TD Les Applications de La Fusion de Protoplaste

Biotechnologies animales et végétales

TD2 : Les applications de la fusion de protoplastes Sommaire

I. Un exemple d'exploitation des ressources génétiques par l'hybridation somatique (cas des agrumes)! 2 I.1. Ressources génétiques!

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I.2. Méthodologie!

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I.2.a. Obtenir un système de régénération à partir de protoplastes efficaces!

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I.2.b. La méthode de fusion (fusion électrique)!

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I.2.c. Sélection des produits de fusion!

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I.3. Résultats!

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I.3.a. Elargir le pool génétique!

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I.3.b. Créer de nouveaux porte-greffes!

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I.3.c. Créer des cultivars triploïdes!

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II - Introduction de caractères provenant d'espèces sauvages (cas de la pomme de terre)! 10 III. Gérer les génomes cytoplasmiques!

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III.1. Génome chroloroplastique du colza!

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III.2. Le génome mitochondrial de la tomate!

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3 applications majeures : Élargir les ressources génétiques au sein de pools génétiques d'espèces L'hybridation somatique (fusion symétrique) 2n + 2n ➠ 4n (cas des agrumes)

Introgresser des gènes provenant d'espèces sauvages à des espèces cultivées Fusion asymétrique : spontanée ou induite (cas de la pomme de terre)

Gérer les génomes cytoplasmiques : Chloroplastes : - Résistance à des herbicides - Élimination des déficiences chlorophyllienne (cas du colza) Mitochondries ➠ stérilité mâles cytoplasmiques (cas de la tomate)

I. Un exemple d'exploitation des ressources génétiques par l'hybridation somatique (cas des agrumes)

Figure 1 : Différentes associations nucléo-cytoplasmiques générales par hybridation somatique

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I.1. Ressources génétiques

Pool primaire, 3 genres : Citrus ➠ espèces consommés Fortunella ➠ quelques cultivars (comme le kumquat) Poncirus trifoliata ➠ porte-greffe (il apporte des résistances)

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Ces 3 genres sont théoriquement sexuellement compatible et du coup, on retrouve une plus grande variabilité génétique dans les : " " " "

Caractères pomologiques (caractères liés à la morphologie du fruit) : - Couleur - Forme - Taille - Albedo

Figure 2 : Diversité des fruits au sein du genre Citrus "

Caractères organoleptiques : - Gout (acidité, amertume, sucré, arômes, huiles essentielles...) Caractères agronomiques :

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Période de production des fruits ☞ Le mandarinier saltuma produit en septembre !

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☞ Oranger Valencia Late produit en juillet aout

Résistance : ☞ Contraintes biotiques

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➥ Maladie due aux champignons ➥ Bactérie (chancre citrique) ➥ Virus (tristéga) ➥ Nématodes ☞ Contraintes abiotiques

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➥ Résistance à la sécheresse ➥ Résistance au sel (mandarinier Cléopâtre) ➥ Résistance au froid (kumquat) ➥ Résistance au calcaire (citrus macrophylla)

Facteur limitant à la reproduction sexuée : 3 sur 12

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Polyembryonie

Ces embryons ne sont pas issus de la fécondation, mais ils sont issus du développement des cellules du nucelle (2n ➠ cellules somatiques) et donc les plantes sont identiques à la plante mère. Ce phénomène ne s’applique pas aux cédratiers, quelques mandariniers et pamplemousses

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Stérilités mâles et femelles

Fabriquées par l'Homme et empêche maintenant de faire des croisements

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L'hétérozygotie élevée

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La longueur de la phase juvénile

Il faut beaucoup de temps avant de faire des croisements (6 ans parfois pour obtenir la première fleur)

Pool secondaire : plantes toujours sexuellement compatible avec celles du pool primaire, mais on obtient des hybrides stériles. Eremocitrus et macrocitrus ont une très forte résistance au sel Pool tertiaire : sexuellement incompatible avec celle du pool primaire On a alors entrepris de faire de l’hybridation somatique afin de contourner la non-compatibilité des pools entre eux

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I.2. Méthodologie

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I.2.a. Obtenir un système de régénération à partir de protoplastes efficaces

Figure 3 : Induction et gestion des cals embryogènes d’agrumes Il faut partir de matériel très jeune (embryons ou ovules) qui donne des cals embryogènes lorsqu’ils sont dans un milieu + saccharose. Ces cals lorsqu’ils seront dans un milieu avec du galactose, se transformeront en embryon somatique et donneront des plantules 4 sur 12

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I.2.b. La méthode de fusion (fusion électrique)

Figure 4. Électrofusion de protoplastes et régénération d'embryons. a : Mélange de protoplastes de cals de mandarinier « Commun » (A1) et de protoplastes de feuille de kumquat « Marumi » (A2). b : Alignement des protoplastes dans le champ électrique. c : Population de protoplastes après émission de pulses électriques (C1 : hétérofusions ; C2 : homofusions ; C3 : protoplastes parentaux). d : Régénération d'embryons à partir de protoplastes électrofusionnés Les cals embryogènes ➠ protoplastes A Feuilles ➠ protoplastes B On obtiendra des protoplastes AB ➠ hétérocaryons et des protoplastes AA et BB ➠ homocaryons !

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I.2.c. Sélection des produits de fusion

Ils ont commencé à faire une double sélection, mais la mort des protoplastes AA et BB libérés des composés toxiques pour les protoplastes AB Ils ont donc fait une sélection tardive sur les plantes régénérées :

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On peut utiliser la cytométrie de flux les plantes AB auront double quantité d'ADN comme les hétérofusion et homofusion, mais on ne peut pas distinguer les plantes AA ou BB des AB

Figure 5. Analyse par cytométrie en flux (le citronnier « Lisbonne » est utilisé comme témoin interne diploïde) du niveau de ploïdie d'hybrides régénérés à partir de fusions de protoplastes haploïdes de clémentinier et diploïdes de mandarinier « Kinnow ». a  : hybride somatique triploïde. b : hybride somatique tétraploïde

Pour les distinguer les plantes AA, BB et AB : " - Caractères morphologiques " - Marqueurs moléculaires " - Marqueurs biochimiques (isoenzymes) ce que les chercheurs de Grenoble ont utilisé

Figure 6. Analyse par électrophorèse enzymatique (phosphoglucomutase) de l'origine nucléaire de plants régénérés après fusions de protoplastes de pomelo « Star Ruby » et de limettier « Mexicain ». P : pomelo « Star Ruby » ; L : limettier « Mexicain » ; SP : plantes régénérées après fusion de protoplastes

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On amplifie par PCR une petite séquence spécifique du génome mitochondrial et ensuite, on la clive avec une enzyme de restriction. Si il y a du polymorphisme au niveau du site de restriction et bien on aura ou non une coupure du fragment PCR

Figure 7. Analyse par CAPS (amorce : trnT3/trnD2 (44) et enzyme de restriction DraI) de la ségrégation des chloroplastes parentaux chez des hybrides somatiques entre le pomelo « Star Ruby » et le mandarinier « Commun ». 1 : marqueur de taille, 2 à 11 : hybrides somatiques, 12 : mandarinier « Commun », 13 : pomelo « Star Ruby » Ils ont réalisé une analyse par caps sur une séquence intergénique du génome chloroplastique. C’est une séquence qui est situé entre le gène TRNt et le gène TRNd (TRN correspond à des gènes qui codent pour des ARN de transfert). Ils ont amplifié la séquence qui est entre les 2 parce qu’ils savaient qu’il y avait du polymorphisme au niveau d’un site de restriction (marqueur déjà mis au point avant). Ensuite il ont fait agire l’enzyme de restriction DRA1 et chez les mandarinier sa oupe le fragment au niveau du site de restriction et chez le pamplemousse il n’y a pas de site de restriction donc sa coupe pas le fragment donc on a 2 fragments pour le mandarinier et qu’un seul fragment pour le pamplemousse et lorsqu’on analyse nos hybrides somatiques, on peut voir si notre chloroplate vient d’un parent ou de l’autre parent car comme il n’y a pas de recombinaison du génome chloroplastique, si on a un seul marqueur, cela nous permet de dire s’il s’agit du chloroplaste de l’un ou de l’autre parent, ce qui n’est pas le cas avec les mitochondrie car comme les mitochondrie recombine, si on utilise qu’un seul marqueur cela ne veut pas dire qu’il y a quand même eu des recombinaisons. Donc le fait d’avoir 2 fragments chez un hybride veut dire que l’on a obligatoirement le génome chloroplastique du mandarinier commun. Et donc en fonction des hybrides, on a pas forcement le même génome chloroplastique (chez certains c’est le mandarinier et chez d’autres ça sera le pamplemousse)

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I.3. Résultats

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I.3.a. Elargir le pool génétique

Fusion d'espèces polyembryonnaires :

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Alloplaste : Le noyau d'une cellule et le cytoplasme d'une autre cellule 2n + 2n ➠ 4n restauration de la fertilité 4n + 2n ➠ 3n triploïdes ➠ stériles donc variétés sans pépins

Fusion entre plantes des différentes génétiques :

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C'est un échec et sa montre la limite de la fusion de protoplaste, il faut rester dans la même espèce. Pour y arriver, il faudrait faire de la fusion asymétrique !

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I.3.b. Créer de nouveaux porte-greffes

Les chercheurs de Grenoble ont choisi de croiser le Citrus reticulata très résistant aux sols calcaires avec le Poncirus trifoliata !

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I.3.c. Créer des cultivars triploïdes

2n + n (technique d'haplodisation, mais cela ne marche que sur le clémentinier)

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II - Introduction de caractères provenant d'espèces sauvages (cas de la pomme de terre) Pomme de terre ➠ Solanum tuberosum (4n) de la famille des solanacées 2n = 4x = 48 Elle est très sensible aux nombreuses maladies. Tandis que les espèces sauvages sont très résistantes aux maladies comme Solanum brevidens, elle résiste à l'erwinia (soft rot) et à 3 virus (PLRV, PVY, PVY). Mais elle est 2n = 24 Donc pour faire de la fusion de protoplastes, ils doivent réduire le lot de 48 à 24 de la pomme de terre (dihaploïde) Fusion S.t + S.b donne des hybrides stériles, ils ne sont donc pas intéressants. On a essayé la fusion asymétrique. Pour se faire, il irradie le noyau de S.b pour éliminer des chromosomes. De 2 à 17 chromosomes ont été conservés et c'est intéressant si l’on garde les chromosomes avec les bons gènes

III. Gérer les génomes cytoplasmiques !

III.1. Génome chroloroplastique du colza

On a utilisé la fusion de protoplaste pour transférer un gène de résistance afin d'éliminer la déficience chlorophyllienne Tout a commencé avec un colza qui au départ n’est pas mâle stérile. Il croise le colza + radis afin d’obtenir des colzas mâles stériles. Ils ont réussi, mais la plante obtenue pousse très mal parce que les chloroplastes du radis ont été aussi transférés 10 sur 12

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Ils ont donc fait de la fusion de protoplastes en sélectionnant que les croisements qui possédé les bons chloroplastes

Ils ont voulu introduire en plus un gène de résistance à l'atragine pour le colza. Ils ont donc croisé le colza mâle stérile avec la navette (qui possède le gène de résistance à l'atrasine) et comme ces 2 plantes sont très proches, il n'y a pas d'incompatibilité des chloroplastes

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III.2. Le génome mitochondrial de la tomate

Tomate ➠ licopersicon exculentum de la famille des solanacées. Elle dispose de 24 chromosomes comme chez la pomme de terre Ils ont fait des fusions de pomme de terre avec des tomates qui donnent des hybrides somatiques, c'est la pomate Ils utilisent des rayons gamma sur le noyau de pomme de terre et un inhibiteur métabolique pour inhiber la mitochondrie de la tomate afin que les mitochondries ne se divisent plus

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Dans les 2 cas, on obtient 2 types de protoplastes qui peuvent régénérer des plantes, mais en fusionnant les 2 protoplastes, ils espèrent que le noyau de l'un (tomate) utilise le cytoplasme de l'autre (pomme de terre) Ils ont obtenu 88 cals ➠ 3 plantes : 2 qui sont 2n = 24 1 qui est 4n = 48 (car fusion de 2 protoplastes de tomate avec un protoplaste de pomme de terre)

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