Solving_Metabolic_Flux_Analysis_Equations_Solving_a_set_of_material_...

Metabolic Engineering   Wei‐Shou Hu 

Solving Metabolic Flux Analysis: Equations  Solving a set of material balance equations for a biochemical reaction network:  Example: The incomplete combustion of CH4 to CO2, CO and H2O is shown in the following set  of chemical reactions:   

Input Output CH 4 + O2 → CO2 + CO + H 2 O

 

Known reactions : CH 4 + 2O2 ⎯⎯ → CO2 + 2 H 2 O 2CH 4 + 3O2 ⎯⎯ → 2CO + 4 H 2 O   If  all  the  inputs  and  outputs  (i.e.  amount  of  CH4,  O2  consumed  and  that  of  CO2,  CO,  H2O  produced)  are  completely  balanced,  the  fraction  of  CH4  going  to  both  reactions  can  be  determined. On the other hand, if the material balance is not closed, there will be uncertainty  about  the  solution,  and  the  distribution  of  materials  can  only  be  estimated.  The  following  outlines the steps need to be followed for Metabolic Flux Analysis: 

1. List all reactions and chemical species  The chemical species for this problem are: CH4, O2, CO, CO2, H2O  J1 CH 4 + 2O2 ⎯⎯ → CO2 + 2 H 2O J2 2CH 4 + 3O2 ⎯⎯ → 2CO + 4 H 2O

 

The Stoichiometric coefficients are: 

CH 4 O2

CO

CO2 H 2O

1

−1

−2

0

2

2

J2

−1

−3

2

0

4

 J

 

2. Set up Material Balance Equations for every species:  We will set up material balance equations for this chemical reaction network. The symbol q is  used to represent external fluxes measured. Remember any flux out of the system is negative,  while any flux into the system is taken as positive. 

   

Metabolic Engineering   Wei‐Shou Hu 

dCH 4 = qCH 4 − J1 − 2 J 2 dt dO2 = qO2 − 2 J1 − 3 J 2 dt dCO = − qCO + 2 J 2 dt dCO2 = − qCO2 + 2 J1 dt dH 2 O = − q H 2O + 2 J 1 + 4 J 2 dt

(1)

 

  If pseudo‐steady state is assumed, then all the left hand terms of the ODE’s will become zero  and the system of equations can re‐written as: 

J1 + 2 J 2 = qCH 4

(2)  

2 J1 + 3J 2 = qO2 2 J 2 = qCO 2 J1 = qCO2 2 J 1 + 4 J 2 = q H 2O   The system of equations can be written in the matrix form as: 

⎡1 ⎢2 ⎢ ⎢0 ⎢ ⎢2 ⎢⎣ 2

⎡ qCH 4 ⎤ 2⎤ ⎢ ⎥ qO2 ⎥ 3⎥ ⎢ ⎥ ⎡J ⎤ 2 ⎥ ⎢ 1 ⎥ = ⎢ qCO ⎥ ⇒ AX = Q ⎢ ⎥ ⎥ J 0 ⎥ ⎣ 2 ⎦ ⎢ qCO2 ⎥ ⎢ ⎥ 4 ⎥⎦ ⎢⎣ qH 2O ⎥⎦

 

(3)

  The matrix A of the left hand side of equation 3 is referred to as the stoichiometric matrix, the  vector  X  on  the  left  hand  side  is  the  flux  vector,  the  vector  Q  on  the  right  hand  side  is  the  external interaction matrix, as discussed later. If in given reaction network, a compound exists  only internally, the element in the corresponding vector is zero.       

Metabolic Engineering   Wei‐Shou Hu 

3. Solving the system of equations:  Let  us  consider  a  general  case.  Generally,  a  metabolic  network  contains  m  compounds  and  n  reactions, all transient material balances can be represented by the following expression:  dY = AX (t ) − Q (t ) dt

 

Where   Y:  m  dimensional  vector  of  intracellular  concentrations  (denoted  as  ci  for  the  ith  species)  of  intermediates, metabolites and nutrients  X: n metabolic fluxes (denoted as Ji)  A: Stoichiometric matrix m×n (denoted as aij)  Q: vector of m specific substrate consumption or product formation (denoted as qi) or material  flow in and out of the system being evaluated   

⎡ c1 ⎤ ⎢c ⎥ Y = ⎢ 2⎥ ⎢M ⎥ ⎢ ⎥ ⎣ cn ⎦

⎡ J1 ⎤ ⎢J ⎥ X = ⎢ 2⎥ ⎢M ⎥ ⎢ ⎥ ⎣Jn ⎦

⎛ a11 K a1n ⎞ A = ⎜⎜ M O M ⎟⎟ ⎜a ⎟ ⎝ m1 L amn ⎠

⎡ q1 ⎤ ⎢q ⎥ Q = ⎢ 2⎥ ⎢M ⎥ ⎢ ⎥ ⎣ qn ⎦

     

In the equation, the dilution due to cell volume change caused by growth (due to cell division) is  considered negligible. The specific rate refers to the metabolic rate based on per cell or per unit  biomass. In general, we are interested in how materials flow in the metabolic system, so we are  interested in how materials are distributed in each cell. For this purpose, the metabolic rates  used in general can be converted to be on a per unit cell mass basis.   The time constants characterizing the metabolic transients are typically very rapid compared to  the time constants of cell growth and process dynamics, therefore, the mass balances can be  simplified to only consider the steady‐state behavior. Eliminating the derivative yields:   

AX (t ) = Q(t )

   

or

  ⎡ J1 ⎤ ⎡ q1 ⎤ ⎛ a11 K a1n ⎞ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎜ M O M ⎟ ⎢ J 2 ⎥ = ⎢ q2 ⎥   ⎜ ⎟ ⎢M ⎥ ⎢M ⎥ ⎜a ⎟ L a ⎥ ⎢ ⎥ mn ⎠ ⎢ ⎝ m1 ⎣ J n ⎦ ⎣ qn ⎦

Metabolic Engineering   Wei‐Shou Hu 

This form is similar to what was derived in previous example as shown in equation 3. Depending  on  the  number  of  fluxes  q’s  are  measured,  there  may  be  different  number  of  unknowns  (in  addition to J1 and J2). There are three possible cases:  •

•

•

Fully  specified  system:  The  system  has  same  number  of  equations  as  variables.  There  exists only one solution. If m=n, where rank(A)=m is the number of linearly independent  equations, then X has a unique solution. For example: if only two of the external fluxes  are  known,  and  we  are  interested  in  estimating  J1  and  J2  only,  then  the  above  set  of  equations becomes a fully‐specified 2×2 system. In the following we discuss the Gauss‐ Elimination method to solve such a system of equations.  Over‐specified  system:  This  occurs  when  m>n,  where  rank(A)=m  is  the  number  of  linearly independent equation in the system of equations, the solution to the problem is  unique and obtained via a Least‐square fitting scheme. In general, biological systems are  over‐specified,  as  a  particular  metabolite  can  participate  in  numerous  pathways.  For  example,  if  three  of  the  external  fluxes  for  say  CO2,  CO  and  O2  are  known,  then  the  system becomes over specified. In the following we discuss the Least squares method to  solve such a system of equations.  Under‐specified system: In this case there are more number of unknowns as compared  to the number of equations. This occurs if rank(A)=m, where m n

(14)  

Which depends on the variables J1, J2, J3,…Jn. A necessary condition for S to be a minimum is:  n n ⎛ ⎞ dS = −∑ 2 ⎜ bi − ∑ aij J j ⎟ ai1 =0 dJ1 i =1 ⎝ j =1 ⎠

(15)

n n ⎛ ⎞ dS = −∑ 2 ⎜ bi − ∑ aij J j ⎟ ai 2 =0 dJ 2 i =1 ⎝ j =1 ⎠

 

M n n ⎛ ⎞ dS = −∑ 2 ⎜ bi − ∑ aij J j ⎟ ain =0 dJ n i =1 ⎝ j =1 ⎠

This  is  a  n×n  system  of  linear  equations,  which  is  fully  specified  and  can  be  solved  using  the  Gauss‐Elimination method discussed before. Lets again solve the previous example of methane  combustion,  if  we  now  have  three  equations  and  2  unknowns.  Let  us  suppose  qCH4=3  mM/s,  qO2=4 mM/s and qCO2=1 mM/s. The system of equations becomes:  J1 + 2 J 2 = 3   2 J1 + 3 J 2 = 4 2 J1

=1

 

Then the squared sum of residuals becomes:  S = ( 3 − J1 − 2 J 2 ) + ( 4 − 2 J1 − 3 J 2 ) + (1 − 2 J1 ) 2

2

2

 

Minimizing S gives us two equations:  dS = 0 ⇒ 9 J1 + 8 J 2 = 13 dJ1

   

dS = 0 ⇒ 8 J1 + 13 J 2 = 18 dJ 2  

Now we can solve these two equations using Gauss‐Elimination method. Again, multiplying the  first  equation  with  ‐9/8  and  adding  to  the  second  equation.  The  transformed  equations  are  shown in the following. Now, using back substitution we obtain the best fit solution.  J1 + 8 / 9 J 2 = 13/ 9 53/ 9 J 2 = 58 / 9

   

⇒ J 2 = 58/ 53 = 1.094 mM / s J1 = 13/ 9 − 8 / 9 J 2 = 10 / 9 − 8/ 9 × 58/ 53 = 66 / 477 = 0.138 mM / s

   

Metabolic Engineering   Wei‐Shou Hu 

Example: Pentose phosphate pathway  In  the  next  section,  we  discuss  the  example  of  a  metabolic  pathway  called  the  Pentose  Phosphate pathway as shown in the following.  Let us suppose the influx of glyceraldehyde‐6‐ phosphate into the pentose phosphate pathway is 100 moles/s, the rate of outflux of Ribose‐5‐ Phosphate is 50 moles/s and that of CO2 is 12 moles/s. 

 

Figure 1 Pentose phosphate pathway  A  simplified  figure  of  the  pentose  phosphate  pathway  is  shown  below,  which  would  be  used  for  the  Metabolic  Flux  Analysis  (MFA).    Lets  write  down  the  mass  balance  for  each  species.  The  system  of  equations in (16) shows the steady state mass balance equations. 

 

Figure 2 Simplified figure for MFA     

Metabolic Engineering   Wei‐Shou Hu  1.G 6 P :

J +J =q 1 10 G6P

2.CO 2 :

J =q 1 CO2

{also NADPH :

(16)

2 J1= q NADPH }

3.Ribu 5 P :

J −J −J =q 1 4 5 Ribu 5 P

4.R 5 P :

J −J =q 4 6 R5P

5. X 5 P :

J −J −J =q 5 6 8 X 5P

6. S 7 P :

J −J =q 6 7 S 7P

7.G 3 P :

J − J + J + 2J = q 6 7 8 9 G 3P

8. F 6 P :

J +J −J +J =q 7 8 9 10 F 6P

9. E 4 P :

J −J =q 7 8 E 4P

 

  As you may  notice,  there are 9 equations and 8 variables, the system seems over‐specified. However,  one of the equations is a linear combination of the others and thus is not independent. Note that the  carbon balance gives: 

6qCO2 + qO2 + 5qribu 5 P + 5qR 5 P + 5q X 5 P + 7qS 7 P + 3qG 3 P + 6qF 6 P + 4qE 4 P = 0   Hence, we eliminate one of the equations, specifically we eliminate the equation (eq 7) corresponding  to G3P to obtain a set of linearly independent equations and solve for the following: 

⎡1 ⎢1 ⎢ ⎢1 ⎢ ⎢0 ⎢0 ⎢ ⎢0 ⎢0 ⎢ ⎢⎣ 0

0 0 −1

0 0 −1

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

1 0

0 1

−1 −1

0 0

0 −1

0 0

0 0 0

0 0 0

1 0 0

−1 1 1

0 1 −1

0 −1 0

1 ⎤ ⎡ J1 ⎤ ⎡ qG 6 P ⎤ ⎡100 ⎤ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ 0 ⎥⎥ ⎢ J 4 ⎥ ⎢ qCO2 ⎥ ⎢⎢12 ⎥⎥ 0 ⎥ ⎢ J 5 ⎥ ⎢ qribu 5 P ⎥ ⎢0 ⎥ ⎥ ⎢ ⎥ ⎥⎢ ⎥ ⎢ 0 ⎥ ⎢ J 6 ⎥ ⎢ qR 5 P ⎥ ⎢50 ⎥ = = 0 ⎥ ⎢ J 7 ⎥ ⎢ q X 5 P ⎥ ⎢0 ⎥   ⎥ ⎢ ⎥ ⎥⎢ ⎥ ⎢ 0 ⎥ ⎢ J 8 ⎥ ⎢ qS 7 P ⎥ ⎢ 0 ⎥ 1 ⎥ ⎢ J 9 ⎥ ⎢⎢ qF 6 P ⎥⎥ ⎢0 ⎥ ⎢ ⎥ ⎥⎢ ⎥ 0 ⎥⎦ ⎢⎣ J10 ⎥⎦ ⎣⎢ qE 4 P ⎥⎦ ⎢⎣0 ⎥⎦

This  equation  is  of  the  form  AX=Q.  Solving  the  set  of  equations  in  MATLAB,  the  flux  J1,…,J10  can  be  estimated. The values of flux are: 

 J1=   12.0000   J4= 37.0000     

Metabolic Engineering   Wei‐Shou Hu 

 J5= ‐26.0000   J6= ‐13.0000   J7= ‐13.0000   J8= ‐13.0000   J9= 62.0000   J10= 88.0000