TD Milieu de Culture

Biotechnologies animales et végétales

TD1 : Milieu de culture Composition du milieu de culture Éléments indispensables (milieu de base) ! ! Eau !

Source de carbone = saccharose

- Rôle pour contrer la déficience de la photosynthèse (20 à 30 g/l) - Rôle osmotique, il est indispensable pour la culture d'embryon immature (100 à 120  g/l). Il permet de mettre en évidence la contamination par un pathogène !

Éléments minéraux

- Macroéléments (besoin en grande quantité g/l) Azote : 1 à 3 % de la matière sèche. On le retrouve dans les protéines, les acides nucléiques, hormones... On le donne sous forme de sel KNO3, sous forme d'ammonium NH4+ . On peut mettre des acides aminés aussi qui contiennent de l'azote Potassium : 2 à 4  % de la matière sèche, il intervient dans les échanges osmotiques. Nécessaire à la synthèse des hormones, de la chlorophylle, nécessaire à la division cellulaire Phosphate (phosphore) : 0,1 à 0,5 % de la matière sèche, on en retrouve dans l'ATP et en grande quantité dans les cellules méristèmatiques Souffre : 0,6 à 0,6 % de la matière sèche. Il est absorbé sous forme de sulfate. On en retrouve beaucoup dans la cystéine Calcium : 1 à 2 % de la matière sèche. Il augmente la rigidité des parois (élément de la pectine) et a un rôle dans la perméabilité cellulaire au niveau des membranes Magnésium : 0,1 à 0,7 % de la matière sèche. C’est un activateur enzymatique et un élément central dans la chlorophylle - Microéléments (besoin en petite quantité mg/l) Cobalt : sous forme de CoCl2 (vitamine B12) Molybdène : cofacteur de la nitrate réductase Manganèse : élément de la membrane des chloroplastes Zinc : interviens dans la fabrication de l'auxine Cuivre : rôle de transporteur dans la photosynthèse Borr : dans le mouvement des sucres Le fer est entre les 2 (micro et macroélément) : il n'est pas fourni sous forme de sel, car il précipite. On le fixe à l'EDTA sous forme chélatée, mais il est indispensable pour les milieux de culture !

Vitamines : généralement du groupe B (mg/l) sauf pour l'inositol (B7 en 100 mg/l)

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Éléments facultatifs (que dans certains milieux) ! Hormones végétales (régulateurs de croissance) On utilise en milieu de culture l'auxine et la cytokinine Auxine de synthèse (ANA) cytokinine de synthèse (BAP) La gibbérelline (AG3) pour l’allongement des tiges Acide jasmonique pour le mécanisme de défense des plantes ! Agar L’Agar permet la culture en milieu solide, mais il n'est pas très purifié donc si ça ne marche pas, on utilise la gelrite qui est plus pure, mais beaucoup plus chère !

Acides aminés : glutamine, glycocolle, cystéine

! Mélanges complexes (utilisé pour les cultures délicates) Le lait de coco à 2 % riche en régulateurs de croissance (division cellulaire) L’hydrolysat de caséine (lait) L’extrait de levure (vitamines, mais en plus grande quantité) ! Charbon actif Le charbon à la capacité d'absorber les molécules inactives. Il est utilisé pour la phase d'enracinement en capturant les cytokinines qui empêchent l'enracinement. Il permet de capturer la libération de composés toxiques lors d’un stress (composés phénoliques qui s'oxydent à la lumière et la plante devient marron)

Composition des éléments minéraux 6 macroéléments principaux en quantité idéale pour le développement pour la plante. On part de milieu existant. Milieu très utilisé (Murashige et Skoog mis au point sur le tabac, car c'est une espèce modèle). On peut l’utiliser soit en concentration x1 ou dans d’autres concentrations selon l'espèce végétale considérée. Il est riche en azote et éléments minéraux. Il est préconisé dans la culture d'explants sans méristèmes Culture de fragments nodaux ➠ Murashige et Skoog, mais à une concentration 1/2 Les plantes carnivores ➠ Murashige et Skoog à une concentration 1/4 On peut cultiver avec MS, mais en enlevant un élément toxique pour la plante considérée (MS sans KNO3, mais il faut compensé l'azote perdu) Parfois les milieux ne sont pas comparables, car la forme des éléments qui sont fournis est différente parfois. Il faut alors comparer en équivalent-gramme d'ion Exercice : comparaison de 2 milieux de culture (Murashige et Skoog et Heller) en fonction de leur contenue en ion NO3-

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Si dans le milieu Murashige et Skoog, on enlève NO3 parce qu’il est toxique pour une plante, on peut remplacer le K (KNO3) et le NH4 (NH4NO3) par du KCl et du NH4Cl par exemple, car le Cl est un ion d’accompagnement et n’est pas toxique Les milieux de culture ont un pH (5,5 - 5,6), mais d'autres plantes poussent sur d'autres pH comme les plantes carnivores (4,5) ou les fougères (5,2). Pour ajuster ce pH, on utilise des solutions acidifiantes (HCl) ou alcalinisantes (KOH). Les solutions sont données en «normalité»

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Exercice :

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