Tecnica de Conteo de Colonias Bacterianas

 

 

TECNOLÓGICO ESTUDIOS SUPERIORES DEDEECATEPEC DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

MICROBIOLOGÍA PRACTICA No. 5 CUENTA DE COLONIAS POR LAS TÉCNICAS DE VACIADO EN PLACA E INOCULACIÓN EN SUPERFICIE EQUIPO 3:   DELGADO MEZA MARICRUZ

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  NÚÑEZ GARCÍA BENJAMÍN ARMANDO

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RAMOS GONZÁLEZ MARÍA DEL ROCÍO

  RODRÍGUEZ PINEDA MARÍA ALEJANDRA

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  YÁÑEZ VARELA JUAN ANTONIO

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PROFESORA: YANIN GABRIELA SANDOVAL GÓMEZ

GRUPO: 3551

 

Laboratorio de microbiología  –  Práctica  Práctica No. 5 Cuenta de colonias por las técnicas de vaciado en placa

PRÁCTICA No. 5 Cuenta de colonias por las técnicas de vaciado en placa e inoculación. OBJETIVO: OBJETIVO: El alumno aislará bacterias aerobias por las técnicas de vaciado en placa e inoculación en superficie. MARCO TEÓRICO: El crecimiento de las poblaciones microbianas puede medirse de diferentes maneras. Alguno métodos determinan el número de células y otros la masa total de la población, que a menudo es directamente proporcional al número de células. La magnitud de la población normalmente se registra como el número de células que hay en un mililitro de líquido o en un gramo de material sólido. Como las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayoría de los métodos de cuantificación se basan en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas; después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total. Supongamos, por ejemplo, que una millonésima parte de un mililitro (10-6 mL) de leche agria contiene 70 células bacterianas. Entonces debe haber 70 veces 1 millón de células, o sea 70 millones de células por mililitro. mili litro. Sin embargo, este método resulta poco práctico para medir una millonésima parte de un mililitro de líquido o de un gramo de alimento. Por consiguiente, el procedimiento se efectúa indirectamente en una serie de diluciones. Por ejemplo, si añadimos 99 mililitros de agua, cada mililitro de esta dilución tendrá una centésima parte de las bacterias que tenía cada mililitro de la muestra inicial. Si mediante una serie de diluciones de este tipo se puede estimar con facilidad el número de bacterias en la muestra original. Para encontrar las poblaciones microbianas en alimentos sólidos (como en una hamburguesa) se realiza un homogenizado en una licuadora de alimentos con una parte de alimento y nueve partes de agua. Después pueden tomarse muestras de esta preparación diluida al 10% y realizar más diluciones o efectuar recuentos celulares. Recuentos en placa

El método utilizado con más frecuencia para la medición de poblaciones bacterianas es el recuento en placa. Una ventaja importante de esta técnica es que mide el número de células viables. Una desventaja es que se requiere bastante tiempo, por lo general 24 horas o más. Para que se formen colonias visibles. Esto puede plantear un grave problema -1-

 

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en algunas aplicaciones, como por ejemplo el control de calidad de la leche, cuando no es posible mantener un lote determinado tanto tiempo. El recuento en placa se basa en la suposición de que cada bacteria crece y se divide para producir una sola colonia. Esto no siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia crecen unidas en cadenas o como grumos. Por consiguiente, a menudo una colonia no se produce como resultado de una única bacteria sino de segmentos cortos de una cadena o de un agregado bacteriano. Para reflejar esta realidad los recuentos en placa suelen informarse como unidades formadoras de colonias (UFC).  (UFC).  Cuando se realiza el recuento en placa es importante que crezca sólo un número limitado de colonias en la placa. Cuando hay demasiadas colonias algunas células se encuentran apiñadas y ni pueden desarrollarse; esta situación es causa de inexactitudes en el recuento. La convención de la  Food and Drug Administration  de los Estados Unidos ha señalado que se cuenten solo las placas con 25 a 250 colonias, si bien muchos microbiólogos prefieren placas con 30 a 300 colonias. Para asegurar que algunos recuentos estén dentro de estos límites el inóculo original se diluye varias veces en un proceso denominado dilución seriada. seriada. Fuentes de error en el recuento en placa

El número de colonias que se obtiene en una determinación de viables no sólo depende del tamaño del inóculo si no también de lo adecuado que sea el medio de cultivo y de las condiciones de incubación, así como la duración de la incubación. Las células depositadas en la placa no se desarrollarán todas en colonias a la misma velocidad y se se emplea un corto tiempo de incubación, se obtendrán menos colonias de las posibles. Además, el tamaño de las colonias varía y si se desarrollan colonias muy pequeñas pueden pasar desapercibidas en el recuento. Es habitual establecer las condiciones de incubación (medio, temperatura y tiempo) que permitan obtener el mayor número de colonias para un determinado organismo y usar luego estas mismas condiciones. La determinación de viables puede estar sujeta a grandes errores y, si se desean recuentos precisos, han de hacerse con cuidado y hacer las placas de las diluciones por duplicado. Hay que advertir que una agrupación de dos o más células sólo producirá una colonia, de modo que el recuento de viables será erróneamente menor. El recuento se expresa a menudo como unidades formadoras de colonias obtenidas, más que como número de células viables (ya que una unidad formadora de colonias pudo originarse a partir de una o más células iniciales). -2-

 

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Pese a estas dificultades, el recuento de viables suministra una buena información sobre el número de células viables y este procedimiento se usa ampliamente. En la alimentación, industria láctea, medicina y microbiología acuática, el recuento de viables vi ables se emplea rutinariamente. El método tiene la ventaja de una elevada sensibilidad: se pueden contar muestras con pocas células, lo que permite una detección muy sensible de la contaminación microbiana de productos o materiales. Además, el uso de medios selectivos y de ciertas condiciones de cultivo permite contar mediante la determinación de viables, tipos celulares particulares en una población mixta de microorganismos. La gran anomalía del recuento en placa

Aunque es una técnica muy sensible, el recuento en placa puede ser irrealizable cuando se trata del recuento de muestras naturales suele dar un número mucho mayor de organismos que los que se obtiene en cultivo en placas de cualquier tupo de medio. Algunos microbiólogos se refieren a este hecho como “la gran anomalía del recuento en placa”. ¿Por qué los recuentos directos al microscopio? Esto se debe a una combinación

de factores, como el hecho de que los métodos microscópicos cuentan células muertas, mientras que los métodos de viables no; y al hecho de que diferentes organismos, incluso en una muestra muy pequeña, pueden tener requerimientos nutricionales y de cultivo muy diversos. Por tanto, aunque los recuentos en placa específicos con medios altamente selectivos, como en el análisis microbiano de aguas residuales o de alimentos, puede dar resultados fiables, “los recuentos del número total de células” de los mismos habitad

pueden ser, y habitualmente son, subestimados en varios órdenes de magnitud. El género Lactobacillus. Caracteres morfológicos: 

En género Lactobacillus  (lactis-leche; bacillus  –  pequeños bacilos), se caracteriza por presentar células en forma de bacilos largos y extendidos, aunque con frecuencia pueden observarse bacilos cortos o coco-bacilos coryneformes; lo cual hace que se puedan confundir con género aislados habitualmente de materiales clínicos. Estos bacilos se presentan comúnmente formando cadenas y en general son no mótiles. Son Gram positivos y sólo las células muertas pueden dar resultados variables a la tinción de Gram. Además, no esporulan y algunas cepas presentan cuerpos bipolares que probablemente contentan polifosfato.

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Caracteres culturales y de las colonias:

Las colonias de Lactobacillus en medios sólidos son pequeñas (2-5 mm), convexas, suaves, con márgenes enteros, opacas y sin pigmentos. Sólo en algunos casos se presenta coloración amarillenta o rojiza. Algunas especies forman colonias rugosas; generalmente no presentan actividad proteolítica ni lipolítica que pueda apreciarse mediante halos claros formados en medios sólidos que contengan proteínas o grasas. Normalmente no reducen los nitratos, pero esta reacción puede ocurrir en algunos casos cuando el pH está por encimo de 6.0. Los lactobacilos no licúan la gelatina ni digieren la caseína. Tampoco producen indol ni ácido sulfhídrico (H 2S). La producción de pigmentos es rara y cuando ocurre, éstos pueden ser de color amarillo o naranja hacia un tono ferroso o rojizo. Los lactobacilos  no desarrollan olores típicos al crecer en medios comunes, pero contribuyen a modificar el sabor de alimentos fermentados, produciendo compuestos volátiles como diacetilo y sus derivados y hasta H2S y aminas en el queso. Especies de Lactobacillus. Lactobacillus.

Se divide el género Lactobacillus  en 44 especies, que se ubican en tres grupos. Además algunas de estas especies se subdividen en varias subespecies; tales son los casos de:  (con tres subespece¿ies: bulgaricus, lactis, delbrueckii). Lactobacillus delbrueckii  (con Lactobacillus salivarius (con dos subespecies: salivarius y salicinus). Lactobacillus casei (con cuatro subespecies: casei, pseudoplatarum, rhamnosus y

tolerans). Lactobacillus coryniformis (con dos subespecies: coryniformis y torquens). Nutrición y condiciones de crecimiento.

Los lactobacilos  presentan particularidades para cada especia respecto a los requerimientos nutricionales complejos para los aminoácidos, péptidos, derivados de ácidos nucléicos, vitaminas, sales, ácidos grasos o ésteres de ácidos grasos y carbohidratos fermentables. -4-

 

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Requieren no sólo carbohidratos como fuentes de carbono y energía, sino también: aminoácidos, vitaminas y nucleótidos. Generalmente estos requerimientos variados suelen suplirse cuando el medio de cultivo de los lactobacilos contiene carbohidratos fermentables, peptona, extracto de carne y extracto de levadura, aunque una suplementación con jugo de tomate, manganeso, acetato y ésteres del ácido oleico, especialmente Tween 80, resulta estimuladora y hasta esencial para muchas especies. Por eso, estos compuestos se incluyen en el medio MRS. METODOLOGÍA: Preparación Prepara ción del material:  

Preparar agua peptonada suficiente para siete tubos (16/150 con tapón de rosca) que contendrán 9 ml cada uno, y 90 ml para un frasco con tapa de rosca azul.

 

Preparar 300 ml de medio MRS para posteriormente vaciar en siete placas de Petri.

**Medio MRS: Para aislamiento, cultivo y enumeración de Lactobacilos y otras bacterias acido lácticas de alimentos y otros materiales. Método de la secuencia de diluciones:

1. 1.   Homogenizar la muestra agitándola vigorosamente. 2. 2.   Transferir 10 ml de muestra a un frasco con 90 ml de agua peptonada. Agitar para homogenizar. 3. 3.   Transferir a un tubo con 9 ml de agua peptonada, 1 ml de la solución hecha de la -1

muestra para así lograr una disolución 10 . 4. 4.   De la disolución 10-1  tomar 1 ml y llevar a un segundo tubo con 9 ml de agua peptonada y así lograr una disolución de 10 -2. 5. 5.   Realizar sucesivamente los mismos pasos como se muestra en le figura hasta lograr una disolución de 10-7.

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Técnica de vaciado en placa (Método A):

1. 1.   En condiciones asépticas, tomar 1 ml de la disolución 10-1 y vaciar sobre una caja Petri (sin agar). 2. 2.   Verter 15 ml de agar fundido y girar suavemente para mezclar. [Fig. (a)]  3. 3.   Repetir el mismo procedimiento con cada una de las siete diluciones hechas e incubar durante 2 a 5 días a 30 ºC. Técnica de expansión en placa (Método B):

1. 1.   En condiciones asépticas, verter el agar en la caja Petri y esperar a que solidifique. 2. 2.   Tomar 0.1 ml de la disolución 10-1 e inocular sobre el agar. 3. 3.   Introducir en alcohol una varilla de vidrio y flamearla, dejarla enfriar en un extremo de la caja. 4. 4.   Extender el inoculo en toda la superficie de la placa pasando la vvarilla arilla repetidas veces. Flamear la varilla para cada disolución. [Figura (b)] 

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5. 5.   Repetir el mismo procedimiento con cada una de las siete diluciones hechas e incubar durante 2 a 5 días a 30 ºC.

Conteo de colonias:

1. 1.   Seleccionar solo las cajas que tengan entre 30 y 300 colonias. 2. 2.   Multiplicar la cuenta por la inversa del factor de dilución y el resultado será en UFC/ml.

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RESULTADOS: Técnica de vaciado en placa): Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

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Se debe inocular el MRS agar con el material o muestra original (homogeneizada) utilizando la técnica de vaciado vaciado en placa. La incubación debe ser de 3 días a 35°C o hasta hasta 5 días a 30° (DE MAN, ROGOSA & Sharpe, 1960) para presentar crecimiento de colonias que facilite su conteo (Fig.4). El tiempo de incubación, en esta ocasión, ocasión, fue de 7 días a 30°C por lo que el conteo de colonias no fue posible dado el crecimiento excesivo de éstas (Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3), y así, cada caja que presentaba crecimiento fue etiquetada como “incontable”.  El tiempo de muestreo óptimo debería ser aquel lo suficientemente largo para captar material en cantidad detectable y lo suficientemente corto para evitar la sobrecarg sobrecargaa del soporte de captación, es decir, al dejar incubar las muestras más tiempo del que se debía, el microorganismo continuó con su crecimiento, lo cual provocó que el resultado del conteo de colonias fuese incontable.  La densidad de las colonias crecidas en el medio de cultivo afectó a la fiabilidad del resultado. Demasiadas colonias incontables son difíciles de examinar. Técnica de expansión en placa:

El tiempo de incubación fue demasiado largo para poder obtener un número de colonias que se encuentren en el rango entre 30 y 300, las cuales se consideran como viables para efectuar un cálculo para el número de unidades formadoras de colonias. Por lo tanto se obtuvo un crecimiento en todas las placas por arriba de 300 colonias así que no se tomaron para un cálculo de UFC. Además de que también se encontró en las placas con contaminación por hongos.

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CONCLUSIÓN: El manejo de este tipo de técnicas es de suma importancia por su manejo tan frecuente en diversas áreas que dependen de la microbiología. La experiencia mas valiosa obtenida fue la realización de la técnica, aun que por circunstancias extra no se lograron obtener los resultados deseados.

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CUESTIONARIO:  CUESTIONARIO:  1. 1.   Explicar las ventajas y desventajas de la técnica de vaciado en placa. VENTAJAS

DESVENTAJAS

- Es útil en muestras que se sospechan con un bajo número de UFC por que se utiliza 1 ml.

- Microorganismos sensibles al calor se dañan por el agar fundido. - Las colonias de bacterias crecen debajo de la superficie y no son adecuadas para el conteo.

2. 2.   Explicar las ventajas y desventajas de la técnica por incubación en superficie VENTAJAS

DESVENTAJAS

-Es útil en muestras que se sospechan con un alto número de UFC por que se utiliza 0.1ml.

-Carencia en la uniformidad de la extensión

-Los microorganismos no se dañan por el agar fundido.

  3. Discuta en base al número colonias que encontraron en cada una de las cajas, si estuvo bien desarrollada la de técnica. Por que el tiempo de incubación fue muy largo, el número de colonias obtenidas rebasa el rango que se encuentra entre 30 y 300 para realizar el conteo. Así que ese fue un impedimento para el cálculo de UFC. 4. 4.   Se desea conocer el número de bacterias por gramo de una muestra de pimienta molida, por lo que realiza siguiente serie de diluciones decimales de 10 -1  a 10-8, siembra 0.1 ml en cajas por técnica de inoculación en superficie y obtiene los siguientes resultados.

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DILUCIÓN

CUENTA MICROBIAN MICROBIANA A

10-1 

Incontable

10-2 

Incontable

10-3 

Incontable

10-4 

Incontable

10-5 

325

10-6 

30

10-7 

4

10-8 

Sin crecimiento

10-9 

Sin crecimiento

10-10 

Sin crecimiento

¿Qué dilución utilizará para conocer el número de células por gramo de pimienta y por que? Se utiliza la 10-6 ya que es la única que tiene un número de colonias que cae dentro del rango (30 – 300). ¿Cuál es el número de bacterias por gramo de pimienta? Indique los cálculos a realizar y sus resultados.

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30  10 Número de colonias reportadas en la placa

6



1

 



6

30   10 UFC  UFC   

Inversa de la dilución de la placa

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Se reporta como Unidades Formadoras de Colonias o Celulas/gr de pimienta

 

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BIBLIOGRAFÍA:   Madigan, M.T., Martinko y J. Parker. Brock: Biologia de los microorganismos. Madrid, España: 10º edición. Pearson. Paginas: 145 – 148.

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  ROGOSA, M., a. SHARPE, M.E.: An approach to the classification of the lactobacilli.  – J. Appl. Bact., 22; 329-340 (1959).

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  Luz María Samaniego Fernández; Maryla Sosa del Castillo., Lactobacillus spp.: Importantes promotores de actividad probiótica, antimicrobiana y bioconservadora., Centro de Estudios Biotecnológicos. Facultad de Agronomía. Universidad de Matanzas “Camilo Cienfuegos”. Matanzas, Cuba. 

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