sis Enzimatica 2010[1] - Bio II Unidad

BIOCATALISIS ENZIMATICA I. RESUMEN

II. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVOS GENERALES Diseñar y realizar diferentes experiencias de estudios cinéticos de la enzima Inulinasa (2,1-β-D-fructan fructanohidrolasa [EC 3.2.1.7]) de un caldo crudo libre de células Kluyveromyces marxianus ATCC-16045 en sus formas soluble e inmovilizada. 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 1.Preparar reactivos y obtener curvas de calibrados de proteínas y azucares reductores.

2. Obtener el caldo enzimático de Kluyveromyces marxianus ATCC-16045. 3.Determinar el rango de linealidad y actividad enzimática (actividades volumétrica y específica) de la enzima en el caldo crudo. 4.Determinar los parámetros cinéticos de la enzima soluble. 5.Inmovilizar Inulinasa en geles. 6.Diseñar y montar el sistema mini-reactor con Inulinasa inmovilizada, para determinar los parámetros cinéticos de la enzima. Analizar su comportamiento.

III. Fundamento teórico Como todos los catalizadores, las enzimas disminuyen la energía requerida para conseguir una reacción comenzada. Debajo se demuestra un diagrama similar con más detalle para el patrón de la energía para la reacción catalizada enzima. Primero, la energía se requiere para formar el complejo entre la enzima y el substrato (complejo del E-S) que es un estado de una energía más alta que la enzima y el substrato/el producto libres.

Figura 01. Diagrama de la energética de la enzima catalizó la reacción contra la reacción nocatalizada. Las enzimas utilizan energía de enlace del atascamiento de substratos para llevar a cabo una catálisis. Porque la enzima es flexible, la poder del marco “absorbe” energía de una manera muy eficiente y puso esta energía al uso para asistir con catálisis. Enzima + substrato = complejo E + S = complejo del ES Este atascamiento lanza energía. Sin embargo. La enzima toma algo de la energía de enlace. Esta energía absorbida tomada por el marco de la enzima es utilizada por ella para asistir a catálisis. Así, esto ayuda a explicar porqué las enzimas son tan grandes que es la enzima tiene un marco grande para utilizarlo mientras que un recurso para almacenar energía de enlace hizo disponible cuando el substrato ata a la enzima que puede utilizar más adelante para conducir la formación de productos. Para que todo este intercambio de la energía sea eficiente, la enzima debe ser muy flexible. ACTIVIDAD ENZIMATICA Las enzimas son de naturaleza proteica y, aunque muchas contienen en su estructura otro tipo de molécula, su funcionabilidad biológica radica siempre en su porción proteica. La capacidad catalítica de la enzima reside en su sitio activo, que esta conformado por un número de residuos aminoaciditos que se agrupan en la estructura tridimensional para generar un nicho, donde el

substrato es ligado y químicamente transformado. La presencia de la estructura de este nicho es esencial para la expresión de dicha capacidad catalítica, por lo que la estabilidad configuracional de la estructura `proteica de la enzima resulta fundamental parta su funcionabilidad. Desde el punto de vista termodinámica las enzimas actúan rebajando la barrera energética que presenta la energía de activación requerida para lograr un complejo de transición activado que dará origen al producto. Desde l punto de vista cinético, la actividad enzimática, que corresponde a la capacidad catalítica de la enzima, se traduce en un incremento de la velocidad de la reacción catalizada y, dado que en ausencia de la enzima la velocidad es generalmente despreciada, la cuantificación de la actividad enzimática se basa justamente en la medición de la velocidad de la reacción. De este modo en la reacción: S

E

P

Se tendrá que: act = V = dp = ds dt

dt

La actividad enzimática representa en consecuencia el máximo potencial catalítico de la enzima para un conjunto de condiciones ambientales dadas. Es preciso señalar que estos valores iniciales de velocidad de reacción no representan aquellos que se obtendrán en un proceso enzimático, en donde, dados los tiempos de operación prolongados, es razonable suponer que los factores descritos estarán presentes. La actividad enzimática se expresa en términos de unidades de actividad. La definición de unidades de actividad a sido bastante arbitraria lo que dificulta muchas veces el análisis comparativo de los resultados obtenidos por diversos obtenidos. En general se ha adoptado la definición propuesta por la UI de bioquímica. Se define la UI como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micro mol de sustrato por minuto.

• •

pH

•

Temperatura optima.

Concentración de substrato saturante

CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola (Figura de la izquierda). La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax. Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk (Figura de la derecha). Es una recta en la cual: •

La pendiente es KM/Vmax

•

La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM

•

La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

MOTIVOS QUE HACEN DE KM UN PARÁMETRO CINÉTICO IMPORTANTE La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante pór múltiples razones: •

KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si KM = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2.

•

El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor K M, menor afinidad. Este hecho tiene fácil explicación si tenemos en cuenta que KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si KM es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).

•

La KM del sustrato natural es menor que la de los sustratos análogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta KM, el que presente mayor KM tiene menor afinidad por el enzima, y la reacción transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor KM, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = Vmax.

•

Los valores de KM de muchos enzimas son próximos a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.

Cinética de un substrato: Principales hechos experimentales: debemos señalar como un preámbulo la necesidad absoluta de que las enzimas sean puras y desprovistas de actividad parasita. Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes generales de de la cinética enzimática son:

a) El substrato S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario transitorio ES. este complejo resulta de una complementaria de la estructura entre el sitio activo de la enzima y de la molécula del substrato. b) La velocidad de la reacción en el tiempo t, es decir la velocidad de la desaparición del substrato, -

dS dP , o de aparición del producto, que se representa por la pendiente dt dt

de la tangente a la curva, P o S = f (t) no es constante para las concentraciones dadas en enzimas o en substrato, y disminuye en función del tiempo debido a la desaparición del substrato en el curso de desarrollo de la reacción. Siempre al principio de la reacción, se puede considerar que la tangente a la curva se confunde con aquella en que la velocidad permanece constante. Los estudios de cinética enzimática corresponden siempre a esta parte lineal de la curva; lo que implica el trabajar a velocidades iníciales. En estas condiciones, al principio de la reacción, la concentración en producto es muy débil; puede despreciarse, así como la reacción inversa de transformación del producto en substrato. Entonces se puede escribir: E+S

k1 → K3 [ ES ] → E+P k2 ←

c) Por otra parte, para una concentración dada de substrato, el estudio de las variaciones de la velocidad inicial de reacción en función de la concentración de enzimas, muestra que esta variación no es lineal. La curva presenta un trazo hiperbólico correspondiente al hecho de que para una cierta concentración de enzima, la totalidad del substrato se encuentra bajo la forma de complejo enzima-substrato; de lo que resulta que la velocidad inicial, función de la concentración de este complejo, permanece constante. Para los estudios cinéticos, es necesario situarse en las condiciones que corresponden al principio de la curva, donde es lineal, es decir a concentración bajas de enzimas. En otros términos, al cantidad de enzima debe ser pequeña en comparación a la concentración del substrato, de tal manera, que la formación del complejo enzima – substrato, ES, no modifica, o modifica poco la concentración del substrato. Influencia del contenido de agua: Las enzimas son proteínas globulosas solubles en agua y las reacciones enzimáticas se efectúan, en su mayor parte, en medio acuoso.

Es común observar que alimentos han sido protegidos del desarrollo microbiano por aplicación de diferentes tratamientos de deshidratación (secado de legumbres, en crudo) sufren sin embargo, a pesar del bajo contenido de agua, degradaciones enzimáticas que conducen a la aparición de olor y sabor desagradables. En estos casos, el papel del disolvente de la enzima que corresponden habitualmente al agua, es del todo secundario y no es indispensable. La lipasa, situada en la interfase aceite-agua, y la lipogenasa que actúan en presencia de cantidades de agua, son un buen ejemplo de este tipo de comportamiento. Pero siempre el agua interviene en todas las reacciones de hidrólisis como un segundo substrato. En este caso, el factor a considerar no es en realidad el tenor en agua, si no la actividad del agua en el medio considerado, actividad que cifra su grado de disponibilidad, especialmente para participar en la reacción de hidrólisis enzimática. Las curvas de sorción desorción del agua, constituyen el método clásico para determinar la variación de la actividad del agua en función del tenor en agua. Cuando el tenor en agua es débil, todo factor que aumenta la movilidad de la enzima y la frecuencia de las colaciones enzima-substrato, acelera el desarrollo de reacciones enzimáticas; uno de los ejemplos mejor conocidos es el del amasamiento intensificadito que favorece la acción de las lipoxigenasas. Considerando la existencia de factores limitantes ligados a la movilidad de los reactivos, las cinéticas no son michelianas. Enzimas inmovilizadas: Desde 1916, Nelson y Griffin habían demostrado que la inulinasa absorbida sobre carbón activo, conserva su actividad. Pero de cualquier modo hubo que esperar hasta la década de los 50”s para que aparecieran las primeras aplicaciones de esta técnica, en particular con los trabajos de Grub-hofer y Schleith. Después de 1960, las investigaciones, las investigaciones se han intensificado y bajo al impulso de los equipos de Katchalski en Israel y de Manecke en Alemania, se han multiplicado las utilizaciones potenciales de las enzimas inmovilizadas. En 1969 Chibata y sus colaboradores desarrollaron en Japón el primer reactor industrial con enzima fijada, una L-aminoácidos a partir de la correspondiente mezcla racemica. Esta técnica permitiría, según los autores, disminuir el precio de costo a menos del 40% con relación al procedimiento convencional. La gran especificidad en la acción de las enzimas y de las condiciones tan suaves en las cuales funcionan les confiere una decidida ventaja sobre los catalizadores químicos ordinarios. Por

ello en numerosos sectores se han desarrollado considerablemente el uso de preparaciones enzimáticas. Pero el alto costo de los de los procedimientos de extracción y de purificación de las macromoléculas enzimáticas, su alta inestabilidad cundo están en solución, son un obstáculo a su recuperación después de haber sido utilizado este biocatalizador. En la práctica la mayor parte de las operaciones industriales se realizan de forma discontinua, en lotes, con la renovación de la enzima al principio de cada ciclo (como se muestra en la fig.1)

Figura N° 01 La inmovilización sobre un soporte insoluble, que a menudo se acompaña de un aumento en la estabilidad de la enzima, facilita el desarrollo de reactores en continuo, que funcionan durante periodos largos, sin necesidad de renovar el catalizador. Permiten también utilizar preparaciones más puras, cierto es que más caras, pero de especificidad en su acción mas estrecha, lo que mejora la calidad de los productos que se obtienen. En la actualidad, se han desarrollado numerosos métodos de fijación de interés para más de 100 enzimas, tanto en la etapa de laboratorio como en escala piloto y se ha abierto un campo de experimentación, después de algunos años, para la inmovilización de células intactas, vivas o muertas. Esta multiplicación de de trabajos ha dado lugar a una abundante literatura científica. Microencapsulación: La técnica de microencapsulacion se utiliza comúnmente en las industrias farmacéuticas, de cosméticos o de colorantes y en la industria alimentaria. Se trata de retener un producto en el interior de una capsula delimitada por una membrana semipermeable. Se han descrito varios procedimientos de micro encapsulación. En el método por polimerización interfacial una solución acuosa que contiene la enzima en un monómero hidrofilico (poliamina o glicol) es emulsionada dentro de un disolvente orgánico miscible con agua. Al adicionar un segundo monómero hidrófobo (cloruro de acido polibásico) se provoca

una reacción de polimerización produciendo la formación de una membrana (poliamida o poliéster) alrededor de microgotitas acuosas. Con frecuencia es necesario adicionar algún agente tensoactivo que estabiliza la acción la emulsión y permite ajustar el tamaño de las capsulas a las dimensiones que se desean, que pueden variar de 1 a 100 micrones. La inmovilización de los biocatalizadores por enlaces covalentes se caracteriza por la fijeza del enlace proteína-soporte. La cantidad de enzimas desarrolladas es menor que en el caso de inclusión o de la fijación por adsorción y las pérdidas por liberación en el medio son mínimas. Esta técnica, aunque relativamente compleja para ponerla en acción es particularmente adaptable a las enzimas de precio elevado. El principal inconveniente del procedimiento reside en los riesgos de inactivación parcial o total de la enzima en el transcurso de la reacción de fijación. Por otro lado, como en las otras técnicas, los soportes orgánicos son susceptibles de ser atacados por los microorganismos y son sensibles a las condiciones del medio: variaciones de pH, empleo de ciertos disolventes. Para mejorar las propiedades mecánicas de las preparaciones, en algunas ocasiones la enzima es absorbida previamente sobre un soporte antes de la reticulacion. Propiedades de las enzimas inmovilizadas: La inmovilización puede causar perturbaciones estructurales en la proteína, reduciendo la eficacia catalítica de la enzima. Además, la inmovilización puede limitar el acceso del reactivo al centro activo de la enzima, reduciendo nuevamente la actividad. Ambos fenómenos pueden ser descritos como efectos conformacionales. La inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas. 1. Se producen cambios en su estabilidad. 2. La enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima. 3. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico y del microentorno. Los efectos de la inmovilización sobre la actividad de las enzimas resultan de la interacción de diferentes factores:

a) Modificaciones de la estructura tridimensional de la enzima, a causa de tensiones durante la fijación. b) Modificaciones del microambiente: ph local, interacciones electrostáticas. c) Fenómenos difusionales en el interior del complejo. d) Impedimentos estéricos. Este conjunto de factores juega un papel determinante en la actividad y estabilidad de la enzima. Aplicaciones de la enzima inmovilizada: Las aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en: 1. Aplicaciones analíticas: biosensores 2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas 3. Aplicaciones industriales: en la industria química, farmacéutica, alimentaria y de tratamiento de residuos. Medición de la actividad: Las condiciones óptimas de acción de las enzimas inmovilizadas difieren a menudo de las enzimas en solución y deben ser perfectamente conocidas para evitar todo riesgo de error de interpretación. Así para la ureasa, fijada sobre bentonita, la actividad de ph es de 7.7 no alcanza sino a 75% de la actividad de la enzima libre mientras que es de100% a ph 7.1. Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilización entraña con frecuencia una perdida de de actividad, muy variable según sea la naturaleza de la enzima y el modo de fijación; pero también se han señalado algunos casos en los que hay aumento de la actividad. Estas variaciones en un sentido o en otro podrían explicarse por una modificación estérica del sitio activo de la enzima de bajo el efecto de un cambio de conformación de la cadena polipeptidica. Influencia de las condiciones de operación: Si la actividad residual de las enzimas inmovilizadas es más débil que de las enzimas nativas, por el contrario, su estabilidad se encuentra generalmente aumentada. La duración de la vida de los complejos es sin embargo muy variable y las cifras citadas en las diferentes obras científicas varían de algunas decenas de horas a varios meses y para algunos casos excepcionales, a varios años. la estabilidad de las preparaciones comerciales es un factor primordial para la explotación industrial de los reactores de enzimas. Las cantidades de proteína retenidas son también muy variables (2-400% de la masa de polímero) y depende de la enzima considerada, del soporte que se utiliza y del método de inmovilización empleado. No se presentan fenómenos de impedimento estérico, de relación

lineal entre la actividad en relación a la unidad de masa del complejo y ala cantidad de biocatalizador fijado (cuadro Nº1). La inmovilización de la enzima, en presencia del substrato o de un inhibidor competitivo, protege el sitio activo e impide la formación de enlaces entre el soporte y los ácidos aminados que interviene en la catálisis. Para las enzimas con agrupamientos –SH, muy sensibles ala oxidación, es preferible bloquear las funciones tiol antes de la fijación y de regenerarlas en el momento del empleo. Las condiciones de pH y de temperatura necesarias para la reacción de inmovilización pueden provocar la desnaturalización parcial o total de la proteína. Pero, una vez que se ha realizado la inmovilización, se observa menudo, que las enzimas fijadas resisten mejor las variaciones de pH y a los tratamientos térmicos, que las especies en solución. La respuesta es diferente según el origen de la enzima, el soporte utilizado y el método de fijación sostenido. Cuadro N°1: Influencia de la naturaleza del soporte sobre la cantidad de papaína fijada y la actividad residual medida (según Manecke y col) ENZIMA

SOPORTE Copolimero

FIJADA ACTIVIDAD

(mg./g soporte) acido

acrílico/m-

isotiocianatoestireno 1/1 450 2/1 1,500 4/1 1,745 Copolimero acido metacrilico/misotiocianatoestireno 1/1 2/1 4/1

RESIDUAL %

330 1,600 2,380

136 155 172

48 102 76

Fenómenos de difusión: Mientras que la actividad de las enzimas en solución es regida por las leyes de la catálisis homogénea, el empleo de las enzimas inmovilizadas hace que intervengan dos fases distintas. Se tiene catálisis heterogénea y los mecanismos de difusión tienen un lugar importante. En la interfase entre las partículas sólidas del soporte y la solución acuosa se encuentra una capa límite en la cual se establece un gradiente de concentración de los reactivos. Si se denomina d a la velocidad de difusión de la materia (masa de substrato o de producto que difunde a través de la capa límite, por unidad de tiempo) y k a la constante de velocidad

de la reacción catalítica para la enzima no fijada, se pueden de acuerdo a Durand y Monsan visualizar tres casos: a) d >> k: la transferencia de materia juega un papel desprecible. b) d = k: transferencia de materia y reacción enzimática que intervienen para la misma parte. c) d