UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS, BIOQUÍMICAS Y BIOTECNOLÓGICAS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA
ASIGNATURA: OPERACIONES UNITARIAS II
SISTEMAS BIOLÓGICOS EN LA OBTENCIÓN DE PRODUCTOS BIOFARMACÉUTICOS Y ENZIMAS Ing. Cinthia Córdova Barrios
[email protected]
SISTEMAS BIOLÓGICOS OBJETIVO
Explicar y comprender la importancia de los sistemas biológicos en el diseño del Downstream Processing (DSP) para la obtención de productos biofarmacéuticos.
SISTEMAS BIOLÓGICOS 1. Introducción
2. Definición y características. 3.Tipos 4. Importancia 5. Ventajas y desventajas: Bacterias, levaduras, hongos, células animales, animales transgénicos y plantas transgénicas. 6. Bibliografía
INTRODUCCIÓN: Un bioproceso es una parte esencial de la industria biotecnológica, es un proceso en el que utilizan células vivas o alguno de sus componentes para obtener un producto.
UPSTREAM
DOWNSTREAM
BIOPROCESO
INTRODUCCIÓN: SISTEMAS BIOLOGICOS
La biotecnología se refiere a toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos (organismos vivos o sus derivados) para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos.
Sistema biológico
UPSTREAM
DEFINICIÓN Y CARACTERÍSTICAS: SISTEMAS BIOLOGICOS
.
Es un organismo vivo o los productos de su metabolismo.
Ser seguro.
Ser genéticamente estable.
Eficiente nivel de expresión del producto deseado.
Sencillez y economía de su cultivo.
TIPOS: SISTEMAS BIOLOGICOS Bacterias: Escherichia coli
Levaduras: Saccharomyces cerevisiae
Hongos: Aspergillus sp. Cultivo de células animales: BHK y CHO Cultivo de células vegetales Animales transgénicos: Cabras, ovejas, cerdos, conejos, vacas. Plantas: Nicotiana tabacum
IMPORTANCIA:
IMPORTANCIA: Biopharmaceutical
Source
Biopharmaceutical
Source
tPA Insulin
E. coli, CHO E. coli
IFN-α IFN-γ IL-2 G-CSF hGH
E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli
FSH IFN-β EPO Glucocerebrosidase Factor VIIa
CHO CHO CHO CHO BHK
BACTERIAS: Escherichia coli
Ventajas
Desventajas
Facilidad de manipulación genética.
Las proteínas heterólogas se acumulan intracelularmente (implicancias en el DSP)
Crecimiento rápido en medios relativamente simples y de bajo costo.
Incapacidad para realizar modificaciones post-traduccionales.
Su tecnología de fermentación está bien establecida.
La presencia de lipopolisacárido (LPS) en su superficie con capacidad inmunogénica.
Altos niveles de expresión de la proteína heterologa.
BACTERIAS: Escherichia coli Table 5.4 Proteins of actual or potential therapeutic use that are glycosylated when produced naturally in the body (or by hydridoma
PROTEÍNAS CON POTENCIAL TERAPÉUTICO, GLICOSILADAS AL SER technology in the case of monoclonal antibodies). These proteins are PRODUCIDAS NATURALEMTE
discussed in detail in various subsequent chapters. See also Table 2.9 Most interleukins (IL-1 being an important exception) IFN-β and -γ (most IFN-αs are unglycosylated) CSFs TNFs Gonadotrophins (FSH, luteinizing hormone and hCG) Blood factors (e.g. Factor VII, VIII and IX) EPO Thrombopoietin tPA α1-Antitrypsin Intact monoclonal antibodies
BACTERIAS: Escherichia coli DESVENTAJA
Cuerpos de inclusión
Proteína heteróloga
Parcialmente plegada.
Agregados insolubles
DSP
Centrifugación
Lisis química de los cuerpos de inclusión
Diálisis
Evitar su formación
Disminuir la temperatura del crecimiento bacteriano
Expresión de una proteína de fusión (proteína de interés + tioredoxina)
Lisis por osmosis y adición de enteroquinasa a la proteína de fusión
BACTERIAS: Escherichia coli
BACTERIAS:
Ácido polihidroxibutírico (PHB)
Ralstonia eutropha
CÉLULAS ANIMALES: CHO y BHK
Ventajas
Desventajas
Facilidad de manipulación genética.
Crecimiento lento
Altos niveles de expresión de proteínas heterólogas.
Requiere de medios complejos.
Poseen la capacidad de realizar modificaciones post-traduccionales
Requiere condiciones exigentes de incubación. Mayores costos de producción. Susceptibles al daño físico.
CÉLULAS ANIMALES:
Factor VIII (Hemofilia), EPO,TPO.
CHO (Chinese Hamster Ovary)
SISTEMAS BIOLÓGICOS: E.coli y CHO/BHK
Biorreactor de células microbianas
Biorreactor de líneas celulares animales
LEVADURAS: Saccharomyces cerevisiae
Ventajas
Desventajas
Facilidad de manipulación genética.
Menores niveles de expresión de proteínas heterólogas.
Crecimiento relativamente rápido en medios sencillos, de bajo costo y resistencia al daño físico.
En ocasiones los patrones de glicosilación difieren.
Su tecnología de fermentación se encuentra establecida y definida. Son organismos GRAS (generally regarded as safe). Poseen la capacidad de realizar modificaciones post-traduccionales.
LEVADURAS: Saccharomyces cerevisiae PROTEÍNAS RECOMBINANTES PRODUCIDAS EN S. CEREVISIAE Trade name
Description
Use
Novolog
Engineered short-acting insulin Granulocyte macrophage CSF (GM-CSF) All vaccine preparations containing rHBsAg as one component
Diabetes mellitus
11
Bone marrow transplantation
10
Vaccination
13
Hirudin Urate oxidase PDGF
Anticoagulant Hyperuricaemia Diabetic ulcers
12 12 10
Leukine
Recombivax, Comvax, Engerix B, TritanrixHB, Infanrmix, Twinrix, Primavax, Hexavax Revasc, Refludan Fasturtec Regranex
Chap
LEVADURAS:
Bioetanol
Saccharomyces cerevisiae
HONGOS: Aspergillus sp.
Ventajas
Desventajas
Su tecnología de fermentación se encuentra establecida y definida.
Menores niveles de expresión de proteínas heterólogas.
Genera proteínas extracelulares
En ocasiones los patrones de glicosilación difieren.
Poseen la capacidad de realizar modificaciones post-traduccionales
Generación de proteasas extracelulares.
HONGOS:
Vitamina B2 (Riboflavina)
Ashbya Gossypii
ANIMALES TRANSGÉNICOS: Cabras
Ventajas
Desventajas
Altos niveles de expresión de proteínas heterólogas.
Resultado negativo de la transgénesis.
La capacidad de producción es alta. Suministro continuo.
La variabilidad de los niveles de expresión
Facilidad de manejo y cría.
En ocasiones los patrones de glicosilación difieren.
Facilidad de recolección.
El animal transgénico debe alcanzar la madurez sexual.
Baja inversión de capital.
ANIMALES TRANSGÉNICOS:
Animales como biorreactores para la producción de proteínas terapéuticas.
Gene - pharming
El gen que produce la proteína terapéutica deseada es introducido mediante transgénesis en la célula diana. Por clonación se hace crecer la célula hasta convertirla en un animal adulto
El animal adulto puede producir la proteína terapéutica o el producto biofarmacéutico en huevos y leche.
ANIMALES TRANSGENICOS: TECNICAS TRANSGENICAS
Retrovirus • Introducción de un transgen (material genético transferido) en el estadio mas temprano posible del desarrollo del cigoto.
Microinyección pronuclear
• Infección de embriones con vectores virales (retrovirus como vector del nuevo DNA) antes de su implantación.
• Fusión de células madre embrionarias con el DNA transferido, reabsorción, transformación e inyección en el huésped. Células madre
ANIMALES TRANSGENICOS:
Biosteel
Antitrombina recombinante
Los métodos transgénicos son rápidos, de confianza y mas baratos. Se utiliza principalmente cabras porque se reproducen mas rápidamente y son mas baratas que el ganado vacuno, además de ser grandes productoras de leche. Las aves de corral tienen un sistema de reproducción muy eficiente, y es fácil generar cientos de huevos en un tiempo relativamente corto.
ANIMALES TRANSGÉNICOS: PROTEÍNAS RECOMBINANTES PRODUCIDAS EN LA LECHE DE ANIMALES TRANSGENICOS
Protein
Animal species
tPA IL-2 Factor VIII Factor IX α1-Antitrypsin Fibrinogen EPO Antithrombin III Human α-lactalbumin IGF-I Protein C GH
Goat Rabbit Pig Sheep Goat Sheep Rabbit Goat Cow Rabbit Pig Rabbit
Expression level in milk (mg l 1) 6000 0.5 3 1000 20 000 5000 50 14 000 2500 1000 1000 50
ANIMALES TRANSGÉNICOS: RENDIMIENTO DE LECHE Y EL TIEMPO ENTRE GENERACION DE UN EMBRION TRANSGENICO Y LA OBTENCION DEL PRODUCTO
Species
Annual milk yield (l)
Time to first production batch (months)
Cow Goat Sheep Pig Rabbit
6000–9000 700–800 400–500 250–300 4–5
33–36 18–20 18–20 16–17 7
ANIMALES TRANSGÉNICOS:
tPA (Activador del plasminógeno tisular)
Cabra transgénica
PLANTAS TRANSGÉNICAS: Tabaco
Ventajas
Desventajas
Costo bajo del cultivo.
Los niveles de expresión son variables.
Metodología de cosecha establecida.
En ocasiones los patrones de glicosilación difieren.
Facilidad de ampliación económicamente factible.
La presencia de metabolitos secundarios interferentes.
Proteínas expresadas en las semillas son generalmente estables.
Riesgo de escape accidental al medio ambiente del material genético.
Los sistemas basados en plantas son libres de patógenos humanos.
PLANTAS TRANSGÉNICAS:
EPO
Tabaco
PLANTAS TRANSGÉNICAS: PROTEÍNAS RECOMBINANTES PRODUCIDAS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS
Protein
Expressed in
Production levels achieved
EPO
Tobacco
0.003% of total soluble plant
HSA Glucocerebrosidase IFN-α IFN-β GM-CSF Hirudin Hepatitis B surface antigen Antibodies/antibody fragment
Potato Tobacco Rice Tobacco Tobacco Canola Tobacco Tobacco
0.02% of soluble leaf protein 0.1% of leaf weight Not listed 0.000 02% of fresh weight 250 ng ml 1 extract 1.0% of seed weight 0.007% of soluble leaf protein Various
Referencias Bibliográficas:
WALSH, G. “Pharmaceutical Biotechnology Concepts and Applications”. John Wiley & Sons Ltd. England. 2007.
Referencias Bibliográficas:
THIEMAN, W. y PALLADINO, M.” Introduction to Biotechnology”. Third Edition. Pearson Education. USA. 2013.
Referencias Bibliográficas:
ARGENBIO.”Por qué Biotecnología”. Consejo Argentino para la formación y desarrollo de la Biotecnología. Argentina. 2000.
