Subiecte Microbiologie an II, Sem i Rezolvate

SUBIECTE MICROBIOLOGIE an II, sem I REZOLVATE 1. Celulele eucariote si procariote – caracteristici comparative PROCARIOTE Dimensiuni: Tipuri de organisme: Tipul nucleului celular ADN

medie: 1-10 microni bacterie, archaea Fără nucleu individualizat.. Circular, in general. Deși nu formează un nucleu, ADN-ul este condensat într-un nucleoid. Procariotele pot transporta elemente ADN extracromosomiale numite plasmide, care sunt de obicei circulare. Plasmidele activează funcții suplimentare, cum ar fi rezistența la antibiotice

ARN-/sinteza proteinelor Ribozomi Structură citoplasmatică Perete celular

cuplat în citoplasmă

Mișcarea celulelor Metabolism Mitocondria Organite citoplasmatice Organizare Diviziunea celulelor

50S+30S (S=constanta de sedimentare) structură simplă

EUCARIOTE medie: 5-20 microni protiste, ciuperci, plante, animale nucleu cu membrană dublă Cromozomi lineari cu proteine histone. ADN-ul eucariotei este organizat într-unul saumai multe molecule liniare, numite cromozomi , care sunt asociate cu proteine histone. Toate ADN-urile cromozomiale sunt stocate în nucleul celulei, separate de citoplasma printr-o membrană. Unele organite eucariote, cum ar fi mitocondriile conțin deasemenea ADN. sinteză de ARN în nucleu sinteză de proteine în citoplasmă 60S+40S structură complexă cu membrane intracitoplasmatice și citoschelet Membrana plasmatică se aseamana cu cea a procariotelor în funcție, cu diferențe minore în configurare. Pereții celulelor pot fi sau nu prezenți.

- serveste ca filtru de protectie - Peretele celular este format din peptidoglican la bacterii, și acționează ca o barieră suplimentară împotriva forțelor exterioare. Acesta previne, de asemenea, celulele de la dezvoltarea exagerată și în cele din urmă de spargerea (citoliza) din cauza presiunii osmotice împotriva unui mediu hipotonic - Deși cele mai multe procariote au un perete celular, există și excepții, cum ar fi Mycoplasma flagel făcut din flagelină flagelară și ciliară făcută de tubulină; anaerob, aerob de obicei aerob nu are de la una până la câteva mii lipsesc RE, ap. Golgi, centrul celular prezente. de obicei celule izolate diviziune binară (diviziune simplă)

Subiecte microbiologie an II sem I

celule izolate, colonii, organisme evoluate multicelulare cu celule specializate Mitoză (pentru celulă somatică) Meioză (pentru foarmarea gameților)

pg. 1

2. Clasificati bacteriile dupa forma si dispunere – exemple DUPA FORMA: a. b. c. d.

rotunde (cocii), alungite (bacili), încurbate (spirili, spirochete, vibrioni) filamentoase (actinomycetele).

Cocii: -

bacterii rotunde (genul Staphylococcus), ovalare (genul Streptococcus), lanceolate (specia Streptococcus pneumoniae), reniforme (genul Neisseria) Ø de 0,8 - 1µ;

Bacilii Sunt bacterii cu formă alungită de bastonas cu dimensiuni între 1,5 - 10µ. La bacili este importantă examinarea extremităţilor, aspectul acestora având rol în identificarea lor. Astfel, bacilii pot prezenta: - capetele rotunjite (familia Enterobacteriaceae), - tăiate drept (Bacillus anthracis - bacilul cărbunos), - măciucate (Corynebacterium diphteriae - bacilul difteric), - în formă de suveică (Fusobacterium); Cocobacilii Sunt bacterii uşor alungite, fiind forme intermediare între coci şi bacili (Yersinia pestis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae); Vibrionii sunt bacterii încurbate în formă de virgulă (Vibrio cholerae); Spirilii sunt bacterii spiralate având 1-2 spire rigide (Spirillum volutans); Spirochetele sunt bacterii spiralate cu corpul flexibil având: - 12-20 de spire (Treponema pallidum), - foarte multe spire strânse (Leptospira) - 2-3 spire (Borrelia): Actinomicetele sunt bacterii foarte asemănătoare fungilor şi formează filamente sau hife lungi şi ramificate care se rup, rezultând forme bacilare (Actinomyces).

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 2

DUPA ASEZARE: COCI: - în grămezi sau asemănător unei ciorchini de struguri ca, de exemplu, germenii din genul Staphylococcus; - în tetrade la genul Micrococcus; - în baloturi de câte 8 coci orientaţi în cele 3 direcţii ale spaţiului la genul Sarcina; - în lanţuri la genul Streptococcus; - în diplo, ca două flăcări de lumânare care se unesc prin bazele lor, la specia Streptococcus pneumoniae; - în diplo, ca două boabe de cafea care se privesc faţă în faţă prin concavităţile lor ca, de pildă, la Neisseria gonorrhoeae (gonococ) şi Neisseria meningitidis (meningococ); - izolaţi, care nu sunt de interes medical. BACILI: - cel mai ades izolaţi şi în poziţii întâmplătoare unul faţă de celălalt ca, de exemplu, majoritatea bacililor gram-negativi; - grupaţi câte doi (diplobacili) sau în lanţuri scurte ca, de exemplu, genul Klebsiella; - dispuşi în lanţuri ca bacilii din genul Bacillus (bacilul cărbunos); - dispuşi în mod caracteristic sub forma unor majuscule sau litere chinezeşti cum sunt bacilii difterici (Corynebacterium diphteriae); - în palisadă, ca scândurile unui gard (bacilii difterimorfi). 3. Enumerati componentele constante si facultative ale celulei bacteriene CONSTANTE 

Nucleul bacterian

Este un nucleoid sau echivalent nuclear, cu o structură primitivă în comparaţie cu nucleul celulelor eucariote şi reprezintă 2% din greutatea uscată a bacteriei. Nucleoidul este format dintr-o moleculă circulară de AND care este în contact direct cu citoplasma. Funcţia nucleului bacterian constă în depozitarea informaţiei genetice necesară autoreplicării, organizării structurale şi funcţionale a celulei bacteriene, deci a caracterelor ce definesc specia. 

Citoplasma

Situată între materialul nuclear şi faţa internă a membranei citoplasmatice, citoplasma este un sistem coloidal alcătuit din 80% apă, în care se găseşte o cantitate mare de molecule organice, ioni anorganici, enzime, ARN, vacuole şi incluzii. . Ribozomii reprezintă sediul sintezelor proteice din celulă. Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolică a celulei bacteriene şi reprezintă un material de rezervă care poate fi folosit ca sursă de energie.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 3

 Membrana citoplasmatică Este o membrană fină (6,5-7nm), elastică, lipsită de rezistenţă mecanică ce mărgineşte la exterior citoplasma bacteriilor şi o separă de peretele celular funcţia de barieră osmotică ce reglează schimburile celulei bacteriene, secretă numeroase enzime hidrolitice, este sediul sintezei acizilor graşi, a fosfolipidelor ETC 

Mezozomii

Sunt structuri membranare care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice sub formă de buzunar sau în deget de mănuşă, prezente la bacteriile gram - pozitive şi ocazional la cele gram – negative.Ei participă la replicarea cromozomului bacterian şi diviziunea celulară, sinteza peretelui celular şi formarea sporului bacterian. 

Peretele celular

înconjoară membrana citoplasmatică, peretele celular este o structură rigidă, specifică bacteriilor. El este format dintr-un strat bazal, asemănător la toate bacteriile şi un strat al structurilor superficiale, NEOBLIGATORII Structuri inconstante: - incluziile – formatiuni structurale inerte care apar in citoplasma la sfarsitul perioadei de crestere activa, pot contine polimeri anorganici, substante anorganice simple, polimeri organici, lipide etc. - Vacuole – formatiuni sferice care contin diferite substante in solutie apoasa, au o membrana lipoproteica numita tonoplast - Capsula – glicocalix, strans legat de celula bacteriana, structura polizaharidica (S pneumonae) sau polipeptidica (Anthracis), vizibila la mo - Flageli – confera mobilitate bacteriilor - Fimbrii – formatiuni scurte cu rol in adeziune - Spori – forma de rezistenta si conservare a speciei

4. Structura peretelui bacterian la bacteriile gram + si gram – Bacteriile gram + -

-

Peptidoglicanul reprezintă 50-90% din greutatea uscată a peretelui celular, are o grosime de 15-30 nm şi conţine până la 200 de lanţuri paralele de mureină. Stratul structurilor speciale este redus şi alcătuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici: acidul ribitoltheicoic şi gliceroltheicoic. Aceştia pot pătrunde până la membrana citoplasmatică legându-se covalent de această - acizii theicoici de membrană sau numai până la perete - acizi theicoici de perete. Ei reprezintă antigenele de supafaţă ale bacteriilor gram-pozitive. Peretele celular este sensibil la acţiunea lizozimului care rupe legăturile dintre acidul Nacetil muramic şi N-acetilglucozamină şi a penicilinei care înhibă sinteza peptidoglicanului.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 4

Bacteriile gram – -

Peptidoglicanul are o grosime de 4-5nm, reprezentând numai 10% din greutatea uscată a bacteriei. Stratul superficial este însă mult mai complex decât la bacteriile gram - pozitive fiind alcătuit din: 

membrană externă,



lipoproteine



lipopolizaharidul de perete.

Membrana externă este formată dintr-un strat dublu fosfolipoproteic ce cuprinde o cantitate foarte mare de molecule proteice. Aceste proteine, bine definite la majoritatea speciilor bacteriene, sunt denumite Omp (outer membrane proteins) sau Momp ( major outer membrane proteins). Membrana externă se leagă de protoplast prin intermediul unei lipoproteine şi a proteinei OmpA din membrana externă. Proteinele nespecifice ale membranei externe cu funcţie de porine, cum sunt trimerii OmpF şi OmpC, delimitează nişte canale umplute cu apă prin intermediul cărora pot difuza în spaţiul periplasmic substanţe hidrosolubile. Proteinele specifice au funcţii de transport pentru anumite substanţe, unele dintre ele fiind şi receptori pentru bacteriofagi. De exemplu, proteina LamB este responsabilă pentru transportul maltozei şi receptor pentru fagul lambda al bacilului coli. Proteinele de suprafaţă pot avea la unele bacterii rol în patogenitate, ca de exemplu cele 7 proteine de suprafaţă al shigellelor care le asigură invazivitatea. Deasupra membranei externe a bacililor gram-negativi se află lipopolizaharidul de perete (LPZ) sau endotoxina bacililor gram-negativi. Aceasta este alcătuită din: • lipidul A care are o structură particulară, fiind format din unităţi dizaharidice de glucozamină, legate de beta-hidroxiacizi graşi cu 10-16 atomi de carbon fixaţi direct de membrana externă, • miezul sau “core”, numit şi antigen R, comun tuturor bacteriilor gram - negative şi care include 2 zaharuri caracteristice: acidul keto-deoxyoctanoic şi o heptoză. • unităţi monozaharidice repetitive (15-40) care sunt specifice de specie şi tip şi constituie antigenul O al bacteriilor gram-negative. LPZ este o toxină termolabilă, care se eliberează în mediul înconjurător de către bacteriile gram-negative numai după liza lor şi foarte reactivă în organismul gazdă. Astfel, lipidul A produce febră, activează mecanismele apărării antiinfecţioase şi în exces produce şocul endotoxic cu evoluţie gravă, chiar fatală. Spaţiul periplasmic. Sistemul structural dublu al peretelui celular la bacteriile gramnegative creează un compartiment ce se întinde de la membrana celulară până la membrana externă, numit spaţiu periplasmic. El conţine peptidoglicanul şi un gel care favorizează nutriţia bacteriei prin conţinutul în enzime degradative ca, de pildă, fosfataze, nucleaze, proteaze etc. Tot aici sunt prezente enzimele de inactivare ale unor antibiotice cum sunt beta-lactamazele şi cefalosporinazele. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 5

* Tipuri de coci Gram (+): - genul Staphylococcus spp., - genul Streptococcus spp., Enterococcus spp., * Tipuri de bacili Gram (+): - Listeria spp., - Bacillus spp., (B. anthracis) - Clostridium spp., (Cl. tetani) * Tipuri de coci Gram (-): - Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoese, - Moraxella, Branhamella etc * Tipuri de bacili Gram (-): - E. coli, Salmonella, Shigella, Proteus, (Enterobacteriaceae), - Haemophilus spp, - Pseudomonas spp * Bacterii Gram (+) la limita: - Corynebacterium diphteriae (prin decolorare prelungita pierde violetul de gentiana – apare colorat in rosu, iar la o colorare obisnuita apare violet). 5. Rolul peretelui bacterian Peretele celular este o componentă celulară obligatorie care înconjoară membrana citoplasmatică, peretele celular este o structură rigidă, specifică bacteriilor. Funcţiile peretelui celular bacterian: • asigură forma, rezistenţa mecanică şi osmotică a bacteriei; • asigură protecţia membranei citoplasmatice faţă de presiunea internă a celulei bacteriene, care este foarte mare: 5-6 atm la E. coli, 20-30 atm. la S. aureus; • reglează traficul molecular de perete în ambele sensuri, deci schimbul de substanţe dintre bacterie şi mediul înconjurător, fiind permeabil pentru molecule cu o GM mai mică de 10.000 daltoni şi cu un diametru mai mic de 1nm; • stochează unele enzime în spaţiul periplasmic la bacteriile gram-negative ce vor fi eliberate după necesităţi, spre deosebire de bacteriile gram-pozitive care îşi elimină enzimele direct în mediul extern; • prezintă receptori pentru bacteriofagi; • este sediul antigenelor de suprafaţă, fiind deci implicat în răspunsul imun al macroorganismului; • este sediul unor factori de patogenitate; • are rol în diviziunea bacteriană şi în procesul de sporulare.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 6

6. Coloratia Gram – timpi, interpretare, exemple Coloratia Gram. Este o coloratie foarte utilizata in bacteriologie, deoarece imparte bacteriile in doua categorii: bacterii Gram-pozitive si bacterii Gram-negative. Tehnica coloratiei este urmatoarea: · frotiul uscat este fixat prin caldura; · se acopera lama cu solutie apoasa de violet de gentiana si se lasa timp de 1-2 min.; · se indeparteaza colorantul si se acopera lama cu solutie Lugol pentru 2 min.; · se indeparteaza mordantul (solutia Lugol) si se trateaza frotiul cu alcool-acetona timp de cateva secunde; · se spala rapid lama cu apa de robinet si se acopera cu fucsina diluata 1/10 in apa timp de 30 sec. pana la 1 min; · se indeparteaza fucsina si se spala frotiul cu apa de robinet; dupa uscare se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie.Bacteriile Gram-pozitive rezista la decolorare, ramanand colorate in violet, dar cele Gram negative sunt decolorate de alcool-acetona si recolorate in rosu. 7. Protoplasti –Sferoplasti – Forme L Bacterii cu perete alterat sau formele L. Sunt bacterii cu stratul bazal viciat sub acţiunea unor factori din mediu ca, de exemplu, lizozimul şi penicilina, care lizează, respectiv împiedică sinteza peptidoglicanului. Bacteriile lipsite total de perete celular se numesc protoplaşti şi provin din rândul bacteriilor gram - pozitive, iar cele cu perete parţial lezat, sferoplaşti din bacteriile gram-negative, care îşi pierd mai greu peretele. Formele L sunt foarte sensibile la variaţiile osmotice, putând supravieţui numai în condiţii speciale de osmolaritate, dar sunt foarte rezistente la antibioticele beta-lactamice. Dacă factorii nocivi dispar din mediu, formele L se pot transforma în bacterii normale prin resinteza peretelui celular. Unele teorii mai vechi susţin că formele L pot întreţine şi croniciza o infecţie, dar dovezile în acest sens lipsesc. Protoplastul este o sfera marginita de membrana citoplasmatica, reprezinta bacteria grampozitiva dupa indepartarea completa a peretelui, de exemplu sub actiunea lizozimului care lizeaza mureina. In medii hipotone protoplastul se lizeaza. Este o structura care nu se poate multiplica. Sferoplastul reprezinta bacteria gram negativa dupa degradarea partiala a peretelui – contine o cantitate mai mica de mureina. Lizozimul poate actiona asupra peptidoglicanului numai dupa alterarea membranei externe. In medii hipotone sferoplastul se lizeaza. Spre deosebire de protoplast acesta se poate multiplica.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 7

8. Coloratia ZIehl-Neelsen, timpi – interpretare – exemple -se realizeaza pentru evidentierea bacteriilor din specia Mycobacterium Tehnica:-etalarea produsului patologic -uscarea -fixarea Etape: •

Se acopera lama cu fuxina pura,5-10 min,

•

Se incalzeste pana la emisia de vapori(nu se ajunge la fierbere),de 2-3 ori in interval de 10 min

•

Se spala cu apa de la robinet

•

Se decoloreaza cu alcool-acid -30 sec.

•

Se spala cu apa

•

Se recoloreaza cu albastru de metilen-2 min.

•

Se spala frotiul cu apa si se lasa la uscat in stativ

Citirea si interpretarea: •

Se foloseste obiectivul cu imersie

•

Mycobacteriile (bacilul tuberculos,bacilul leprei)apar colorate in rosu pe fond albastru=bacilii acido-alcoolo rezistenti=BAAR,ceilalti germeni si elemente celulare apar colorate in albastru

•

Proprietatea de acido-alcoolo rezistenta este caracteristica genului Mycobacterium

•

Se datoreaza structurii particulare a peretelui celular,cantitatii mari de lipide pe care acesta le contine si in special acidului micolic

9. Structura si rolul membranei citoplasmatice Membrana citoplasmatică Este o membrană fină (6,5-7nm), elastică, lipsită de rezistenţă mecanică ce mărgineşte la exterior citoplasma bacteriilor şi o separă de peretele celular. Pe secţiune apare trilaminată, fiind alcătuită din două straturi fosfolipidice dispuse cu părţile hidrofobe faţă în faţă. Printre moleculele fosfolipidice se găsesc molecule proteice, situate fie la nivelul unuia dintre cele două straturi fosfolipidice, fie le traversează fiind expuse la ambele feţe ale membranei. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 8

Această structură dinamică, fluidă, temporară şi reversibilă în funcţie de factorii de mediu este o “structură în mozaic”, modelul ei fiind descris în 1972 de Singer şi Nicholson. Funcţiile membranei citoplasmatice: • este o membrană cu permeabilitate selectivă, îndeplinind funcţia de barieră osmotică ce reglează schimburile celulei bacteriene, în ambele sensuri cu mediul înconjurător. Permeabilitatea selectivă a membranei citoplasmatice permite realizarea în interiorul celulei, pentru unele substanţe, concentraţii de 105 ori mai mari decât în afara celulei, • secretă numeroase enzime hidrolitice ce se eliberează în mediul înconjurător unde scindează substratul nutritiv în unităţi absorbabile, • unele proteine legate de membrana citoplasmatică joacă rolul de chemoreceptori, • îndeplineşte rolul mitocondriilor de la celulele eucariote, fiind sediul enzimelor lanţului respirator şi al fosforilării oxidative, deci centrul energogenezei celulare, • este sediul sintezei acizilor graşi, a fosfolipidelor, • este implicată în sinteza peretelui celular, al polizaharidelor capsulare, participând activ la creşterea şi diviziunea celulei bacteriene, la formarea sporului bacterian, • constituie o posibilă ţintă pentru acţiunea unor chimioterapice ca, de pildă, polimixinele. 10. Ribozomii, structura si rol Ribozomii sunt structuri sferice cu diametru de aproximativ 180nm şi constanta de sedimentare de 70S. Marimea lor depinde de concentratia ionilor de MG si K, unii apar liberi in citoplasma altii legati de fata interna a membranei citoplasmatice. În absenţa ionilor de Mg2+ se desfac în două subunităţi cu constanta de sedimentare de 50S şi 30 S. Intre cele doua subunitati se formeaza un canal prin care trec moleculele de ARNm in cursul sintezei proteice Din punct de vedere chimic sunt alcătuiţi din 65-70% ARN şi 30-35% proteine. O parte din ribozomi se asociază formând polizomi (mai ales în timpul sintezelor proteice), alţii sunt liberi, iar o a treia categorie se ataşează mezozomilor sau membranei citoplasmatice. Ribozomii reprezintă sediul sintezelor proteice din celulă. ARNm transporta informatia genetica de la genom la nivelul ribozomilor. Traducerea se face la nivelul ribozomilor de catre ARNt care are dubla specificitate (pentru fiecare din cei 20AA exista unul sau mai multi ARNt) 11. Mezozomi – Incluziuni – Vacuole (in structura celulei bacteriene) Incluziile citoplasmatice, descrise la unele specii bacteriene, sunt formaţiuni structurale inerte, temporare, de diferite dimensiuni, variind în funcţie de specia bacteriană şi condiţiile de mediu. Compoziţia lor chimică este diferită, ele putând fi de glicogen sau amidon (la unii bacilii aerobi sporulaţi), lipide (la genul Bacillus), polimetafosfaţi (sau incluziile de volutină descrise mai întîi la Spirillum volutans şi apoi de Babeş şi Ernst la bacilii difterici) etc. Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolică a celulei bacteriene şi reprezintă un material de rezervă care poate fi folosit ca sursă de energie. Mezozomii sunt structuri membranare care se formează prin invaginarea membranei Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 9

citoplasmatice sub formă de buzunar sau în deget de mănuşă, prezente la bacteriile gram pozitive şi ocazional la cele gram - negative. Ei nu formează în citoplasmă cavităţi inerte, ci deschise spre spaţiul periplasmic (spaţiul dintre membrana citoplasmatică şi peretele celular) şi sunt în contact direct cu materialul nuclear. După morfologia lor, mezozomii sunt lamelari, veziculari şi tubulari, iar dispoziţia lor în celula bacteriană poate fi septală, periferică şi nucleară. Funcţiile mezozomilor: • participă la replicarea cromozomului bacterian şi diviziunea celulară, • participă la reacţiile de fosforilare oxidativă şi oxidoreducere, dar în măsură mai mică decât membrana celulară, • sediul unor enzime hidrolitice care îndeplinesc rolul enzimelor lizozomale de la celulele eucariote, • sinteza şi secreţia unor exoenzime, ca de exemplu penicilinaza sau cefalosporinaza, • sinteza peretelui celular şi formarea sporului bacterian. Vacuolele – sunt formatiun sferice care contin diferite substante in solutie apoasa. Au o membrana lipoproteica numita tonoplast. Au fost descrise in special la bacteriile acvatice. 12. Masa nucleara bacteriana – structura, caracteristici - vine in contact direct cu citoplasma - contine ADN, nu are nucleoli - are afinitate pentru coloranti bazici dar pe preparatele colorate uzual este mascat de bazofilia intensa a citoplasmei bogata in ARN - unicul cromozom bacterian este alcatuit dintr-o singura molecula de ADN dublucatenar cu aspectul unui fir lung (1000-2000 Mm) inchis intr-un inel si replicat pe el insusi - Nucleul contine informatia genetica necesara proceselor vitale de crestere si multiplicare - Codonul – din punct de vedere functional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formeaza un codon. Codonii detin informatia genetica pentru a plasa intr-o anumita secventa un anumit aminoacid - Cistronul – reprezinta o subunitate functionala a genei capabila sa determine independent sinteza unui lant polipeptidic - Gena – reprezinta o portiune a genomului, o anumita secventa de nucleotide dispuse liniar - genele structurale reprezinta circa 90% din ansamblul informatiei genetice - gena poarta inscrisa in structura sa informatia genetica necesara pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau functionale (enzime) 13. Cum este inscrisa informatia genetica in genomul celulei bacteriene - Nucleul contine informatia genetica necesara proceselor vitale de crestere si multiplicare - Codonul – din punct de vedere functional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formeaza un codon. Codonii detin informatia genetica pentru a plasa Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 10

intr-o anumita secventa un anumit aminoacid - Cistronul – reprezinta o subunitate functionala a genei capabila sa determine independent sinteza unui lant polipeptidic - Gena – reprezinta o portiune a genomului, o anumita secventa de nucleotide dispuse liniar - genele structurale reprezinta circa 90% din ansamblul informatiei genetice - gena poarta inscrisa in structura sa informatia genetica necesara pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau functionale (enzime)

14. Enumerati si descrieti succint etapele biosintezei proteice are loc la nivelul ribozomilor. - Initial are loc transcrierea informatiei genetice pe ARNm - ARNm va transporta aceasta informatie de la genom la ribozom, sub forma unei copii complementare - De regula numai o catena de ADN este folosita drept matrita pentru ARNm - Transcrierea mesajului genetic este selectiva si se desfasoara intre promotor si semnalul de terminare fiind controlata de ARN polimeraza ADN dependenta - Traducerea mesajului genetic este realizata la nivelul ribozomilor de catre ARNt - ARNt are dubla specificitate (pentru fiecare din cei 20 AA exista unul sau mai multi ARNt iar enzime specifice fiecarui aminoacid controleaza legarea corecta a aminoacizilor activati pe ARNt corespunzator - Fiecare ARNt poseda un triplet de nucleotide (anticodon) complementar codonului corespunzator aminoacidului - Succesiunea specifica a nucleotidelor este transpusa intr-o secventa specifica de aminoacizi care intra in constitutia lantului polipeptidic din proteina in curs de formare. 15. Capsula bacteriana – structura,rol, localizare Capsula bacteriana Majoritatea bacteriilor patogene şi comensale sunt capabile să producă in vivo un material de înveliş extracelular. Capsula este un înveliş compact, intim legat de celula bacteriană, cu o lăţime de cel puţin 0,2µm. Este vizibilă pe preparatele uzuale sau în coloraţiile negative sub forma unui halou clar ce înconjoară bacteria. Din punct de vedere chimic, capsula tuturor bacteriilor de interes medical este de natură polizaharidică (Streptococcus pneuomoniae, Klebsiella etc.) cu excepţia capsulei bacilului cărbunos care este polipeptidică. Capsula are rol în rezistenţa bacteriilor faţă de fagocitoză, fiind astfel un factor de virulenţă. Variantele necapsulate ale aceloraşi specii sunt nepatogene. De exemplu, Streptococcus pneumonie, de tip S, capsulat, produce la şoarecele alb de laborator o septicemie mortală, pe când varinata necapsulată nu este patogenă. Capsula este o structură cu proprietăţi antigenice specifice (antigenele K) care permit Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 11

diferenţierea unor serotipuri în cadrul speciei. Bacteriile nu sintetizează material capsular in vitro pe mediile uzuale, coloniile rezultate fiind rugoase, de tip R =“rough”. Pe medii speciale, însă, bacteriile pot creşte capsulate, coloniile fiind mucoase, de tip S =“smooth”. Structura descrisă mai sus este “capsula clasică” a bacteriilor, la care ne referim atunci când vorbim de bacterii capsulate. La unele bacterii s-au mai evidenţiat şi alte structuri de înveliş, cum sunt: Microcapsula este o structură discretă cu o grosime sub 0,2µm care nu se evidenţiază la microscopul optic, ci numai prin metode imunologice sau electronomicroscopice (Neisseria gonorrhoeae). Ea constituie un factor de virulenţă. Stratul mucos, glicocalixul este un strat amorf şi vâscos ce înveleşte bacteria. El este format din lanţuri lungi de polizaharide, cum sunt levanii şi dextranii, cu rol major în adezivitatea bacteriilor de suprafeţe. Astfel, de pildă, Streptococcus mutans produce cantităţi mari de dextran şi levan prin intermediul cărora se ataşează de suprafaţa dinţiilor contribuind la formarea cariilor şi a plăcii dentare. Un alt exemplu este Pseudomonas aeruginosa, care secretă un strat mucos dens care îi creşte rezistenţa la antibiotice. Funcţiile capsulei: • este un factor de aderenţă şi colonizare a bacteriile pe suprafeţe; • protejează bacteriile de diferiţi agenţi antibacterieni din mediu cum sunt: bacteriofagii, colicinele, complementul, lizozimul sau alte enzime bacteriolitice; • protejează bacteriile de acţiunea fagocitelor, fiind deci un factor de virulenţă; • reprezintă sediul antigenelor capsulare, importante în identificarea acestor bacterii. 16. Flagelii bacterieni – structura, rol, localizare Cilii sau flagelii bacterieni Sunt apendici filamentoşi ai speciilor bacteriene mobile, cu originea în citoplasma bacteriană, şi servesc ca organe de locomoţie. Ei sunt prezenţi mai ales la bacili (Enterobacteriaceae) dar şi la unii coci (enterococ). Flagelii sunt formatiuni fine, alungite, flexibile cu origine la nivelul corpusculului bazal. - Din punct de vedere chimic flagelul este de natura proteica (flagelina) - Roluri: - In mobilitate (50Mm/s) - Antigenic (structura proteica, antigenul H) - In clasificarea bacteriilor o Monotriche (cu un flagel) o Lofotriche (cu un manunchi de flagel) o Peritriche (cu mai multi flageli dispusi de-a lungul suprafetei) Cilii sunt structuri helicoidale, cu dimensiunea în general mai mare decât cea a celulei bacteriene căreia îi aparţin (2-15/2-20 nm) şi se evidenţiază microscopic prin coloraţii Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 12

speciale. Dispoziţia şi numărul cililor sunt caracteristice speciei. S-au descris bacterii atriche (fără cili), monotriche - cu un cil polar (Vibro cholerae), lofotriche - cu un smoc de cili situat la unul din polii bacteriei - (Pseudomonas fluorescens), amfitriche - cu cilii situaţi la ambii poli ai bacteriei (la genul Spirillum) şi peritriche - cu cilii dispuşi pe întreaga suprafaţă a bacteriei (Salmonella, E. Coli, Proteus etc.). Structura cililor este tubulară, ei fiind formaţi dintr-o proteină contractilă, flagelina, sub formă polimerizată. Cilul se ataşează de bacterie printr-un corpuscul bazal şi un cârlig de articulaţie aflate în citoplasma bacteriei. Corpusculul bazal se inseră prin cârligul de articulaţie de membrana citoplasmatică şi peretele celular. Mobilitatea şi direcţia mişcării cililor pot fi influenţate de concentraţia unor substanţe din mediu (chimiotactism pozitiv sau negativ) şi de temperatură. Ei sunt sediul antigenelor flagelare (H), importante în identificarea bacteriilor. Cilii bacterieni nu se observă decât pe preparate colorate special. În practica de rutină nu se evidenţiază flagelii, ci mobilitatea bacteriilor, fie prin examinarea lor pe un preparat nativ între lamă şi lamelă în care se urmăresc mişcările bacteriilor, fie prin însămânţarea tulpinii pe un mediu semisolid prin înţeparea în profunzime a mediului. Dacă bacteria creşte nu numai pe traseul însămânţării şi difuzează în mediu, ea este mobilă. 17. Fimbriile bacteriei Fimbriile Fimbriile sunt oligomeri proteici care apar ca apendici filamentoşi la suprafaţa celulei bacteriene. Ele sunt alcătuite din subunităţi proteice cu masa moleculară de 17.000 Da şi dintro componentă proteică minoră. Sinteza fimbriilor este influenţată de condiţiile de mediu, mai ales de temperatură şi de factori ce influenţează rata de dezvoltare a culturii microbiene. Subunităţile proteice ale fimbriilor pot fi supuse unei variaţii antigenice care scapă bacteria de răspunsul imun al gazdei. • fimbriile de tip 1, sau pilii comuni, sunt prezente la multe specii de Enterobacteriaceae. Ele se leagă de glicoconjugaţii din membrana citoplasmatică a celulelor gazdă ce conţin manoză. • fimbriile P sunt prezente pe tulpinile de Escherichia coli pielonefritogene. Receptorul pentru aceste fimbrii sunt glicolipidele ce conţin două molecule alăturate de galactoză prezente în membrana celulelor epiteliului urinar. • fimbriile S s-au evidenţiat la tulpinile de E.coli implicate în meningite şi se ataşează de glicoconjugaţii ce conţin acid sialic. • fimbriile K88 şi K89 se găsesc la tulpinile de E.coli enterotoxigene ce produc diaree. Receptorii celulelor sensibile conţin acid sialic şi lactoză. Aceeaşi tulpină de Escherichia coli poate conţine mai multe tipuri de fimbrii codificate de anumite zone cromozomiale sau plasmidice. Această diversitate genetică permite adaptarea tulpinii la condiţii diferite oferite de organismul gazdă. • fimbriile ce conţin N-metilfenilalanină au fost evidenţiate la o serie de genuri de bacterii gram-negative, cum sunt Pseudomonas (bacilul piocianic), Neisseria (gonococ şi meningococ), Bacteroides, Vibro etc. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 13

18. Sporii bacterieni – structura, rol, localizare Sporii Unele bacterii se transformă în spori, care sunt forme primitive de diferenţiere celulară, cu rezistenţă crescută la factorii de mediu şi care apar endocelular în condiţii nefavorabile de viaţă. Sporogeneza se întâlneşte numai la 3 genuri de bacterii gram-pozitive, Clostridium şi Bacillus care sunt bacili şi Sporosarcina care sunt coci. Sporii nu sunt forme de înmulţire ale bacteriilor. Dintr-o bacterie vegetativă se formează un singur spor, care în condiţii favorabile de viaţă va da naştere unei singure celule bacteriene. Forma sporului poate fi rotundă sau ovală. Diametrul sporilor este mai mic la bacilii sporulaţi aerobi, nedepăşind diametrul bacteriei (genul Bacillus), pe când la genul anaerob Clostridium, sporul are un diamentrul mai mare decât bacteria, producând deformarea acesteia. Acest caracter al sporului se numeşte “caracter clostridial” şi este important în identificarea bacililor gram-pozitiv anaerobi. Poziţia sporului bacterian constituie un caracter taxonomic. Poate fi centrală, ca la bacilul cărbunos (Bacillus anthracis), subterminală, ca la B.cereus, sau terminală, ca bacilul tetanic (Cl.tetani). În coloraţiile obişnuite sporul apare ca o zonă incoloră în corpul bacterian. El se evidenţiază însă prin coloraţii speciale, la cald, care permeabilizează învelişurile sporale pentru coloranţi (coloraţia Möller). Pe preparatele native între lamă şi lamelă efectuate din culturi, sporii apar ca nişte formaţiuni rotunde, refringente. Ultrastructura şi compoziţia chimică a sporilor asigură acestora o mare rezistenţă la agenţii fizici şi chimici, ceea ce face ca ei să fie consideraţi forme de rezistenţa ale bacteriilor. De importanţă deosebită pentru medicină este rezistenţa sporilor la căldură, de care trebuie să se ţină cont la sterilizare. Sporularea. Este un proces ce se declanşează în condiţii nefavorabie de viaţă, când bacteriile sunt lipsite de surse nutritive. Ea presupune formarea unor structuri noi şi dispariţia altor structuri caracteristice formei vegetative ale bacteriei. Din punct de vedere morfologic, sporularea începe prin condensarea la un capăt al celulei a materialului nuclear. Acesta va fi separat de un sept ce provine din invaginarea membranei citoplasmatice. Septul creşte, se desprinde de membrana citoplasmatică şi formează în jurul materialului nuclear o membrană dublă a cărei feţe care se privesc sunt cele ce sintetizează peretele bacterian. Acesta este stadiul de prespor.Cele două lamele ale membranei presporale vor sintetiza învelişurile sporale: peretele sporal şi cortexul situate între cele două lamele ale membranei presporale şi o tunică proteică şi exosporiumul în afara membranei presporale. Structura sporului variază de la specie la specie, dar organizarea generală se aseamănă. De la interior spre exterior, sporul este format din: • core sau protoplastul sporal, format din materialul nuclear inconjurat de membrana citoplasmatică. Aici este depozitat DNA şi o substanţă care are rol în rezistenţa sporului la căldură - dipicolinatul de Ca, care nu s-a mai evidenţiat nicăieri în natură, • cortexul intern sau peretele sporal format din peptidoglican şi care este peretele celular primordial, • membrana externă sau cortexul sporal, care este stratul cel mai gros al sporului şi care conţine şi el un peptidoglican, cu o structură particulară, foarte sensibil la lizozim. Autoliza acestui strat este momentul cheie în transformarea sporului în forma vegetativă, Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 14

• tunica proteică este formată din proteine chitinoase cu numeroase legături disulfitice. Ea este impermeabilă, fiind responsabilă de rezistenţa sporilor la unele dezinfectante, • exosporiumul este prezent numai la unii spori şi conţine lipoproteine şi zaharide. Germinarea sporului. În condiţii de mediu favorabile, sporul germinează şi va da naştere unei bacterii vegetative identice cu aceea în care s-a format. Germinarea are loc în 3 etape: Activarea sporului. Se produce când acesta întâlneşte condiţii favorabile de viaţă, dar şi un factor care să lezeze învelişul sporal (mecanic sau chimic ca, de exemplu, lizozimul, compuşi cu grupări sulfhidrilice libere etc.). Iniţierea este declanşată de un mediu nutritiv bogat. Pentru unii spori triggerul este L-alanina, iar pentru altele adenozina. Acesta duce la activarea unei enzime autolitice care degradează cortexul sporal. Are loc absorbţia de apă, eliberarea dipicolinatului de calciu şi degradarea unor compuşi sporali. Dezvoltarea sporului. Protoplastul sporal se transformă în bacterie vegetativă, care trece printro perioadă metabolic activă de refacere a constituenţilor celulari normali şi a echipamentului enzimatic complet. 19. Apa, substantele minerale si pigmentii in structura celulei bacteriene Continutul în apa al bacteriilor se situeaza în medie la 85% din masa celulara. Apa este faza în care se solubilizeaza, sunt transportati electrolitii si substantele neelectrolitice si mediul în care se petrec toate reactiile metabolice. Ea participa la multe din aceste reactii (hidroliza, reactii anabolice etc.) si formeaza împreuna cu substantele anorganice si macormoleculele organice continute o unitate fizico-chimica si biologica. Exista apa libera (mediu de dispersie) si apa legata fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au putina apa, in special apa legata. Bacteriile sunt fiinte acvatice prin excelenta. Roluri: mediu de dispersie, reactiv in reactiile metabolice, erapa finala a unor reactii oxidative. Substante minerale – 2-30% din greutatea uscata a bacteriei si variaza in functie de specie. Unele elemente intra in compozitia diferitelor strucuri (sulful in str aa) Roluri: - favorizeaza schimburile cu mediul - regleaza presiunea osmotica - pot stimula cresterea si functia bacteriei - activeaza unele sisteme enzimatice - contribuie la reglarea pH-ului Pigmentii – pigmentogeneza este caracteristica bacteriilor cromogene si este dependenta de conditiile de cultivare Poate reprezenta un criteriu de identificare. Dupa localizarea pigmentului bacteriile pot fi: - cromofore (pigmentul este legat in citoplasma) - paracromofore (pigmentul este prezent in perete sau in stratul mucos) - cromopare (pigmentul este difuzibil in mediu Roluri: - protectie fata de UV - antibiotic - enzimatic Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 15

20. Glucidele, proteinele si lipidele in structura celulei bacteriene Glucidele – in structura bacteriana se pot gasi glucide cu rol in metabolismul intermediar glucidic precum si glucide complexe, polizoide. Acestea din urma au urmatoarele roluri: - participa la realizarea structurii peretelui celular - fac parte din capsula unor bacterii Exista teste biochimice in care se urmareste utilizarea sau imposibilitatea utilizarii unui anumit zahar de catre o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei respective (in special in cazul enterobacterilor, etc). Testariile biochimice sunt de mare utiliate in studiul fungilor. Proteinele – pot fi simple, cu rol in metabolismul intermediar pritidic si complexe, heteroproteinele: - mucoproteine - cromoproteine - nucleoproteine De remarcat prezenta in structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic, precum si a aminoacizilor in forma D (adaptare biochimica a bacteriilor fata de actiunea nociva a enzimelor proteolitice) Lipidele – reprezinta mai putin de 10% din greutatea uscata a bacteriilor si variaza cantitativ in functie de specie, varsta etc. Lipidele se pot gasi libere in vacuole sau combinate, facand parte din diferitele structuri ale celulei bacteriene (perete, membrana, mezozomi): - acizii grasi speciali (ac mycolic la mycobacterii) - cerurile (acizi grasi + alcooli monovalenti superiori) – bacteriile acid-alcool rezistente - fosfolipidele – lipidul ubiquitar - lipidul A

21. Substante cu actiune antibiotica produse de bacterii piocianina elaborata de P. Aeruginosa fata de B anthracis - plasmida „col” codifica proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine cu efect asupra unor bacterii receptive inrudite (de exemplu colicinele elaborate de E.coli) - unele bacterii din genul bacillus produc antibiotice polipeptidice (de ex B licheniformis produce bacitracina, B. Brevis gramicina, B. Plymyxa polimixina)

22. Nutritia principalelor bacterii studiate: tipuri de nutritie Nutritia bacteriana reprezinta totalitatea proceselor prin care bacteriile îsi procura din mediul înconjurator substantele necesare supravietuirii, cresterii si înmultirii , iar respiratia bacteriana modalitatea de a-si produce energia necesara activitatii metabolice. Sursa de energie. În functie de sursa de energie pe care o folosesc, bacteriile se împart în: Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 16

• fotosintetizante, care utilizeaza energia luminoasa pentru sinteza compusilor proprii si • chimiosintetizante, care îsi procura energia prin reactii de oxido-reducere a unor substante. Bacteriile care oxideaza substantele anorganice se numesc lithotrofe, iar cele care oxideaza substante organice chemoorganotrofe. Sursa de carbon. Dupa sursa de carbon, bacteriile se clasifica în: • autotrofe, care sintetizeaza compusi organici pornind de la substante anorganice, sursa de carbon fiind CO2, • mixotrofe, care folosesc ca sursa de carbon atât substante organice cât si CO2, • heterotrofe, care utilizeaza ca sursa de carbon numai substante organice. Sursa de azot a bacteriilor de interes medical o constituie în general aminoacizii, dar unele bacterii utilizeaza si sarurile de amoniu (Escherichia coli, Salmonella etc.). Necesarul de oxigen pentru dezvoltarea bacteriilor este variabil si va fi discutat în cadrul reactiilor de energogeneza. Necesarul de substante organice este foarte diferit de la o specie bacteriana la alta. Astfel, de pilda, Escherichia coli cultiva foarte bine pe medii care au în compozitie o singura sursa organica de carbon (glucoza, acetat sau succinat), o sursa de azot [(NH4)2SO4)], ioni esentiali dezvoltarii (K+, Mg2+ etc.) si oligoelemente (Cl-, Co, Cu, Mo, Ni, Se, Zn etc.). Cu cât necesitatile nutritive bacteriilor sunt mai mari cu atât dependenta lor fata de o gazda naturala creste. Astfel, o categorie aparte în cadrul bacteriilor heterotrofe sunt bacteriile paratrofe. Ele sunt lipsite de unele enzime (genul Rickettsia) sau nu sunt capabile de energogeneza (genul Chlamydia) 23. Clasificarea bacteriilor in functie de tipul respirator (vezi tabel la sfarsitul subiectului!) La bacterii deosebim în functie de acceptorul final de hidrogen, 3 tipuri de oxidatie: respiratia, în care acceptorul final de hidrogen este oxigenul atmosferic, fermentatia, în care acceptorul final de hidrogen este o substanta organica, si respiratia anaeroba, în care acceptorul final de hidrogen este oxigenul prezent într-o sare anorganica (nitrat sau sulfat) care se va reduce. Din punct de vedere practic, bacteriile se împart, dupa necesarul de oxigen, în: • bacterii strict aerobe, care se dezvolta numai în prezenta oxigenului atmosferic, folosind exclusiv respiratia aeroba si deci oxigenul ca acceptor final de hidrogen. Astfel de bacterii sunt, de exemplu, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis etc. • bacterii strict anaerobe, care nu se dezvolta decât în absenta oxigenului, prezenta lui fiind foarte toxica culturii chiar la o presiune de numai 10-5 atm. Aceste bacterii folosesc ca reactie energogenetica exclusiv fermentatia, în conditii anaerobe, deci oxidatia de substrat. Daca fermentatia se produce în prezenta oxigenului, se formeaza radicali de superoxid (O 2-) foarte toxici. Bacteriile strict anaerobe, spre deosebire de cele aerobe, sunt lipsite de superoxiddismutaza care transforma radicalul superoxid în apa oxigenata si catalaza care descompune apa oxigenata. Exemple de bacterii strict anaerobe sunt cele din genul Clostridium, Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 17

Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium etc. • bacterii facultativ anaerobe, care se pot dezvolta atât în prezenta cât si în absenta oxigenului atmosferic. Ele utilizeaza ca reactii energogenetice respiratia aeroba, fermentatia iar unele chiar si respiratia anaeroba. Majoritatea speciilor de interes medical sunt facultativ anaerobe (de pilda, enterobacteriile). • bacterii anaerobe aerotolerante folosesc numai fermentatia în prezenta aerului atmosferic, fara participarea oxigenului la reactiile energogenetice. Ele tolereaza oxigenul în mediu fie pentru ca au în echipamentul enzimatic superoxiddismutaza si catalaza, fie ca enzimele exista în mediul de cultura. Astfel, bacteriile din genul Streptococcus sunt lipsite de catalaza, dar pot fi cultivate în conditii de aerobioza pe medii cu sânge, care suplineste catalaza. • bacterii microaerofile folosesc respiratia si fermentatia, dar necesita o concentratie mai mare de bioxid de carbon decât cea din atmosfera pentru reactii de carboxilare. Astfel, unele specii, ca cele din genurile Neisseria, Brucella, Campylobacter, necesita concentratii de bioxid de carbon de 6-10%. Reactiile energogenetice ale bacteriilor sunt în principiu aceleasi ca si la celulele eucariote, si anume: glicoliza pe calea Embden-Mayerhoff (în conditii de aerobioza sau anaerobioza), calea pentozofosfatilor, (în care se produce NADPH2 important donor de ioni de H pentru reactiile anabolice), beta-oxidatia acizilor grasi, ciclul acizilor tricarboxilici, dezaminarea oxidativa si transaminarea aminoacizilor, oxidarea de substrat, fosforilarea oxidativa. Necesar de O2

Unde se dezvolta

Reactia energogenetica

Exemple

1. STRICT AEROBE

in prez. O2 atmosferic

Respiratie aeroba

-Pseudomonas -Mycobacterium tuberculosis

2. STRICT ANAEROBE

in absenta de O2 atmosferic [prezenta = toxica. Nu au: superoxiddismutaza si catalaza]

Fermentatie in conditii anaerobe [fermentatia in conditii aerobe => radicali de superoxid => toxic]

-Clostridium -Bacteroides -Prevotella -Fusobacterium

3. FACULTATIV ANAEROBE

in prezenta + absenta - respiratie aeroba -Enterobacterii O2 [majoritatea speciilor - fermentatie de interes medical] - respiratie anaeroba (unele din ele)

4. ANAEROBE AEROTOLERANTE

tolereaza O2 - fermentatie in conditii -Streptococcus aerobe, fara particip. Prezinta: superoxiddismutaza si O2 catalaza sau enzimele exista in sistemele de cultura

5. MICROAEROFILE

necesita conc. mare de - fermentatie CO2 - respiratie

Subiecte microbiologie an II sem I

-Neisseria -Brucella -Campylobacter (6-10% conc. CO2)

pg. 18

24. Definiti factorii de crestere bacterieni: exemple Definitie: Factorii de crestere sunt metaboliti esentiali pe care bacteria nu ii poate sintetiza pe baza substantelor din mediu. Exemple: Factorii X si V pentru Haemophilus influenzae ! bacteriile patogene devin dependente de un astfel de factor. exemplu: Mycobacterium Leprae este cea mai „pretentioasa” bacterie 25. Clasificati bacteriile in functie de temperatura optima de dezvoltare: exemple In functie de temp de dezvoltare, bacteriile pot fi: a)mezofile-cu temp optima 30-37 grade(majoritatea bact studiate de microbiologia medicala); b)psichrofile- temp optima in jur d 20 grade(unele accepta si temp apropiata de 0 grade); c)termofile- temp opt de 50-60 grade(unele se multiplica si la ~95 grade:ex :thermus aquaticus).Nu sunt patogene. Temperarura optima de dezvoltare a bacteriilor este cea a habitatului lor natural. În functie de aceasta temperatura, bacteriile se împart în psihrofile, care se înmultesc optim la 20°C dar si sub aceasta temperatura, mezofile, cu temperatura optima cuprinsa între 20-40°C si termofile, care se înmultesc optim la peste 45°C. Bacteriile mezofile sunt cele patogene deoarece se înmultesc la temperatura organismului, fiind denumite si bacterii “homeoterme”. Limitele de temperatura în care aceste bacterii pot sa creasca sunt însa mai mari si variaza de la specie la specie. Astfel, gonococul si meningococul nu suporta variatii mai mari de 1-2°C fata de temperatura optima, spre deosebire de enterobacterii, care cresc în limite foarte largi. Microorganismele sunt sensibile la temperaturile ridicate, aplicatia practica a acestui aspect fiind sterilizarea. Temperaturile moderat scazute, ca, de pilda, cea de +4oC din frigidere, nu distrug bacteriile, dar opresc în general înmultirea lor prelungindu-le viabilitatea. Din acest motiv, majoritatea produselor biologice sau patologice destinate examenului bacteriologic se pastreaza în aceste conditii. Totusi, exista tulpini microbiene care se înmultesc si la temperatura frigiderului ca, de exemplu, tulpinile criogene de Pseudomonas aeruginosa, ce se înmultesc la 0oC si tulpini din familia Enterobacteriaceae (E.coli) care se în înmultesc la +5oC. Acest aspect trebuie luat în calcul de catre medicul bacteriolog, mai ales acolo unde implicatia etiologica a unui germene într-o infectie se bazeaza pe criteriul numeric. Congelarea. Daca o suspensie bacteriana este supusa înghetului la temperaturi nu prea mici fata de 0oC, cristalizarea apei determina formarea unor spatii ce contin solutii concentrate de saruri care nu cristalizeaza decât la temperaturi mult mai joase (-20°C pentru NaCl de exemplu), când solutiile devin saturate si pot cristaliza. Aceste concentratii ridicate de saruri minerale, la care se adauga cristalele de apa, vor leza structurile bacteriene. Prin înghetare nu vor fi omorâte toate celulele unei suspensii, dar înghetul si dezghetul repetat scad foarte mult numarul de bacterii viabile. Conservarea prin congelare. Temperatura congelatoarelor casnice (-10°C) nu este destul de scazuta pentru a permite conservarea bacteriilor. Temperatura optima este cea realizata de CO2 (-78°C) sau de azotul lichid (-180°C). Conservarea bacteriilor, a virusurilor prin congelare Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 19

este favorizata de adaosul de glicerol sau dimethilsulfoxid. Acesti agenti chimici induc o solidificare amorfa, vitroasa care înlocuieste solicificarea prin cristalizare. 26. Structua si sinteza peptidoglicanului Peptidoglicanul sau mureina este structura chimica responsabila de rigiditatea peretelui celular si care asigura forma si rezistenta mecanica a bacteriei. Prezent la toate bacteriile, el consta dintr-un schelet, format din molecule lungi paralele polizaharidice de N-acetil-glucozamina si acid N-acetil-muramic. Moleculele de acid N-acetil-muramic din lanturile vecine sunt legate intre ele prin punti polipeptidice, transversale.

Sinteza: incepe prin sinteza in citoplasma a UDP-acid N-acetil muramicpentapeptid( NAM). Acesta se ataseaza de bactoprenol(lipid din mbr celulara),apoi urmeaza un lant d reactii biochim. Legarea incrucisata finala se realizeaza printr-o reactie de transpeptidare in care terminatiile amino libere ale pentaglicinei inlocuiesc reziduurile terminale ale D-Ala de la peptidul invecinat.Reactia e catalizat de transpeptidaze, un set d enzime aka PBPs(penicillin binding proteins), cu activitate atat de trans cat si de carboxipetidaze, dar controleaza si gradul de legare a peptidoglicanului.(lucru important in diviziunea celulara).La nivelul lor se leaga penicilinele si alte beta lactamice. Orice compus care inhiba o etapa in sinteza peptidoglicanului la o bacterie in crestere va produce liza bacteriana. 27. Definiti notiunea de cultivare a bacteriilor; enumerati pe ce substraturi se realizeaza Cultivarea se realiz prin insamantarea bacteriilor pe medii de cultura. Cunoasterea necesitatilor nutritive ale bacteriilor este foarte importanta în bacteriologia medicala, deoarece sta la baza prepararii mediilor de cultura destinate izolarii diverselor specii bacteriene din produsele biologice sau patologice. Mediul Loeffler pentru cultivarea bacilului difteric, mediul Löwenstein-Jensen pentru bacilul lui Koch, mediul selectiv Wilson-Blair pentru salmonele si multe altele. Se ultilizeaza diferite substraturi biologice nutritive complexe care au în compozitia lor aceste ingredinente. Astfel: peptonele, care se obtin prin hidroliza enzimatica sau acida a proteinelor de origine animala (de exemplu faina de oase). Ele nu au o compozitie chimica foarte bine definita, iar prin continutul în peptide si aminoacizi constituie o sursa universala de azot, pentru toate bacteriile cultivabile, fiind folosite practic în prepararea tuturor mediilor de cultura, extractul de carne, ce se obtine prin deshidratarea decoctului de carne de vita. Acesta contine cantitati importante de creatina, xantina, hipoxantina, acid uric, acid adenilic, glicocol, uree, glutamina ca sursa de azot precum si glicogen, hexozofosfati, acid lactic etc. ca sursa de carbon, extractul de drojdie, care se obtine prin cultivarea controlata a drojdiilor si care contine numeroase vitamine, mai ales cele din grupul B, În afara de ingredientele mai sus mentionate mai amintim: Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 20

clorura de sodiu, care se adauga la mediile uzuale într-o concentratie de 0,9%. Pentru cultivarea bacteriilor halofile concentratie poate creste pâna la 10%, mono sau polizaharidele, unii alcooli (glicerina, manitol) pot înmbogati mediile, deoarece constituie surse de carbon usor accesibile multor bacterii 28. Definiti notiunea de crestere si multiplicare bacteriana Cresterea si înmultirea bacteriilor este rezultatul nutritiei si al metabolismului bacterian. Viteza de multiplicare a bacteriilor este foarte mare dar nu toate bacteriile se divid repede. Baciul tuberculos, de pilda, a carui timp de generatie este de 24 de ore, se va înmulti lent si va produce o infectie cu evolutie insidioasa, cronica. Cresterea oricarui organism are loc prin sinteza de noi molecule; Multiplicarea= o consecinta a cresterii(se restabileste rap dintre volum si si supraf celulei). Multiplicarea se face de obicei prin diviziune simpla. În organism, cresterea si multiplicarea bacteriilor este diferita de multiplicarea in vitro, fiind stresata de necesitati nutritive (prin competitie cu flora normala) si prin mecanismele de aparare antiinfectioasa. Conditiile pe care microorganismele le întâlnesc în organism le selecteaza pe acelea care cresc în anumite limite de temperatura, osmolaritate si pH. 29. Definiti notiunea de mediu selectiv, electiv si de imbogatire; exemple Mediul electiv: prezinta ingrediente speciale pentru un anumit tip de bacterie. -

Loeffler: bacil difteric Lowenstein: Mycobacterium tuberculosis

Mediul selectiv: Inhiba dezvoltarea unor bacterii in detrimentul altora. Se deosebesc bacterii patogene de cele saprofite. -

slab selective: McConkey moderat selective: Hectoem inalt selective: Chapman cu telurit: bacil difteric

Mediul de imbogatire: se dezvolta o anumita specie de bacterie in detrimentul alteia -

Chapman: stafilococ Selenit: Salmonella

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 21

30. Definiti notiunea de mediu diferential; exemple Bacteriile se diferentiaza pe baza unui singur caracter: geloza sange: bacterii saprofite de stafilococ β - hemolitic AABTL: lactozo+ (E.Coli) de lactozo- (Salmonella) Chapman: manito+ (stafilococ auriu) de manito- [prezenta/absenta zaharului MANITA] 31. Ce este o colonie bacteriana? Cum se pot obtine colonii bacteriene izolate? O colonie bacteriana este o micropopulatie ce rezulta din înmultirea unui singur microb pe un mediu, vizibila în general cu ochiul liber. Introducerea mediilor de cultura solide a însemnat un progres urias în tehnicile de diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distincta a microbilor, sub forma de colonii izolate. Cel mai simplu mediu solid este geloza simpla, ce se obtine prin adaugarea la bulion a unei substanta gelificabile, care de regula este geloza, un polizaharid obtinut din alga marina agar-agar. La aceast mediu simplu se pot adauga diferite ingrediente (sânge de oaie, ser, ascita, extract de drojdie etc.) pentru a putea cultiva bacteriile pretentioase. Caracterele culturale sunt foarte importante în identificarea microbilor. Ele se apreciaza fie cu ochiul liber, fie cu ajutorul unei lupe. Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate si care se suspenda omogen în ser fiziologic se numesc colonii de tip S (smooth), pe când coloniile aceleiasi specii, cu suprafata rugoasa, relief si margini neregulate si care aglutineaza sponatan în ser fiziologic - colonii de tip R (rough). În general, cu unele exceptii, coloniile S apartin tupinilor virulente, pe când cele R sunt nevirulente. 32. Fazele dezvoltarii unei culturi bacteriene Faza de lag. În aceasta perioada nu se remarca o crestere a numarului de celule, cu toate ca ele cresc în volum si dovedesc o activitate metabolica intensa. Durata acestei faze variaza în functie de specie, conditiile de mediu, de numarul de celule din inocul si este intervalul de timp în care celulele se adapteaza noilor conditii de mediu. Faza exponentiala sau logaritmica este precedata de o faza de accelerare în care celulele bacteriene încep sa se înmulteasca din ce în ce mai repede. Celulele se divid constant prin fisiune binara, deci în progresie logaritmica, raportul dintre numarul bacteriilor si timp fiind liniar. Aceasta rata intensa de multiplicare este posibila doar in vitro, in vivo ea fiind mult frânata de mecanismele apararii antiinfectioase. Durata acestei perioade este dependenta de aceleasi conditii de mediu ca si faza precedenta dar si de specie. Astfel E.coli are un timp de generatie de aproximativ 10 minute iar Mycobacterium tuberculosis peste 25 ore Faza stationara. Multiplicarea bacteriilor în progresie logaritmica nu mai este posibila, rata de înmultire scade treptat pâna când bacteriile trec în faza stationara. Numarul bacteriilor ramâne constant, ele nici nu se înmultesc si nici nu mor. În aceasta faza, celulele nu mai cresc, ci are loc o activitate metabolica endogena, prin care celula îsi sintetizeaza rezerve de energie si produsi intermediari necesari mentinerii în viata în noile conditii.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 22

Faza de declin care dureaza mai multe zile se caracterizeaza prin scaderea numarului de bacterii, remarcându-se o divergenta între curba care ilustreaza numarul total de bacterii si cea care reprezinta bacteriile vii. Ea se datoreaza scaderii substantelor nutritive si acumularii de substante toxice pentru bacterii. Modificarile morfologice sunt pregnante atât în ceea ce priveste forma, dimensiunile cât si caracterele tinctoriale. 33. Aspectele culturilor bacteriene pe medii solide; corelatii intre acestea si patogenitate; exemple Aspectul culturilor pe mediile solide Dimensiunea - Mari, >2mm (Staphylococcus spp, K. pneumoniae) - Medii 1-2 mm( Streptococcus pyogenes) - Mici ,1mm ( Streptococcus viridans) - Foarte mici( Mycoplasma, Ureaplasma) •

Bacteriile si fungii facultativ anaerobi se dezvolta in toata masa de lichid, tulburandu-l

•

Bacteriile strict aerobe se dezvolta la suprafata mediului

•

Tulpinile care pe medii solide formeaza colonii tip S , tulbura omogen mediul, tulpinile care formeaza colonii R tulbura mai putin omogen, sau pot lasa mediul limpede formand flocoane care se depun, sau un strat, val

•

Se mai poate remarca pigmentogeneza sau aparitia unui miros caracteristic

Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numaratoarea de germeni întrun anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece în multe infectii criteriul de implicare etiologic este numarul bacteriilor în produsul de examinat (infectii urinare). 34. Aspectele culturilor bacteriene pe medii lichide corelatii intre acestea si patogenitate; exemple Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide difera. Astfel, bacteriile apartinând familiei Enterobacteriaceae tulbura uniform mediul, altele, ca de pilda bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia) formeaza pelicule la suprafata mediului. Altele formeaza agregate care se dezvolta sub forma de grunji ce se depun pe peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus). Unele bacterii secreta în mediu pigmenti difuzibili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps.aeruginosa). Unele medii de lichide au ca factor electiv anumite substante, ca, de exemplu, selenitul acid de sodiu, care permite dezvoltarea salmonelelor din materiile fecale.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 23

35. Sisteme de culturi continue; definitii si exemple (?!)

36. Definiti notiunile de asepsie si antisepsie; exemple de antiseptice; aplicatii Antisepsia consta în aplicarea unor substante bactericide sau bacteriostatice în scopul de a omorâ sau inhiba dezvoltarea florei patogene la nivelul tegumentelor, mucoaselor, plagilor. Asepsia cuprinde toate masurile care împiedica contaminarea cu agenti infectiosi a unei plagi. Antisepticele sunt substante cu actiune bacteriostatica, uneori bactericida, putând fi aplicate pe tegumente sau ca spalaturi ale unor mucoase (vaginala, uretrala, otica etc.). Aceeasi substanta poate fi antiseptic sau dezinfectant în functie de concentratie. Ca antiseptice se folosesc mai frecvent: • acidul boric: 2-3% în solutii apoase, 10% în unguente si 0,005 - 1,6% pentru colire. Nu se aplica sugarilor, pentru ca este toxic si nu se aplica pe plagi întinse, • acidul acetil glacial: diluat 28 -32% se utilizeaza în dermatologie si stomatologie ca antiseptic, astringent, cauterizant si antifungic. 37. Definiti notiunile de spreilizare si dezinfectie; exemple de dezinfectante; aplicatii Dezinfectantele sunt substante puternic bactericide la concentratii relativ scazute, folosite la decontaminarea obiectelor si încaperilor. Dupa folosirea de catre Lister a fenolului pentru dezinfectia salilor de operatii, s-a convenit ca acest compus sa fie socotit dezinfectantul standard, cu toate ca actioneaza în concentratii mai mari decât majoritatea dezinfectantelor folosite astazi. Sterilizarea-distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafata sau dintr-un mediu(lichid sau solid).prin sterilizare se realizeaza asepsia. Dezinfectia-distrugerea formelor vegetative microbiene(uneori si a sporilor) din anumite medii (lichide,solide) sau de pe suprafete.Se realizeaza cu ajutorul unor agenti fizici sau cu ajutorul substantelor dezinfectante.(realizeaza antisepsia) Dezinfectante-substante toxice sau iritante pentru tesuturile vii ,puternic germicide, care se utilizeaza pentru decontaminarea obiectelor si suprafetelor(in functie de concentratie unele dezinfectante pot fi folosite si ca antiseptice) Exemple:alcoolii,halogenii(clor iod),fenolii,compusi cuaternari de amoniu,aldehide(glutaraldehida,formaldehida),peroxizii(apa oxigenata,acid peracetic) 38. Antiseptice si dezinfectante. Mecanisme de actiune In functie de mecanismul de actiune se clasifica in: a. Substante care denatureaza proteinele: alcoolul etilic 70-95%, utilizate atat ca antiseptice cat si ca dezinfectante Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 24

b. Substante care oxideaza gruparile libere ale enzimelor : hipermanganat de potasiu 1 o/oo, peroxid de hidrogen 3%, halogenii: hipocloriti, lugol, betadina c. Substante care lezeaza membranele celulare: fenoli, detergenti anionici (sapunuri), detergenti cationici (saruri cuaternare de amoniu) d. Substante care altereaza acizii nucleici: coloranti bazici (Al de metilen, fucsina bazica, violet de gentiana), rivanol

39. Sterilizarea prin caldura umeda; metode, presiune, temperatura, aplicatii Caldura umedaa este mai eficienta decât caldura uscata, distrugând bacteriile la o temperatura mai scazuta si timp mai scurt. Formele vegetative a majoritatii bacteriilor, fungilor si virusurilor animale sunt omorâte de caldura umeda în 10 minute la temperaturi cuprinse între 50 oC (Neisseria gonorrhoeae) si 65oC (Staphylococcus aureus) Omorârea microorganismelor prin caldura umeda se produce prin coagularea proteinelor structurale si inactivarea enzimelor, cu participarea apei. Cei mai rezistenti spori sunt distrusi prin expunere la caldura umeda la 121o timp de 30 de minute. • fierberea este de fapt o metoda de dezinfectie deoarece ea nu distruge toate formele sporulate. Se efectueaza la 100oC timp de 1/2 de ora si se aplica siringilor si instrumentelor de mica chirurgie • pasteurizarea: consta în încalzirea lichidului la 62°C pentru 30 de minute (pasterurizare joasa), 71oC 15 minute (pasteurizare medie), 80-85o 3-5 minute (pasteurizare înalta) sau introducerea unor vapori filanti la o temperatura de 130 -150oC sub presiune pentru câteva secunde, este o metoda eficienta deoarece bacteriile patogene care se pot dezvolta în lapte (Mycobacterium tuberculosis, Salmonella, Streptococcus si Brucella) nu sunt bacterii sporulate, numarul lor reducându-se dupa pasteurizare cu 97-99% •tyndalizarea consta în încalzirea produsului de sterilizat 3 zile la rând, în baie de apa la 56100oC câte o ora. •autoclavarea este metoda folosita pentru instrumentarul de chirurgie iar în laboratoarele de microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultura si a materialului infectios. Sterilizarea are loc într-o atmosfera saturata de vapori de apa la 121oC, la o presiune de 1 atm, timp de 20-30 de minute, în aparate speciale numite autoclave sau la 134 oC, la o presiune de 2 atm. 10-15 minute.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 25

40. Autoclavarea – principiu, parametrii, tehnici, utilizari Autoclavarea este metoda folosita pentru instrumentarul de chirurgie iar în laboratoarele de microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultura si a materialului infectios. Sterilizarea are loc într-o atmosfera saturata de vapori de apa la 121oC, la o presiune de 1 atm, timp de 20-30 de minute, în aparate speciale numite autoclave sau la 134 oC, la o presiune de 2 atm. 10-15 minute. Autoclavul are ca piesa principala un cazan su pereti rezistenti care se inchide etans si in interiorul caruia, vaporii de apa sunt comprimati la presiunea necasare sterilizarii.Exista mai multe tipuri de autoclave. Prin autoclavare se pot steriliza-substante in solutie,sticlarie(cu exceptia pipete si lamele),materiale contaminate de laborator,instrumentare chirurgical(metalic,cauciuc sau bumbac),medii de cultura,aparate de filtrat. 41. Sterilizarea prin caldura uscata; metode, presiune, temperatura, aplicatii Caldura uscata omoara microorganismele prin oxidarea distructiva a componentelor celulare. Cei mai rezistenti spori sunt distrusi de caldura uscata la 160o, timp de 60 de minute. Caldura uscata de 100o C distruge în 60 de minute bacteriile care sunt omorâte prin calduraa umedaa la 60oC în 30 de minute. Sporii fungilor sunt distrusi în 60 de minute la 115 oC, iar cei bacterieni la temperaturi cuprinse între 120-160oC. În laboratorul de microbiologie se utilizeaza urmatoarele tehnici de sterilizare: • încalzirea la rosu în flacara a obiectelor se aplica anselor bacteriologice în laboratorul de microbiologie; • flambarea (trecerea prin flacara pentru câteva secunde) se aplica gâtului baloanelor, eprubetelor dupa deschiderea si înainte de închiderea lor, pipetelor înainte de utilizare pentru a preveni contaminarea cu germenii din aer. Se mai sterilizeaza prin flambare instrumente de mica chirurgie, dupa ce se stropesc cu alcool, dar temperatura produsa nu este suficient de înalta pentru a asigura o sterilizare optima; • sterilizarea la pupinel. Pupinelul sau cuptorul cu aer cald este o cutie metalica cu pereti dubli între care se gaseste un strat de azbest care împiedica pierderile de caldura, o sursa de caldura care este energia electrica si un termoregulator. În interior pupinelul este prevazut cu rafturi pentru obiectele de sterlizat. Temperatura de sterilizarea la pupinel este de 180 oC timp de o ora. La pupinel se sterilizeaza întreaga sticlarie de laborator, instrumentarul de stomatologie, seringi fara armatura metalica, pudre, uleiuri etc. Pupinelul nu trebuie sa fie supraîncarcat, pentru ca aerul sa poata circula nestingherit printre obiectele de sterilizat. • sterilizarea cu raze infrarosii este folosita pentru sterilizarea seringilor faraa armaturaa metalicaa la o temperatura de 180oC. Sterilizarea se poate efectua ssi la 200oC în vid, aplicându-se instrumentelor chirurgicale.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 26

42. Congelarea si liofilizarea bacteriilor – definitie, efecte asupra viabilitatii germenilor, aplicatii - temperaturile joase au in general un efect bacteriostatic. La temperaturi scazute, reactiile biochimice incetinesc, multiplicarea este stopata. In functie de viteza de racire avem situatii diferite. a) CONGELAREA LENTA – la temperaturi superioare celei de -21,3; are efecte bactericide prin formarea de cristale de gheata si prin hiperconcentratie salina cu denaturarea proteinelor. b) CONGELAREA BRUSCA la -70 are efect de conservare a bacteriilor prin solidificare in masa a apei fara aparitia cristale de gheata. c) LIOFILIZAREA (criodesicarea) reprezinta congelarea brusca concomitent cu desicatia (deshidratarea in vid). O suspensie microbiana , in mediu protect, liofilizata poate fi pastrata in fiole inchise timp indelungat (vaccinul BCG). 43. Bacteriofagii – definitie, structua, tipuri de intearctiune fag – bacterie (enumerare) Bacteriofagii : Sunt virusuri care pazaritează bacteriile. Se cunosc 6 grupe morfologice de bacteriofagi, cei mai bine studiaţi fiind bacteriofagii T ai bacilului coli. Bacteriofagii sunt formaţi dintr-un cap hexagonal, un gât şi o prelungire numită picior (coadă). Capul este alcătuit dintr-un înveliş proteic caracteristic virusurilor (capsida) şi adăposteşte ADN. Coada este un cilindru rigid învelit într-un manşon proteic asemănător miozinei şi se termină cu o placă hexagonală ce conţine o enzimă de tipul lizozimului. De placa bazală se aprind 6 fibre cu rol în fixarea bacteriofagului pe suprafaţa bacteriei. Relatii bacterie–bacteriofag: sunt 2 tipuri: de tip litic/productiv; de liogenizare/de tip reductiv. Sunt strict specifice si sunt mediate de receptori. 44. Interactiunea fag – bacterie: ciclul litic (etape, evidentiere) 1. Atasarea: atasarea este specifica, exista receptori(R) strict specifici la nivelul fagului ce recunosc receptorii de la nivel bacterian. Fixarea pe R este initial reversibila ( prin fibrele cozii), apoi ireversibila (prin crosetele placii bazale) 2. Penetrarea: fagul elibereaza muramidaza care lizeaza mureina. Teaca cozii se contracta si antreneaza cilindrul axial injectarea ADN fagic in citoplasma bacteriana; 3. Multiplicarea – dupa 4 min ADN-ul bacterian este blocat, functia este preluata de ADN fagic. 4. Maturarea (asamblarea) fagului; 5. Liza bacteriana si eliberarea fagului matur, virulent. EVIDENTIERE: - in mediu lichid (tulbure), inocularea fagului duce dupa un timp la limpezirea mediului – pe mediu solid – insamantat uniform, apare o zona de liza, clara, bine circumscrisa (plaja de liza). Bact lizosensibile permit adsorbtia, penetrarea si multiplicarea fagilor pana la realizarea lizei celulare.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 27

45. Interactiunea fag – bacterie: ciclul lizogen, proprietatile bacteriilor lizogene Dupa atasare si penetrare, ADN fagic: - fie se integreaza liniar in cromozomul bacteriei gazda si se replica sincron cu aceasta; fie se circularizeaza si atasat de membrana citoplasmatica se replica sincron cu diviziunea bacteriana. Bacteria a devenit lizogena, se reproduce si transmite descendentilor fagul latent (profag, fag temperat); in anumite conditii el poate deveni fag virulent. Proprietatile bacteriilor lizogene: 1. este imuna fata de un fag omolog profagului 2. pot aparea fenomene importante dpdv genetic: transductia, conversia, recombinarea genetica (bact parazitata de 2 fagi diferiti, dar inruditi), inductia fagica (sub infl ag inducori ex raze UV sau spontan profagul isi recastiga virulenta—>fag virulent liza bact. Bact lizorezistente nu permit infect cu un fag fie datorita lipsei R specifici, fie datorita unei stari de imunitate. Bact lizogene sunt imune la fagii virulenti omologi profagului. 46. ADN bacterian; localizare, structura, rol Genomul viral este constituit fie dintr-o moleculă de ADN, fie din ARN dispusă helical, lineară sau circulară, monocatenară sau bicatenară. În structura ADN intră dezoxiriboza, adenina, guanina, citozina, timina şi radicalul fosfat. În structura ARN intră riboza, adenina, guanina, citozina, uracilul şi radicalul fosfat. Nucleotidele sunt legate între ele prin legături fosfodiesterice. Un virus este alcătuit dintr-un înveliş proteic numit capsidă şi un miez de acid nucleic. Miezul de acid nucleic este constituit din ADN sau ARN, niciodată ambele (ADN la dezoxiribovirusuri şi ARN la ribovirusuri). ADN poate fi dublu catenar, linear sau circular sau dublucatenar linear. ADN bacterian nu este complexat cu proteine histonice, dar la unele grupe bacteriene ADN este asociat cu proteine bazice asemănătoare histonelor. Se presupune că aceste proteine au rol în neutralizarea încărcăturii negative a grupărilor fosfat ale ADN, asigurându-i stabilitatea. Din punct de vedere chimic nucleoidul este un complex ADN-ARN-proteine (80% ADN, 10% ARN – ARNr şi ARNm şi 10%proteine – ARN polimerază). Rol: depozitarea informatiei genetice; replicarea; transcrierea si traducerea genetica; protejarea materialului genetic propriu; reglarea si controlul activitatii celulare. 47. Replicarea ADN bacterian; mecanism Structura dublu spiralată a ADN permite replicarea lui identică, semiconservativă. Spirala se deschide ca un fermuar la locul iniţial al replicării sub acţiunea unei ADN-giraze. Pe fiecare spirală se va sintetiza o spirală nouă, complementară, cu participarea ADN - polimerazei (I, II, III) din direcţia capătului 5' terminal spre capătul 3' terminal.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 28

48. Plasmidele; definire, tipuri, roluri in celula bacteriana Plasmidele sunt formaţiuni genetice autonome, extracromozomiale, libere în citoplasmă, reprezentate de molecule circulare de ADN care se replică independent de cromozom. Plasmidele pot fi: • conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de exemplu plasmidele de rezistenţă la antibiotice R, • neconjugative, care nu pot părăsi ele însăşi bacteria de origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codifică secreţia de beta-lactamază la S.aureus) • episomi, care se pot integra prin recombinare în cromozomul bacterian, pierzându-şi astfel autonomia de replicare. Un exemplu de episom este factorul de sex F (plasmidul F sau factorul de fertilitate). 49. Factorul F si factorul R; definitie, roluri Plasmidele R -de rezistenţă la chimioterapice (Factorul R) sunt molecule circulare de ADN care constau în esenţă din două regiuni genetice distincte: genele care codifică rezistenţa la antibiotice “R”, care pot fi unice sau multiple şi genele care conferă plasmidului capacitatea de a se transfera “FTR”. Rezistenţa la peste 90% din tulpinile de spital este de natură plasmidică. Existenţa acestor plasmide se explică prin aglomerarea mai multor gene de rezistenţă R, pe acelaşi plasmid, prin fenomenul transpoziţiei repetate de material genetic. Plasmide de rezistenţă au fost evidenţiate la genurile Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia, Klebsiella, Serratia din familia Enterobacteriaceae, la genurile Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Yersinia, Pasteurella, Campylobacter, Haemophilus, Neisseria, Bacteroides, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, şi Corynebacterium. Plasmidele prezente la bacilii gramnegativi sunt mai mari decât cele evidenţiate la bacteriile gram-pozitive. Plasmidul F se mai numeşte şi plasmid de sex, sau factor de fertilitate ( factor F) şi conţine, pe lângă alţi determinanţi genetici, genele de transfer tra. Plasmidul F se poate transmite altor celule bacteriene prin conjugare. El se poate integra în cromozomul bacterian putând media transferul de gene cromozomiale de la o celulă bacteriană donor la cea receptor. În funcţie de prezenţa factorului F, bacteriile se împart în: • bacterii F- lipsite de factorul F, denumite celule femele şi care sunt receptoare de material genetic, • bacterii F+, masculine, care au factorul F+, autonom, ca plasmid în citoplasmă şi care sunt celule donoare, • bacterii Hfr care au factorul F+ integrat în cromozom, de asemenea masculine, • bacterii F ‘ care au factorul F+ ca plasmid autonom, după ce acesta a fost integrat în cromozom şi l-a părăsit rupând un fragment ADN din cromozom. •i aceste celule dunt donoare, deci masculine. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 29

50. Definiti notiune de genom, genotip si fenotip; variabilitatea genetica si fenotipica Genomul = suma genelor din organism. Totalitatea info genetice a unui organism = genotip. Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip in interactiune cu mediul ambiant = fenotip. Variabilitatea fenotipica: reprezinta modificarile morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat. Variabilitatea genotipica: reprezinta modificarile definitive ale materialului genetic (cromozomiale sau extracromozomiale) care se transmit descendentilor. Mecanisme: mutatie ; transfer genetic urmat de recombinarea genetica.

51. Mutatiile la bacterii; definitie, tipuri de mutatii, clasificare Modificările spontane ale genomului se numesc mutaţii şi constau din modificarea secvenţei de nucleotide dintr-o genă. Ele pot fi punctiforme, inversii, inserţii, deleţii şi mutaţii secundare. Mutaţiile punctiforme afectează un singur nucleotid în cadrul unei gene şi sunt reversibile. • înlocuirea unui codon cu altul, ceea ce se va traduce prin înlocuirea unui aminoacid cu altul din structura unui polipeptid. Această mutaţie se numeşte “mutaţie cu sens greşit”, • apariţia unui codon nonsens. Mutaţia nonsens împiedică sinteza în continuare a unui polipeptid, iar dacă ea se produce la începutul genei ce codifică un polpeptid - mutaţie polară, acesta nu se va mai putea sintetiza deloc. Inserţia şi deleţia înseamnă adăugarea, respectiv pierderea a două până la sute sau chiar mii de nucleotide, procesul fiind ireversibil. Acest tip de mutaţie duce la modificarea importantă a secvenţei de aminoacizi, fiind denumită “mutaţie cu schimbare de proiect”. Mutaţiile secundare sunt mutaţiile reverse, care restabilesc o secvenţă nucleotidică ce s-a modificat, iar mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a unei gene care a suferit o mutaţie, fără restaurarea codonilor iniţiali. Acest fenomen se explică prin sinteza unui ARNt care “ştie” să citească un codon nonsens. Frecvenţa pe unitatea de timp cu care se produc mutaţiile este diferită şi se numeşte rată de mutaţie. Mutaţia spontană variază de la genă la genă între 10 -6 şi 10 -10. MUTATII REGRESIVE (retromutatii) – afecteaza celulele mutante, determinand revenirea acestora la tipul initial. MUTATII SUPRESOARE – permit exprimarea functiilor anterioare ale genei, desi o modificare a secventei bazelor nucleotidice persista. MUTATIA SPONTANA – apare in conditii d mediu obisnuite si fara interventia unui factor decelabil MUTIA INDUSA – care se produce sub actiunea unor factori fizici (radiatii, raze UV) sau chimici care actioneaza ca agenti mutageni. MUTATIILE EXTINSE – alterari care depasesc limitele unui codon, putand afecta secvente mai mari ale uneia sau mai multor gene. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 30

52. Transformarea la bacterii; definitie, mecanism Reprezintă transferul de material genetic de la o celulă donor la una receptor sub forma de ADN pur, eliberat fie prin liza celulei donor, fie prin extracţie chimică. Acest proces a fost observat pentru prima oară la pneumococi de Griffith în 1928. ADN-ul pneumococilor virulenţi, capabili să sintetizeze capsula, s-a transferat la mutante R, nevirulente, acestea din urmă dobândind capacitatea de a sintetiza capsula. Transformarea s-a pus în evidenţă ulterior la numeroase genuri cum sunt, de pildă, Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, Neisseria, Salmonella etc. şi se petrece nu numai între tulpiile aceleiaşi specii, ci şi între specii diferite. Transformarea genetică este posibilă numai dacă bacteria receptoare se află în stare de competenţă, stare care-i permite înglobarea de ADN străin. Competenţa este o stare fiziologică temporară a bacteriei, care variază în funcţie de specie şi de faza de multiplicare în care se află bacteria. După unii autori, celulele competente au pe suprafaţa lor un antigen special numit factor de competenţă. În timpul stării de competenţă se modifică structura peretelui celular, care devine mai poros, încărcat electropozitiv, favorizând legarea ADN-lui străin. 53. Transductie; definitie, mecanism, tipuri de transductie Transducţia reprezintă un transfer de gene cromozomiale de la o celulă bacteriană la alta, mediat de bacteriofagi. Unii bacteriofagi sunt capabili să transfere orice genă bacteriană (transducţie generalizată) iar alţii numai anumite gene (transducţia specializată). Transducţia generalizată este mediată de fagii virulenţi, litici, care după pătrunderea în celula bacteriană se multiplică şi determină liza celulei gazdă. În timpul lizei celulei bacteriene cromozomul acesteia se fragmentează. Se poate întîmpla, ocazional, ca un fragment cu o dimensiune apropiată de cea a genomului fagic să se integreze în capisda bacteriofagului, în locul genomului fagic. Astfel de fagi sunt defectivi şi nu se vor mai putea replica, dar pot pătrunde în alte celule bacteriene injectîndu-le ADN-ul, ce provine de fapt din genomul celulei donoare. ADN-ul se va integra în cromozomul celulei receptoare prin recombinare, conferindu-i acesteia caractere noi, ca, de exemplu, rezistenţa la chimioterapice, proprietăţi ce ţin de patogenitatea bacteriei etc. Transducţia specializată este mediată de fagii temperaţi. După pătrunderea în celula bacteriană a ADN-lui bacteriofagului temperat, acesta suferă iniţial un proces de circularizare după care se inseră în cromozom prin recombinare sub forma de profag. Inserţia în cromozom se face pe baza homologiei dintre 10 perechi de bază ale ADN fagic şi bacterian. Profagul devine parte integrantă a cromozomului bacterian, se va replica o dată cu acesta şi nu independent, deoarece este supus unui proces de represie din partea genomului gazdă. Bacteriile care au integrate în cromozomul lor un profag sunt în stare de lizogenie. În anumite condiţii, însă, are loc un proces de derepresie şi genomul bacteriofagic părăseşte cromozomul bacterian devenind din nou autonom. Când părăseşte cromozomul bacterian poate detaşa din acesta un fragment de ADN care va rămâne legat de genomul bacteriofagic. Acest bacteriofag nu se va putea înmulţi, fiind defectiv, dar va putea intra în altă celulă integrându-se în cromozomul acesteia tot sub forma de profag. Fragmentul provenit de la Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 31

prima celulă bacteriană poate să codifice diferite caractere (rezistenţa la antibiotice, secreţia unor enzime, toxine etc.), ce se vor manifesta fenotipic la noua bacterie gazdă. Cel mai bine studiat exemplu de transducţie specializată este cea mediată de fagul lambda şi gena bacteriană ce codifică degradarea galactozei (lambda-gal). Transducţia specializată nu trebuie să se confunde cu conversia lizogenă. In acest caz caracterul nou al celulei bacteriene este codificat chiar de genomul bacteriofagului temperat. Fenomenul a fost descris pentru prima oară, aşa cum am mai arătat, la Corynebacterium diphteriae, toxigeneza fiind tributară prezenţei unui fag temperat în cromozomul bacterian. 54. Conjugarea bacteriana Reprezinta un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau extracromozomial) prin efectuarea unei legaturi intre celule. Prin intermediul factorului F+ inserat în cromozom se poate transfera o copie întreagă a cromozomului celulei donoare la cea receptoare. Conjugarea la bacilii gram negativi. Transferul prin conjugare a plasmidelor este condiţionată de prezenţa în plasmid a genelor de transfer tra, care sunt responsabile de sinteza sex-pilului şi de transferul plasmidului. Conjugarea începe prin sinteza sex-pilului care va adera de receptori specifici prezenţi pe peretele celular al bacteriei receptoare. După formarea legăturii dintre celula donor şi cea receptor are loc replicarea de transfer a plasmidului. O catenă parentală de ADN va rămâne în celula donor, iar a doua va trece în celula receptoare, pe tiparul lor sintetizându-se catene complementare. Din punct de vedere medical importante sunt plasmidele conjugative de rezistenţă - plasmidele R. • frecvenţa transferării: frecvenţa transferului multor plasmide sălbatice pe receptori adecvaţi este relativ scăzută 10-4/ cel. Dacă se incubează donorii şi receptorii împreună mai multe ore, numărul de celule recombinante cresc; • spectrul de gazde: plasmidele transferabile R circulă între specii diferite. Dar nu exista transfer intre bacterii G+ si GConjugarea la bacterii gram-pozitive S-au descris procese de împerechere şi la bacteriile gram-pozitive ca, de pildă, la genurile Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, procesul bazându-se pe performanţa celulei receptoare. Celula receptoare produce un peptid cu mol. mică (GM=1000 daltoni) care determină sinteza unor substanţe proteice de agregare de către celula donoare cu afinitate pentru unele substanţe adezive de pe suprafaţa receptorului. Se produce astfel o legătură strînsă între Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 32

receptor şi donor cu formarea unei punţi intercelulare care permite transferul de material genetic. Prin analogie cu substanţele atrăgătoare la insecte peptidul ce induce substanţa de agregare a fost desemnat ca sexpheromon.

55. Substante antibiotice si chimioterapice; definitie, utilizari in clinica si laborator In trecut chimioterapicele erau substantele antimicrobiene din sinteza chimica si antibioticele erau cele secretate de unele bacterii si mucegaiuri. Acum un atibiotic este o substanta de origine biologica, semisintetica sau sintetica care are activitate electiva impotriva bacteriilor si astfel poate fi utilizata in tratamentul infectiilor. Conditii pentru un atibiotic ideal:       

Spectru larg de activitate, poate distruge sau inhiba multe specii de microorg. patogene Absenta toxicitatii pentru gazda Absenta efectului alergizant pentru gazda Absenta efectelor de eliminare a florei normale din organismul gazdei Capacitatea de a accesa zonele anatomice in care se dezvolta infectia Stabilitate chimica Inductor slab al rezistentei microorg.

In clinica sunt utilizate in vederea combaterii infectiilor (nu trebuie folosite abuziv sau fara interpretarea corecta a datelor de laborator). In laborator antibioticele sunt testate pentru a se observa daca unele tulpini bacteriene mai sunt sau nu sensibile la acestea. 56. Antibiotice bactericide si bacteriostatice – exemple Bactericid = actiunea antibioticelor duce la distrugerea bacteriilor. Exemple: penicilina, vancomicina, cefalosporine, bacitracina Bacteriostatic = antibiotice care opresc multiplicarea bacteriana. Exemple: tetraciclina, eritromicina, sulfamidele 57. Clasificarea antibioticelor dupa mecanismul de actiune – exemple 1. 2. 3. 4.

Inhibitori ai sintezei peretelui celular: beta lactamice (penicilina, cefalosporine) Inhibitori ai functiei membranei celulare: polimixinele (B, E) Inhibitori ai sintezei proteice la niv. ribozomilor: tetracicline, aminoglicozidele Inhibitori ai sintezei acizilor nucleici: rifampicina, sulfamide

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 33

58. Clasificarea antibioticelor dupa structura chimica – exemple 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)

Beta lactamice: peniciline, cefalosporine Aminoglicozidele: streptomicina Cicline: tetraciclina Ansamicinele: rimfapicina Macrolidele: eritromicina Polipeptide ciclice: bacitracina Care nu se incadreaza

59. Rezistenta la actiunea antibioticelor. Definitii, tipuri Definitie: rezistenta la antibiotice reprezinta capacitatea unor microorganisme de a supravietui si a se multiplica in prezenta antibioticelor Poate fi: naturala (determinata genetic) si/sau dobandita; cromozomiala si/sau extracromozomiala Tipuri: A. Dupa nr. de antibiotice la care este rezistenta bacteria: - monovalenta - plurivalenta B. Dupa tipul de antibiotice la care este rezistenta - directa (1 bacterie se leaga de un antibiotic) - incrucisata (1 bacterie este rezistenta fata de mai multe antibiotice asemanatoare) C. Dupa ritmul de instalare: - Rapid: streptomicina - Intermediar: eritromicina - Lent: penicilina - Foarte lent: vancomicina 60. Antibiograma difuzimetrica = metoda calitativa a antibiogramei = metoda Kirby Bauer 1. Mediul de cultura: agar Mueller – Hinton (nu contine subst. cu actiune inhibitoare). - pentru anumite tulpini se pot adauga Ca2+, Mg2+ - pH neutru: 7.2-7.4 - grosime: 4 mm (25 ml mediu/9 cm placa) 2. Inoculul - din 5 colonii izolate = cultura pura (1 celula -> 1 colonie) - turbiditate = 0,5 unitati McFarland Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 34

3. Timp de incubare - 37 grade C => 18-20h 4. Microcomprimatele cu antiobiotic - diametru: 6 mm - 8 comprimate/placa => 8 zone de inhibitie - depunere: manuala, automana (dispencer) 5. Interpretare: masurarea zonei de inhibitie in mm => corelatii cu tabel Tehnica de lucru -

inocularea unei bacterii intinderea bacteriei pe placa depunerea comprimatelor antibioticul difuzeaza => se formeaza cercuri. Daca nu exista cercuri => zona de inhibitie este de 6 mm, nu de 0 mm! citire cu rigla => comparare cu tabel = CRITERIUL pentru determinarea antibiogramei

61. Definiti notiunea de CMI si CMB. Cum se determina si care este utilitatea. CMI = concentratia minima inhibitorie. Cea mai mica concentratie de antibiotic care determina inhibitia dezvoltarii unei culturi bacteriene. => efect bacteriostatic CMB = concentratia minima bactericida. Cea mai mica concentratie de antibiotic care determina distrugerea bacteriilor => efect bactericid Determinarea CMI a. in mediu solid - se face prin metoda E-Test asemenea metodei difuzimetrice - metoda E- test exprimă direct, cantitativ, prin valori CMI, gradul de sensibilitate microbiană - se adauga pe mediu un strip de plastic, marcat pe scara valorilor MIC în µg/ml. - dupa difuzia antibioticului se citeste diametrul zonei de inhibitie pe striperul de plastic - se compara cu tabel b. in mediu lichid - in bulion Mueller-Hinton se prepara dilutii binare de antibiotic (descrescator) - in fiecare tub se adauga cant. fixa de inocul - se folosesc martori+ si martori- incubare 18-20h, 37 grade C - ultimul tub ramas limpede = CMI Determinare CMB -

se fac treceri pe medii solide din tuburile ramase vizibil limepezi (de la det. CMI)

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 35

-

CMB corespunde ultimei concentratii de antibiotic care a determinat distrugerea completa a bacteriilor (efect bactericid)

Indicatiile determinarii CMI: Infectii sistemice, grave: septicemii, endocardite, meningite purulente, osteomielite etc. 62. Definiti notiunile de simbiozia, comensalism, parazitim; exemple Între organismul uman si microorganisme (bacterii, virusuri, fungi, protozoare) se stabilesc relatii care pot fi de comensalism, mutualism si parazitism. Comensalismul este o asociatie în care un microorganism foloseste ca mediu de viata un alt organism fara sa-l prejudicieze. Omul este gazda unei flore comensale foarte bogate, prezenta pe piele, mucoase, tract digestiv etc. si care alcatuieste flora normala. Simbioza (Mutualismul) este o relatie care se stabileste în beneficiul ambilor parteneri ai asociatiei. De exemplu, între bacilii lactici si gazda umana exista un beneficiu reciproc: vaginul ofera conditii de viata bacililor lactici iar acestia la rândul lor acidifica, mediul împiedicând dezvoltarea altor microorganisme. Parazitismul este o relatie care se stabileste în mod cert în beneficiul microorganismului si în detrimentul gazdei umane. Din aceasta categorie fac parte microorganismele patogene. Parazitismul consta în folosirea unei specii de catre o alta specie ca habitat. Exista multe forme de parazitism între microorganisme, dar din punct de vedere medical importante sunt virusurile care paraziteaza bacterii (bacteriofagii). Prin relatiile care se stabilesc între bacteriofagi si celulele parazitate se pot raspândi diverse caractere, dintre care de interes medical sunt cele legate de patogenitatea si rezistenta la antibiotice ale bacteriilor. Subliniem, însa, ca acestor tipuri de relatii nu le corespund grupe taxonomice fixe de microorganisme, deoarece relatiile ce se stabilesc depind în egala masura de gazda umana. Astfel, în anumite conditii, relatia de comensalism sau mutualism poate sa se transforme într-o relatie de parazitism cu efecte nefavorabile asupra gazdei. Asadar, microorganismele nu se pot clasifica rigid din punct de vedere al patogenitatii, deoarece în anumite conditii acelasi microorganism stabileste relatii diferite cu gazda umana.

63. Definiti patogenitatea si virulenta; exemple de factori de patogenitate Patogenitatea este un proces complex si multifactorial, care cuprinde totalitatea mecanismelor biochimice prin care microorganismele produc infectii. Ea este dependenta atât de microorganism cât si de gazda în care acesta patrunde. În timp ce unele microorganisme (patogene) produc în mod obisnuit infectii la indivizii neimunizati dar cu rezistenta naturala intacta, altele (oportuniste) produc infectii doar la indivizi cu barierele apararii naturale compromise. Virulenta este gradul de patogenitate a unei tulpini în cadrul speciei. Spre deosebire de patogenitate, care este un caracter de specie, virulenta este un caracter de tulpina. De exemplu, în cadrul speciei Corynebacterium diphteriae exista specii toxigene virulente si netoxigene, deci nepatogene. Chiar si între tulpinile toxigene exista o diferenta în ceea ce priveste cantitatea de toxina secretata. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 36

S-a observat ca tulpinile de bacil Koch izolate de la pacienti din India sunt mai virulente pentru cobai decât cele izolate de la pacientii din Anglia. De asemenea, patogenitatea tulpinilor de pneumococ pentru soricelul alb variaza în functie de cantitatea materialului capsular. Exemplele sunt nenumarate. Virulenta unei tulpini microbiene se apreciaza prin comparatie cu o tulpina standard a carei virulenta este cunoscuta si se exprima prin DLM (doza letala minima) sau DL50 (doza letala medie). Doza letala minima este numarul total de germeni necesari sau cantitatea de toxina necesara pentru a omorî toate animalele dintr-un lot experimental, iar DL50 numarul de germeni sau cantitatea de toxina necesara pentru a omorî 50% dintr-un lot de animale experimentale. Pentru a produce o infectie, microorgansimele trebuie sa parcurga, în general, dar nu în mod obligatoriu, urmatoarele etape: • atasarea si patrunderea în organismul gazda; • invadarea locala sau generala a organismului; • multiplicarea în organismul gazda si secretia unor factori de patogenitate. FACTORI DE INVAZIE MICROBIANA : Diseminarea bacteriilor în organsim se poate face pe mai multe cai: • din aproape în aproape, prin intermediul unor exoenzime si a unor elemente structurale ale bacteriilor; • prin endocitoza si translocare; • pe cale sanghina sau/si limfatica.

64. Flora microbiana normala a organismului uman FLORA NORMALA A ORGANISMULUI În timpul vietii intrauterine, organismul este steril, fiind ferit de contaminarea ascendenta prin membranele fetale, iar placenta este impermeabila pentru majoritatea microorganismelor, cu exceptia unor virusuri (virusul rubeolic, citomegalic etc.), bacterii (Treponema pallidum) si paraziti (Toxoplasma gondi). Prima întâlnire a organismului uman cu microorganismele mediului înconjurator se produce în momentul nasterii, când fatul vine în contact cu flora vaginala si cutanata a mamei. Dupa nastere, organismul este supus unei contaminari continue. Unele din speciile cu care organismul vine în contact dispar foarte repede, iar altele colonizeaza pielea si suprafetele organismului ce vin în contact cu exteriorul, constituind flora normala a organismului. Organismul uman este populat de foarte multe de specii bacteriene si de un numar mai mic de virusuri, fungi si protozoare. Flora normala a organismului depinde de o serie de factori, cum sunt: vârsta, regimul alimentar, statusul hormonal, starea de sanatate, conditiile de igiena colectiva si personala. Este foarte dificila definirea exacta a speciilor care alcatuiesc flora normala, deoarece o serie de specii patogene pot fi si ele prezente temporar pe tegumente si mucoase, fara sa produca înbolnaviri. De exemplu, pneumococul si meningococul sunt bacterii patogene, fiind cauza unor infectii foarte grave. Totusi ele se gasesc la 10% din populatia sanatoasa. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 37

Zonele organismului populate în mod normal cu microorganisme sunt: pielea, tractul respirator superior (vestibul nazal, faringe), tubul digestiv (cavitatea bucala si intestinul gros), tractul urinar (partea anterioara a uretrei) si vaginul. În zonele intens colonizate, ca, de pilda, în intestinul gros, numarul de bacterii este de 1 x 1012/ml pe când în zonele cu flora mai redusa, cum sunt pielea, vaginul, numarul lor nu depaseste în mod normal 1 x 106/ml. În afara de aceste zone, microorganisme mai pot aparea în numar mic si în mod pasager în restul tractului respirator, digestiv si în uter, fiind rapid îndepartate de mijloacele de aparare ale organismului. Sângele, lichidul cefalorahidian, lichidele sinoviale, din seroase, tesuturile profunde sunt sterile. Prezenta microbilor în aceste zone are întotdeauna o semnificatie patologica. Pielea este populata de multe specii bacteriene, densitatea acestora fiind mai mare în zonele umede, cum sunt axila, zona perineala, zonele interdigitale si scalpul. Specia cel mai des întâlnita, care reprezinta 90% din flora cutanata aeroba este Staphylococcus epidermidis. Se apreciaza densitatea S.epidermidis la 103-104/cm2. În regiunile umede se poate întâlni si S. aureus. Speciile ce colonizeaza aceste cavitatea bucala si vestibulul nazal sunt, în general, streptococi, stafilococi, bacili difterimorfi, coci gram-negativi si mai rar ciuperci. Unele din aceste specii, ca, de exemplu, S.aureus, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Candida, sunt conditionat patogene. Stomacul contine doar ocazional flora bacteriana acidotoleranta (unii lactobacili si streptococi) data fiind aciditatea gastrica pronuntata. Frecvent se izoleaza de pe mucoasa gastrica Helicobacter pylori, care ar putea constitui cauza unor gastrite si a ulcerului duodenal. La personane la care se admnistreaza o medicatie ce schimba pH-ul continutului gastric, flora normala sufera modificari. Intestinul gros este cea mai populata zona cu microbi a organismului. Aici, peste 90% din flora este anaeroba, reprezentata mai ales de bacili apartinând genului Bacteroides, însotita de enterobacterii care sunt facultativ anaerobe, la care se adauga protozoare nepatogene, ca, de pilda Entamoeba coli. Uretra anterioara este populata la ambele sexe cu flora asemanatoare celei de pe piele: S. epidermidis, Enterococcus faecalis, difterimorfi etc. Flora vaginala variaza în functie de vârsta. Astfel, pâna la pubertate flora vaginala contine specii prezente pe piele, iar dupa pubertate pâna la menopauza vaginul este populat cu o varietate foare mare de bacterii, predominante fiind speciile de Lactobacillus (bacili Döderlein). Dintre speciile prezente mentionam: stafilococi coagulazo-negativi, streptococi (mai ales din grupul B), enterococi, Gardnerella vaginalis, micoplasme, Mobiluncus etc. Ocazional pot fi prezente si specii de Candida.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 38

65. Definiti notiunile de exotoxina, endotoxina, anatoxina si antitoxina. exemple Exotoxinele bacteriene sunt proteine biologic active cu o toxicitate de regulă foarte ridicată. Unele dintre ele sunt cele mai puternice otrăvuri cunoscute. Exotoxinele sunt puternic imunogene şi se transformă prin învechire şi sub acţiunea formolului în derivaţi imunogeni, dar netoxici, numite anatoxine. Fiind netoxice, dar imunogene, anatoxinele constituie baza vaccinării împotriva bolilor produse de bacterii toxigene (tetanos, difterie). Unele bacterii, ca, de pildă, baciul difteric, tetanic, botulinic, holeric, au ca singur factor de patogenitate toxigeneza, iar tabloul clinic este caracteristic toxinei respective. Elaborate in general de microbii gram + lizogenizati(si de grup A) sau codificati plasmidic (clostridium tetani), dar si de bacili gram -, sub control plasmidic (e coli); structura proteica proteica; prezinta un domeniu B obligatoriu (necesarpenetrarii) si o portiune enzimatica A. Sunt secretate in timpul vietii. Endotoxina este lipopolizahardul (LPZ) din membrana externă a peretelui celular al bacteriilor gram-negative şi joacă un rol important în patogenia infecţiilor produse de aceste microorgansime. Ea este “cartea de vizită” a bacteriilor gram-negative. Au structura lipopolizaharidica, toxicitate mai redusa, dar pot actiona la mai multe nivele (febra leucopenie hiperpermeabilitate vasculara) implicate in aparitia socului endotoxic. Macrofagele, activate de endotoxină, sunt capabile să distrugă unele celule tumorale. ANTITOXINELE = struct proteica,imunogene si determina aparitia Ac specifici care pot neutraliza activitatea toxica prin cuplare specifica cu toxina -> seruri imune. 66. Inflamatia; definitie, factori care determina procesul inflamator Inflamatia = proces fiziopatologic complex ce include: fenomene alternative, fenomene de tip reactiv (vasculo-exudative si proliferative) si fenomene reparatorii, cu scopul limitarii si /sau neutralizarii „agresorului” (indiferent de natura). În esenta, patrunderea microbilor în tesuturi duce la activarea complementului, ceea ce are ca urmare liza celulelor microbiene, pe de o parte, si declansarea raspunsului inflamator infectios, pe de alta parte. Inflamatia acuta este rezultatul schimbarilor ce se petrec într-un tesut ca raspuns la o agresiune mecanica, chimica sau infectioasa. Ea este un mecanism de aparare antiifectios rapid, care tinde sa localizeze infectia si sa previna diseminarea ei. Manifestarile locale ale inflamatiei sunt eritemul (rubor), caldura (calor), durerea (dolor) si edemul (tumor). Inflamatia poate evolua spre vindecare cu restitutio ad integrum a tesuturilor sau cu sechele. Deznodamântul unei reactii inflamatorii depinde de extinderea procesului inflamator, de microorganismele implicate, precum si de reactivitatea gazdei. Cele 3 evenimente majore ale inflamatiei sunt: • vasodilatatia capilara locala, • modificarile structurale microvasculare, si • acumularea leucocitelor la locul injuriei. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 39

67. Etapa mecanismelor de declansare a inflamatiei Agentul implicat determina modificari atat la nivelul tesutului interstitial, cat si la nivelul celulelor parenchimatoase, avand rezultat eliberarea unor factori chemotactici si a unor proteaze si kinaze. Rezultatul acestei etape = raspunsul inflamator acut manifestat prin vasodilatatie capilara (roseata), exsudare a proteinelor plasmatice (edem) si acumularea PMN Elementele esentiale in dezvoltarea inflamatiei sunt sistemele monocito – macrofag, colagenul vasc, citokinele si nu in ultimul rand ficatul. Acumularea celulelor inflamatoare la locul unde se afla AG detine un loc central in declansarea inflamatiei. PMN si macrofagele se deplaseaza conform gradientelor chemotatice, urmeaza apoi fagocitoza nonselfului, proces favorat de prezenta opsoninelor. 68.Sub-etapele vasculara si exsudativa,in cadrul procesului inflamator Inflamatia acuta este rezultatul schimbarilor ce se petrec într-un tesut ca raspuns la o agresiune mecanica, chimica sau infectioasa. Ea este un mecanism de aparare antiifectios rapid, care tinde sa localizeze infectia si sa previna diseminarea ei. Manifestarile locale ale inflamatiei sunt eritemul (rubor), caldura (calor), durerea (dolor) si edemul (tumor). Cele 3 evenimente majore ale inflamatiei sunt: • vasodilatatia capilara locala, • modificarile structurale microvasculare, si • acumularea leucocitelor la locul injuriei. Vasodilatatia capilara. Mediatorii plasmatici ai inflamatiei, ca, de pilda, complementul, exista sub forma unor precursori care, asa cum am vazut, devin biologic activi numai dupa activare. Activarea C3 a complementului este o etapa critica a inflamatiei. C3a si C5a rezultate în cursul activarii complemenetului sunt anafilatoxine puternice ce determina degranularea mastocitelor cu eliberarea unor mediatori chimici. O parte dintre acestia sunt preformati, asa cum este histamina. Ea are actiune vasodilatatoare asupra capilarelor, crescând totodata si permeabilitatea acestora. În consecinta, se produce o exudare din capilare spre zona infectata a plasmei cu mediatorii pe care aceasta îi contine. Modificarile structurale microvasculare si acumularea de leucocite. Sub actiunea unor mediatori chimici rezultati în timpul activarii complementului si secretati de macrofagele stimulate de toxine bacteriene se modifica endoteliul capilar, care permite adeziunea PMN de acesta. PMN sunt atrase de factorii chemotactici de natura bacteriana, de cei produsi în urma activarii complementului si de cei rezultati din degranularea mastocitelor. Ele vor parasi capilarul prin diapedeza si se vor îndrepta catre focarul inflamator unde vor distruge microbii prin fagocitoza Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 40

69.Consecintele activarii mecanismelor inflamatorii În esenta, patrunderea microbilor în tesuturi duce la activarea complementului, ceea ce are ca urmare liza celulelor microbiene, pe de o parte, si declansarea raspunsului inflamator infectios, pe de alta parte. Cascada de activare a complementului va antrena eliberarea unor mediatori chimici (citokine, proteinele de faza acuta, mediatori rezultati din degranularea mastocitelor etc.) care participa direct în procesul inflamator si vor atrage în focarul infectios fagocitele. Acestea vor înlatura microorganismele invadatoare prin fagocitoza. 70. Definiti notiunile de infectie, infectie inaparenta, stare de boala si stare de purtator de germeni INFECTIE -

Infectia reprezinta o patrundere activa sau pasiva a unor germeni patogeni intrun organism gazda. Pt realizarea acesteia microorganismele trebuie sa colonizeze organismul gazda si sa depaseasca mecanisemele de aparare, sa se multiplice si sa intre intr-un lant de transmitere prin care poarte contamina o noua gazda.

INFECTIE INAPARENTA -

Infecţia inaparentă se desfăşoară asimptomatic, agentul patogen putând fi identificat numai prin mijloace de laborator. Ea are o evoluţie acută şi ciclică, fiind urmată de imunitate din cauza slabelor calităţi patogene ale agentului infecţios sau rezistenţei crescute din partea organismului-gazdă (ex : difterie, rubeolă).

STAREA DE BOALA -

Se datoareaza intereactiunii microorganism – gazda si este urmata de leziuni manifestate si de reactii din partea gazdei. Infectia nu este urmata neaparat de starea de boala.

PURTATOR DE GERMENI -

Starea de purtător de germeni este, de fapt, definitorie pentru orice persoană care adăposteşte germeni patogeni. Deşi multe dintre acestea par sănătoase, ele constituie, totuşi, potenţiale focare adiţionale de contaminare, cu atât mai mult cu cât, în practică, numărul lor este mult mai mare decât al celor clinic afectate. În cazul acestor purtători ”aparent sănătoşi”, infecţia se rezumă numai la procesul de multiplicare locală a germenilor, deoarece gradul mai mare de rezistenţă sau imunitate al individului afectat împiedică răspândirea şi multiplicarea agenţilor patogeni în întregul lor organism

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 41

71. Definiti notiunea de raspuns imun si precizati principalele sale atribute RASPUNSUL IMUN -

-

Raspunsul imun este reprezentat de un lant de procese, declansat de prezenta unei structuri straine organismului, procese care au ca punct final distrugerea acestori structuri (non-self).Implică în mod absolut necesar stimularea şi proliferarea limfocitelor antigen-specifice şi sinteza unor molecule de recunoaştere a antigenului, reprezentate de anticorpi şi/sau receptori membranari. Răspunsul imun se derulează în trei secvenţe: 1.Selecţia clonală este etapa în care sînt selectate de către antigen doar acele limfocite capabile să recunoasca antigenul, denumite limfocite antigen-specifice. O clonă limfocitară este o populaţie de limfocite capabilă să recunoasca un singur tip de antigen, datorită prezenţei pe suprafaţa membranei celulare a unui singur tip de receptor pentru antigen. 2.Activarea clonală: activarea metabolismului intermediar al limfocitelor selectate; 3.Expansiunea clonală: proliferarea celulelor selectate şi activate metabolic; consecinţă: creşterea numărului limfocitelor din clona stimulată de antigen.

ATRIBUTE -

Specific Discerne intre self si nonself Are memorie Reactioneaza numai fata de moleculele care indeplinesc conditia de antigen Poate fi de tip o Umoral o Celular

72. Definiti raspunsul imun umoral si specificati celulele implicate in realizarea sa RIU -

este declanşat de antigenele T-dependente; necesită cooperarea a trei categorii celulare: CPA(celule prezentatoare de antigen), limfocitele T helper şi T supresoare, (cu rol imunoregulator) şi limfocitele B efectorii. parcurge două etape, prima cu efect activator, derulată dinspre CPA spre limfocitele B, care activate devin plasmocite producătoare de anticorpi şi a doua etapă cu efect inhibitor sau de control, care limitează răspunsul imun eficient la minimul necesar;cea de a doua etapă este realizată prin intermediul unor subclase de imunoglobuline şi prin

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 42

activarea limfocitelor T supresoare care limitează participarea limfocitelor B şi T la RIU; Menţinerea unui echilibru stabil între cele două etape ale RIU reprezintă cheia homeostaziei RIU. If you want more -

Secvenţial, derularea RIU parcurge următorul model: o antigenul declanşator este preluat de CPA (macrofage sau celule dendritice); o transportat în ariile timodependente ale organelor limfoide, este prezentat limfocitelor T helper (TH), care se activează şi devin limfoblaşti TH; o aceştia migrează în alte domenii ale organelor limfoide, unde urmează să întîlnească limfocitele B cu care cooperează; o simultan, antigenul este transportat pe cale limfatică în zonele bursodependente ale organelor limfoide, unde este recunoscut de limfocitele B antigen specifice, care vor fi activate, tranformîndu-se în limfoblaşti B ce migrează treptat, venind în contact cu limfoblaştii TH, cu care cooperează (direct, datorită numeroaselor molecule MHCII de pe suprafaţa limfoblaştilor B sau indirect, prin intermediul IL2 şi IL4, eliberate de limfoblastul TH activat); o in urma acestei cooperări, limfoblastul B este complet activat, el devenind plasmocit producător de anticorpi specifici eliberaţi în circulaţie.

73. Enumerati tipurile de imunitate si descrieti-le pe scurt IMUNITATE 1. condiţie în care organismul, în contact cu un agent patogen (microbian sau de altă natură) nu contractează în mod specific starea patologică (boala) indusă de agentul patogen respectiv; 2.totalitatea mecanismelor de aparare impotriva microorganismelor invazive (bacterii, virusuri,paraziti), a structurilor non-self si a structurilor self modificate. IMUNITATEA MOSTENITA NESPECIFICA: structuri si mecanisme cu rol protector (tegumente, mucoase, enzime dinsecretii exocrine – lizozimul, bactericidina),pH-ul secretiei gastrice, temperatura corpului ce ofera conditii precare de dezvoltare unor microorganism IMUNITATEA MOSTENITA SPECIFICA: rezistenta unui organism fata de anumiti agenti microbieni care il particularizeaza de alte organisme din aceeasi populatie sau specie, sensibile la actiunea acelor agenti microbieni. IMUNITATEA DOBANDITA -

Pasiv o Natural – transferul anticorpilor materni la fat o Artificial – transferul de seruri imune sau anticorpi preformati de alta gazda

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 43

-

Activ o Natural – in urma contactului cu diferite microorganism o Artificiala – in cazul administrarii antigenelor sub forma vaccinurilor. 74. Organele centrale si periferice ale sistemului imun; localizare, functi

ORGANELE LIMFOIDE PRIMARE -

Sunt măduva osoasă roşie şi timusul. În aceste organe limfocitele devin celule imunocompetente, dobândind repertoriul de recunoaştere a antigenelor şi proprietatea de a deosebi “selful” de “non-self”. Acest proces de “şcolarizare” se desfăşoară în absenţa antigenelor din mediul extern. - În timus proliferează limfocitele T, din care 10% dobândesc caracterul imunocompetent iar restul de 90% sunt distruse. - Limfocitele B se diferentiaza in maduva rosie, aceasta fiind si un organ limfoid secundar ORGANELE LIMFOIDE SECUNDARE - După diferenţierea lor în organele limfoide primare, limfocitele B şi T migrează pe calea vaselor sanguine şi limfatice în organele limfoide secundare, care sunt ganglioni limfatici, splina, amigdalele şi ţesutul limfoid ataşat mucoaselor (MALT). - Limfocitele imunocompetente care populează organele limfoide secundare sunt celule antigen-reactive. Deci spre deosebire de organele limfoide primare, unde instruirea se face în absenţa antigenului, în organele limfoide secundare prezenţa acestuia este obligatorie.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 44

-

Ganglionii limfatici o au rolul unui filtru pentru antigenele venite pe cale limfatică şi care vor fi preluate de celulele prezentatoare de antigen (CPA): macrofage, celulel foliculare dentritice). o Sub capsula conjunctivă a ganglionilor se află sinusul subcapsular, marginat de macrofage. Limfocitele şi antigenele ajung din alte regiuni aici prin vasele limfatice aferente. o Zona corticală a ganglionului conţine limfocitele B organizate în foliculi limfoizi, care prezintă centrii germinativi dacă au fost stimulaţi antigenic. o Zona paracorticală conţine limfocite T care sunt în contact strâns cu celulele dendritice (prezentatoare de antigen). o Zona medulară conţine limfocitele T şi B, plasmocite, dispuse în cordoane şi macrofage aşezate de-a lungul traveelor conjunctive. În trecerea limfei de la vasul limfatic aferent spre cel eferent, antigenele sunt fagocitate de macrofagele din zona medulară.

-

-

Splina o este formată din pulpa roşie implicată în distrugerea eritrocitelor îmbătrânite şi pulpa albă care reprezintă ţesutul limfoid al splinei. Acest ţesut este organizat în jurul arteriolelor centrale, constuituind arii limfoide periarteriolare. o Ele cuprind o zonă adiacentă arteriolei care conţine limfocite T, în jurul acestei zone dispunându-se limfocitele B, organizate fie în foliculi primari nestimulaţi, fie în foliculi secundari stimulaţi ce conţin centri germinativi. În zona marginală a centrilor germinativi se găsesc macrofage şi celule dendritice Sistemul imun al mucoaselor (MALT) o este format din ţesut limfoid ataşat mucoasei gastrointestinale, respiratorii şi a tractului uro-genital şi este deosebit de important în apărarea antiinfecţioasă

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 45

dobândită deoarece este principala barieră antiinfecţioasă faţă de microorganismele care pătund în organism pe cale digestivă, respiratorie şi urogenitală. o Mai bine cunoscut este ţesutul limfoid asociat bronhiilor (BALT 2) cu rolul de a capta antigenele venite pe calea aerului şi ţesutul limfoid asociat intestinului (GALT3) care preia antigenele venite pe cale digestivă. o Acestea duc la aparitia unor anticorpi protectori la suprafata mucoasei nazale, bronsice sau intestinale. 75. Enumerati celulele implicate in raspunsul imun

-

Celulele prezentatoare de antigen (CPA). Sunt celulele care au proprietatea de a prezenta antigenele limfocitelor. Ele cuprind macrofagele (fagocite profesioniste), celulele Langerhans din piele, celulele dendritice din ganglionii limfatici şi splină, şi limfocitele B. o Macrofagele  In sange se numesc monocite  In functie de locul unde migreaza ele se numesc : macrofage alveolare în plămân, microglii în ţesutul nervos, celule Kupffer în ficat, osteoclaste în schelet, celulele mezangiale renale o Celulele dendritice  Ele nu au capacitatea de a fagocita antigenele ci doar de a le endocita si a le prezenta la suprafata o Indiferent de tipul de CPA, ele au la suprafaţa lor antigene de histocompatibilitate (MHC) de clasa II.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 46

-

Celulele cu origine limfoida – limfocitele o Limfocitele B. Atunci cand sunt stimulate dau nastere in stadiul final la plasmocite ce au rol in producerea rapida si in cantitati mari a anticorpilor o Limfocitele T care se impart in  Limf Thelper (Th) alcătuiesc o subpopulaţie de limfocite care după interacţiunea cu antigenul stimulează limfocitele B în elaborarea unui răspuns imun umoral în anticorpi  Limfocitele T supresoare (Ts) limitează expansiunea clonală a limfocitelor B şi T stimulate antigenic participând la reglarea intensităţii răspunsului imun.  Limfocitele T citotoxice (Tc) sunt stimulate prin antigene care sunt exprimate la suprafaţa celulei gazdă ca, de pildă, celule virus infectate, celule infectate cu microbi cu habitat intracelular sau celule tumorale pe care sistemul imun nu le mai recunoşte ca self.  Limfocitele T cu memorie  limfocitele TDH au rol reglator prin secreţia de limfokine  Limfocitele Killer (K)  Limfocitele Natural Killer (NK)

76.Limfocite T- origine, evolutie, tipuri, functii Limfocitele alcătuiesc 10 -15% din elementele seriei albe sanguine. Cele aproximativ un trilion de celule limfocitar poartă responsabilitatea majoră a sistemului imun. Ele nu pot fagocita, dar demonstrează alte proprietăţi speciale: • poartă pe suprafaţa lor receptori specifici care permit fiecărei celule să reacţioneze cu un anumit antigen. Aceasta constituie baza specificitătii imunologice; • se divid după stimularea antigenică şi formează clone celulare cu specificitate identică. Unele limfocite au durată de viaţă lungă reţinând informaţia antigenică timp îndelungat, chiar toată viaţa. Aceasta este baza memoriei munologice; • limfocitele sunt vehiculate de sânge şi limfă, memoria specifică dobândită în urma unui răspuns imunologic repartizându-se întregului organism. Limfocitele cu funcţionalitate diferită au aspect asemănător la microscopul optic, dar au markeri de suprafaţă ce pot fi identificaţi cu anticorpi monoclonali. Astfel se identifică limfocitele B şi limfocitele T cu subpopulaţiile corespunzătoare şi celule nule Limfocitele T reprezintă 69-80% din limfocitele circulante. Origine: Au originea la nivelul org limfoide primare(timus) din celula stem pluripotenta. La acest nivel ele devin imunocompetente(doar 10% dobandesc caracterul imunocompetent, restul 90%sunt distruse). In gg limfatici ele se afla in zona paracorticala si sunt in contact strans cu celulele dendritice(prezentatoare de antigen) si in zona medulara sub forma de cordoane. In splina ele cuprind zona adiacenta arteriolei. Ca şi limfocitele B, ele recunosc în mod specific un număr imens de antigene ceea ce Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 47

înseamnă că şi ele trebuie să dispună de un mecanism care să le garanteze variabilitatea receptorilor. Principiul mecanismului de sinteză a receptorilor este asemănător celui prin care se sintetizează anticorpii. Se deosebesc şi aici fragmentele de genele V,D,J, posibilitatea de variablitate fiind foarte mare. Markerii de surafaţă a limfocitelor T. La suprafaţa limfocitelor T se găsesc markerii care individualizează subpopulaţiile de limfocite T. La toate categoriile funcţionale de limfocite T este prezentă molecula CD3, formată din 5 lanţuri glicoproteice ( ) care se asociază cu receptorul pentru antigen al limfocitului T. Limfocitele T helper (Th) alcătuiesc o subpopulaţie de limfocite care după interacţiunea cu antigenul stimulează limfocitele B în elaborarea unui răspuns imun umoral în anticorpi, limfocitele Tc pentru obţinerea unui răspuns celular şi activează macrofagele. Markerul de suprafaţă a limfocitului Th este molecula CD4+. Limfocitele T supresoare (Ts) limitează expansiunea clonală a limfocitelor B şi T stimulate antigenic participând la reglarea intensităţii răspunsului imun. Limfocitele T citotoxice (Tc) sunt stimulate prin antigene care sunt exprimate la suprafaţa celulei gazdă ca, de pildă, celule virus infectate, celule infectate cu microbi cu habitat intracelular sau celule tumorale pe care sistemul imun nu le mai recunoşte ca self. Markerul de suprafaţa este tot CD8+. Limfocitele TDH1 sunt limfocite care au pe suprafaţa lor marker CD4+ fiind responsabile de producerea hipersensibilităţii de tip întârziat (vezi capitolul de hipersensibilitate). Ele secretă după stimulare antigenică limfokine care activează macrofagele ce adăpostesc bacterii cu habitat facultativ sau obligator intracelular. Limfocitele T cu memorie se formează în timpul răspunsului primar, ele având o viaţa de aproximativ 40 de ani. Memoria lor imunologică însă se intinde pe o perioadă de 10-15 ani. 77.Limfocite B-origine, evolutie, tipuri, functie Limfocitele alcătuiesc 10 -15% din elementele seriei albe sanguine. Cele aproximativ un trilion de celule limfocitar poartă responsabilitatea majoră a sistemului imun. Ele nu pot fagocita, dar demonstrează alte proprietăţi speciale: • poartă pe suprafaţa lor receptori specifici care permit fiecărei celule să reacţioneze cu un anumit antigen. Aceasta constituie baza specificitătii imunologice; • se divid după stimularea antigenică şi formează clone celulare cu specificitate identică. Unele limfocite au durată de viaţă lungă reţinând informaţia antigenică timp îndelungat, chiar toată viaţa. Aceasta este baza memoriei munologice; • limfocitele sunt vehiculate de sânge şi limfă, memoria specifică dobândită în urma unui răspuns imunologic repartizându-se întregului organism. Limfocitele cu funcţionalitate diferită au aspect asemănător la microscopul optic, dar au markeri de suprafaţă ce pot fi identificaţi cu anticorpi monoclonali. Astfel se identifică limfocitele B şi limfocitele T cu subpopulaţiile corespunzătoare şi celule nule. Limfocitele B reprezintă 2-12% din limfocitele circulante. Au originea la nivelul maduvei osoase rosii din celula stem pluripotenta. La acest nivel ele Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 48

devin imunocompetente, dobandind repertoriul de recunoastere a antigenelor si propietatea de a deosebi “selful” de “non-self”. Acest process se desfasoara in absenta Ag din mediu extern. Ele sunt organizate in foliculi limfoizi in zonei corticala si in cordoane(alaturi de limfocite T si plasmocite) in zona medulara a gg limfatic.La nivelul splinei limfocitele B se afla in jurul zonei care contine limfocite T organizate fie in foliculi primary nestimulati fie in foliculi secundati stimulate ce contin centri germinativi. Evolutie: cand limfocitul B este stimulat corespunzător prin limfocitul T-helper sau mai rar de antigene timoindependente, el începe să se dividă transformându-se în limfoblaşti care dau naştere la plasmoblaşti, apoi la plasmocite. Toate celulele provenite dintr-un singur limfocit B aparţin unei singure clone celulare, producătoare a milioane de anticorpi identici care vor fi eliberaţi în mediul intern. Pe suprafaţa limfocitelor B se găseşte BCR(receptorul pt Ag) care permite celulelor B să recunoască antigenele specifice. Ele au pe suprafaţa lor markerul CD19 şi antigene MHC de clasa II. Cele mai multe limfocite B sunt sub control direct al limfocitelor T-helper care stimulează activitatea lor şi T-supresoare care o deprimă. Există însă şi limfocite timoindependente, care nu necesită cooperarea cu limfocitele T reglatoare fiind stimulate direct de antigen. După stimulare antigenică, limfocitele se diferenţiază, în afară de plasmocite secretoare de anticorpi, şi în limfocite B cu memorie, care sunt celule cu viaţă lungă, fiind responsabile de un răspuns umoral rapid la o stimulare ulterioară cu acelaşi antigen.

78.Sistemul mononuclear :origine, tipuri de celule, functii Fagocite mononucleare includ monocitele din sânge si macrofagele tisulare. Ele sunt capabile sa fagociteze microorgansime opsonizate(reprezinta faza în care microorganismele sunt pregatite pentru fagocitoza si adera de fagocite), sa distruga unele dintre ele dar nu pe toate. Unele microorgansime (micobacterii, listerii, brucelle, crypococci, toxoplasme) supravietuiesc si se înmultesc în macrofage. În acest caz celula serveste ca factor de diseminare al infectiei, protejând microorganismele respective. În cadrul proceselor imunitare mediate celular, monocitele activate pot omorâ germenii patogeni intracelulari. Monocitele/macrofagele reprezinta o linie celulara cu functie imp in imunologie, prin interventia lor in imunitea naturala, in prezentarea antigenica si in react imuna specifica. Macrofagele exista in toate tesuturile. Se form in maduva osoasa hematogena, dintr-un precursor comun monoblast-mieloblast.Cand devin mature poarta numele de monocite. Monocitele circula in sange 6-8 ore dupa care migreaza in tesuturi unde iau nume diferite si au functii diferite:  histiocite in tesut conjnctiv,  celule microgliale in tesut nervos,  osteoclaste in tesut osos  macrofage alveolare pulmonare  macrofage peritubulare in rinichi,  celulele kuppfer in ficat, Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 49

 

macrofage splenice, macrofage din maduva osoasa si timus (macrofagele de aici nu trebuie confundate cu celulele dendritice)

79.Granulocitele – tipuri, rol in imunitate: NEUTROFILELE -

-

Reprezinta majoritatea granulocitelor circulante. Adera la endoteliul capilar prin procesul de marginatie si apoi il traverseaza prin diapedeza. Au un rol important in procesul de inflamatie acuta, fiind atrase de factori chemotactici precum: fragmente ale complementului, factoi derivati din alte tipuri de leucocite, bacterii si trombocite. Contin un intreg arsenal de protein cu rol in fagocitoza

EOZINOFILELE -

-

-

celule cu slabe performanţe fagocitare care reprezintă 2-5% în formula leucocitară a sîngelui periferic. Ele sînt totuşi capabile de a distruge microorganisme endocitate şi joacă un rol important în apărarea antiparazitară. Mecanismul de acţiune împotriva paraziţilor implică fenomenul de degranulare a eozinofilelor, proces în urma căruia este eliberat conţinutul granulelor în mediul extracelular. Acest proces poate fi declanşat şi de alţi stimuli. Nu sînt celule prezentatoare de antigen, eozinofilul fiind implicat în limitarea procesului inflamator şi reducerea migrării neutrofilelor în focarul inflamator datorită eliberării de histaminază şi aril-sulfatază, inactivatorii substanţelor cu efect pro-inflamator eliberate de mastocite.

BAZOFILELE SI MASTOCITELE -

celule implicate în realizarea răspunsului imun, dar nu sînt celule prezentatoare de antigen.

-

Bazofilele sînt foarte puţin numeroase în sîngele periferic, ele reprezentînd numai 0,2% din leucocitele circulante.

-

Mastocitele sînt celule extrem de asemănătoare bazofilelor din punct de vedere funcţional; se găsesc doar la nivelul mucoaselor şi ţesutului conjunctiv, fiind clasificate din acest motiv în două categorii: mastocite ale mucoaselor (MMC – mucosa mast cell) şi mastocite ale ţesutului conjunctiv (CTMC – conective tissue mast cell).

-

Bazofilele şi mastocitele conţin granulaţii bogate în heparină, leucotriene, histamină şi factorul chemotactic pentru eozinofile al anafilaxiei (ECF-A). Stimulul degranulării bazofilelor şi mastocitelor este cel mai frecvent un antigen capabil să declanşeze reacţii alergice, adică un alergen. Pentru declanşarea acestui tip de răspuns imun, alergenul

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 50

interacţionează prin intermediul IgE situate la suprafaţa bazofilelor şi mastocitelor care exprimă receptori pentru fracţiunea Fc a acestor imunoglobuline (FcεR). Mediatorii eliberaţi astfel produc simptomele clinice inflamatorii caracteristice alergiei 80.Sistemul complement-definitie,elemente, roluri si efecte biologice Este principalul constituient al apararii naturale, al imunitatii umorale si respectiv unul dintre elementele importante ale reactiei imune survenite ca urmare a actiunii Ac. Este un complex de proteine serice cu activitate enzimatică, citolitică şi reglatoare care prin activare produc chemotaxie, opsonizare si citoliză a agenţilor patogeni. Complementul este alcătuit din 25-30 de enzime ce sunt activate in cascada, rolurile jucate de acest sistem în cadrul RIU fiind cel de a finaliza acţiunea anticorpilor asupra antigenelor şi cel de a realiza recunoaşterea nespecifică a structurilor nonself, aceste roluri putand fi indeplinite fie separat, fie complementar. Componentele majore sunt notate cu C1-C9.Ỉn mediile lichidiene, fiecare factor al complementului se gaseşte sub formă inactiva (in acest caz componentul va fi precedat de litera i, ex:iC3b).Un factor al complementului odata activat, va avea drept substrat un alt factor in formă inactiva, pe care il va activa, In urma conversia enzimatice a fiecarui factor inactiv in forma sa activa rezulta 2 fragmente: un fragment mic, notat cu “a”(ex:C3a) si unul mare, notat cu “b”(ex:C3b).Acesta din urma putand funcţiona în cadrul cascadei de activare a complementului ca enzimă, sau cofactor. . Fragmentele mici “a” raman în faza fluida, intervenind in procesul inflamator prin efecte precum vasodilatatia, cresterea permeabilitatii capilare, chemoatractia si activarea leucocitara. Cea mai mare parte a reactiilor complementului se desfasoara pe suprafata membranelor celulare . Când produsii de clivaj se asociaza pentru a forma împreuna o enzima activa, ca, de pilda, C4b2a(format din C4b si C2a) se adauga o bara deasupra componentelor sale. Rolul biologic al complementului Activarea complementului genereaza o serie de efecte biologice de o importanta deosebita în rezistenta antiinfectioasa: • declansarea inflamatiei. Activarea complementului aduce dupa sine declansarea reactiei inflamatorii prin produsii intermediari rezultati pe parcursul activarii. Astfel, C5a este un puternic factor chemotactic si chemokinetic pentru PMN pe care le va aduce în focarul infectios. C3a si C5a sunt anafilatoxine care vor duce la o degranulare fiziologica a mastocitelor cu eliberarea unor mediatori chimici vasoactivi; • citoliza. Celulele pe care s-a fixat complementul si care în mod fiziologic sunt celulele straine organismului (bacteriile, în cazul de fata) sunt lizate sub actiunea complexului de atac al membranei. În cazuri patologice, complementul se poate fixa de celulele proprii organismului Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 51

producând distrugerea acestora; • opsonizarea. Fagocitele au pe suprafata lor receptori pentru C3b. Astfel, microbii de care s-a fixat C3b vor adera de celulele fagocitare fiind fagocitati mai eficient. Activarea complementului se poate petrece pe doua cai cu punct de plecare diferit, dar, care converg spre aceiasi produsi finali: - calea alternativa, se activeaza în absenta anticorpilor specifici si face parte, deci, din rezistenta antiinfectioasa naturala, - calea clasica, a carei activare presupune în general prezenta anticorpilor specifici, deci, un contact prealabil cu agentul etiologic respectiv. Momentul esential în activarea complementului este activarea C3, care se descompune în C3a si C3b sub actiunea C3-convertazei 81.Calea clasica de activare a complementului Componentele C se gasesc in ser in stare inactiva. Pentru a declansa activarea lor este necesar un stimul, pentru calea clasica punctul de pornire este reprezentat de complexele Ag-Ac. Astfel, bacteriile cu care organismul a mai venit în contact, patrund în organism si intalnesc anticorpii corespunzatori cu care vor forma complexe antigen anticorp.In mod asemanator calea clasica poate fi activata si de microorganisme sau diferite substante chimice: bact gram -, retrovirusuri, glicoproteinele anvelopei HIV, complexe heparina-protamina. Activarea caii clasice: Cate o molecula de C1q,C1s si 2 molecule de C1r formeaza unitatea de recunoastere care se va lega de complezul Ag-Ac. Aceasta unitate de recunoastere va cliva C2 (in C2a si C2b) si C4 (in C4a si C4b) . C4b si C2a se vor asocia si vor forma C3 convertaza caii clasice care va cliva C3 in C3a si C3b. Indiferent pe ce cale s-a activat complementul, reactiile urmatoare sunt comune ambelor cai. C3 convertaza se combina cu C3b formând C5 convertaza (C3b2BbP pentru calea alternativa si C3b4b2a pentru calea clasica). C5 se va descompune in C5a si C5b. C5b se fixeaza pe suprafata bacteriei. De C5b se vor lega în continuare C6,7,8 care împreuna cu mai multe molecule de C9, care polmerizeaza, formeaza un complex de atac al membranei ce perforeaza membrana celulara cu liza consecutiva a celulei bacteriene.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 52

82.Calea alternativa de activare a complementului Constituie una dintre primele linii de aparare a organismului contra unui agent patogen, inaintea constituirii raspunsului imun. Aceasta cale poate fi activata de diferite microorganisme, dar si de substante neimune, precum: bacterii gram + sau -, virusuri, fungi, paraziti, diverse substante: endotoxine bacteriene, insulina, fibre de azbest, gluten, hemoglobina, prafuri, unele prod de contrast utiliz in radiologie. În plasma normala C3 este supus permanent unei activari spontane discrete prin clivarea în C3a si C3b. Activarea caii alternative: C3b se combina cu factorul B rezultând C3bB. Acesta la rândul sau este supus actiunii factorului D care va transforma C3bB în C3bBb si C3bBa. C3bBb este C3-convertaza caii alternative. Aceasta convertaza, rezultata, deci, în mod fiziologic ar putea cliva cantitati mari de C3 printr-un feedback pozitiv, asemanator unui cerc vicios, daca nu ar exista mecanisme foarte riguroase de reglare ce împiedica activarea spontana a unor cantitati mari de C3. În prezenta unor polizaharide de pe suprafata bacteriilor, a endotoxinei si a acizilor theicoici, C3bBb rezultat în urma clivarii fiziologice se leaga de suprafata bacteriilor fiind protejat astfel de inactivare. La stabilizarea C3bBb participa si o proteina plasmatica, properdina. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 53

Deci, activarea complementului pe calea alternativa este rezultatul stabilizarii C3bBb (a C3convertazei) ce poate fi determinata, printre altele, de prezenta bacteriilor. Indiferent pe ce cale s-a activat complementul, reactiile urmatoare sunt comune ambelor cai. C3 convertaza se combina cu C3b formând C5 convertaza (C3b2BbP pentru calea alternativa si C3b4b2a pentru calea clasica). C5 se va descompune in C5a si C5b. C5b se fixeaza pe suprafata bacteriei. De C5b se vor lega în continuare C6,7,8 care împreuna cu mai multe molecule de C9, care polmerizeaza, formeaza un complex de atac al membranei ce perforeaza membrana celulara cu liza consecutiva a celulei bacteriene.

83. Inteleukinele Unele simptome generale ale infectiei, ca, de exemplu, febra, somnolenta, starea de disconfort, durerea musculara etc., se datoreaza activitatii acestor substante. În cazul invaziei organismului de catre agenti straini (bacterii, toxine), se declanseaza secretia de citokine care contribuie în ansamblu la cresterea rezistentei la infectii. Astfel, citokinele au rol important în declansarea inflamatiei. IL-1este implicata în producerea febrei, cresterea permeabilitatii vasculare, induce explozia respiratorie în macrofage si PMN, moment esential în fagocitoza. IL-6 declanseaza în ficat sinteza proteinelor de faza acuta. IL-8 secretata de macrofage la stimularea acestora de Il-1 si TNFa este un puternic factor chemotactic pentru PMN, contribuind astfel la formarea puroiului în focarul infectios. TNFa favorizeaza agregarea si activarea leucocitelor neutrofile si eliberarea enzimelor proteolitice din celulele mezemchimale, deci sunt producatoare de leziuni tisulare. Citokinele sunt peptide, asemanatoare hormonilor, cu proprietati imunomodulatoare, produse de celulele care raspund invaziei microbiene. Cele care actioneaza chiar asupra celulelor care le produc sunt denumite autocrine, cele cu efect pe celulele învecinate paracrine, iar cele cu efect pe celule la distanta endocrine. Exista multe celule producatoare de citokine, dar cele mai importante sunt macrofagele si limfocitele.

87.Precizati succesiunea de evenimente din cadrul raspunsului imun umoral pana la sinteza de Ac. Soarta antigenelor, deci şi a microorganismelor care pătrund în organism, depinde de calea de pătrundere şi de penetrarea barierelor externe ale apărării antiinfecţioase. Dacă microorganismul pătrunde direct în sânge, va ajunge în splină unde va avea loc şi răspunsul imun. Microorganismele care pătrund în tegument ajung pe cale limfatică la primul ganglion limfatic, iar cele care au reuşit să traverseze mucoasele (digestivă, respiratorie) vor ajunge în sistemul limfatic ataşat mucoaselor (MALT). Indiferent de calea de pătrundere a antigenelor (cu excepţia celor timoindependente), ele vor fi preluate prin fagocitoză de macrofage. În macrofage, antigenele vor fi digerate de enzimele lizozomale până la eliberarea epitopilor secvenţiali, care sunt întotdeauna peptide scurte. Epitopii secvenţiali ajung printr-un mecanism încă necunoscut la suprafaţa macrofagului, care îl prezintă limfocitului Th în asociaţie cu complexul major de histocopatibilitate MHC de clasa II. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 54

În contact cu un limfocit Th a cărui receptor este complementar antigenului prezentat în asociaţie cu MHC de clasa II şi poartă la suprafaţă antigenul CD4, se produce un semnal care va stimula secreţia de Interleukină-1 (IL-1) de către macrofag. Aceasta va acţiona asupra limfocitului T-helper care va secreta IL-2, care are induce creşterea celuelor ce au receptori pentru această interleukină, printre care chiar limfocitul Th (activare autocrină). Stimularea limfocitului Th este esenţială în răspunsul imun, deoarece Th va stimula în continuare limfocitele B, care vor produce efectorii umorali ai imunităţii (anticorpii) şi celulele Tc, efectorii imunităţii celulare. Cum sunt stimulate limfocitele B? În timp ce limfocitul Th este stimulat de epitopul secvenţial, prelucrat şi prezentat de macrofage, al unui antigen, un limfocit B este stimulat la rândul său de epitopul structural, neprelucrat, nativ. Stimularea de către epitopul structural este un prim semnal pentru limfocitul B, dar insuficient pentru a produce un răspuns în anticorpi. Aici intervine limfocitul Th care a fost stimulat de epitopul secvenţial al aceluiaşi antigen. Limfocitul Th va secreta după activare un factor de creştere şi un factor de diferenţiere pentru limfocitele B, care se vor transforma în limfoblaşti, plasmoblaşti şi în final plasmociţi secretori de anticorpi. Deci, ca un antigen microbian să inducă un răspuns în anticorpi, el va trebui să fie fagocitat pe de o parte de macrofag care îi va evidenţia epitopul secvenţial (numit carrier în trecut), iar pe de altă parte va fi recunoscut prin epitopul structural de pe suprafaţa lui (haptenă) direct de limfocitul B care, sub influenţa citokinelor secretate de limfocitului Th, va deveni celulă secretoare de anticorpi. În decursul răspunsului imun o parte din limfocitele Th şi B se vor diferenţia în limfocite T, respectiv B de memorie care vor iniţia la o stimulare ulterioară cu acelaşi antigen un răspuns secundar mai rapid şi eficient. În afară de antigenele timodependente mai există şi antigene timoindependente. Acestea sunt în general antigene cu epitopi repetitivi (care se repetă în mod regulat de-a lungul moleculei ca, de exemplu, polizaharidul pneumococic), ele având proprietatea de a stimula direct limfocitele B, fără participarea limfocitelor T. Aceste antigene induc un răspuns în anticorpi discret şi fără memorie imunologică. 88.Expuneti principiile teoriei selectiei clonale in raspunsul imun Urmaşii unui limfocit B vor forma o clonă, şi atâta timp cât nu apare o mutaţie somatică în clona respectivă, toţi descendenţii clonei vor da naştere unui singur tip de anticorp. În decursul răspunsului imun normal se activează mai multe clone de limfocite B, care produc anticorpi cu afinitate mai mare sau mai redusă pentru antigenul respectiv, astfel că în ser vom găsi un amestec de de anticorpi în a căror moleculă secvenţa de aminoacizi va fi diferită. Acest aspect se explică prin faptul că cele mai multe antigene au mai mulţi epitopi. Astfel, dacă două antigene pot avea pe lângă epitopii specifici şi epitopi comuni, vor induce formarea de anticorpi policlonali care vor reacţiona cu ambele antigene prin epitopii comuni (reacţie încrucişată). În mod natural anticorpi monoclonali apar prin malignizarea plasmocitelor (în mielomul multiplu) care secretă un anticorp monoclonal în cantităţi mari. Proteina secretată de plasmocitele bolnavilor cu mielom multiplu (proteina Bence-Jones), care se elimină prin urină, reprezintă de fapt lanţuri uşoare L monoclonale. Ele au avut un rol important în descoperirea Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 55

structurii imunoglobulinelor. Dificultatea de a obţine anticorpi monoclonali in vitro a constat în imposibilitatea de cultivare a limfocitelor B. Anticorpii monoclonali s-au obţinut în laborator de prin izolarea în cadrul unui răspuns imun policlonal a unui singur limfocit B şi hibridizarea lui cu o celulă tumorală care să-i confere “imortalitate”. Produsul de fuziune, hibridomul, uneşte imortalitatea celulei tumorale cu specificitatea celulei B. Anticorpii monoclonali sunt reactivi foarte valoroşi întrucât recunosc un singur epitop. Ei nu reacţionează încrucişat decât în cazuri de excepţie când structurile sunt extrem de asemanătoare. Anticorpii monoclonali au o largă utilizare atât în cercetare, terapie cât şi în practica de rutină a oricărui laborator. Cu ajutorul anticorpilor monoclonali marcaţi cu o substanţă fluorescentă (de obicei izotiocianatul de fluoresceină) se evidenţiază prin microscopie în UV antigene bacteriene sau virale în produsele patologice sau biologice recoltate de la bolnavi, fiind astfel posibil un diagnostic rapid şi precis în infecţii în care agentul etiologic este greu de cultivat (infecţii chlamydiene, herpetice, sifilis etc.).

89.Raspunsul imun primar si secundar – caracteristici principale La o nouă întîlnire cu antigenul, receptorii pentru antigen se găsesc în concentraţie mai mare decât la prima întâlnire. Ca urmare probabilitatea întâlnirii partenerilor de reacţie potriviţi creşte, reacţia imunogenetică decurgând mai rapid. Răspunsul primar. În urma stimulării antigenice, răspunsul în anticorpi parcurge 4 faze: • o perioadă de latenţă, a cărei durată depinde de natura antigenului şi care durează în general 2 săptămâni, • o fază de creştere, în cursul căreia apar anticorpii, titrul lor crescând în progresie geometrică, • o faza în platou, în care anticorpii se menţin la un nivel costant pentru câteva săptămâni şi, • o fază de descreştere, în care anticorpii sunt metabolizaţi şi dispar. Răspunsul secundar se deosebeşte de cel primar piin: 1. cinetica răspunsului. Faza de latenţă în răspunsul secundar este mai scurtă (3-5 zile), faza de platou prelungită (luni) şi descreşterea mai lentă (luni, ani, uneori pe toată viaţa). 2. nivelul de anticorpi. Titrul maxim de anticorpi este în general de 10 ori mai mari decât în răspunsul primar. 3. clasa de anticorpi. Anticorpii din răspunsul primar sunt IgM, iar cei din răspunsul secundar IgG. 4. afinitatea anticorpilor. În răspunsul secundar, afinitatea anticorpilor faţă de antigen este mai mare decât în răspunsul primar. Amplitudinea crescută şi rapiditatea răspunsului secundar sau a unor rapeluri ulterioare sunt posibile datorită memoriei imunologice. Limfocitele B de memorie au pe suprafaţa lor receptori pentru antigene cu afinitate mai mare pentru antigen, şi după contactul cu acesta Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 56

proliferează foarte repede transformându-se în plasmocite producătoare de IgG specifice. Nu se ştie precis dacă şi receptorii pentru antigen ai limfocitelor T au afinitate mai mare pentru antigen decât în răspunsul primar, dar s-a constatat că răspunsul secundar se produce la o stimulare cu cantităti mai mici de antigen. Cunoaşterea dinamicii de apariţie ai anticorpilor în răspunsul primar şi secundar este importantă pentru calendarul de vaccinări.

90.Vaccinuri – ce sunt?in ce scop se utilizeaza? Vaccinurile sunt preparate biologice dotate cu proprietăți antigenice, care declanșează apariția răspunsului imun la organismele supuse vaccinării.Protecția imunologică se instalează după interval de timp variabil de la inoculare (săptămâni, luni), în funcție de vaccin, și este de lungă durată (ani). Eficiența vaccinării este demonstrată prin dovezi statistice, care indică fără dubii o scădere importantă a numărului de cazuri de îmbolnăvire prin agenți infecțioși acoperiți de vaccinuri, după introducerea vaccinării în masă. Cel mai semnificativ rezultat obținut până în prezent printr-un program de vaccinare în masă a fost eradicarea variolei. În prezent, există 26 de boli infecțioase care pot fi prevenite prin vaccinare, dar acest număr este în creștere. Sunt în curs de desfășurare sute de proiecte de cercetare pentru dezvoltarea de noi vaccinuri. Poliomielita este în curs de eradicare, printr-un program al O.M.S., obiectivul propus fiind obținerea certificării mondiale a eradicării poliomielitei, până la sfârșitul anului 2008. Chiar dacă acest termen se va prelungi, eradicarea poliomielitei va deveni, cu siguranță, o certitudine în anii următori. 91.Clasificarea vaccinurilor,exemple 1.Vaccinări cu obligativitate generală Sunt vaccinările cuprinse în programele naționale de vaccinare ale fiecărei țări, care sunt obligatorii pentru toată populația țării respective și se efectuează gratuit. În continuare ne vom referi la vaccinările obligatorii care se efectuează în România. 

Vaccinarea BCG - se administrează în doză unică, intradermic, în regiunea deltoidiană, nou născuților cu greutatea la naștere mai mare de 2500 grame, între vârsta de 2-7 zile și 2 luni. În clasa a VIII-a (la vârsta de 13-14 ani) se administrează o nouă doză de vaccin BCG, numai dacă rezultatul testării IDR la tuberculină este negativ (sub 9 mm). Injecția este foarte dureroasă. Reacția postvaccinală poate fi destul de neplăcută, iar timpul de vindecare al leziunii postvaccinale poate ajunge și la 6 luni, în caz de ulcerație si abces. Intensitatea reacției postvaccinale crește odata cu vârsta, de aceea în ultimii ani s-a renunțat la vaccinarea din clasele a VIII-a și a XII-a.



Vaccinarea DiTePer (împotriva difteriei, tetanosului și tusei convulsive)



Vaccinarea DT (împotriva difteriei și tetanosului)



Vaccinarea antipolio



Vaccinarea antihepatită B



Vaccinarea ROR (împotriva rujeolei, oreionului și rubeolei)

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 57

2. Vaccinări cu obligativitate selectivă Nu vizează populația generală, fiind obligatorii doar pentru grupele de populație expuse la factori de risc suplimentari, conform reglementărilor Direcției de Sănătate Publică. 

Vaccinări efectuate în situații epidemiologice speciale

Se efectuează acolo unde există risc de izbucniri epidemice: vaccinare anti-tifoidică, antidizenterică, anti-hepatită A (de ex. în regiunile unde s-au produs inundații). 

Vaccinări de necesitate

Se efectuează preventiv, post expunere (de ex. vaccinarea antirabică și antitetanică, în cazul mușcăturilor de animale, pentru prevenirea rabiei și tetanosului, vaccinarea antitetanică cu o doză de rapel, în cazul plăgilor tetanigene, vaccinarea antirujeolică a contacților de rujeolă, în primele 5 zile de la contact). 

Vaccinări de interes regional

Sunt necesare pentru cei ce călătoresc în zone endemice pentru anumite boli: vaccinarea antiamarilică (împotriva febrei galbene), anti-pestoasă (împotriva ciumei), antiholerică. Se efectuează în centre speciale. 

Vaccinări de interes profesional

Se efectuează la personalul care, prin natura profesiei, este expus riscului de a contacta diverse boli (vaccinare anti-hepatitică B la personalul medical; vaccinare anti-leptospirotică, anticarbunoasă, antirabică la personalul din zootehnie etc.). Unele din aceste vaccinări se efectuează în centre speciale. 

Vaccinări efectuate la grupele de risc

Vizează selectiv grupele de populație cu risc crescut pentru forme grave de boală și deces (bolnavi cronici sau vârste extreme: copii și bătrâni). În România, se încadrează în această categorie vaccinarea antigripală. 

Vaccinări efectuate în funcție de sex

Din această categorie fac parte: vaccinarea obligatorie a gravidelor în luna a VIII-a, cu o doză de rapel anti-diftero-tetanic (în scopul imunizării pasive a fătului, anticorpii materni trecând în sângele fetal, unde persistă și după naștere, aproximativ până la vârsta de 6 luni), și vaccinarea anti-rubeolică selectivă a fetelor (în clasa a VII-a), în scopul reducerii incidenței rubeolei congenitale. 3. Vaccinări opționale 

Vaccinare împotriva Haemophilus influenzae tip b (Hib)



Vaccinare antivariceloasă



Vaccinare antihepatitică A



Vaccinare antigripală



Vaccinare antipneumococică



Vaccinare antimeningococică

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 58

92.Descrieti schematic structura unei molecule de imunoglobulina Imunoglobulinele sunt structuri moleculare bifuncţionale: o parte a moleculei se leagă prin complementaritate de antigen, iar cealaltă parte este responsabilă de o serie de efecte biologice secundare. Unitatea de bază a imunoglobulinelor este formată din 2 lanţuri identice grele, H (heavy) cu GM de 50.000 - 70.000 Da şi 2 lanţuri identice uşoare L (light), cu GM în jur de 25.000 Da, care se asamblează în formă de T sau Y. Lanţurile sunt legate între ele de forţe necovalente hidrofobe şi prin punţi disulfurice: o punte între lanţurile L şi H şi cel puţin două între lanţurile H în funcţie de clasa şi subclasa de anticorp. Această unitate monomerică are o GM în jur de 150.000 Da. Lanţurile grele prezintă o diversitate structurală accentuată fiind notate cu literele greceşti gama (γ), miu (μ), alfa (α), delta (δ) şi epsilon (ε). Lanţurile uşoare sunt numai de două tipuri: kappa (κ) şi lambda (λ). Fragmentele Fab reprezintă capetele NH2 terminale ale moleculei, fiind purtătoare, fiecare, a unui situs de combinare cu antigenul. Paratopul, structura esenţială a anticorpului, este situsul de interacţiune cu epitopul, format din regiuni hipervariabile şi variabile ale lanţurilor H şi L. Fiecare imunoglobulină conţine doi paratopi identici ce se află în regiunea hipervariabilă a lanţurilor H şi L. Deci, un anticorp este bivalent. Dacă se cercetează secvenţa de aminoacizi a lanţurilor grele şi a lanţurilor uşoare în cadrul unei clase de imunoglobuline, se observă o enormă diversitate a acesteia la capătul NH2terminal al lanţurilor, pe când restul domeniilor (unul C-terminal la lanţul uşor şi 2 domenii mijlocii şi unul terminal la lanţurile grele) demonstrează o structură constantă. Regiunile NH 2 terminale a lanţurilor grele H şi a lanţurilor uşoare se notează cu VH, respectiv VL. Partea constantă a lanţului uşor se numeşte CL. Partea constantă la lanţului greu cuprinde 3 regiuni diferite CH1, CH2, CH3. Aceste regiuni sunt stabilizate prin punţi disulfurice intracatenare şi se numesc domenii. De domeniile CH2 se leagă lanţuri oligozaharidice. Cele 2 situsuri de legare cu antigenul sunt situate în domeniile variabile. Regiunea balama este un segment al lanţurilor grele localizat între CH1 şi CH2 şi ea schimbă unghiul dintre Fab şi Fc după legarea anticorpului cu antigenul. Astfel, Fab este perpendicular pe Fc, imaginea tridimensională a imunoglobulinelor amintind de litera T. Fragmentul Fc, situat la extremitatea -COOH terminală a moleculei, poartă situsuri citofile (prin care unele imunoglobuline se pot fixa de anumite celule ca, de pildă, neutrofile, macrofage, bazofile), situsuri de fixare a complementului şi markerii izotipici şi alotipici al lanţurilor H.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 59

93.Tipuri de imunoglobuline Imunoglobulinele se clasifică în funcţie de lanţurile pe care le conţin în 5 clase: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. De exemplu imunoglobulina G conţine 2 lanţuri grele γ şi două lanţuri uşoare κ sau λ. Aceeaşi imunoglobulină conţine sau lanţuri λ sau κ. Imunogobulinele care conţin lanţuri κ apar de două ori mai frecvent decât cele ce conţin lanţuri λ. (nu stiu ce sa scriu mai mult)

94.IgM si IgG structura si rol Imunoglobulina G IgG reprezintă 70% - 80% din imunoglobulinele serice, concentraţia ei fiind de 8-16mg/ml. Concentraţia normală este atinsă la vârsta de 5-8 ani. Dimensunea mică a moleculei (GM 15 KD) face posibilă pătrunderea ei şi în ţesuturi. IgG se împarte în 4 subclase IgG1, IgG2, IgG3 şi IgG4, care diferă între ele structural prin secvenţa aminoacizilor în Fc al lanţurilor H şi prin numărul şi sediul legăturilor disulfurice dintre lanţurile H şi L şi dintre lanţurile H. Diferenţelor structurale le corespund proprietăţi diferite care sunt ilustrate în tabelul xx. Proprietatea IgG1 şi IgG3 de a se lega prin Fab de antigenul bacterian (opsonizare) şi prin Fc de receptorii de pe suprafaţa PMN şi a macrofagelor favorizează înglobarea bacteriilor de către aceste celule, potenţând fagocitoza. În afară de IgG4, toate celelalte subclase de IgG sunt capabile să activeze complementul pe cale clasică după unirea cu antigenul specific (de exemplu o celulă bacteriană), ceea ce are ca urmare citoliza dacă antigenul este situat la suprafaţa unei celule (bacteriene de exemplu). Clasa IgG cuprinde, în afară de anticorpi opsonizanţi, şi anticorpi neutralizanţi (antitoxine), precipitanţi (precipitine) şi aglutinanţi (aglutinine). IgG trec prin placentă de la mamă la făt, asigurând rezistenţa antiinfectioasă a sugarului în primele luni după naştere. Timpul de înjumătăţire a IgG serică este de 21 de zile, cu excepţia IgG3 care este metabolizată după 7 zile. Imunoglobulina M IgM se prezintă sub forma unei structuri mari (IgM-macroglobulină) pentamerice cu o greutate moleculară de 900.000 Da şi constantă de sedimentare de 19S. Cei 5 monomeri de IgM sunt legaţi între ei printr-un lanţ J. Datorită greutăţii moleculare mari, IgM nu trece prin placentă. Reprezintă 6-7% din totalul imunoglobulinelor serice, concentraţia fiind de 0,52mg/ml. Această concentraţie este atinsă la vârsta de 1 an. Timpul de înjumătăţire a IgM este de 6 zile. Se cunosc 2 subclase de IgM - IgM1 şi IgM2, fără a se evidenţia însă diferenţe în activitatea lor biologică. În contextul răspunsului imun, IgM este clasa de anticorpi care apare în răspunsul primar. Prezenţa anticorpilor IgM faţă de un anumit agent infecţios indică o infecţie acută, recentă.Mare parte din “anticorpi naturali”, ca de exemplu isoaglutininele de grup (anti-A, anti B), sunt IgM. Datorită structurii pentamerice, IgM are 10 situsuri de combinare cu o configuraţie care permite legarea preferenţială de antigenele corpusculare. Aşadar, este deosebit de eficace în legarea microorganismelor, producând aglutinarea acestora. Prin fixarea complementului se realizează concomitent opsonizarea bacteriilor. IgM activează complementul pe cale clasică favorizând deci şi bacterioliza. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 60

95. IgA si IgE structura si rol Imunoglobulina A IgA reprezintă 17% din totalul imunoglobulinelor. Ea apare în ser ca monomer, cu GM de 160.000 Da şi o constantă de sedimentare de 7S, într-o concentraţie de 200 mg/100ml şi este formată de plasmocitele din ganglionii limfatici şi splină. Nu este capabilă să fixeze complementul, dar reacţionează cu antigenele din torentul circulator. Se presupune, de pildă, că antigenele din intestin ce au pătruns prin bariera intestinală şi au ajuns în sânge sunt fixate de IgA şi vor fi eliminate prin ficat. Cea mai mare parte a IgA este prezentă extravascular sub formă de dimer - IgA secretor (SIgA) - în secreţiile epiteliilor (lacrimi. salivă, mucus bronşic etc.) şi la suprafaţa mucoaselor. Cea mai mare parte a S-IgA este produsă de plasmocitele ţesutului limfatic asociat mucoasei intestinale dar şi ale celui asociat celorlalte mucoase (respiratorii, nazale etc.). S - IgA este alcătuită din 2 molecule de IgA, legate printr-un lanţ J (join) glicolipidic şi o componentă secretorie polipeptidică (CS). Componenta secretorie se adaugă dimerului în celula epitelială şi facilitează transportul IgA prin epitelii şi secreţia sa în salivă, lacrimi, lapte şi protejează S - IgA de acţiunea enzimelor digestive. Ca şi IgA seric, S - IgA nu poate fixa (activa) complementul pe cale clasică ci numai alternativă, deci nu poate participa la opsonizare. Fixează însă bacterii şi virusuri prin Fab formând complexe imune şi împiedică astfel fixarea acestor agenţi infecţioşi de celulele epiteliale ale mucoaseor. Această “neutralizare” este cea mai importantă funcţie antiinfecţioasă a S-IgA pe mucoase. IgA are două subclase IgA1 şi IgA2. IgA 1 se găseşte predominent sub formă monomerică deci în ser, iar IgA2 mai ales sub forma de S-IgA. Concentraţia normală de S-IgA este atinsă la vârsta de 10-11 ani, ceea ce explică frecvenţa infecţiilor respiratorii la copii. La una din 700 de persoane se constată un deficit de S-IgA, Dacă acest deficit nu este compensat de o activitate crescută de IgM sau dacă se adaugă şi un deficit de IgG, persoanele afectate sunt susceptibile de a face frecvent infecţii respiratorii şi intestinale. Imunoglobulina E Este o Ig monomer, cu GM 190.000 şi costantă de sedimentare 9S. Timpul de înjumatăţire este de 2-4 zile. Nu fixează complementul. Se găseşte în cantităţi extrem de mici în serul persoanelor sănătoase, dar în concentraţii crescute la persoane alergice. IgE sunt anticorpi citofili, care se leagă prin Fc de receptorii specifici de pe suprafaţa leucocitelor bazofile şi a mastocitelor. În contact cu alergenul specific, care le-a indus producerea, are loc degranularea acestor celule cu eliberarea unor mediatori chimici (histamină, serotonină, leucotriene, prostaglandine), responsabili de manifestările alergice de tip I anafilactic 96.Ce sunt antigenele: definitie,tipuri,exemple Antigenele sunt substanţe capabile de a interacţiona specific cu receptorii pentru antigen (anticorp, BCR1, TCR2). Datorită configuraţiei de suprafaţă, antigenele sunt recunoscute de organism ca străine, ca “non-self”. În unele situaţii patologice chiar şi unele substanţe proprii ale organismului pot deveni antigenice, nemaifiind recunoscute de organism ca self. Un agent infecţios, indiferent de natura lui, este un mozaic de antigene capabile să producă un răspuns imunitar. Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 61

Grupările unui antigen care sunt recunoscute de organism ca “non-self” se numesc epitopi. Partea complementară a efectorilor imuni (anticorpi sau receptori de pe suprafaţa limfocitelor) se numeşte paratop. Un antigen poartă în general mai mulţi epitopi diferiţi faţă de care organismul va produce tot atâţia anticorpi cu paratopi diferiţi. S-au descris şi antigene cu epitopi identici repetitivi. Poziţia epitopilor într-un antigen este diferită şi în funcţie de această poziţie pot fi recunoscuţi de limfocitele - T sau B. Tipuri de antigene:  Antigenele de histocompatibilitate (MHC) Se deosebesc trei clase de antigene majore de histocompatibilitate: MHC-I, MHC-II şi MHC-III. Limfocitele T recunosc antigenele străine numai dacă acestea sunt în asociaţie cu antigenele MHC. Limfocitele T - helper (CD4) recunosc antigenele doar în asociaţie cu MHC-II. Antigenele pot fi prezentate, deci, limfocitelor Th doar de macrofage (monocite şi macrofage tisulare) şi limfocitele B. Aceasta constituie baza restricţiei imunologice. Limfocitele T - citotoxice (CD8) “vânează” celulele organismului care devin “non-self” prin modificarea structurii antigenice de suprafaţă în urma pătrunderii unui virus, unui microorganism facultativ intracelular sau a transformării tumorale. Ele recunosc antigenele de pe suprafaţa acestor celulele numai în asociaţie cu antigenele MHC-I. În condiţii fiziologice vor fi reperate toate celulele devenite “non-self”.  Antigene microbiene Dintre acestea amintim: • antigenele capsulare (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella, Bacillus anthracis, antigenul de înveliş Vi al bacilului tific, antigenul K al bacilului coli enteropatogen etc.), • antigenele de perete (antigenul O din peretele bacteriilor gram-negative, proteina M a streptococului de grup A), • exoenzimele (coagulaza, hemolizinele secretate de Staphylococcus aureus, fibrinolizinele streptococului beta-hemolitic de grup A etc.), • exotoxinele (difterică, tetanică, diferitele enterotoxine etc.)  Antigene de specificitate- Antigenele pe baza cărora agenţii infecţioşi se încadrează în diferite unităţi taxonomice (familii, genuri, specii)  Superantigenele sunt antigene care stimulează în mod necontrolat şi dramatic proliferarea limfocitelor T care au în structura receptorului lor pentru antigen anumite specificităţi V (vezi receptorii pentru antigen ai limfocitelor), fără să se supună restricţiei MHC. 97.Antigenele-factori de care depinde imunogenitatea Antigenele trebuie să aibă o anumită configuraţie de suprafaţă şi o structură chimică ce le conferă caracterul de “non-self”, deci de străin de organism. Natura chimică a antigenelor este foarte variată. Cele mai bune antigene sunt proteinele urmate de polizaharide, care sunt antigene şi haptene foarte bune, apoi de lipide şi acizi nucleici, care sunt cel mai ades haptene. Se adminte că greutatea moleculară a unui antigen Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 62

este în general peste 10.000 D, dar există şi excepţii. Glucagonul, spre exemplu, este imunogenic cu toate că are GM de 3.600 D. Intensitatea răspunsului imun faţă de un antigen este în funcţie de natura chimică, persistenţa în organism, doza, ritmul, calea, intervalul şi calea de administrare. Cunoaşterea răspunsului în funcţie de aceşti factori stă la baza elaborării calendarului de vaccinări. Administrarea antigenelor cuplate cu adjuvanţi induce un răspuns imunitar mai intens, deoarece creşte perioada de remanenţă a antigenului în organism. Exemple de adjuvanţi sunt adjunvatul Freund incomplet ce conţine apă, ulei mineral şi lanolină şi adjuvantul Freund complet care conţine în plus BCG1. Studiul răspunsului imun faţă de antigenele cuplate şi necuplate cu adjuvanţi este foarte important, deoarece antigenele de pe suprafaţa bacteriilor nu induc niciodată răspunsuri imune în stare pură, ci cuplate cu corpul bacterian, a cărui componente au rol adjuvant, influenţează răspunsul imun. Din punct de vedere al organismului care produce anticorpii faţă de antigene, acestea sunt: - antigene alogenice, care provin de la indivizii aceleiaşi specii şi împart specia în grupe. Un exemplu de astfel de antigene sunt antigenele eritrocitare care determină grupele sanguine, - antigene singenice, care provin de la acelaşi organism, - autoantigene, care sunt substanţe proprii organismului ce au suferit o modificare, nemaifiind recunocute ca “self” de sistemul imunitar, - antigene xenogenice sunt antigene care provin de la o altă specie. Astfel de antigene, foarte importante în patologia umană, sunt antigenele bacteriene. 98.Reactia antigen-anticorp;mecanism general si forme de evidentiere Este determinată de interacţiunea specifică dintre epitopii antigenului şi paratopii anticorpilor Intervin legături o de hidrogen o electrostatice o forţe Van der Waals o hidrofobe Caracetristici: 1. Are o mare putere de rezoluţie 2. Selectivitatea fiecărei reacţii nu este absolută 3. Necesită obţinerea unui semnal secundar pentru a fi detectabilă 4. Prezintă un domeniu de aplicare extrem de larg Forme de evidentiere:

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 63



Seroidentificare: detectarea şi dozarea Ag (component necunoscut)(medicamente,hormoni peptidici, antigene virale sau bacteriene) cu: - Ac monoclonali - Ac policlonali 

Serodiagnostic: detectarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor (component necunoscut) faţă de un Ag specific cunoscut Pentru evidentiere se efectueaza reactii de precipitare,aglutinare,de fixare a complementului,de seroneutralizare,reactii care utilizeaza componente marcate.(sunt prezentate in detaliu in subiectele urmatoare) 99.Reactiile de precipitare in mediu lichid exemple,utilizari Formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac.Condiţiile de formare a reţelei de precipitare: - Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi) - Ag sa fie multivalent Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalenţă (Ac si Ag sunt in raport optimal de concentraţie) ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator În exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formează. Reactia de precipitare inelara (depistarea antigenelor microbiene): prot.M streptococi, Ag.termostabil antrax (reactia Ascoli) Reacţia de floculare (tehnica Ramon) - Calitativa - Cantitativa  Se efectuează diluţia succesivă a serului imun la care se adauga cantităţi egale de Ag  Se întroduc probele în termostat  Periodic se examinează pentru depistarea tubului în care apare precipitatul iniţial (zona de echivalenţă)  Utilizare: determinarea cantitativa de toxină, antitoxină sau anatoxină,VDRL

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 64

100.Reactia de precipitare in gel exemple,utilizari Difuzia în gel : Difuzia simplă Difuzia dublă Difuzia combinată cu migrarea în câmp electric. Se utilizează gel de agar sau agaroză (concentraţie de 0,8-1,6 g %) Imunodifuzia radială simplă(Mancini, Carbonara, Heremans;1965)IDRS Aplicaţii (cantitativ): IgG, IgA, IgM, C3, alfa-1 antitripsină, siderofilină, proteina C-reactivă (CRP) Imunodifuzia dublă ( Elek, Ouchterlony; 1948 ) DD Aplicaţii (calitativ) : proteinele Bence-Jones(kappa şi lambda), crioglobuline Testul Elek (toxinogeneza la C.diphteriae )

101.Reactii de aglutinare principiu,tipuri,exemple Agregarea antigenelor corpusculare naturale sau fixate artificial pe suprafaţa unor particule (bacterii, hematii, latex)/aglutinogene prin Ac specifici completi/aglutinine. Ac reacţionează numai cu determinantul Ag specific; Ac specifici sunt compleţi, cel puţin bivalenţi; Ac pot fi: - aglutinanţi - neaglutinanţi (blocanţi sau incompleţi) - care aglutinează numai la rece (+4°C) Mecanism: scăderea forţelor de respingere electrostatice dintre particule şi aparitia unor punţi de legătură prin intermediul Ac Clasificarea reacţiilor de aglutinare 1.Aglutinare “activă” sau “directa”, în care particula figurată (Ag corpuscular) este el însuşi purtător de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite,spermatozoizi, bacterii) Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 65

ex. determinarea grupelor sanguine, seroidentificarea Ag bacteriene sau depistarea şi titrarea Ac din serul pacientilor (ex.bruceloza)

2.Aglutinare “pasivă” sau “indirectă”, în care particula serveşte doar de suport pentru un determinant antigenic solubil fixat artificial pe suprafaţa sa (hematii, particule de latex sau microcristale de colesterol) Ex. TPHA - se bazeaza pe o reactie de hemaglutinare pasiva pentru evidentierea anticorpilor specifici anti-treponemici. Reacţia de coaglutinare este utilizată în detectarea antigenelor diferitelor grupuri de steptococi, Neisseria meningitidis şi Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae Tehnica Coombs directă (test antiglobulinic direct)La un nou-născut: prezenţa Ac materni anti-Rh fixaţi pe hematii (dacă mama este Rh-) Testul Coombs indirect (detecteazã anticorpii circulanti antieritrocitari) 102.Reactia de fixare a complementului Este o reactie complexa, constituita din 2 sisteme Ag-Ac si cu participarea C.In RFC participa Ig capabile sa fixeye C- IgM si IgG(se utilizeaza in diagn virozelor,infectiilor bacteriene etc.)Toate componentele RFC sunt utilizate in acelasi volum fiind titrate in prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru.Rectia este însoţită de martori ai tuturor componenţilor. RFC se efectuează în 2 etape utilizând 2 sisteme I etapă-Sistemul de bază este constituit din Ag 1(diagnosticuri sau Ag necunoscute),Ac 1(serul bolnavului) şi complement in doza de lucru.Amestecul este incubat la 1h şi 37°C sau mentinut 16-18 ore la 4°C.Dacă Ac se combină cu Ag omolog va avea loc şi fixarea C(efect frecvent invizibil). II etapă-la sistemul de bază se adaugă sistemul indicator(hemolitic), constituit di hematii de berbec(Ag2) combinate cu Ac specifici- serul hemolitic(Ac2).Peste 1h incubare la 37°C reactia este terminată. Interpretarea rezultatelor- dacă C a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se observă(rezultat pozitiv).Dacă Ag1 nu corespunde cu Ac1, C rămâne disponibil pentru fixarea pe sistemul indicator Ag2-Ac2,provocând hemoliza(rezultat negativ).

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 66

103.Reactia de seroneutralizare Este reacţia serologică de inhibare specifică a unor caracteristici biologice ale Ag microbian.Acest lucru înseamnă combinarea Ag specific, biologic activ,cu Ac corespunzător conducând la blocarea proprietaţilor biologice ale acestuia.Pentru a putea vizualiza reacţia trebuie sa adugăm un sistem indicator(hematii de oaie). RSN se realizează în 2 etape: I etapă- se pun în contact Ag şi serul imun neutralizant(contine Ac anihilanti) După o perioadă de incubare(formarea reacţiei Ag-Ac) amestecul este testat pentru efectul său biologic. II etapă-dacă reactia Ag-Ac s-a realizat efctul biologic dispare( proprietatea biologică a Ag a fost neztralizată) dacă nu efectul biologic activ se produce pe sistemul indicator. Aplicatii: 1.Diagn microbiologic: identif. Serologică a Cl. perfringens,identif exoroxinei difterice,exotxinei botulinice. 2.Serodiagnostic:dozarea ac ASLO,serodiagnosticul unor viroze Reactia ASLO:reactia de seroneutralizare utilizată în diagnosticul microbiologic indirect:ASLO se practica în: diagn serologic al infecţiilor streptococice şi post-streptococice şi a complicaţiilor ASLO(-) nu infirmă diagnosticul de infecţie streptococică Principiu:dozarea Ac antistreptolizină O se bazează pe efectul neutralizant al acestora asupra streptolizineiO(SLO) prin existenţa în ser a antistreptolizinei O este observată prin absenţa hemolizei unor eritrocite test(sistemul indicator) Materiale necesare: Ser de cercetat,SLO liofilizată.sânge defibrinat de iepure,soluţie salină,sol de Rivanol, etc. Tehnica de lucru. I-serul bolnavului se inactivează 30 min la 56°C şi se tratează cu Rivanol pentru îndepărtarea inhibitorilor -se efectuează dilutia 1/10 a seului si se menţine 30 min la 56°C Se realizează diluţii succesive binare,de ser şi se pun în contact cu SLO(cantitate constanata) Se agită tuburile şi se menţin 15 min la 37°C(R. de neutralizare) II- se adaugă suspensia de hematii cantitate fixă,0,5 ml în fiecare tub Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 67

-se incubează 45 min la 37°C plus peste noapte la 4°C Citire a doua zi. Titrul este dat de tubul cu diluţia cea mai mare de ser de testat în care lipseşte hemolizaceea ce exprimă prezenţa unei cantităţi suficiente de Ac ASLO,capabili sa neutralizeze întreaga cantitate de SLO din amestec Titrul normal ASLO este între 0-200UI/ML. 104.Reactii Ag-Ac care utilizeaza componente marcate In unele cazuri este imposibil de a detecta o reactie Ag-Ac deoarece exista Ac care nu precipita,altii care nu aglutineaza,altii care nu fixeaza complementul.In aceste cazuri utilizam Ac marcati pentru a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac cu marcanti nu afecteaza proprietatile lor imunologice.Aceste reactii semonteaza pe suport solid(lama,placi din plastic). Marcantii utilizati uzual: 1.Fluorocromi(rodamina,floresceina) care emit o lumina rosu-oranj sau verde-galbena la tratarea lor cu raze UV(r. De imunofluorescenta – RIF) 2.Enzime(fosfataza alcalina,peroxidaza) capabila sa modifice culoarea unui substrat(r imunoenzimatica) 3.Radio-izotopi care emit raze gamma sau beta-analiza radioimuna 105.Hipersensibilitate-definire,tipuri,exemple În evoluţia unor infecţii, efectorii imunitari pot contribui, alături de agentul etiologic, la patogenia bolii prin sensibilizarea la unele antigene microbiene. Răspunsurile imune care apar într-o manieră improprie sau exagerată corespund termenului de hipersensibilitate. Aceste reacţii sunt denumite reacţii alergice, iar antigenele implicate, alergeni. Reacţiile de hipersensibilizare apar la indivizi sensibilizaţi în prealabil printr-un contact anterior cu antigenul, deci sunt reacţii secundare. P.G. Coombs şi R.A. Gell clasifică în 1963 reacţiile de hipersensibilitate în 4 tipuri, în funcţie de viteza de reacţie şi natura efectorilor imuni implicaţi: • tipul I - reacţii mediate de anticorpi IgE (reagine), • tipul II - reacţii citolotic-citotoxice, mediate de anticorpi formaţi faţă de antigenele de pe suprafaţa celulelor, cu participarea complementului, celulelor K şi macrofagelor, • tipul III - reacţii mediate de complexe imune cu participarea complementului, • tipul IV - reacţii mediate de limfocitele T sensibilizate. Deşi tratate separat, reacţiile de hipersensibilitate apar în realitate rar complet izolate una de cealaltă, deoarece mecanismele lor se intrică. Exemple: Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 68

Tipul I: Alergenele care induc acest tip de hipersensibilitate sunt foate variate ca, de pildă, polenul, sporii de mucegai (Aspergillus), praful de casă, părul animalelor, unele alimente (ouă, lapte, căpşuni, ciocolată etc.), seruri terapeutice, medicamente (penicilina), veninul unor insecte (viespi) etc Tipul II: Sindromul Goodpasture poate fi considerat un exemplu tipic. Reacţia de tip II apare şi în unele infecţii, ca, de pildă, în infecţiile streptococice (cardita reumatismală), în care se sintetizează anticorpi faţă de unele antigene streptococice ce au asemănăre cu un antigen al fibrei miocardice. Hipersensibilitatea citotoxică-citolitică se mai întâlneşte în infecţii cu mycoplasme, virusuri (hepatită B), protozoare (malarie) etc. Tipul III: plămânul de fermier datorată inhalării prafului provenit dela fân mucegăit Boala serului este o reacţie de tip III generalizată şi apare la pacienţi cărora li s-au administrat, în scop terapeutic, doze mari de ser imun heterolog (ser antidifteric sau antitetanic preparat pe cai). Tipul IV: Manifestările clinice ale hipersensibiblităţii de tip întârziat sunt reacţia la tuberculină, reacţia granulomatoasă, dermatita de contact şi hipersensibilitatea Jones-Mote. 106.Reactii anafilactice – mecanism,forme de manifestare Primul pas în desfăşurarea reacţiei de tip I este reprezentat de contactul alergenului cu organismul, cea mai frecventă cale de pătrundere a acestor antigene fiind cea respiratorie. Alergenele se pot afla în forme mai mult sau mai puţin pure (polenul), sau cuplate cu particulele de praf inhalate şi depozitate pe mucoasa respiratorie. După depozitarea în epiteliu, sau penetrarea filmului de mucoasă, alergenele sunt preluate de celulele prezentatoare de antigen (CPA). Acestea prezintă alergenul limfocitelor Th. Limfocitele Th activate vor secreta interleukinele IL4, IL13 şi IL5. IL4 şi IL13 vor acţiona asupra limfocitului B care sub acţiunea acestor interleukine se va transforma în plasmocit care va produce în loc de IgG, IgE. Interleukina 5 va induce eozinofilie. Limfocitele Th activate induc apoi transformarea limfocitelor B în plasmocite producătoare de IgE. A doua etapă a reacţiei de tip I este activarea celulelor mastocitare şi este declanşată de o nouă întâlnire cu alergenul. Alergenul se va uni cu IgE fixate pe mastocite şi va determina o reacţie încrucişată între două molecule de IgE cu interconexiuni ale receptorilor Fc la nivelul membranei iritate a celulei mastocitare. Degranularea apare ca o consecinţă a influxului de Ca++. Granulele, conţinând mediatori deja sintetizaţi, migrează spre suprafaţa celulelor mastocitare, fuzionează cu membrana externă şi îşi eliberează constituienţii (histamina, serotonina, leucotriene şi prostaglandine, factori chemotactici). În a treia fază a recţiei de tip I, mediatorii produc variate efecte care dau naştere simptomatologiei clinice Forme de manifestare: La nivelul tractului respirator, histamina eliberată determină contracţia musculaturii netede a bronhiilor (bronhoconstricţia) în decurs de câteva minute. În acelaşi timp, mediatorii Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 69

chemotactici eliberaţi favorizează invadarea mucoasei de către granulocitele eozinofile şi neutrofile, limfocite şi trombocite, în decurs de câteva ore. Aceste celule inflamatorii eliberează ele însele mediatori, unii dintre ei toxici, de exemplu, aşa-numita “proteină bazică majoră a eozinofilelor”. Aceşti mediatori cauzează o reacţie întârziată, la 6-10 ore de la contactul cu alergenul, tradusă prin: bronhoconstricţie, secreţie de mucus şi edem al mucoasei. Reacţia indusă de celulele inflamatorii determină o creştere a hiperreactivităţii bronşice şi formează baza alergiei sau inflamaţia astmatică a mucoasei respiratorii. Când antigenul sensibilizant (alergenul) este inoculat parenteral în doză suficient de mare (penicilină, procaină, seruri heteroloage etc.) apare o reacţie sistemică manifestată prin urticarie, fenomene asfixice, şoc şi colaps circulator cu deznodământ adesea fatal. Când alergenul este inoculat în doză foarte mică (înţepături de albină) sau depus pe o mucoasă (polenuri, praf de casă, mucegaiuri, alimente ca: ouă, peşte, fragi), expresia clinică a fenomenului este mai mult sau mai puţin circumscrisă la tegument (urticaria), la mucoasa nazală şi conjunctivă (febra de fân), la căile respiratorii inferioare (astmul bronşic). Sensibilizările spontane faţă de antigene care pătrund în organism pe cale digestivă sau respiratorie se numesc şi reacţii atopice. Evoluţia unor infecţii se poate însoţi de fenomene anafilactice: viroze ale copilului (de exemplu, cu virusul sinciţial respirator), astmul intrinsec (sensibilizare la antigene ale bacteriilor care infectează tractul respirator inferior), lambliaza, helmintiaze (ascaridioză, echinococoză etc.). Depistarea sensibilizărilor anafilactice este obligatorie, mai ales atunci când se administrează un produs cunoscut pentru reacţiile anafilactice pe care le produce. Testul intradermic este indicat înainte de administrarea penicilinelor, a procainei, a serurilor imune heteroloage. La câteva minute de la inocularea intradermică a unei mici doze de alergen, la persoanele sensibilizate, apare o papulă urticariană înconjurată de o aureolă congestivă şi însoţită de prurit. Fenomenele dispar după aproximativ o oră. Riscul şocului anafilactic impune medicului care face testarea să lucreze cu diluţii mari de antigen şi să aibă la dispoziţie o medicaţie corespunzătoare şi antişoc. 107.Hipersensibilitatea de tip III – mechanism,boala serului,alte exemple Leziunile produse de reacţiile de tip III sunt iniţiate de complexe imune antigen-anticorp care, formate în cantitate mare, sau persistente în circulaţie, activează complementul şi determină leziuni la locul depunerii lor. La persoanele sănătoase, complexele antigen-anticorp sunt rapid fagocitate de macrofage dar, în anumite circumstanţe (de obicei când există un exces de antigen), ele persistă şi stau la baza a numeroase afecţiuni Complexele antigen-anticorp pătrund prin epiteliul vascular, se depun pe membrana bazală a vaselor şi activează complementul. C3a şi C5a, care sunt anafilatoxine, vor creşte permeabilitate vasculară, iar C5a (factor chemotactic) va determina afluxul de PMN. Activarea complementului, eliberarea enzimelor lizomale ale PMN vor produce alterarea membranei bazale. Simptomatologia clinică depinde de sediul reacţiei. Boala serului este o reacţie de tip III generalizată şi apare la pacienţi cărora li s-au administrat, în scop terapeutic, doze mari de ser imun heterolog (ser antidifteric sau antitetanic preparat pe cai). După 7-10 zile de la admnistrarea serului apar în circulaţie anticorpi faţă de proteinele de Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 70

cal. Dacă proteinele nu au fost înlăturate din circulaţie până la apariţia anticorpilor, aceştia se vor uni cu ele şi complexele imune formate se vor depune pe pereţii vaselor. Prin activarea complementului se vor leza pereţii vaselor la care se adaugă leziunile datorate enzimelor lizozomale pe care PMN, “frustrate” de a nu putea fagocita complexele depuse pe pereţii vaselor, le eliberează aici. În scurt timp pacienţii devin febrili, prezintă rash urticarian, adenită generalizată, splenomegalie, tumefieri şi dureri articulare, leucocitoză cu neutrofilie şi eozinofilie, scăderea complementului seric. Frecvent apare albuminurie, care traduce leziuni de glomerulonefrită. Infecţii cronice cauzate de streptococi hemolitici, stafilococi, virusuri hepatitice (stimulare antigenică persistentă) pot duce la continua formare de complexe imune şi afectarea consecutivă a organelor vizate. Un exemplu este glomerulonefrita care apare la la 2-3 săptămâni de la debutul unei infecţiei cu anumite serotipuri de Streptococcus pyogenes sau S. zooepidemicus. Mecanismul patogenic este similar bolii serului.

108.Hipersensibilitatea de tip IV – mechanism,evidentiere,aplicatii practice Reacţiile de hipersensibilitate de tip IV sunt antigen-specifice, dependente de limfocitele T, fiind rezultatul unei interacţiuni exagerate dintre un antigen şi mecanismele imunităţii celulare. Mecanismele reacţiei de tip IV sunt: hipersensibilitatea întârziată şi citotoxicitatea mediată celular. Hipersensibilitatea de tip întârziat. Limfocitele TDH (CD4+) sunt responsabile de hipersensibilitatea de tip întârziat. După stimulare antigenică, (prin microorgansime cu habitat intracelular limfocitele TDH secretă limfokine care vor activa macrofagele şi vor atrage şi alte celule în focarul inflamator. Macrofagele activate vor secreta la rândul lor o serie de mediatori biologic activi, cum sunt unele citokine, radicali liberi ai oxigenului, enzime lizozomale cu puternică actvitate microbicidă. Toate reacţiile descrise anterior se încadrează, de fapt, în apărarea antiinfecţioasă faţă de infecţii cronice cu bacterii intracelulare (tuberculoza, lepra, bruceloza etc.), infecţii micotice (histoplasmoza, blastomicoza etc.), infecţii virale (oreillonul, infecţia herpetică etc.) şi infecţii parazitare (leishmanioza etc.). Când aceste mecanisme nu reuşesc eliminarea microorganismului, antigenele persistente ale acestuia vor provoca o reacţie de hipersensibilitate cronică locală Manifestările clinice ale hipersensibiblităţii de tip întârziat sunt reacţia la tuberculină, reacţia granulomatoasă, dermatita de contact şi hipersensibilitatea Jones-Mote. Testarea reactivităţii mediată celular. Numărul în creştere al persoanelor cu deficienţe ale imunităţii mediată celular, unele congenitale, altele dobândite, sau induse iatrogen (prin medicaţie antitumorală, imunosupresivă), explică interesul pentru testarea acestui tip de reactivitate. Intradermoreacţia este cea mai simplă posiblitate de a depista hipersensibilitatea întârziată. Majoritatea persoanelor normale răspund cu reacţii de tip întârziat la inocularea intradermică a antigenelor de candida, tuberculină etc. Răspunsul negativ la inocularea acestor antigene indică o deficienţă a reactivităţii mediată celular. O reacţie exagerată semnifică o hipersensibilizare la antigenul utilizat.Cea mai utilizată reacţie este reacţia Mantoux de testare a reactivităţii la tuberculină. Se efectuează în şcoli pentru a depista copiii care nu sunt sensibilizaţi Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 71

la bacilul tuberculos pentru a fi vaccinaţi, pe cei imunizaţi şi pe cei hipersensibilizaţi pentru a fi investigaţi dacă nu cumva au dezvoltat o infecţie tuberculoasă. Hipersensibilitatea întârziată mediată de limfocitele Tc- citotoxice. Limfocitele Tc (CD8) sunt ele însăşi citotoxice după stimulare antigenică şi interacţiunea cu Th (CD4) Aceste celule au efect citotoxic direct asupra celulelor ţintă prin limfokinele pe care le secretă. Limfocitele Tc sunt stimulate de antigene prezente pe suprafaţa celulelor pe care organismul nu le recunoaşte ca “self”, cum sunt celulele virus infectate, celule tumorale sau ţesuturile transplantate Dintre limfokinele secretate de T citotoxice, cea mai importantă este perforina care se aseamănă cu fracţiunea C9 a complementului. Ca şi aceasta, se inseră pe membrana celulei ţintă, polimerizează şi şi formează canale transmembranare ce permit influxul de sodiu şi deci liza celulei. Limfocitele Tc sunt protejate de activitatea perforinei printr-o substanţă numiă protectină. Limfocitele Tc joacă rol esenţial în respingerea grefelor de ţesuturi şi organe.

Subiecte microbiologie an II sem I

pg. 72