varias substancias orgánicas como lactosa en productos lácteos, salicilatos en productos farmacéuticos, fenoftaleína en laxantes, nicotina en plaguicidas, colesterol en cereales y benzaldehído en almendras. Agentes precipitantes inorgánicos Estos reactivos normalmente forman sales ligeramente solubles u óxidos hidratados con el analito. Como muestra la Tabla 3.4, la mayoría de los reactivos inorgánicos no son muy selectivos.

Métodos de análisis por valoración

•• •• ••

61

TABLA 3.4. Algunos agentes precipitantes inorgánicos Agente precipitante

Elemento precipitado*

NH3 (ac)

Be (BeO), Al (Al2O3), Sc (Sc2O3), Cr (Cr2O3), Fe (Fe2O3), Ga (Ga2O3), Zr (Zr3O3), In (In2O3), Sn (Sn2O3), U (U3O8)

H2S

Cu (CuO), Zn (ZnO o ZnSO4), Ge (GeO2), As (As2O3 o As2O5), Mo (MoO3), Sn (SnO2), Sb (Sb2O3 o Sb2O5), Bi (Bi3S3)

(NH4)2S

Hg (HgS), Co (CoO4)

(NH4)2HPO4

Mg (Mg2P2O7), Al (AlPO4), Mn (Mn2P2O7), Zn (Zn2P2O7), Zr (Zr2P2O7), Cd (Cd2P2O7), Bi (BiPO4)

H2SO4

Li, Mn, Sr, Cd, Pb, Ba (todos con sulfatos)

H2PtCl6

K (K2PtCl6), Rb (Rb2PtCl6), Cs (Cs2PtCl6)

H2C2O4

Ca (CaO), Sr (SrO), Th (ThO2)

(NH4)2MoO4

Cd (CdMoO4), Pb (PbMoO4)

HCl

Ag (AgCl), Hg (Hg2Cl2), Na (NaCl en alcohol butílico), Si (SiO2)

AgNO3

Cl (AgCl), Br (AgBr), I (AgI)

(NH4)2CO3

Bi (Bi2O3)

NH4SCN

Cu (Cu2(SCN)2)

NaHCO3

Ru, Os, Ir (precipitados como óxidos hidratados y reducidos con H2 al estado metálico)

HNO3

Sn (SnO2)

H5IO6

Hg (Hg(IO6)2)

NaCl, Pb(NO3)2

F (PbClF)

BaCl2

SO42– (BaSO4)

MgCl2 , NH4Cl

PO43– (Mg2P2O7)

* La forma precipitada se indica entre paréntesis.

62

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Agentes precipitantes orgánicos En general, son mucho más selectivos que la mayoría de los reactivos inorgánicos. Los agentes precipitantes orgánicos forman productos no iónicos ligeramente solubles denominados compuestos de coordinación. Algunos de los compuestos más utilizados son: a) 8-Hidroxiquinolina. Las solubilidades de los 8-hidroxiquinolatos metálicos varía mucho de catión a catión. También son dependientes del pH debido a que la 8-hidroxiquinolina siempre está desprotonada durante la quelación. b) Dimetilglioxima. Es un reactivo específico de Ni2+ , ya que es el único catión que precipita con dimetilglioxima en una disolución débilmente alcalina. c) Tetrafenilborato de sodio. En disoluciones frías de ácidos minerales es un agente precipitante casi específico de iones potasio y magnesio. Las únicas especies que interfieren son el mercurio (II), el rubidio y el cesio.

Análisis de grupos funcionales orgánicos Varios reactivos reaccionan selectivamente con ciertos grupos funcionales orgánicos (Tabla 3.5), por lo que pueden utilizarse en la mayoría de los compuestos que contienen estos grupos.

3.6.2. Métodos de volatilización Los dos métodos más comunes son los que se aplican para H2O y CO2. El H2O ó el CO2 se eliminan cuantitativamente de muchas muestras inorgánicas por calcinación. Los compuestos se recogen en un sólido desecante y su masa se determina a partir de la ganada por el desecante. También se puede determinar por la pérdida de masa sufrida por la muestra a causa del calentamiento. Este método es menos satisfactorio, ya que asume que solo se volatilizan estos dos compuestos.

Métodos de análisis por valoración

•• •• ••

63

TABLA 3.5. Métodos gravimétricos para determinación de grupos funcionales orgánicos Grupo funcional

Base del método

Reacción y producto pesado*

Carbonilo

Masa del precipitado con 2,14-dinitrofenilhidrazina

RCHO + H2NNHC6H3(NO2)2 → R-CH=NNHC6H3(NO2)2 (s) + H2O (RCOR’ reacciona de manera similar)

Carbonilo aromático

Masa de CO2 formado a 230 °C en quinolina; CO2 destilado, absorbido y pesado

230 °C ArCHO ———→ Ar + CO2 (g) CuCO3

Nitro aromático

Pérdida de masa de Sn

RNO2 + 3/2 Sn (s) + 4 H+ → RNH2 + 3/2 Sn4+ + 2 H2O

Azo

Pérdida de masa de Cu

RN=NR’ + 2 Cu (s) + 4 H+ → RNH2 +R’NH2 + 2 Cu2+

Fosfato

Masa de la sal de Ba

ROP=O(OH)2 + Ba2+ → ROP=OO2Ba (s) + 2 H+

Ácido sulfámico

Masa de BaSO4 después de la oxidación con HNO2

RNHSO3H + HNO2 + Ba2+ → ROH + BaSO4 (s) +N2 + 2 H+

Ácido sulfínico

Masa de Fe2O3 después de la calcinación de sulfinato de Fe (III)

3 ROSOH + Fe3+ → (ROSO)3Fe (s) + 3H+ (ROSO)3Fe → CO2 + SO2 + Fe2O3 (s)

Metoxilo y etoxilo

Masa de AgI formada después de la destilación y descomposición de CH3I o C2H5I

ROCH3 + HI → ROH + CH3I RCOOCH3 + HI → RCOOH + CH3I ROC2H5 + HI → ROH + C2H5I CH3I + Ag+ + H2O → AgI (s) + CH3OH

* Se indica subrayada la forma de pesada.

PARTE

Técnicas espectroscópicas

III

4

Técnicas espectroscópicas

CONTENIDO 4.1. Introducción a las técnicas espectroscópicas 4.2. La radiación electromagnética 4.2.1. Naturaleza de la radiación 4.2.2. Algunos parámetros básicos relacionados con la radiación 4.2.3. El espectro de radiación electromagnética 4.3. Teoría de la absorción molecular 4.3.1. Tipos de transiciones moleculares 4.3.2. Diagramas de niveles de energía 4.4. Instrumentos ópticos en medidas de absorbancia 4.5. Especies moleculares que absorben radiación visible y ultravioleta 4.5.1. Absorción por compuestos orgánicos 4.5.2. Absorción por especies inorgánicas 4.5. Transmitancia, absorbancia y Ley de Lambert-Beer 4.7. Espectroscopía de fluorescencia 4.7.1. Teoría de la fluorescencia 4.7.2. Especies fluorescentes 4.7.3. Equipos de medida de fluorescencia 4.7.4. Efecto de la concentración de analito sobre la intensidad de la fluorescencia 4.7.5. Aplicaciones de los métodos de fluorescencia 4.8. Espectroscopía de infrarrojos 4.8.1. Frecuencias vibracionales 4.8.2. Espectros de infrarrojo y especies que absorben radiación infrarroja 4.8.3. Información cualitativa de los espectros de infrarrojo

67

68

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

4.1. INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS Las técnicas espectroscópicas de análisis se basan en la observación de las interacciones entre la materia y la radiación electromagnética. Así, se estudiará la emisión o absorción de dicha radiación para detectar y cuantificar la presencia de ciertos analitos en una muestra. Las radiaciones electromagnéticas más utilizadas con finalidad analítica son las comprendidas en la región infrarroja, visible y ultravioleta. La especificidad de la detección del analito se basará en la selección de la longitud de onda de la radiación emitida o absorbida. Los instrumentos que miden la absorción de luz visible se denominan colorímetros, mientras que los espectrofotómetros son los aparatos encargados de medir la absorción de luz ultravioleta y visible. Ambos tipos de instrumento constan de un sistema de emisión de radiación, un sistema de selección de longitud de onda de la radiación empleada, un sistema de introducción de la muestra en el haz de radiación y un sistema detector, que mide la intensidad de luz recibida tras atravesar la muestra. Finalmente, un sistema electrónico se encarga de calcular la relación entre la intensidad de la radiación emitida por la fuente y la intensidad de la radiación recibida en el detector. En capítulos posteriores veremos que son varias las técnicas de separación de analitos que utilizan métodos espectroscópicos de absorción para la detección y cuantificación de analitos. En este capítulo se describirán de forma elemental los principios básicos de absorción y emisión de radiación electromagnética, los tipos de sustancia que las producen, la ley que cuantifica la absorción (Ley de Lambert-Beer) y los instrumentos necesarios para cuantificar la absorción y la emisión de radiación.

4.2. LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA 4.2.1. Naturaleza de la radiación Cuando un campo eléctrico y un campo magnético asociados no varían con el tiempo y no interaccionan entre ellos pueden ser considerados de manera individual. Sin embargo, si los campos no son constantes no es posible tratarlos individualmente. La ley de Faraday dice que si un campo magnético varía con el tiempo actúa como una fuente de campo eléctrico; y según la ley de Ampere, un campo eléctrico variable actúa como una fuente de campo magnético. De este modo, cuando uno de los campos varía con el tiempo, se induce un campo del otro tipo en las regiones adyacentes del espacio. Las radiaciones electromagnéticas se caracterizan por la existencia en cada punto del espacio en que se transmiten de un campo eléctrico y un campo magnético relacionados entre sí. Como se observa en la Figura 4.1, el campo eléctrico oscila en el pla-

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

69

Y ε

c

β

X

Z

FIGURA 4.1. Campos eléctrico y magnético de una onda electromagnética.

no XY y el campo magnético en el plano XZ, lo cual origina una onda polarizada linealmente. Las ondas electromagnéticas presentan una variación periódica que se propaga en el vacío a una velocidad de 300000 km/seg. La radiación electromagnética es portadora de una cantidad de energía y presenta características específicas según la banda de frecuencias (o longitud de onda) en que se halle inscrita. La radiación electromagnética puede propagarse sin un soporte material, es decir, viajar por el vacío.

Puede ver una animación sobre la propagación de ondas electromagnéticas en el espacio en: http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/17143/lecciones/cap01/animacion2.htm (Página activa en julio de 2004.)

4.2.2. Algunos parámetros básicos relacionados con la radiación Longitud de onda (λ) = distancia entre dos puntos iguales de la onda (se suele medir en unidades de longitud, normalmente nm o Å). Número de ondas (λ–1) = magnitud inversa de longitud de onda (se suele medir en cm–1). Periodo (τ) = tiempo que tarda la onda en llegar a dos puntos idénticos del ciclo de la onda (se mide en unidades de tiempo, normalmente s). Los conceptos de longitud de onda y periodo se ilustran en la figura 4.2.

70

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Amplitud

Campo eléctrico

Longitud de onda o periodo

0

Distancia o tiempo

FIGURA 4.2. Parámetros de una onda electromagnética.

Frecuencia (ν) = número de ciclos en una unidad de tiempo (se expresa en unidades inversas de tiempo, normalmente s–1). Hertzio (Hz) = Unidad de frecuencia del sistema internacional. Es la frecuencia que corresponde a un fenómeno periódico cuyo periodo es de un segundo. Velocidad de la onda (V) = Es la relación entre la longitud de onda y el periodo, se suele expresar en km/s. La velocidad de una onda desplazándose en el vacío es de 300000 km/s. La longitud de onda y la frecuencia se relacionan entre sí por la relación: ν = V / λ. Energía de la onda = Se calcula como el producto entre la frecuencia y la constante de Plank (h = 6.62 × 10-34 J. s). Es importante indicar que la energía de las ondas electromagnéticas está cuantificada.

Cuanto mayor es la frecuencia de una onda electromagnética mayor es su energía asociada y menor su longitud de onda.

No debe confundirse energía de los fotones con su luminosidad o intensidad de la radiación. El número de fotones es proporcional a la luminosidad, pero la energía del fotón está relacionada con el color (longitud de onda) de este. De todo lo expuesto, debemos resaltar la idea de que cuanto mayor es la frecuencia de una onda electromagnética mayor es su energía asociada y menor su longitud de onda.

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

71

Puede ver una animación sobre conceptos básicos de ondas electromagnéticas en: http://www.vitual.unal.edu.co/cursos/ciencias/17143/lecciones/cap01/animacion1.htm (Página activa en julio de 2004.)

4.2.3. El espectro de radiación electromagnética Las ondas electromagnéticas cubren una amplia gama de frecuencias y longitudes de onda. La clasificación no tiene límites precisos, ya que fuentes diferentes pueden producir ondas en intervalos de frecuencia parcialmente superpuestos. La clasificación habitual del espectro electromagnético se muestra en la Figura 4.3 y es la siguiente: 1) Ondas de radiofrecuencia: Las longitudes de onda van desde algunos kilómetros hasta 0.3 m; el intervalo de frecuencias es de entre algunos Hz hasta 109 Hz. Es1e-13

1e+ 6

1e-12

1e+ 5

1e-11

1e+ 4

1e-10

1e+ 3

1e-9

1e+ 2

1e-8

1e+ 1

1e-7

VISIBLE

1e+ 0

1e-6

INFRARROJO

1e- 1

RAYOS GAMMA

1e+20 1e+19

RAYOS X

1e+18 1e+17

FRECUENCIA (Hz)

1e+16

ULTRAVIOLETA

1e+15 1e+14 1e+13

1e- 2

1e+12 1e+11 1e+10 1e+9

1e- 3 radar MICROONDAS horno microondas doméstico

1e+8

radios de FM, televisiones

1e+7

RADIOFRECUENCIA radios de onda media

1e+6 1e+5 1e+4 1e+3

ENERGÍA (eV)

1e+ 7

1e+21

1e-5 1e-4 1e-3

1e- 4

1e-2

1e- 5

1e-1

1e- 6

1e+0

1e- 7

1e+1

1e- 8

1e+2

1e- 9

1e+3

1e- 10

1e+4

1e- 11

1e+5

FIGURA 4.3. El espectro de radiación electromagnética.

Longitud de onda (m)

1e+22

72

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

tas ondas se utilizan para propagar señales de radio y televisión y son generadas por dispositivos electrónicos. 2) Microondas: Las longitudes de onda van desde 0.3 m a 10–3 m, siendo el intervalo de frecuencias desde 109 hasta 3 × 1011 Hz. Estas ondas se utilizan en el radar y otros sistemas de comunicaciones. 3) Infrarrojo: Cubre longitudes de onda entre 10–3 y 8 × 10–7 m; el intervalo de frecuencias es entre 3 × 1011 y 4 × 1014 Hz. Estas ondas son producidas por cuerpos calientes y tienen muchas aplicaciones en industria, medicina y astronomía. 4) Visible: Es una estrecha banda formada por las longitudes de onda a las cuales la retina humana es sensible. Se extiende entre 7.8 × 10–7 hasta 3.8 × 10–7 m, con frecuencias entre 4 × 1014 hasta 8 × 1014 Hz. Las diferentes sensaciones que la luz produce en el ojo, que se denominan colores, dependen de la longitud de onda y se corresponden aproximadamente con los intervalos mostrados en la Tabla 4.1. 5) Ultravioleta: Cubre desde 3.8 × 10–7 hasta alrededor de 6 × 10–9 m, con frecuencias desde 1015 hasta 1017 Hz. Su energía es del orden de magnitud de la energía involucrada en muchas reacciones químicas, lo que explica muchos de sus efectos químicos. 6) Rayos X: Esta parte del espectro electromagnético abarca una gama de longitudes de onda entre 10–9 y 6 × 10–12 m, o sea frecuencias entre 3 × 1017 y 5 × 1019 Hz. Tiene numerosas aplicaciones médicas. TABLA 4.1. El espectro visible Color

λ (nm)

Color complementario

Violeta

400-435

Amarillo-verdoso

Azul

435-480

Amarillo

Azul-verde

480-490

Naranja

Verde-azul

490-500

Rojo

Verde

500-560

Púrpura

Amarillo-verde

560-580

Rojo

Amarillo

580-595

Azul

Naranja

595-650

Azul-verde

Rojo

595-750

Verde-azul

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

73

7) Rayos gamma (γ). Estas ondas electromagnéticas son de origen nuclear y se superponen al límite superior del espectro de rayos X; sus longitudes de onda van desde alrededor de 10–10 hasta menos de 10–14 m, estando la gama de frecuencias entre 3 × 1019 y 3 × 1022 Hz. Puede ver una animación sobre el espectro electromagnético en: http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/17143/lecciones/cap03/animacion4.htm (Página activa en julio de 2004.)

4.3. TEORÍA DE LA ABSORCIÓN MOLECULAR Todas los átomos o moléculas poseen un número discreto de niveles de energía. A temperatura ambiente, la mayoría de las especies se encuentran en su nivel energético más bajo denominado estado fundamental. Cuando una onda electromagnética interacciona con un átomo o molécula, la energía de dicha onda puede resultar absorbida si coincide exactamente con la energía necesaria para llevar a la especie química en cuestión desde el estado fundamental hasta alguno de los niveles energéticos superiores. En este caso, la energía de la onda se transfiere a la molécula, promoviéndola a un estado de energía más elevado o estado excitado. La excitación es un proceso en el cual una especie química absorbe energía y es promovida a un estado energético superior o estado excitado.

Después de un periodo de tiempo muy breve (unos pocos nanosegundos) la especie excitada se relaja a su estado original devolviendo energía al medio que le rodea.

4.3.1. Tipos de transiciones moleculares La excitación originada por radiaciones visibles o ultravioleta promueve transferencias de electrones que se hallan en niveles bajos de energía hasta orbitales de energía superior. La transición de un electrón entre diferentes niveles de energía se denomina transición electrónica y el proceso de absorción asociado es conocido como absorción electrónica. Además de las transiciones electrónicas, las moléculas presentan transiciones vibracionales, que ocurren como consecuencia de los niveles de energía cuantizados aso-

74

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

ciados a los enlaces intramoleculares. Las transiciones vibracionales se dan cuando se produce absorción de energía de longitud de onda infrarroja. En la Figura 4.4 se representan los tipos de vibraciones de enlaces por tensión y por flexión. Una molécula también posee un gran número de estados rotacionales cuantizados debidos al movimiento rotacional de la molécula alrededor de su centro de gravedad. Así pues, la energía total asociada a una molécula viene dada por la energía asociada a los orbitales externos de la molécula, a la energía de la molécula debida a las vibraciones interatómicas y a la energía asociada a los distintos movimientos rotacionales de una molécula alrededor de su centro de gravedad. a) Vibraciones de tensión

asimétrica

simétrica

b) Vibraciones de flexión

balanceo en el plano +

+

aleteo fuera del plano

tijereteo en el plano +

–

torsión fuera del plano

FIGURA 4.4. Vibraciones moleculares. El signo positivo indica movimiento del plano de la página hacia el lector. El signo negativo, el movimiento del plano de la página alejándose del lector.

4.3.2. Diagramas de niveles de energía La Figura 4.5 es un diagrama parcial de los niveles de energía, que muestra lo que ocurre cuando una molécula absorbe radiación infrarroja, visible y ultravioleta. Las líneas E1 y E2 representan las energías de los distintos niveles electrónicos excitados de una molécula de nivel energético fundamental E0. Las líneas de los números 1 a 4 representan energías de niveles vibracionales asociados a cada estado electrónico. Se puede observar que las diferencias entre los diferentes estados vibracionales son menores que las diferencias entre niveles de energía. Aunque no se muestra en la Figura 4.5 cada estado vibracional está a su vez asociado a varios niveles rotacionales.

Técnicas espectroscópicas

ENERGÍA

IR

VIS

•• •• ••

75

UV

E2

4 3 2 1 0

E1

4 3 2 1 0

E0

4 3 2 1 0

FIGURA 4.5. Diagrama de los niveles de energía de un átomo o molécula. Se muestran los cambios que se producen por absorción de radiación infrarroja (IR), visible (VIS) y ultravioleta (UV).

Absorción en el infrarrojo La radiación infrarroja no es lo suficientemente energética como para provocar transiciones electrónicas, aunque sí produce cambios en los estados vibracionales y rotacionales asociados al estado energético fundamental (E0) de la molécula. Absorción ultravioleta y visible En la Figura 4.5 se muestran diferentes transiciones desde el estado fundamental (E0) a diferentes estados vibracionales del primer estado excitado (E1). Para que se produzcan estas transiciones son necesarios fotones de longitud de onda visible, más energéticos que los infrarrojos. Para la transición a un estado excitado superior al E1 son necesarios fotones todavía más energéticos, en ese caso hablamos de radiación ultravioleta. Para que se dé cualquiera de las transiciones indicadas en la Figura 4.5, la energía de la onda electromagnética que incide sobre la muestra ha de ser exactamente igual a la diferencia de energía entre el estado fundamental y el estado excitado al que vaya a ser promovida la molécula.

76

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

4.4. INSTRUMENTOS ÓPTICOS EN MEDIDAS DE ABSORBANCIA La Figura 4.6 muestra los componentes básicos de un espectrofotómetro de absorción. Es decir, de un instrumento diseñado para cuantificar la absorción de radiación ultravioleta o visible por sustancias químicas. Dichos componentes básicos son: • La fuente, que emite la radiación que posteriormente interactúa con la muestra. • Un sistema monocromador que permita separar bandas de luz estrechas, ya sea antes o después de la interacción de la luz con la muestra. El monocromador está constituido por lentes, espejos, redes de difracción, prismas de refracción, rendijas, etc. • Un compartimento para colocar la muestra en celdas o cubetas adecuadas, dependiendo de la región del espectro utilizada. El compartimento estará colocado de manera que el haz de luz de la fuente atraviese la muestra perpendicularmente. • Un sistema para la detección de la radiación que ha atravesado la muestra o sistema detector. • Sistemas electrónicos de amplificación, transformación y comparación de señal. • Sistemas de registro de señal o almacenamiento de datos.

rendija

Fuente de radiación

Sistema monocromador

rendija

Cubeta de muestra

Sistema de medida

FIGURA 4.6. Partes básicas de un espectrofotómetro de absorción.

Fuentes de radiación visible La fuente más común para la espectrometría de absorción visible es una lámpara de incandescencia. El filamento suele ser de tungsteno (wolframio) que, cuando se pone a unos 3000 °C emite un espectro continuo de radiación electromagnética de longitud de onda entre 320 y 750 nm.

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

77

Fuentes de radiación ultravioleta Las llamadas lámparas de arco (Figura 4.7) son las fuentes de radiación ultravioleta más utilizadas en espectroscopía de absorción. Estas lámparas están formadas por una ampolla hermética interna que contiene dos electrodos conectados a una fuente de energía. La ampolla se rellena con un gas (generalmente H2, D2, Ar o Xe, o un vapor metálico de mercurio o sodio). Los electrodos aplican una descarga eléctrica que excita las partículas del gas. Cuando las partículas excitadas vuelven al estado fundamental, lo hacen emitiendo luz ultravioleta con un espectro continuo de 190 a 320 nm.

Pantalla reflectora

Hacia la muestra

Ampolla llena de gas

Electrodo

Electrodo

FIGURA 4.7. Lámpara de arco.

Para la espectroscopía de absorción se suele utilizar lámparas de descarga rellenas de deuterio, mientras que para medidas de fluorescencia se necesitan fuentes de mayor potencia y se utilizan lámparas rellenas de xenon o vapor de mercurio. Contrastando con las lámparas de visible y ultravioleta, posteriormente veremos que en espectrometría de absorción atómica se utilizan lámparas que emiten radiaciones de una sola longitud de onda, específica de cada tipo de lámpara.

Fuentes de radiación infrarroja El vidrio y la sílice son opacos a las radiaciones infrarrojas, con lo que no se pueden utilizar fuentes que contengan estos materiales. La fuente más comúnmente utilizada para el espectro de infrarrojo en el emisor de Nernst (Figura 4.8). Consiste en una varilla de unos pocos cm de longitud y aproximadamente 1 mm de diámetro fabricada con un material cerámico compuesto de óxido de zirconio con itrio. La varilla

78

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Cerámica incandescente

Resistencia para el calentamiento de la cerámica

Alambres de Pt para paso de corriente

Reflector

1 mm

FIGURA 4.8. Emisor de incandescencia de Nernst.

se calienta con una resistencia eléctrica adyacente hasta que alcanza unos 1800 K, temperatura a la que emite radiación infrarroja. A esta temperatura la varilla es conductora y la temperatura se mantiene pasando corriente a través de ella mediante unos alambres de platino. El carburo de silicio es otra cerámica conductora que también se utiliza como fuente de infrarrojo.

Sistemas monocromadores La función principal de un monocromador es la de proporcionar un haz de energía radiante con una longitud de onda (λ) dada. La salida espectral de cualquier monocromador usado con una fuente de radiación continua consiste en una gama de longitudes de onda con un valor medio de longitud que se ajusta orientando el monocromador. Un sistema monocromador consta de: 1. Una rendija de entrada que proporciona una imagen óptica estrecha de la fuente de radiación. 2. Una lente colimadora que hace paralela la radiación procedente de la rendija de entrada. 3. Una red de difracción para dispersar la radiación incidente. 4. Otra lente colimadora para reformar las imágenes de la rendija de entrada sobre la rendija de salida. 5. Una rendija de salida para aislar la banda espectral deseada, bloqueando toda la radiación dispersada excepto la del intervalo deseado.

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

79

Celdas y cubetas Es el compartimento donde se deposita la muestra a analizar. Es conveniente que el compartimiento esté aislado de la luz exterior. Las cubetas donde se depositan las muestras para realizar las medidas han de ser de plástico, vidrio o cuarzo en el caso de espectroscopía de absorción visible y necesariamente de cuarzo en el caso de espectroscopía de absorción ultravioleta. La necesidad del cuarzo en el último caso viene dada por la opacidad del plástico y el vidrio a la radiación ultravioleta. Normalmente las cubetas utilizadas para absorción ultravioleta y visible son siempre de 1 cm de paso de luz. No obstante, si se desean ganar sensibilidad se puede aumentar la longitud del paso óptico. En el caso de absorción infrarroja las cubetas normalmente son de 1 mm de paso de luz y de cloruro de sodio pulimentado. Las celdas han de ser estrechas para poder medir la transmisión de intensidades medibles de radiación infrarroja. Sistemas detectores Generalmente los detectores también son transductores, es decir, convierten la radiación electromagnética que atraviesa la muestra en una corriente o voltaje que se mide después de ser amplificado en el circuito electrónico de lectura. Para el ultravioleta, el visible y el infrarrojo cercano se utilizan los fototubos de vacío, que contienen un cátodo sensible a la radiación. El fototubo basa su funcionamiento en el efecto fotoeléctrico, es decir, detecta los electrones que emiten determinados materiales cuando reciben el impacto de fotones de determinadas frecuencias (Figura 4.9). Los electrones emitidos por el material que recubre el cá-

Cátodo

Fotón (UV-VIS) Ánodo

Electrón emitido

Sistema de amplificación y medida de diferencia de potencial

FIGURA 4.9. Fototubo empleado en la detección de luz UV-VIS.

80

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

todo son recogidos por el ánodo, generándose así una diferencia de potencial proporcional a la cantidad de fotones que inciden sobre el cátodo. Esta diferencia de potencial es amplificada, cuantificada y registrada. Los fotomultiplicadores son una combinación de un fototubo y una cadena interna multiplicadora de electrones. La radiación incidente expulsa electrones del cátodo. Estos electrones son enfocados por un campo electrostático y acelerados hacia un electrodo cubierto con un compuesto que expulsa varios electrones como resultado del impacto de un electrón de alta energía. Repitiendo este proceso varias veces, se produce la amplificación de la corriente interna para finalmente llegar al ánodo. Los fotodiodos funcionan según un principio completamente diferente al de los detectores anteriores. Este consiste en una unión semiconductora, la cual posee una polarización inversa, de modo que en estado de reposo no existe un flujo de corriente. Cuando un fotón impacta con el diodo, los electrones llegan hasta la banda de conducción, donde pueden actuar como portadores de carga. De esta manera, la corriente generada es proporcional a la potencia radiante incidente. Todos los componentes comentados en este apartado pueden ensamblarse de diversas maneras dependiendo de varios factores. No obstante, las dos configuraciones más empleadas son las de espectrofotómetros de haz sencillo o espectrofotómetros de doble haz. La Figura 4.10 muestra ambas configuraciones. Instrumentos con configuración óptica de un solo haz Los instrumentos de simple haz son aquellos en los que el haz de luz sigue una única trayectoria entre la fuente y el detector (Figura 4.10A). La banda de luz atraviesa la muestra que se halla contenida en una celda y la luz transmitida por la muestra pasa al detector, originándose una corriente eléctrica que por medio de diferentes circuitos permite observar una señal, ya sea el movimiento de una aguja o señal digital o un registro gráfico. El sistema puede tener una o dos celdas. En el caso de que solo disponga de una celda, en primer lugar se realiza la medición con la muestra blanco y, seguidamente, con muestra problema. Si el equipo dispone de dos celdas (como en la Figura 4.10A), se colocan en el aparato ambas muestras (blanco y problema) y un sistema mecánico desplaza las cubetas alternativamente para colocarlas delante del haz de luz incidente y así poder realizar las mediciones. Instrumentos de doble haz En los instrumentos de doble haz, la luz proveniente de la fuente es dividida en dos haces mediante un sistema de espejos divisores después de salir del monocromador (Figura 4.10B). Esta división produce dos haces de luz, uno de ellos se dirige a la

Técnicas espectroscópicas

celda de muestra blanco

81

fotodetector amplificador

monocromador

A:

•• •• ••

fuente celda de muestra problema

sistema de lectura

espejo sistema de lectura

celda de muestra blanco espejo fotodetector 1

monocromador

B:

amplificador

espejo

fuente fotodetector 2

espejo

celda de muestra problema

FIGURA 4.10. Diseño de espectrofotómetros de haz sencillo (A) y de doble haz (B).

celda de referencia, que contiene el blanco, y el otro haz se dirige hacia la celda de muestra. Los dos haces de luz, después de atravesar la celda de referencia y la de muestra, llegan a detectores separados para obtener la señal correspondiente. Los sistemas de doble haz tienen la ventaja de que cualquier variación en la intensidad de la fuente, la eficiencia de la red, la reflectividad de los espejos, la fotosensibilidad del detector, etc., afecta simultáneamente a los dos haces. En consecuencia, la relación de energía de los dos haces permanece siempre constante. Encontrará un espectrofotómetro virtual de haz sencillo en: http://www.chm.davidson.edu/java/spec/spec.html (Página activa en julio de 2004)

4.5. ESPECIES MOLECULARES QUE ABSORBEN RADIACIÓN VISIBLE Y ULTRAVIOLETA Los grupos funcionales orgánicos que absorben radiación en la región ultravioleta y visible se denominan cromóforos. Los denominados espectros de absorción son re-

82

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

presentaciones de la absorción o absorptividad molar en función de la longitud de onda. Estos espectros son relativamente específicos de cada especie química. No obstante, los datos de posición e intensidad de los picos de absorción pueden servir únicamente como orientación en la identificación de compuestos, ya que pueden verse influidos por el disolvente, así como por ciertos detalles estructurales de la molécula. Además, la conjugación entre dos o más cromóforos tiende a ocasionar cambios en los máximos de absorción.

Los espectros de ultravioleta-visible nunca deben ser considerados como único criterio de identificación de una molécula.

4.5.1. Absorción por compuestos orgánicos La λ a la que absorbe una molécula depende de la fuerza con que están unidos sus electrones. Así, los enlaces sencillos (C-C o C-H) solo absorben a λ < 180 nm debido a que los electrones están muy firmemente unidos a los enlaces y necesitan radiación muy energética. Ello implica que apenas sean utilizados con finalidad analítica, ya que a estas longitudes de onda también absorben los componentes del aire. Sin embargo, los enlaces múltiples y especialmente los anillos aromáticos presentan picos útiles a λ > 180 nm, ya que los electrones implicados en la excitación no están tan firmemente unidos al enlace como en el caso anterior. Los electrones no compartidos en heteroátomos como el azufre, bromo, cloro, etc. están menos fuertemente retenidos que los electrones compartidos de los enlaces CC y C-H y también presentan picos útiles de absorción ultravioleta. La Tabla 4.2 muestra los cromóforos más comunes y las longitudes de onda aproximadas a las que absorben. La Figura 4.11A muestra el espectro de absorción ultravioleta-visible de algunos compuestos orgánicos.

Encontrará una animación sobre la transmitancia de los disolventes en: http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/17143/lecciones/cap08/animacion6.htm (Página activa en julio de 2004.)

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

83

TABLA 4.2. Características de absorción de algunos de los cromóforos orgánicos más comunes Cromóforo

Ejemplo

Disolvente

λmax nm

Alqueno

C6H13CH=CH2

n-heptano

177

Alqueno conjugado

CH2=CHCH=CH2

n-heptano

217

Alquino

C5H11C≡CH3

n-heptano

178 196 225

Carboxilo

CH3COH

Etanol

204

Amido

CH3CNH2

Agua

214

Azo

CH3N=NCH3

Etanol

339

Nitro

CH3NO2

Isooctano

300

Nitroso

C4H9NO

Éter etílico

300 665

Nitrato

C2H5ONO2

Dioxano

270

Aromático

Benceno

n-hexano

204 256

4.5.2. Absorción por especies inorgánicas Los iones y complejos de los elementos de las dos primeras series de transición absorben radiación visible en al menos uno de sus estados de oxidación, produciendo espectros con anchas bandas. La absorción implica transiciones entre orbitales d ocupados y libres. Las diferencias de energía entre estos orbitales (y, por lo tanto, la posición del pico de absorción correspondiente) dependen de la posición del elemento en la tabla periódica, de su estado de oxidación y de la naturaleza del ligando al que está unido. La Figura 4.11B muestra espectros de absorción visible de algunos metales de transición. La Figura 4.11C muestra los espectros de absorción para los iones de metales pertenecientes a los lantánidos y actínidos. Se puede observar que difieren notablemente de los espectros de la Figura 4.11B, ya que los picos son mucho más estrechos. La explicación de estas diferencias está en que los electrones responsables de la absorción se hallan protegidos de influencias externas por otros orbitales. En consecuen-

84

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

cia, las bandas tienden a ser estrechas y relativamente poco afectadas por los ligandos unidos a ellos. Los denominados complejos de transferencia de carga se forman cuando en la misma molécula se enlazan un grupo donador de electrones con un grupo receptor de electrones. Cuando este compuesto absorbe radiación, uno de los electrones del donador se transfiere a un orbital íntimamente asociado con el receptor. El estado excitado es, por tanto, el producto de un proceso de oxidación-reducción interno. La absorción de los complejos de transferencia de carga es muy importante en procesos cuantitativos, ya que estos complejos tienen una alta absorptividad molar y por tanto los métodos que los emplean son muy sensibles. Algunos ejemplos de complejos de transferencia de carga son el complejo fenólico de hierro (III), el complejo de 1,10-fenantrolina con hierro (II), el complejo ferrocianuro de hierro (III) (azul de Prusia) o el ion triyoduro (I3–). En la mayoría de los complejos de transferencia de carga que implican un ion metálico, el metal sirve de receptor de electrones. La Figura 4.11D muestra espectros de absorción visible de complejos de transferencia de carga. C

1.00

ACETONA

0.75 0.50 0.25 0.00

250

275

300

ABSORBANCIA

ABSORBANCIA

A

325

1.00

Co2+

0.75 0.50 0.25 0.00 350

400

CAROTENO

0.75 0.50 0.25 0.00 450 500 550 LONGITUD DE ONDA (nm)

ABSORBANCIA

ABSORBANCIA

1.00

400

450

500

0.50 0.25 600

650

700

ABSORBANCIA

ABSORBANCIA

Pr

550

0.50 0.25 0.00 450 500 550 LONGITUD DE ONDA (nm)

0.75 0.50 0.25 0.00

750

450

Ho

0.75 0.50 0.25 450

500

550

600

LONGITUD DE ONDA (nm)

650

700

ABSORBANCIA

ABSORBANCIA

1.00

400

600

1.00 Almidón

LONGITUD DE ONDA (nm)

0.00

750

Ni2+

400

0.75

500

700

D

1.00

450

650

0.75

600

3+

400

600

1.00

B

0.00

550

LONGITUD DE ONDA (nm)

LONGITUD DE ONDA (nm)

500 550 600 LONGITUD DE ONDA (nm)

1.00

650

700

Complejo hierro-fenantrolina

0.75 0.50 0.25 0.00 450

500

550

600

650

700

LONGITUD DE ONDA (nm)

FIGURA 4.11. Espectros de absorción de: varios compuestos orgánicos (A); disoluciones acuosas de lantánidos (B); disoluciones acuosas de metales de transición (C) y compuestos de transferencia de carga (D).

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

85

4.6. TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA Y LEY DE LAMBERT-BEER Imaginemos un dispositivo experimental como el de la anterior Figura 4.6. Disponemos de una fuente emisora de radiación electromagnética (lámpara), unos sistemas de enfoque (rendijas) para hacer que la radiación incida perpendicularmente en la muestra, un dispositivo que permite seleccionar la longitud de onda que incide sobre la muestra (red de difracción) y un sistema electrónico de medida de intensidad de luz. Imaginemos también que hacemos dos medidas de la intensidad de luz: 1) En la primera medida, la muestra será una disolución con la misma matriz que el analito que deseemos determinar pero en ausencia de este (disolución blanco). La intensidad de radiación (luz) que llega al lector será Io. 2) La segunda medida se hará en presencia del analito (cromóforo) que deseemos estudiar. En este caso la intensidad de luz que llega al lector será I. Como trabajamos con analitos que absorben radiación a la longitud de onda que selecciona la red de difracción, lógicamente, I < Io. Existen dos maneras de expresar la relación entre I e Io. La relación directa se denomina transmitancia (T), mientras que se denomina absorbancia al logaritmo con signo cambiado de la transmitancia. La absorbancia es un término actualmente mucho más utilizado que la transmitancia. La expresión matemática de ambos parámetros es: TRANSMITANCIA (T) I T=— I0

ABSORBANCIA A = –log T

Puede encontrar una animación sobre el principio de transmitancia en: http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/17143/lecciones/cap05/animacion3.htm (Página activa en julio de 2004.)

La ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia está directamente relacionada con las propiedades intrínsecas del analito, con su concentración y con la longitud de la trayectoria del haz de radiación al atravesar la muestra. La expresión matemática de la ley de Lambert-Beer es: A=C·ε·L

86

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

donde: A = Absorbancia de la muestra. C = Concentración del cromóforo. L = Longitud del paso óptico que contiene la muestra. ε = Absorptividad molar. Depende del cromóforo en si mismo, de la λ y de las condiciones de medida (pH, T,...). Puesto que la absorbancia es adimensional, sus unidades son: concentración–1 longitud–1. Ejemplos de la aplicación de Lambert-Beer 1) Una disolución 100 μM de un determinado cromóforo tuvo una transmitancia a 525 nm de 0.5 cuando se midió en una celda de 1.5 cm de longitud. Calcular: a) la absorbancia de la disolución; b) la absorptividad molar del cromóforo. a) A= –log T = –log 0.5 = 0.301 b) A = C · ε · L. Reordenando la ecuación obtendremos: ε = A/(C × L) = 0.301/(10–4 M × 1.5 cm) = 2 × 103 M–1 cm–1 2) Una disolución patrón de níquel 5.00 × 10-5 M se coloca en una cubeta de longitud de paso 1 cm. La absorbancia a 592 nm es 0.446: a) ¿Cuánto vale la absorptividad molar a 592 nm? b) Si una disolución problema de níquel tiene una absorbancia de 0.125 a la misma λ ¿cuál es la concentración de níquel en la muestra? a) Dado que A = C · ε · L. Entonces 0.446 = 5 × 10-5 M × 1 cm × ε y deducimos ε = 8920 M–1 cm–1. b) Aplicando que A = C · ε · L. Así pues, 0.125 = 8920 M–1 cm–1 × 1 cm × C; y por lo tanto C= 14 μM.

¿Cómo se selecciona la longitud de onda en un análisis colorimétrico? Para determinar la longitud de onda más apropiada para estudiar un cromóforo se deberá realizar un espectro de absorción del mismo y seleccionar aquella longitud de onda donde la absorbancia sea mayor.

La radiación que se utilice en un análisis colorimétrico deberá ser por lo general del color complementario al del analito. La Tabla 4.1 muestra los colores del espectro de radiación visible con sus colores complementarios y sus respectivas longitudes de onda.

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

87

Si no disponemos del equipo necesario para realizar este espectro, se puede determinar de manera aproximada la longitud de onda apropiada para el análisis. Imaginemos que nuestro analito proporciona un color rojo a la disolución. Una disolución es roja no porque el analito añada radiación roja al disolvente, sino porque absorbe el color verde de la radiación blanca que le llega. Ello implica que la longitud de onda apropiada para determinar la absorbancia de una disolución roja será la zona del color verde.

4.7. ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética y, al relajarse al estado basal, liberan el exceso de energía en forma de fotones.

La fluorescencia es un proceso de emisión, no de absorción.

Las dos principales ventajas de los métodos de fluorescencia sobre los de absorción son: 1) Una sensibilidad entre 1 y 3 órdenes de magnitud mayor, y 2) Mayor intervalo de respuesta lineal. No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican menos que los de absorción, ya que no todos los sistemas químicos son capaces de fluorescer y, además, el equipamiento necesario es mucho más costoso que el de la espectroscopía de absorción.

4.7.1. Teoría de la fluorescencia La Figura 4.12 muestra un diagrama de energía parcial para una especie molecular hipotética. Se presentan un nivel electrónico basal (E0) y dos excitados (E1 y E2). Cada uno de estos estados electrónicos muestra 4 niveles vibracionales. Cuando la molécula se irradia con ondas electromagnéticas cuya energía coincide con las diferencias de energía entre los diferentes niveles, se producen las transiciones electrónicas que se muestran en la Figura 4.12A. La relajación molecular, señalada por las flechas cortas entre niveles de energía vibracionales, tiene lugar durante las colisiones entre moléculas excitadas y las moléculas del disolvente (Figura 4.12B). También puede ocurrir el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior de un estado excitado y el nivel vibracional superior de otro estado electrónico. Este tipo de relajación se produce por una conversión interna, como se ilustra en la Figura 4.12B. La fluorescencia es otro proceso de relajación que se muestra en la Figura 4.12C. La radiación fluorescente se emite cuando las moléculas electrónicamente excitadas se relajan a cualquiera de los estados vibracionales del estado electrónico basal.

88

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

a) absorción molecular

E2

b) relación no radiante 4 4 3 3 2 2 1 1 0 E2 0 E2 relación

E1

4 3 2 1 0 E1

E0

4 3 2 1 0 E0

c) fluorescencia 4 3 2 1 0

ENERGÍA

vibracional

Conversión interna

4 3 2 1 0 E1

4 3 2 1 0

4 3 2 1 0 E0

4 3 2 1 0

FIGURA 4.12. Diagrama de los niveles de energía. Se muestran parte de los cambios que ocurren durante la absorción (A), relajación no radiante (B) y fluorescencia (C).

4.7.2. Especies fluorescentes La fluorescencia es uno de los mecanismos mediante los cuales una molécula regresa a su estado basal después de haber sido excitada por absorción de radiación. Por lo tanto, a priori cualquier molécula capaz de absorber radiación electromagnética sería capaz de fluorescer. No obstante, la mayoría de las moléculas no fluorescen porque disponen de vías no radiantes. El rendimiento cuántico (φ) es la proporción del número de moléculas excitadas que fluorescen en relación con el número total de moléculas excitadas.

Fluorescencia y estructura La mayoría de los compuestos que contienen anillos aromáticos proporcionan emisión fluorescente. Ciertos compuestos carbonílicos alifáticos y alicíclicos y estructuras de dobles enlaces también lo hacen. Sin embargo, su número es pequeño en comparación con el número de compuestos fluorescentes que contienen anillos aromáticos. La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos fluorescen con un φ creciente con el número de anillos y con su grado de condensación. Los anillos heterocíclicos más sencillos (piridina, furano, pirrol,...) no fluorescen (Figura 4.13), pero las estructuras de anillos fusionados con más de dos anillos (quinolina, isoquinolina, indol) lo hacen con frecuencia (Figura 4.14).

Técnicas espectroscópicas

N

O

piridina S

furano H N

tiofeno

pirrol

•• •• ••

89

FIGURA 4.13. Moléculas aromáticas que NO fluorescen. N

N

quinolina

indol

FIGURA 4.14. Moléculas aromáticas que fluorescen.

Efecto de la rigidez estructural La fluorescencia está favorecida por moléculas rígidas. Así, por ejemplo, el φ del bifenilo es aproximadamente 0.2, en tanto que el del fluoreno es 1 (Figura 4.15). La diferencia puede ser el resultado de la rigidez que le otorga al bifenilo el puente formado por el metileno. Esta rigidez reduce las posibilidades de relajación por vías vibracionales y permite que se produzca la emisión fluorescente.

bifenilo (ø = 0 · 2)

C H2 fluoreno (ø = 1)

FIGURA 4.15. Efecto de la rigidez sobre el rendimiento cuántico.

Efecto de la temperatura y los disolventes En la mayoría de las moléculas el φ disminuye con el aumento de la temperatura. Ello es debido a que a temperaturas elevadas se aumenta la frecuencia de las coli-

90

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

siones entre moléculas de analito y disolvente, aumentándose también la posibilidad de que se den relajaciones no radiantes. Una disminución en la viscosidad del disolvente conduce al mismo resultado.

4.7.3. Equipos de medida de fluorescencia Un fluorímetro (Figura 4.16) consta de una fuente de luz y de un sistema de selección de longitud de onda de excitación. Cuando la muestra es excitada con una radiación de energía apropiada, emite radiación en todas las direcciones del espacio. No obstante la luz emitida se detecta mejor en ángulo recto con respecto al haz de excitación, ya que se evitan problemas de dispersión de la luz y también el haz de luz excitante que es de mucha mayor intensidad que el haz de luz emitida. La luz emitida es recogida seleccionando una longitud de onda apropiada y conducida a un detector donde queda registrada por sistemas similares a los de un espectrofotómetro de absorción.

fuente de luz

Selector de longitud de onda de entrada

(E0)

muestra

(E0) luz emitida

(E0) > (E1)

Selector de longitud de onda de salida (E1) (E1)

registrador

detector

FIGURA 4.16. Diseño experimental de un equipo de medida de fluorescencia.

4.7.4. Efecto de la concentración de analito sobre la intensidad de la fluorescencia La energía de radiación fluorescente F es proporcional a la energía radiante del haz de excitación: F=K·C

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

91

Donde C es la concentración de la especie fluorescente y K una constante de proporcionalidad que engloba la potencia de la fuente, la eficiencia del proceso de luminiscencia (φ), la longitud del paso óptico y la geometría del aparato.

4.7.5. Aplicaciones de los métodos de fluorescencia Métodos para especies inorgánicas Las moléculas inorgánicas no fluorescen, por lo tanto deben reaccionar con otras moléculas para formar estructuras que sí lo hagan. Para ello existen dos tipos de métodos: a) Los métodos directos se basan en la reacción del analito con un agente quelante para formar un complejo fluorescente. b) Los métodos indirectos dependen de la disminución o apagamiento (quenching) de la fluorescencia de un reactivo como resultado de la reacción con el analito. El apagamiento se utiliza básicamente para la determinación de iones. Los mejores reactivos para la determinación de cationes son los compuestos aromáticos con dos o más grupos funcionales, que permiten la formación del quelato con el ion metálico. La Tabla 4.3 muestra algunos reactivos fluorométricos típicos y sus aplicaciones. TABLA 4.3. Métodos fluorométricos seleccionados para especies inorgánicas Longitud de onda (nm) Reactivo

Absorción

Fluorescencia

Sensibilidad (μg/mL)

Al3+

Alizarina granate R

470

500

0.007

Be, Co, Cr, Cu, F–, NO3–, Ni, PO43–, Th, Zr

F–

Complejo Al de alizarina granate R

470

500

0.001

Be, Co, Cr, Cu, Fe, Ni, PO43–, Th, Zr

B4O72

Benzoína

370

450

0.04

Be, Sb

Cd2+

2-(o-hidroxifenil)benzoxazol

365

Azul

2

NH3

Li+

8-hidroxiquinolina

370

580

0.2

Mg

Sn4+

Flavonol

400

470

0.1

F–, PO43–, Zr

Ion

Interferencia

92

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Métodos para especies orgánicas y bioquímicas Entre los compuestos orgánicos que pueden ser determinados por técnicas de fluorescencia destacaríamos: adenina, ácido antranílico, hidrocarburos policíclicos aromáticos, cisteína, guanidina, indol, naftoles, proteínas, ácido salicílico, triptófano, ácido úrico, adrenalina, alquilmorfina, cloroquina, LSD, penicilina, fenobarbital, procaína y reserpina, clorofila, diversos alcaloides, varios flavonoides, etc. La aplicación más importante de la fluorimetría está en el análisis de productos alimenticios, farmacéuticos, muestras clínicas y productos naturales.

4.8. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJOS Como se comentó anteriormente, prácticamente todas las especies moleculares absorben radiación infrarroja. Dado que el espectro de infrarrojo proporciona una huella digital única (sólo los isómeros ópticos tienen espectros idénticos), la espectroscopía infrarroja es, junto a la espectrometría de masas, una poderosa herramienta para determinar estructuras químicas. Las aplicaciones cuantitativas de la espectroscopía de absorción infrarroja son menores que las de las de absorción visible y ultravioleta, debido a que las absorptividades molares son mucho menores y a las dificultades instrumentales para conseguir medidas de transmitancia precisas y reproducibles.

4.8.1. Frecuencias vibracionales Cada enlace químico actúa como un muelle que conecta dos átomos con masas M1 y M2. El muelle sigue la ley de Hooke: Fuerza = –k Δ X donde k es una constante y Δ X es la distancia recorrida desde la posición de equilibrio. Las masas vibran con una frecuencia que depende de ellas y de la fortaleza del muelle: ν = (k/μ)1/2/(2 π) donde ν es la frecuencia natural de vibración de las masas; k es la constante de fuerza del «muelle» del enlace químico y μ es la masa reducida (μ = (M1 · M2)/(M1 + M2)). De esta ecuación se puede deducir que: a) Cuanto más fuertes son los enlaces químicos, más altas son las frecuencias observadas.

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

93

b) Las masas atómicas menores tienden a originar frecuencias observadas mayores. Modos normales vibracionales Las vibraciones que provienen de movimientos simultáneos de más de dos átomos se denominan modos normales de vibración y dependen únicamente de los átomos y de la fortaleza de sus enlaces. Además, los átomos y grupos de átomos cercanos también influyen en las frecuencias de los modos normales. La Figura 4.17 muestra los modos normales de vibración de una molécula sencilla con dos átomos idénticos y un tercer átomo diferente de los anteriores (por ejemplo el CO2). modo simétrico de tensión

modo asimétrico de tensión

modo de flexión

+

+

modo de flexión –

FIGURA 4.17. Modos normales de vibración. El signo + indica movimiento desde la página hacia el lector y el signo – que el átomo permanece en el plano de la página.

4.8.2. Espectros de infrarrojo y especies que absorben radiación infrarroja Los espectros de infrarrojo son representaciones de porcentaje de transmitancia frente a número de ondas (Figura 4.18). La longitud de onda a la cual la energía se absorbe depende de: a) La identidad de los átomos en la molécula. b) La estructura molecular (no tienen el mismo espectro CH 3CHO que CH2=CHOH). c) El enlace de los átomos (H2C=O es diferente de H3C–O–H).

94

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Los espectros IR permiten asociar bandas individuales a grupos químicos específicos (carbonilo, cloro,...). La Tabla 4.4 muestra las características vibracionales de algunos grupos orgánicos clásicos. TABLA 4.4. Número de ondas de vibraciones moleculares de diferentes estructuras químicas

Enlace

Tipo de vibración

Número de ondas (cm–1)

Intensidad*

C–H

Alcanos –CH3 –CH2– Alquenos

(tensión) (flexión) (flexión) (tensión) (fuera del plano de flexión) Aromáticos (tensión) (fuera del plano de flexión) Alquino (tensión) Aldehidos

3000-2850 1450 y 1375 1465 3100-3000 1000-650 3150-3050 900-690 3300 2900-2800

f m m m f f f f d

C=C

Alqueno Aromático

1680-1600 1600 y 1475

m-d m-d

C≡C

Alquino

2250-2100

m-d

C=C

Aldeino Cetona Ácido carboxílico Éter Amida Anhídridos

1740-1720 1725-1705 1725-1700 1750-1730 1670-1640 1810 y 1760

f f f f f f

C–C

Alcoholes, éteres, esteres, anhidridos

1300-1000

f

N–H

Aminas y amidas primarias y secundarias

3500-3600 1640-1550

m m-f

C–N

Aminas

1350-1000

m-f

C≡N

Nitrilos

2260-2240

m

N=O

Nitro (R–NO2)

1550 y 1350

f

S=O

Sulfóxidos Sulfonas Sulfatos

1050 1375-1300 1200-1340

f f f

C–X

Fluoruros Cloruro Bromuro, yoduro

1400-1000 800-600 < 667

f f f

* f = fuerte; m = media, y d = débil.

(tensión) (flexión)

Técnicas espectroscópicas

•• •• ••

95

Con la excepción de algunas especies homonucleares (O2, N2, Cl2, etc.) casi todas las moléculas orgánicas e inorgánicas absorben radiación infrarroja. Este es uno de los motivos por los que la espectroscopía de absorción infrarroja es una de las técnicas analíticas más utilizadas. Como quedó dicho anteriormente, la absorción infrarroja implica transiciones entre niveles de energía vibracional asociados al estado energético fundamental de la molécula. El número de posibles vibraciones depende del número de enlaces que contiene. El número de modos de vibración posibles de una molécula es grande, aun cuando la molécula sea simple. Así, una molécula como el n-butanal tiene 33 modos diferentes de vibración. No todos estos modos de vibración producen picos en el infrarrojo. No obstante, como se muestra en la Figura 4.18, los espectros de IR son complejos y su interpretación requiere un cierto grado de adiestramiento.

% TRANSMITANCIA

La absorción infrarroja no ocurre solo con moléculas orgánicas, sino también con compuestos inorgánicos sencillos como CO2, CO, H2S, NO2, SO2, etc., así como con distintos tipos de complejos metálicos unidos covalentemente. 100

CH3 CH2 CH2 CHO

75 50 2

25 1

4

3

0 2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

LONGITUD DE ONDA (μm)

FIGURA 4.18. Espectro infrarrojo de n-butanal. Obsérvese que al contrario que en la figura 4.7 en el eje de ordenadas se representa transmitancia en lugar de absorbancia. Modos de vibración: (1) Alargamiento C–H grupo metilo; (2) Alargamiento C–H aldehído; (3) Alargamiento C=0; (4) Flexión C–H aldehído.

4.8.3. Información cualitativa de los espectros de infrarrojo Los espectros de infrarrojo se pueden utilizar para identificar componentes de muestras comparando los espectros de una sustancia desconocida con espectros de estructuras conocidas. Los espectros de infrarrojo de compuestos orgánicos se pueden dividir en: a) La región de grupos funcionales. Indica la presencia de grupos funcionales orgánicos específicos. Comprende la zona entre 4000 y1300 cm–1 (2.5 y 8 μm). b) La región de huellas características. Contiene picos que aparecen por modos normales complicados que conllevan movimientos de flexión y no son fácilmente

96

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

asignables. Representan la «huella dactilar de cada compuesto». Comprende la zona entre 1300 y 910 cm–1 (8 y 11 μm). c) La región de aromáticos. Comprende la zona entre 910 y 650 cm–1 (11 y 15 μm). No indica automáticamente la presencia de grupos aromáticos, ya que en esta región también aparecen las bandas de los enlaces carbono-halógeno. d) La región entre 650 cm–1 y 200 cm–1 (15 y 50 μm). Las vibraciones ayudan a la identificación de enlaces inorgánicos y organometálicos y también a la de los enlaces entre metales e iones metálicos.

5

Espectroscopía atómica

CONTENIDO 5.1. Espectros de absorción y emisión atómica 5.2. Metodología de la espectroscopía de absorción atómica 5.2.1. Estructura básica de un equipo de absorción atómica 5.2.2. Nebulizadores 5.2.3. Atomizadores 5.2.4. Fuentes de radiación 5.2.5. Modulación de las fuentes de radiación 5.3. Técnicas especiales de absorción atómica 5.3.1. Determinación de mercurio por espectrometría de absorción atómica de vapor frío 5.3.2. Espectroscopía de absorción atómica con cámara de hidruros 5.4. Metodología de emisión atómica 5.4.1. Posibilidades y requerimientos de la técnica de emisión atómica 5.4.2. El plasma de acoplamiento inductivo (ICP) 5.4.3. El ICP óptico

5.1. ESPECTROS DE EMISIÓN Y ABSORCIÓN ATÓMICA La espectroscopía atómica se emplea en la determinación cualitativa y cuantitativa de unos 70 elementos. Los métodos de espectroscopía atómica se han generalizado porque suelen ser muy rápidos, selectivos y sensibles. La espectroscopía de absorción o emisión molecular se realiza habitualmente en disoluciones en que el disolvente es transparente a la longitud de onda de trabajo. Sin embargo, en las técnicas de espectroscopía atómica, la absorción o emisión de luz se aplica a átomos aislados, sin la complejidad de los enlaces moleculares. La determinación espectroscópica de especies atómicas solo se puede llevar a cabo dentro de un medio gaseoso, en el cual los átomos individuales están separados unos 97

98

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

de otros. Consecuentemente, el primer paso en los métodos espectroscópicos es la atomización, un proceso en el cual la muestra se volatiliza y descompone para producir un gas atómico. La eficacia y reproducibilidad del paso de atomización determina en gran parte la sensibilidad, precisión y exactitud del método. Los espectros de emisión y absorción atómica están constituidos por una serie de picos estrechos y bien definidos. Los espectros atómicos son más sencillos que los moleculares gracias a que no existen estados vibracionales ni rotacionales. La falta de estados vibracionales y rotacionales provoca que muchos elementos atómicos sean capaces de excitarse, absorbiendo la energía de radiación de solo una determinada longitud de onda, y de relajarse, emitiendo al medio radiación de esa misma longitud de onda. Como veremos más adelante, la construcción de lámparas de cátodo hueco, específicas de cada metal, se basa en esta propiedad. La Figura 5.1 representa un diagrama de los niveles de energía del sodio atómico. Al calentar el sodio a 2000-3000 °C, el calor promueve (excita) los electrones exteriores de los orbitales 3s (estado basal) a los orbitales 3p, 4p, 5p (estados excitados). Después de un pequeño lapso de tiempo de excitación los electrones vuelven a su estado basal y desprenden su energía como fotones, emitiendo radiación visible o ultravioleta. Las longitudes de onda de la radiación emitida son 590, 330 y 285 nm.

5p 4 4p

0

590 nm

285 nm

1

3p 330 nm

2

Energía térmica o eléctrica

Energía, eV

3

3s

FIGURA 5.1. Líneas de emisión del sodio.

La Figura 5.2A muestra tres picos de absorción del vapor de sodio. La absorción de la radiación de 285, 330 y 590 nm excita al electrón del nivel basal 3s al estado excitado de los orbitales 3p, 4p y 5s respectivamente. Después de microsegundos, los átomos excitados se relajan a su estado basal, transfiriendo su exceso de energía a otros átomos o moléculas del medio. El origen de estos picos está indicado en el dia-

Espectroscopía atómica

•• •• ••

99

5p 4

3

2

300

400

500

Longitud de onda (nm)

600

590 nm

200

330 nm

1

3p

285 nm

Energía, eV

Absorbancia

4p

3s

0

(A)

(B)

FIGURA 5.2. Espectro de absorción parcial del vapor de sodio (A) transiciones electrónicas responsables de las bandas (B).

grama de energía que muestra la Figura 5.2B. Para los elementos que tienen varios electrones exteriores que pueden ser excitados, los espectros de absorción pueden ser mucho más complejos y contar con centenares de picos.

5.2. METODOLOGÍA DE LA ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA 5.2.1. Estructura básica de un equipo de absorción atómica La espectroscopía de absorción atómica es intrínsecamente un método de determinación unielemental. El elemento que se determina depende de la fuente de luz que se utilice, la cual es específica de cada elemento. Las longitudes de onda más utilizadas para la determinación de cada elemento se muestran en la Figura 5.3. La precisión de las medidas de absorción atómica depende menos de la temperatura de atomización que de las técnicas de emisión. La espectroscopía de absorción atómica responde a la Ley de Lambert-Beer y, por lo tanto, los cálculos a aplicar para determinaciones cuantitativas seguirán los mismos procedimientos que con las técnicas de absorción molecular. La Figura 5.4 muestra un esquema de un espectrómetro de absorción atómica con atomización de llama, que es la configuración más clásica de un equipo de absorción atómica (Tabla 5.1). Consta de una bomba peristáltica para introducir la mues-

100

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

H

He

671 Li 671 589 Na 589 767 K 767 780 Rb 780 852 Cs 456

235 Be 235 285 Mg 285 423 Ca 423 461 Sr 461 554 Ba 554

391 Sc 402 410 Y 597 550 La 442

Fr

Ra

Ac

364 Ti 400 361 Zr 361 307 Hf 531

Ce

Th

318 V 438 406 Nb 406 272 Ta 474

358 Cr 425 313 Mo 390 401 W 401

280 248 241 Mn Fe Co 403 372 345 350 344 Tc Ru Rh 373 344 346 306 285 Re Os Ir 346 442 550

232 Ni 353 275 Pd 364 266 Pt 266

325 Cu 325 328 Ag 328 243 Au 268

214 Zn 481 229 Cd 326 254 Hg 254

250 B 518 396 Al 396 287 Ga 417 304 In 451 277 Tl 535

C 252 Si 252 265 Ge 265 225 Sn 284 217 Pb 406

N

O

F

Ne

P

S

Cl

Ar

Br

Kr

I

Xe

At

Rn

194 As Se 194 218 214 Sb Te 253 238 223 Po Bi 223

496 463 430 459 368 433 421 410 401 372 399 331 Pr Nd Pm Sm Eu Gd Tb Dy Ho Er Tm Yb Lu 496 493 476 467 622 534 405 410 401 372 399 452 359 U Np Pu Am Cm Bk Cf Es Fm Md No Lw Pa 545

FIGURA 5.3. Tabla periódica con las principales longitudes de onda utilizadas en espectroscopía de emisión (número inferior) y absorción atómica (número superior). Los elementos en casillas sombreadas no pueden ser determinados por técnicas de espectroscopía atómica.

Llama Lámpara de cátodo hueco MONOCROMADOR Quemador de flujo laminar Nebulizador

Detector

Entrada de aire u oxidante Entrada de combustible Muestra

FIGURA 5.4. Espectrómetro de llama de absorción atómica.

Espectroscopía atómica

•• •• ••

101

TABLA 5.1. Técnicas de espectroscopía atómica más utilizadas Espectroscopía de absorción

Espectroscopía de emisión

De llama

De llama

Con cámara de gráfico

ICP-óptico simultáneo

Con cámara de hidruros

ICP-óptico secuencial

Por vapor frío

tra en un sistema de nebulización colocado antes del atomizador (una llama). Hay una fuente de radiación (generalmente una lámpara de cátodo hueco colocada en línea recta con la llama) que emite radiaciones de la longitud de onda apropiada para que sea absorbida por un elemento de la muestra que ha sido atomizado en la llama. El monocromador selecciona la radiación de la longitud de onda apropiada que llega al detector, encargado de cuantificar y registrar la intensidad de luz que recibe, comparándola con la intensidad emitida por la fuente y transformándola en absorbancia o transmitancia. El detector se acopla a un sistema informático de registro que además controlará el aparato. Los datos registrados comparados con la respuesta de patrones de concentración conocida permitirán cuantificar los elementos de la muestra. En los espectrómetros de absorción atómica también es necesario un sistema de modulación (no mostrado en Figura 5.4) que permita discriminar entre la radiación que procede de la fuente y la que procede de la llama. Hablaremos más delante de estos sistemas de modulación de luz. En algunos aparatos de absorción atómica el nebulizador es eliminado y la llama es sustituida por otros sistemas de atomización, como hornos (cámaras de grafito) o plasmas (Tabla 5.1). Los equipos de emisión atómica de plasma carecen de lámpara, ya que el mismo plasma actúa como fuente excitadora (Tabla 5.1). No obstante, la mayoría de equipos de absorción atómica permiten realizar medidas de emisión, si bien con una sensibilidad y reproducibilidad menor que los equipos de emisión atómica con plasma. Los detectores y monocromadores funcionan de manera similar a lo descrito para los espectrofotómetros de absorción molecular, por lo que no nos ocuparemos de ellos en este capítulo.

5.2.2. Nebulizadores Un nebulizador es un sistema que convierte la muestra líquida en una niebla o aerosol. Esta niebla entra a continuación en el quemador y, a medida que las finas go-

102

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

tas del aerosol se calientan, se van evaporando, dejando pequeñas partículas sólidas que se atomizan en la llama. La cantidad de muestra líquida y el tamaño de las gotas del aerosol que alimentan a la llama dependen de factores como el propio diseño del nebulizador, el caudal de gas y las propiedades del líquido (muestra). Así, para que un conjunto de medidas sea comparable, estas deben haber sido realizadas en nebulizadores de diseño idéntico con condiciones idénticas de nebulización. A continuación se describen los principales tipos de nebulizador (Tabla 5.2). TABLA 5.2. Diferentes tipos de nebulizadores utilizados en espectroscopía atómica de absorción De flujo concéntrico (neumático) Ultrasónico

Nebulizador de flujo concéntrico (neumático) Un mecanismo que nebulice muestras líquidas requiere un flujo rápido de gas para que interaccione con una corriente de líquido más lenta. El modelo más sencillo de nebulizador se denomina nebulizador de tubo concéntrico o neumático (Figura 5.5). La muestra líquida se succiona mediante un tubo capilar por una corriente de gas a alta presión que fluye alrededor de la punta del tubo. La elevada velocidad del gas descompone el líquido en finas gotitas (igual que un atomizador de un frasco de perfume o un pulverizador de pintura) que son introducidas en la llama. Según el modo de interacción entre el gas que provoca la nebulización y el flujo de muestra se habla de nebulizadores concéntricos o de flujo cruzado. Normalmente, el gas a presión que provoca la nebulización es el propio gas oxidante que se va a introducir en la llama. Algunos nebulizadores neumáticos incorporan la Tubo capilar

aerosol

Flujo de líquido

Flujo de gas a alta presión

FIGURA 5.5. Nebulizador de flujo concéntrico.

Espectroscopía atómica

•• •• ••

103

denominada bola de impacto (Figura 5.6A), contra la que chocan las gotas de aerosol tras la primera nebulización, reduciéndose así todavía más el tamaño de las gotas. Las de mayor tamaño son eliminadas por el drenaje y las de menor tamaño son arrastradas por la corriente de combustible gaseoso al interior del quemador.

Nebulizador ultrasónico El nebulizador ultrasónico (Figura 5.6B) es otra variante del primer tipo de nebulizador. Las gotas que salen del nebulizador neumático inicial chocan con una placa que vibra a frecuencias ultrasónicas y que rompe las gotas generando otras mucho más pequeñas.

(A)

Entrada de gas oxidante Entrada de combustible

Entrada de muestra

(B) A la llama

A la llama

Vibrador ultrasónico

Drenaje Bola de impacto

Entrada de muestra

Entrada de gas a alto flujo

FIGURA 5.6. Nebulizador neumático con bola de impacto (A) y ultrasónico (B).

5.2.3. Atomizadores El atomizador es el sistema encargado de vaporizar la muestra. Los atomizadores más utilizados en espectroscopía de absorción son las llamas y los electrotérmicos (Tabla 5.3). Aunque las llamas y los plasmas pueden ser utilizados indistintamente en técnicas de emisión y de absorción, sin embargo las llamas se utilizan casi exclusivamente en modo de absorción, mientras que los plasmas se utilizan básicamente en técnicas de emisión.

104

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

TABLA 5.3. Diferentes tipos de atomizador utilizados en espectroscopía atómica de absorción Llamas Electrotérmicos Plasmas

Atomizadores de llama Cuando una muestra nebulizada entra en una llama, el disolvente se evapora en la zona de combustión primaria (Figura 5.7), localizada justamente debajo de la punta del quemador. Las partículas sólidas resultantes de la evaporación del disolvente pasan a la denominada región interzonal (Figura 5.7), que es la parte más caliente de la llama y se localiza en su parte central. En esta región se produce la evaporación de los elementos y su excitación en el caso de la espectroscopía de emisión atómica. Finalmente, los átomos vaporizados pasan al borde exterior de la llama o zona de combustión secundaria (Figura 5.7), donde algunos elementos se oxidan antes de pasar a la atmósfera. Las temperaturas que alcanzan las llamas dependen de las proporciones de la mezcla combustible y oxidante (Tabla 5.4). Ello implica que las etapas de evaporación, vaporización, disociación / atomización y excitación se pueden producir a diferentes distancias de la base de la llama y en diferentes zonas, dependiendo del elemento en sí y del tipo de llama. Zona de combustión secundaria

Región interzonal Zona de combustión primaria

Mezcla (combustible + oxidante)

FIGURA 5.7. Zonas de una llama.

Espectroscopía atómica

•• •• ••

105

TABLA 5.4. Llamas empleadas en espectroscopía atómica Combustible y oxidante

Temperatura (°C)

Gas natural-aire

1700-1900

Gas natural

2700-2800

H2-Aire

2000-2100

H2

2550-2700

*C2H2-aire

2100-2400

*C2H2

3050-3150

*C2H2-N2O

2600-2800

* Acetileno.

Se pueden obtener temperaturas de entre 1700 y 2400 °C con diversos combustibles cuando el aire es el que actúa como oxidante. A estas temperaturas, solo las especies que son excitadas con facilidad, como los metales alcalinos y alcalinotérreos, producen espectros de emisión utilizables. Para los metales pesados (que son excitados con menor facilidad) se debe emplear óxido nitroso como oxidante. Con combustibles comunes, estos oxidantes producen llamas con temperaturas que son de 2500 °C a 3100 °C. Las temperaturas elevadas aumentan la población total de átomos excitados, por lo que también se aumenta la sensibilidad de las técnicas de emisión atómica. Así, una llama de aire-acetileno produce una relación de átomos excitados / átomos totales de Mg de 10–8, aumentando esta relación hasta 10–6 con una llama de acetileno-óxido nitroso (que produce una temperatura unos 700 °C mayor). Estos datos dan una idea de la importancia del control de la temperatura en los métodos de emisión atómica. Los atomizadores de llama pueden emplearse tanto en técnicas de emisión como de absorción. Si bien son más eficaces en los métodos de absorción, ya que una llama no es capaz de excitar un gran número de átomos. Dado que la espectroscopía de absorción sigue la Ley de Lambert-Beer, una mayor longitud de paso óptico aumenta la sensibilidad. Ese es el motivo de que las llamas tengan una gran longitud. Los quemadores de ranura o flujo laminar (Figura 5.8) son los dispositivos empleados para obtener llamas con una gran trayectoria.

106

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Llama Cabeza del quemador

Combustible Oxidante

Muestra Nebulizador

Desagüe

FIGURA 5.8. Quemador de flujo laminar.

Atomizadores electrotérmicos (cámaras de grafito) Los hornos se utilizan principalmente para atomizar sólidos y lodos, aunque también son aplicables a disoluciones (Tablas 5.1 y 5.3). La Figura 5.9 muestra un horno de grafito. Suele consistir en un tubo cilíndrico de grafito abierto por los extremos y con un agujero central para la introducción de la muestra. El diámetro interno es algo inferior a 1 cm, mientras que su longitud es de aproximadamente 2 cm. El tubo de grafito se fija por los extremos a unos contactos eléctricos. Todo este conjunto se mantiene dentro de un recipiente metálico refrigerado por agua. El sistema contiene unos tubos para purgar los gases generados durante las primeras etapas del calentamiento. El tubo de grafito se calienta al hacer pasar una corriente eléctrica entre los contactos, de ahí que el método se llame también de atomización electrotérmica. Cada muestra requiere un calentamiento diferente. Por ejemplo, si la muestra es una disolución o un lodo, el primer paso es calentar hasta unos 100 °C para eliminar todo el disolvente. A continuación, se eleva la temperatura tan rápidamente como sea posible hasta la temperatura de atomización y la muestra se vaporiza en el camino óp-

Espectroscopía atómica

•• •• ••

107

Entrada de muestra

Radiación incidente

Al monocromador

Plataforma L'vov

FIGURA 5.9. Atomizador electrotérmico de cámara de grafito.

tico de la radiación. Es fundamental mantener el horno en una atmósfera inerte (como el argón) durante el calentamiento, para reducir al mínimo las reacciones químicas no deseadas con las partículas atomizadas de analito. Algunos hornos incluyen en su interior una plataforma de grafito denominada plataforma L`vov. La muestra se coloca en la plataforma en lugar de en la superficie del horno. La plataforma toca las paredes del horno por el canto inferior de este, de forma que el calor de sus paredes no calienta la muestra directamente. La muestra se calienta mediante el calor radiado, que tiende a producir un calentamiento más uniforme. Por tanto, lo primero que se calienta es las paredes del horno, luego se evapora la muestra, lo cual evita que condense en la superficie interior del horno. Plasmas Un plasma es un gas ionizado que puede operar como atomizador de alta temperatura (pueden alcanzarse 10000 K). Los plasmas se pueden utilizar para espectroscopía de absorción, aunque más comúnmente se utilizan con técnicas de emisión, por lo que se comentará detalladamente en la sección 5.4 de este capítulo.

5.2.4. Fuentes de radiación Las lámparas de cátodo hueco son las fuentes de radiación más utilizadas en espectroscopía de absorción atómica. Las lámparas de cátodo hueco (Figura 5.10) son

108

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Ánodo

Al atomizador

Cátodo

Ampolla llena de gas

FIGURA 5.10. Lámpara de cátodo hueco.

tubos de vidrio de pared gruesa con una ventana transparente en un extremo. En el otro extremo del hueco se encuentran dos alambres de volframio. Uno de ellos actúa como ánodo, mientras que al extremo del otro alambre está adherido un cilindro metálico hueco de unos 10-20 mm de diámetro. Este cilindro actúa como cátodo. La superficie externa del cilindro se recubre del metal que se desea determinar. El tubo se llena con helio o argón puro a 1-4 mm de Hg de presión. Cuando se aplica un potencial a través de los electrodos se produce la ionización del gas. Si el potencial es lo suficientemente grande, los cationes gaseosos adquieren bastante energía cinética para desalojar alguno de los átomos metálicos del cátodo y producir una nube atómica (Figura 5.11A); a este proceso se le llama chisporroteo. El bombardeo por el gas de los átomos desalojados del cátodo hace que una fracción de estos se excite (Figura 5.11B). Tras un breve periodo de tiempo, los átomos excitados vuelven a su estado fundamental emitiendo radiación de longitud de onda característica del elemento (Figura 5.11C). Al avanzar este proceso, los átomos metálicos difunden de nuevo hacia las paredes del cátodo o hacia las paredes de vidrio. La configuración cilíndrica tiende a concentrar la radiación en una zona muy limitada del tubo, lo que también aumenta la probabilidad de que los elementos se depositen de nuevo en la pared del cátodo. Como se observa en la Figura 5.3, algunos elementos presentan las mismas longitudes de onda de emisión y de absorción. Esto hace que la luz emitida por la relajación del átomo arrancado al cátodo y excitado por colisión con el gas (Figura 5.11 C) sea capaz de excitar los átomos presentes en la muestra del mismo elemento químico para el que está construida la lámpara. A

B Ar+

Ar+ Mo

C

Mo

M*

M* fotón Mo

FIGURA 5.11. Funcionamiento de una lámpara de cátodo hueco.

Espectroscopía atómica

•• •• ••

109

Se pueden obtener comercialmente lámparas de cátodo hueco para unos 70 elementos. Los cátodos de algunas de estas lámparas están formados por una mezcla de varios metales, lo que permite la determinación de más de un elemento con la misma lámpara. Los metales que pueden ser utilizados en lámparas de cátodo hueco multielemento son aquellos cuyas longitudes de onda de emisión y absorción están suficientemente bien separadas como para que no se produzcan interferencias espectrales. Algunos ejemplos de lámparas multielemento comerciales son: Ca-Mg, K-Na, Al-Ca-Mg, etc. Lámparas de descarga sin electrodo Producen intensidades de radiación entre uno y dos órdenes de magnitud mayores que las lámparas de cátodo hueco. Estas lámparas están constituidas por un tubo de cuarzo, sellado que contiene un gas inerte (argón) a unos pocos torricelli de presión, y una pequeña cantidad de una sal del metal a analizar. La lámpara no contiene electrodos, pero en su lugar la energía necesaria la suministra un intenso campo electromagnético de radiofrecuencia o de microondas. El gas se ioniza en este campo y los electrones son acelerados hasta que ganan energía suficiente para excitar (por colisión) los átomos del metal cuyo espectro se analiza. Al igual que en las lámparas de cátodo hueco, la relajación de los átomos excitados lleva aparejada la emisión de radiación electromagnética de longitud de onda capaz de excitar los átomos de la muestra del elemento que se desea determinar. Existen en el mercado lámparas de descarga sin electrodo para, entre otros, los siguientes elementos: As, Bi, Cd, Cs, Ge, Hg, Pb, Rb, Sb, Se, Sn, Te, Tl y Zn.

5.2.5. Modulación de las fuentes de radiación En las mediciones de absorción atómica es necesario discriminar entre la radiación que proviene de la fuente y la que proviene de la llama. La llama emite un espectro de radiación continuo resultante de la excitación de las moléculas de combustible. Además, contendrá un espectro de líneas como consecuencia de la excitación de los átomos metálicos de la muestra. La fracción de átomos que experimenta excitación térmica es pequeña, no obstante, los pocos átomos excitados emiten radiación correspondiente a la línea de absorción. Gran parte de esta última es eliminada por el monocromador que se coloca entre la llama y el detector. Sin embargo, la excitación térmica de una fracción de átomos del analito en la radiación produce una radiación de longitud de onda a la cual está ajustada el monocromador. Debido a que esta radiación no se elimina, esta convierte en una potencial fuente de interferencias. Estas dificultades se eliminan mediante la modulación de la fuente (lámpara de cátodo hueco). Se consigue haciendo que la intensidad del haz fluctúe a una frecuencia constante. El detector recibe entonces dos tipos de señal: una alternativa, proce-

110

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

dente de la fuente y otra continua, procedente de la llama. Estas señales son convertidas en los correspondientes tipos de señales eléctricas. Se emplea un sistema eléctrico para eliminar la señal continua no modulada, al tiempo que se amplifica la parte de la señal proveniente de la fuente. Para modular el haz se emplea un disco rotatorio que se coloca entre la fuente y la llama. A este disco se le han quitado cuadrantes alternativos para permitir el paso del haz. La rotación del disco a velocidad constante hace que el rayo que llega a la llama varíe periódicamente desde intensidad cero a un máximo determinado y, de ahí, de nuevo a cero.

5.3. TÉCNICAS ESPECIALES DE ABSORCIÓN ATÓMICA 5.3.1. Determinación de mercurio por espectrometría de absorción atómica de vapor frío Uno de los métodos más útiles para la determinación de mercurio está basado en la absorción atómica de la radiación del vapor de mercurio metálico a 254 nm (Tabla 5.1). La Figura 5.12 muestra un dispositivo empleado en su determinación por la técnica de vapor frío. El método está basado en la baja solubilidad del mercurio en la mezcla de reacción y en su alta presión de vapor (2 × 10–3 torr a 25 °C). El límite de detección del método es menor de 0.001 ppm (1 μg/Kg) y se utiliza para detectar Aire Lámpara de cátodo hueco Sistema de registro

Bomba Agua + vapor de Hg

Vapor de Hg

Tubo secador

Mezcla de reacción (contiene el Hg)

FIGURA 5.12. Esquema de un equipo para la determinación de mercurio por absorción atómica de vapor frío.

Espectroscopía atómica

•• •• ••

111

mercurio en alimentos, metales, menas y muestras ambientales. El método tiene la ventaja de su sensibilidad, su sencillez y de que opera a temperatura ambiente. Como se ve en la Figura 5.12, la muestra a analizar se digiere con una mezcla de ácido nítrico y sulfúrico. Este tratamiento convierte el mercurio en sales de mercurio (II). El mercurio de estas sales se reduce a estado metálico con una mezcla de sulfato de hidroxilamina o sulfato de estaño (II). Una vez finalizado el proceso de reducción, se bombea aire a través de la disolución para llevar el vapor resultante que contiene mercurio, a través de un tubo de secado, al interior de la celda de observación. El vapor de agua es atrapado en el desecador de modo que a la celda solo llega mercurio y aire. El monocromador del espectrómetro de absorción atómica se ajusta a 254 nm. La absorbancia obtenida es directamente proporcional a la concentración de mercurio en la celda, la cual es a su vez proporcional a la concentración de mercurio en la muestra original. La cuantificación se realiza comparando los resultados con muestras patrón de concentración de mercurio conocida.

5.3.2. Espectroscopía de absorción atómica con cámara de hidruros Varios elementos del sistema periódico tiene puntos de ebullición muy superiores a los de su correspondiente hidruro (Tabla 5.5). Por tanto, el hidruro es más fácil de volatilizar en la llama o el horno que el elemento metálico. Cuando se pretende determinar alguno de estos elementos por espectroscopía atómica, se introducen en el atomizador tras un tratamiento químico que los transforma en hidruros. TABLA 5.5. Puntos de ebullición de unos elementos y de sus hidruros covalentes Elemento

Punto de ebullición (°C)

Hidruro

Punto de ebullición (°C)

Arsénico

613

AsH3

–62

Bismuto

1560

BiH3

–22

Germanio

2830

GeH3

–88

Plomo

1725

PbH4

–13

Antimonio

1380

SbH3

–18

Selenio

682

SeH2

–41

Estaño

2270

SnH4

–52

Teluro

9990

TeH2

–2

112

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Los hidruros metálicos volátiles se generan mezclando una disolución de borohidruro sódico estabilizada en hidróxido sódico con una disolución ácida del metal. Los iones metálicos reaccionan para formar hidruros volátiles, produciéndose un gran exceso de hidrógeno. Los hidruros formados son arrastrados hasta el atomizador para la cuantificación espectrométrica. El método requiere optimizar las condiciones para cada metal, ya que se requieren distintas concentraciones del ácido y del NaBH4 para los distintos metales.

5.4. METODOLOGÍA DE EMISIÓN ATÓMICA 5.4.1. Posibilidades y requerimientos de la técnica de emisión atómica La radiación procedente de las emisiones atómicas es de longitudes de onda características para cada uno de los elementos de la muestra. Las longitudes de onda más utilizadas se muestran en la Figura 5.3. Al ser las longitudes de onda de emisión atómica características de cada elemento, la espectroscopía de emisión atómica es una técnica de análisis simultáneo multielemental. Así, con un equipamiento sofisticado, se puede detectar casi todo el sistema periódico en un solo experimento. Para determinar los elementos de una muestra por emisión atómica tiene que medirse la intensidad de radiación para cada elemento a la longitud de onda específica de ese elemento. Se puede utilizar tanto la detección simultánea como la detección secuencial (Tabla 5.1). La detección simultánea se apoya en los policromadores; por el contrario la secuencial se basa en un barrido de la región espectral de interés mientras la muestra se introduce a velocidad constante en el atomizador. La principal dificultad de la técnica de espectroscopía de emisión atómica es la interferencia espectral. Una muestra se compone de muchos átomos diferentes emitiendo simultáneamente radiación a diferentes longitudes de onda. Muchas de estas longitudes de onda son muy próximas. Por ejemplo, el Sc emite a 402 nm, mientras que el Mn lo hace a 403 nm; el Ca lo hace a 423 nm y el Cr a 425 nm (Figura 5.3). Es decir, se pueden producir fácilmente interferencias espectrales que obligan a disponer de equipos capaces de diferenciar emisiones de longitudes de onda tan próximas como 1 y 2 nm. Por lo tanto, se requiere disponer de la tecnología necesaria para obtener esas separaciones espectrales y así poder confirmar en una muestra la presencia simultánea de, por ejemplo, Ca y Cr o Sc y Mn.

5.4.2. El plasma de acoplamiento inductivo (ICP) Un plasma es un gas ionizado. Los plasmas pueden operar como atomizadores de alta temperatura (pueden alcanzar los 10000 K). El tipo más comúnmente utilizado para emisiones atómicas es la antorcha de plasma de acoplamiento inductivo (ICP).

Espectroscopía atómica

•• •• ••

113

La abreviatura ICP está universalmente aceptada y proviene del inglés induced coupled plasma. El ICP es un plasma que se induce en una corriente de flujo de argón. La corriente de Ar fluye entre dos tubos de cuarzo y se hace conductora por una descarga eléctrica que genera iones y electrones. Estos iones son obligados a circular por un espacio anular cerrado dentro del campo magnético de radiofrecuencia, lo cual, debido a la resistencia, provoca un calentamiento, que a su vez provoca una ionización adicional que mantiene el argón en estado de plasma. Si el flujo de gas y la potencia son correctos, se formará una zona de plasma de temperatura alta y sostenida desde la base del plasma, que es por donde se introduce la muestra. La temperatura de este plasma es lo suficientemente elevada como para que sea necesario aislar térmicamente el cilindro de cuarzo donde se produce el plasma. El aislamiento se consigue haciendo fluir tangencialmente una corriente adicional de argón alrededor del tubo. El flujo tangencial enfría las paredes interiores del tubo central y centra radialmente el plasma. La estructura de una antorcha de ICP se muestra en la Figura 5.13. Existen otras formas de generar un plasma: mediante la aplicación de corriente continua de alto voltaje entre dos electrodos, mediante la aplicación de corriente alterna (plasma AC), mediante la radiación de microondas (plasma inducido por microondas) y descargas luminiscentes generadas en las superficies metálicas. Ninguno de ellos es tan común como el ICP.

Circulación de iones generados

H (campo magnético)

Plasma de argón

H (campo magnético)

Bovina para la inducción del campo magnético

Flujo tangencial de argón

Argón para el plasma y la muestra

FIGURA 5.13. Generación de un plasma acoplado inductivamente.

114

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Las antorchas de plasma pueden incorporarse tanto a equipos de emisión como de absorción (aunque esto último es muy poco frecuente). En los equipos de absorción el plasma realiza solo funciones de atomizador. Sin embargo, en los equipos de emisión, los plasmas actúan simultáneamente de atomizador y de fuente de excitación. Como veremos en un tema posterior, las antorchas de ICP también se acoplan a espectrómetros de masas para dar una técnica de detección multielemental simultánea.

5.4.3. El ICP óptico Debido a las interferencias espectrales, las fuentes de emisión en los equipos de espectroscopía de emisión atómica tienen que tener una temperatura muy estable para mejorar la precisión y reproducibilidad. Como consecuencia de ello, los espectrómetros de emisión atómica son similares a los de absorción, aunque se prefiere incorporar plasmas (generalmente ICP) en lugar de llamas como sistema de atomización. Se denomina ICP óptico a los equipos de medida de emisión o absorción atómica (aunque generalmente funcionan en modo emisión) que incorporan una antorcha de ICP. En los ICP ópticos se distingue entre los de lectura secuencial y los de lectura simultánea según sea el modo de recogida de datos (Tabla 5.1). Las condiciones experimentales óptimas de detección de cada elemento no son idénticas. Las principales diferencias en las condiciones idóneas de determinación surgen de las diferencias en la atomización. Así, cualquier cambio en el caudal de gas de la antorcha, en la potencia de la radiofrecuencia y en la temperatura puede modificar las especies químicas presentes en la muestra y, por lo tanto, la emisión de radiación. Con el desarrollo de la espectrometría de masas y utilizando la atomización por ICP se ha desarrollado una metodología de detección elemental que combina ambas técnicas y que se denomina espectrometría de masas acoplada a ICP (ICP-MS). Los equipos de ICP-MS son todavía más caros que cualquier equipo de absorción atómica o de ICP óptico, aunque ofrecen prestaciones superiores a las de cualquier modalidad de espectroscopía atómica, como son una superior sensibilidad, un gran intervalo de linealidad y una mayor estabilidad de la señal. Estudiaremos en detalle la técnica del ICP-MS en otro capítulo de este libro.

PARTE

Técnicas de separación

IV

6

Introducción a la cromatografía

CONTENIDO 6.1. Cromatografía, experimentos cromatográficos sencillos 6.2. Desarrollo histórico de la cromatografía 6.3. Algunos términos elementales empleados en cromatografía 6.4. Clasificación de las técnicas cromatográficas 6.5. Parámetros básicos en cromatografía 6.5.1. Parámetros de bandas individuales 6.5.2. Parámetros de eficacia 6.5.3. Parámetros para describir pares de bandas 6.5.4. Ejemplos de cálculos de parámetros básicos de cromatografía

6.1. CROMATOGRAFÍA, EXPERIMENTOS CROMATOGRÁFICOS SENCILLOS La cromatografía se define como el conjunto de técnicas para la separación de los componentes de una mezcla sobre la base de su diferente movilidad en un medio poroso (fase estacionaria) cuando son arrastrados por un fluido (fase móvil o eluyente). Las separaciones se consiguen a través de una gran variedad de técnicas, con bases moleculares muy claramente diferenciadas: Por ejemplo, se puede conseguir la separación de los elementos de una muestra sobre la base de sus cargas eléctricas (cromatografía iónica), de su polaridad (cromatografía de adsorción), de su tamaño (cromatografía de exclusión molecular), de su afinidad por otras moléculas (cromatografía de afinidad), de su solubilidad en diferentes disolventes (cromatografía de reparto) e, incluso, de la disposición espacial de los enlaces (cromatografía quiral). 117

118

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Ejemplos de procesos cromatográficos estándar en columnas La Figura 6.1 muestra un esquema de lo que sería un proceso cromatográfico modelo. El sistema consta de un soporte tubular (normalmente denominado columna) de un diámetro determinado (puede ir desde décimas de mm en cromatografía de gases hasta unos pocos cm en cromatografía de líquidos) y de una longitud determinada (desde unos pocos cm en cromatografía de líquidos hasta unos 100 m en columnas capilares de cromatografía de gases). El cilindro sirve de soporte a un material denominado fase estacionaria que llena todo su interior y con el cual van a interaccionar los diversos componentes de la muestra. Cerca del extremo por donde se introduce la muestra también se introduce un fluido que arrastra los diversos componentes de la muestra por el interior de la columna. Este fluido puede ser un líquido, un gas o un fluido supercrítico y se denomina fase móvil o eluyente. Al final de la columna normalmente se acopla un detector capaz de medir una propiedad físico-química de los componentes de la muestra que se desean separar. La propiedad físico-química a determinar se puede registrar en continuo (como en la Figura 6.1A), o bien sobre volúmenes discretos determinados (normalmente denominados fracciones) del material emergente de la columna (como se muestra en la Figura 6.2). En el proceso cromatográfico de la Figura 6.1 la muestra contiene tres analitos (1, 2 y 3) que se desea separar. El analito 1 es el que interacciona más fuertemente con la fase estacionaria y el 3 el que interacciona más débilmente. El analito 2 lo hace con una fuerza intermedia entre los otros dos. En primer lugar, la mezcla se introduce en la columna (Figura 6.1A). Al entrar en la columna la muestra es arrastrada por la fase móvil a través de la fase estacionaria (Figura 6.1B). El proceso continúa y como 1 interacciona muy fuertemente con la fase estacionaria avanza muy lentamente, al contrario que el analito 3, que siempre encabeza el frente de las moléculas de muestra ya que apenas interacciona con la fase estacionaria (Figura 6.1C). Al final del proceso los tres analitos llegan separados al detector (que está registrando continuamente la propiedad físico-química característica de los analitos) (Figura 6.1D). Esta diferente movilidad ha sido la base de la separación cromatográfica de los tres componentes de la muestra. La separación mostrada en la Figura 6.1 podría estar referida a una cromatografía de líquidos (si la fase móvil fuese un líquido) o a una cromatografía de gases (si la fase móvil fuese un gas). En ambos casos, el proceso se esquematiza sobre una sistema cerrado donde la fase móvil ha de ser introducida en la columna mediante un sistema de bombeo del líquido o que impulse el gas. Existen otros casos donde la separación se realiza en sistemas abiertos donde la fase móvil es necesariamente líquida y fluye por la columna por gravedad. Uno de estos procesos se muestra en las Figuras 6.2 y 6.3. En la cromatografía de líquidos de baja presión las columnas son habitualmente de vidrio o plástico resistente a disolventes orgánicos. Estas columnas están abiertas por

Introducción a la cromatografía

•• •• ••

119

Fase est acionaria A Fase móvil

Al detector B

Fase móvil

Al detector

C Fase móvil

Al detector D

Fase móvil

Al detector

FIGURA 6.1. Proceso cromatográfico estándar. Analito 1 = ; Analito 2 = ; Analito 3 = .

la parte superior y cuentan con un filtro en la parte inferior, donde también hay una llave para regular el flujo de salida de fase móvil. Como en todos los casos, las columnas contienen en su interior una fase estacionaria. El proceso empieza con la adición de la muestra por la parte superior de la columna (Figura 6.2-1). A continuación se añade la fase móvil (Figura 6.2-2). Ambos (muestra y fase móvil) bajan por la columna por gravedad. Los componentes de la muestra tienen diferentes grados de interacción con la fase estacionaria y se separan formando bandas. Si los analitos son coloreados, se puede ver claramente bandas definidas a lo largo de la columna que avanzan a diferente velocidad (Figura 6.2-3). La llave de la parte inferior de la columna se puede abrir y cerrar a voluntad del operador. Este va recogiendo en tubos separados cantidades iguales del material que sale por la parte inferior de la columna (fracciones). Al final del proceso se mide una propiedad físico-química (absorbancia, conductividad térmica, actividad enzimática, etc.) de cada una de las fracciones que se han recogido y se representa en función del volumen total salido por la columna (o del tiempo de elución, si el flujo es constante). A esta representación se la denomina cromatograma. La Figura 6.3 muestra el cromatograma resultante de la separación cromatográfica presentada en la Figura 6.2. A diferencia de la Figura 6.1, el detector empleado en cromatografía de líquidos en columna abierta no suele estar acoplado directamente a la columna y el registro no se hace en el mismo momento en que la muestra sale de la columna.

120

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

1) Adición de la muestra

2) Adición de la fase móvil

3) Separación por gravedad

FIGURA 6.2. Proceso de cromatografía líquida en columna abierta.

Fracción

1

2

3

4 5 6 7 Tiempo (min)

8

9

1

2

3

4

8

9

5

6

7

FIGURA 6.3. Cromatograma de la cromatografía realizada en la Figura 6.2.

Puede ver una animación sobre una separación cromatográfica en columna abierta en: http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/animations/lc_column.mov (Página activa en julio de 2004.)

Introducción a la cromatografía

•• •• ••

121

6.2. DESARROLLO HISTÓRICO DE LA CROMATOGRAFÍA Antecedentes: análisis capilar de colorantes Las primeras aplicaciones cromatográficas (todavía no se denominaba cromatografía) se desarrollaron en el siglo XIX por químicos de colorantes. En 1861 se publicó un tratado llamada análisis capilar donde se describía que sumergiendo cuerdas o pedazos de tela en tanques de colorante la disolución ascendía por capilaridad por el material sumergido y los componentes de los colorantes producían bandas de diferente color. El descubrimiento: Tswett y pigmentos vegetales El descubrimiento de la cromatografía se atribuye a Tswett. Este botánico ruso reconoció las bases físico-químicas de la separación y las aplicó de manera racional a la separación de pigmentos de plantas (principalmente carotenos y clorofilas). Tswett describe en un libro publicado en 1910 un proceso donde, tras rellenar y empaquetar una columna de vidrio con material adsorbente, se deposita en la parte superior de la columna la mezcla de pigmentos a separar. A continuación se adiciona también en la parte superior un disolvente orgánico para lavar la columna. Se observa la separación de los diversos pigmentos en bandas discretas coloreadas y separadas en la columna por zonas sin pigmento (no coloreadas). Tswett llamó a este proceso cromatografía (del griego «escribir con color»). No obstante, la cromatografía no se consideró seriamente como una técnica de separación hasta 1931, cuando Richard Kuhn y Edgar Lederer publicaron su aplicabilidad en la separación de un gran número de materiales importantes. Cromatografía de reparto Algo más tarde (en 1941) Martin y Synge también aplicaron técnicas cromatográficas para estudiar la composición de aminoácidos de la lana. Los trabajos iniciales de Martin y Synge aplicaron una técnica llamada distribución líquido-líquido en contracorriente. Esta técnica no proporcionó resultados satisfactorios e idearon un método similar en el cual un líquido (agua) era firmemente enlazado a un sólido granulado (gel de sílice). El gel de sílice se empaquetaba en un tubo de vidrio y un segundo líquido, inmiscible con el primero (cloroformo) era pasado a través de la sílice. Aunque el trabajo mecánico era similar al descrito por Tswett, se introdujo el concepto de una fase estacionaria líquida (agua) unida a un soporte inerte (gel de sílice) que no interaccionaba con la muestra. Esta técnica se llamó cromatografía de reparto. Para entonces, sus descubridores ya introdujeron la idea de que la fase móvil también podría ser un gas. No obstante, esta idea no se aplicó hasta una dé-

122

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

cada después, cuando Martín, en colaboración con James inició los estudios de cromatografía de reparto líquido-gas. En 1952 Martin y Synge recibieron el premio Nóbel de Química por sus trabajos en el desarrollo de la cromatografía moderna. Cromatografía en papel y cromatografía de capa fina La cromatografía de reparto presentaba grandes problemas de reproducibilidad debido a la falta de uniformidad del tamaño de partícula de la sílice y a la dificultad de conseguir un empaquetado homogéneo de las columnas. Por este motivo, Martin y sus colaboradores empezaron a trabajar en un nuevo procedimiento en el cual la fase estacionaria era una hoja de papel de filtro. El papel fue pensado como agua enlazada a la celulosa, ofreciendo otro método de reparto. La técnica dio la reproducibilidad deseada y, a comienzos de 1940, la cromatografía de papel encontró una amplia aplicación en el análisis de compuestos de importancia biológica, tales como aminoácidos, esteroides, carbohidratos y pigmentos biliares. Izmaylov y Shrayber distribuyeron el material de soporte como una película delgada sobre una placa de vidrio. La placa y el material de soporte podían ser manipulados de una manera similar a la de la cromatografía de papel. Los resultados de los estudios fueron publicados en 1938, pero el potencial del método no se reconoció ampliamente hasta 1956, cuando Egon Stahl empezó una investigación intensiva en este campo. Este sistema llegaría a ser conocido como Cromatografía en Capa Fina (TLC). Cromatografía de intercambio iónico Los intercambiadores iónicos son sustancias naturales o artificiales que contiene iones positivos o negativos anclados a la estructura del intercambiador, lo que permite retener con mayor o menor fuerza los iones de signo opuesto presentes en la disolución. Esta es la base de la Cromatografía de Intercambio Iónico. La primera separación cromatográfica por intercambio iónico fue descrita en 1938 por Taylor y Urey, quienes usaron una zeolita como intercambiador. El método recibió mucha atención en 1942 (durante el desarrollo del proyecto Manhattan) como una forma de separar las tierras raras y otros elementos del uranio. La cromatografía de intercambio iónico puede ser aplicada a la separación de iones orgánicos, por lo tanto tiene una particular importancia en la separación de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Cromatografía de gases Martin y James publicaron en 1952 la elución por cromatografía de gases de ácidos orgánicos y aminas. En su trabajo, pequeñas partículas del material de soporte fueron recubiertas con un líquido no volátil y empaquetadas en un tubo de vidrio ca-

Introducción a la cromatografía

•• •• ••

123

liente. Las mezclas se inyectaban a la entrada del tubo y, al ver impulsadas a través de él por un gas comprimido, apareciendo como zonas bien separadas. Este sistema fue inmediatamente reconocido por los químicos del petróleo como un método simple y rápido para el análisis de la mezcla compleja de hidrocarburos encontrados en sus productos. Golay concluyó en 1957 que columnas muy largas (90 a 180 metros) con un diámetro interno estrecho (unos 0.25 milímetros) y con su pared recubierta con una película delgada podrían producir mejores separaciones. Esos capilares tuvieron un impacto explosivo sobre la metodología cromatográfica, ya que permitían separar cientos de compuestos de una mezcla en un solo experimento cromatográfico. Cromatografía líquida de alta resolución En 1954, Giddings hipotetizó que sería posible aplicar a la cromatografía de líquidos los mismos factores que hacían de la cromatografía de gases una poderosa técnica de separación. Es decir, tamaños muy pequeños de partícula de fase estacionaria distribuidos en una fina película en las paredes de una columna de poco diámetro. Este fue el inicio de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). No obstante, la técnica de HPLC no se desarrolló hasta que no se dispuso de bombas capaces de producir un caudal de fase móvil estable a las altas presiones necesarias para hacer fluir el líquido a través de los poros de fase estacionaria empaquetada en una columna de fino diámetro. Cromatografía de exclusión molecular En 1959, Flodin y Porath desarrollaron polímeros de celulosa que actuaban como tamices moleculares para sustancias dispersas en líquidos. Los tamices moleculares son sustancias porosas que son atravesadas por una fase móvil. Las moléculas grandes no entran en los poros del tamiz, por lo que fluyen sin impedimento a través del sistema. Sin embargo, las moléculas pequeñas ven interrumpida su migración en la medida en que serpentean saliendo y entrando de los poros del tamiz. Las moléculas de tamaño intermedio muestran diferentes velocidades relativas de migración, dependiendo de su tamaño. Esto ocasiona una separación de los componentes de la muestra en función del tamaño del analito. El término genérico para tales separaciones es el de Cromatografía de Exclusión Molecular.

6.3. ALGUNOS TÉRMINOS ELEMENTALES EMPLEADOS EN CROMATOGRAFÍA Algunos términos que es necesario conocer para empezar a estudiar los procesos cromatográficos son:

124

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

FASE ESTACIONARIA: Material inmóvil implicado en el proceso cromatográfico. Las interacciones químicas cruciales del proceso de separación se producen entre la fase estacionaria y los analitos. La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido enlazado a un sólido (cromatografía de reparto) o radicales químicos enlazados a un sólido (cromatografía de adsorción o intercambio iónico). SOPORTE: Es el material sobre el que se sustenta la fase estacionaria. FASE MÓVIL: Fluido que arrastra la muestra a través de la columna. Puede ser un líquido, un gas o un fluido supercrítico. RETENCIÓN: es el fenómeno que causa la inmovilización de las moléculas de analito debido a la atracción entre estas y el adsorbente. La retención ocurre cuando las moléculas de analito tienen más afinidad por la fase estacionaria que por la matriz en la que se encuentran. ELUCIÓN: es el proceso por el cual un analito se suelta de la fase estacionaria a la que estaba unido. La elución ocurre cuando el analito tiene más afinidad por el eluyente que por la fase estacionaria. ELUYENTE: Fase móvil empleada en el proceso cromatográfico. El término eluyente se reserva para fases móviles líquidas o supercríticas (no gaseosas). ELUIDO: Fase móvil que sale de la columna. Determinadas fracciones del eluido contendrán los analitos. DETECTOR: Aparato que registra una propiedad físico-química del material eluido. CROMATOGRAMA: Representación de una propiedad físico-química del eluido en función del tiempo o volumen de elución. Consideramos que los términos comentados son básicos e imprescindibles para la comprensión de las técnicas cromatográficas al nivel que se van a describir en este libro. En caso de desear ampliar el conocimiento de los términos utilizados en cromatografía recomendamos los siguientes sitios en Internet (todos ellos activos en julio de 2004): 1) Compendio de términos de cromatografía de líquidos: http://www.lcgcmag.com/lcgc/data/articlestandard/lcgc/482001/2936/article.pdf 2) Compendio de términos de cromatografía de gases: http://www.chromatographyonline.com/lcgc/data/articlestandard/lcgc/462002/ 38300/article.pdf

6.4. CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS Las técnicas cromatográficas se clasifican atendiendo a varios criterios. La Tabla 6.1 presenta las principales clasificaciones:

Introducción a la cromatografía

•• •• ••

125

TABLA 6.1. Clasificación de las técnicas cromatográficas Interaciones analito-fase estacionaria

Fase móvil

Disposición fase estacionaria

Composición fase móvil

Temperatura fase móvil

Adsorción

Líquida

Columna

Isocrática

Isoterma

Reparto

Gaseosa

Placa

Gradiente

Gradiente

Exclusión molecular

Fluidos supercríticos

Papel

Intercambio iónico Afinidad

Las interacciones entre analito y fase estacionaria son la base de las separaciones y serán estudiadas y caracterizadas en próximos capítulos. En cualquier caso y brevemente, podemos decir que dichas interacciones pueden ser de: Adsorción. Son interacciones electrostáticas no iónicas (dipolos, puentes de hidrógeno, etc.) Este tipo de interacciones puede subdividir en cromatografía de adsorción en fase normal y cromatografía de adsorción en fase reversa. Reparto. La fase estacionaria es un líquido (agua) retenido en los poros de una matriz sólida inerte. El eluyente es un líquido orgánico inmiscible en agua. Los analitos más solubles en el eluyente son retenidos en menor medida por la fase estacionaria. Fue una de las primera técnicas cromatográficas desarrollarse, no obstante, hoy en día se halla en desuso. Intercambio iónico. La fase estacionaria es una matriz sólida inerte que tiene grupos cargados negativa o positivamente y unidos covalentemente. Los analitos con carga de signo opuesto al de la matriz quedarán retenidos en ella, separándose del resto de analitos con carga del mismo signo que la matriz o neutros. Exclusión molecular. La fase estacionaria contiene partículas porosas con tamaño de poro comparable al tamaño de las moléculas que se quieren separar. La separación se consigue porque los analitos han de recorrer caminos diferentes (más o menos largos) para alcanzar el final de la columna. El camino que recorren los analitos depende del tamaño y, por lo tanto, del peso molecular. Afinidad. Las interacciones que se dan entre fase estacionaria y analitos son absolutamente específicas entre pares de moléculas. Algunos ejemplos: antígeno-anticuerpo, hormona-receptor, avidina-biotina, azúcar-lectinas. Es un tipo de cromatografía muy eficaz debido a la especificidad de cada caso, no suele ser posible obtener fases estacionarias comerciales.

126

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

La fase móvil Como ha quedado establecido en este capítulo, la fase móvil de una separación cromatográfica puede ser un líquido, un gas o un fluido supercrítico. Los dos primeros serán desarrollados con profundidad en los próximos capítulos. Un fluido supercrítico también puede ser fase móvil en un proceso cromatográfico. Es una técnica que requiere un equipamiento similar (inyector, columnas y bombas) a la de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), pero con un generador de fluido supercrítico colocado antes de la bomba. Los detectores de HPLC clásicos deben ser modificados para soportar la presión necesaria con el fin de mantener el fluido en estado supercrítico, mientras que los detectores de cromatografía de gases deben modificarse para funcionar con los volúmenes tan grandes de gases que se producen al despresurizar el fluido supercrítico. La cromatografía de fluidos supercríticos no está tan extendida como la de HPLC o la cromatografía de gases (GC). Disposición de la fase estacionaria Como se ha comentado anteriormente, en la mayoría de los procesos cromatográficos modernos la fase estacionaria está dispuesta sobre una columna del diámetro y longitud apropiadas según la presión a que esté sometida y según la fase móvil sea líquida o gaseosa. Además, existe una técnica relativamente extendida (se comentará más adelante en un capítulo específico) denominada cromatografía en capa fina (TLC). En esta técnica la fase estacionaria está colocada como una fina película en una plancha de vidrio o aluminio. Una técnica predecesora de la anterior, aunque hoy en desuso, consiste en utilizar como fase estacionaria un papel con la celulosa modificada como fase estacionaria. Composición y temperatura de la fase móvil En cromatografía de líquidos, la composición de la fase móvil puede ser constante (isocrática) a lo largo del tiempo o cambiar a lo largo del cromatograma. En este último caso se habla de cromatografía en gradiente. En GC la fase móvil puede estar a una temperatura constante todo el proceso, en el caso de GC isoterma, o, por el contrario, puede haber un gradiente de temperaturas. Es decir, la temperatura puede variar a lo largo del proceso.

6.5. PARÁMETROS EN CROMATOGRAFÍA En cromatografía es posible parametrizar la forma, la resolución y la posición de las bandas. La parametrización de datos en cromatografía facilita la comunicación

Introducción a la cromatografía

•• •• ••

127

de datos y también la comparación de los resultados entre diferentes condiciones y métodos. Los parámetros que describen un cromatograma pueden correlacionarse con descripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separación. No obstante, no es intención de este libro profundizar en descripciones teóricas, por lo que a continuación describiremos los parámetros cromatográficos básicos sin entrar en dichas consideraciones.

6.5.1. Parámetros de bandas individuales Un parámetro necesario en la caracterización de un cromatograma es el volumen mínimo de fase móvil que puede transportar un componente de muestra a lo largo de toda la columna. Este parámetro se denomina volumen muerto (VO). El VO del sistema se calcula introduciendo en él un analito que no interacciona con la fase estacionaria y determinando el volumen necesario para que alcance el final de la columna. En ocasiones, todos los analitos de la muestra interaccionan con la columna y no es posible calcular el V0 del sistema. En este caso se debe adicionar a la muestra un componente que no interaccione con la columna y determinar su volumen de elución o bien, si no se desea alterar la muestra, hacer un cromatograma separado únicamente con el componente en cuestión. Los picos que eluyen después del V0 se describen mediante otros parámetros. Uno de estos parámetros es el volumen de retención (VR) o volumen de elución (Ve) (Figura 6.4), que se define como el volumen necesario para eluir un componente determinado. La diferencia entre el volumen de retención y el volumen muerto es otro parámetro importante para la determinación de un pico y se llama volumen corregido de retención o volumen corregido de elución. Los tres parámetros descritos hasta ahora tienen sus definiciones equivalentes cuando en un cromatograma se representa el tiempo de elución en lugar del volumen. Así, el tiempo muerto (t0) es el tiempo necesario para llevar un analito que no interacciona con la fase estacionaria desde el principio hasta el final de la columna. El tiempo de retención (tR) o tiempo de elución (te) (Figura 6.4) es el tiempo necesario para que un componente de la muestra que interacciona con la fase estacionaria atraviese la columna mientras que la diferencia entre el tiempo de elución y el tiempo muerto se conoce como tiempo corregido de retención o tiempo corregido de elución. El ancho de pico (W) y el ancho de pico a media altura (W1/2) se miden en unidades de tiempo o de volumen y son parámetros que ayudan a definir y caracterizar un pico cromatográfico. El ancho de pico (W) corresponde a la base del triángulo teórico que se formaría uniendo las líneas tangentes a los puntos de inflexión de la Gaus-

128

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

siana que forma el pico (Figura 6.4). Así pues, W solo puede ser determinado matemáticamente a posteriori, ya que depende de la triangulación del pico. Sin embargo, el ancho de pico a media altura (W1/2) es un parámetro medible experimentalmente, ya que el sistema nos puede ofrecer el tiempo transcurrido entre que se alcanza la mitad de la altura máxima al ascender y descender la línea de registro. El dato de W1/2 nos permite calcular W, ya que se puede demostrar que si el pico es una campana de Gauss perfecta: W = 1698 W1/2

1.4

Tiempo de retención (tR) o volumen de retención (VR)

1.2

Señal

1.0 0.8 0.6

Altura de pico (h)

Ancho de pico a media altura (W1/2)

0.4

Media altura de pico (h1/2)

0.2 Ancho de pico (W) Tiempo (o volumen)

FIGURA 6.4. Pico cromatográfico donde se indican los principales parámetros de bandas individuales.

El factor de capacidad (k) se define como la relación entre el volumen corregido de retención y el volumen muerto (o bien como la relación entre el tiempo corregido de retención y el tiempo muerto si el flujo es constante). VR – V0 Factor de capacidad (k) = ———— V0 Idealmente, las separaciones deben realizarse en condiciones dadas para las que k esté comprendido entre 1 y 5. Al contrario que los tiempos y volúmenes de retención, el factor de capacidad no depende de la geometría del sistema. Es decir que,

Introducción a la cromatografía

•• •• ••

129

para una fase estacionaria y unas condiciones dadas, el k se mantendrá constante al variar la longitud de la columna, el diámetro y su tamaño de partícula.

El factor de capacidad es adimensional.

La Tabla 6.2 recoge y resume las expresiones matemáticas de los parámetros de bandas individuales. TABLA 6.2. Expresiones matemáticas de los parámetros de bandas individuales de un cromatograma Parámetro

Expresión matemática

Volumen (tiempo) muerto

V0(t0)

Volumen (tiempo) de retención

VR(tR)

Volumen (tiempo) corregido de retención

VR – V0(tR – t0)

Factor de capacidad

k = (VR – V0)/V0 = (tR – t0)/t0

Ancho de banda a mitad de la altura

W1/2

Ancho de banda

W = 1698 W1/2

6.5.2. Parámetros de eficacia El objetivo primordial de la cromatografía es separar los componentes de una mezcla. La separación depende del ancho de los picos y del espacio de tiempo (o volumen) que los separa. Así pues, se puede obtener una separación eficiente de dos componentes tanto con picos anchos como con picos estrechos. Sin embargo, si las bandas son más anchas, el cromatograma puede llevar más tiempo. La tendencia general es a preferir que los picos sean lo más estrechos posible. La eficacia cromatográfica (N) es el parámetro que cuantifica la preferencia de los componentes por bandas estrechas. Es un parámetro individual para cada banda del cromatograma y, por tanto, no todas las bandas tienen la misma eficacia cromatográfica. El parámetro N también suele denominarse número de platos teóricos y resulta útil para comparar separaciones cromatográficas en condiciones diferentes. Cuanto mayor es N, mayor es la tendencia del analito a aparecer en el cromatograma

130

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

como un pico estrecho y, por lo tanto, mejor es la separación obtenida. La ecuación matemática que describe el parámetro N es: N = 16 (tRi / Wi)2 = 5,54 (tRi / W1/2)2 La eficacia cromatográfica es adimensional.

La eficacia cromatográfica de un pico está determinada por factores como la construcción y empaquetado de la columna y la velocidad de la fase móvil. La cromatografía de líquidos de alta resolución llega a ofrecer varios miles de platos teóricos, mientras que en cromatografía de gases este número puede alcanzar varios centenares de miles. El concepto de eficacia pretende cuantificar la capacidad del sistema para aprovechar las interacciones entre el analito y la fase estacionaria, consiguiendo que se forme el equilibrio entre ambas fases el mayor número posible de veces. La expresión número de plato teórico nace de la idea de los «platos» de las columnas de destilación fraccionada de petróleo, donde cada plato correspondía a un equilibrio en la interacción sólido-gas. Cuando decimos que una columna tiene una eficacia de 200, es como si la columna se comportara como 200 pequeños compartimentos, en cada uno de los cuales el analito establece un equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria, tras lo cual la fase móvil pasa al siguiente compartimiento (Figura 6.5). Número de plato teórico

1

2

3

4

5

Fase móvil Fase estacionaria

FIGURA 6.5. Representación esquemática de los estados de equilibrio de reparto (constante de reparto = 1) que el analito establece con la fase estacionaria en cada plato teórico. En el plato teórico número 5 se ha conseguido que la pureza del analito (bolas blancas) alcance el 83% (5 bolas blancas de un total de 6 bolas totales), cuando inicialmente era del 50% (5 bolas blancas de 10 bolas totales).

Otra medida útil es el número de platos teóricos por unidad de longitud de la columna, o bien su inverso, la altura equivalente de plato teórico (H). Cuanto menor es H, mejor es el sistema cromatográfico para el componente que se haya calculado. Suponiendo que la columna tenga una longitud L con un total de N platos teóricos, entonces H viene dada por la ecuación:

Introducción a la cromatografía

•• •• ••

131

H = L / N = (L / 16) × (Wi / tRi)2 La altura de plato teórico tiene unidades de longitud.

6.5.3. Parámetros para describir pares de bandas El factor de separación se utiliza para definir el grado de mezcla de las sustancias contenidas en los picos eluidos. El factor de separación (α1/2) o especificidad de dos bandas adyacentes se define como la razón entre los volúmenes corregidos de elución. La expresión matemática de esta razón es: α1/2 = (tR2 – t0) / (tR1 – t0) y si el flujo es constante, haciendo las transformaciones oportunas se llega a: α1/2 = (VR2 – V0) / (VR1 – V0) = k2 / k1 El factor de separación se calcula siempre con la banda que eluye más tarde en el numerador. Un factor de separación alto nos indica que el centro de los picos está muy alejado y, por lo tanto, que la fase estacionaria retiene más una sustancia que la otra; es por ello que el factor de separación a veces se denomina también especificidad. El factor de separación compara únicamente los factores de carga de las bandas, sin tener en cuenta que los anchos de pico también determinan la calidad de la separación.

El factor de separación es adimensional.

El parámetro que considera estos dos factores (separación y ancho de pico) es la resolución (RS). La resolución se define como la razón entre la diferencia de los volúmenes de retención y la media del ancho de cada pico. Para cualquier par de bandas la expresión matemática que define la resolución es: VR1 – VR2 Rs = ——————— 1 — × (W2 + W1) 2 La resolución cromatográfica es adimensional.

132

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Dos picos se pueden considerar resueltos (no solapados) cuando la resolución sea mayor de 1 (Figura 6.6). Cuando la resolución tiene un valor de 1 se observa como los picos se solapan ligeramente en los extremos (Figura 6.6). Para valores de resolución menores de 1 se producen solapamientos significativos (Figura 6.6). Todos los cálculos de R se hacen de manera que den un valor positivo.

área

2.0 Resolución 0.25 1.5 1.0 0.5

área

2.0 Resolución 0.50 1.5 1.0 0.5

área

2.0 Resolución 0.80 1.5 1.0 0.5

área

2.0 Resolución 1.00 1.5 1.0 0.5

área

2.0 Resolución 1.50 1.5 1.0 0.5 0

1

2

3

4

5

6

7

Tiempo (min)

FIGURA 6.6. Representación esquemática del solapamiento de 2 picos de igual área separados por diferentes factores de resolución. En línea continua se muestra el registro que llegaría al detector (suma de la señal de los dos picos en todo momento). En líneas discontinuas se muestra la descomposición de los dos picos individuales. La zona sombreada corresponde a la zona de solapamiento entre ambos picos.

Introducción a la cromatografía

•• •• ••

133

La resolución está determinada por la fase estacionaria, la fase móvil, la temperatura y la longitud de la columna.

6.5.4. Ejemplo de cálculos de parámetros básicos de cromatografía Vamos a calcular todos los parámetros descritos en las secciones anteriores a los picos B y C del siguiente cromatograma. Se supone que el componente A no interacciona con la fase estacionaria. El flujo es constante a 0.6 mL/min y la columna es de 10 cm de longitud. B

Absorbancia

2.0 1.5

C 1.0 0.5 0.0

A 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Tiempo (min)

Parámetros de bandas individuales TIEMPO Y VOLUMEN MUERTO t0 = 2 min; V0 = 2 min × 0.6 mL/min = 1.2 mL PICO B)

tR = 6 min VR = 0.6 mL/min × 6 min = 3.6 mL; kA = (6-2)/2 = 2.0 W1/2 = 0.2 min W1/2 = 0.2 min × 0.6 mL/min = 0.12 mL W = 1.698 × W1/2= 1.698 × 0.2 min = 0.33 min W = 1.698 × W1/2= 1.698 × 0.12 mL = 0.20 mL

PICO C)

tR = 8 min VR = 0,6 mL/min × 8 min. = 4.8 mL kB = (8-2)/2 = 3.0 W1/2 = 1.2 min W1/2 = 1.2 min × 0.6 mL/min = 0.72 mL

134

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

W = 1.698 × W1/2 = 1.698 × 1.2 min = 2.04 min W = 1.698 × W1/2 = 1.698 × 0.72 mL = 1.22 mL Cálculo de parámetros de eficacia y altura de plato teórico PICO B) N = 16 × (6/0.33)2 = 5300; H = 10/5300 = 0.0019 cm PICO C) N = 16 × (8/2.04)2 = 250; H = 10/250 = 0.04 cm Los parámetros N y H confirman lo que puede deducirse gráficamente, que el pico B es mucho más estrecho y más apto para una separación cromatográfica que el pico C.

Cálculo de parámetros para describir bandas Factor de separación: Resolución:

α1/2 = (8-2) / (6-2) = 1.5 8–6 Rs = ———————— = 1.7 0.5 × (0.33 + 2.04)

7

Tipos de cromatografía de líquidos

CONTENIDO 7.1.

Tipos de cromatografía de líquidos

7.2.

Cromatografía de líquidos de adsorción en fase normal

7.3.

Cromatografía de líquidos de adsorción en fase reversa

7.4.

Cromatografía de líquidos de intercambio iónico

7.5.

Cromatografía de líquidos de exclusión molecular

7.6.

Cromatografía de líquidos quiral

7.7.

Cromatografía de líquidos de afinidad

7.8.

Gradientes en cromatografía de líquidos

7.9.

Efecto de la temperatura sobre la cromatografía de líquidos

7.10. Tamaño de partícula de fase estacionaria

7.1. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS Afinidades del analito por la fase móvil y estacionaria Cuando una muestra entra en contacto con una fase estacionaria cromatográfica las moléculas de analito tienden a establecer un equilibrio: analito (fase móvil)  analito (fase estacionaria) Es decir, las moléculas se reparten entre la fase móvil y la fase estacionaria de acuerdo con sus afinidades relativas. Ello implica que para una molécula de analito con mayor afinidad por la fase móvil que por la fase estacionaria el equilibrio estará más desplazado a la izquierda y viceversa. Es decir, que las diferentes moléculas de analito serán arrastradas por la fase móvil en mayor o menor medida en función 135

136

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

de la posición de este equilibrio. La separación cromatográfica se produce porque el equilibrio se halla en una posición diferente para cada analito, es decir, que cada analito tendrá una movilidad diferente en el sistema y, por lo tanto, eluirá con la fase móvil por orden creciente de afinidad por dicha fase (o decreciente de afinidad por la fase estacionaria). Una molécula tiene una afinidad dada para una fase estacionaria seleccionada y dicha afinidad no cambia a no ser que se cambie el material de la fase estacionaria. Sin embargo, si mantenemos constante la afinidad por la fase estacionaria podemos regular la afinidad por la fase móvil cambiando la composición de esta. Como su nombre indica en la cromatografía de líquidos (LC), la fase móvil es un medio líquido. El gran poder de la LC reside en parte en que es posible utilizar una gran variedad de fases móviles de muy diferentes propiedades físico-químicas y que, por lo tanto, se va a tener un gran poder de regulación de la afinidad de los analitos por la fase móvil. Las técnicas de LC se pueden clasificar atendiendo al tipo de interacciones que se dan entre el analito y la fase estacionaria. Los 3 diferentes tipos de interacciones se presentan en la Figura 7.1. Según esta clasificación, las interacciones pueden ser de adsorción, electrostáticas y de filtración. Dependiendo del propósito final de la cromatografía se habla de cromatografía analítica cuando solo se pretende conocer y cuantificar los componentes de una muestra. En cambio, se habla de cromatografía preparativa cuando la técnica aplicada nos permite, además de conocer y cuantificar los componentes de la muestra, separarlos físicamente. La modalidad preparativa no permite el uso de detectores destructivos, mientras que estos si están permitidos en la modalidad analítica.

Cromatografía de adsorción La adsorción (Figura 7.1A) es el fenómeno por el cual moléculas o iones en fase líquida o gaseosa se retienen sobre la superficie de un cuerpo sólido. Este es un fenómeno muy utilizado y da lugar a varios tipos de cromatografía. Si la fase estacionaria es más polar qua la fase móvil se habla de cromatografía de adsorción en fase normal. En cambio cuando la fase móvil es más polar que la fase estacionaria hablamos de cromatografía de adsorción en fase reversa. La cromatografía de adsorción normal se utiliza casi exclusivamente con fines preparativos, mientras que la cromatografía de adsorción en fase reversa se utiliza con fines preparativos y analíticos. En todos estos casos la separación cromatográfica se debe a interacciones entre analitos y fase estacionaria reguladas por polaridad. Otro tipo de cromatografía de adsorción es la cromatografía quiral, donde la fase estacionaria presenta grupos quirales e interacciona de manera diferente con los diferentes estereoisómeros de los analitos.

Tipos de cromatografía de líquidos

A

B

•• •• ••

137

C

+ -

+ + +

-

+ + +

-

+ + + +

FIGURA 7.1. Mecanismos de interacción entre analito y fase estacionaria más utilizados actualmente en cromatografía de líquidos: adsorción (A), intercambio iónico (B) y exclusión molecular (C).

Cromatografía de intercambio iónico Otro tipo de interacción en LC es la interacción iónica (Figura 7.1B). En estos casos, la fase estacionaria es una resina (natural o artificial) que contiene cargas en su superficie y la cromatografía se denomina de intercambio iónico. Existen resinas cargadas positivamente (de intercambio aniónico) y resinas cargadas negativamente (de intercambio catiónico). Las cargas de las resinas pueden interaccionar con cargas de signo opuesto de los analitos. Estas interacciones provocan que el analito cargado con el signo opuesto al de la resina sea retenido y, por lo tanto, se separe del resto de analitos sin carga o con carga del mismo signo que la resina. Tras la retención los analitos se separan de la resina cambiando las condiciones de la fase móvil para dificultar o impedir la atracción iónica. La cromatografía de intercambio iónico se utiliza con finalidades preparativas (por ejemplo, en la purificación de proteínas) y analíticas (por ejemplo, en la determinación de aminoácidos e iones inorgánicos).

Cromatografía de filtración en gel Las fases estacionarias de filtración en gel (o exclusión molecular) (Figura 7.1C) son sólidos con unos poros de un determinado diámetro. Las moléculas de analito pueden atravesar la fase estacionaria por dentro de estos poros en función de su tamaño. Así, moléculas de tamaño menor que el del poro lo atravesarán siguiendo un determinado camino. Moléculas de tamaño mayor que el del poro no podrán atravesarlo y seguirán un camino mucho más corto que las moléculas que si lo hagan. En este caso, estas moléculas serán excluidas del gel y eluirán con el volumen muerto de la columna. Por debajo de este tamaño de exclusión existirá una graduación que hará

138

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

que los caminos sean mayores cuanto menor sea el tamaño de la molécula. Esto originará tiempos de elución diferentes y, por lo tanto, separación de las moléculas de analito sobre la base de su tamaño.

Cromatografía de afinidad Algunas técnicas de separación de biomoléculas reciben el nombre de cromatografía de afinidad cuando la cromatografía está basada en interacciones muy específicas entre el analito y la fase estacionaria. Estas interacciones pueden ser del tipo antígeno-anticuerpo, enzima-inhibidor, enzima-sustrato, avidina-biotina, etc. Las interacciones que se dan pueden ser electrostáticas, de adsorción, formación de enlace covalente, etc. Esto hace que sea difícil clasificar la cromatografía de afinidad dentro de alguno de los apartados anteriores.

Cromatografía de reparto Otro tipo de interacción es la que se da en la cromatografía de reparto. En este caso, la fase estacionaria es un líquido inmiscible con la fase móvil que queda retenido en un soporte sólido (por ejemplo agua en cromatografía en papel). Los analitos se reparten entre las fases móvil y estacionaria de acuerdo a sus solubilidades relativas. Esto convierte la cromatografía de reparto en una sucesión de extracciones líquidolíquido. Este tipo de cromatografía es importante históricamente, ya que fue de los primeros que se desarrolló (véase capítulo 6, sección 2). Sin embargo, hoy en día está prácticamente en desuso a causa de que sus prestaciones se ven superadas por las de las cromatografía de adsorción. Es por ello que no nos ocuparemos de la cromatografía de reparto en este libro. En las próximas secciones describiremos en detalle las características principales de la cromatografía de adsorción, de intercambio iónico, de exclusión molecular y de afinidad, así como sus aplicaciones y modalidades de trabajo.

7.2. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ADSORCIÓN EN FASE NORMAL Los primeros experimentos cromatográficos descritos por Twsett estaban basados en la separación mediante cromatografía de adsorción en fase normal y es por tanto, la forma cromatográfica más antigua. Es una técnica que se aplica mayoritariamente en placa, dando lugar a la cromatografía en capa fina, de la que hablaremos específicamente más adelante. También suele utilizarse en columna abierta, aunque en esta configuración se destina mayoritariamente a cromatografía preparativa.

Tipos de cromatografía de líquidos

•• •• ••

139

Las fases estacionarias de LC de adsorción en fase normal son polímeros inorgánicos con una gran área superficial. Los materiales más comunes son óxidos de silicio hidratados (gel de sílice) o polímeros de óxido de aluminio hidratados (alúmina). Antiguamente también se utilizaba carbón activo, aunque hoy en día esta fase estacionaria está prácticamente en desuso. Actualmente se pueden adquirir comercialmente fases estacionarias con una gran variedad de tamaño de partícula (desde unas pocas micras hasta aproximadamente 1 mm). La Figura 7.2 representa una partícula de gel de sílice. Los iones de silicio presentan diferentes grados de hidratación. Los oxígenos superficiales se hallan en diferentes niveles de protonación dependiendo del pH (en la figura se observan varios oxígenos desprotonados). A su vez, el estado de protonación va a condicionar también la carga superficial de la partícula. Ambas formas químicas de los oxígenos superficiales (protonada y desprotonada) van a tener interacciones de tipo polar y/o electrostático con los analitos de la muestra. Por tanto, la capacidad separadora del gel de sílice va a depender de la densidad superficial de hidroxilos y de su carga. La capacidad separadora se va perdiendo con el uso, ya que los enlaces Si-O se hidrolizan en medio básico. El silicio se elimina en forma de ácido silícico hidratado (ver parte inferior derecha de la Figura 7.2). Ello obliga a utilizar muestras de pH ácido o neutro. En la cromatografía en fase normal, la fase sólida es más polar que la fase móvil. Con ello queremos decir que los enlaces de la fase estacionaria presentan un momento dipolar mayor que los enlaces de las moléculas de disolvente. En cromatografía en fase normal la polaridad del disolvente es el principal factor que determina los volúmenes de elución. Como ya ha quedado establecido en LC de ad-

HO

H OH

O

H

O Si

O Si Si

O

O

O

HO Si

Si O Si

OH

O O

O

H

Si

O

Si

Si -O

Si

OH

O

O

O O-

O

Si O

O Si Si

Si

O O-

O-

FIGURA 7.2. Partícula de gel de sílice.

Si O

OH

140

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

sorción, la mayor o menor retención de las moléculas de analito irá en función de la mayor o menor afinidad por las moléculas de fase estacionaria. Como la fase estacionaria tiene carácter polar, los analitos serán más retenidos cuanto mayor sea su polaridad. A su vez, independientemente de esta afinidad por la fase estacionaria, todos los analitos eluirán mejor cuanto mayor sea la polaridad de la fase móvil. La explicación es simple. Como los analitos están retenidos por interacciones polares, los disolventes más polares competirán mejor por el analito que los menos polares.

Con disolventes más polares los analitos se mueven más rápidamente y eluyen antes de fases estacionarias de adsorción en fase normal.

En LC de adsorción, la elución está basada en un aumento de la afinidad del analito por el disolvente, no en una disminución de afinidad por la fase estacionaria. Ello implica que no es posible cambiar el orden relativo de elución de un conjunto de analitos, ya que siempre eluirán primero los menos polares y se retendrán más los más polares. Solo es posible acelerar o retardar la elución aumentando o disminuyendo la separación entre ellos. El conocimiento del grado de polaridad de los disolventes ayudará en el desarrollo de los análisis de LC de adsorción en fase normal. Por ejemplo, si la elución es lenta, se puede buscar una fase móvil más polar para acelerarla. Los listados que clasifican los disolventes en una relación basada en la capacidad de eluir solutos de la fase estacionaria se denominan series elutrópicas. La Tabla 7.1 muestra una serie elutrópica para la alúmina. Como se puede comprobar, el orden de los disolventes en las series elutrópicas es parecido al de polaridad de sus moléculas. Por lo tanto, el agua presenta el valor más alto en la lista. El agua es capaz de unirse (y por lo tanto bloquear) los grupos hidroxilos que causan las separaciones. Por lo tanto, al unirse con tanta fuerza a los centros activos, se produce el desplazamiento de los analitos adheridos. El problema es que dado que el agua es el disolvente más polar conocido, no es posible eliminar el agua con otro disolvente, por lo tanto, la partícula de sílice queda desactivada. La única manera de recuperar los centros activos es evaporando el agua que los bloquea. Para ello la fase estacionaria se debe calentar a unos 120 °C durante varias horas. El hecho de que el gel de sílice se disuelva a determinados pHs, junto con el todavía más importante hecho de que el agua bloquea los centros activos, justifica totalmente la necesidad de que se utilicen fases móviles con disolventes muy secos (carentes de agua), para así alargar la vida de la columna. El uso de disolventes secos, además de alargar la vida útil de la fase estacionaria, también contribuye notablemente a mejorar la reproducibilidad de los experimentos.

Tipos de cromatografía de líquidos

•• •• ••

141

TABLA 7.1. Serie elutrópica para la alúmina e0 (*)

Disolvente

e0 (*)

Pentano

0.00

Dicloruro de etileno

0.49

Éter de petróleo

0.01

Metil etil cetona

0.51

Hexano

0.01

Dioxano

0.56

Ciclohexano

0.04

Acetona

0.56

Tetracloruro de carbono

0.18

Acetato de etilo

0.58

Xileno

0.26

Dimetilsulfóxido

0.62

Tolueno

0.29

Acetonitrilo

0.65

Clorobenceno

0.30

Piridina

0.71

Benceno

0.32

iso-Propanol

0.82

Éter etílico

0.38

n-Propanol

0.82

Cloroformo

0.40

Metanol

0.95

Cloruro de metileno

0.42

Ácido acético

1.00

Tetrahidrofurano

0.45

Agua

Disolvente

Superior

(*) Parámetro e0 (fuerza del disolvente) para soportes de alúmina.

En los últimos años se han desarrollado fases estacionarias modificadas químicamente. Son moléculas de gel de sílice a las que se les han unidos radicales químicos en los hidroxilos que formaban los centros activos. Estas fases estacionarias modificadas presentan una mayor resolución que la del gel de sílice o alúmina no modificada y están desplazando a estas. Las interacciones entre fase estacionaria modificada de LC de adsorción en fase normal y analito son las mismas que con fases estacionarias no modificadas, por lo tanto, los factores que determinan elución y retención son también similares. Estas fases estacionarias son las mismas que se describieron en la sección 2.6.8 para separaciones en minicolumnas de extracción por interacciones polares. La Tabla 2.4 muestra las estructuras químicas más utilizadas en LC de adsorción con fase normal modificada. Esta modalidad de cromatografía se utiliza casi exclusivamente con técnicas de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).

142

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

7.3. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ADSORCIÓN EN FASE REVERSA La LC de fase reversa deriva de la LC de adsorción en fase estacionaria normal modificada. En el caso de la cromatografía de fase reversa, el radical químico unido a la partícula de sílice es menos polar que la fase estacionaria. Básicamente, los radicales unidos al soporte de gel de sílice son cadenas hidrocarbonadas alifáticas o aromáticas de diferente longitud. La cadena de dieciocho átomos de carbono (C18) es la más popular. La cromatografía en fase reversa suele producir picos muy agudos y simétricos, además de que puede separan analitos de un amplio rango de polaridad, por lo que es una técnica muy utilizada. La cromatografía en fase reversa suele aplicarse en HPLC con fines analíticos. Las fases estacionarias utilizadas en fase reversa son las mismas que se describieron en el Capítulo 2.6.8 dedicado a las extracciones en minicolumnas basadas en interacciones apolares. Las estructuras de las fases estacionarias más utilizadas en cromatografía de fase reversa se muestran en la Tabla 2.4. El hecho de que la fase estacionaria esté formada por cadenas carbonadas apolares implica que la separación cromatográfica se producirá de acuerdo con la mayor o menor afinidad de las moléculas de analito con los enlaces C-H de las cadenas carbonadas de fase estacionaria. Por lo tanto, las moléculas de analito más apolares serán más retenidas por la fase estacionaria, al contrario que las moléculas más polares, que serán poco retenidas. También contrariamente a lo que ocurre en LC de fase normal, las fases móviles tienen un mayor poder de elución al disminuir su polaridad. En LC de absorción en fase reversa los analitos eluyen más lentamente cuanto mayor es la polaridad de la fase móvil.

Las fases móviles utilizadas en LC de fase reversa son mezclas acuosas con diferentes porcentajes de modificadores orgánicos miscibles con agua. Los modificadores más utilizados son acetonitrilo, metanol ,etanol, alcohol isopropílico, etc. La apolaridad del medio aumenta (y con ella la fuerza de elución) aumentando la proporción del modificador orgánico. La Figura 7.3 muestra un ejemplo de una muestra que contiene el carbamato carbaryl (pico 1) y su producto de hidrólisis 1-naftol (pico 2) analizada con la misma columna en condiciones cromatográficas idénticas pero cambiando el porcentaje de metanol. Como se observa, al disminuir la polaridad del medio (al aumentar la concentración de metanol) se acortan los tiempos de elución. Esto se produce como consecuencia de que la fase móvil tiene más facilidad para romper las interacciones apolares entre los analitos y la fase estacionaria.

Tipos de cromatografía de líquidos

•• •• ••

143

A: 40% metanol

0.3 0.2 (1)

0.1

(2)

0.0 B: 60% metanol

0.3 0.2 (1)

0.1

(2)

0.0 C: 65% metanol

0.3 0.2 Absorbancia 280 nm

(1)

(2)

0.1 0.0 D: 70% metanol

0.3 0.2

(1)

(2)

0.1 0.0 E: 75% metanol

0.3 (1) (2)

0.2 0.1 0.0 0.3

F: 80% metanol

(1)(2)

0.2 0.1 0.0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

Tiempo (min)

FIGURA 7.3. Efecto de la polaridad de fase móvil sobre las separaciones cromatográficas en fase reversa. En todos los casos se inyectaron 10 μL de una muestra de carbaryl 500 μM (pico 1) y 1-naftol 500 μM (pico 2). El flujo fue de 1 mL/min de una mezcla de tampón acético-acetato 0.5 M pH 3.3 más metanol. La concentración de metanol se indica en cada caso. La columna fue de C18 LiChrospher de 5 μm de tamaño de partícula, 12.5 cm de longitud y 4 mm de diámetro interno.

144

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Al aumentar la polaridad del medio (disminuir la concentración de metanol) se observa que, además de aumentar los tiempos de elución, también se aumenta la separación entre las bandas (Figura 7.3). Otro efecto relacionado con el aumento de polaridad de la fase móvil es el ensanchamiento de los picos y el aumento de la resolución (Tabla 7.2). TABLA 7.2. Parámetros básicos de los cromatogramas de la Figura 7.3

% metanol

Ancho de pico carbaryl (min)

Ancho de pico 1-naftol (min)

Resolución

40

0.40

0.48

9.6

60

0.32

0.39

9.0

65

0.25

0.28

7.8

70

0.19

0.21

6.4

75

0.15

0.16

4.5

80

0.12

0.13

3.3

Obsérvese en la Figura 7.3 como el ensanchamiento de los picos provoca una disminución de la altura de los mismos. Sin embargo, el área total se mantiene constante e independiente de la cantidad de metanol utilizada. Al igual que en la LC en fase normal, la LC de fase reversa basa el poder de elución en modificar la afinidad de los analitos por la fase móvil, no en modificar la afinidad por la fase estacionaria. Como consecuencia de ello, no se puede alterar el orden de elución de analitos en una muestra. Es decir que, como se observa en la Figura 7.3, el carbaryl (pico 1) siempre eluye antes que el 1-naftol (pico 2), independientemente de la polaridad de la muestra.

Efecto del pH: alteración de la polaridad del analito Debe tenerse en cuenta que el pH de la fase móvil puede alterar la forma química del analito (es decir, puede alterar el estado de protonación y por tanto su carga). En este caso, como consecuencia del cambio de especie química del analito, se estaría también alterando su afinidad por la fase estacionaria. La Figura 7.4 muestra los cromatogramas de una muestra que contiene fenol (pico 1) y 4-nitrofenol (pico 2) 500 μM analizada con fases móviles de diferente pH. En el

•• •• ••

Tipos de cromatografía de líquidos

0.100

145

A

(2) Absorbancia 280 nm

0.075 0.050 0.025 (1)

0.000 0.100

B (2)

0.075 0.050

(1)

0.025 0.000 0

2

4

6

8

Tiempo (min)

FIGURA 7.4. Efecto del pH sobre cromatografía de fase reversa. Se inyectaron 10 μL de una mezcla de fenol (pico 1) y de 4-nitrofenol (pico 2) 500 μM.El flujo fue de 1 mL/min. La fase móvil fue una mezcla isocrática de 45% metanol + 55% tampón acuoso pH 3.3 (A) o 7.4 (B). La columna fue C18 Spherisorb ODS-2 de 25 cm de longitud, 4 mm diámetro interno y 5 μm de tamaño de partícula.

cromatograma A (pH 3.3) ambos compuestos están protonados (sin carga) y el fenol eluye antes que el 4-nitrofenol porque tiene menos afinidad por la fase estacionaria de C18. Las interacciones más importantes se producen entre el anillo bencénico del analito y la cadena hidrocarbonada de la fase estacionaria. El grupo nitrofenol produce unas interacciones adicionales a las del fenol que hacen que se retenga algo más que este. En el cromatograma B (pH 7.4) el 4-nitrofenol ha eluido antes que el fenol. A este pH, el 4-nitrofenol posee el grupo alcohol desprotonado, es decir con carga negativa, mientras que el fenol continúa en la misma forma química que a pH 3.3. Como consecuencia de esta nueva situación, el fenol mantiene aproximadamente constante su tiempo de retención, mientras que el p-nitrofenol eluye antes que a pH 3.3 porque la carga negativa introduce interacciones de repulsión entre la fase estacionaria y el compuesto. El aumento de velocidad de elución del p-nitrofenol ha supuesto que eluya antes que el fenol.

No es posible alterar el orden de elución de los analitos sin alterar su afinidad por la fase estacionaria.

146

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Efecto de la longitud de la cadena de la fase estacionaria Las cadenas hidrocarbonadas unidas al soporte de sílice que forman la fase estacionaria pueden ser de diferente longitud. Las más comunes son las denominadas C18

(1)

Absorbancia

(2) (3) (4)

C8

(1) (2) Absorbancia

(4) (3)

C1

(4)

Absorbancia

(1)(2) (3)

0

5

10

15

20

Tiempo de elución (min)

FIGURA 7.5. Efecto de la longitud de la cadena hicrocarbonada de la fase estacionaria de fase reversa sobre los tiempos de retención. En todos los cromatogramas se utilizó una fase móvil isocrática metal/agua 50/50 con un flujo de 1 mL/min. La detección se realizó a 280 nm. Identificación de los picos: (1) fenol; (2) acetofenona; (3) benzoato de metilo y (4) tolueno.

Tipos de cromatografía de líquidos

•• •• ••

147

C18 , aunque las C8 son también bastante utilizadas. Existen en el mercado fases estacionarias de cadenas de menos de 8 carbonos, aunque su uso no es tan frecuente como el de C18 y C8. Cuanto más larga sea la cadena hidrocarbonada son posibles un mayor número de interacciones con el analito y por lo tanto se aumentan los tiempos y volúmenes de elución. Como se observa en la Figura 7.5, al disminuir la longitud de la cadena de carbonos los tiempos de elución se acortan progresivamente.

7.4. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE INTERCAMBIO IÓNICO En capítulos y secciones anteriores se ha descrito que existen fases estacionarias que poseen elementos con carga eléctrica en su superficie. Estos elementos cargados pueden unirse mediante interacciones electrostáticas a elementos de carga opuesta, separándose así de los componentes de la mezcla neutros o con carga del mismo signo que la fase estacionaria. Las fases estacionarias de cromatografía de intercambio iónico se denominan resinas de intercambio iónico. En la Tabla 2.4 se puede observar las estructuras de las resinas de intercambio iónico más utilizadas. Los cationes se intercambian en fases estacionarias con cargas negativas (resinas de intercambio catiónico). De manera similar, los aniones se intercambian con fases estacionarias con cargas positivas (resinas de intercambio aniónico). En el mercado existen resinas de intercambio iónico para ser aplicadas en columna abierta de baja presión y en HPLC. Los procesos de cromatografía de intercambio iónico son muy similares a los descritos en el Capítulo 2.6.6 dedicado a la extracción en fase sólida por interacciones iónicas. Los procesos típicos se suelen dividir en 5 etapas diferenciadas: 1) Equilibrado. Dado que la composición iónica de la disolución va a ser muy importante, en primer lugar se debe dedicar un tiempo al equilibrado de la fase estacionaria. Es decir, se ha de conseguir que la composición de la fase móvil introducida en la columna sea idéntica a la composición que sale de ella. El equilibrado se realizará con una fase móvil de baja fuerza iónica, a un pH tal que los grupos iónicos de la resina y de los analitos estén cargados y en ausencia de iones que puedan bloquear las cargas de la fase estacionaria. 2) Paso de los analitos en la columna. Una vez equilibrada la columna, la muestra se introduce en esta. La muestra debe estar en un medio tal que los analitos estén cargados. La muestra pasa por la columna arrastrada por la fase móvil con que se haya realizado el equilibrado de la columna y los analitos con la carga apropiada se retienen en la fase estacionaria. Dado que los analitos están retenidos en la fase estacionaria por una interacción relativamente fuerte, no hay peligro de elución hasta que no se cambien las condiciones de la fase estacionaria, por lo que es convenien-

148

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

te, después de pasar la muestra, lavar la columna con la misma fase móvil utilizada en el equilibrado. 3) Elución. Cuando la nuestra ha pasado por la columna los analitos quedan retenidos en ella. Para eluirlos, se pueden seguir las mismas estrategias mostradas en la Figura 2.19. Básicamente se trata de romper las interacciones electrostáticas entre el analito y la fase estacionaria. Para ello se puede aumentar la fuerza iónica de la fase móvil, o bien cambiar el pH para que el analito y/o fase móvil pierdan su carga, o añadir al medio altas concentraciones de un contraión que tenga afinidad por la fase estacionaria y sea capaz de desplazar al analito. También se puede aplicar cualquier combinación entre estas tres estrategias. 4) Equilibrado. Una vez eluidos los analitos se puede volver a repetir el paso 1 para tener la fase estacionaria lista para el siguiente cromatograma. 5) Regenerado. Tras varios cromatogramas las resinas de intercambio iónico pierden resolución y reproducibilidad. Este es debido a que normalmente los procesos de elución no son capaces de liberar totalmente todos los centros activos de la resina de los iones que tiene unidos. Por lo tanto, es necesario un tratamiento enérgico que limpie todos los iones retenidos y devuelva la fase estacionaria a su estado original. Este tratamiento se denomina regenerado y suele consistir en lavar las fases estacionarias de intercambio aniónico con disoluciones concentradas de NaCl o KOH y las de intercambio catiónico con disoluciones concentradas de HCl o KNO3. El tratamiento de regenerado se aplica solo cuando es necesario, en función del estado en que se encuentre la resina intercambiadora. Cuando la cromatografía de intercambio iónico se aplica por HPLC las etapas 2 y 3 se suelen aplicar simultáneamente. Es decir que, tras el equilibrado, se inyecta la muestra en unas condiciones que favorezcan la unión de los analitos. A la vez, se aplica un gradiente que cambia el disolvente, aumentando con el tiempo las condiciones de fase móvil que favorezca la elución (es decir, aumentando la fuerza iónica o cambiando el pH en la dirección apropiada). Dado que los sistemas de HPLC son automatizados, normalmente, tras cada cromatograma, se suele realizar una pequeña operación de regeneración consistente en aumentar drásticamente las condiciones de fase móvil que favorezcan la elución de analitos. La Figura 7.6 muestra un proceso como el descrito en el párrafo anterior. En este caso se inyectó en un sistema de HPLC con una columna de DEAE una muestra de suero de conejo previamente purificado por otras técnicas. El flujo fue de 1 mL/min de Tris 10 mM pH 7.0 con un porcentaje de NaCl 1M creciente desde 0 al 40% en 15 minutos. Obsérvese como las proteínas eluyen con concentraciones de cloruro sódico de entre el 20 y el 40%. Cuando dejan de eluir proteínas, la concentración de NaCl se aumenta súbitamente para regenerar la columna. El cromatograma no muestra el proceso de equilibrado, ya que durante este tiempo no se suele registrar la absorbancia por carecer de interés analítico.

Tipos de cromatografía de líquidos

0.25

149

40

0.15

30

0.10 20

Na Cl 1 M (% )

50

0.20 A280nm

•• •• ••

0.05 10 0.00 0 6

9

12

15

Volumen (ml)

FIGURA 7.6. Ejemplo de cromatograma de intercambio aniónico en HPLC.

El intercambio iónico puede ser útil cuando se aplica en suspensión sobre muestras parcialmente purificadas. Si tenemos una muestra donde sabemos que solo un analito tiene carga, podemos tratar la muestra con fase estacionaria simplemente depositando la resina en la muestra y agitando suavemente. Como solo nuestro analito se une a la fase estacionaria, transcurrido un tiempo se puede centrifugar la mezcla y precipitar la resina con el analito unido, que de esta manera se separa del resto de la muestra. A continuación se lava el gel con un pequeño volumen de disolución de composición apropiada y así el analito queda aislado de manera sencilla, eficaz y rápida.

Cromatografía iónica Una aplicación especial de la cromatografía de intercambio iónico es la denominada cromatografía iónica, que permite determinar iones metálicos y pequeños iones orgánicos. La cromatografía iónica se aplica casi exclusivamente en la modalidad de HPLC y utiliza columnas de intercambio iónico normal, aunque a la salida de la columna y antes de llegar al detector de conductividad se debe acoplar un equipo especial denominado supresora de iones. La Figura 7.7 y la Tabla 7.3 muestran un ejemplo de cómo esta técnica permite separar 24 aniones orgánicos e inorgánicos diferentes en un solo cromatograma. La cromatografía iónica implica dos procesos de intercambio iónico. El primero se da en la columna y genera la separación de los analitos como ya se ha explicado. El segundo se da en la supresora de iones y tiene por finalidad disminuir la conducti-

150

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

(22)

(8)

(17)

μS

(7)

(19)

(2)

(21) (12) (13) (14)

(9)

(4)

(18) (23)

(11) (15) (1)

(5) (6)

(20)

(16)

(24)

(10)

(3)

0

2

4

6

8

10

12

14

Volumen de elución (mL)

FIGURA 7.7. Cromatograma de intercambio iónico mostrando la identificación de 26 aniones. Columna Dionix Ion Pac AS 11. Fase móvil 1: Agua desionizada; fase móvil 2: NaOH5 mM; fase móvil 3: NaOH 100 mM. Flujo: 2 mL/min. Composición fase móvil: 90% eluyente 1-10% eluyente 2 durante 2 minutos, a continuación se aplica gradiente lineal hasta alcanzar 100% de eluyente 2 en 3 minutos; finalmente gradiente lineal para alcanzar 65% de eluyente 2 con 35% de eluyente 3 en 10 minutos.

TABLA 7.3. Identificación de los picos del cromatograma de la Figura 7.7 1. Metilfosfonato

9. Triluoroacetato

17. Pftalato

2. Fluoruro

10. Bromuro

18. Fosfato

3. Propionato

11. Clorato

19. Cromato

4. Metilsulfonato

12. Carbonato

20. Citrato

5. Piruvato

13. Malonato

21. Tricarbalilato

6. Valerato

14. Sulfato

22. Isocitrato

7. Cloruro

15. Centomalonato

23. cis-Aconitato

8. Nitrito

16. Wolframato

24. trans-Aconitato

vidad de la fase móvil para así poder medir con mejor sensibilidad la conductividad debida a los iones que eluyen de la columna. Este proceso se denomina supresión. Como el disolvente utilizado en la cromatografía iónica es siempre agua desionizada, el límite de detección de un detector de conductimetría estará muy condicionado (entre otros factores) por el ruido de fondo de la conductividad de los iones que causan la disociación de los analitos de la columna.

•• •• ••

Tipos de cromatografía de líquidos

151

El cuadrado grande de la Figura 7.8 muestra el proceso de supresión. La supresión consta de dos reacciones diferentes que se dan simultáneamente. En una de ellas los iones hidroxilo se neutralizan dando agua. En la otra los iones Na+, que proceden del NaOH utilizado para eluir los analitos, se sustituyen por protones. Cuando se neutralizan los iones hidroxilo se reduce significativamente la conductividad de fondo de la disolución, mientras que la substitución de sodio por protones ayuda a no alterar el número total de cargas de la disolución. A ambos lados del flujo de eluyente hay membranas que tienen unidos covalentemente iones con cargas negativas. La presencia de estas cargas hace que solo sean permeables a iones positivos e impermeables a los negativos. El ánodo se sitúa en el compartimiento izquierdo de la cámara supresora y oxida el agua que fluye generando oxígeno y protones. Los dos protones generados por cada molécula de agua oxidada atraviesan la membrana incorporándose a la corriente de eluyente que viene de la columna. Una vez dentro de esta zona, uno de los protones reacciona inmediatamente con un ion hidroxilo neutralizándolo y generando una molécula de agua. De esta manera se consigue eliminar iones hidroxilo del medio. El segundo protón sirve como contraión a los analitos que fluyen de la columna (iones X– en la Figura 7.8). Los iones sodio que provienen de la columna atraviesan la membrana derecha, donde se incorporan a una corriente de agua de pH básico que se genera 1) Muestra: X– = Cl–, Br– y otros aniones 2) Eluyente: Na+OH–

- OH X - OHX - Columna OH- XXde OH - OH intercambio X - abiónico X X- -OH X X X OH OH

Eluyente Na+X– en Na+OH– Desagüe H2O, O2

Desagüe H+

OH

–

H2O Supresora

Detector de conductividad

4H + + O2 2H2O + ánodo H2O

H+

X

–

Na+ Na

+

H2O, H2, Na+OH– H + + OH – H2O

H+ X – H+ X –

cátodo

H2O

H2O

Hacia el detector Cromatograma

FIGURA 7.8. Equipo cromático necesario para cromatografía iónica. El cuadrado muestra el proceso que se da en la supresora que se sitúa entre la columna y el detector de conductividad.

152

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

por reducción de agua en el cátodo. Los iones sodio se eliminan de la corriente que fluye hacia el desagüe. Cromatografía de pares iónicos La cromatografía de pares iónicos es una modalidad de cromatografía de intercambio iónico que se aplica sobre una columna de fase reversa y que está especialmente indicada para analizar compuestos iónicos de elevada polaridad como detergentes y algunos fármacos. Así, hablamos de cromatografía de pares iónicos cuando se hace fluir fase móvil que contiene iones a través de columnas de fase reversa (por ejemplo C18). Los iones han de tener una larga cadena hidrocarbonada para quedar adsorbidos sobre los centros activos de las fases estacionarias reversas. Así, para intercambio catiónico, se suele utilizar ácido hexanosulfónico (C6H13SO3– H+) y para intercambio catiónico, hidróxido de tetrapropilamonio ((C3H7)4N+OH–). Las cadenas de hexilo, en el primer caso, y de propilo, en el segundo, van a tener una alta afinidad por la fase estacionaria de las columnas de C18 y van a quedar adheridas a ella, dejando los grupos iónicos libres para realizar un intercambio iónico como los comentados anteriormente. Ajustando apropiadamente las concentraciones del ion se puede conseguir que no todos los centros activos se bloqueen y, de esta manera, obtener una columna mixta de intercambio iónico y de fase reversa. Cuando se desea regenerar las propiedades originales de fase reversa, la columna se lava con metanol para eluir los iones adheridos a la fase estacionaria de fase reversa.

7.5. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE EXCLUSIÓN MOLECULAR Las separaciones cromatográficas descritas hasta el momento se basan en interacciones químicas entre los átomos de las moléculas de fase estacionaria y los de analito. Sin embargo, existe otro tipo de técnica de LC que no está basada en la interacción química entre átomos. Es una separación que recibe el nombre de LC de exclusión molecular y está basada en la filtración de las moléculas de analito en un lecho tamiz poroso. Esta técnica recibe también el nombre de filtración en gel o permeabilidad en gel. Como muestra la Figura 7.1 C, la fase estacionaria es un material poroso compuesto de unas pequeñas partículas huecas de un tamaño interno determinado y aproximadamente constante. Las moléculas de analito contactan con la fase estacionaria; las que sobrepasen un determinado tamaño no podrán ser filtradas a través de la fase estacionaria, por lo que no interaccionarán y saldrán de la columna con el volumen muerto. Las moléculas por debajo de un determinado tamaño sí interaccionan con la

Tipos de cromatografía de líquidos

•• •• ••

153

fase estacionaria y la atraviesan, por lo que recorren un camino mayor que las excluidas y por lo tanto eluyen más tarde. El camino que recorran las moléculas de analito será mayor cuanto menor sea el tamaño de la molécula, lo que ocasionará que las moléculas menores eluyan más tarde (Figura 7.9). Por debajo de un determinado tamaño, las moléculas son tan pequeñas que atraviesan la fase estacionaria sin interaccionar con ella, por lo que todas eluyen en el mismo volumen ya que, al no interaccionar con la fase estacionaria, todas recorren el mismo camino, independientemente de su tamaño.

FIGURA 7.9. Exclusión molecular en columna abierta.

El camino que recorren las moléculas (y, por lo tanto, el volumen de elución) es proporcional al logaritmo del peso molecular (y por lo tanto está muy relacionado con el tamaño de la molécula). De este modo, es posible calibrar las columnas de cromatografía de exclusión molecular con analitos de peso molecular conocido. Utilizando la representación del logaritmo del peso molecular frente a volumen de elución (Figura 7.10) podemos interpolar el volumen de elución de nuestro analito y, de esta manera, estimar su peso molecular.

Puede ver una animación sobre una separación cromatográfica de exclusión molecular en: http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/animations/gel.mov (Página activa en julio de 2004.)

154

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

6.5 6.0

(2) (1)

Log (Pm)

5.5 5.0

(4)

(3)

4.5

(5)

(6)

4.0 3.5 3.0 2.5

(7) 6

8

10

12

14

16

Velución (mL)

FIGURA 7.10. Ejemplo de calibrado de una fase estacionaria de exclusión molecular de Superdex 75™. Los puntos corresponden a la elución de: tiroglobulina (1), ferritina (2), inmunoglobulina G humana (3), transferrina humana (4), ovoalbúmina (5), mioglobina (6) y Vitamina B12 (7).

Dado que las fases estacionarias no responden a formas químicas específicas, normalmente las fases estacionarias se conocen con el nombre comercial que le otorga la empresa fabricante acompañado de un número (por ejemplo Superdex 75™, Superdex 200™, Sephadex G-10™, Sephadex G-100™, etc.). El número suele estar relacionado (aunque no directamente) con el límite superior de exclusión. Existe una gran variedad de fases estacionarias de exclusión molecular (tanto para HPLC como para columna abierta) que cubren un amplio intervalo de pesos moleculares. Sin embargo, cada fase estacionaria presenta un intervalo relativamente estrecho de pesos moleculares que es capaz de discriminar (en el caso de la Figura 7.10, entre 1.4 y 669 kDa). También se comercializan las denominadas columnas de lecho mixto. Son columnas empaquetadas con mezclas de diversas fases estacionarias en proporciones cuidadosamente seleccionadas. Estas columnas de lecho mixto aumentan el rango de discriminación de pesos moleculares entre 1 y 10000 KDa.

7.6. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS QUIRAL Los isómeros son compuestos químicos con la misma composición molecular pero diferente estructura espacial. Los isómeros quirales o estereoisómeros son moléculas isómeras que tienen los mismos enlaces pero con diferente orientación espacial. Dado que los isómeros tienen la misma estructura molecular no existen diferencias

Tipos de cromatografía de líquidos

•• •• ••

155

físico-químicas (misma polaridad, mismo número de cargas, mismo peso molecular) entre ellos que permitan una separación cromatográfica según las técnicas descritas hasta el momento y, por lo tanto, se ha de recurrir a técnicas especiales. La separación de enantiómeros se realiza normalmente utilizando su interacción diferencial con reactivos quirales. Para ello existen dos estrategias: 1) Añadir a la fase móvil un reactivo quiral. El reactivo quiral añadido reacciona de manera diferente con uno de los estereoisómeros, permitiendo que se produzca la separación sobre una fase estacionaria aquiral. 2) Unir un reactivo quiral a la fase estacionaria. De este modo la interacción diferencial se produce en la misma fase estacionaria. Esta es una modalidad que se aplica casi exclusivamente en HPLC y, en algunos casos, en cromatografía de gases. La separación quiral es bastante importante en Toxicología, Ciencias Ambientales y Farmacología, ya que los diferentes isómeros de una molécula suelen tener diferentes propiedades tóxicas, biológicas o farmacológicas. Un ejemplo de esto lo representa la Figura 7.11, donde se muestra una separación quiral de los isómeros del insecticida organofosforado O-hexil O-2.5-diclorofenil fosforamidato (HDCP). Los dos isómeros de este compuesto tienen propiedades tóxicas y rutas de metabolización muy diferentes que no pudieron ser demostradas hasta que no se dispuso de la técnica cromatográfica apropiada para separar los isómeros R y S de HDCP. HDCP mezcla racémica

R-HDCP

S-HDCP

5

10

Tiempo (min)

FIGURA 7.11. Ejemplo de separación quiral de isómeros de O-hexil O-2.5 diclorofenil fosforamidato (HDCP) por HPLC. En el cromatograma superior se inyectaron 100 μL de HDCP racémico 10 mM. Los cromatogramas inferiores corresponden al R-HDCP y al S-HDCP purificados y colectados tras la inyección de mezcla racémica. En los tres casos se empleó una fase móvil de hexano (60): 1.5-dicloroetano (30): etanol (10) y una columna Techocel OA-4100.

156

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

7.7. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE AFINIDAD Los métodos de cromatografía de afinidad están diseñados para la separación específica de determinadas sustancias. La separación se basa en interacciones específicas entre el analito y la fase estacionaria. Algunos ejemplos de interacciones específicas son: enzima-sustrato; enzima-inhibidor, antígeno-anticuerpo, avidina-biotina, etc. Dada la especificidad de cada caso, solo existen unas pocas fases estacionarias comerciales para las aplicaciones más comunes y es el propio usuario el que ha de fabricarlas. Precisamente por este motivo se aplica casi exclusivamente en la variante de columna abierta de baja presión. La Figura 7.12 muestra un proceso hipotético de LC de afinidad. En este caso, cuando la muestra pasa por la fase estacionaria (Figura 7.12-1), solo las moléculas que «encajen» apropiadamente con la fase estacionaria serán retenidas, separándose así de las demás (Figura 7.12-2). A continuación se deberá eluir el analito, para ello se utilizan dos estrategias. Se puede añadir a la fase móvil una alta concentración de una molécula igual o similar al centro activo anclado a la fase estacionaria y que también interaccione con el analito. Este se separará de la fase estacionaria y eluirá con la fase móvil (Figura 7.12-3). Otra estrategia consiste en romper la interacción entre el analito y la fase estacionaria. Para ello, se pueden cambiar las condiciones de la fase móvil de modo que se altere el analito y/o fase estacionaria para que se rompa el enlace y de esta manera el analito eluya con la fase móvil (Figura 7.12-4).

(1)

(2)

(3)

(4)

FIGURA 7.12. Ejemplo de separación cromatográfica basada en interacciones de afinidad.

Tipos de cromatografía de líquidos

•• •• ••

157

7.8. GRADIENTES EN CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS A lo largo de este capítulo ha quedado claro que el gran poder de la LC descansa en la gran cantidad de diferentes composiciones de fase móvil que se puede aplicar. Muchas veces, una cromatografía requiere que la composición del disolvente no sea constante a lo largo del tiempo. Cuando ocurre esto se dice que se ha aplicado un gradiente. El gradiente cambia siempre desde la mezcla de disolventes de menor poder de elución de los analitos hacia la composición que posee un mayor poder de elución. En cromatografía de fase normal los gradientes evolucionan aumentando la polaridad de la fase móvil.

En cromatografía de fase reversa los gradientes evolucionan disminuyendo la polaridad de la fase móvil.

En cromatografía de intercambio iónico los gradientes evolucionan aumentando la fuerza iónica de la fase móvil.

El único requisito que se ha de valorar antes de aplicar un gradiente es la miscibilidad de los disolventes. Los disolventes de la fase móvil deben ser solubles en todas las concentraciones aplicadas. ¿Cuáles son los beneficios de aplicar un gradiente? Normalmente los gradientes mejoran la resolución, acortan los tiempos de elución de los analitos más fuertemente retenidos y tienden a producir picos más agudos. Encontramos un ejemplo en la Figura 7.13. Podemos observar como en el cromatograma isocrático (Figura 7.13A) el pico de naftol es mucho más ancho y menos retenido que en el cromatograma donde se aplicó gradiente (Figura 7.13B). Todo ello se traduce en un notable incremento del número de platos teóricos al aplicar el gradiente (Tabla 7.4). El gradiente se puede aplicar no solo variando la concentración de disolvente orgánico. La Tabla 7.5 muestra algunas de las propiedades que se pueden variar en un gradiente. ¿Cuáles son los inconvenientes de aplicar un gradiente? Los gradientes requieren un sistema que pueda cambiar la composición del disolvente de manera precisa y reproducible. Las bombas de los equipos actuales de HPLC tienen resuelto este problema; no obstante, cuando se aplica LC en columna abierta es una complejidad que debe ser superada contando con el equipo técnico necesario. Por otra parte, tras la

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

A

0.3

Absorbancia280nm

0.2

60 50

0.1 40 0.0 B

0.3 0.2

60

% metanol

158

50

0.1 40 0.0 4

6

8

10

12

14

Tiempo (min)

FIGURA 7.13. Efecto del gradiente sobre la forma del pico. En ambos cromatogramas se inyectaron 10 μL de una muestra de 1-naftol 500 μM a un flujo de 1 mL/min. La fase móvil fue una mezcla isocrática de acético/acetato 0.2 M pH 3.3-metanol (60/40) en el cromatograma A. En el cromatograma B la fase móvil tuvo la misma composición, pero se aplicó un gradiente que elevó el porcentaje de metanol desde el 40 al 60% en 15 minutos. En ambos casos la columna empleada fue de C18 LiChrospher de 5 μm de tamaño de partícula, 12.5 cm de longitud y 4 mm de diámetro interno. TABLA 7.4. Parámetros cromatográficos de los picos de los cromatogramas de la Figura 7.13 Cromatograma

Ancho (min)

Número de platos

Isocrático

0.47

12000

Gradiente

0.14

37000

TABLA 7.5. Propiedades del eluyente que se pueden variar en las separaciones en gradiente Fuerza iónica pH Capacidad de formar puentes de hidrógeno Polaridad Constante dieléctrica Concentración del reactivo que compite con el analito por los centros activos de la fase estacionaria

Tipos de cromatografía de líquidos

•• •• ••

159

aplicación del gradiente es necesario un tiempo de reequilibrado de la columna. Es decir, que la fase móvil de la columna debe volver a las condiciones iniciales antes de realizar otro cromatograma. De nuevo los sistemas automatizados de HPLC resuelven este problema sin necesidad de la presencia física del operador, no obstante, suponen un mayor consumo de tiempo y fase móvil. A la vista de estas consideraciones, ¿cuándo se debe aplicar un gradiente? Se debe aplicar un gradiente siempre que mejore significativamente la resolución del cromatograma. Por ejemplo, la Figura 7.3F muestra un cromatograma realizado en condiciones isocráticas con dos picos agudos y una resolución de 3.3. Si se hubiera aplicado un gradiente hubiéramos observado una mejora de la resolución y un estrechamiento de los picos. No obstante, la resolución en modo isocrático es suficiente para nuestra finalidad, por lo tanto no consideramos necesario aplicar un gradiente ya que la mejora no hubiera sido significativa y hubiéramos arrastrado los inconvenientes arriba reseñados. A veces la forma del gradiente que se aplica es importante. La Figura 7.14 muestra como pequeños cambios en el gradiente pueden inducir variaciones muy importantes en la resolución. Esta figura muestra como el monómero de albúmina eluye antes cuando la pendiente del gradiente es mayor (cromatograma inferior). Sin embargo, la resolución del monómero del albúmina con respecto a su dímero es mayor cuanto menor es la pendiente del gradiente (cromatograma superior). Al mismo tiempo se observa como el pico del complejo CO-hemoglobina eluye también antes con una mayor pendiente en el gradiente, aunque su separación del pico adyacente también es peor. Monómero de albumina

0.4

Dímero de albumina

0.3

0.50

0.2

0.25

0.1

0.00 CO-hemoglobina

1.00 0.75

0.0 0.5

Monómero de albumina

0.4 0.3

0.50

0.2

Dímero de albumina

0.25

NaCl (M)

Absorbancia254 nm

0.75

0.5 NaCl (M)

CO-hemoglobina

1.00

0.1

0.00

0.0 0

25

50

75

100

Tiempo (min)

FIGURA 7.14. Importancia de la pendiente del gradiente en una separación cromatográfica. La separación se hace con un gel de intercambio iónico de DEAE. El eluyente fue Tris-HCl 0.1 MpH 8.3 con NaCl a la concentración indicada en cada caso.

160

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

El cambio en la composición del disolvente no ha de aplicarse necesariamente de manera lineal continua. La Figura 7.15 muestra un ejemplo donde se ve que un gradiente en escalera ha mejorado notablemente la resolución de un cromatograma. El cuarto pico del cromatograma con gradiente lineal proviene de albúmina sérica. Esta proteína eluye en dos picos distintos (cuarto y quinto del cromatograma inferior) si se aplica en gradiente en escalera. La variación de las propiedades del disolvente no ha de ser lineal con el tiempo. Así, es posible que gradientes no lineales (cóncavos o convexos) ofrezcan mejores resultados que los gradientes lineales. No obstante, la primera elección a la hora de poner a punto un método ha de ser siempre un gradiente lineal. 0.5

1.00

0.4 0.3

0.50

0.2

0.25

0.1

0.00 1.00

0.0 0.5 0.4

0.75

Fuerza iónica

Absorbancia254 nm

0.75

0.3

0.50

0.2

0.25

0.1

0.00 0

50

100

0.0 150

Tiempo (min)

FIGURA 7.15. Diferencias en la separación de proteínas de suero bovino con columna de intercambio iónico aplicando gradiente de NaCl lineal y en escalera. Columna de QAESephadex A-50. Eluyente: Tris-HCl 0,1 m pH 6.5 con NaCl.

7.9. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS Cambios en la temperatura pueden alterar todos los equilibrios y procesos de transporte que intervienen en una separación cromatográfica. Así, a altas temperaturas: a) La viscosidad del disolvente disminuye, dando lugar a que el eluyente fluya más fácilmente. b) Las velocidades de difusión del soluto aumentan. c) Los equilibrio entre los diversos solutos y la fase estacionaria se desplazan en diferentes proporciones.

Tipos de cromatografía de líquidos

•• •• ••

161

No obstante, cabe decir que para que los cambios sean significativos, las diferencias de temperatura han de ser muy importantes. En general, los cambios en temperaturas cercanas a las ambientales tienen poco efecto sobre las separaciones y no afectan a la reproducibilidad, por lo que en la mayor parte de las técnicas de LC no es necesario un control preciso de la temperatura. Por el contrario, como veremos más adelante, la temperatura sí es un factor crucial en las separaciones por cromatografía de gases.

7.10. TAMAÑO DE PARTÍCULA DE LA FASE ESTACIONARIA El tamaño de partícula de la fase estacionaria es otro factor a tener en cuenta en LC. Reduciendo el tamaño de la partícula se reduce también la altura de plato teórico, 10 μm, 690 p si

(2) (1) (3)

Absorbancia

(4)

5 μm, 1900 p si

(2)

(1) (3)

0

5

(4)

10

15

20

25

Tiempo de elución (min)

FIGURA 7.16. Efecto del tamaño de partícula sobre el tiempo de análisis. En ambos casos las columnas empleadas fueron de C18. Identificación de los picos: (1): fenol;(2): acetona; (3): nitrobenceno; (4): tolueno.

162

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

con lo que en teoría es posible obtener las mismas separaciones con columnas más cortas. Ello es debido a que, si la fase estacionaria está más finamente dividida la densidad de centros activos disponibles será mayor y, por lo tanto, se podrá disminuir la longitud conservando constante el número de platos teóricos. Las disminuciones en el tamaño de partícula llevan aparejadas aumentos de presión para poder mantener el flujo constante. La Figura 7.16 muestra un ejemplo de cómo, reduciendo el tamaño de partícula, se puede acortar el tiempo de análisis conservando relativamente constante la eficacia.

8

Cromatografía en capa fina

CONTENIDO 8.1. Principios generales de cromatografía en capa fina 8.2. Desarrollos bidimensionales de cromatografía en capa fina 8.3. Detección de analitos en cromatografía de capa fina 8.4. Aplicaciones de la cromatografía en capa fina 8.5. Cromatografía en capa fina de alta resolución

8.1. PRINCIPIOS GENERALES DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Hasta ahora hemos hablado de LC en el contexto general de una fase estacionaria dispuesta en el interior de una columna, que puede ser abierta y sometida a bajas presiones o, como veremos en el siguiente capítulo, cerrada y sometida a altas presiones. Sin embargo la columna no es el único formato en que se puede aplicar LC. También existe un formato relativamente popular denominado cromatografía en capa fina (TLC). La abreviatura es internacional y deriva de la expresión inglesa thin layer cromatography. Una de las ventajas de la TLC es que no requiere un gran dispositivo instrumental. La Figura 8.1 muestra un montaje necesario para un sistema de TLC en modalidad ascendente. La Figura 8.2 muestra el desarrollo de la cromatografía en tres momentos diferentes. En la TLC ascendente la fase estacionaria se dispone sobre una lámina de plástico, vidrio o aluminio formando una lámina de entre 0.5 y 2 mm de espesor. La muestra (1-5 μL) se deposita cerca del borde inferior de la placa (Figura 8.1 y 8.2A). El punto donde se deposita la muestra se denomina origen. A continuación, la placa se pone en contacto con la fase móvil dentro de un recipiente cerrado. La fase móvil ha de contactar con la placa por debajo del punto donde se 163

164

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Tapa

Placa de TLC

Fase estacionaria

Origen Fase móvil

FIGURA 8.1. Dispositivo de cromatografía en capa fina en modalidad ascendente.

A

B

C

Origen

FIGURA 8.2. Vista frontal de una placa de TLC en el momento de inicio de la cromatografía (A), durante el desarrollo (B) y al final de la misma (C).

depositó la muestra. La fase móvil asciende por capilaridad por la placa y cuando llega al origen arrastra la muestra. Los diferentes analitos de la muestra tendrán diferentes afinidades por la fase estacionaria. Los analitos más afines a la fase estacionaria serán más retenidos y avanzarán más despacio que los analitos menos afines, que se moverán más rápidamente (Figura 8.2B). Al final del proceso, los componentes de la muestra se habrán separado sobre la base de las diferencias de afinidad por la fase estacionaria (Figura 8.2C).

Puede ver una animación sobre una separación por TLC en modalidad ascendente en: http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/animations/tlc.mov (Página activa en julio de 2004.)

Cromatografía en capa fina

•• •• ••

165

También existe la TLC descendente. El dispositivo experimental necesario se muestra en la Figura 8.3. Básicamente se opera de manera similar, pero en este caso la placa con la fase estacionaria se coloca entre dos soportes con un ángulo de unos 45°. La parte superior de la placa está en contacto con papel de filtro sumergido en un depósito de fase móvil. El disolvente pasa por capilaridad a la placa y baja a través de ella por gravedad.

Papel de filtro

Fase estacionaria Papel de filtro

Fase móvil

Fase móvil

FIGURA 8.3. Dispositivo de cromatografía en capa fina modalidad descendente.

Las fases estacionarias más utilizadas son: a) gel de sílice (utilizada en aproximadamente el 80% de las separaciones de TLC); b) alúmina; c) silicato de magnesio; d) tierra silícea o Kieselguhr; y e) poliamidas. Como se observa, son las mismas fases estacionarias utilizadas en LC de adsorción en fase normal. Por lo tanto, la separación, retención y elución de los analitos se realizará siguiendo los mismos principios descritos en el capítulo 7.2. Podemos resumir la situación de una separación en TLC diciendo que la fase estacionaria es más polar que la fase móvil, que estará compuesta por mezclas de disolventes orgánicos de diferente polaridad. Los analitos más polares quedarán más retenidos por la fase estacionaria que los menos polares. Al igual que se comentó en el capítulo de LC, no es posible alterar el orden de elución de los analitos sin cambiar su afinidad por la fase estacionaria.

Los disolventes más polares lograrán que los analitos se muevan siempre más deprisa en la placa de TLC, mientras que los disolventes menos polares tendrán el efecto contrario.

166

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Para análisis cualitativos de las posiciones de los analitos tras una separación de TLC se utiliza el parámetro denominado factor de retención o Rf . El Rf se calcula como: distancia desde el punto de aplicación hasta la mancha Rf = ————————————————————————————– distancia desde el punto de aplicación hasta el frente del disolvente La Figura 8.4 muestra gráficamente el concepto de factor de retención. El Rf se utiliza para definir la posición de las bandas y comparar diferentes condiciones de trabajo. Cada sustancia presenta un factor de retención característico para unas condiciones dadas, por lo que la comparación del Rf de las manchas de la muestra con los de sustancias patrones conocidas podrá servir para identificar la presencia de sustancias en las muestras analizadas. No obstante, una de las limitaciones de TLC es que presenta relativamente baja resolución y varias sustancias pueden tener valores de Rf muy similares, por lo que nunca debe usarse el Rf como único factor para asegurar la presencia de un compuesto en una mezcla. Los materiales que se usan en TLC son los mismos que en LC de fase normal. Sin embargo, el comportamiento de un determinado soluto no tiene porque ser extrapolable de LC a TLC. La principal razón de esto es que en TLC los solutos y el disol-

Punto de aplicación x

a

Centro de la mancha

b

Frente del disolvente a Rf = — b

FIGURA 8.4. Concepto de factor de retención.

Cromatografía en capa fina

•• •• ••

167

vente interaccionan sobre superficies secas que inicialmente no estaban en equilibrio con el disolvente, mientras que esta situación no se da en LC.

Una de las ventajas de TLC es que se pueden desarrollar simultáneamente varias muestras.

8.2. DESARROLLOS BIDIMENSIONALES EN CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Para aumentar la resolución de las separaciones en TLC se aplica un procedimiento llamado TLC de doble desarrollo o TLC en dos dimensiones. La Figura 8.5 esquematiza uno de estos procedimientos. En realidad se hacen dos desarrollos cromatográficos. El primero de modo normal, colocando una muestra (solo una) cerca de una esquina de la placa y desarrollándola con un eluyente (disolvente 1). La Figura 8.5A muestra como de la mezcla de analitos ABCDE solo C ha podido ser completamente separado, ya que A eluye junto a B y D lo hace junto a E. Tras este primer desarrollo, la placa se seca y se gira 90°. Seguidamente se cambian las condiciones de fase móvil de manera apropiada y se hace un segundo desarrollo con un disolvente diferente del primero (disolvente 2). El origen del segundo desarrollo es la posición en que quedaron los componentes tras el primer desarrollo (Figura 8.5 B). El resultado del doble desarrollo ha permitido separar los cinco componentes de la mezcla (Figura 8.5 B). En los desarrollos bidimensionales la posición de los analitos se identifica con 2 factores Rf, uno para cada desarrollo. a) Cromatograma unidireccional

b) Cromatograma bidireccional Frente del disolvente 1

Frente del disolvente 2

D,E

D

B C

C

E A

A,B X ABCDE

90°

Punto de aplicación de la muestra (origen del disolvente 1)

X A,B

C

D,E

Origen del disolvente 2

Frente del disolvente 1

FIGURA 8.5. Desarrollo bidimensional en cromatografía en capa fina.

168

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

La Figura 8.6 muestra los resultados de la aplicación de TLC bidimensional a la separación de esteroides. Se puede observar como esta separación no hubiera sido posible con desarrollo unidimensional. El desarrollo se hizo primero de arriba hacia abajo y los compuestos 2 y 3 se movieron juntos, al igual que los compuestos 4, 5 y 6. Tras el secado de la placa los compuestos se separaron desarrollándola de derecha a izquierda. La muestra se depositó en al lugar de la mancha 7, que no se movió en ninguna dirección.

(7)

(6) (5)

(4)

(3) (2)

(1)

FIGURA 8.6. Separación de esteroides utilizando cromatografía en capa fina bidimensional. La fase sólida fue gel de sílice con un 10% de silicato de magnesio. Identificación de sustancias: (1) Progesterona; (2) estrona; (3) 11-dehidrocorticoesterona; (4) estradiol; (5) corticosterona; (6) 11-deoxicortisol; (7) hidrocortisona.

8.3. DETECCIÓN DE ANALITOS EN CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA Normalmente la mayoría de loa analitos no son coloreados, por lo que tras el desarrollo se deberá aplicar algún proceso de revelado para hacer visibles las manchas. La detección y localización de las manchas de TLC se suele hacer de acuerdo con alguno de los siguientes métodos: • Color propio de los analitos. • Fluorescencia de los analitos.

Cromatografía en capa fina

•• •• ••

169

• Se pueden obtener placas de TLC con fase estacionaria que lleva un compuesto fluorescente. Antes del desarrollo del TLC toda la placa fluoresce bajo luz UV. Sin embargo, tras el desarrollo de la placa, los lugares donde haya analitos dejan de fluorescer porque esa zona se halla cubierta por el analito que tapa la fluorescencia. • El color de los analitos después de reaccionar con reactivos más o menos específicos. Por ejemplo, los esteroides de la Figura 8.7 no tiene color, por lo que tras el secado de la placa esta se rocía con una disolución de ácido sulfúrico con formaldehído y se calienta a 180 °C durante 30 minutos. Este tratamiento produce las manchas oscuras que muestra la Figura 8.7. Otros ejemplos son la reacción de dimetilglioxima con níquel o de la fluoresceína con aminas. • La radioactividad de los compuestos de la mezcla. Si estamos interesados en detectar algún compuesto radioactivo, tras el secado de la placa esta se pone en contacto con una película fotográfica en la oscuridad. Las sustancias radioactivas mostrarán su posición en la placa con manchas en la película.

8.4. APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA La TLC ha sido aplicada para analizar analitos como productos farmacéuticos, lípidos, ácidos orgánicos, carbohidratos, amino-ácidos, péptidos, fenoles, indoles, purinas, esteroides, vitaminas, compuestos quirales, etc. Ello hace que se utilice con frecuencia para análisis químicos en campos como Toxicología, Química Orgánica, Bioquímica, Biología, industria, agricultura, medioambiente, alimentación, farmacia, estudios clínicos, productos naturales, etc. La técnica de TLC se aplica sobre todo a: a)Detección cualitativa rápida de analitos; b) Determinación semicuantitativa de analitos; c) Aislamiento y purificación parcial de analitos o familias de analitos de una muestra. a) Detección cualitativa rápida de analitos La TLC no permite habitualmente separaciones de alta resolución ni de alta especificidad. Sin embargo, es una técnica muy útil para el control de los contenidos de una muestra de forma rápida y sencilla. Por ejemplo, si tratamos un tripéptido con HCl concentrado y deseamos saber si se ha completado la hidrólisis, podremos hacer una TLC en condiciones apropiadas de la muestra hidrolizada y de la muestra control no hidrolizada. Esta última mostrará solo una mancha con un Rf determinado. Si la muestra tratada presenta una mancha (además de otras) con el mismo Rf esto indicará que la hidrólisis no habrá sido completa. Además, una vez completada la hidrólisis, podremos hacer una TLC comparando el producto hidrolizado con amino-ácidos patrón. La comparación de los Rf de los amino-ácidos y de las

170

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

manchas de la muestra tratada sugerirá la composición inicial del tripéptido. Sin embargo, en una muestra respecto de la que no disponemos de ningún dato previo, la presencia de una mancha al mismo Rf que una sustancia patrón no permite asegurar la presencia de la sustancia patrón en la muestra, ya que puede haber más de una sustancia con el mismo Rf. b) Determinación semicuantitativa de analitos El análisis cuantitativo de TLC no es tan preciso como el de cromatografía de líquidos o de gases. El mayor factor de error en la cuantificación de la muestra es la aplicación de la misma. Se ha de aplicar la muestra (unos pocos μL) con la suficiente precisión como para que la cuantificación sea fiable. Existen sistemas que son capaces de medir la fluorescencia emitida por una mancha de una placa. No obstante, estos sistemas no son fáciles de aplicar, ya que se ha de medir en toda la superficie de la mancha, lo cual es un inconveniente puesto que normalmente las manchas tienen formas irregulares y además el analito suele estar más concentrado en el centro que en los bordes. Una aproximación que mejora la cuantificación consiste en cortar con una cuchilla la porción de gel de sílice donde se halla el analito. Tras ello, la superficie cortada se trata con disolvente para liberar el compuesto y la mezcla se centrífuga para eliminar el gel de sílice. De esta manera se obtendrá el analito en disolución separado de la sílice. Sobre esta preparación se puede medir con bastante más precisión fluorescencia, absorbancia o cualquier otra propiedad. De cualquier modo, la precisión y reproducibilidad de la cuantificación continúa condicionada por la aplicación de la muestra.

c) Aislamiento y purificación parcial de analitos o familias de analitos de una muestra La TLC se puede utilizar para fraccionar la muestra y separar un analito (o familia de analitos) de una matriz compleja. Para ello, se procede de manera idéntica a lo descrito en el párrafo anterior. Para asegurar la extracción del componente que queremos extraer es muy importante la selección de la zona del gel sobre la que se actúa. No podremos hacer revelados que destruyan o modifiquen el analito, por lo que la visualización de sustancias fluorescentes con un lámpara de luz UV será una técnica apropiada de detección. En caso de no disponer de una técnica de identificación de la zona de interés, se dividirá la placa en varias zonas y el tratamiento se aplicará a cada una de ellas.

Cromatografía en capa fina

•• •• ••

171

8.5. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE ALTA RESOLUCIÓN La experiencia en cromatografía de líquidos en columna demostró que la altura equivalente de plato teórico (H) disminuye al reducir el tamaño de la partícula y homogeneizar el relleno. Aplicar estas modificaciones a TLC ha dado el mismo resultado que en LC. El resultado es la técnica denominada cromatografía en capa fina de alta resolución (high performance thin layer cromatography) o HPTLC. Mientras que en TLC convencional se usan partículas de unos 20 μm de tamaño medio, en HPTLC se usan partículas de 5 μm, lo que mejora la calidad del relleno reduciendo la formación de «canales». Como resultado de estas mejoras, la altura del plato teórico se disminuye por un factor de aproximadamente 3. Esta reducción permite elevar el número de platos teóricos de una placa de 300 (TLC convencional) a 5000 (HPTLC). La consecuencia final es que se pueden obtener separaciones equivalentes con menores distancias de migración. El gran inconveniente del HPTLC es que requiere un equipamiento especial. Todos los procesos de la separación se realizan mediante aparatos e instrumentos mecánicos programables. Además, para no dañar la superficie de la placa se necesitan microjeringuillas especiales para depositar la muestra. Consecuentemente, su aplicación no está muy extendida, debido a que no ofrece la sencillez de la TLC convencional y que para análisis de alta resolución se suele recurrir a técnicas de HPLC.

9

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

CONTENIDO 9.1. Componentes básicos de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución 9.2. El sistema de impulsión de la fase móvil 9.2.1. Bombas 9.2.2. Sistemas de regulación de la presión 9.2.3. Modos de mezclado de disolventes 9.3. Columnas 9.4. Inyectores 9.4.1. Inyectores manuales 9.4.2. Inyectores automáticos 9.5. Detectores 9.5.1. Características básicas de un detector de HPLC 9.5.2. Detector de absorción UV-VIS 9.5.3. Detector del índice de refracción 9.5.4. Detector de fluorescencia 9.5.5. Detector electroquímico (amperométrico) 9.5.6. Detector conductimétrico 9.5.7. Detector espectrómetro de masas 9.6. Identificación de analitos en HPLC 9.7. Cuantificación de analitos en HPLC 9.8. Cursos de HPLC en internet

Las primeras columnas de LC tenían una longitud de varias decenas de cm, un diámetro interno de entre 10 y 50 mm y las fases estacionarias utilizadas tenían un tamaño de partícula de entre 100 y 200 μm. Las fases móviles se hacían fluir a través de las columnas por gravedad o utilizando bombas peristálticas que conseguían unos flujos de hasta 0.3-0.5 mL/min. Los intentos de acelerar los flujos aplicando mayor pre173

174

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

sión condujeron a un incremento de la altura del plato teórico con la consiguiente reducción de la eficacia de los procesos. Sin embargo, pronto se averiguó que disminuyendo el tamaño de la partícula y mejorando la calidad de los empaquetados se conseguía aumentar notablemente la cantidad de centros activos separadores dentro de las columnas. Por consiguiente, se podían conseguir las mismas separaciones con columnas de menor longitud. Para hacer que la fase estacionaria fluyera por el interior de las columnas a un flujo razonable era necesario aplicar altas presiones, lo que a su vez obligaba a que las columnas fueran metálicas en lugar de hechas de vidrio. Al disminuir la longitud y el diámetro también disminuyó la capacidad de carga, es decir, la cantidad de muestra analizable en cada cromatograma. Fue en la década de los setenta cuando se empezó a disponer de toda la tecnología necesaria para trabajar en LC de alta resolución. Los condicionantes técnicos básicos eran: 1) Capacidad para fabricar y empaquetar homogéneamente columnas con fases estacionarias de tamaño de partícula de entre 5 y 10 μm; 2) Sistemas de impulsión de fase móvil capaces de vencer la resistencia originada por la fase estacionaria sin originar variaciones significativas de flujo en el tiempo del cromatograma; 3) Un sistema capaz de introducir en la columna pequeñas cantidades de muestra sin interrumpir el flujo y 4) Detectores capaces de registrar señales originadas por muy pequeñas cantidades de analito. La técnica de LC que se aplica siguiendo estas características se denomina cromatografía de líquidos de alta resolución o según su abreviatura normalizada HPLC (del inglés high performance liquid cromatography). Desde sus inicios la tecnología no ha dejado de evolucionar y actualmente los sistemas de HPLC alcanzan niveles altísimos de resolución y constituye una de las primeras opciones a la hora de seleccionar una técnica de separación. La Tabla 9.1 muestra algunas de las áreas de aplicación de las técnicas de HPLC junto a su utilidad específica. Se observa que es una técnica muy versátil y con campos de aplicación muy variados.

9.1. COMPONENTES BÁSICOS DE UN CROMATÓGRAFO DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN La Figura 9.1 muestra los componentes básicos de un equipo de HPLC. Los componentes imprescindibles en un equipo de HPLC son: 1) Bomba impulsora de disolvente; 2) Sistema de inyección de muestra; 3) Columna; 4) Sistema de registro. En los equipos modernos todos estos componentes están comunicados entre sí y controlados desde un ordenador, el cual controla y sincroniza el funcionamiento de todos los módulos con una aplicación informática específica. El ordenador encargado del control registra y almacena de forma digital toda la información que le llega al

TABLA 9.1. Principales áreas de aplicación de técnicas de HPLC Bioquímica

Aminoácidos

Clínica

Carbohidratos

Barbitúricos

Sales biliares

Catecolaminas Hormonas sexuales Hormonas AntidepresiNucleótidos vos tricíclicos Isómeros ópticos Porfirinas Péptidos Proteínas Prostaglandinas Purinas Pirimidinas Esteroides

Petróleo

Farmacéutica

Industria

Pesticidas

Aceites

Antibióticos

Herbicidas

Lubricantes

Fertilizantes

Productos sintéticos

Anticoncepti- Aminas vos Aromáticos Cosméticos Isocianatos

Hormonas vegetales Hormonas de insectos

Medicamentos Hormonas

Alcoholes

Medioambiente

Comtaminación ambiental Polución acuática

Iones metálicos

Tratamiento de residuos

Fenoles

Residuos de plaguicidas

Detergentes

Alimentaria

Forense

Polímero

Aflatoxinas

Alcaloides

Aromas

Toxinas

Antioxidantes

Azúcares

Aceleradores.

Nitrosaminas

Tintes

Conservantes

Plastificantes

Vitaminas

Surfactantes Pinturas Resinas

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

Ácidos grasos

Anticonvulsionantes Teofilina

Agroquímica

•• •• •• 175

176

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Dispositivo para eliminar burbujas

Inyector

Precolumna

Entrada de helio

Filtro Bomba Columna

Estabilizador de presión Cromatograma

Registrador

Detector

FIGURA 9.1. Componentes básicos de un cromatógrafo líquido de alta resolución.

detector. Esta sección describe globalmente un equipo de HPLC; en secciones posteriores se comentará en detalle cada uno de estos componentes. En primer lugar se observan unos recipientes (botellas) que contiene los disolventes que constituirán la fase móvil. Las botellas suelen estar tapadas con un tapón agujereado y atravesado por dos tubos de teflón. Por uno se puede hace pasar He para desgasificar la disolución. El otro está conectado a la bomba y por él circula la fase móvil. A la salida de la botella y antes de llegar a la bomba se puede instalar un dispositivo de seguridad para eliminar pequeñas burbujas que, si se introdujeran en el sistema, producirían incrementos de presión y disminución del flujo de fase móvil. Dado que el sistema opera a alta presión, los gases disueltos en la fase móvil tienden a escapar de ella causando microburbujas que dan lugar a cambios significativos de presión y flujo, si se producen en la columna, y a picos agudos en forma de espiga, si se producen en el detector. El problema es especialmente grave en lo que toca al oxígeno presente en disoluciones acuosas. Para evitarlo, se puede sonicar la fase móvil durante aproximadamente 5 minutos y también burbujear He en el recipiente durante el tiempo de funcionamiento del HPLC. La bomba es el sistema encargado de impulsar la fase móvil. Absorbe el disolvente de la botella por una tubería de teflón de varios mm de diámetro y lo desplaza presurizado por todo el sistema a través de un tubo capilar de acero de entre 0.1 y 0.25 mm de diámetro. Normalmente se dispone de dos bombas (cada una de las cuales puede tener más de una línea) para poder hacer cambios en la composición de la fase móvil.

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

•• •• ••

177

A la salida de la bomba, antes de llegar al inyector, pero tras la columna, se suele colocar un sistema estabilizador de presión que evita variaciones importantes en el flujo de fase móvil. En los equipos modernos el estabilizador de presión está físicamente unido a la bomba formando un solo módulo. El sistema inyector introduce la muestra en el sistema. El inyector puede ser manual o automático. El inyector automático puede además disponer de una bandeja de muestras donde se almacenan las muestras hasta el momento de su análisis. A lo largo de todo el circuito se suelen colocar varios filtros para evitar que se introduzcan en la columna partículas que produzcan variaciones de presión, alteren el análisis y su reproducibilidad y dañen la columna. A la salida de la columna se encuentra el detector. Es un sistema que registra variaciones en el tiempo de una propiedad físico-química del material que eluye de la columna. El detector suele estar conectado a un sistema que dibuja el cromatograma. Este sistema puede ser un polígrafo simple que realiza la representación sobre papel, aunque actualmente se tiende a registrar los datos del cromatograma en un sistema informático que memoriza toda la información recibida para su posterior análisis. Desde principios de la década de los noventa prácticamente todos los equipos de HPLC están totalmente controlados por ordenador. El operador debe introducir en el programa de gestión del HPLC los parámetros para cada uno de los módulos y ejecutar este conjunto de instrucciones (normalmente denominado «método»). El sistema está totalmente automatizado y no requiere presencia alguna para realizar el cromatograma. En el caso de disponer de inyector automático con bandeja de muestras el sistema puede estar trabajando de manera autónoma e independientemente hasta finalizar todos los análisis programados.

9.2. EL SISTEMA DE IMPULSIÓN DE LA FASE MÓVIL 9.2.1. Bombas Para forzar al disolvente a fluir a través de la fase estacionaria se requiere aplicar alta presión. La presión necesaria aumenta al disminuir el tamaño de partícula de la fase estacionaria. Dado que la resolución de la columna aumenta al disminuir el tamaño de partícula, la tendencia es a empaquetar columnas de un máximo de 10 μm de tamaño de partícula, lo cual obliga a utilizar sistemas de impulsión capaces de aplicar presiones de varias atmósferas. Las bombas de HPLC deben cumplir los requisitos especificados en la Tabla 9.2. Si bien en cromatografía analítica el flujo normal de trabajo se sitúa entre 0.5 y 1.5 mL/min, en cromatografía preparativa el flujo puede ser de hasta 10 mL. Además, el flujo ha de ser estable y presentar las menores variaciones posibles. La presión au-

178

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

TABLA 9.2. Requisitos necesarios para una bomba de HPLC Flujo entre 0.05 y 10 mL/min Estabilidad del flujo Presión de hasta 6500 psi

mentará de manera directa con el flujo e inversa con el tamaño de partícula, por lo tanto la bomba debe ser capaz de aplicar presiones de hasta 6500 psi. Existen dos tipos de bomba, la bomba de desplazamiento positivo (de jeringa) y la bomba de pistón con movimiento de vaivén. La bomba de pistón con movimiento de vaivén puede mantener el flujo por tiempo indefinido; por el contrario las bombas de desplazamiento positivo deben ser rellenadas cada vez que se agota el volumen de la jeringa.

Bombas de pistón con movimiento de vaivén La Figura 9.2 muestra el funcionamiento de una bomba de pistón. El pistón conectado a la biela se retrae una distancia programada dentro de la cámara de bombeo. Esta retracción succiona la fase móvil desde la botella hasta la cámara que queda completamente llena. A continuación, se inicia un movimiento en sentido contrario que expulsa el líquido a presión hacia la columna. La distancia que se retrae el pisSalida de disolvente Bola de zafiro Biela

Pistón Bola de zafiro Entrada de disolvente

FIGURA 9.2. Bomba de pistón con desplazamiento de vaivén.

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

•• •• ••

179

tón es regulable y función del flujo. Uno de los inconvenientes de este sistema es que el disolvente es bombeado a «pulsos» que coinciden con los movimientos del pistón. Ello obliga en la mayoría de los casos a colocar sistemas de amortiguación de dichos pulsos.

Puede ver una animación sobre el funcionamiento de una bomba de pistón de vaivén en: http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/animations/pump.mov (Página activa en julio de 2004.)

Bombas de desplazamiento positivo Estas bombas están formadas por un cilindro que contiene la fase móvil, la cual es introducida en el circuito por el avance de un émbolo que la presiona hacia fuera. Cada vez que se vacía el cilindro el sistema ha de ser detenido y recargado. Una de las ventajas es que este sistema funciona «en continuo» y por lo tanto está libre de los pulsos ocasionados por las bombas de pistón. El principal inconveniente de estas bombas es que no pueden aplicar gradientes y que el reservorio de disolvente está limitado a unos 20 mL. Estas características hacen que sean aptas para sistemas de micro-HPLC, donde el flujo es de entre 1 y 100 μL/min y la limitación del volumen no es tan importante. Ambos tipos de bombas se pueden combinar, colocando, en primer lugar, una bomba de émbolo que suministra de manera programada o continua el disolvente al reservorio de la bomba de desplazamiento positivo, que es la que lo introduce en el sistema. De esta manera esta bomba puede trabajar de manera ininterrumpida y aplicar gradientes, aunque en realidad es la bomba de pistón la que los ha realizado.

9.2.2. Sistemas de regulación de la presión Los detectores (en particular el de índice de refracción) son sensibles a los «pulsos» de fase móvil. Ello hace necesario un sistema de amortiguación de estos pulsos. El sistema más simple es un serpentín de tubo colocado en línea entre el inyector y la bomba. Cuando llega el «pulso» causado por el pistón, el serpentín se flexiona y de esta manera absorbe el exceso de energía estabilizando el flujo. Este tipo de amortiguador tiene el inconveniente de que el serpentín ha de rellenarse con el disolvente y causa un volumen muerto que ha de ser purgado cada vez que se cambia la composición de la fase móvil, lo que imposibilita por lo tanto la aplicación de gradientes.

180

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Diafragma Salida de fase móvil Líquido compresible Entrada de fase móvil

FIGURA 9.3. Amortiguador de flujo de membrana.

El amortiguador de flujo más utilizado es el de membrana (Figura 9.3). La membrana encierra un pequeño volumen de líquido compresible (menos de 500 μL de heptano). La compresibilidad del líquido es suficiente para compensar los cambios de presión que se producen como consecuencia de las pulsaciones del pistón.

9.2.3. Modos de mezclado de disolventes En el capítulo 7 quedó de manifiesto que el modo de elución en gradiente aportaba muchas ventajas a la LC. En los sistemas de HPLC existen dos sistemas de mezcla de disolventes: mezcla a alta presión y mezcla a baja presión.

Mezcla a alta presión En este sistema de mezclado deben existir dos bombas (A y B). Cada una de ellas comunica presión a uno de los disolventes y los introducen en el porcentaje apropiado dentro de la cámara de mezclado. En esta cámara se produce la mezcla y el eluyente resultante es impulsado hacia el inyector. Normalmente, el operador programa en el sistema de control el porcentaje de uno de los disolventes (A o B) que debe contener en cada momento la fase móvil, y dicho sistema de control (que comunica con ambas bombas) se encarga de ajustar automáticamente el porcentaje del otro componente. La Figura 9.4A muestra el sistema de mezclado a alta presión binario. También es posible utilizar un sistema terciario cuando se dispone de un sistema de tres bombas. Entre las ventajas del mezclado a alta presión se destaca la rápida respuesta del sistema a los cambios de presión y la posibilidad de la utilización de cada bomba independientemente. Las principales desventajas son que incluso las cámaras de diseño especial no proporcionan un mezclado completo y que la exactitud de la mezcla en porcentajes inferiores al 10% no es alta.

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

•• •• ••

181

Mezcla a baja presión En los sistemas de mezclado a baja presión la mezcla se realiza antes de la bomba (Figura 9.4B). El controlador maneja dos válvulas (normalmente de tipo solenoidal) que están abiertas durante el tiempo apropiado para dispensar a la cámara de mezclado el porcentaje apropiado de cada disolvente. A Sistema de control

Disolvente A

Cámara de mezclado

Bomba A

Al inyector Disolvente B

Bomba B

B Válvula solenoide A

Disolvente A

Sistema de control

Cámara de mezclado Bomba

Al inyector

Disolvente B

Válvula solenoide B

FIGURA 9.4. Sistemas de mezclado de disolventes de alta (A) y baja (B) presión.

9.3. COLUMNAS Las columnas analíticas de HPLC son cilindros de acero de entre 10 y 25 cm de longitud y 4-5 mm de diámetro interno (Figura 9.5). La fase estacionaria se halla en el interior de los cilindros, dividida en partículas de tamaños que oscilan entre 2 y 10 μm. Estas dimensiones se consideran el mejor compromiso entre capacidad, consumo de fase móvil, velocidad de elución y resolución. Si se aplica HPLC preparativo, las columnas son de diámetros mayores (entre 30 y 50 mm).

182

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

FIGURA 9.5. Varias columnas de HPLC.

Las columnas suelen tener incorporado un filtro a la entrada. Su finalidad es proteger la fase estacionaria de algún tipo de partícula que pueda ser introducido en el sistema. Las muestras biológicas son las principales responsables de la introducción de partículas en las columnas (fibras, agregados proteicos, etc.). A la salida de la columna hay otro filtro para evitar que pequeñas partículas de fase estacionaria puedan ser arrastradas por la fase móvil e introducidas en el detector. Esto es posible si la fase móvil es especialmente agresiva con la fase sólida (por ejemplo, pH básico que disuelven gel de sílice). Al contrario que en LC de columna abierta, el empaquetado de las columnas requiere cierto equipamiento técnico. Por esta razón las columnas de HPLC se adquieren empaquetadas. En general las columnas son duraderas y tienen una larga vida útil (a menos que se utilice una técnica intrínsecamente destructiva, como eluyentes con ácidos o bases fuertes, muestras biológicas con alto contenido proteico o de fibras etc.). La causa final de deterioro de una columna de HPLC suele ser bien la obturación del filtro de entrada, con aumento de presión una o bien, pérdida de resolución por bloqueo irreversible de los centros activos de la fase estacionaria. Con la finalidad de proteger las columnas del deterioro existen unos dispositivos llamados «precolumnas». Las precolumnas son unas columnas de menor longitud que se colocan a la entrada de las columnas (Figura 9.6). Utilizan la misma fase estacionaria que la columna que protegen y ejercen la labor de «filtro». La precolumna

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

•• •• ••

183

FIGURA 9.6. Precolumna de HPLC.

no requiere un empaquetado tan preciso como la columna, ya que representa solo una pequeña proporción del total de fase estacionaria. Por este motivo, la precolumna es un dispositivo que el operador puede abrir y rellenar manualmente con fase estacionaria apropiada. Cuando se considera conveniente, dependiendo del número de cromatogramas, agresividad de la fase móvil, limpieza de la muestra, etc., la fase estacionaria es reemplazada para recuperar la total efectividad de la precolumna.

9.4. INYECTORES El inyector es el dispositivo encargado de introducir la muestra en la corriente de fase móvil que fluye desde la bomba hacia la columna. El dispositivo ha de ser capaz de inyectar la muestra en el sistema sin interrupción del flujo y sin alterar significativamente la presión. Actualmente existen en el mercado inyectores manuales y automáticos.

9.4.1. Inyectores manuales El inyector manual más común funciona con una válvula de 6 vías (3 de entrada y 3 de salida) (Figura 9.7). La válvula tiene en un extremo una entrada al sistema por donde se introduce la muestra con una jeringa; dispone de un circuito interno para recircular muestra y disolvente por los conductos apropiados y por el bucle (loop) hasta dirigirlos a la columna. El volumen de inyección que es capaz de manejar el inyector depende del bucle. El bucle es un tubo capilar de acero que hace de puente para introducir la muestra en el sistema. Existen loops de volúmenes comprendidos entre 50 y 1000 μL, con lo que estos sistemas permiten inyectar cualquier volumen comprendido entre 5 μL y 1 mL. La Figura 9.8 muestra el funcionamiento interno de una válvula de 6 entradas de un inyector de HPLC. Se observa (Figura 9.8A) como la fase móvil que viene de la bomba entra en la válvula a través de la posición 6 y sale por la posición 5 para ir di-

184

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

FIGURA 9.7. Sistema de inyección manual de HPLC. A (carga de la muestra) Entrada de muestra

Loop de muestra

Desagüe 2

3 Jeringa 4

1 Desde la bomba

Válvula de inyección A la columna 6

5

B (inyección y cromatograma) Entrada de muestra

Loop de muestra

Desagüe 2

3 Jeringa 4

1 Desde la bomba

Válvula de inyección A la columna 6

5

FIGURA 9.8. Esquema de funcionamiento de un inyector con loop.

rectamente a la columna. La muestra introducida en el sistema entra en el inyector por la posición 3 y pasa al bucle de muestra a través de la 4. Si el volumen de muestra es mayor que el loop, el exceso va a un desagüe por las posiciones 1 y 2. El loop se encontrará lleno de fase móvil procedente del cromatograma anterior. La muestra

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

•• •• ••

185

empuja esta fase móvil al desagüe a través de las posiciones 1 y 2 de la válvula. Si el volumen de inyección es igual al del loop conviene cargar la jeringa, con una cantidad de muestra algo superior para que se pueda llenar la tubería que va de la posición 2 al desagüe y no se produzca dilución. Una vez la jeringa ha introducido la muestra en el sistema, se produce un cambio en la posición de las conducciones (Figura 9.8B). En este momento se comunican la posición 6 con la 1 y la posición 4 con la 5. De este modo, la fase móvil que viene de la bomba pasa a través del bucle y empuja la muestra, que sale camino de la columna a través de la posición 5. Los inyectores manuales presentan el inconveniente de que requieren la presencia física del operador en el momento de inicio del cromatograma. Además, al ser un proceso manual, la reproducibilidad y precisión del sistema depende de la pericia del operador (especialmente en el momento de ajuste del volumen de inyección en la jeringa).

9.4.2. Inyectores automáticos Los equipos modernos disponen de la posibilidad de incorporar inyectores automáticos que, además de realizar la inyección automáticamente, incorporan bandejas de muestras donde se almacenan los viales preparados para la inyección, por lo que es posible analizar un gran número de ellas sin intervención directa del operador. Además de ser convenientes para el procesado de lotes de muestras, los inyectores automáticos mejoran notablemente la precisión y reproducibilidad de los procesos. En relación con el sistema de introducción de muestra existen dos modelos básicos de inyectores. Uno de estos modelos funciona de manera similar a lo descrito en la Figura 9.8. En la posición donde aparece la jeringa manual se sitúa un carro de muestras en viales sellados. La aguja automática atraviesa el sello de goma del vial y se introduce en él. Una vez dentro del vial, la aguja succiona la muestra con ayuda de una pequeña bomba peristáltica que introduce la muestra en la válvula de 6 vías. Luego la válvula cambia de posición y el volumen de muestra que está en el bucle entra en el sistema hacia la columna. El volumen muerto que queda en la aguja y en la bomba peristáltica debe ser lavado a costa de la pérdida de parte de la muestra, por lo que este modelo de inyector presenta el inconveniente de que el consumo de muestra siempre es mayor que el necesario para la inyección. Otros modelos de inyector automático incorporan una pequeña bomba de desplazamiento positivo que succiona a través de la aguja un volumen preestablecido de muestra y a continuación lo introduce en el sistema utilizando una válvula de 6 vías estándar. En este caso, la aguja pasa a formar parte del circuito, por lo que no es necesario limpiar la aguja y, al contrario que en el caso anterior, el consumo de muestra se corresponde con el volumen de inyección. La Figura 9.9 muestra el funcionamiento de estos sistemas.

186

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

2

A (preparado para inyectar)

4 3 1

5

2

B (cargando muestra)

4 3 1

5

2

C (inyección y cromatograma)

4 3 1

5

FIGURA 9.9. Proceso de inyección en un inyector automático de HPLC con bomba de desplazamiento positivo. (1): Válvula de inyección; (2): Bomba de desplazamiento positivo; (3): Unidad de muestreo; (4): De la bomba; (5): Hacia la columna.

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

•• •• ••

187

Cuando el sistema está preparado para inyectar (Figura 9.9A), la fase móvil fluye desde la bomba por la tubería 4, entra en la válvula de inyección y sale camino de la columna por la tubería 5. Mientras tanto, la bomba de desplazamiento positivo (2) está parada, la aguja está introducida dentro de la tubería atravesando la unidad de muestreo (3). En el momento de carga de la muestra (Figura 9.9B) la unidad de muestreo (3) coloca el vial con muestra en la posición adecuada. La bomba de desplazamiento positivo (2) succiona del vial el volumen de muestra establecido, que queda en el volumen de tubería entre la jeringa y la propia bomba. La fase móvil pasa desde la bomba hasta la columna siguiendo el mismo recorrido que en la Figura 9.9A. Para realizar la inyección (Figura 9.9C), la válvula (1) cambia de posición conectando la llegada de fase móvil de la bomba por la tubería 4 con la bomba de desplazamiento positivo (2). La válvula también conecta el circuito de inyección con la tubería (5) que va hacia la columna. En esta mueva situación, la fase móvil empuja la muestra a través de la aguja (pasando por la bomba de desplazamiento positivo) y la introduce, camino de la columna, por la tubería 5.

9.5. DETECTORES El detector es un dispositivo electrónico que registra una propiedad físico-química del material eluido por la columna en función del tiempo. Los detectores actuales tienen un amplio rango dinámico que, normalmente, permite trabajar en las escalas analítica y preparativa con el mismo aparato. Los detectores actuales tienen sensibilidades que permiten la detección de nanogramos de material y admiten rápidamente el cambio de una fase móvil a otra.

9.5.1. Características básicas de un detector de HPLC El detector de HPLC ideal debe cumplir los requisitos expuestos en la Tabla 9.3. TABLA 9.3. Características exigibles a un detector de HPLC Baja deriva Bajo ruido Alta sensibilidad Respuesta rápida Amplio intervalo dinámico lineal Bajo volumen muerto Insensibilidad a los cambios de presión, flujo, temperatura y composición del disolvente Sencillez de manejo No destructivo

188

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Ruido del detector Los cromatogramas son representaciones, en función del tiempo, de una propiedad del material que eluye por una columna. La aparición de un analito se traduce en el cromatograma en una fuerte variación del nivel basal medido en la propiedad de que se trate. Si el analito produce una señal muy baja, puede llegar a ser un problema diferenciar la elución de los analitos de las fluctuaciones de la señal producidas por «ruido». El ruido basal se define como la desviación de una recta de la línea base causada por fluctuaciones electrostáticas, temperatura, inestabilidad de la lámpara y otros factores. El ruido es el principal factor limitante de la sensibilidad, ya que dificulta la distinción de los picos pequeños. Normalmente una variación de la señal se considera pico cuando tiene una altura superior a 2 veces el valor del ruido promediado en todo el cromatograma. No obstante, a efectos cuantitativos este factor se incrementa a 5. La Figura 9.10 ilustra el nivel de ruido de la línea base y el pico más pequeño que podría ser inequívocamente detectado. Pico > 2 x ruido

deriva

Ruido

FIGURA 9.10. Ruido y deriva de señal de un detector de HPLC.

Deriva del detector Otro parámetro relacionado con la fluctuación de la señal del detector es la deriva. El ruido se considera como la variación de la señal en un determinado periodo de tiempo. No obstante, también debemos considerar que la línea base se debe desviar de la horizontal tan poco como sea posible. Esta desviación de la horizontalidad de la línea base es lo que se denomina deriva de la señal. La Figura 9.10 muestra gráficamente el concepto de deriva.

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

•• •• ••

189

Sensibilidad La sensibilidad es una de las propiedades más importantes de un detector de HPLC. La sensibilidad se describe como la capacidad para discriminar entre pequeñas diferencias en la concentración de analito. Este parámetro se ve directamente reflejado en la pendiente de la recta de calibrado. Así, a mayor pendiente, mayor sensibilidad del detector. La sensibilidad del detector no debe confundirse con el límite de detección (mínima cantidad de analito que es capaz de detectar). El límite de detección está influido por las condiciones cromatográficas ya que, por ejemplo, los picos que eluyen antes en el cromatograma suelen ser más agudos, mientras que los que eluyen al final son más anchos y por lo tanto más difíciles de distinguir de la línea base. Selectividad La selectividad es otra propiedad deseable en los detectores de HPLC. Un detector selectivo es aquel que permite ver solo un componente de interés a pesar de que coeluya con otros. Usualmente se considera que a mayor selectividad menor ruido y mayor sensibilidad. El detector de índice de refracción es un ejemplo de un detector no selectivo, ya que cualquier componente (incluido los de la fase móvil) da respuesta. Los detectores de absorción de luz UV-VIS son poco selectivos, ya que muchas sustancias absorben luz UV. Los detectores de fluorescencia y electroquímicos son más selectivos que los de absorción UV-VIS, ya que son pocas las sustancias que fluorescen o poseen un potencial redox significativo. Intervalo dinámico lineal La respuesta de un detector se considera lineal si la diferencia de respuesta entre dos concentraciones de un compuesto dado es proporcional a la diferencia entre las concentraciones. Este tipo de respuestas causa curvas de calibrado lineales. El intervalo dinámico lineal es el intervalo de concentraciones de analito que causa una respuesta lineal del detector. La Figura 9.11 muestra gráficamente este concepto.

9.5.2. Detector de absorción UV-VIS El detector de absorción de luz UV-VIS es el más popular entre todos los detectores de HPLC. De hecho, cuando un equipo incorpora más de un detector, siempre uno

190

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Señal

Máxima respuesta lineal

Ruido del detector x 2

Concentración

FIGURA 9.11. Representación del intervalo dinámico lineal.

de ellos es de absorción UV-VIS. Su funcionamiento es igual al de los espectrofotómetros descritos en la sección 4.4 de este libro. La única diferencia es que en este caso la muestra se coloca en una celda por la que fluye el material eluido de la columna. Existen tres variedades de detectores: 1) de longitud de onda fija; 2) de longitud de onda variable; 3) de batería de diodos (o diodo-array). La Figura 9.12 muestra el diseño de un detector de absorción UV-VIS de longitud de onda variable. Los detectores de longitud de onda fija tienen el mismo diseño pero funcionan un filtro en lugar de con una red de difracción.

Entrada de eluyente

Salida de eluyente

Red de difracción Hacia el transductor Fuente de luz UV-VIS

Ventanas para el paso de luz

FIGURA 9.12. Detector de HPLC de absorción UV-VIS.

La luz de la fuente pasa a través de la ventana y del tubo relleno del material eluido de la columna. La señal que llega al transductor es la diferencia entre luz emitida y luz absorbida. Esta diferencia es amplificada y trasformada en la señal que produce

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

•• •• ••

191

el cromatograma. La longitud de onda se selecciona de una de las tres formas siguientes: a) Mediante un filtro colocado delante de la celda. Por este sistema solo se puede medir la longitud de onda del filtro, por lo que los sistemas se denominan detectores de longitud de onda fija. Normalmente el filtro suele ser de 280 nm, que es una longitud de onda a la que absorbe muchas moléculas. Actualmente es casi imposible encontrar en el mercado un detector de longitud de onda fija y todos son de longitud de onda variable. b) Mediante una red de difracción que selecciona la longitud de onda deseada; esta longitud de onda puede ser variada desde el sistema informático de control, por lo que el detector se denomina de longitud de onda variable. Dado que la absorbancia es proporcional al paso de luz, se tiende a construir caminos de luz lo más largos posible y estrechos (de menor volumen) para así aumentar la sensibilidad del detector evitando la dilución de la muestra. Existe un tercer tipo de detector (c) llamado de batería de diodos o de diodo array. Estos sistemas tienen la capacidad de realizar espectros de absorción UVVIS del material eluido de la columna. Estos detectores aportan una importante información adicional muy útil para la identificación del analito y la determinación de su pureza. La Figura 9.13 muestra cómo un detector de batería de diodos permite obtener un cromatograma a una longitud de onda determinada y un espectro de absorción UVVIS en los momentos que se desee. El sistema se puede programar para que los espectros se realicen coincidiendo con la cima de los picos. De esta manera, se pueden identificar los analitos, además de por comparación con el tiempo de retención de patrones, por comparación de los espectros de estos con el espectro del material que eluye de la columna. Otra ventaja adicional del detector de batería de diodos es que el espectro del analito ayuda a identificar el máximo de absorción y permite reajustar las condiciones de trabajo para ganar sensibilidad. Además, este detector ayuda a determinar la pureza del material eluido en un pico. Cuando un analito eluye por la columna puro, el espectro de absorción que se obtiene debe ser idéntico al del patrón. En caso de que no lo fuera, se observarían diferencias en el espectro que nos indicarían que el pico no eluye puro. A veces las diferencias en los espectros son demasiado sutiles como para ser detectadas visualmente. Existen programas informáticos que, basándose en las relaciones de absorbancia a diferentes longitudes de onda, pueden ofrecer información acerca de la pureza del analito.

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Absorbancia

192

0.125 0.100 0.075 0.050 0.025 0 1

2

3 Tiempo (min)

0.10 0.05 0 –0.05 200

4

5

1.0

0.15

Absorbancia

Absorbancia

0

250

300

350

0.8 0.6 0.4 0.2 0 200

400

Longitud de onda (nm)

250

300

350

400

Longitud de onda (nm)

Absorbancia

0.3 0.2 0.1 0 200

250

300

350

400

Longitud de onda (nm)

FIGURA 9.13. Cromatograma con espectros de absorción UV-VIS obtenidos con detector de batería de diodos.

9.5.3. Detector de índice de refracción El índice de refracción depende de las propiedades refractantes del líquido analizado. El índice de refracción de la luz cambia al variar la composición del eluyente; por tanto, cuando un analito llegue al detector, va a producir un cambio de índice de refracción. Los detectores de índice de refracción son absolutamente universales: la presencia de cualquier analito produce una respuesta. Ello implica que los detectores de índice de refracción no se pueden utilizar con gradientes, ya que el cambio de composición de la fase móvil producirá un cambio de índice de refracción de la misma, independientemente de la presencia o no de analitos. Una aplicación muy generalizada de este detector es la detección de azúcares y polímeros.

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

•• •• ••

193

La Figura 9.14 muestra un diseño de un detector de índice de refracción. Se observa cómo un pulso de luz emitida por una fuente de luz pasa a través de la ventana de la celda y atraviesa la muestra, se refleja en un espejo y, a través de la muestra, vuelve a la fotocélula, que registra el ángulo con el que le llega la luz. La principal desventaja de este detector es que, dada su universalidad, no permite cambios de composición de la fase móvil, tiene una sensibilidad relativamente baja y es muy sensible a la temperatura, por lo que el detector debe estar termostatizado. Entrada del eluyente Fuente de luz

Cámara termostatizada a temperatura constante

Espejo

Ventana tranaparente para el paso de luz

Fotodiodo

Salida del eluyente

FIGURA 9.14. Detector de HPLC de índice de refracción.

9.5.4. Detector de fluorescencia El principio de funcionamiento del detector de fluorescencia de HPLC es similar al del fluorímetro estándar. Como se comentó en el capítulo 4, los fluorímetros son similares a los detectores de UV-VIS, pero registran la luz emitida en un ángulo de 90 °C con la luz incidente. La Figura 4.16 muestra un diagrama de funcionamiento de un detector de fluorescencia. La luz procedente de la lámpara pasa a través de un filtro que selecciona su longitud de onda de excitación. Cuando la muestra se excita, emite luz a la longitud de onda de emisión, que es seleccionada por un segundo filtro antes de llegar al transductor. Los detectores de fluorescencia son (junto al espectrómetro de masas) los más efectivos de entre todos los detectores de HPLC existentes. Típicamente, la sensibilidad

194

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

de fluorescencia de una molécula es entre 10 y 1000 veces mayor que su sensibilidad de absorbancia. A veces se aplica una técnica denominada derivatización, que consiste en modificar el analito de manera específica para transformarlo en una molécula fluorescente. Si bien la aparición de fluorescencia puede permitir la detección de una molécula por un método muy sensible, la derivatización presenta el inconveniente de que añade a la muestra tratamientos adicionales antes del análisis. Una aplicación típica de del detector de fluorescencia con derivatización previa es la detección de aminoácidos.

9.5.5. Detector electroquímico (amperométrico) El detector electroquímico mide, mediante un electrodo apropiado, la corriente resultante de una reacción rédox del analito. La corriente generada en la reacción rédox es proporcional a la concentración de analito, por lo que el detector puede también ser utilizado para cuantificación. La fase móvil empleada con el detector electroquímico debe ser eléctricamente conductora. Muchos analitos requiere ajustes muy precisos del pH para ser detectados por este sistema. La pureza de la fase móvil es muy importante, ya que la presencia de oxígeno, contaminación de metales y halógenos puede causar problemas de ruido de fondo y deriva de la línea base. La Figura 9.15 muestra la estructura de un detector electroquímico. El sistema consta de un potenciómetro de tres electrodos conectado a los electrodos de trabajo, de referencia y auxiliar. La fase móvil entra por la cabeza del detector y pasa sobre el electrodo de trabajo a través de un fino canal. El detector se pone en funcionamiento ajustando el electrodo de trabajo a un potencial dado y registrando la corriente en función del tiempo. Si los analitos tienen diferentes potenciales de oxidación-reducción, la discriminación se realiza ajustando los potenciales del electrodo de trabajo. El electrodo de trabajo se puede construir con materiales tales como platino, oro, carbón vítreo o grafito. Los electrodos de referencia pueden ser diversos. La Figura 9.15 muestra un electrodo de Ag/AgCl. El electrodo auxiliar es un tubo capilar metálico en contacto con el eluyente. Las áreas de aplicación del detector electroquímico no son grandes. Sin embargo, se puede utilizar para detectar muchos tipos de contaminantes ambientales y productos naturales. Dada la especificidad del detector, es posible utilizarlo en matrices muy complejas como fluidos corporales. La sensibilidad de este detector a productos como fenoles, catecolaminas, nitrosaminas y ácidos orgánicos está en el rango de los picomoles.

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

Tubo eléctricamente conductor Electrodo de referencia Ag/AgCl

•• •• ••

195

Entrada de eluyente

Salida de eluyente

Material aislante

Electrodo de trabajo Potenciómetro de tres electrodos Electrodo auxiliar

FIGURA 9.15. Estructura del detector electroquímico de HPLC.

9.5.6. Detector conductimétrico El detector conductimétrico detecta cambios en la conductividad de la fase móvil debido a la aparición de un analito. La conductividad del eluyente se mide usando un equipo de corriente alterna. Los electrodos son cilindros huecos, metálicos y que se hallan en contacto con el eluyente, pero separados por una región no conductora. La conducción de una corriente eléctrica a través de una disolución iónica se realiza por medio del movimiento de los iones de la disolución. Una forma de conocer la capacidad conductora de la disolución es poner dos electrodos en la disolución y medir su resistencia. La resistencia va a depender de: a) el área de superficie de los electrodos; b) la forma de los electrodos; c) la posición de los electrodos entre sí en la disolución; d) el tipo de especies en la disolución; e) la concentración de las especies; f) la temperatura (la conductividad iónica cambia un 2% por cada °C). Los valores experimentales de las conductividades se obtienen casi siempre utilizando celdas con electrodos en posición. La cuantificación de las medidas de conductividad se puede hacer calibrando los instrumentos con disoluciones iónicas de concentración conocida y, después, midiendo la conductividad de la muestra. Los detectores de conductividad solo encuentran aplicación en el campo de la cromatografía iónica.

196

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

9.5.7. Detector espectrómetro de masas En la última década se han hecho progresos significativos en el desarrollo de las interfases para el detector de espectrometría de masas. El detector de espectrometría de masas es el detector más sensible, selectivo y universal. Hablaremos con profundidad de este detector en el capítulo dedicado a la espectrometría de masas.

9.6. IDENTIFICACIÓN DE ANALITOS EN HPLC La identificación de analitos en HPLC se puede realizar por dos procedimientos: 1) Comparando el tiempo de retención con el de un patrón. 2) Comparando el espectro de absorción ultravioleta visible o espectro de masas (hablaremos de espectros de masas en un capítulo posterior). Ninguno de los detectores utilizados en HPLC permite la identificación segura de la estructura molecular de los analitos. En realidad, lo que se hace es comparar los tiempos de retención con los de patrones idénticos al del analito que se desea identificar. Ello obliga a tener una idea de la composición previa de la muestra para saber que patrones se deben utilizar. Como se comentó en el capítulo 4, el espectro de absorción UV-VIS no es un dato suficiente para confirmar la identidad de un analito. Sin embargo, la coincidencia de los espectros de absorción y de los tiempos de retención con los de un patrón conocido refuerza la identificación del compuesto. El detector de espectrometría de masas produce espectros que dependen de las condiciones de realización, es decir, que al contrario de los espectrómetros de masas acoplados a cromatografía de gases, el espectro de masas no puede ser tomado como «huella dactilar» universal del compuesto. No obstante, el espectro de masas obtenido en HPLC proporciona un apoyo (de mucho más peso que el espectro de absorción) para la identificación del compuesto en caso de coincidencia con los tiempos de retención. Si disponemos de un patrón y comparamos los espectros de masas del patrón con el espectro de masas del pico de la muestra ante un mismo tiempo de retención, y ambos (medidos en las mismas condiciones) coinciden, tendremos una seguridad absoluta de la identidad del analito.

9.7. CUANTIFICACIÓN DE ANALITOS EN HPLC La respuesta de los detectores de HPLC es proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra. Esto proporciona la oportunidad de cuantificar el analito, comparando la respuesta del detector cuando pasa la muestra con la respuesta del detector cuando se pasan patrones de concentración conocida.

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

•• •• ••

197

La respuesta del detector (y por lo tanto la cantidad de analito) se parametriza utilizando el tamaño del pico. Los parámetros que definen el tamaño del pico son: 1) la altura y, 2) el área. En las etapas iniciales de la cromatografía, para cuantificar el área del pico en un registro en papel se recortaba y se pesaba. Se representaba el peso del papel en función de la concentración y se interpolaba el peso del papel del pico del analito que se estudiaba. Actualmente este método ya no se utiliza. La altura de pico también es un parámetro sencillo de obtener sobre un registro gráfico. Simplemente se mide la distancia desde la línea base hasta la cima del pico y se representa en función de la concentración. Este sistema puede ser útil en caso de trabajar con picos muy agudos. Sin embargo, se introducen errores significativos si el pico no es agudo. Por ejemplo, los cromatogramas de la Figura 7.3 corresponden a analitos de idéntica concentración y sin embargo se observa una gradual disminución de la altura de los picos al aumentar el porcentaje de fase acuosa. Los picos insuficientemente resueltos o extremadamente pequeños también causan problemas en la cuantificación a través de la altura del pico. Una medida más real del tamaño del pico es su área. La integración de los picos de los diversos cromatogramas de la Figura 7.3 muestra para todos un área casi idéntica (como corresponde a inyecciones de cantidades equivalentes de analito). El área de los picos se puede estimar de forma sencilla asumiendo que son triángulos (área del triángulo = (base × altura)/2). No obstante, de nuevo se introducen errores importantes cuando los picos no son triángulos perfectos o están mal resueltos. Para resolver este problema se desarrollaron los integradores, que son aparatos que utilizan diversos criterios matemáticos para estimar el área del pico. Actualmente todos los sistemas de HPLC llevan incorporados sistemas de integración computerizada capaces de aplicar los algoritmos necesarios para obtener integraciones de acuerdo a las instrucciones del operador, permitiendo estimar las áreas incluso cuando se produce solapamiento parcial de los picos, como se muestra en la Figura 6.6.

9.8. CURSOS DE HPLC EN INTERNET Puede encontrar mucha información en Internet sobre HPLC, dos de las direcciones que pueden ser interesantes son: 1) Manual sobre HPLC: http://hplc.chem.shu.edu/new/hplc_book/index.html 2) Curso ON-LINE de HPLC del Forum Scientific Education http://www.forumsci.co.il/hplc/program.html Ambas páginas se encuentran activas en julio de 2004.

10

Cromatografía de gases (GC)

CONTENIDO 10.1. Conceptos básicos en cromatografía de gases (GC) 10.1.1. Clasificación de GC según el tipo de columna 10.1.2. Clasificación de GC según la fase estacionaria 10.1.3. Muestras analizables por cromatografía de gases 10.1.4. Gas portador 10.1.5. Identificación y cuantificación de picos en cromatografía de gases 10.2. Columnas en cromatografía de gases 10.2.1. Columnas empaquetadas 10.2.2. Columnas capilares 10.2.3. Fases estacionarias de las columnas 10.3. Inyectores y modos de inyección en cromatografía de gases 10.3.1. Inyector de columnas empaquetadas 10.3.2. Inyector de columnas capilares 10.3.3. Modo de inyección «split» (con división de flujo) 10.3.4. Modo de inyección «splitless» (sin división de flujo) 10.4. Temperatura en cromatografía de gases 10.5. Detectores en cromatografía de gases 10.5.1. Detector de conductividad térmica (TCD) 10.5.2. Detector de ionización a la llama (FID) 10.5.3. Detector de captura electrónica (ECD) 10.5.4. Detector de fósforo-nitrógeno (NPD) 10.5.5. Detector fotométrico de llama (FPD) 10.5.6. Detector espectrómetro de masas (MS)

10.1. CONCEPTOS BÁSICOS EN CROMATOGRAFÍA DE GASES La cromatografía de gases (GC) o cromatografía gaseosa es una técnica que ha sido ampliamente utilizada en los últimos 50 años. Los parámetros que describen la 199

200

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

eficacia de GC son los mismos que lo hace para la LC. En GC los analitos (siempre en estado gaseoso) se distribuyen entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria que puede ser un sólido o un líquido. Al igual que en la LC, la separación de los analitos de una mezcla por GC se produce en función de cómo las especies químicas se distribuyan entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuanto mayor sea la afinidad del analito por la fase gaseosa, más rápido se moverá por la columna y menor será el tiempo de elución. Contrariamente, cuanto mayor sea la afinidad del analito por la fase estacionaria, mayor será el tiempo de retención. La Figura 10.1 muestra las partes básicas de un equipo de GC. El gas portador es almacenado a alta presión en una botella apropiada conectada al equipo mediante un regulador de presión. La muestra se introduce en el sistema mediante jeringas, utilizando los inyectores. El inyector está a una temperatura superior a la del punto de ebullición del disolvente de la muestra y, normalmente, también superior al de los analitos; y es ahí donde se produce la necesaria volatilización de los mismos. Si la columna es capilar (formato más habitual hoy en día) normalmente la muestra se diluye con gas portador y solo una fracción de la misma entra en la columna. Esta es la misión del divisor de muestra. En las columnas se realiza la separación. La separación es fuertemente dependiente de la temperatura, por lo que la columna se encuentra dentro de un horno. Tras atravesar la columna, los analitos llegan a los detectores, donde se produce una señal eléctrica que es amplificada y enviada a un sistema de almacenado de datos para ser analizada. Los detectores pueden requerir gases adicionales para su funcionamiento (no mostrado en la Figura).

Controlador de flujo Inyectores Datos Divisor de muestra

Control de división de flujo Columna capilar

Detectores

Columna empaquetada Horno calefactor Depósito de gas portador

FIGURA 10.1. Diagrama de las partes básicas de un cromatógrafo de gases.

Cromatografía de gases (GC)

•• •• ••

201

10.1.1. Clasificación de GC según el tipo de columna a) Columnas empaquetadas. La fase estacionaria está constituida por partículas empaquetadas dentro de una columna de acero inoxidable o vidrio de entre 2 y 3 m de largo y con un diámetro interno de entre 2 y 4 mm (Figura 10.2A). La eficacia cromatográfica típica de estas columnas es de unos 5000 platos teóricos. Estas columnas se utilizaron en las primeras etapas de desarrollo de la GC, sin embargo están actualmente casi en desuso. b) Columnas capilares. Poseen diámetros internos menores de 1 mm. La longitud oscila entre 25 y 100 m (Figura 10.2B). La columna es habitualmente de sílice fundida y sus paredes internas están recubiertas de una película de fase estacionaria, mientras que las externas lo están de poliimida, compuesto que le otorga mayor flexibilidad. La eficacia cromatográfica de estas columnas ronda los 200000 platos teóricos. Esta es la razón por la que las columnas capilares han sustituido casi totalmente a las columnas empaquetadas.

FIGURA 10.2. Columnas empaquetada (A) y capilar (B) de cromatografía de gases empaquetada.

La Tabla 10.1 compara las características de ambos tipos de columnas.

10.1.2. Clasificación de GC según la fase estacionaria a) Cromatografía gas-sólido. La fase estacionaria es un sólido. La separación se debe al equilibrio propiciado por la adsorción-desorción del analito con el sólido adherido a las paredes internas de la columna.

202

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

TABLA 10.1. Comparación entre características de columnas empaquetadas y capilares Empaquetada

Capilar

Diámetro interno columna (mm)

3-6

0.10-0.53

Longitud de columna (m)

1-3

30-50

Platos teóricos / m columna

1000-5000

1000-8000

Platos teóricos totales

1000-5000

25000-200000

Capacidad total (μg componente)

100

0.05-5

Superficie de la fase estacionaria (m2)

0,2

10–6-10–7

Caudal (mL/min)

20-100

0.5-5

Flujo lineal (cm/s)

10-50

20-50

b) Cromatografía gas-líquido. La fase estacionaria es un líquido de alto punto de ebullición (superior a 350 °C) sobre un soporte sólido. Los analitos se retienen más o menos sobre la fase estacionaria en función de su solubilidad en el líquido.

10.1.3. Muestras analizables por cromatografía de gases Es analizable por GC todo compuesto con un punto de ebullición inferior a unos 250 °C. Una limitación adicional a la del punto de ebullición es que la sustancia debe ser estable en estado gaseoso y no pirolizarse (romperse por acción del calor). Excepcionalmente, en la llamada GC pirolítica, el analito se descompone deliberadamente a altas temperaturas y son los productos de descomposición los que se analizan. La GC pirolítica se utiliza en el análisis y comparación de la composición de materias complejas como pinturas, fracciones pesadas del petróleo, plásticos, etc. En el otro extremo de temperaturas, la columna de GC puede enfriarse para las separaciones de sustancias con puntos de ebullición muy bajos, como H2 o metano. Existen métodos de análisis de estos compuestos con temperaturas que van de la ambiental a –80 °C. A veces se puede recurrir a la derivatización. Es decir, a someter al analito a una reacción química que lo transforme en un compuesto analizable por GC. La derivatización tiene dos finalidades: 1) transformar el analito en un compuesto volatilizable y 2) transformar el analito en un compuesto que cause una mayor señal en el detector. Un ejemplo del primer caso lo constitulle las transformaciones de ácidos carboxílicos (puntos de ebullición cercanos a 200 °C) en los correspondiente ésteres metílicos (puntos de ebullición cercanos a 100 °C). Una derivatización típica de se-

Cromatografía de gases (GC)

•• •• ••

203

gundo grupo sería la adición de átomos de cloro a una molécula cuando se utiliza un detector de captura electrónica (muy sensible a los halógenos). En cualquier caso, la norma general es que, si el punto de ebullición está por encima de 200-230 °C, la LC debe ser la primera opción.

10.1.4. Gas portador El gas portador debe cumplir dos propósitos: 1) arrastrar los analitos por el interior de la columna; y 2) proporcionar una matriz adecuada al detector. Los requisitos que deben concurrir en un gas portador son: a) debe ser inerte, es decir, no debe reaccionar con la muestra; b) debe estar fácilmente disponible y con una alta pureza; y 3) debe ser económico. Los gases portadores más comúnmente utilizados son He, Ar, N2 e H2. Las presiones que debe suministrar el gas portador en la cabeza de la columna oscilan entre 50 y 200 kPa y los flujos en el interior del sistema deben ser de entre 10 y 50 mL/min. Actualmente la mayoría de equipos dispone de medidores y reguladores electrónicos de flujo. No obstante, todavía está muy extendido el medidor de flujo de burbuja, como el que muestra la Figura 10.3.

FIGURA 10.3. Medidor de flujo de burbuja.

Este dispositivo es una probeta de cristal graduada para 1, 10 y 100 mL. Funciona depositando agua jabonosa en la tetina inferior de caucho y conectando el tubo de goma a los respiraderos de flujo del cromatógrafo. Cuando pulsamos ligeramente la tetina, las burbujas suben a través de la probeta impulsadas por el gas portador. El flujo se calcula dividiendo el volumen que recorre la burbuja (1, 10 o 100 mL) entre el tiempo empleado.

10.1.5. Identificación y cuantificación de picos en cromatografía de gases Al igual que en LC, la identificación de picos se realiza por comparación de los tiempos de retención de la muestra y de patrones de identidad conocida. El detector clásico más universal es el de ionización a la llama, existiendo otros detectores de usos algo más específicos como el de fósforo-nitrógeno, captura electrónica, etc. De

204

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

entre todos los detectores usados en GC solo el espectrómetro de masas es capaz de identificar inequívocamente un compuesto. Hablaremos en un capítulo posterior del espectrómetro de masas acoplado a un cromatógrafo de gases. Se puede adelantar que es un detector universal, es decir, que reacciona con todas las moléculas, y que además es capaz de ofrecer el espectro de masas del analito. El espectro de masas de una molécula obtenido a partir de GC es único e identificativo de esa molécula, por lo que puede ser considerado como la «huella dactilar» universal de cada compuesto. Por lo tanto, si se dispone de una colección adecuada de espectros de masas o de la experiencia necesaria para analizarlos, es posible identificar cada pico del cromatograma sin necesidad de comparar el tiempo de retención de analitos y patrones. La cuantificación de los picos de GC se realiza siguiendo los mismos criterios que en LC (ver sección 9.7).

10.2. COLUMNAS EN CROMATOGRAFÍA DE GASES 10.2.1. Columnas empaquetadas Los tamaños de partícula se expresan en función del tamaño de malla del empaquetado. Estos números definen el tamaño del hueco en un tamiz. Cuanto más alto sea el número, más densa será la malla y menor el diámetro de la partícula del empaquetado. Por ejemplo: «tamiz 80/100» significa que las partículas pasan a través de tamiz de 80 pero se retienen en tamiz de 100. La capacidad de la columna (y los tiempos de retención del analito) aumentan a medida que disminuye el tamaño de la partícula. Esta relación inversa se da porque el área por unidad de peso (y en consecuencia el número de centros activos) se incrementa con la disminución del tamaño de partícula.

10.2.2. Columnas capilares El parámetro que define las columnas capilares es el denominado proporción de fase, que relaciona el diámetro del capilar con el espesor de la película de fase estacionaria. Así, si r es el diámetro interno de la columna y dP es el grosor de la película, la proporción de fase de la columna vendría definida por la relación: β = r / 2 dP El parámetro β ayuda a determinar el tipo de columna necesaria para separar analitos. Así, columnas con bajos β son útiles para compuestos de bajo peso molecular y apolares, ya que se requiere mayor volumen de gas para retardar estos compuestos tan fácilmente eluibles. La Tabla 10.2 relaciona la proporción de fase con la aplicación cromatográfica que le corresponde.

•• •• ••

Cromatografía de gases (GC)

205

TABLA 10.2. Aplicaciones de distintas proporciones de fase β

Aplicación

16-100

Gases, hidrocarburos de bajo peso molecular, disolventes, compuestos volátiles halogenados (peso molecular 16-350).

100-320

Semivolátiles, aplicaciones generales (peso molecular 100-700).

320-1325

Hidrocarburos de alto peso molecular, ceras, productos del petróleo (peso molecular 300-1500).

Además, la proporción de fase ayuda a comparar cromatogramas con diferentes columnas, ya que las columnas capilares de distinto diámetro pero igual β generan los mismos cromatogramas.

10.2.3. Fases estacionarias de las columnas La Tabla 10.3 muestra las columnas recomendadas para distintos tipos de muestra. Las fases estacionarias gas-sólido y gas-liquido más ampliamente utilizadas se muestran en las Tablas 10.4 y 10.5 respectivamente. TABLA 10.3. Columnas recomendadas para varios tipos de muestras Compuesto

Fase estacionaria

Tipo

Gases

Tamices moleculares

Gas-sólido

Gases ligeros

Polímeros porosos

Gas-sólido

Líquidos no polares

Metilsiloxanos

Gas-líquido

PCBs, muestras petroquímicas Herbicidas/plaguicidas,

Polisiloxanos-carboranos

Gas-líquido

Farmacéuticos

Fenil polisilfenilsiloxanos

Gas-líquido

Azúcares

Cianopropilfenil metilsiloxanos

Gas-líquido

Ácidos grasos, alcoholes

Polietilenglicoles

Gas-líquido

Alcoholes, aminas

Femilmetilsiloxanos (>50% fenil)

Gas-líquido

TABLA 10.4. Fases estacionarias más comunes en cromatografía gas-sólido Alúmina, gel de sílice, carbono, grafito, tamiz molecular (zeolitas), polímeros orgánicos porosos.

206

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

TABLA 10.5. Fases estacionarias para cromatografía gas-líquido Límite de temperatura

Estructura

150 300 300

A B (n = 100%, m = 0) B (n = 95%, m = 5%)

300 225

C (n = 86%, m = 14%) B (n = m = 50%)

Polares 50% cianopropil/50% metipolisiloxano 50% trifluoropropil/50/ metipolisiloxano polietilenglicol

275 250 225

E F G

Muy polares 70%cianopropilpolisilfenilenosiloxano poli (dietilenglicol succinato)

250 200

H I

Fases líquidas

No polares escualeno 100% metilpolisiloxano 5% fenil/95% metipolisiloxano Moderadamente polares 14% cianopropilfenil/86% metilpolisiloxano 50% fenil/50% metipolisiloxano fenilsiloxano carborano

CN (CH3)2CH(CH2)3CH(CH2)3CHCH2CH2— CH3

CH3

A

2

CH3

C6H5

(CH2)3

CH3

—O—Si———O—Si———

—O—Si———O—Si——— CH3

C6H5

n

m

CH3

B

C6H5

n

C

O CF3

CN

—Si—

(CH2)2

(CH2)3 CH3 —Si—O— CH3

—O—Si———

—O—Si———

CH3

CH3

n

E

F

D CN CH3 HO—CH2—CH2—O—H

—O—Si—

n

CH3

(CH2)3

CH3

—Si————O—Si——— CH3

n

G

(CH2)3 CN

H O

O

—O—(CH2)2—O—(CH2)2—OC—(CH2)2—C— N

I

m

n

m

Cromatografía de gases (GC)

•• •• ••

207

10.3. INYECTORES Y MODOS DE INYECCIÓN El inyector es la zona del cromatógrafo de gases que introduce la muestra en la columna y vaporiza los elementos de la misma para que puedan ser cromatografiados. Para que las separaciones sean eficaces, reproducibles y con los picos lo mejor resueltos posible (sin ensanchamiento de las bandas) la inyección se debe realizar en el menor tiempo posible. A su vez, para que la evaporación sea eficaz, la temperatura del inyector ha de ser superior a la del punto de ebullición del disolvente y preferiblemente también a la de los puntos de ebullición de los analitos. Esto supone que el inyector está siempre a una temperatura superior a la de la columna. La temperatura del inyector se debe determinar empíricamente, aunque la norma general es que a mayor temperatura del inyector mayor volatilización, más señal, y por lo tanto mayor sensibilidad. La inyección puede realizarse de manera manual o mediante un dispositivo automático. Los inyectores automáticos mejoran notablemente la reproducibilidad de los cromatogramas, especialmente en lo que se refiere a la cuantificación. La mayor dificultad de la inyección manual reside en la reproducibilidad de la misma, ya que no es fácil medir con precisión y sensibilidad volúmenes de entre 1 y 5 μL. Además, la velocidad de introducción de la muestra en el inyector también afecta a la reproducibilidad de los tiempos de retención y a la forma de los picos, y difícilmente la velocidad de inyección manual es idéntica de un pinchazo a otro.

10.3.1. Inyector de columnas empaquetadas La Figura 10.4 muestra un inyector de columna empaquetada. El diseño es mucho más sencillo que los de columna capilar. El interior y el exterior del inyector están separados por un sello de goma que se suele denominar «séptum». La muestra se inyecta con una jeringa a través del séptum. El séptum ha de ser perforado por la aguja de la jeringa en el momento de la inyección. Cuando se realiza la inyección la jeringa se retira y la goma perforada del séptum se retrae restaurando el sello. El séptum es un elemento que debe ser cambiado regularmente en función del número de pinchazos, ya que tras un cierto número de ellos, el sello deja de ser hermético. Tras la inyección, la muestra queda depositada dentro de un tubo de vidrio (inserto) llamado liner (alineador) que la conduce al interior de la columna. El gas portador entra por una ramificación lateral del tubo de vidrio para impulsar la muestra. La columna se halla conectada al inyector por la parte inferior de este mediante una férula de grafito. Todo el inyector está insertado en un bloque termostatizado para conseguir la volatilización de la muestra. En el inyector de columna empaquetada toda la muestra que se inyecta entra dentro de la columna, cosa que no siempre ocurre en los inyectores de columnas capilares.

208

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Tuerca para la sujección del séptum

Séptum

Bloque calefactor

Alineador (liner)

Bloque calefactor

Entrada de gas 1 portador Bloque calefactor

Férula

Columna empaquetada

1 = Manómetro regulador de la presión total

FIGURA 10.4. Diagrama de un inyector de columna empaquetada.

Encontrará una animación sobre el funcionamiento de un inyector de columna empaquetada en: http://www.savant4training.com/35a+.htm (Página activa en julio de 2004.)

10.3.2. Inyector de columnas capilares La inyección de muestras en columnas capilares es técnicamente más complicada que la inyección en columnas empaquetadas por dos razones: a) el diámetro de la columna capilar es mucho menor, y; 2) la cantidad de muestra introducida en la fase estacionaria ha de ser pequeña para no saturar los centros activos de esta. Estas dos limitaciones hacen que los diseños de los inyectores de columnas capilares (Figura 10.5) sean más complicados que los de las columnas empaquetadas. La Tabla 10.1 muestra como la capacidad de carga (cantidad máxima de analitos que se puede introducir en la columna sin saturar los centros activos de la misma) de una columna capilar es entre 20 y 2000 veces menor que la de una columna empaquetada. Como norma general, se debe tener en cuenta que la cantidad de muestra que se debe inyectar ha de ser tal que todos sus componentes puedan interaccionar simultáneamente con la fase estacionaria.

Cromatografía de gases (GC)

Tuerca para la sujección del séptum

•• •• ••

209

Séptum Alineador (liner)

Bloque calefactor Entrada de gas 1 portador

Bloque calefactor 2 3

Bloque calefactor

Bloque calefactor

Férula

Columna capilar

1 = Manómetro regulador de la presión total 2 = Manómetro regulador de la presión en la purga del séptum 3 = Manómetro regulador de la presión de las salida de split

FIGURA 10.5. Diagrama de un inyector de columna capilar.

Si comparamos la Figura 10.4 con la 10.5, observamos que ambos inyectores tienen partes comunes, como la tuerca para la sujeción del séptum, el séptum, el inserto de vidrio y la entrada de gas portador. Sin embargo, la Figura 10.5 muestra en su parte derecha dos salidas de gases, la salida de gases de venteo y la salida de gases de la purga del séptum. Este dispositivo será el encargado de, cuando sea necesario, diluir la muestra en las proporciones apropiadas antes de ser introducida en la columna. El dispositivo suele denominarse «divisor de muestra» y aparece indicado en la columna capilar de la Figura 10.1. Obsérvese como la columna empaquetada de la Figura 10.1 no presenta este dispositivo. El divisor de muestra (Figura 10.6) hace que sea posible inyectar muestra en dos modos diferentes. En modo «split» (con división de muestra) y en modo «splitless» (sin división de muestra).

10.3.3. Modo de inyección «split» (con división de flujo) En el modo de inyección split, la muestra se diluye con el gas portador de modo que solo una parte entra en la columna. El resto de la muestra sale por el respiradero de purga. El modo split se utiliza generalmente para analizar componentes mayoritarios de muestra o para analizar muestras que, por su estado físico, no se pueden diluir antes de la inyección. Además, en modo split la resolución puede ser más alta porque, evita saturaciones y formación de «colas» en los picos.

210

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

El divisor de muestra consta de dos válvulas. Una válvula lateral, que conecta con el inyector propiamente dicho y la columna, y una válvula superior en la línea del flujo de purga del séptum. La misión del flujo de purga del séptum es eliminar residuos de descomposición del propio séptum (recordemos que es una goma permanentemente sometida a altas temperaturas). Durante la inyección en modo split las válvulas del divisor de muestra se hallan en las posiciones indicadas en la Figura 10.6A. El sistema permite regular tres parámetros: a) el flujo total, b) la presión en la cabeza de la columna y c) el flujo de la purga del séptum. En la Figura 10.6A se fija un flujo total de 52 mL/min, un flujo de purga del séptum de 1 mL/min y una presión en la columna que necesita 50 mL/min de flujo para ser mantenida. Como el séptum arrastra 1 mL/min en el inyector entran 51 mL/min. De los 51 mL/min que pasan al inyector, necesariamente 50 mL/min se desviarán por la válvula que controla la purga para mantener la presión fijada. Esta relación determinará que solo 1 mL/min fluya por la columna. Así pues, en estas condiciones, al inyectar una muestra, solo entrará en la columna 1/51 del total. La relación de split se define paramétricamente como: flujo por el respiradero de split Relación de split = —————————————– flujo en columna Así pues, la relación de split nos indica que cuanto mayor sea la relación menor será la cantidad de muestra que entra en la columna. La Figura 10.7 muestra varios cromatogramas de la misma sustancia inyectados en diferentes relaciones de split. Se observa que al aumentar la relación, disminuye el área del pico del cromatograma. Los equipos de GC antiguos (pero de los que todavía existen muchos en funcionamiento) regulan el flujo a través del manómetro de presión de la botella donde se almacena el gas portador y de manómetros adicionales en el equipo, que regulan la presión total y en la cabeza de la columna. En estos equipos, si además de la presión en la cabeza de la columna, se desea saber cual es el flujo dentro de la columna, se debe calcular utilizando la siguiente relación: Velocidad de flujo volumétrico dentro de la columna (cm3/min) = μ (cm/min) × área de la columna (cm2) = μ × π × r2 donde μ es la velocidad lineal dentro de la columna y r es el radio interno de la misma. La velocidad dentro de la columna se expresa en cm/min y se calcula inyectando un componente que no interaccione con la fase estacionaria (normalmente metano o dióxido de carbono) y dividiendo la longitud de la columna en cm entre los minutos que tarde en llegar esta sustancia no retenida al detector. Los equipos actuales (disponibles desde la segunda mitad de los noventa) cuentan con reguladores electrónicos de flujo total, flujo en la columna, velocidad en la columna y relación de split.

Cromatografía de gases (GC)

•• •• ••

211

A: Modo de inyección split (con división) Control de flujo total

Inyector capilar

Control de purga del séptum

52 mL/min

Respiradero de la purga 1 mL/min

51 mL/min 50 mL/min

1 mL/min, flujo de purga del séptum 50 mL/min Presión en la cabeza de la purga

Válvula que controla la purga

Respiradero de con división

50 mL/min, flujo del inyector de purga Al detector (1 mL/min) 1 mL/min

Columna

B: Modo de inyección splitless (sin división) Control de flujo total

Control de purga del séptum

Inyector capilar

51 mL/min

1 mL/min

52 mL/min

1 mL/min

Respiradero de la purga 1 mL/min

50 mL/min

Válvula que controla la purga

Presión en la cabeza de la purga

Respiradero de con división

50 mL/min, flujo del inyector de purga Al detector (1 mL/min) 1 mL/min

Columna

FIGURA 10.6. Representación del divisor de muestra funcionando en modo split (A) y splitless (B).

Los equipos modernos permiten un modo especial de inyección llamado «split pulsado» (pulse split). Este sistema de inyección introduce un pulso de presión justo antes del comienzo de la inyección, la presión normal retorna a la columna tras un tiempo predeterminado. El pulso de presión ayuda a que la muestra penetre más rápidamente en la columna, reduciendo así las posibilidades de descomposición térmica en el inyector (recordemos que el inyector se halla a una temperatura superior

212

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

a la de la columna y superior a la del punto de ebullición de los analitos). Esto se traduce en algunos casos en un aumento de la sensibilidad del método. El pulso se puede aplicar independientemente de la relación de split.

10.3.4. Modo de inyección «splitless» (sin división de flujo) En el modo de inyección splitless la válvula lateral del divisor de muestra está cerrada durante la inyección (Figura 10.6B). Si utilizamos las mismas condiciones de flujo total (52 mL/min), 1 mL/min de purga de séptum y la misma presión en la cabeza de la columna que en la Figura 10.6A, observamos como al permanecer cerrada la válvula lateral del divisor de muestra y al estar regulado el flujo en el séptum a 1 mL/min, necesariamente se ha de abrir la válvula superior para permitir que 50 mL/min mantengan la presión en la cabeza de la columna. Esta relación permite que de nuevo solo 1 mL/min entre en la columna. Sin embargo, a diferencia del modo split, en esta ocasión todo el caudal que entra en el puerto de inyección pasa a la columna, por lo que el 100% de la muestra inyectada alcanzará el detector. A un tiempo determinado tras la inyección, las válvulas del sistema vuelven a la posición de la Figura 10.6A para evitar la acumulación de vapores. La Figura 10.7 muestra como el área de un pico inyectado en modo splitless es superior a la de los picos de cantidades de muestra idénticas inyectadas en diversas relaciones de split. El modo de inyección splitless también dispone de un modo pulsado (pulse splitless). La idea es análoga a la del split pulsado. Aumentar la presión en el momento de la inyección para disminuir el tiempo de residencia de la muestra en el inyector, disminuyendo los riesgos de pirólisis.

Encontrará una animación sobre una inyección en modo split en: http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/animation/split.mov (Página activa en julio de 2004.)

Encontrará una animación sobre una inyección en modo splitless en: http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/animations/splitless.mov (Página activa en julio de 2004.)

Cromatografía de gases (GC)

Señal

5e + 5

•• •• ••

213

A: modo splitless

4e + 5

Área de pico = 58 unidades

3e + 5 2e + 5 1e + 5

Señal

2e + 5

B: modo aplit, relación split = 20

2e + 5 Área de pico = 20 unidades 1e + 5 5e + 4 C: modo split, relación aplit = 50

Señal

75000 50000

Área de pico = 0.59 unidades

25000

D: modo split, relación aplit = 100

Señal

40000 30000 20000

Área de pico = 0.22 unidades

10000

Señal

40000

E: modo split, relación aplit = 200

30000 20000 10000

Área de pico = 0.12 unidades 6

7

8

9

10

Tiempo (min)

FIGURA 10.7. Efecto de la división de muestra sobre el área de los picos. En todos los cromatogramas se inyectó 1 μL de paraoxon 500 μM en modos splitless (A) y split con las relaciones indicadas en cada caso (B-E). Las temperaturas del inyector y detector se mantuvieron constantes a 300 y 280 °C respectivamente. La temperatura del horno se aumentó a 20 °C/min desde 60 a 200 °C. La columna fue una HP5 (metil siloxano) de 25 m de longitud, 0.20 mm de diámetro interno y 0.11 μm de tamaño de partícula. El flujo en la columna fue de 1 mL/min. El detector fue un espectrómetro de masas y la señal monitorizada corresponde al pico de relación m/z = 275, 149 y 109.

214

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

10.4. TEMPERATURA EN CROMATOGRAFÍA DE GASES La temperatura es el factor más determinante en las separaciones por cromatografía de gases. Para obtener resultados reproducibles, el horno donde se encuentra la columna debe ser capaz de controlar la temperatura con una precisión de ±0,5 °C. El aumento de la temperatura de la columna acelera la elución de los analitos, ya que aumenta su volatilidad (como consecuencia del aumento de la presión de vapor) y por lo tanto la velocidad con que se desplazan en la fase móvil.

En GC el aumento de temperatura disminuye el tiempo de elución.

La Figura 10.8 muestra el efecto de la temperatura sobre la separación cromatográfica de dos componentes. Los cromatogramas A, B y C están realizados en condiciones isotermas (temperatura constante) a 200, 175 y 150 °C. Los insertos de las Figuras A y B facilitan la comparación de tiempos de retención. En la Figura 10.8 se observa como los tiempos de retención de ambos picos aumentan al disminuir la temperatura del cromatograma. Este aumento de los tiempos de retención viene acompañado de un ensanchamiento del pico (Tabla 10.6). En todos los casos, la temperatura de trabajo vendrá determinada por un compromiso entre tiempo total empleado en el cromatograma y resolución obtenida. La separación no tiene porque realizarse en condiciones isotermas. Es posible que la temperatura varíe a lo largo del cromatograma, es decir, se puede aplicar un gradiente de temperatura. Los gradientes siempre ofrecen mejor resolución que las condiciones isotermas. La Figura 10.8D muestra el resultado de la separación de la misma mezcla del resto de paneles, pero aplicando un gradiente de temperatura de manera que la columna pasa de 60 a 200 °C en 3.5 minutos (es decir, se aplica un incremento de temperatura de 40 °C/min). El inserto del panel D facilita la comparación por la escala de tiempos. Como se observa, los picos están mejor resueltos que TABLA 10.6. Parámetros cromatográficos de los cromatogramas mostrado en la Figura 10.8

T (°C)

Ancho pico 1 (min)

Ancho pico 2 (min)

Resolución

200 175 150

0.064 0.146 0.369

0.058 0.116 0.290

0.90 2.4 4.5

Gradiente

0.078

0.053

1.3

Señal

10000

250 225 (2) 200

2.5

2.6

(2)

5000

2.7

2.8

A

250 225

2.9

Tiempo (min)

200 2

4

6

8 10 Tiempo (min)

12

215

14

Señal

15000

(1) 10000

(1)

10000

175

5000

(2) 4.5

5000

200 150

5.0 Tiempo (min)

175

5.5

(2) 2

4

200

150 6

8

10

12

Temperatura (˚C)

B

15000 Señal

(1)

Temperatura (˚C)

Señal

15000

20000 15000 10000 5000

•• •• •• Temperatura (˚C)

(1)

20000

Temperatura (˚C)

Cromatografía de gases (GC)

14

C

Señal

10000

200

7500

(1) 175

5000 2500

150

(2) 2

4

6

8

10

12

Temperatura (˚C)

Tiempo (min)

14

(1)

D

15000

Señal

Señal

20000

10000 (2)

5000

25000 20000 15000 10000 5000 5.0

2

4

6

8

200

(1)

150 (2) 5.1

5.2

100

5.3 5.4 5.5 Tiempo (min)

10

5.6

12

5.7

5.8

Temperatura (˚C)

25000

200 150 100

Temperatura (˚C)

Tiempo (min)

14

Tiempo (min)

FIGURA 10.8. Efecto de la temperatura ssobre las separaciones cromatográficas por GC. En todos los casos se inyectó en modo split 1 μL de una mezcla de paraoxon (pico 1) y carbaryl (pico 2) 500 μM. Las condiciones cromatográficas (columna, temperaturas del inyector y del detector y flujo) fueron las mismas que en la Figura 10.7, pero con las temperaturas de la columna isocráticas y en gradiente mostradas en cada caso. En todos los casos el detector fue un espectrómetro de masas y se registró la abundancia de los iones de masa/carga = 109, 115, 144, 149 y 275.

216

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

los picos obtenidos a 200 °C (Tabla 10.6). El uso de gradientes mejora la resolución disminuyendo el ancho de pico y evitando o disminuyendo la formación de «colas» en los picos. Cuando la mezcla es algo más compleja, es inevitable tener que aplicar gradientes para obtener una separación apropiada. La Figura 10.9A representa el cromatograma

(1

, ,2

3,

4,

A

5)

(9)

Señal x 106

30

175 150

25 125

20

100

15 10 (8) (6)(7)

5

Temperatura (˚C)

35

75 (10)

50 10

15

20

25

30

35

B

(9)

80 70

150

Señal x 106

60

(11)

50

(7) (8)

40

125 (10)

(3)

100

(5)

30

(2)

20

(4)

75

(1) (6)

10 0

175 Temperatura (˚C)

0

50 4

6

8

10

12

Tiempo (min)

FIGURA 10.9. Efecto del gradiente de temperatura sobre la separación de una mezcla compleja. En ambos casos se inyectó 1 μL en splitless de la misma mezcla de compuestos. La columna fue una HP1 (metil siloxano) de 60 m de longitud, 0.25 mm de diámetro y 1 μm de tamaño de partícula. El flujo total y en el interior de la columna fue de 24 y 1.1 mL/min respectivamente. La tempertura del inyector fue 150 °C y la del detector 280 °C. La temperatura de la columna se representa en cada caso. El detector fue un espectrómetro de masas funcionando en modo scan. Identificación de los picos: (1): acetona; (2): disulfuro de carbono; (3): metiletilcetona; (4): acetato de etilo; (5): benceno; (6): ciclohexano; (7): tricloroetileno; (8): heptano; (9): tolueno; y (10): p-cimeno.

Cromatografía de gases (GC)

•• •• ••

217

isotermo de la misma mezcla cromatografiada en la Figura 10.9B, donde tras 1 minuto a 45 °C se aplica un gradiente con dos diferentes rampas de temperatura (5 y 10 °C/min). Se puede observar como los 10 picos del cromatograma en gradiente (B) están separados e identificados, mientras que el cromatograma isotermo (A) no consigue separar los picos 1 a 5, los picos 6, 7 y 8 están mal resueltos y el pico 11 no ha eluido tras 40 minutos de cromatograma. Los gradientes de temperatura pueden tener perfiles más complejos que los mostrados hasta ahora. La Figura 10.10 muestra un ejemplo de un gradiente hipotético donde se aplican 4 diferentes rampas de temperatura con periodos de meseta intercalados entres ellas. Se observa que al final de cada cromatograma siempre sigue una etapa de enfriamiento rápido para devolver la columna a la temperatura inicial antes de iniciar un nuevo cromatograma. Este enfriamiento es incontrolado y se realiza extrayendo calor del horno tan rápidamente como sea posible. Esta falta de control obliga a que cuando se alcanza la temperatura de inicio, se deba aplicar necesariamente un periodo de equilibrado de la columna para estabilizar su temperatura. Una ventaja adicional de los gradientes es que permiten separaciones en tiempos razonablemente cortos de mezclas con analitos con tiempos de elución muy diferentes. Muchos cromatogramas se inician a una temperatura mucho más baja que la del inyector y también inferior a los puntos de ebullición de la muestra (en el caso de la Figura 10.10 a 40 °C). El motivo es que procediendo de esta manera la muestra se vaporiza en el inyector pero al entrar en la columna condensa y, por lo tanto, no es arrastrada por la fase móvil. Esto produce una concentración de la muestra al inicio de la columna. Tras un breve periodo a esta baja temperatura, se aplica un gradiente con gran pendiente hasta una temperatura superior a los puntos de ebullición de 5 °C/min

300

10 °C/min

200

20 °C/min

150

Enfriamiento

100 40 °C/min 50 0

10

20

Equilibrado

Temperatura (˚C)

250

30

Tiempo (min)

FIGURA 10.10. Perfil de temperaturas de un cromatograma con gradiente.

218

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

los componentes de la mezcla. Este incremento de temperatura consigue volatilizar de nuevo la muestra e iniciar el proceso de separación dentro de la columna. A este gradiente brusco siguen otros de menor pendiente. Este procedimiento consigue que los analitos eluyan más concentrados y los picos tengan una forma más aguda. Presenta el inconveniente de que se necesita mucho más tiempo para volver a alcanzar la temperatura de inicio del cromatograma, ya que se ha de enfriar el horno hasta temperaturas cercanas a la temperatura ambiente. La temperatura más alta que se puede alcanzar en el cromatograma no está solo limitada por la posible descomposición de la muestra, sino también por la estabilidad de la fase estacionaria de la columna. Si se sobrepasa cierta temperatura (temperatura máxima o límite de temperatura de la columna, véase Tabla 10.5) la fase estacionaria puede ser vaporizada (cromatografía líquido-gas) o descompuesta (cromatografía sólido-gas), atravesar la columna y llegar al detector. Esto es los que se denomina sangrado de la columna. El sangrado trae como consecuencia, además de la pérdida de poder separador de la columna, la posible obturación del detector por fragmentos de líquido o sólido de la fase estacionaria. Para aliviar este problema cuando se adquiere una columna, se debe acondicionar antes de ser conectada al detector. Este proceso consiste en pasar fase móvil durante unas horas por la columna a una temperatura de unos 50 °C por debajo de la temperatura máxima de la columna. La temperatura máxima de la columna es un dato que siempre figura en las especificaciones técnicas de esta.

10.5. DETECTORES EN CROMATOGRAFÍA DE GASES Existe una gran variedad de detectores que indican los cambios de composición del gas que eluye de la columna. Los detectores más sensibles han permitido el desarrollo de métodos de análisis de componentes al nivel de trazas o ultratrazas. La GC puede utilizarse para cuantificar niveles de concentración de ppm, requiriéndose cantidades de analito tan bajas como 10–10 g. La Tabla 10.7 presenta los detectores más comúnmente utilizados en GC. A continuación se comentan las características principales de cada uno de ellos. TABLA 10.7. Detectores más utilizados en GC De conductividad térmica (TCD) De ionización a la llama (FID) De captura electrónica (ECD) De fósforo-nitrógeno (NPD) Fotométrico de llama (FPD) Espectrómetro de masas (MS)

Cromatografía de gases (GC)

•• •• ••

219

10.5.1. Detector de conductividad térmica (TCD) Cuando un gas circula alrededor de un filamento metálico caliente, disminuye la temperatura del filamento llevándose una parte del calor. La cantidad de calor retirada del filamento depende del caudal de gas y de su conductividad térmica. En un momento dado, la temperatura del filamento va a ser dependiente del calor comunicado para su calentamiento y del calor capturado por el gas. Si la velocidad de calentamiento se mantiene constante (mediante una resistencia eléctrica o el paso de una corriente constante), el filamento alcanzará una temperatura de equilibrio que depende de la composición de la mezcla de gases de su alrededor. Por lo tanto, un cambio en la composición de los gases (por ejemplo por elución de un analito) va a producir un cambio de temperatura en el filamento. La Figura 10.11 muestra la estructura de un detector TCD. Los filamentos tienden a ser delgados para que ante cualquier cambio se alcance rápidamente el estado estacionario. El detector tiene dos filamentos idénticos. Por uno de ellos pasa fase móvil al mismo caudal que por el otro, que recibe el material que eluye de la columna. El detector registra cualquier diferencia de temperatura entre ambos filamentos. El detector TCD es universal (es decir, que produce señal con cualquier molécula), no es destructivo y tiene un límite de detección aproximado de 10–5 a 10–6 g s–1. Helio e hidrógeno son los gases con una mayor conductividad térmica. Ello hace que sean los gases más utilizados como fases móviles con un detector TCD. Dado que las diferencias no son muy grandes, se prefiere utilizar He por su menor reactividad y peligrosidad.

Alambre de wolframio calentado

Gas portador

Efluente de la columna

Alambre de wolframio calentado

Bloque metálico termostatizado

FIGURA 10.11. Estructura del detector de conductividad térmica (TCD).

220

•• •• ••

10.5.2

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Detector de ionización a la llama (FID)

El FID es probablemente el detector más utilizado con fines generales, es un detector destructivo y casi universal, es decir, que responde a casi todos los analitos independientemente de su estructura química. El único requerimiento de un detector FID para obtener señal es que tenga carbonos orgánicos. El FID es casi insensible a moléculas pequeñas como N2, NOx, H2S, CS2, CO y CO2. El límite de detección de un detector FID es más bajo que el de un TCD (unos 10–12 g s–1). La Figura 10.12 muestra la estructura de un detector FID. Este detector funciona mediante la pirólisis del material que eluye de la columna en una llama de hidrógenoaire con exceso de oxígeno. Cuando pasan por el detector los compuestos separados por la columna, estos reaccionan en la llama produciendo cationes. Los iones producidos son conducidos mediante un campo eléctrico hacia el colector, donde la corriente generada se amplifica para producir una respuesta. El detector FID tiene el inconveniente de que requiere al menos tres balas de gases. Será necesario un gas portador (N2 ó He), hidrógeno y aire comprimido. Todos los flujos deberán ser cuidadosamente controlados para obtener buenos resultados. Encontrará una animación sobre el funcionamiento de un detector FID en: http://www.savant4training.com/47a+.htm (Página activa en julio de 2004.)

Colectores de iones + + A A + A + A A

Amplificador de corriente

+

Al registro de datos

Llama de hidrógeno A

Hidrógeno + comburente (aire)

A A

Columna

Gas portador = Analito + = Analito ionizado por la llama A A

FIGURA 10.12. Estructura de un detector de ionización a la llama (FID).

Cromatografía de gases (GC)

•• •• ••

221

10.5.3. Detector de captura electrónica (ECD) El detector ECD (Figura 10.13) consiste en una cavidad con dos electrodos y una fuente (radioactiva) emisora de partículas β (electrones). La fuente emisora de electrones normalmente es 63Ni. Las colisiones entre el gas portador y las partículas β generadas producen un plasma con electrones. Los electrones del plasma son atraídos hacia el ánodo, generando una corriente eléctrica que es registrada. Cuando eluye algún analito por la columna, el compuesto puede capturar alguno de los electrones del plasma, disminuyendo así la corriente que llega al ánodo. Esta disminución de corriente será proporcional a la concentración de analito eluido e indicará que han llegado al detector analitos procedentes de la columna. Los factores de respuesta del detector ECD son función del tipo y número de átomos electronegativos que existen en la estructura del analito. Por ejemplo, la respuesta del detector a un hidrocarburo clorado puede ser un millón de veces mayor que la respuesta al correspondiente hidrocarburo no clorado. Las características de electronegatividad hacen que los compuestos halogenados, nitrilos, nitratos, compuestos organometálicos y compuestos con dobles enlaces conjugados sean idóneos para ser analizados con este detector, siendo especialmente útil para la detección de organoclorados (DDT, plaguicidas y sus derivados, etc.). El límite de detección para analitos con alta afinidad electrónica puede llegar a 10–14 g s–1. Además de su gran insensibilidad a analitos poco electronegativos, el detector ECD presenta el inconveniente de que tiene una fuente emisora de radioactividad que ha de ser tratada como tal.

Amplificador de corriente

-

Al registro de datos

A

A

Ánodo

Capa de 63 Ni (emisor de electrones)

A

A A A

Columna

Gas portador = Analito

A

A

= Electrón

= Analito ionizado

FIGURA 10.13. Detector de captura electrónica (ECD).

222

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Encontrará una animación sobre el funcionamiento de un detector ECD en: http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/animations/ecd.mov (Página activa en julio de 2004.)

10.5.4. Detector de fósforo-nitrógeno (NPD) Como muestra la Figura 10.14, el detector NPD es similar a un detector FID. De hecho, también recibe el nombre de detector de fósforo-nitrógeno de ionización de llama (N-FID). La diferencia con el detector FID es que la ionización no se lleva a cabo en una llama. Los iones se producen en una capa gaseosa que rodea a una esfera cerámica muy caliente que contiene silicato de rubidio. Los iones así producidos se recogen y cuantifican de manera similar a los detectores FID.

Amplificador de corriente

Colector de iones

A

+

A

+ A

Esfera de silicato de rubidio

A

+

A

+

A A

Al registro de datos

A

Analitos vaporizados en la llama

Llama de hidrógeno

A A

Hidrogeno + comburente (aire)

A

Columna

Gas portador A

A

= Analito +

= Analito ionizado por la llama

FIGURA 10.14. Detector de fósforo-nitrógeno (NPD).

Cromatografía de gases (GC)

•• •• ••

223

La esfera es la pieza clave del detector NPD. El material es silicato de rubidio porque es sabido que los metales alcalinos emiten iones positivos cuando se calientan en una corriente de gas que arrastra compuestos con fósforo o nitrógeno. Los detectores NPD se utilizan para el análisis de pesticidas (especialmente, insecticidas organofosforados) en agua, alimentos y muestras ambientales. El NPD es un detector destructivo que tiene un límite de detección para compuestos con nitrógeno o fósforo en su estructura de 10–8-10–14 g s–1.

10.5.5. Detector fotométrico de llama (FPD) El detector fotométrico de llama (FPD) (Figura 10.15) posee algunas características similares a las del detector FID, ya que el eluyente se quema en una llama de hidrógeno. Es un detector selectivo para compuestos que contengan fósforo o azufre. Las moléculas que contienen azufre o fósforo son excitadas en la llama y al relajarse al estado fundamental, emiten radiación electromagnética que se detecta en el tubo fotomultiplicador. El filtro óptico (394 nm para al azufre y 526 nm para el fósforo) que se coloca entre la llama y el tubo fotomultiplicador, proporciona selectividad para estos compuestos. Al igual que el FID, el detector FPD también es un detector destructivo. Ambos detectores tienen también límites de detección parecidos (en torno a 10–12-10–13 g s–1).

Luz emitida por los analitos excitados

Filtro óptico

A A A

A A

Tubo fotomultiplicador

Llama de hidrógeno

Hidrógeno + comburente (aire)

Columna

Gas portador A

= Analito

FIGURA 10.15. Detector fotométrico de llama (FPD).

224

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

10.5.6. Detector espectrómetro de masas (MS) El detector de masas de GC permite identificar el analito, ya que ofrece un espectro de masas de la molécula que es exclusivo de la estructura química de que se trate. Por ser un detector de unas características especiales, hablaremos en detalle de él en el capítulo dedicado a espectrometría de masas.

11

Electroforesis capilar (CE)

CONTENIDO 11.1. Características generales y aplicaciones de la electroforesis capilar 11.2. El equipo de electroforesis capilar 11.3. Fundamentos físico-químicos de la electroforesis capilar 11.3.1. Movilidad eléctrica 11.3.2. Flujo electroosmótico 11.3.3. Movilidad electroferética efectiva 11.4. Sistemas de introducción de muestra 11.5. Detectores de electroforesis capilar 11.6 Modos de separación en electroforesis capilar 11.6.1. Electroforesis capilar en zona libre 11.6.2. Electroforesis capilar en micelas 11.6.3. Isoelectroenfoque 11.6.4. Electroforesis capilar en gel 11.7. Identificación de analitos por electroforesis capilar 11.8. Selección del método electroforético apropiado

11.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES Y APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR Se conoce como electroforesis capilar (CE) a un conjunto de técnicas que emplean corriente eléctrica que atraviesa tubos capilares (20-100 μm de diámetro interno) de sílice fundida para realizar separaciones de alta resolución de los componentes de una mezcla. Las características básicas de la EC son: • La separación se desarrolla dentro de un tubo capilar de sílice fundida. 225

•• •• ••

226

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

• • • • •

Utiliza campos eléctricos altos, a veces se superan los 500 V/cm. Tiene un poder separador comparable al de la GC. Requiere muy poca cantidad de muestra y reactivos. Es sencillo de utilizar y fácilmente automatizable. Gracias a los modernos detectores y sistemas de registro, los electroforetogramas son muy similares a cromatogramas de GC o HPLC. • Es aplicable a una amplia gama de analitos.

La CE tiene características propias de la separación tradicional por electroforesis en geles de acrilamida y de las técnicas de separación por HPLC. Los primeros equipos de CE aparecieron a final de la década de los ochenta y desde entonces el número de aplicaciones desarrolladas ha crecido espectacularmente. Las distintas modalidades de CE permiten separar moléculas de muy diferentes propiedades físicas (peso molecular, carga, polaridad, etc.). La Tabla 11.1 muestra algunas de las aplicaciones más populares de CE. Como se observa, esta técnica tiene aplicación en la detección y cuantificación de la mayoría de moléculas orgánicas e inorgánicas. El acoplamiento de detectores de espectrometría de masas a equipos de EC está ampliando todavía más el campo de aplicación de estas técnicas. TABLA 11.1. Algunas de las determinaciones habituales realizadas por técnicas de electroforesis capilar Ambiental

Biomédico

Herbicidas

Proteínas

Insecticidas

Péptidos

Fenoles

Ácidos nucleicos

Cationes inorgánicos

Marcadores tumorales

Aniones inorgánicos

Drogas de abuso

Farmacéutico

Alimentario

Quiralidad de los principios activos

Aminoácidos

Control de calidad de preparados farmacéuticos

Aditivos

Azúcares Ácidos orgánicos Vitaminas Contaminantes

Análisis forense

Hidrocarburos aromáticos

11.2. EL EQUIPO DE ELECTROFORESIS CAPILAR Los elementos principales de un equipo de CE se indican en la Tabla 11.2. La Figura 11.1 muestra un esquema de un equipo de CE.

Electroforesis capilar (CE)

•• •• ••

227

TABLA 11.2. Componentes básicos de un equipo de electroforesis capilar Capilar de sílice fundido Sistema de refrigeración del capilar Fuente de corriente eléctrica Viales con electrolito y muestra Electrodos de platino Detector Sistema de registro y análisis de señal

Capilar

– – – –– –

–

– –

+ + +

++ ++ ++

15

16

17

Tiempo de migración (min)

Fuente emisora de radiación Tampón

Sistema de registro

Absorbancia

Sistema receptor de radiación

Sistema de refrigeración

Tampón

Electrodo

Electrodo

Fuente de corriente eléctrica

FIGURA 11.1. Esquema de los elementos básicos de un equipo de electroforesis capilar.

La configuración básica de un equipo de CE es relativamente simple y está constituida por: 1) Capilar de sílice fundida. Tienen entre 15 y 100 cm de longitud y 20 y 100 μm de diámetro interno. Al igual que las columnas capilares de GC, las paredes externas del capilar están recubiertas de una capa de poliimida para dotarlo de una mayor resistencia. Como se observa en la Figura 11.1, dentro del capilar se realiza la separación de los analitos. Los capilares se sujetan normalmente en un cartucho de plástico que hace las veces de soporte y que alinea los extremos del capilar en los viales de tampón y los electrodos. Debido a la gran longitud de los capilares, estos se enrollan en círculos en un

228

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

soporte en la parte superior del cartucho de plástico (Figura 11.2). Normalmente el capilar se adquiere en piezas de 1-2 m y es el propio usuario el que lo corta e inserta dentro del soporte de plástico ajustando la longitud del mismo a lo deseado. 2) Sistema de refrigeración del capilar. Durante la separación se aplican grandes cantidades de corriente. Debido a la resistencia al movimiento de las cargas, se genera una gran cantidad de calor que ha de ser disipado para tener controladas las condiciones y evitar que el capilar se funda. Es por ello que el capilar ha de ser refrigerado. 3) Fuente de corriente eléctrica de alto voltaje. Debe suministrar una diferencia de potencial entre los extremos del capilar de hasta 20-30 kV con una intensidad de hasta 200-250 μA. 4) Viales con electrolito y muestra. Contienen una disolución tampón en la que se va a realizar la separación o bien la muestra que ha de ser analizada. Normalmente se colocan en un carrusel de muestras que suele estar termostatizado. El sistema mueve los viales automáticamente y los eleva e inserta en los extremos del capilar mediante un sistema neumático. 5) Dos electrodos de platino. Cada uno se encuentra en contacto con un extremo del capilar y sumergido en los recipientes que contienen el tampón donde se va a realizar la separación. Se denomina cátodo al electrodo negativo (hacia el que migran las cargas positivas por atracción electrostática), mientras que el ánodo es el electrodo positivo (hacia el que migran las cargas negativas por atracción electrostática). 6) Detector. En el extremo del capilar se encuentra un sistema que registra una propiedad física de los analitos que llegan a él. El detector más común es el de absorción de radiación UV-VIS de longitud de onda variable o de batería de diodos. Estos detectores son similares a los empleados en HPLC, aunque actualmente existen otras opciones como los detectores de fluorescencia, electroquímicos o espectrómetros de masas.

FIGURA 11.2. Cartucho cerrado (A) y abierto (B) de soporte del capilar.

Electroforesis capilar (CE)

•• •• ••

229

La representación de la propiedad físico-química medida (generalmente absorbancia) en función del tiempo de migración es lo que se denomina electroforetograma. 7) Un sistema de registro y análisis de señal. Al igual que en los modernos equipos de HPLC y GC, la señal del detector es registrada por un ordenador que, con el software apropiado, es capaz (entre otras cosas) de representar dicha señal en función del tiempo para generar el electroforetograma.

11.3. FUNDAMENTOS FÍSICO-QUÍMICOS DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR 11.3.1. Movilidad eléctrica Cuando se aplica una diferencia de potencial entre dos electrodos en una disolución, los iones que la contienen son atraídos hacia el electrodo de signo opuesto. La movilidad eléctrica de un determinado ion es directamente proporcional a la carga del mismo e inversamente proporcional a su masa y a la viscosidad del disolvente. Es decir que, para un medio con una viscosidad constante, la movilidad eléctrica será mayor cuanto mayor sea el número de cargas del analito y menor su tamaño. La movilidad eléctrica es una magnitud vectorial, es decir que, además de un valor numérico, debe llevar asociada una dirección (hacia el cátodo o hacia el ánodo).

11.3.2. Flujo electroosmótico La electroforesis se define como: «Desplazamiento de partículas que se hallan en disolución o en emulsión bajo la influencia de un campo eléctrico». De acuerdo a esta disolución, cuando el cátodo se conecte en el extremo del capilar donde se sitúa el detector solo registraría los analitos con carga positiva y no los neutros o los de carga negativa. De manera análoga, si el ánodo se coloca en el detector solo registraríamos los analitos cargados negativamente y no los neutros o los cargados positivamente. Sin embargo, la CE es capaz de separar en un mismo proceso cationes, aniones y analitos neutros. ¿Cómo se explica esta aparente contradicción? La explicación la encontramos en el denominado flujo electroosmótico, que se define como el movimiento del fluido electrolítico contenido en un capilar de sílice cuando se aplica una diferencia de potencial en sus extremos. El flujo electroosmótico es consecuencia de la carga neta negativa de las paredes del capilar. Dicha carga es debida al equilibrio: -Si-OH → -Si-O– + H+ Las cargas negativas de las paredes del capilar atraen a los iones positivos del tampón, creando así una doble capa eléctrica (Figura 11.3). Cuando se aplica un volta-

230

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Pared del capilar Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- O+ + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + Flujo electroosmótico + + + + + + + + + + + Ánodo

anión

neutra

catión

Cátodo

Movilidad Movilidad Movilidad efectiva efectiva efectiva + + + + + + + + + + Flujo electroosmótico + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + ++ + + O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- OSi Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Pared del capilar

FIGURA 11.3. Representación de la formación de la doble capa eléctrica y del flujo electroosmótico que aparece al aplicar una diferencia de potencial en los extremos de un capilar de sílice.

je a lo largo del capilar, los cationes de la doble capa difunden hacia el cátodo arrastrando agua con ellos. El resultado es un flujo neto de fluido que migra hacia el electrodo negativo. Este flujo es el que va a arrastrar a los aniones y moléculas neutras hacia el detector situado en el cátodo. (Figura 11.3). El flujo electroosmótico puede ser controlado. Así, a mayor pH, el grado de ionización de los grupos silanol será mayor, y por lo tanto también lo será el flujo electroosmótico. A la inversa, si el pH es bajo, disminuirá el porcentaje de grupos silanol ionizados y también lo hará el flujo electroosmótico. La adición de modificadores orgánicos miscibles con el tampón (acetonitrilo, metanol, etc.) también se ha utilizado para regular el flujo electroosmótico. Determinadas variedades de CE (como el isoelectroenfoque) requieren la eliminación del flujo electroosmótico. Ello se puede conseguir utilizando capilares de teflón (material no ionizable) o revistiendo las paredes internas del capilar de sílice de algún polímero que neutralice la carga de la superficie del mismo.

11.3.3. Movilidad electroforética efectiva La movilidad efectiva de un analito durante una separación electroforética es la suma vectorial de la movilidad eléctrica y del flujo electroosmótico (Figura 11.4). A

Electroforesis capilar (CE)

ANIONES

ESPECIES NEUTRAS

CATIONES

Movilidad eléctrica

Movilidad eléctrica

Movilidad eléctrica

Flujo electroosmótico

Flujo electroosmótico

Flujo electroosmótico

Movilidad efectiva

Movilidad efectiva

Movilidad efectiva

•• •• ••

231

FIGURA 11.4. Suma vectorial de las movilidades eléctricas y de fllujo electroosmótico.

mayor movilidad efectiva, menor será el tiempo de migración de las diferentes especies. El flujo electroosmótico será constante para todos los analitos, mientras que, como se ha explicado anteriormente, la movilidad eléctrica será positiva para los cationes, negativa para los aniones y cero para cualquier especie química neutra. Por lo tanto, cuando en un capilar de sílice se introduce la muestra en el ánodo, llegarán al detector en primer lugar los cationes, seguidos de las especies neutras y finalmente los aniones.

11.4. SISTEMAS DE INTRODUCCIÓN DE MUESTRA Para evitar el ensanchamiento de picos y la consiguiente pérdida de resolución, el volumen de muestra introducida en el capilar no deberá exceder el 1-2% del volumen total del mismo. El volumen total de un capilar de 1 m de longitud y 100 μm de diámetro es de aproximadamente 3 μL, ello implica que la cantidad de muestra consumida para la realización del análisis será de unos pocos nL. Existen varios modos principales de introducción de muestra en un capilar (Figura 11.5):

Sistemas de introducción de muestra en el capilar: • • • •

Hidrodinámica Electrocinética Hidrostática Cualquier combinación de dos de las anteriores

a) Introducción hidrodinámica. La muestra entra en el capilar cuando se aplica presión o vacío en el extremo del capilar sumergido en el vial que contiene la mues-

232

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

tra (Figura 11.5A). El volumen de muestra que se introduce en el capilar es directamente proporcional al tiempo y presión aplicados e inversamente proporcional a la viscosidad de la muestra. b) Introducción electrocinética. La muestra se introduce en el capilar aplicando una diferencia de potencial en sus extremos (Figura 11.5B). Los componentes de la muestra se mueven desde el vial hasta el capilar según su movilidad efectiva, que se rige según lo comentado en la sección anterior. Dado que la movilidad efectiva no es la misma para todos los componentes de la muestra, este sistema de inyección presenta el inconveniente de que determinados analitos entran en el capilar en mayor proporción que otros. No obstante, ello puede no ser un inconveniente si se desea analizar solo moléculas neutras. c) Introducción hidrostática. La introducción hidrostática se da cuando los viales que contienen muestra y el tampón se sitúan a diferente altura (Figura 11.5C). Los equipos de CE modernos son capaces de introducir muestra por cualquier combinación de dos de los métodos anteriores. A Capilar Presión

Muestra

Tampón B Capilar

Muestra

+Tampón

C Capilar

Muestra Tampón

FIGURA 11.5. Introducción de muestra por los métodos hidrodinámico (A), electrocinético (B) e hidrostático (C).

Electroforesis capilar (CE)

•• •• ••

233

11.5. DETECTORES DE ELECTROFORESIS CAPILAR Entre los detectores empleados habitualmente se encuentran: • Detector de absorción ultravioleta visible. Los detectores empleados son similares a los de HPLC. Es el detector más extendido por su sencillez, pero presenta la desventaja de su baja sensibilidad. Una pequeña sección del capilar no ha de estar revestida de recubrimiento de poliimida con la finalidad de dejar pasar la radiación UV emitida por la lámpara. El hecho de que la sensibilidad de estos detectores sea menor que la de un detector de HPLC es consecuencia de: a) La pequeña longitud del paso óptico. La absorbancia de una muestra es directamente proporcional a la longitud del paso óptico, y dado que la detección se realiza en el capilar, el paso óptico es de solo de 20-100 μm. b) La sección circular del capilar proporciona un diseño óptico pobre, que facilita la reflexión de la radiación que incide sobre él. Con la finalidad de aumentar la longitud de paso óptico y elevar así la sensibilidad se han diseñado capilares con una pequeña burbuja en el camino óptico y capilares doblados en forma de Z (Figura 11.6). En el primer caso se consigue aumentar la sensibilidad unas 3 veces, mientras que en el segundo el aumento de sensibilidad es algo superior (unas 10 veces). También se han diseñado capilares con una sección trasversal rectangular que mejora el diseño del paso óptico y disminuye la reflexión de la radiación. Sin embargo, estos capilares tienen el inconveniente de que son muy quebradizos, lo que les convierte en poco prácticos.

Detectores más comunes en equipos de electroforesis capilar: • • • •

De absorción UV-VIS Fluorimétrico Espectrómetro de masas Electroquímico

• Detector fluorimétrico. También son similares a los empleados en HPLC y, por lo tanto, más sensibles que los de absorción UV-VIS. Al igual que en cromatografía, presentan el inconveniente de que no todas las moléculas son fluorescentes y a veces es necesario recurrir a una derivatización previa. • Espectrómetro de masas. Son idénticos a los empleados en HPLC. De hecho se han diseñado interfases que permiten conectar el mismo espectrómetro de masas a

•• •• ••

234

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Muestra Muestra

Radiación incidente

Radiación transmitida

Radiación incidente

Radiación transmitida

FIGURA 11.6. Capilares con burbuja y doblados en forma de Z que aumentan la longitud del paso óptico.

un equipo de HPLC y a un sistema de CE alternativamente. Como se verá en el capítulo dedicado a espectrometría de masas, estos detectores presentan la ventaja de que aportan información sobre la estructura del analito, si bien su coste es muy elevado y su manejo más complicado que el de un detector fluorimétrico o de absorción UV-VIS. • Detector electroquímico. Con la finalidad de aumentar la sensibilidad de los métodos se ha conseguido adaptar los detectores electroquímicos de HPLC a sistemas de CE. Estos detectores son más sensibles y selectivos que los de absorción UVVIS. Al igual que el detector fluorimétrico, estos detectores presentan el inconveniente de que no todas las moléculas dan señal electroquímica y, por lo tanto, a menudo es necesario recurrir a la derivatización.

11.6. MODOS DE SEPARACIÓN EN ELECTROFORESIS CAPILAR La CE es una familia de diferentes técnicas cuyos principales miembros son: • • • •

Electroforesis capilar en zona libre. Electroforesis capilar en micelas. Isoelectroenfoque. Electroforesis capilar en gel.

11.6.1. Electroforesis capilar en zona libre La electroforesis capilar en zona libre es la forma más simple de CE. La separación de los analitos en capilares de sílice fundida se basa en las diferencias de movilidad efectiva, que, como quedó reflejado en el Capítulo 11.3, son función del flujo electroosmótico, del tipo y la cantidad de carga del mismo, así como de su tamaño.

Electroforesis capilar (CE)

•• •• ••

235

Los capilares deben ser acondicionados antes de ser utilizados. Este acondicionamiento es importante para asegurar que la superficie del capilar está uniformemente cargada. Tras la separación se realizan varios tratamientos de lavado (con agua, con ácidos y con bases) para asegurar la limpieza del capilar antes de empezar la siguiente separación. En la Figura 11.7 se detalla un ejemplo de acondicionamiento del capilar utilizado para la separación mediante CE de zona libre de los fármacos Danfetamina, metadona y de uno de sus metabolitos.

(2) (3) Absorbancia

(1)

0

1

2

3

4

5

6

Tiempo de migración (min)

FIGURA 11.7. Separación mediante electroforesis capilar de zona libre de D-anfetamina (pico 1), metadona (pico 2) y su metabolito etiliden dimetil defenil pirrolidina (pico 3). Se empleó un capilar de sílice fundida de 37 cm con la ventana de detección situada a 30 cm del punto de inyección. Antes de inyectar la muestra el el capilar se trató durante 2 minutos con tampón fosfatado 100 mH pH 4.5. La inyección fue electrocinética, aplicando 10 kV. El voltaje aplicado durante la separación fue de 15 kV. Tras la separación el capilar se lavó durante 0.5 minutos con agua, 1 minuto con HCl 100 mM; 0.5 minutos con agua, 2 minutos con NaOH 100 mM y finalmente 1 minuto con agua. Los analitos detectaron registrando la absorbancia a 200 nm. La temperatura de la separación fue 20 °C. Imagen cedida por Javier Esteban y la Dra. Mari de la Cruz Pellín (División de Toxicología, Universidad Miguel Hernández de Elche).

El tampón en el que se va a realizar la separación es de vital importancia, ya que el pH puede afectar a: 1) La carga del analito, y por tanto también a la movilidad eléctrica; 2) El nivel de protonación de los grupos silanol de las paredes del capilar, y por tanto al flujo electroosmótico. Cabe recordar que ambos factores tienen influencia en la movilidad electroforética efectiva y por lo tanto en la resolución del método. Aunque existen muchas posibilidades, la Tabla 11.3 presenta los tampones más utilizados en CE en zona libre. La concentración típica de estos tampones es de entre 50 y 100 mM.

236

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

TABLA 11.3. Tampones más comunes en electroforesis capilar de zona libre Tampón

Rango de pH

Fosfato

1.1-3.1

Acetato

3.8-5.8

Fosfato

6.2-8.2

Borato

8.1-10.1

MES

5.2-7.2

PIPES

5.8-7.8

HEPES

6.6-8.6

Tris

7.3-9.3

La Figura 11.8 muestra el efecto del pH sobre la separación de 5 diferentes fármacos antirretrovirales por CE de zona libre. Se observa como a pH 2.5 (Figura 11.8A) la separación es satisfactoria, mientras que si se eleva el pH hasta 3.0 los picos 2 y 3 apenas se separan (Figura 11.8 B). Un incremento posterior de 1 unidad de pH (Figura 11.8 C) lleva a la no separación de los componentes de la mezcla, ya que los picos 1, 2, 3, 4 y 5 eluyen juntos. En CE de zona libre es relativamente frecuente la utilización de aditivos en el tampón de separación, ya que estos aditivos pueden modificar selectivamente la movilidad efectiva electroforética de los analitos. Es decir, dos compuestos con movilidades electroforéticas idénticas en un tampón simple podrían ser separados con un aditivo apropiado. La Tabla 11.4 muestra varios aditivos comunes más junto con el mecanismo que emplean para modificar la separación.

11.6.2. Electroforesis capilar en micelas Las micelas son agregados de moléculas conocidas como surfactantes. Los surfactantes son moléculas que se caracterizan por tener una larga cadena hidrocarbonada y una cabeza hidrofílica que normalmente está cargada. Las micelas se forman en una disolución acuosa cuando la concentración del surfactante alcanza una determinada concentración denominada concentración micelar crítica. Por encima de dicha concentración, las colas hidrofóbicas hidrocarbonadas se orientan hacia el in-

Electroforesis capilar (CE)

•• •• ••

237

A: pH = 2.5 (4) Señal

(5) (2) (1)

(3)

Señal

B: pH = 3.0

(4) (5) (2) (1)

(3)

Señal

C: pH = 4.0

(3) (2) (1) 0

5

(4) (5) 10

15

20

Tiempo (min)

FIGURA 11.8. Influencia del pH en la separaciones de CE en zona libre. Se empleó un capilar de sílice fundida de 36 cm y 0,5 mm de diámetro. El tampón de separación fue fórmico-formiato 50 mM al pH indicado en cada caso. La inyección fue electrocinética, aplicando 10 kV durante 20 s. El voltaje aplicado durante la separación fue de 25 kV. Los analitos se detectaron registrando la absorbancia a 200 nm. Identificación de los picos: (1) Indinavir; (2): Abacavir; (3): Nelfinavir; (4): Nevirapina; (5): Saquinavir. Imagen cedida por Jesús Giménez y la Dra. Mari de la Cruz Pellín (División de Toxicología, Universidad Miguel Hernández de Elche).

terior de la micela, dejando las cabezas polares hacia el exterior de la disolución acuosa (Figura 11.9). De esta manera se consigue reducir la energía libre del sistema. Hay cuatro clases de surfactantes: aniónicos, catiónicos, no iónicos y zwteriónicos. Los surfactantes aniónicos (producen micelas con carga negativa) y los catiónicos (producen micelas con carga positiva) son los más utilizados habitualmente en CE micelar. El surfactante aniónico más común es el SDS (dodecil sulfato sódico), aunque también son bastante utilizadas determinadas sales biliares como el colato sódico.

238

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

TABLA 11.4. Aditivos para tampones de electroforesis capilar de zona libre Aditivo

Función

Sales inorgánicas

Induce cambios conformacionales en las proteínas

Disolventes orgánicos

Modifica el flujo electroosmótico

Urea

Desnaturaliza proteínas y oligonucleótido

Ácidos sulfónicos

Interacciona hidrofóbicamente con los analitos

Celulosa

Reduce el flujo electroosmótico

Aminas

Cubre los grupos silanol libres A

B +

– –

+ +

–

+

+ +

–

– –

FIGURA 11.9. Representación de una micela catiónica (A) y una micela aninónica (B) en disolución acuosa.

El corazón hidrofóbico de las micelas tiene una gran poder solubilizador de analitos apolares. Así, cuanto más apolar sea el analito, más facilidad tendrá para entrar en el interior de la micela y aislarse así del entorno polar acuoso. A pHs alcalinos o neutros el flujo electroosmótico se mueve en dirección hacia el cátodo. Si el surfactante utilizado para la separación es el SDS (surfactante aniónico), las micelas serán electrostáticamente atraídas por el ánodo y, por lo tanto, fluirán en dirección contraria al flujo electroosmótico. Por lo tanto, los analitos que se muevan en el interior de las micelas verán como su tiempo de migración aumenta. Por lo tanto, cuanto mayor sea la afinidad del analito por la micela mayor será su tiempo de migración. Cuando se utilizan surfactantes aniónicos como el SDS, generalmente llegan primero al detector los aniones, ya que no pueden acceder al interior de la micela debido a las fuertes repulsiones electrostáticas con el exterior de la misma (Figura 11.10). A con-

Electroforesis capilar (CE)

•• •• ••

239

tinuación llegan las moléculas neutras, apareciendo en el electroforetograma en orden creciente de apolaridad (Figura 11.10). Finalmente llegan los cationes, que están fuertemente adheridos al exterior de la micela por las atracciones electrostáticas, y por lo tanto han visto retrasado su tiempo de migración debido a que el movimiento de la micela se opone al del flujo electroosmótico (Figura 11.10). Aunque generalmente esta es la situación que se encuentra, a veces las fuerzas de atracción hidrofóbica vencen a las de repulsión electrostática y los aniones pueden llegar al cátodo antes que las moléculas neutras.

Pared del capilar Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si

Ánodo

O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- O+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Flujo electroosmótico + + + + + + + + + + + Catión Neutra Anión - Neutra -

Cátodo

Movilidad Movilidad Movilidad efectiva efectiva efectiva + + + + + + + + + + Flujo electroosmótico + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- O- OSi Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Pared del capilar

FIGURA 11.10. Representación de un proceso de separación por electroforesis capilar micelar con surfactante aniónico.

La Figura 11.11 muestra la separación de algunos corticoides por CE micelar. El surfactante utilizado fue colato sódico. Dado que todos los analitos son neutros solo la hidrofobicidad influye en esta separación, por lo tanto, los analitos llegan al detector en orden decreciente de polaridad. Esta afirmación queda demostrada por el hecho de que el acetato de hidrocortisona (pico 4) tenga una tiempo de migración mayor que la hidrocortisona (pico 2).

En electroforesis capilar micelar las moléculas neutras llegan al cátodo en orden decreciente de polaridad.

240

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

(2) (3) (4) (1) Absorbancia

(5)

13

14 15 16 Tiempo de migración (min)

17

FIGURA 11.11. Separación de corticosteroides por electroforesis capilar micelar. El tampón empleado fue 100 mM borato pH 8.5 en presencia de colato sólido 100 mM. Picos: (1) triamcinolona; (2) hidrocortisona; (3) betametasona; (4) acetado de hidrocortisona; (5) acetato de dexametasona.

Los modificadores orgánicos también son ampliamente utilizados en CE capilar micelar. Estos compuestos, además de reducir el flujo electroosmótico, son capaces de alterar los coeficientes de reparto de los analitos entre la fase acuosa y la micela. Ello es debido a que, al añadir el modificador al medio, el tampón de separación se vuelve más apolar y por lo tanto disminuye la afinidad de los analitos apolares por las micelas. Esto se traduce en un aumento en la velocidad de migración de los analitos, ya que ahora son capaces de estar más tiempo en la fase acuosa y por lo tanto no son retrasados por la micela.

Separación de moléculas quirales Como se comentó en el capítulo de cromatografía líquida quiral, para separar moléculas quirales es necesario que se produzca una interacción diferencial entre los estereoisómeros y la fase móvil o fase estacionaria. En CE micelar se pueden conseguir separaciones quirales si se utilizan como agentes surfactantes isómeros ópticos de sales biliares o ciclodextrinas. Los compuestos de ambas familias son capaces de reaccionar de manera distintas con los diferentes isómeros de analitos. Así, el isómero con mayor afinidad por las micelas llegará más tarde al detector que el isómero con una menor afinidad por las mismas, produciéndose así una separación efectiva de los estereoisómeros del analito.

Electroforesis capilar (CE)

•• •• ••

241

11.6.3. Isoelectroenfoque La premisa fundamental del isolectroenfoque es que una molécula migrará a lo largo del capilar solo cuando esté cargada. El isoelectroenfoque es una separación de CE que se desarrolla en una capilar donde hay un gradiente de pH que aumenta desde el extremo situado en el ánodo hasta el extremo del capilar situado en el cátodo. Cuando se aplica corriente, las moléculas cargadas positivamente migran hacia el cátodo, mientras que las cargadas negativamente lo hacen hasta el ánodo. El analito dejará de migrar en el punto del capilar cuyo pH sea igual a su punto isoeléctrico (pH al cual la molécula no tiene carga) (Figura 11.12).

Ánodo

–

+

Cátodo

pl Bajo pH

Alto pH

FIGURA 11.12. Representación esquemática de un proceso de isoelectroenfoque.

El isolectroenfoque es una variante de CE que es utilizada para separar anfolitos (moléculas que pueden ser neutras o con cargas dependiendo del pH). Normalmente se utiliza en el análisis de péptidos y proteínas, aunque puede ser utilizada con cualquier tipo de anfolito. En el isoelectroenfoque el flujo electroosmótico debe ser suprimido. Para ello se utilizan capilares con las paredes recubiertas de celulosa o poliacrilamida. Las etapas básicas del isoelectroenfoque son: carga, enfoque y movilización. En las técnicas de electroforesis clásicas no es necesaria la movilización, ya que, una vez se ha producido el enfoque, el gel puede ser teñido para revelar la posición de los analitos. En CE la movilización es necesaria para llevar los analitos hasta el detector. Carga. La muestra se mezcla con el anfolito que cree un gradiente de pH apropiado. La concentración final de este anfolito suele ser de 1-2%. La mezcla se carga en el capilar por el método hidrodinámico (aplicando vacío o presión). Enfoque. El vial en el extremo del cátodo debe contener hidróxido sódico, mientras que el vial del ánodo debe contener ácido fosfórico. En estas condiciones se aplica un campo eléctrico del orden de 500-700 V/cm. El campo eléctrico aplicado atrae la mezcla de muestra y anfolito hacia el detector. Cuando el anfolito alcanza un pH donde no está cargado, se detiene y eso provoca una disminución de la corriente. Se considera que el enfoque se ha completado cuando la corriente cae por debajo de 1 μA.

242

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Movilización. La movilización se puede producir en dirección al cátodo o al ánodo. Para la movilización catódica el vial suele contener una mezcla de hidróxido sódico/cloruro sódico. En la movilización anódica el vial contiene solo cloruro sódico. La asignación del punto isoeléctrico del analito se realiza comparando el tiempo de migración de patrones de punto isoeléctrico conocido.

Encontrará una animación sobre el funcionamiento de una separación por electroenfoque en: http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/animations/focus.mov (Pagina activa en julio de 2004.)

11.6.4. Electroforesis capilar en gel La necesidad de separar moléculas de alto peso molecular (polímeros, oligonucleótidos y proteínas) ha llevado a desarrollar la denominada CE en gel. Los principios físicos que rigen esta separación son los mismos que actúan en la electroforesis en placa (aunque en este caso el campo eléctrico aplicado es mucho mayor). En la CE en gel, los analitos migran a través de un polímero reticular que ofrece mayor resistencia cuanto mayor es el tamaño del analito; es decir, que a mayor peso molecular mayor tiempo de migración (Figura 11.13). Los geles más utilizados son los de poliacrilamida, aunque también son comunes los de hidroxi alquil celulosa y agarosa. Los geles se comercializan con un mayor o menor grado de entrecruzamiento, lo que va a determinar el tamaño del poro que han de atravesar los analitos. En todos los casos se suele aplicar introducción de muestra electrocinética para evitar que la presión del sistema hidrodinámico dañe el reticulado del gel. A continuación comentamos las dos principales aplicaciones de la CE capilar en gel; la separación de proteínas y de DNA. Análisis de proteínas. Para determinar el peso molecular de proteínas, las muestras se desnaturalizan tratándolas durante 30 minutos a 90 °C en presencia de 1% SDS y 2% mercaptoetanol. El SDS solubiliza las proteínas, que quedan incluidas dentro de micelas, mientras que el mercaptoetanol y la alta temperatura reducen los puentes disulfuro y desnaturalizan las proteínas. En estas condiciones la carga nativa de las proteínas queda enmascarada por la nube de cargas negativas de la micela y por lo tanto todas serán atraídas con igual velocidad por el ánodo. Sin embargo, el gel ejercerá de tamiz, de modo que las micelas de mayor tamaño tardarán más tiempo en llegar al detector que las de menor tamaño, que atravesarán el gel con una mayor facilidad (Figura 11.13).

Electroforesis capilar (CE)

243

Calibrado

0.03 A280 nm

•• •• ••

(b) (a)

0.02 (c)

(e)

(d)

0.01

(f) (g) Muestra problema

A280 nm

0.15 0.10 0.05

14

16

18 20 Tiempo de migración (min)

22

24

FIGURA 11.13. Electroforetogramas en capilares de gel de poliacrilamida de muestras patrón y problema. El calibrado se realizó con 9.6 μg de: (a) lactoalbúmina (14.2 kDa); (b) anhidrasa carbónica (29 kDa); (c) ovoalbúmina (45 kDa); (d) albúmina de suero bovino (66 kDa); (e) fosforilasa b (97.4 kDa); (f) galactosidasa (116 kDa); y (g) miosina (205 kDa). La muestra problema se analizó con 0.1 g de proteína.

2.4 (g)

a

Log (P m (k Da ))

.5 kD

40 P m=

2.0

(f) (d)

1.6

1.2

(b)

(c)

14

16

(e)

(a) 12

18

20

22

Tiempo de migración (min)

FIGURA 11.14. Determinación del peso molecular de la proteína problema analizada en el electroforetograma de la Figura 11.13. Los puntos representados corresponden a los resultados obtenidos en el calibrado de la Figura 11.13. La flecha marca el tiempo de migración de la muestra problema analizada en la Figura 11.13.

244

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Existe una correlación lineal entre el logaritmo del peso molecular de la proteína y su tiempo de migración (Figura 11.14). Por lo tanto, utilizando patrones de peso molecular conocido, es posible interpolar el tiempo de migración de la muestra problema y así calcular su peso molecular. Análisis de DNA. La separación de oligonucleótidos y moléculas de DNA sigue los mismos principios que la de proteínas. Las muestras se han de desnaturalizar previamente con urea 7 M. Al igual que en el caso anterior, el peso molecular de los analitos se calcula por comparación de los tiempos de migración de moléculas de DNA de tamaño conocido.

11.7. IDENTIFICACIÓN DE ANALITOS EN ELECTROFORESIS CAPILAR Para la identificación de analitos en técnicas de CE se deben aplicar los mismos principios descritos en la sección dedicada a HPLC. Por lo tanto, los analitos deben identificarse por comparación con tiempos de migración de patrones conocidos. Los detectores de absorción UV-VIS con batería de diodos proporcionan una información adicional útil sobre el espectro de absorción del analito. No obstante, este espectro de absorción nunca debe tomarse como único criterio de identificación del analito, sino que debe ser utilizado junto con el del tiempo de migración. Los detectores de espectrometría de masas también proporcionan una importante información sobre la estructura química del analito.

11.8. SELECCIÓN DEL MÉTODO ELECTROFORÉTICO APROPIADO A modo de orientación, la Tabla 11.5 muestra la modalidad de CE más apropiada para el análisis de diversos tipos de analitos. TABLA 11.5. Analitos que pueden ser determinados con las diversas modalidades de electroforesis capilar Zona libre

Pequeños iones

Micelar

Pequeñas moléculas neutras

Pequeñas moléculas Péptidos neutras Péptidos Proteínas

Oligonucleótidos

Isoelectroenfoque

En gel

Péptidos

Péptidos

Proteínas

Oligonucleótidos DNA

PARTE

Espectrometría de masas

V

12

Espectrometría de masas (MS)

CONTENIDO 12.1.

El espectrómetro de masas

12.2.

Los espectros de masas

12.3.

Fuentes de ionización 12.3.1. Ionización por impacto electrónico (EI) 12.3.2. Ionización química (CI) 12.3.3. Ionización a presión atmosférica por electrospray (API-ES) 12.3.4. Ionización química a presión atmosférica (APCI) 12.3.5. Ionización por desorción asistida por láser (MALDI)

12.4.

Analizadores 12.4.1. Analizadores de sector magnético 12.4.2. Analizadores de doble enfoque o de doble sector 12.4.3. Analizador de tiempo de vuelo (TOF) 12.4.4. Analizador de cuadrupolo

12.5.

Detectores

12.6.

Espectrómetros de masas en tándem (MS-MS)

12.7.

Modos de detección de m/z

12.8.

Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)

12.9.

Cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS)

12.10. Plasma acoplado inductivamente acoplado a espectrometría de masas (ICPMS). 12.11. Espectrometría de masas en internet

247

248

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

La espectrometría de masas (MS) es una potente técnica analítica utilizada para la identificación y cuantificación de compuestos y para elucidar la estructura química de algunas moléculas. La detección de los compuestos por MS requiere cantidades de material tan bajas como unos 10–12 g. El conjunto de técnicas englobadas bajo el nombre de espectrometría de masas es uno de los más versátiles e importantes instrumentos de análisis químico. Su versatilidad se debe en parte al amplio abanico de posibilidades de cada una de las secciones que componen un espectrómetro de masas. Algunas de las aplicaciones más importantes de la espectrometría de masas son: • Detectar e identificar el uso de esteroides en atletas. • Monitorizar durante las operaciones el aliento de los pacientes anestesiados. • Determinar la composición molecular de los compuestos químicos encontrados en el espacio. • Monitorizar los procesos de fermentación en industria biotecnológica. • Detectar dioxinas en tejidos biológicos. • Establecer la composición elemental de materiales semiconductores. • Identificar estructuras de macromoléculas. • Secuenciar biopolímeros (proteínas, oligosacáridos). • Determinar la presencia de drogas de abuso en fluidos biológicos. • Análisis forense. • Análisis de contaminantes ambientales. • Identificar y cuantificar compuestos en mezclas complejas. • Realizar análisis inorgánicos multielemento.

12.1. EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS Un espectrómetro de masas es un instrumento que mide la masa de iones. En realidad el instrumento no mide la masa sino la relación masa/carga (m/z). En muchos casos los iones formados en espectrometría de masas tienen carga 1, por lo que m/z es numéricamente igual a la masa molecular del ion formado, aunque no siempre es así. La Figura 12.1 representa la estructura fundamental de un espectrómetro de masas. La zona del aparato donde se introduce la muestra, se evapora, y las moléculas de analito se ionizan y se aceleran se llama fuente de ionización. Los iones acelerados pasan desde la fuente de ionización al analizador de masas, donde se separan los iones de distinta masa de modo que los iones de diferente m/z llegan al detector de io-

Espectrometría de masas (MS)

Fuente de ionización

Analizador

•• •• ••

249

Detector de iones

Bomba de vacío Recogida de datos Sistema de introducción de muestra

abundancia

Espectro de masas

0

10

20

30 40 m/z

50 60

FIGURA 12.1. Estructura de un espectrómetro de masas.

nes a diferentes tiempos. Los iones que llegan al detector generan una corriente eléctrica que se amplifica en un multiplicador de electrones, produciendo una señal de salida que es recogida por un sistema de recogida de datos. La intensidad de la corriente recibida se representa frente a la relación m/z que la genera para producir el espectro de masas. La vaporización de la muestra es un requisito esencial para la detección. La fuente de ionización, el analizador y el detector suelen estar en vacío (presión entre 10-3 y 10-7 torricelli) para permitir que los iones formados se desplacen sin rozamiento con el aire. La Tabla 12.1 muestra los diversos componentes de los espectrómetros de masas actuales. En secciones posteriores se detallarán las bases del funcionamiento de todos estos componentes.

12.2. LOS ESPECTROS DE MASAS Imaginemos una molécula de agua (H2O). La masa total de una molécula de agua es igual a la suma de las masas de sus elementos (18 unidades de masa atómica). Supongamos que introducimos una pequeña cantidad de agua gaseosa en un espectrómetro de masas. La muestra entra dentro de una cámara de ionización donde un haz de electrones bombardea la muestra. Alguno de los electrones podrá golpear una mo-

250

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

TABLA 12.1. Componentes de un espectrómetro de masas Componente Introducción de la muestra

Opciones Directa MALDI

Acoplado a:

Fuente de ionización

Analizador

Detector

Comentarios Evaporación por calor Desorción asistida por láser que también actúa como fuente de ionización (siempre acoplado a analizador de tiempo de vuelo TOF))

GC

Analitos volatilizados y previamente fraccionados arrastrados por un gas portador

HPLC

Analitos previamente fraccionados arrastrados por un eluyente que se evaporará en corriente de N2 caliente

Electroforesis capilar

Mismo principio que para HPLC

Plasma de acoplamiento inductivo

Muestra volatilizada por un plasma de alta temperatura

Impacto electrónico (EI)

Electrones bombardean moléculas de muestra (típicamente se utiliza acoplada a GC)

Ionización química

Un reactivo ionizante interacciona con los analitos

Electrospray a presión atmosférica (API-ES)

Creación de un aerosol y evaporación por corriente de gas secante (típicamente se utiliza acoplada a HPLC o electroforesis capilar)

Ionización química a presión atmosférica (APCI)

Creación de un aerosol similar a API-ES y evaporación en cámara a 400 °C (típicamente se utiliza acoplada a HPLC o electroforesis capilar)

Desorción por láser

Muestra sólida bombardeada por un láser (acoplado siempre a analizador TOF)

Sector magnético

Los iones se mueven circularmente en un campo magnético

Doble sector (doble enfoque)

Los iones se mueven circularmente primero en un campo magnético y luego en un campo eléctrico

Tiempo de vuelo (TOF)

Se calculan las masas por diferencia de tiempo de llegada al detector

Cuadrupolo

Los iones se mueven dentro de cuatro barras metálicas paralelas orientadas en un campo magnético

Dinodo continuo Dinodo discontinuo

Ambos detectores constituidos por material electroemisivo sobre el que chocan los iones generados para producir corriente eléctrica

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

251

lécula de agua y extraer un electrón de ella. Si se extrae un electrón de una molécula de agua neutra, el agua adquirirá una carga positiva. En otras palabras, se han producido iones según la reacción: H2O + 1 electrón → [H2O]+ + 2 electrones Alguna de las colisiones entre las moléculas de agua y el electrón serán lo suficientemente energéticas como para romper la molécula en pequeñas piezas o fragmentos. En el caso del agua los únicos fragmentos posibles son: OH+, O+ y H+. Esto originará un espectro de masas (Figura 12.2) con picos a m/z de 1 (H+), 16 (O+), 17 (OH+) y 18 (H2O+). Solo ciertas combinaciones de elementos pueden producir iones con ciertas masas. Por ejemplo, el ion amonio ([NH4]+) tiene también una masa aproximada de 18, pero si se descompusiera por el mismo método daría iones de masas 14 y 15, correspondientes a las especies N+ y NH+. Es decir, aun teniendo el mismo peso molecular que el agua tendría un espectro de masas totalmente diferente. Esta especificidad de los espectros de masas hace que esta sea una técnica capaz de discernir la estructura molecular de los analitos aunque tengan la misma masa molecular. Los operadores expertos en espectrometría de masas pueden interpretar los espectros de masas (picos m/z y su abundancia relativa) y determinar la estructura y composición elemental de las moléculas analizadas.

abundancia

18

17

16

1 m/z

FIGURA 12.2. Espectro de masas del agua.

252

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Cuando la estructura de las moléculas se complica también lo hacen los espectros de masas. La Figura 12.3 muestra el espectro de masas de la acetona (CH3COCH3). Como se observa, aparecen multitud de picos. Los picos de mayor abundancia relativa son los de m/z = 15, 27 y 43, que se asignan a los fragmentos CH3+, C2H3+ y CH3CO+.

43

abundancia

CH3 CO +

15

CH3 +

58

C2 H3 + 27

0

10

20

30

40

50

60

m/z

FIGURA 12.3. Espectro de masas de acetona.

La Figura 12.4 muestra el espectro de masas del paraoxon (O ,O’-dietil p-nitrofenil fosfato), metabolito del insecticida parathion. Se observa como el número de picos m/z del espectro aumenta con la complejidad de la estructura de la molécula.

12.3. FUENTES DE IONIZACIÓN La fuente de ionización es la zona del espectrómetro de masas donde las moléculas de analito se ionizan para posteriormente pasar al detector. La Tabla 12.1 muestra los principales tipos de fuentes de ionización. A continuación se describe cada una de dichas fuentes.

Espectrometría de masas (MS)

1.6

•• •• ••

253

—

O

(CH3CH2O)2—P—O—

1.4

—NO2

abundancia × 10 6

109

1.2 1.0 0.8 81 149

0.6

275

0.4

220 65

0.2

247

127 203

0.0 50

100

150

200

250

m/z

FIGURA 12.4. Espectro de masas del paraoxon. En la parte superior se muestra la estructura química del compuesto.

12.3.1. Ionización por impacto electrónico (EI) La Figura 12.5 muestra una cámara de ionización por impacto electrónico. Se observa como un filamento de tungsteno o renio emite electrones de manera termoiónica. Estos filamentos emisores suelen tener una corriente de unos 10-4 amperios. Los electrones abandonan la superficie del filamento y son acelerados hacia el interior de la cámara de ionización que posee un potencial positivo. Los electrones adquieren una energía igual a la diferencia de voltaje entre el filamento y la cámara (típicamente unos 70 eV). Una proporción del haz de electrones impactará en la trampa de electrones, produciendo una corriente de trampa que se utiliza para retroalimentar el circuito y para estabilizar el haz de electrones. Normalmente las cámaras de ionización por impacto electrónico aplican un campo magnético paralelo al haz de electrones. Esto focaliza dicho haz desde el filamento hasta la trampa, al tiempo que evita desviaciones que disminuirían la eficacia de los impactos con los analitos y por lo la tanto de la ionización. Las moléculas gaseosas de muestra se introducen en el haz de electrones y son ionizadas por impactos con los electrones. El voltaje del «repelente de iones» (repeller) produce un campo eléctrico dentro de la cámara de ionización, tal que, los iones producidos abandonan la cámara por repulsión electrostática, siendo focalizados hacia el analizador. Así pues, el repelente de iones deberá estar cargado con la misma polaridad que los iones que se deseen detectar.

254

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Repelente de iones (repeller)

A eS N

e-

A

A

Imán

A

e-

Imán

ee-

e-

e-

S N

A+ Filamento emisor

A+ A

+

A+

A+ Lente electromagnética para enfoque de iones

AL ANALIZADOR

FIGURA 12.5. Cámara de ionización por impacto electrónico.

Aunque es posible generar aniones y cationes con el mismo impacto, solo se puede detectar una polaridad. Los espectros de masas de iones positivos son los más comúnmente registrados, ya que estos ionizadores generan muy pocos iones negativos. En caso de que se desee detectar iones negativos, el repelente de iones deberá estar cargado negativamente.

12.3.2. Ionización química (CI) La generación de iones mediante la técnica de ionización química se base en la interacción de los analitos con una especie química ionizante (en la mayoría de los casos, un ácido de Bronsted). Al igual que en la ionización por EI los iones se generan en fase gaseosa. El diseño de las fuentes de ionización por CI es muy similar al de las fuentes de EI (Figura 12.5). Solo hay ligeras variaciones que hacen que el reactivo ionizante permanezca más tiempo en la cámara para favorecer la interacción con los analitos. La presión dentro de las cámaras de CI es del orden de 0.1-1 torricelli. Uno de los reactivos ionizantes más empleados en CI es el metano (CH4). La reacción se inicia con la generación del ion CH4+ por los impactos que se dan entre los electrones que emite el filamento y las moléculas de metano neutras. Es decir, que se da la reacción: 2CH4 + 2 electrones → 2CH4+ + 4 electrones Tras ello, dos moléculas de CH4+ reaccionan entre sí para generar el ácido de Bronsted (CH5+) de acuerdo a la siguiente reacción:

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

255

CH4+ + CH4+ → CH5+ + CH3 Si el analito (A) que entra en la cámara de ionización tiene una gran afinidad por protones se puede dar la reacción: A + CH5+ → AH+ + CH4 Siendo AH+ el ion detectado. Aunque el metano es el más utilizado, se puede emplear una gran variedad de reactivos ionizantes. Otro ejemplo típico es el hidrógeno (H2), que al interaccionar con el haz de electrones genera el reactivo H3+, encargado de producir la ionización de los analitos.

12.3.3. Ionización a presión atmosférica por electrospray (API-ES) API-ES es una técnica de ionización utilizable para la determinación de moléculas de pesos moleculares de entre 100 y 150000 Da. Ello la convierte en una buena técnica de ionización para la determinación de proteínas, péptidos y oligonucleótidos. API-ES es un proceso de ionización seguido por evaporación. El proceso se muestra en la Figura 12.6 y consta de las siguientes etapas: 1) Nebulización y carga. La muestra se bombea a través de un capilar de acero (75100 μm de diámetro interno) a flujos entre 1 y 1000 μL/min. El capilar está situado dentro de la cámara de ionización, donde se aplica un campo eléctrico de unos 5 kV/cm. Como consecuencia del campo eléctrico creado, la muestra emerge del capilar y es dispersada en un aerosol de gotas fuertemente cargadas. Este proceso se ve favorecido por la introducción de manera coaxial de un gas nebulizador (usualmente N2). 2) Desolvatación. Además de la corriente de N2 encargada de nebulizar la muestra existe una corriente de gas caliente (temperatura igual o superior a 300 °C), usualmente llamada de «gas secante», que pasa a través de la fuente de ionización evaporando el disolvente de las pequeñas gotas del aerosol. 3) Evaporación. Cuando las gotas reducen su tamaño, llegan a un punto donde las fuerzas de repulsión electrostáticas son superiores a las fuerzas de cohesión y la gota explota reduciendo de nuevo su tamaño. Este proceso continúa hasta que el analito queda en fase gaseosa y entra en el analizador atraído por un campo eléctrico (usualmente de unos 5 kV).

256

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Muestra

Entrada de gas para el nebulizador

–5 kV Aerosol

Capilar

AL ANALIZADOR

Repulsión electrostática y explosión

Evaporación

+ + +

+ A

+ + +

+

Nitrógeno caliente (secante)

++ + + A + + +

+ +A++

Ion del analito

A+

+ +

FIGURA 12.6. Cámara de ionización por electrospray a presión atmosférica (API-ES). La imagen inferior esquematiza el proceso de ionización que sufren los analitos en el aerosol que se genera en la punta del capilar.

12.3.4. Ionización química a presión atmosférica (APCI) Al igual que la anterior, esta es una técnica de ionización suave aplicable a moléculas de un amplio rango de polaridades y pesos moleculares moderados. Al igual que API-ES, la APCI también es un proceso de evaporación seguido de ionización. La nebulización en APCI es similar a API-ES. Sin embargo, como muestra la Figura 12.7, en este caso ocurre en una cámara de vaporización caliente (250-400 °C), donde el calor evapora rápidamente las gotas del aerosol generando moléculas de disolvente y analito en fase gaseosa.

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

257

Muestra

Entrada de gas para el nebulizador Aguja de descarga

Aerosol

Capilar

AL ANALIZADOR

FIGURA 12.7. Cámara de ionización química a presión atmosférica (APCI).

Las moléculas gaseosas de disolvente son ionizadas por una descarga eléctrica de un electrodo de aguja. A continuación, el disolvente ionizado transfiere cargas a las moléculas de analito de una manera parecida a como ocurre en la ionización por impacto electrónico. Los analitos cargados se transportan a través de filtros hacia el analizador.

12.3.5. Ionización por desorción asistida por láser (MALDI) MALDI es una técnica de ionización especialmente útil para compuestos de alto peso molecular. El uso de esta técnica está ampliamente generalizado en bioquímica para el análisis de proteínas, péptidos, glicoproteínas, oligosacáridos y oligonucleótidos. MALDI se basa en el bombardeo de moléculas con un láser para producir la ionización. Esta técnica requiere que la muestra sea previamente mezclada con una matriz altamente absorbente. La matriz absorbe la energía del láser y la transforma en energía de excitación para la muestra, lo cual lleva al chisporroteo del analito y la matriz.

258

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

El mecanismo de ionización MALDI no está totalmente clarificado en el ámbito teórico. No obstante, se cree que el proceso se desarrolla como se indica en la Figura 12.8 y siguiendo las siguientes etapas: 1) Mezcla de la muestra con una matriz sólida. Las moléculas de analito se distribuyen en una matriz sólida, de manera que todas las moléculas estén totalmente aisladas unas de otras. Es necesario que la mezcla de matriz y muestra sea homogénea. 2) Excitación de la matriz. Parte de la energía del láser incidente es absorbida por la matriz, lo que se traduce en un rápido calentamiento y evaporación de la misma. La materia evaporada forma unos agregados que constan de una molécula de analito rodeada de moléculas de matriz. 3) Ionización del analito. Las moléculas de analito evaporadas reaccionan con las de matriz captando cationes (generalmente protones) y dando lugar a iones [A+X]+, donde A es el analito y X es H, Li, Na, K, etc. Los iones negativos se forman por reacciones que implican la desprotonación del analito y protonación de la matriz, con formación de los iones [A-H]–, o bien la interacción del analito con electrones de la matriz excitados por el láser. Esta última modalidad de excitación da lugar a la formación de radicales [A]- de analito.

Analizador de tiempo de vuelo (TOF)

= Analito = Matriz = Catión Haz de láser

Bandeja de muestra

FIGURA 12.8. Esquema de funcionamiento de la ionización por desorción asistida por láser (MALDI).

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

259

La ionización de péptidos y proteínas generalmente produce iones positivos, mientras que oligonucleótidos y oligosacáridos tienden a generar iones negativos. Una desventaja de este sistema es el corto tiempo de vida media de los iones formados. Eso hace que los sistemas de ionización MALDI solo sean compatibles con analizadores de tiempo de vuelo (TOF). La energía del láser debe regularse apropiadamente para evitar que la muestra se descomponga debido a la ruptura de los enlaces químicos menos energéticos de las moléculas de analito. En caso de no conocerse la energía apropiada para la muestra a analizar, se suele empezar aplicando una potencia de aproximadamente 106 W/cm2. La Tabla 12.2 muestra algunas de las matrices más comúnmente utilizadas, junta a sus aplicaciones y a la longitud de onda de la luz láser. TABLA 12.2. Matrices más utilizadas en MALDI

Matriz

Analito

Longitud de onda del láser (nm)

2-amino-4-metil-5-nitropiridina Proteínas, oligonucleótidos

355

2-amino-5-nitropiridina

Oligonucleótidos

355

6-azo-2-tiotiamina

Proteínas

266, 337

Ácido 2,5-dihidrobenzoico

Proteínas, oligosacáridos, oligonucleótidos

337, 355

Ácido caféico

Proteínas, oligonucleótidos

337

Ácido ferúlico

Proteínas, oligonucleótidos

337, 355, 488

Ácido 2-(4-hidroxifenilazo) benzoico

Proteínas, gangliósidos, polímeros industriales

Ácido 3-hidroxipicolínico

Oligonucleótidos, glicoproteínas

Ácido nicotínico

Proteínas, glicoproteínas, oligonucleótidos

266

3-nitrobencil alcohol

Proteínas

266

Ácido sinapínico

Proteínas, polímeros industriales

Ácido a-ciano-4-hidroxicinámico

Proteínas, oligosacáridos

266, 377

266, 308, 355

377, 355 337

260

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

12.4. ANALIZADORES El analizador es la parte del espectrómetro de masas encargada de determinar cual es la m/z responsable de los iones que llegan al detector. La Tabla 12.1 recoge los tipos más comunes de analizadores, que se describen a continuación.

12.4.1. Analizadores de sector magnético Los analizadores de sector magnético se basan en el hecho de que cuando un ion en movimiento atraviesa perpendicularmente a un campo magnético, se desvía de su trayectoria original. Si un ion de masa m y carga z se acelera mediante un potencial V, y la intensidad del campo magnético es B, la trayectoria circular que la partícula sigue en el campo magnético posee el radio: r = (1/B) × (2Vm/z)1/2 Este comportamiento se aplica a un analizador de masas de sector magnético. El detector y la rejilla de salida se colocan en posiciones como las mostradas en la figura 12.9. Lo más usual es que el potencial de aceleración V se mantenga constante, de modo que para un radio constante (el de la geometría del analizador), la magnitud B es la que determina la masa de los iones que alcanzan el detector. El espectro de masas se obtiene haciendo un barrido de B. Los iones de m/z diferente de la focalizada para una B determinada se pierden por colisión con la superficie del aparato y las láminas de la rendija, a continuación se fija otra B manteniendo constantes r y V, de manera que solo alcanzará el detector una m/z diferente, y así sucesivamente.

SECTOR MAGNÉTICO

+ +

+ +

+ + +

+

+

+

+

+

+ +

++

++ +

+ +

+ ++

+ +

+

+ +

+

+

+

+

+

60 °

+

FUENTE DE IONIZACIÓN DETECTOR

FIGURA 12.9. Analizador de masas de sector magnético.

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

261

12.4.2. Analizadores de doble enfoque o de doble sector Los analizadores de doble enfoque usan una combinación de campos magnéticos y eléctricos para focalizar los iones. Una configuración común en este tipo de analizadores se muestra en la Figura 12.10, donde un sector eléctrico sigue a un sector magnético. La rendija situada entre ambos campos actúa como filtro para seleccionar valores específicos de m/z. El sector eléctrico enfoca los iones con respecto a las diferencias en energía cinética con que llegan a la salida del sector magnético. Este doble enfoque ha ofrecido resolución suficiente para separar los iones de las moléculas C2H4, N2 y CO, cuyas «masas exactas» son respectivamente 28.0313; 28.0061 y 27.9949 Da. Sector magnético

Sector eléctrico

FUENTE DE IONIZACIÓN DETECTOR

FIGURA 12.10. Analizador de doble enfoque.

12.4.3. Analizador de tiempo de vuelo (TOF) El analizador de tiempo de vuelo es el modelo aparentemente más simple de analizador de espectrómetro de masas, posee una alta sensibilidad y un intervalo de detección de masas prácticamente ilimitado, por lo que su uso se ha extendido al análisis de proteínas y otras biomoléculas. Los iones que se generan en la fuente por cualquiera de los métodos de ionización disponibles son extraídos de la misma mediante un potencial eléctrico. Este potencial aplicado también acelera los iones dentro de una zona denominada «zona de deriva libre de campo». En el caso ideal, todos los iones producidos abandonarán la fuente al mismo tiempo con idéntica energía cinética, ya que todos han sido acelerados con la misma diferencia de potencial. Dado que la energía cinética es igual a 0.5 m v2, donde m es la masa del ion y v su velocidad, conociendo la distancia que separa la fuente de ionización del detector y el tiem-

262

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

po empleado por el ion para alcanzar el detector es posible determinar la velocidad, y por lo tanto, también la relación masa/carga de cada ion que alcance el detector. El principio básico de funcionamiento de los analizadores TOF es: Cuanto mayor es el ion, menor es su velocidad y por lo tanto mayor es el tiempo necesario para atravesar la «zona de deriva libre de campo». Iones generados Zona de deriva libre de campo

Fuente de ionización

Detector

FIGURA 12.11. Analizador de tiempo de vuelo (TOF).

12.4.4. Analizador de cuadrupolo Como veremos más adelante, este es el analizador de uso más generalizado para su acoplamiento a HPLC, GC, electroforesis capilar e ICP. El cuadrupolo se construye a partir de cuatro barras metálicas de la misma longitud y diámetro alineadas paralelamente entre sí (Figura 12.12). Las barras suelen estar construidas de acero inoxidable o molibdeno y, a veces, se recubren de un revestimiento de cerámica para proteger el elemento de la corrosión. El cuadrupolo actúa como filtro de masas aplicando un campo eléctrico en un par de rodillos (diametralmente opuesto) y un campo magnético en el par opuesto. Para una combinación determinada de campos eléctrico y magnético, solo los iones (iones resonantes) de una relación m/z determinada serán capaces de atravesar el cuadrupolo y llegar al detector (Figura 12.13). Los iones no resonantes se desviarán de la trayectoria y chocarán con las paredes del cuadrupolo (Figura 12.13). El sistema actúa fijando un campo eléctrico y variando la intensidad del campo magnético para que en cada momento atraviesen el sistema iones de un intervalo de m/z. El sistema eletrónico del detector controla qué combinación de campo magnético se está aplicando en cada momento, de manera que si recibe el impacto de un ion puede automáticamente asignar el valor correspondiente de m/z. La frecuencia de ba-

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

263

FIGURA 12.12. Analizador de masas tipo cuadrupolo.

DETECTOR

Rodillos del cuadrupolo Ion resonante (detectado)

+ +

FUENTE DE IONIZACIÓN

Ionos no resonantes (no detectados) Rodillos del cuadrupolo

FIGURA 12.13. Diagrama de funcionamiento de un detector cuadrupolo.

rrido del campo magnético puede ser programada según las necesidades del sistema, pero normalmente se trabaja realizando 2-3 muestreos por segundo para cada valor entero m/z entre 30 y 300.

264

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

12.5. DETECTORES Los espectrómetros de masas ionizan los analitos de la muestra y los iones generados son filtrados de acuerdo con la relación m/z para llegar al detector en un orden determinado. El detector es el sistema del espectrómetro encargado de transformar la energía de los iones generados en corriente eléctrica. La mayoría de los espectrómetros de masas utiliza como detector un dispositivo llamado multiplicador de electrones. Los multiplicadores de electrones son del tipo dinodo, y pueden ser de tipo continuo (Figura 12.14) o discontinuo (Figura 12.15).

En electrónica un dinodo es un electrodo encargado de suministrar una emisión secundaria.

El detector continuo tiene forma de embudo sobre el que se aplica una diferencia de potencial creciente (Figura 12.14). La superficie interna del embudo es de un material electroemisivo. Cuando un ion golpea la cara interna del dinodo, arranca electrones de la superficie. El potencial eléctrico hace que los electrones arrancados se aceleren para chocar de nuevo con las paredes. Estos impactos arrancan a su vez más electrones, que vuelven a ser acelerarados, vuelven a chocar, y así el ciclo se repite. Esta cascada de electrones produce una amplificación muy significativa de la señal. El funcionamiento del detector de dinodo discontinuo (Figura 12.15) es muy similar a la del detector continuo. En este caso, el detector está formado por una serie discreta de dinodos que, colocados estratégicamente, consiguen que cada módulo produzca una cascada de electrones cuyo resultado final es, de nuevo, una multiplicación de la señal.

+

FIGURA 12.14. Dinodo detector de electrones modo continuo.

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

265

+

M

+

M

Ion

e-

Electrones e-

Dinodo

FIGURA 12.15. Dinodo detector de electrones modo discontinuo.

12.6. ESPECTRÓMETROS DE MASAS EN TÁNDEM (MS-MS) Un espectrómetro de masas en tándem es un espectrómetro de masas con más de un analizador (normalmente, en la práctica, dos). El acoplamiento de dos analizadores de masas se usa en la identificación de estructuras complejas de compuestos. Los dos analizadores están físicamente separados por una cámara de fragmentación situada entre ambos. Esta cámara de fragmentación contiene un gas inerte que bombardea los iones que entran en la cámara produciendo nuevas fragmentaciones. En teoría, es posible cualquier combinación de detectores, no obstante, las combinaciones más comunes se muestran en la Tabla 12.3. TABLA 12.3. Combinaciones de detectores más comunes en sistemas MS-MS Cuadrupolo-cuadrupolo Sector magnético-cuadrupolo Sector magnético-sector magnético Cuadrupolo-TOF

El modo de operar clásico de un sistema MS-MS se muestra en la Figura 12.16. La muestra es inicialmente fragmentada y el primer analizador selecciona un ion dado. A continuación, el ion seleccionado pasa a la nueva cámara de fragmentación, donde se generan iones más pequeños que son analizados por el segundo analizador. Gracias a la doble fragmentación, los espectros obtenidos son muy útiles en la determinación de las estructuras de los analitos. El MS-MS encuentra un amplio campo de aplicación en el análisis estructural de pequeñas moléculas orgánicas y en la secuenciación de péptidos.

266

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

A1

+

A2 A5

+ A4

+

A3

+

+

Primer análisis de m/z

A3

+

Ion seleccionado

Cámara de fragmentación

A9

+

A7

+ A6

+

A8

+

Segundo análisis de m/z

FIGURA 12.16. Funcionamiento de un sistema de MS-MS.

Otro modo de trabajo de los MS-MS consiste en que el primer analizador no selecciona ningún ion, sino que deja pasar a todos. En cambio, el segundo analizador está programado para detectar solo un ion o bien un grupo de ellos. Este modo de trabajo es útil en la detección de analitos específicos en mezclas complejas, por ejemplo, hidrocarburos aromáticos en aceites, conjugados glucorónicos de xenobióticos en orina, etc. Estas detecciones podrían realizarse también con un solo analizador trabajando a la misma m/z que el segundo, sin embargo, si la muestra ha sido previamente fragmentada, aumenta la especificidad de la detección. Un tercer modo de trabajo implica que ambos analizadores estén constantemente detectando un rango de m/z fijado. Sin embargo, el segundo analizador está programado para registrar señales que difieran en un cierto número de las señales enviadas por el primer analizador. Por ejemplo, los ácidos carboxílicos tienden a fragmentarse liberando CO2, lo cual corresponde a una pérdida de masa atómica de 44. Así pues, para detectar ácidos carboxílicos, el segundo detector se programaría para registrar m/z que difieran en un valor de 44 de los registrados en el primer analizador. En el cuarto modo de trabajo de los MS-MS ambos analizadores están registrando señales de un solo ion o grupo de iones. Se utiliza para detectar la presencia de com-

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

267

puestos cuyo patrón de fragmentación está muy definido y sirve para confirmar inequívocamente la presencia de un compuesto en una matriz muy compleja. Este sistema de trabajo no solo es altamente específico, sino que también tiene una gran sensibilidad.

12.7. MODOS DE DETECCIÓN DE M/Z Los espectrómetros de masas pueden operar en modo barrido (scan) o en el modo de monitorización de un ion seleccionado selected ion monitoring (SIM). Modo scan En el modo scan los instrumentos detectan todas las señales en un rango de m/z dado. En la Figura 12.4 se miden las m/z entre 50 y 275 en un corto periodo de tiempo (0.5 segundos). Durante este tiempo la electrónica del sistema lee las 225 señales detectadas dentro del intervalo designado, con lo que cada valor m/z será registrado solo durante 2.2 milésimas de segundo. Los espectros mostrados en las Figuras 12.2 a 12.4 están obtenidos en modo scan. Modo SIM Cuando un espectrómetro de masas trabaja en modo SIM, en lugar de estar continuamente barriendo todas las m/z, monitoriza solo unas pocas de ellas. Como consecuencia, el analizador es capaz de estar mucho más tiempo haciendo un muestreo de cada uno de los valores m/z seleccionados. La Figura 12.17 es un espectro de masas de la misma muestra analizada en la Figura 12.4 pero obtenido en modo SIM, detectando a las m/z de 109, 149 y 275. En este caso el analizador dispondrá de 0.17 segundos para monitorizar cada masa. Esto se traducirá en un gran incremento de reproducibilidad de la señal. Otra consecuencia del modo de trabajo scan es que, si se seleccionan apropiadamente los valores de m/z, se puede reducir significativamente el ruido de fondo inespecífico. Actualmente las aplicaciones informáticas que analizan espectros de masas permiten analizar un espectro en el modo «ion extraído». Es un paso intermedio entre el scan y el SIM. Inicialmente el sistema registra y memoriza el espectro en modo scan en el rango seleccionado. Sin embargo, luego es posible «extraer» del espectro la señal de uno o varios de esos valores de m/z. Es decir, se eliminan del registro aquellos valores no seleccionados, obteniéndose así el equivalente a un espectro registrado en modo SIM. Este modo de análisis permite eliminar la señal de un determinado ion; de esta manera se puede, por ejemplo, «limpiar» ruido de fondo inespecífico sin perder información específica sobre la estructura de los analitos.

268

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

1.6 1.4 Abundancia × 106

109

1.2 1.0 0.8 149

0.6

275

0.4 0.2 0.0 50

100

150

200

250

m/z

FIGURA 12.17. Espectro de masas de paraoxon en modo SIM.

12.8. CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (GC-MS) La espectrometría de masas se convierte probablemente en la técnica analítica más poderosa si se acopla a un sistema de separación. De esta manera se puede conseguir que los analitos de una mezcla sean convenientemente separados y puedan ser analizados por espectrometría de masas de manera individual. Esto es lo que consigue la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). La Figura 12.18 esquematiza el proceso que se da en un sistema GC. Inicialmente una muestra que contiene 3 analitos (a, b y c) es cromatografiada en el sistema GC. Si la separación es apropiada, el resultado serán tres picos totalmente separados. Estos picos están físicamente separados y, por lo tanto, llegarán en momentos diferentes al detector de masas (MS), que está directamente acoplado al aparato de GC. Esto permitirá obtener 3 espectros de masas de cada uno de los analitos de la mezcla. Como resultado final dispondremos de un doble criterio de identificación; el tiempo de retención (que deberá ser comparado con patrones) y el espectro de masas. En la Figura 12.18 se observa el esquema del sistema de GC acoplado al MS mediante una unión. La figura 12.19 muestra una interfase de un equipo de GC-MS. La columna capilar se inserta dentro de la interfase por donde se indica en la Figura. La columna atraviesa los aproximadamente 25 cm de longitud de la interfase, de modo que el final de la misma hace que la fase móvil de la cromatografía desemboque directamente sobre el haz de electrones de la cámara de ionización de impacto elec-

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

269

Muestras

GC

MS

C A C

Espectro de masas de B B

B A Espectro de masas de C

Espectro de masas de A

FIGURA 12.18. Esquema de un proceso de GC-MS.

Manta calefactora Salida de la columna

A la fuente de ionización

INTERFASE

FIGURA 12.19. Interfase de un sistema GC-MS.

trónico (sistema de ionización presente en la mayoría de los aparatos GC). Toda la interfase está termostatizada por una manta calefactora necesaria para que los analitos recién cromatografiados continúen en estado gaseoso (requisito imprescindible para ser ionizados).

270

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

En un GC-MS la ionización suele ser por impacto electrónico.

Al igual que en todos los espectrómetros de masas, los analitos pasan desde la cámara de ionización al analizador. En la mayoría de casos (aunque no en todos) el analizador de un GC es un cuadrupolo. Del cuadrupolo pasan luego al detector, que suele ser un dinodo continuo (Figura 12.20).

En un sistema GC-MS el analizador suele ser un cuadrupolo.

El resultado de una GC con un detector MS acoplado es siempre una representación de la corriente eléctrica que llega al detector en función del tiempo. Para cada punto temporal del cromatograma es posible obtener un espectro de masas del material eluido en ese punto. De esta manera es posible, como esquematiza la Figura 12.18, obtener un espectro de masas de cada uno de los analitos eluidos. Por ejemplo, el espectro de masas del paraoxon (Figura 12.4) ha sido obtenido del pico 2 del cromatograma de la Figura 10.7C.

FIGURA 12.20. Detector de MS.

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

271

Como ha quedado comentado a lo largo de esta sección, los espectros de masas pueden llegar a ser realmente complejos. Se puede obtener mucha información sobre la estructura química del analito (aun sin ser un experto en espectrometría de masas) ya que el espectro de masas obtenido de un GC es una «huella dactilar» del analito. Es decir, que cada molécula tiene una manera de fragmentarse que es propia e irrepetible y no depende del proceso cromatográfico previo. Esta característica de los espectros de masas permite la creación de colecciones de espectros que se agrupan por familias de moléculas. Por ejemplo, existen librerías de plaguicidas, de drogas de abuso y sus metabolitos, etc. Existen actualmente aplicaciones informáticas muy fiables que comparan los espectros de masas obtenidos en nuestro cromatograma con los de las librerías y nos ofrecen porcentajes de similitud entre ambos. Si el pico está bien resuelto, el espectro obtenido será idéntico al de la librería, la comparación se realizará de modo casi automático y el analito podrá ser identificado de una manera casi infalible por el operador. La existencia de librerías de espectros de masas y de las aplicaciones informáticas capaces de compararlos permite la identificación de analitos de la muestra sin necesidad de disponer de patrones.

El espectrómetro de masas es el único detector de GC que permite la identificación de los analitos sin la comparación de resultados con patrones.

La señal del espectro de masas es proporcional a la cantidad de muestra que llega al detector. Esto permite que los sistemas GC-MS puedan ser utilizados en la cuantificación de los analitos de manera similar a cualquier otro detector de GC comentado en el capítulo 10. Al igual que se describió en esa sección, se debe comparar el área de los picos con el área de picos de patrones de concentración conocida analizados en condiciones idénticas.

12.9. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (HPLC-MS) Al igual que existen sistemas de GC acoplados a MS, también existen sistemas de HPLC acoplados a MS. Los sistemas HPLC-MS son más recientes que los sistemas GC porque ha sido necesario desarrollar sistemas capaces de volatilizar la corriente líquida que eluye del HPLC con la suficiente eficacia y rapidez para ser introducida en el detector de masas. Esta dificultad no existía en el caso de GC-MS porque la fase móvil que eluía de la columna se encontraba en todo momento en fase gaseosa. El poder de los sistemas HPLC-MS reside, al igual que en los GC-MS, en que se acopla un sistema de separación que permite obtener espectros de masas de cada uno de los analitos de las muestras.

272

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Los sistemas de HPLC-MS facilitan el análisis de muestras que tradicionalmente han sido difíciles de analizar por GC-MS. Es decir, básicamente, de analitos poco volátiles. Así pues, los sistemas HPLC-MS expanden significativamente el uso analítico de la MS para compuestos orgánicos (desde fármacos hasta proteínas). Los sistemas de ionización que definitivamente hicieron posible el desarrollo de HPLC-MS fueron el API-ES y el APCI. Entre estos dos sistemas de ionización se pueden analizar compuestos de peso molecular hasta aproximadamente 100 kDa con un rango de polaridades que va desde analitos no polares hasta los muy polares. Los espectros de masas obtenidos por HPLC-MS suelen ser más sencillos que los de GC-MS. Esto es debido a que el nivel de fragmentación de las moléculas es menor. Los espectros de HPLC-MS tienen el inconveniente de que dependen parcialmente de los parámetros de ionización, es decir, que no pueden ser considerados como «huella dactilar» del compuesto y, por lo tanto, la comparación con colecciones de espectros estándares no es posible. Por lo tanto, la comparación de espectros de masas de analitos con patrones debe realizarse en las mismas condiciones de trabajo. No obstante, como se muestra en la Figura 12.21, los espectros de masas obtenidos mediante HPLC-MS siguen siendo una poderosa herramienta de identificación. La Figura 12.21 muestra la separación e identificación por HPLC-MS con columna de fase reversa de 4 diferentes neurotransmisores (3 catecolaminas y serotonina) secretados por células cromafines bovinas. Las catecolaminas no son volatilizables y, por lo tanto, su análisis mediante GC-MS requiere necesariamente de una derivatización previa. En cambio, mediante HPLC-MS, los 4 neurotransmisores pueden ser analizados inyectando directamente la mezcla sin tratamientos previos.

12.10. PLASMA ACOPLADO INDUCTIVAMENTE ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (ICP-MS) ICP-MS es un sistema de análisis multielemental de excelente sensibilidad. El instrumento emplea plasma acoplado inductivamente (ICP) como fuente de vaporización e ionización para el analizador del espectrómetro de masas (MS). La Figura 12.22 muestra la estructura general de un aparato ICP-MS. Las muestras líquidas se introducen a través de una bomba peristáltica en un nebulizador con una cámara de doble paso. El gas (Ar) se introduce a través de una serie de tubos de cuarzo concéntricos, donde se forma la antorcha de plasma acoplado inductivamente según se ha descrito en la sección 5.4.2 (Figura 5.10). El aerosol que contiene la muestra es instantáneamente volatilizado e ionizado por el plasma. Los iones producidos se extraen desde el plasma a través de un sistema de lentes electromagnéticas iónicas hasta una cámara de muy alto vacío (típicamente 10–4 Pa), donde se encuentra el cuadrupolo. Una vez en esta cámara, los iones son filtrados por el

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

273

D

2.5e+6 B m/z total

2.0e+6 1.5e+6 1.0e+6

C

A

5.0e+5 0.0

0

2

1

3

4

5

6

7

TIEMPO (min)

0.4 0.2 0.0 50

100

150 m/z

200

D: serotonina

1.75 Abundancia × 106

Abundancia × 106

A: noradrenalina 0.6

250

1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 50

100

150

250

C: dopamina

B: adrenalina 1.0

0.6 Abundancia × 106

Abundancia × 106

200

m/z

0.4 0.2 0.0 50

100

150 m/z

200

250

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 50

100

150

200

250

m/z

FIGURA 12.21. Separación e identificación de diferentes neurotransmisores. Se inyectaron 25 μl de una disolución de 2 μg/mL de noradrenalina (pico A), adrenalina (pico B), dopamina (pico C) y serotonina (pico D), en una columna de C8 con un flujo de 0.75 mL/min. La fase móvil fue tampón acético/acetato 50 mH pH 2.9 y metanol. Al comienzo del cromatograma se aplicó un gradiente que elevó la concentración de metanol desde 0 hasta 60% en 6 minutos. El detector fue un espectrómetro de masas API-ES funcionando en modo scan positivo. Condiciones de detección: 12 L/min de N2 secante a 300 oC, presión del nebulizador 50 psi, voltaje del capilar 3000 V. Figura cedida por Ester Sabater y la Dra. Victoria Carrera de la División de Toxicología de la Universidad Miguel Hernández de Elche.

274

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

Generador de radiofrecuencia Cámara de nebulización Lentes iónicas

Cuadrupolo Muestra

Bomba de vacío Sistema de recogida, análisis y almacenamiento de datos

Bomba de vacío

Generador de radiofrecuencia

Bomba de vacío

Antorcha de plasma Bomba de vacío

Argón

FIGURA 12.22. Estructura de un equipo ICP-MS.

cuadrupolo en función de m/z como ya se ha descrito en la sección 12.4.4. Finalmente, la señal producida es amplificada por un dinodo discontinuo como el que se presenta en la Figura 12.15. El sistema de ICP-MS puede medir simultáneamente la mayoría de los elementos del sistema periódico. La Figura 12.23 muestra los elementos del sistema periódico que pueden ser determinados por ICP-MS, así como sus límites de detección aproximados. La Figura 12.24 compara el ICP-MS con otros sistemas de detección de elementos en cuanto a sensibilidad y facilidad para el análisis del número de muestras. La Tabla 12.4 realiza la misma comparación para otras características importantes. Se observa que, salvo en lo relativo a motivos económicos, el ICP-MS supera en prestaciones a todos los demás sistemas de detección de elementos, ya que es un sistema que: 1) requiere bajas cantidades de muestra; 2) tiene un excelente intervalo de linealidad (casi 9 órdenes de magnitud); 3) puede utilizar disolventes orgánicos; 4) es una técnica multielemental de detección simultánea (es decir, que una operación de medida puede detectar muchos elementos); 5) puede trabajar con isótopos, es decir, que no solo detecta los isótopos mayoritarios de un elemento sino también los minoritarios. En el campo medioambiental (control de aguas y de contaminación de suelos y otros medios) es probablemente donde mayor aplicación han encontrado los ICP-MS, aunque no es el único. Las características de este sistema lo hacen útil, además, en campos como la Química Nuclear, la Clínica, Geología, etc. (Tabla 12.5).

Espectrometría de masas (MS)

No detectable por ICP-MS Li

Be

Na

Mg

K

Ca

Sc

Ti

V

Cr

Rb

Sr

Y

Zr

Nb

Mo

Cs

Ba

La

Hf

Ta

W

Ce

Pr

Nd

Th

X

< 0,1 ppt

X

1-10 ppt

X

0,1-1 ppt

X

>10 ppt

Mn

B

•• •• ••

F

Al

Si

P

S

Cl

Fe

Co

Ni

Cu

Zn

Ga

Ge

As

Se

Br

Ru

Rh

Pd

Ag

Cd

In

Sn

Sb

Te

I

Ir

Pt

Au

Hg

Tl

Pb

Bi

Eu

Gd

Tb

Dy

Ho

Er

Tm

Yb

Lu

Re

Sm

275

U

Alta

FIGURA 12.23. Límites de detección aproximados de los sistemas ICP-MS. Las casillas que aparecen vacías corresponden a elementos no detectables por ICP-MS.

IC P - MS

Sensibilidad

ABSORCIÓN ATÓMICA CON HORNO DE GRAFITO

EMISIÓN ATÓMICA POR ICP

Baja

ABSORCIÓN ATÓMICA CON LLAMA

Baja

Número de análisis

Alta

FIGURA 12.24. Comparación gráfica de las características de varias técnicas de detección.

276

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

TABLA 12.4. Comparación de técnicas de análisis elemental Absorción atómica con horno de grafito

Emisión atómica con ICP óptico

ICP-MS

Límite de detección

ppt

ppb

ppq-ppt

Rango de linealidad

2-3

4-6

9

Moderadas

Muchas

Pocas

Lenta

Lenta

Rápida

Multielemental

NO

SÍ

SÍ

Simultánea

NO

NO

SÍ

Tamaño de la muestra

μL

mL

mL

Costo del equipo

€

€€

€€€€

€€€

€€

€€€

Criterio

Interferencias Velocidad de análisis

Costo de cada análisis

TABLA 12.5. Aplicaciones de los sistemas ICP-MS Sistemas ICP-MS

Aplicaciones

Medioambientales

Análisis de agua de consumo humano, residuales, de mar, suelos, lodos, especiación de Hg, As, Pb y Sn

Semiconductores

Detección de contaminantes en chips de silicio

Clínica

Análisis de sangre, pelo, suero, orina, tejidos

Nuclear

Producción de combustible nuclear, medida de radioisótopos, medida de contaminación en aguas refrigerantes

Geología

Análisis de suelos, rocas, sedimentos

Medicina Forense Análisis de alimentos

Espectrometría de masas (MS)

•• •• ••

277

Los espectros de masas de elementos son extremadamente simples. Cada elemento aparece como una banda a su peso molecular de intensidad proporcional a la cantidad de iones generados. Por ejemplo, 27Al aparecerá como una banda en la zona de m/z 27 uma. La Figura 12.25 muestra el espectro de masas de una muestra de agua analizada en nuestro laboratorio. A pesar de la simplicidad de los espectros se debe tener un cierto grado de destreza en su interpretación, ya que, en determinadas ocasiones, la presencia de oxígeno induce la formación de óxidos o hidróxidos de determinados elementos. A veces también se da la formación de combinaciones entre elementos y el Ar de la antorcha. No obstante, las aplicaciones informáticas de análisis de espectros ICP-MS poseen 1.2e+6 1.0e+6 Cuentas

8.0e+5 6.0e+5 4.0e+5 2.0e+5 0.0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

m/z 200

Cuentas

Cuentas

2 000

150 100 50

1 500

0 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z

1 000 500 0 100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

260

270

280

290

200

m/z

Cuentas

400 300 200 100 0 200

210

220

230

240

250 m/z

FIGURA 12.25. Análisis por ICP-MS de una muestra de agua.

300

278

•• •• ••

Técnicas analíticas de contaminantes químicos

recursos basados en algoritmos matemáticos que comparan la abundancia relativa entre los distintos isótopos y que permiten identificar y corregir las interferencias que se derivan de estas situaciones. Dado que el sistema analiza elementos, y no moléculas, no se produce fragmentación durante la ionización. Es por ello que cada elemento produce para las mismas condiciones de trabajo siempre la misma respuesta del detector. Debido a esto, los ICP-MS tienen un modo de trabajo denominado «semicuantitativo» que permite cuantificar los elementos de la muestra sin necesidad de patrones y curvas de calibrado. Normalmente solo se recurre a la cuantificación mediante patrones cuando es necesaria una gran exactitud. La Figura 12.26 muestra la cuantificación en modo «semicuantitativo» del espectro de masas de la Figura 12.27. Obsérvese como el sistema informático hace sugerencias sobre la posible formación de óxidos u otros compuestos de ciertos elementos.

12.11. ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN INTERNET Si se desea ampliar información sobre las técnicas de MS, se encontrará en internet multitud de enlaces relacionados. Algunos de los más interesantes son: 1) Principios de MS: http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/mass_spec/index.html 2) Curso on-line de la Sociedad Americana de Espectrometría de Masas: http://www.asms.org/whatisms/index.html 3) Curso de MS del Departamento de Química de la Universidad de Cambridge: http://www-methods.ch.cam.ac.uk/meth/ms/theory/ 4) Curso de MS de la Facultad de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Leeds: http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/mstut/mstutorial.htm 5) Principios de GC-MS: http://ull.chemistry.uakron.edu/gcms/ 6) Curso del Centro de Investigación en Espectrometría de Masas de la Universidad de Vandervilt http://ms.mc.vanderbilt.edu/tutorials/ms/ms.htm 7) Curso de Espectrometría de Masas del Instituto Fraunhofer http://www.ivv.fraunhofer.de/ms/ms-introduction.html Todas estos enlaces se encuentran activos en julio de 2004.

Espectrometría de masas (MS)

Mass

Conc.

Counts (CPS) B

Li 7 Be 9 B 11 Na 23 Mg 24

59.00 ng/l