Southern Blot

1. Southern Blot Dinamai setelah penemunya, biologi Edwin Selatan, Selatan Blot adalah metode untuk menyelidiki keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel DNA. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan enzim restriksi dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran dengan blotting melalui aksi kapiler. Membran tersebut kemudian terkena probe DNA berlabel yang memiliki urutan basa pelengkap untuk urutan DNA pada bunga. Kebanyakan protokol asli yang digunakan label radioaktif, namun non-radioaktif alternatif yang sekarang tersedia. Southern blotting kurang umum digunakan dalam ilmu laboratorium karena kapasitas teknik lain, seperti PCR, untuk mendeteksi urutan DNA spesifik dari sampel DNA. Bercak ini masih digunakan untuk beberapa aplikasi, bagaimanapun, seperti mengukur jumlah salinan transgen pada tikus transgenik, atau rekayasa gen sel induk garis KO embrio.

Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975). Teknik ini mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya yaitu dengan menempatkan gel elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti spons yang telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk pula beberapa kertas peresap di atasnya. Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan ke membran, demikian pula dengan gel yang membawa molekul ke kertas membran, sementara gelnya diserap oleh kertas peresap. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat kita dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA tersebut.

Di bawah kondisi-kondisi optimal, Southern blot mendeteksi ~ 0.1 pg DNA yang menarik. Blot teknik digunakan untuk memindahkan protein DNA dan RNA ke suatu pengangkut sehingga dapat dipisahkan, dan sering juga diikuti penggunaan suatu gel ectrophoresis. Southern blot digunakan untuk memindahkan DNA. Digunakan biologi molekular untuk melihat kemungkinan kehadiran suatu urutan DNA dalam suatu sample DNA. Southern blot Selatan berkombinasi gel agarose electrophoresis untuk separasi ukuran DNA dengan metoda untuk memindahkan DNA ke suatu membran filter untuk pemeriksaan hybridisasi. Metoda lain adalah Western blot dan Northern blot memiliki prinsip kerja yang sama tetapi menggunakan RNA dan protein. Setelah electrophoresis, gel tersebut diperlakukan dengan suatu alkali yang menyebabkan DNA terdenaturasi dan terpisah menjadi rantai tunggal. Suatu membran seperti selaput ditempatkan pada gel dan diberi tekanan melalui pengisapan atau metoda mundane dalam kertas handuk (paper towels) dengan suatu berat. DNA berpindah tempat ke membran dan stick. Membran DNA-impregnanted dibakar atau menyebar secara permanen dengan menyertakan DNA tersebut. Molekul yang kemudian diperlakukan dengan suatu pemeriksaan hybridisasi yang mana hanya suatu molekul DNA dengan urutan dikenali yang akan dipasangkan dengan urutan DNA yang telah ditandai (diblot). Pemeriksaan DNA berlabel dengan fluorescents atau chromogenic berpijar sehingga dapat teridentifikasi. Dengan pengujian pola dari hybridisasi dengan sinar X atau Autoradiografi, peneliti dapat menentukan fragmen yang berisi DNA sequence spesifik atau gen. Southern blots digunakan penemuan gen dan pemetaan, evolusi dan studi pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada organisme, Southern blot digunakan sebagai test untuk memastikan bahwa bagian DNA tertentu mengenal urutan gen. Southern blot analysis untuk menandai karakter transforman. Southern blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah copy dan untuk mendeteksi gross DNA penyusunan kembali yang mungkin telah terjadi perubahan. Jika kamu sedang menganalisis ß – galactosidase dengan memasukkan atau menyisipkan dan dipotong – potong dengan EcoRV maka akan dihasilakn potongan sekitar 1kb dari atas dan bawah dari urutan ß – galactosidase persandian dimulai. Pemecahan oleh enzim restriksi, Analisis Gel, dan bloting. Ini adalah prosedur standar dari Southern blot analysis.

a. dipecah sedikitnya 1 ug gen Drosophila dengan enzim restriksi yang sesuai. Dipecah 1 – 5 ug DNA dalam volume 20 ul dengan 10 unit enzim. Pemecahan dilalukan selama 4 – 12 jam. b. Periksa kualitas pemecahan dengan analisis 100 ng dari tiap sample dalam minigel. meliputi sample control yang belum dipecah sebagai perbandingan. Sample yang telah dipecah tampak sebagai band – band dari repetitif sequen (urutan berulang) yang dapat diperlihatkan. c. Sisa DNA 1% pada gel agarose meliputi jalur dengan penanda lamda untuk gel yang diwarnai dengan ethidium bromida dan difoto. d. Gel diwarnai selama 20 menit dalam 1ug/ml ethidium bromida. Destain dalam air selama 10 menit dan difoto. e. Serap gel selama 15 menit dalam 0.12 M HCL – bromophenol blue hingga menguning. f. Serap gel dalam 0.4 M NaOH selama 30 menit. g. Potong 3 potongan dalam memblot kertas yang akan meluas sekitar 1 inci di luar gel pada empat sisi. Rendam masing-masing dengan 0.4 M NaOH Dan tumpukan dalam suatu kaca. h. Potong gel sampai pertengahan dan membuang bagian puncaknya. Dengan memotong jalur pertengahan, identasi akan tertinggal di puncak gel dimana gel diratakan dengan prosedur blotting, dan ini dapat digunakan untuk penyaringan baik telah ditempatkan dia tas gel. Hempaskan gel yang tak teratur dan menempatkannya pada pertengahan tumpukan kertas hisap untuk mendorong ke luar gelembung udara. i. Gel dilemparkan disebabkan DNA pada umumnya semakin dekat kepada sisi bawah gel. frame gel dengan potongan plastik. Plastik meluas di bawah tepi gel dari 1 – 2 milimeter. dengan perlahan memaksa gelembung udara memberes bebas dari gel. Plastik mencegah penyangga mengalir di sekitar gel. j. Suatu potongan Genescreen yang lebih untuk memenuhi ukuran gel. Permukaan basah gel dengan beberapa tetesan 0.4 M NaOH. perlahan – lahan meletakkan gen menyaring ke permukaan gel. Hindari menjerat gelembung udara di bawah saringan juga menghindari bergesernya saringan yang berhubungan dengan gel seperti beberapa DNA mungkin telah mulai untuk dipindahkan ke saringan. k. Dua potongan kertas hisap untuk memenuhi Genescreen dan meletakkan hingga lembar tersebut mengeringkan pada waktu yang sama di atas saringan. Kertas pertama basah, dan melicinkannya sebelum menambahkan yang kedua. Potongan yang kedua basah sepenuhnya mengumpulkan tumpukan paper towels.

l. Menumpuk 1 inchi lapisan dari paper towels di atas potongan puncak kertas hisap. Towels harus memotong untuk memenuhi ukuran saringan. m. Tempatkan potongan flat/plexiglass atau kaca yang diletakkan di paling atas. Menimbang tumpukan yang hancur bersama suatu botol yang berisi 200 – 500 ml tentang segala bentuk. Kemudian DNA dipindahkan selama 6 jam. n. Setelah transfer, dipindahkan ke saringan dandiserap selama 15 menit dalam 200 ml 0.2 M Tris-Cl pH 7.5, 2X SSC. o. Blot filter dikeringkan dengan paper towels dan kemudian dibiarkan kering selama sedikitnya 1 jam. Saringan dapat disimpan bila telah kering, keadaan ini cukup untuk menentukan DNA ke dalam saringan. Tidak kebutuhan untuk membakar saringan genescreen untuk menyertakan DNA. Tahapan Southern Blot Tahap awal dari metode Southern Blot adalah pendigestian DNA dengan enzim restriksi endonuklease sehingga terbentuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil. Kemudian DNA dipisahkan sesuai ukuran dengan elektroforesis agarosa. Setelah DNA terpisah dilakukan pemindahan DNA ke membran nitroselulosa tahap ini disenevertheless dengan tahap blotting. Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas dari gel agarosa. Pada teknik blotting dengan menggunakan vakum membran diletakkan pada bagian bawah gel. Tekanan diberikan secara merata pada gel untuk memastikan terjadi kontak antara gel dengan membran. Proses transfer berlangsung dengan memanfaatkan daya kapilaritas. setalah DNA ditransfer ke gel membran nitroselulosa dipanaskan dengan suhu tinggi (60oC-100oC) kemudian membran diberi radiasi UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan membran. Lalu membran dicampur dengan probe (pelacak) yang telah dilabel radioaktif tetapi dapat juga digunakan tag nonradioaktif yang dapat berpendar. Probe yang digunakan adalah DNA utas tunggal yang memiliki sekuen yang akan dideteksi. Probe diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi dengan DNA yang ada pada membran. Setelah proses hibridisasi probe yang tidak terikat dicuci dari membran sehingga yang tinggal hanya probe yang hibrid dengan DNA di membran. Pola hibridisasi kemudian dideteksi dengan visualisasi pada film X-ray melalui autoradiografi. Pemisahan DNA dan RNA berdasarkan ukuran dengan elektroforesis pada berbagai sistem gel merupakan teknik dasar yang penting dalam biologi molekuler. Pada pH netral, DNA dan RNA bermuatan negatif dan akan bermigrasi ke arah anoda. Jika migrasi dilakukan pada matriks polimer (gel), fragmen kecil akan bergerak lebih cepat daripada fragmen yang besar

(Gambar 1-2). Dengan demikian, migrasi elektroforetik melalui gel akan memisahkan campuran fragmen DNA sehingga nampak sebagai pita-pita yang berbeda ukurannya. Banyak matriks gel yang dapat dignakan untuk pemisakhan asam nukleat, tapi yang paling banyak digunakan adalah gel agarose dan poliakrilamid. Gel agarose sesuai untuk pemisahan fragmen DNA yang berukuran 0.1-20 kb, sedangkan poliakrilamid untuk fragmen Dna berukuran 0.025-2 kb. Denaturan seperti urea dapat ditambahkan pada gel poliakrilamid untuk dapat memisahkan fragmen DNA sampai pada tingkat resolusi 1 pb (misalnya untuk sekuensing DNA). Salah satu jenis elektroforesis el agarose adalah pulsed field gel electrophoresis (PFGE) yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang sangat besar (lebih dari 1000 kb). Untuk melihat fragmen DNA setelah dipisahkan dengan elektroforesis gel digunakan teknik lain. Jika fragmen DNA cukup banyak, gel dapat langsung diwarnai (staining) selama atas setelah elektroforesis sehingga DNA dapat langsung dilihat. Ethidium bromide mengikat DNA dan akan berfluoresensi/berpendar merah dibawah sinar UV. Jika jumlah DNA terlalu sedikit untuk divisualisasi langsung, radioaktif digunakan untuk mendeteksi (lihat hibridisasi). Hibridisasi asam nukleat. Hibridisasi asam nukleat adalah salah satu metode analisis yang paling sering digunakan. Teknik ini digunakan untuk Southern blotting, Northern blotting dan untuk skrining library. Tujuan metode ini adalah untuk melihat (visulisasi) sekuens asam nukleat tertentu (DNA atau RNA) dalam lingkungan/latar belakang campuran sekuens lain yang kompleks. Teknik ini memanfaatkan sifat DNA yaitu dua untai asam nukleat yang komplemen akan salaing mengikat (hibridisasi) dengan tingkat spesifisitas yang tinggi. Sebaliknya, sekuens asam nukleat yang nonkomplemen tidak berikatan secara spesifik, mismatch nukleotida menurunkan temperatur/titik leleh. Untuk mendeteksi DNA atau RNA tertentu dalam suatu campuran yang kompleks, isi campuran harus diimobilisasi pada membran dan diubah menjadi bentuk untai tunggal (lihat Southern dan Northern blotting). Larutan hibridisasi yang mengandung probe untai tunggal yang dilabel radioaktif ditambahkan agar terjadi hibridisasi pada kondisi tertentu. Temperatur dan konsentrasi garam pada larutan hibridisasi menentukan kespesifikan pengikatan. Pada temperatur tinggi dan konsentrasi garam rendah, probe hanya akan mengikat sekuens target yang benar-benar cocok. Setelah hibridisasi, kelebihan probe yang tidak terikat dicuci, sinyal radioaktif akan terdeteksi pada lokasi di mana sekuens target terletak. Sinyal radioaktif divisualisasi dengan mengeksposkan pada fim X-ray menghasilkan titik atau pita hitam pada tempat radioaktif. Southern blotting. Ketika DNA genom didigesti dengan endonuklease restriksi dan dipisahkan dengan elektroforesis gel, fragmen individual tidak akan dapat dilihat, bahkan jika digunakan DNA dalam jumlah besar. Karena kompleksnya DNA genom,

digesti dengan enzim restriksi yang divisualisasi dengan ethidium bromide akan menghasilkan pola ‘smear’ yang tercipta dari ribuan fragmen DNA. Untuk mendeteksi fragmen tertentu pada ‘smear’ tersebut digunakan teknik hibridisasi denganprobe radioaktif yang lazim dikenal sebagai Southern blotting (diambil dari nama penemunya Ed Southern) (Gambar 1-9). Southern blotting dimulai dengan pemisahan elektroforesis gel fragmen DNA yang telah didigesti dengan enzim pemotong. DNA kemudian didenaturasi (dipisahkan menjadi 2 untai tunggal) dengan perlakuan alkali, selanjutnya untai tunggal ditransfer ke membran melalui transfer kapilaritas. DNA akan terikat pada secara kovalen pada membran dan diimobilisasi pada fase padat, menghasilkan replika fragmen pada gel. Fagmen DNA spesifik pada membran dapat diidentifikasi dengan hibridisasi menggunakan probe yang spesifik untuk fragmen gen yang dikehendaki.

Gambar : Southern blot. DNA genom diisolasi dan digesti dengan enzim restriksi. DNA kemudian dirun pada gel agarose dan ditransfer ke membran di mana DNA kemudian diikatkan secara kovalen. DNA selanjutnya dihibridisasi menggunakan probe yang dilabel 32P. Interaksi antara DNA dan probe yang dilabel dideteksi dengan cara memajankan DNAmembran ke film otoradiografi

Keuntungan  Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran di bandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau matriks  Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan  Waktu untuk melakukan staining DNA, destaining, inkubasi, mencuci, dll menjadi lebih singkat  Pola yang terbentuk dapat di keringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum di analisis  Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode analisis yang di pakai  Matriks : matriks yang biasa di pakai dapat berupa nitroselulosa (NC). Namun NC juga memiliki kekurangan yaitu, beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat hilang selama pemrosesan. Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi kekurangannya adalah kertas diazobenzyloxymethyl (DBM) atau diazophenylthioeter (DPT)