Tecnica de cultivo de microorganismos_7.pdf

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Laboratorio de Microbiología

“AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD  ALIMENTARIA”

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA - LA MOLINA

INFORME N° 7 TECNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS Integrantes: 20111360 20091001 20120456 20100472

Colquehuanca Mejía, Eliana Elsye Flores Calderon, Elvis Hedim Norabuena Damian, Juan Bernardo Tantahuillca Landeo, Pat Teresa

Mesa N°5 Grupo: Miércoles de 3 a 5 pm

2013

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I.

INTRODUCCIÓN Muchos de los análisis realizados en los laboratorios de microbiología de alimentos incluyen en recuento de microorganismos presentes en una muestra. Aunque se puede usar el microscopio para enumerar los microorganismos, esta técnica tiene tres limitaciones. Primero, es difícil de diferenciar las células vivas de las células muertas. Segundo, es casi imposible observar la bacteria a la luz del microscopio con una 6

densidad celular de menos de 10   por mililitro. Tercero, los materiales sólidos como partículas de nutrientes no pueden ser vistos sin una ruptura mecánica debajo de la luz de un microscopio de alta potencia (Swanson, Petran y Hanlin; 2001). Seguido de la incubación, la población de microorganismos originalmente presente puede ser estimada por un recuento del número de colonias o el número de tubos que muestran evidencia del crecimiento y multiplicación a través de la dilución que fue agregada a las placas o tubos. En el caso de los alimentos, existe un límite para recuento de bacterias en estos, que ya están establecidos por la norma siendo permitidos dentro de un rango de 30 a 300 u.f.c./ml. Generalmente los microorganismos se encuentran mezclados unos con otros en una muestra, por lo que se realizan aislamientos para estudiar un microorganismo objetivo a través de un cultivo puro. Esto porque viven de forma sinergística, o sea que existe cooperación entre ellos. En este informe se explican las principales técnica usadas para el cultivo del microorganismo, características del crecimiento en medios de cultivos como en el caldo nutritivo y agar nutritivo (inclinado y vertical); además del aislamiento y recuento de microorganismos con dos métodos: a) por estrías en placas con agar Mc Conkey y agar Manitol-salado, b) diluciones por incorporación (0,1 ml) en agar nutritivo licuado.

OBJETIVOS: 

Observar características de crecimiento de los microorganismos al trasplante en medios de cultivo líquido y sólido.



Separar colonias individuales individuales a partir de una mezcla de microorganismo utilizando técnicas de aislamiento.

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II.

MARCO TEÓRICO El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de cultivo, recibe el nombre de “siembra”,  esta operación la podemos realizar a partir de muestras biológicas (orina, pus, secreciones, etc.), de análisis de control de calidad (alimentos, aguas, cosméticos, medicamentos, etc.), procedentes de muestras ambientales (agua, suelo, aire, etc.) etc.) o de un cultivo cultivo microbiano a otro. Por otro lado, si

denomina “subcultivo” “subcultivo” o “repique”  (Rojas, 2011). la realizamos de un cultivo a otro se denomina Una vez que ha sido preparado un medio de cultivo (Agar Gelatina, Agar Mc Conkey, etc.), puede ser inoculado e inmediatamente incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. En la toma de muestras de un medio (solido, liquido o aire), mayormente se tiene una población mixta, entonces si se quiere cultivar una especie de la muestra se debe rea lizar “técnicas de aislamientos ” que permitan obtener cultivo axénicos o puros. Un cultivo puro o axénico es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo y que procede de una sola célula, el crecimiento de esta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente reconocibles o visibles que recibe el nombre de “colonia” , un ejemplo figura 1.

Figura 1: Pseudomona aeruginosa cultivada en agar Triptacasa-Soja

Fuente: Madigan, 2009.

La técnica de aislamiento, fue desarrollada durante el siglo XIX. En un principio se utilizó diluciones seriadas en medio líquido, pero la presencia de contaminantes (microorganismos no deseados) dificulto el aislamiento. Posteriormente la escuela de Robert Koch introdujo los medios sólidos, completamente con agar y las placas Petri para bacterias, permitiendo así la separación de física de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. Esto permite tener una visión macroscópica de las colonias y de diferenciar distintas especies microbianas.

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2.1 Técnica de siembra en medios medios contenidos en tubos tubos Se tiene siembra en medios de cultivo contenido en tubos, ya sea caldo, caldo nutritivo, agar inclinado, otros. Así se observara en las colonias su intensidad de enturbiamiento, aparición de película o sedimento en el tubo, también poder determinar un crecimiento móvil o no. En esta siembra se debe tener mayor cuidado, puesto que un contaminante del aire puede superar en crecimiento al microorganismo de estudio, por lo tanto se deber tomar las siguientes precauciones:



Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la bica de este.



Los tapones se deben deben mantener en la mano contraria a aquella que contiene el tubo, sosteniéndolos entre el dedo menique, el anular y el dedo del corazón. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar.



Flamear la boca de tubo antes de cerrarlo después de la siembra o inoculación.



Esterilizar el asa adecuadamente (toda porción que entra en contacto con el medio de cultivo)



Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.



Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.



Después de realizar la siembra, siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo.



Al sembrar trabajar en cámara de flujo laminar o en su defecto con mechero Bunsen.



En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, así como, utilice asas totalmente rectas.

a) Siembra en tubos por estrías simples Se realiza en un tubo con medio solido inclinado (en bisel o pico de flauta), y deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marque con movimiento en zigzag o surcos en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el área inclinada. Luego incubar en estufa durante 28-48 horas a temperatura más adecuada a 37ªC.

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Figura 2: Siembra en un tubo de agar inclinado b) Siembra en tubos por picadura Se realiza con asa recta en punta en tubos de medios sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el centro de superficie, llegando con el extremo del asa al fondo del tubo y retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura. Una siembra con asa (de argolla) argolla) o con cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de crecimiento que se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana. Por ultimo incubar durante 24-48 horas a temperatura optima de crecimiento.

Figura 3: Prueba de movilidad en agar

semisólido.

c) Siembra en tubo tubo en medio líquido (caldo líquido) líquido) Transferir asépticamente con el asa bacteriológica (de argolla), o en algunos casos, pipetas estériles o hisopos. hisopos. Si se usa asas bacteriológicas, bacteriológicas, pequeña muestra de

de una

microorganismos, se transfiere desde desde el tubo que

contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estéril, se inocula el microorganismo en el medio líquido, sumergiendo el asa en el líquido y rotar el mango para desprender la muestra.

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Figura 4: Inoculación de un caldo de cultivo 2.2 Técnicas de aislamiento Un modo de estudiar un ecosistema ecosistema microbiano consiste en

aislar de él los

microorganismos y estudiar sus propiedades en cultivos de laboratorio. El aislamiento

es

importante

porque

se

obtienen

cultivos

para

estudios

experimentales en el laboratorio y para las aplicaciones en los campos de la biotecnología y la microbiología industrial y ambiental (Madigan, 2009). Hernández (2003) nos dice que se ha desarrollado una serie de técnicas microbiológicas

para

aislar

microorganismo

y

obtener

cultivos

puros.

A

continuación se mencionan tres de ellas: 

Siembra en placas de Petri por rayado



Siembra en placa vertida



Diluciones en serie

2.2.1

La siembra en placas de Petri por rayado Esta técnica se basa en la separación de los microorganismos al dispersarpor rayado sobre agar- una muestra que los contiene, según se muestra en la figura 5, a. Para llevar a cabo la disgregación, se recoge una porción de la muestra con un asa bacteriológica y se raya sobre una sección de una placa Petri; luego, se repite el rayado en tres secciones más de la placa. En cada rayado, se toma la muestra de la sección anterior por lo que se logra una disminución gradual en la cantidad de microorganismos. Los microorganismos dispersos en la placa se incuban a la temperatura y el tiempo recomendados; al crecer, formarán colonias separadas unas de otras en alguna de las secciones del rayado, como se puede observar en la figura 5, b. En esa figura, cada punto representa una colonia. Posteriormente, se toma una muestra de una de las colonias separadas y se repite el procedimiento, con la finalidad de confirmar la presencia de un solo tipo de microorganismos.

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Figura 5: Siembra en placa Petri por rayado. a) El rayado de placas con asa microbiológica. b) El crecimiento y la separación de las colonias. Fuente: Hernández, 2003.

2.2.2

La siembra en placa vertida En esta técnica se hacen crecer los microorganismos en tubos, cada uno con una concentración diferente, y se evalúa el tubo en el que las colonias crecieron en forma separada.

Como primer paso, se preparan suspensiones de la muestra en diversas diluciones y se coloca cada una en un tubo con agar fundido, como se muestra en la figura 6, a. Luego, se mezcla homogéneamente el contenido (el agar y el inóculo) de cada tubo y se vierte (no se siembra por rayado) en una placa de Petri, según se muestra en la figura 6, b.

Se incuba cada placa, a la temperatura y el tiempo recomendados, y se selecciona la dilución en la que se haya obtenido mayor separación de las colonias.

Por último, de esta dilución, se toma una muestra de las colonias y se siembra en una placa de Petri, por rayado, para confirmar si el cultivo está puro. La conformación de pureza se puede realizar por observación a simple vista (colonias de igual morfología), por observación microscópica o mediante pruebas bioquímicas.

Figura 6: La siembra en placa vertida. a) Las diluciones de la muestra. b) El vertido del cultivo en una placa de Petri.

Fuente: Hernández, 2003.

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2.2.3

Diluciones en serie Esta técnica se aplica cuando se conoce de antemano que el microorganismo de interés se encuentra en mayor cantidad que los demás. Para llevarla a cabo, se preparan varias diluciones de la muestra y se incuban en el medio de cultivo adecuado para que crezca este microorganismo; así, se logra que en alguna de las diluciones solo él aparezca. Es necesario reconfirmar su presencia, utilizando el método de siembra en placa de Petri por rayado.

2.3 Morfología de la colonia de bacterias bacterias Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivos exhiben diferentes tipos, formas macroscópicas en su crecimiento, estas diferencias llamadas

“características culturales”, son la base para la separación de ellas en grupos taxonómicos. Estas son determinadas por el cultivo de microorganismos en agar Nutritivo inclinado, en placas de Petri, en caldo nutritivo y otros.

La morfología colonial, es una característica indispensable a tener en cuenta en el aislamiento primario de una bacteria y, en la cual se debe considerar el borde y la elevación de la misma. Adicionalmente, es importante apreciar la consistencia y textura de la masa celular, pues también son características distintivas. La consistencia va desde viscosas que se pegan en el asa y se separan de la colonia formando un hilo. Así como también la pigmentación de la colonia, las películas continúas de crecimiento (bacterias móviles), colonias lisas (generalmente virulentas) o colonias rugosas (generalmente avirulentas).

2.3.1

Caracterización del crecimiento sobre Agar Nutritivo inclinado Los cultivos en este medio se inoculan en una sola línea recta (sobre la superficie del bisel), y se evalúan de la siguiente manera:



Abundancia de crecimiento: La cantidad de crecimiento es designada como ninguna, leve, moderada o abundante.

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

Pigmentación:  Los microorganismos cromogénicos, pueden producir pigmentos intracelulares que son responsables de la coloración de las colonias; otros microorganismos, producen pigmentos solubles extracelulares que son excretados en el medio y también producen color, sin embargo la mayoría de la los microorganismos

son

no

cromogénicos

y

aparecerán

en

tonalidades que van desde el blanco al gris. 

Las características ópticas: Pueden evaluarse con base en la cantidad de luz transmitida a través del crecimiento, estas características son descritas como: opaca (ninguna transmisión de luz), translucida (transmisión parcial), o transparente (transmisión total de la luz).



Forma:   La apariencia del crecimiento de la siembra en una sola línea sobre la superficie del agar inclinado se designa de la siguiente forma (Ver figura 7).

Estas pueden ser:

a. Filiforme.-  Crecimiento en forma de hilo con bordes lisos continuos.

b. Equinulado.-   Crecimiento en forma de hilo con bordes irregulares continuos.

c. Barbado.- Colonias semi-confluentes o no confluentes. d. Difuso.- Crecimiento difuso y reducido. e. Arborescente.- Crecimiento en forma de árbol. f.

Rizoide.- Crecimiento en forma de raíz.

Figura 7:  Apariencia del crecimiento bacteriano, sembrado en una sola línea sobre agar Nutritivo inclinado, donde: (A)  Crecimiento filiforme, (B) equinulado, (C) barbado, (D) difuso, (E) arborescente y, (F) rizoide. Fuente: Rojas, 2011.

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2.3.2

Caracterización del crecimiento en caldo nutritivo Son evaluados según la distribución y apariencia del crecimiento como sigue (Ver figura 8):

a. Turbidez fina uniforme.-  Crecimiento fino y totalmente disperso

b. Floculante.-  Crecimiento en agregados escamosos totalmente dispersos

c. Película.- Crecimiento en la superficie como plataforma, grueso

d. Sedimento.- Concentración del crecimiento en el fondo del caldo; puede ser granular, escamoso o floculante.

Figura 8:  Apariencia del crecimiento bacteriano, sembrado en caldo Nutritivo, donde: (A)  Crecimiento de turbidez fina uniforme, (B) floculante, (C) película y, (D) sedimento. Fuente: Rojas, 2011.

2.3.3

Caracterización del crecimiento en placas de Agar Nutritivo La descripción se realiza sobre las colonias formadas (agrupamiento bacteriano originado por el crecimiento y observable macroscópicamente), de forma aislada y se evalúa de la siguiente manera (figura 9).

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a. Tamaño:  Grande (diámetro mayor a 1mm), mediano (diámetro aproximado a 1 mm), pequeño (diámetro inferior a 1 mm) y puntiforme.

b. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide y lanceolada.

c. Borde: De borde regular (continuo), de borde irregular (ondulado, lobulado, espinoso/dentado/lacerado, ondulado y filamentoso).

d. Elevación: Plana o aplastada (no elevación), elevada (convexa baja, convexa cupuliforme, mamelonada, pulvinada y umbilicada).

e. Superficie: Lisa o rugosa. f.

Consistencia: Blanda, dura o mucoide.

g. Aspecto: Brillante, opaco y mate o translucido. h. Pigmento: De diferente color. Pueden ser pigmentos solubles en agua y que decoloran el medio, pigmentos fluorescentes y pigmentos no difundibles confinados a las colonias.

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Figura 9: Descripción macroscópica realizada en colonias creciendo sobre  Agar Nutritivo, donde se aprecia la forma, la elevación y el borde.

Fuente: Rojas, 2011

La morfología de las colonias es un parámetro importante en el proceso de identificación bacteriana, siendo estas características, comunes entre cada género bacteriano. Sin embargo, la morfología puede alterarse por tiempo de incubación, composición del medio de cultivo (excesiva desecación o humedad), etc. Esta descripción es también aplicable a las levaduras, debido a que esta presenta crecimientos típicos a bacterias.

III.

PARTE EXPERIMENTAL Ejercicio 1:  Técnicas de cultivo de Microorganismos: Características de crecimiento en medio de cultivo Materiales: 

Cultivo de microorganismos de 18 horas: Staphylococcus sp



Asa de kölle



 

Mechero

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

Tubos con agar nutritivo inclinado



Tubos con agar nutritivo vertical



Tubos con caldo nutritivo

Procedimiento: 1.

Se esterilizó esterilizó el asa de kölle por flameo a la llama. llama.

2.

Se tomó el tubo con cultivo de 18 horas, se retiró el tapón, se flameó la boca del tubo al mechero y se obtuvo una pequeña porción del cultivo cultivo con ayuda del asa de kölle. Se flameó nuevamente la boca del tubo antes de volver a taparlo.

3.

Se tomó el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores se introdujo el asa en el líquido para dejar el inóculo. Se homogenizó la mezcla girando el tubo entre las palmas de la mano.

4.

Se repitió el procedimiento 1 para obtener más inóculo, inóculo, pero se usó esta vez aguja de kölle.

5.

Se tomó el tubo de agar inclinado y se realizó la siembra depositando el inóculo a lo largo de una sola línea descrita desde la base de inclinación hasta el extremo.

6.

Se repitió el procedimiento 1 para obtener más inóculo, se usó nuevamente aguja de kölle.

7.

Se tomó el tubo con agar vertical y se realizó la siembra por picadura profunda del medio.

8.

Se rotularon los los tubos sembrados y se colocaron a incubar a 37°C por 24 horas.

9.

Cumplido el tiempo de incubación, incubación, se evaluó el crecimiento.

Figura 10. 1. Se esterilizó el asa de kölle por flameo.

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Figura 11. Se introdujo el asa en el líquido para dejar el inóculo.

Figura 12. Se introdujo el asa en el líquido para dejar el inóculo.

Ejercicio 2: Técnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y Recuento en placas

Materiales:

-

Tubos

de

caldo

conteniendo

una

mezcla

de

microorganismos

(Serratiamarcescens, Bacillus sp., sp., Escherichia coli, Micrococcus sp., sp., Proteus sp.) -

Asa de kölle, aguja de kölle

-

Mechero

-

Tubos con 12ml de agar nutritivo licuado y manteniendo a 50°C

-

Placas Petri estériles

-

Placas con Agar nutritivo

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-

Placas con Agar Mc Conkey

-

Placas con Agar Manitol Salado

Procedimiento:

A. Aislamiento por estrías 1.

Se tomó el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa o aguja de kölle previamente esterilizada a la llama, se retiró el inóculo. Se consideró todas las recomendaciones antes dadas para el trabajo con asepsia.

2.

Se tomó la placa con agar nutritivo con la la mano izquierda y con ayuda de los dedos pulgar e índice se levantó hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. No se descubrió por completo la placa, así se evitó mayor contaminación. Con el asa cargada de inóculo, se hizo estrías sobre toda la superficie del medio, se procuró trazar una última estría en un espacio libre. Se cerró la placa.

3.

Se esterilizó el asa a la llama nuevamente. nuevamente.

4.

Se repitió los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mc Conkey. Conkey.

5.

Se colocó colocó las placas en incubación a 37°C por 24 horas.

6.

Se observó el desarrollo de colonias individuales y se describieron sus características de forma, elevación, consistencia, bordes, etc. Se diferenció las características de las colonias desarrolladas en el medio selectivo-diferencial.

B. Aislamiento por diluciones 1.

Se tomó el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa de kölle se retiró inóculo.

2.

Se tomó un primer tubo de agar licuado licuado

manteniéndolo a 50°C y

transferir asépticamente el inóculo. Se esterilizó el asa a la llama del mechero. Con el tubo cerrado se mezcló el inóculo con el medio, se hizo girar entre las palmas de las manos. 3.

Se transferir una asada del agar mezclado con el inóculo hacia un segundo tubo de agar licuado. Se repitió la operación anterior para obtener una mezcla homogénea.

4.

Se vertió el contenido de cada tubo por separado en dos placas Petri estériles y se rotó lentamente sobre la mesa para distribuir el medio de manera uniforme. Se rotularon cada dilución para diferenciarlas.

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5.

Se incubó las placas a 37°C por 24 horas.

6.

Se examinó el crecimiento de las colonias en las placas. Se hizo un recuento de colonias (el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300). Se describieron las características diferenciales de las colonias observadas.

IV.

OBSERVACIONES  Al día d ía siguiente se observaron los resultados en cada placa, y cada tubo. Obteniendo los siguientes resultados:

Ejercicio 1: Características de crecimiento en medio de cultivo. culti vo.

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Figura 13: Agar nutritivo inclinado . Agar Nutritivo inclinado Cantidad Distribución en la superficie Forma de crecimiento Consistencia de crecimiento Pigmentación

 Abundante Irregular Rizoide Viscoso Blanco

Figura 14: Agar nutritivo vertical Agar Nutritivo Vertical Crecimiento

Limitado a la línea de inoculación En profundidad

Figura 15: Caldo nutritivo

Caldo Nutritivo Cantidad

Escasa

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Turbidez, aparición de opacidad en el medio.

Apariencia o tipo

Ejercicio 2: Técnica de aislamiento. A) Aislamiento por estrías:

Características de colonias observadas:  

Tienen forma redondeada Presentan elevación

Figura 16. Crecimiento de Staphylococcus sp Staphylococcus sp en Agar MacConkey.

Características de colonias observadas: No se observó crecimiento de colonias de Staphylococcus  Staphylococcus   sp, después de aproximadamente 24 horas.

a)

Figura 17. Crecimiento de Staphylococcus sp en agar manitol salado.

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B) Aislamieno por diluciones

Figura 18. Primera asada del agar mezclado con el inóculo.

Características de las colonias presentes con la primera asada del inóculo : 

Se obsevó colonias muy juntas y abundantes.

Colonias formadas

Figura 19. Segunda asada del agar mezclado con el inóculo.

Características de las colonias presentes con la segunda asada del inóculo: 



Se observó que las colonias presentes estaban aún juntas pero si se podían contabilizar. El número de colonias

contabilizadas fue de 92.

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V.

DISCUSIONES Las bacterias Staphylococcus sp son poco exigentes en sus necesidades; crece bien en cualquier medio ordinario, aunque lo hacen mejor en los medios enriquecidos. Los medios de cultivo comunes son el agar nutritivo

donde crece Staphylococcus  Staphylococcus   sp.,

como se muestra en las figuras 13 y 14, donde se observa un crecimiento de microorganismos; lo mismo sucede en el medio de caldo nutritivo como se muestra en la figura 1, donde se observa turbidez (cambio de color) después después de aproximadamente 24 horas, siendo esto indicador de que se han crecido microorganismos.

En la figura 16 se muestra el crecimiento de Staphylococcus sp en el medio de cultivo de agar Mac Conkey, pero según Konemman et al . (2006) este medio de siembra es diferencial,

solo

para

seleccionar

y

recuperar

Enterobacteriaceae  Enterobacteriaceae  y

bacilos

gramnegativos entéricos relacionados, inhibiendo a las gram-negativas como lo es Staphylococcus  Staphylococcus  sp; por lo tanto en el experimento

ocurrió un error, tal vez en la

preparación del medio o al momento de sembrar las bacterias.

Según Pahissa

(2009),

el medio selectivo

más empleado para identificar

Staphylococcus  Staphylococcus  sp es el agar sal manitol (medio Chapman), que por su elevado contenido en sal inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias gramnegativas. Sin embargo como se muestra en la figura 17, en la experimentación no crecieron colonias de Staphylococcus  Staphylococcus   sp, este error pudo deberse a una mala preparación del medio de cultivo.

Para aislar un microorganismo de la naturaleza, se debe conocer previamente los requerimientos

nutricionales

y

las

condiciones

ambientales

óptimas

para

su

crecimiento, en la figura 18 se muestra que en la primera asada se obtuvieron una gran cantidad de colonias, pero en la segunda asada se obtuvo una cantida menor a 300 y mayor a 30 , siendo esta contabilizada (92 colonias) como se muestra en la figura 19, estas crecieron en el centro de la placa petri.

VI.

CONCLUSIONES



Se logró observar el crecimiento de las las bacterias bacterias S taphylococcus sp taphylococcus sp en medios de cultivo cultivo como agar agar nutritivo inclinado, inclinado, agar nutritivo nutritivo vertical y caldo nutritivo.

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

Se logró separar colonias

con la técnica de estrías, aunque este

experimento presento un error ya que las bacterias Staphylococcus S taphylococcus no debían crecer en el medio con agar MacConkey pero si en el agar manitol.



Se logró observar colonias individuales

con dos asadas a partir del

inóculo de una mezcla de bacterias.

VII.

CUESTIONARIO Ejercicio 1:  Técnicas de cultivo de Microorganismos: Características de crecimiento en medio de cultivo.

1. ¿Por qué algunos microorganismos desarrollan en caldo un característico crecimiento tipo película? ¿Qué factores ambientales podrían alterar la formación de una película superficial? El crecimiento tipo película es la acumulación de los microorganismos que se están cultivando en la superficie del medio de cultivo, en este caso del caldo nutritivo. Los microorganismos se acumulan allí por tener respiración tipo aerobia. Al ser el oxígeno poco soluble en agua no penetra en la totalidad del tubo, y se concentra en la superficie del medio donde se agrupan los microorganismos, formando la película. La

concentración

del

oxígeno

ambiental

que

disiparía

la

acumulación

de

microorganismos en la superficie del medio o factores como el aumento de temperatura pueden también causar la muerte del microorganismo.

2. Cuando utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las características de crecimiento es preferible inocular con aguja de kölle köll e y no con asa. ¿Por qué?

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La aguja de Kölle, a diferencia del asa, facilita el sembrado del inóculo en el agar debido a que es necesario hacer la estría sobre éste, la cual debe realizase desde la base hasta el borde del medio, asegurando de este modo el crecimiento de los microorganismos. Además la cantidad de inóculo debe ser moderada y el asa tiende a recoger muestras abundantes.

3. Cuando se utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las características de crecimiento es preferible inocular con aguja de kölle y no con asa ¿Por qué? ¿Qué factores de influirán en la abundancia del crecimiento en caldo, agar inclinado y agar vertical? El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

a) Disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles.  Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona. Consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

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Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.  Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

b) Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

c) Condiciones adecuadas de humedad Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

d) Luz ambiental La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

e) pH La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

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f) Temperatura Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertermófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprófitos tienen rangos más amplios.

g) Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

Ejercicio 2: Técnica de cultivo de Microorganismos: Aislamiento y recuento en placas

1. ¿Qué procedimiento procedimiento seguiría a continuación continuación del desarrollo en estos ejercicios para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? ¿Cómo podríamos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las colonias aisladas? Luego de tener las colonias aisladas, éstas deben transferirse con el filamento a un tubo que contenga agar nutritivo estéril para cultivar esa colonia aislada; este procedimiento se conoce como trasplante. Para garantizar la pureza del cultivo obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo de colonia aislada, repetir el proceso de aislamiento antes descrito. Se considerará que se ha obtenido un cultivo puro, cuando al realizar este proceso, todas las colonias obtenidas presenten las mismas características. El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento dependerá, entre otros factores, de los requerimientos nutricionales de los microorganismos que se espera aislar y de la presencia de microorganismos que, por sus características y/o por la cantidad en que se encuentren en la muestra, dificulten la obtención del microorganismo objeto del aislamiento. En este último caso, se deben utilizar medios de enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de gérmenes contaminantes.

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La temperatura y otras condiciones de incubación, variarán según los microorganismos, usualmente la temperatura óptima de los microorganismos patógenos para el hombre oscila entre 30 y 40ºC. Cuando el microorganismo que se intenta aislar es anaeróbico, deben tomarse las precauciones necesarias a fin de eliminar la presencia de oxígeno en el ambiente donde se desarrollará el mismo. Basándose en el origen y naturaleza de la muestra se pueden inferir los posibles microorganismos que se encuentran presentes en la misma, y ese conocimiento ayudará en la selección del medio y las condiciones de cultivo adecuadas. Para iguales fines, es de gran utilidad el conocimiento de la procedencia de la muestra analizada.

2. ¿Qué factores limitan el tamaño de las colonias en una placa de cultivo? Existen diversos factores que limitan el tamaño de las colonias en un placa de cultivo; una de ellas es el pH, dependiendo del rango de pH del medio; el contenido de agua, influenciar en la forma y tamaño de la colonia; el potencial de óxido reducción; el contenido nutricional presente en el medio cultivo; los constituyentes antimicrobiales y las estructuras bilógicas.

3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el número total de colonias por gramo. Plantee una metodología cuantitativa basada en diluciones sucesivas para resolver el problema. El método de recuento en placa consiste en sembrar por duplicado 1 ml de la muestra liquida o 1ml de la dilución madre en placas Petri estériles. Se repite esta operación en cada una de las diluciones decimales preparados. Verter 15 ml de agar VRBL a 45ºC, mezclar y dejar solidificar, preparar de la misma manera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio, cubrirla con 4ml del mismo medio a 45ºC. Dejar solidificar e incubar a 30ºC durante 24 a 48 horas. Se contabiliza las colonias de diámetro mayor o igual a 0.5mm en las placas que contengan 150 colonias características o de 30 a 300 colonias. Por medio de la densidad se podrá hallar el número de colonias por gramo.

4. ¿En qué consiste la técnica del número más probable y qué usos tiene? La estimación por el método del Número Más Probable (NMP) es muy adecuado para determinar bacterias anaerobias, porque permite mantener un ambiente anaerobio dentro de los tubos, sin necesitar de sistemas anaerobios más complejos como cámaras o jarras anaerobias.

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El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados. El método consiste en la estimación del número de microorganismos viables a partir de diluciones sucesivas (1/10) partiendo de 1 g de suelo o sedimento en base húmeda o 1 ml de agua; posteriormente, de tres o más de las diluciones se inoculan tubos con medio de cultivo con sustratos y aceptores de electrones específicos. En este método se asume que en las series de diluciones los microorganismos se encuentran distribuidos al azar y que al menos un microorganismo generará crecimiento, produciendo una respuesta positiva (turbidez, cambio de color, producción de algún metabolito específico). Esta técnica se basa en la estimación de la densidad bacteriana por el método estadístico de máxima probabilidad, utilizando la teoría de diluciones. Para realizar la estimación microbiana se utiliza un mínimo de tres diluciones y un

intervalo de 3 a 10 réplicas (“n” tubos de medio para crecimiento) por dilución; el número de diluciones y réplicas utilizadas estará en función de la precisión requerida.  Actualmente, existen tablas estándar como las publicadas por la FDA o NACE para estimar el número de microorganismos más probable. Estas tablas están limitadas a tres diluciones y a 3, 5 y 10 réplicas por dilución; sin embargo, también existen

programas de computadora (MPN CalculatorTM, “Chem SW”) para obtener la estimación microbiana empleando más de tres diluciones y un número mayor de réplicas.

5. ¿De qué manera se pueden preservar cepas puras por largos períodos? Existen varios métodos para la conservación de los microorganismos-, todos buscan que las células sufran el daño mínimo y se preserven por el máximo periodo posible. Los cuatro procedimientos generales son:

La siembra o el subcultivo:  Este método consiste en sembrar el microorganismo en determinado medio de cultivo y, luego, conservarlo en refrigeración. El procedimiento se debe repetir cada cierto tiempo. Se lleva a cabo en tubos de ensayo con agar inclinado, o en botellas especiales que contienen un medio de cultivo sólido y estéril. Una de las desventajas del método es que los tubos guardados en refrigeración se deshidratan y, entonces el microorganismo muere, por esta razón, es necesario repetir el procedimiento periódicamente.

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Una variación del método consiste en adicionar aceite mineral estéril al tubo o a la botella con el microorganismo en crecimiento, de tal forma que cubra al agar hasta una altura de un centímetro y medio, para reducir el metabolismo del microorganismo y la deshidratación del medio de cultivo.

La desecación:  El método consiste en remover el agua celular e impedir la rehidratación de las células de los microorganismos. Para llevarlo a cabo se inocula una muestra de cultivo en tierra húmeda estéril (material de soporte), se separa hasta que haya crecimiento (vatios días) y, luego se seca con aire a vacío. Después, el cultivo se guarda en una atmósfera seca o en refrigeración. Otros materiales de soporte pueden ser sílica gel, discos de gelatina y tiras de papel. Entre las ventajas del método se puede mencionar que no necesita equipo especial ni mucho personal para ejecutarlo y, si no sufre daños durante la desecación, el cultivo puede continuar viable por muchos años.

La congelación: La congelación es, al igual que la liofilización, uno de los métodos de mantenimiento más utilizados, porque se logran los periodos de conservación más largos (superiores a veinte años, cuando se utiliza nitrógeno líquido). En el proceso de congelación lo más importante es controlar la velocidad de disminución de la temperatura, porque, si es muy lenta, los cristales que se forman a partir del líquido contenido en las células serán muy grandes y pueden romper la membrana celular. El proceso de congelación se puede clasificar, con base en la temperatura en la que se lleva a cabo, en: Congelación ordinaria: Se mantienen temperaturas de -5 a -20°C. Congelación ultrafría: Se efectúa en congeladores mecánicos entre -50 y -80°C. Congelación con nitrógeno líquido: Se logran temperaturas de -150 a -196°C.

La liofilización: Es la remoción de agua de las células congeladas (sólidas) a presión reducida (sublimación). Para llevar a cabo este procedimiento, se toma una muestra de cultivo por conservar y se suspende en algún medio con crioprotectores, como leche, suero o glutamato de sodio. Se transfieren unas gotas de la muestra a una ampolla, se congela y se somete a alto vacío hasta que el agua celular se sublima (pasa de estado sólido al gaseoso). Una vez liofilizada la cepa, la ampolla que la contiene se sella para impedir que el microorganismo se altere por el contacto con el medio ambiente.

6. ¿Qué técnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaeróbicos?

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El aislamiento de bacterias anaeróbicas por método de siembra en placa plantea problemas especiales. Siempre que los organismos en cuestión no mueran rápidamente al ser expuestos al oxígeno, las placas pueden preparase de la manera usual y luego incubarse en recipientes, de los cuales se elimina el oxígeno bien sea por absorción química o por evacuación. Para los anaeróbicos más sensibles al oxígeno, es preferible una modificación del método de siembra por vertido, denominado cultivo por dilución y agitación. Un tubo con agar fundido y enfriado se inocula y se mezcla, aproximadamente la décima parte de su contenido se transfiere a un segundo tubo el cual se mezcla a su vez y se utiliza para inocular un tercer tubo de la misma manera. Después de haber preparado de 6 a 10 disoluciones sucesivas, los tubos se enfrían rápidamente y se encierran herméticamente una forma es verter un capa de vaselina y parafina, con el fin de evitar el acceso del aire a la columna de agar. En esto cultivos, las colonias se desarrollan en profundidad dentro de la columna de agar, y por lo tanto no son tan fácilmente accesibles. Para hacer una transferencia de colonias se elimina el cierre de vaselina-parafina con una aguja estéril y la columna de agar se extruye del tubo soplando suavemente una corriente de gas libre de oxígeno a través de una pipeta capilar introducida entre la pared del tubo y el agar. La columna extruida se recoge en una placa Petri estéril y se secciona en discos con una cuchilla estéril, a fin de permitir el examen y transferencia de las colonias. Muchas bacterias mueren al ser expuestas aunque sólo sea momentáneamente al aire; por lo tanto, el cultivo con éxito de estos anaerobios estrictos exige medidas extraordinarias

para

excluir,

en

todo

momento,

incluso

trazas

de

oxígeno.

Habitualmente se utilizan dos técnicas principales para el cultivo de bacterias en completa ausencia de oxígeno; son las técnicas de tubo rodante y las de la cámara anaeróbica con guantes. El procedimiento del tubo rodante, desarrollado por R. E. Hungate, se usa para obtener cultivos puros de anaerobios estrictos distribuyendo células en una fina capa de agar depositado en la pared de un tubo de ensayo, en donde se desarrollan como colonias aisladas. El tubo de ensayo contiene unos pocos mililitros de medio con agar fundido que ha sido reducido químicamente para eliminar el oxígeno disuelto; el tubo es cerrado herméticamente con un tampón de goma de butilo. El agar fundido se inocula con diluciones apropiadas de la fuente de baterías, introduciéndolas a través de los tapones de goma con una jeringa estéril. Los tubos se depositan luego tumbados sobre hielo y se los hace rodar hasta que el agar se solidifique formando una capa fina en la pared del tubo. Después de un periodo de incubación, cuando las colonias son ya visibles, se quita el tampón y las colonias aisladas se recogen con una aguja o con un tubo capilar. Siempre que se destapa un tubo, se impide la entrada de aire pasando continuamente una corriente libre de O2 (normalmente CO2 ó N2) al interior del tubo. Para asegurarse de que no ha penetrado algo de aire inadvertidamente, se suele incluir en el medio el

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colorante sensible al redox resazurina, que vira de incoloro a rojo cuando el Eh alcanza un valor de -0.042 V. También pueden aislarse anaerobios estrictos utilizando técnicas convencionales de siembra por estría en placa, si se realizan todos los procedimientos dentro de una cámara anaeróbica, que contiene una atmósfera reductora.

VIII.

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