SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA

Síntesis y caracterización de nanopartículas de plata aplicadas en el sector de la biomedicina Cáceres, A & Vega, R. SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA APLICADAS EN EL SECTOR DE LA BIOMEDICINA Elaborado por A. Cáceres Estudiante de la Carrera de Química Industrial Curso de Nanotecnología Carrera de Química Industrial Universidad Nacional Profesor del curso Dr. José Roberto Vega Baudrit Catedrático, Universidad Nacional Coordinador Red NanoUNA, Universidad Nacional Director del Laboratorio Nacional de Nanotecnología LANOTEC-CeNAT-CONARE

Resumen La nanociencia estudia y sintetiza materiales en un rango de 1 a 100 nm. La reactividad y propiedades de estos materiales son diferentes al mismo material en escala macroscópica. A pesar de que varias nanopartículas de diferentes metales como la del cobre, oro, titanio, entre otros, poseen actividad antibacteriana, se ha demostrado que las nanopartículas de plata poseen mayor actividad antibacteriana contra bacterias, virus y hongos. En la siguiente reseña se contemplarán diferentes síntesis de nanopartículas de plata, entre ellas la síntesis por el método de reducción química empleando nitrato de plata y borohidruro de sodio como agente reductor, síntesis de nanopartículas de oro y plata funcionalizadas in situ con un poli(fenilenetinileno), síntesis de nanopartículas de plata funcionalizadas con péptidos análogos de lactoferrampina , síntesis de nanopartículas plata-sílice a través de un método organometálico. Todas las síntesis se estudiarán con el fin de poder aplicarlas a la medicina y conocer cuál es la mejor ruta para la obtención de las nanopartículas de plata. Introducción Debido a las enfermedades infecciosas causadas por bacterias patógenas y virus, además de la resistencia a antimicrobianos, surge la necesidad de encontrar nuevos compuestos antibacterianos. Las infecciones más frecuentes se encuentran en las heridas quirúrgicas, y en las vías urinarias y respiratorias. Los microorganismos que se encuentran con frecuencia en este tipo de infecciones son la Pseudomona aeroginosa, Estafilococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, de las cuales muchas de ellas son resistentes a la mayoría de los antibióticos.1 Se ha demostrado que las nanopartículas de plata poseen propiedades bactericidas contra bacterias Gram positivas y Gram negativas.2 La alta toxicidad de la plata ha sido demostrada en al menos 16 especies, entre esas las mencionadas anteriormente. Existen estudios que explican las propiedades antibacteriales de los iones de plata, este efecto se debe a que los iones de plata disminuyen el tamaño de la membrana citoplasmática o desprenden la pared celular de la célula, esto provoca que las moléculas de ADN comiencen a condensarse y perder la habilidad para replicarse bajo la infiltración de los iones de plata, además los iones

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Síntesis y caracterización de nanopartículas de plata aplicadas en el sector de la biomedicina Cáceres, A & Vega, R. interaccionan con los grupos tiol de las proteínas, fosfatos, carboxilatos, imidazol, hidroxilo, indol o aminas , provocando la desactivación de las proteínas bacteriana.1 La plata ha sido utilizada como metal precioso en joyería, utensilios, monedas, entre otros, además es utilizada en el tratamiento de quemaduras pero más que todo, es utilizada por ser altamente efectiva como agente antimicrobial contra bacterias y virus. Una de las propiedades más importantes de las nanopartículas de plata es su efecto cicatrizante, al estar insertadas en los vendajes, además son capaces de controlar procesos inflamatorios mediante la inhibición de citoquinas pro-inflamatorias. La plata no requiere de ningún agente fotocatalítico para la acción bactericida, como si lo necesitan otros metales, el uso de las nanopartículas de plata es mejor que muchos antibióticos utilizados en la actualidad.7 Para la síntesis de nanopartículas metálicas como la plata, se debe de dar importancia al tamaño, forma, composición, cristalinidad y estructura, ya que las propiedades de la nanopartícula dependen de estas variables Las nanopartículas de plata, presentan propiedades ópticas que se basan en la oscilación colectiva de los electrones de la banda de conducción al interaccionar con un campo electromagnético incidente, denominado resonancia de plasmón superficial, el campo eléctrico de la radiación electromagnética induce la formación de un dipolo en la nanopartícula creándose una fuerza restauradora en la nanopartícula que intenta compensar ese efecto, es por esto que las nanopartículas de plata presentan disoluciones coloidales de colores intensos cuyas frecuencias de resonancia de plasmón aparecen en el rango visible y que dependen del tamaño y forma de la partícula.3 En estas propiedades ópticas es por lo que se desarrolla las aplicaciones de dichas nanopartículas. Es por esto que se han desarrollado diferentes métodos para la síntesis de nanopartículas de plata, la mayoría de los métodos se basan en reacciones de reducción de sales metálicas de plata. La manipulación de las condiciones de síntesis permite el control racional de la morfología de las partículas y provee los medios para adaptar las propiedades de los materiales durante el proceso de síntesis, se debe tomar en cuenta la estabilización de la nanopartícula, para así mantener su tamaño y forma en función del tiempo. La síntesis de las nanopartículas permite explotar sus propiedades y llevar a cabo nuevas aplicaciones en catálisis, electrónica, fotónica, magnetismo y sensado químico y biológico.4 Síntesis de nanopartículas de plata Una de las síntesis de nanopartículas de plata, por medio de la polimerización en microemulsión, se emplea para encapsular las nanopartículas de plata, con un iniciador como el 2,2azobisisobutironitrilo recristalizado con metanol, además de la utilización de un surfactante como el bromuro de centiltrimetilamonio, esto se realiza en un reactor enchaquetado de vidrio. Para determinar el tamaño de las nanopartículas se puede utilizar un microscopio electrónico de barrido con emisión de campo (STEM) y un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Las morfologías obtenidas en el estudio aplicado en el artículo muestran que las partículas tienen forma esférica y de un tamaño menor a 100nm, además de poseer cierto grado de encapsulación de las nanopartículas de plata, como se observa en la Fig 1. Luego para comprobar la acción antibacterial, se preparan los inóculos de las bacterias en estudio, y se miden los halos de inhibición. Se logra demostrar que entre menor tamaño tenga la nanopartícula mayor actividad antibacterial y esto se debe a su mayor área superficial.1 Otro tipo de síntesis de nanopartículas de plata, es el uso de las mismas con péptidos antimicrobianos, esto se da a partir de la resistencia a antibióticos que se ha suscitado en los www.tribuglobal.com

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Síntesis y caracterización de nanopartículas de plata aplicadas en el sector de la biomedicina Cáceres, A & Vega, R. últimos años. Las nanopartículas de plata poseen la mayor actividad bactericida y biocompatibilidad, entre otras nanopartículas de otros metales, este no requiere agentes fotocatalíticos para dicha acción.

Figura 1. Micrografía de STEM y TEM respectivamente de un nanocompuesto de PMMA/NAg y PS/NAg. Extraído de Betancourt, R. A.R. Paredes, Mata-Padilla, C. Cabrera, B.A, Puente, S, O. Rodríguez (2011), Propiedades antibacteriales de nanocompuestos de PS y PMMA con nanopartículas de plata como potenciales aplicaciones en la prevención de infecciones nosocomiales, 6 (72), pp. 662-674

Los péptidos antimicrobianos son componentes de las defensas naturales de los seres vivos contra microorganismos patógenos, también poseen actividad antibacteriana. Son relativamente pequeños, catiónicos, anfipáticos, y de longitud de secuencia y estructura variable. Estos péptidos poseen mecanismos de acción que consisten en formar canales de manera que las superficies hidrofílicas apunten hacia adentro produciendo un poro acuoso y así perdiéndose contenido celular y el otro es que los péptidos están en contacto con la cabeza de los fosfolípidos en la zona externa de la membrana por lo que afecta su permeabilidad.7 Se ha encontrado que al aumentar la carga neta positiva de estos péptidos, cerca del extremo C-terminal aumenta significativamente la actividad antibacteriana y antifúngica in vitro.5 Para dicha síntesis de la nanopartícula se requiere un precursor metálico, un agente reductor y un agente estabilizante. La formación de dicha partícula se da en dos etapas, la primera es una nucleación siguiendo por un crecimiento. Se encuentran varias formas de la acción antimicrobiana de las nanopartículas de plata, una de ellas es su absorción a la membrana bacteriana logrando penetrar al interior de la bacteria, la nanopartícula de plata interacciona con las proteínas sulfuradas de la bacteria, atacando la cadena respiratoria y el proceso de división celular produciendo la muerte de la célula, liberando también iones Ag+, mejorando la actividad bactericida. 7 La lactoferrampina es un péptido antimicrobiano, y se encuentra formado por 17 aminoácidos, el cual posee un amplio espectro de acción antibiótica contra bacterias, hongos y virus, mediante ciertos mecanismos como el modelo de ruptura por barril, el cual forma unos poros, provocando perdida del contenido celular llevando a la muerte celular y por medio del modelo de capa, donde el péptido está en contacto con la cabeza del fosfolípido de la zona externa de la membrana, afectando la permeabilidad de la misma. El método más habitual para obtenerlo es la unión del aminoácido carboxi-terminal (C- terminal) a un soporte insoluble y posterior elongación www.tribuglobal.com

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Síntesis y caracterización de nanopartículas de plata aplicadas en el sector de la biomedicina Cáceres, A & Vega, R. secuencial, aminoácido tras aminoácido, de la cadena peptídica, esto provoca mayores rendimientos, lavado y filtrado sencillo de los péptidos y la posibilidad de automatización del proceso de síntesis.7 Al sintetizar la nanopartícula de plata con la lactoferrampina, se logra que la plata entre con mayor facilidad a la membrana debido a que el péptido afecta la permeabilidad de la membrana, además dicho péptido controla la forma y tamaño de la nanopartícula de plata, mejorando la estabilidad, biocompatibilidad y capacidad de dispersión de la nanopartícula.7 La investigación demuestra que dependiendo de la síntesis de la nanopartícula y del tipo de péptido va a tener un mayor efecto antimicrobiano realizados a la E. coli (Fig 2). Los primeros métodos de síntesis de nanopartículas de plata, consisten en utilizar nitrato de plata como precursor metálico y citrato de sodio como agente reductor, sin embargo en este método se encuentra un amplia variedad de tamaños de las nanopartículas, por lo que otro método más utilizado es utilizar borohidruro de sodio como agente reductor, ya que los tamaños son de 10nm y una distribución de tamaño limitado.

Figura 2. Microscopia electrónica de las nanopartículas de plata. Extraída de la tesis “Síntesis de nanopartículas de plata funcionalizadas con péptidos análogos de lactoferrampina con potencial antibiótico contra Escherichia coli O157:H7”

La síntesis por medio del método de reducción, emplea como materia principal el nitrato de plata y borohidruro de sodio como agente reductor, obteniendo dispersiones coloidales de plata amarilla. En este caso se agrega un exceso del borohidruro de sodio para reducir los iones Ag+, estabilizando así las nanopartículas formadas, mediante la reacción: AgNO3 + NaBH4

½ H2 + ½ B2H6 + NaNO3

Las nanopartículas son mantenidas en suspensión por fuerzas electroestáticas repulsivas por el NaBH4 absorbido, este estabiliza conforme se da el crecimiento de las nanopartículas, la cantidad debe ser suficiente para estabilizar las partículas, pero no debe de pasarse, debido a que podría www.tribuglobal.com

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Síntesis y caracterización de nanopartículas de plata aplicadas en el sector de la biomedicina Cáceres, A & Vega, R. aumentar la fuerza iónica y provocar que ocurra agregación. Como resultado el tamaño de la nanopartícula es aproximadamente de 12 nm.10 En este tipo de reacciones la oxidación de las nanopartículas formadas es desfavorecida termodinámicamente debido al alto potencial de reducción de la plata, lo que permite la formación de suspensiones acuosas o alcohólicas sin la presencia de agentes estabilizantes. La doble capa eléctrica formada alrededor de las nanopartículas en soluciones coloidales de alta fuerza iónica es necesario el uso de agentes estabilizantes como monocapas autoensambladas, estos agentes no sólo protegen las nanopartículas del medio ambiente y evitan su aglomeración, sino que también juegan un papel importante en el control de la forma y tamaño de las nanopartículas.7 Las nanopartículas de plata presentan propiedades bactericidas y las de oro catalíticas, por lo que se realiza una síntesis para la aplicación en medicina. Al utilizar un poli(fenilenetinileno) en los cuales la combinación de anillos aromáticos con triples enlaces conjugados se da una elevada deslocalización electrónica que posee propiedades ópticas de emisión. 9 Ambos metales se sintetizan por métodos químicos coloidales, también para la plata se emplea ablación láser. Al caracterizar ambas partículas por MET, según el trabajo de investigadores de Centros de Investigación de México e Italia, el tamaño promedio del oro es de 5,8 nm, con una morfología icosaédrica para las partículas funcionalizadas con tioles, sin formar aglomerados (ver fig 1), además de presentar una disminución en el rendimiento cuántico de aproximadamente el 20% con respecto al polímero, la conductividad eléctrica de la superficie aumento. En el artículo plantean con base en los resultados, la aplicación en celdas solares. En el caso de la plata, el tamaño de las partículas por el método químico es de 10,1 nm y por ablación láser 21,2 nm, en este caso hay presencia de aglomeración (ver fig 1) por los dos métodos precipitándose. Suponen que el polímero interactúa con las nanopartículas de plata por medio de los átomos de azufre. Las partículas obtenidas por ablación laser, presentan un incremento notable en el rendimiento cuántico por lo que podría utilizarse como marcadores fluorescentes, en estado sólido para biosensores o diodos electroluminiscentes. Aun así, concluyen que se debería de buscar una técnica que elimine el exceso de polímero y disminuya el tamaño de la nanopartícula. 6

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Síntesis y caracterización de nanopartículas de plata aplicadas en el sector de la biomedicina Cáceres, A & Vega, R.

Figura 3. Imágenes bidimensionales MFA por tapping 10μm X 10μm de una película en ITO de pPET3OC12sqS (arriba) y Au(pPET3OC12-sqS) (abajo). Extraída del artículo” Nanopartículas de plata y oro funcionalizadas in situ con el polímero conjugado fluorescente pPET3OC12-sqS. Síntesis, propiedades, morfologícas, ópticas y eléctricas”.

La síntesis de nanopartículas a partir de un método organometálico, se logra controlar de mejor manera el tamaño, forma y composición de la nanopartícula. Dicha investigación demuestra que usando hexadecilamina como agente estabilizante, logra que las nanopartículas de plata posean un diámetro de 9,8 nm, con una buena capacidad bactericida, además la utilización de alquitiolatos también como agente estabilizador, crea superredes cristalinas de nanopartículas de 6 nm.9 La síntesis se da a partir del complejo [Ag (C6F5)], sintetizado a partir de la siguiente reacción: [NBu4] [Ag(C6F5)2] + AgClO4

[NBu4] ClO4 + 2 [Ag(C6F5)]

Luego se agrega en exceso la polivinilpirrilidona como agente estabilizante, utilizando THF como disolvente. Posteriormente se empleó etilenglicol como disolvente. Al formar este complejo, (Fig 4) se logra de mejor manera que las nanopartículas estén rodeadas por sílice, sin embargo al complejo formado usando como disolvente etilenglicol, se obtienen nanopartículas de tamaños más homogéneos, y ninguna nanopartícula queda fuera de las láminas de sílice. 9 Las nanopartículas causan deformación de la membrana debido a la probable producción de especies reactivas de oxígeno, produciendo radicales libres, lo cual puede provocar estrés oxidativo, inflamación y daño consecuente, no solo de las membranas sino también del ADN y las proteínas. Esto se puede confirmar por medio de microscopia de Transmisión Electrónica, ya que se observa la formación de pozos en la pared celular de la bacteria y la acumulación de plata en la www.tribuglobal.com

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Síntesis y caracterización de nanopartículas de plata aplicadas en el sector de la biomedicina Cáceres, A & Vega, R. membrana bacteriana lo cual incrementa la permeabilidad y logra producir la muerte celular.7 Otro mecanismo se relaciona con la absorción a la membrana logrando penetrar el interior de las bacterias. Dicha membrana contiene proteínas sulfuradas y las nanopartículas interactúan con estas proteínas y con el fósforo que contienen las moléculas de ADN, cuando las nanopartículas ingresan a la célula bacteriana, forman una región de bajo peso molecular en el centro de la bacteria, por lo que atacan la cadena respiratoria y el proceso de división celular conduciendo a la muerte de las células.8

Figura 4. Síntesis de nanopartículas de plata estabilizadas con polivinilpirridona a partir de un compuesto organometálico. Extraído de la tesis “ Síntesis de nanopartículas plata-sílice a través de un método organometálico”.

Conclusiones A partir de la revisión de cada síntesis, se logra concluir que, a pesar de la técnica utilizada, se logran nanopartículas de plata que, aunque de diferentes tamaños, tienen la misma función antimicrobiana contra bacterias, virus y hongos. Depende del objetivo buscado, se debe seleccionar el método que mejor se ajuste al tamaño de partícula requerido, tomando en cuenta las variables como equipo, reactivos, costo de la síntesis, entre otros. A partir de la síntesis nanopartículas de plata y su aplicación en bacterias se logra demostrar que las nanopartículas más pequeñas, poseen mayor acción antibacteriana, por lo que su aplicación en diferentes campos médicos lograría ser un avance para evitar las contaminaciones de microorganismos. Al comprobar que entra más pequeña sea la nanopartícula de plata, mayor poder antibacterial posee, es recomendable escoger el tipo de síntesis que produzca la nanopartícula más pequeña, evitando la aglomeración de la misma. Referencias 1.

2. 3.

Betancourt, R. A.R. Paredes, Mata-Padilla, C. Cabrera, B.A, Puente, S, O. Rodríguez (2011), Propiedades antibacteriales de nanocompuestos de PS Y pmma con nanopartículas de plata como potenciales aplicaciones en la prevención de infecciones nosocomiales, 6 (72), pp. 662-674 C.N.R. Rao, A.Muller, A.K. Cheetham, Nanomaterials Chemistry, 2007, 185. P.K.Stoinmenov, et all. Metal Oxide Nanoparticles as bactericidal Agents Langmuir (2002) 18, 66796686 www.tribuglobal.com

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Síntesis y caracterización de nanopartículas de plata aplicadas en el sector de la biomedicina Cáceres, A & Vega, R. 4. 5.

Rodolfo Zanella. (2012). Metodologías para la síntesis de nanopartículas. Mundo nano, 5, 13. Haney EF, Lau F, Vogel HJ. Solution structures and model membrane interactions of lactoferrampin, an amtimicrobial peptide derived from bovine lactoferrin. Biochim. Biophys. Acta 2007; 1768(10) : 2355-64 6. H.avila, KJ Moreno, I. Moggio, E. Arias, G. Castruita, R.A. Vazquez, D.I. Medellin, R.F Ziolo (2008) Nanopartículas de plata y oro funcionalizadas in situ con el polímero conjugado fluorescente Ptet30c12-sqS.,21 (1)pp. 20-25 7. Sistema Web accesado el 08 de setiembre, 2013. Disponible en : http://repositorio.uis.edu.co/jspui/bitstream/123456789/7392/2/143147.pdf 8. Morones J, Elechigerra J, Camacho A. Ramírez J. The bacterial effect of silver nanoparticles. Nanotech 2005; 16:2346-53 9. Sistema Web accesado el 14 de setiembre, 2013, Disponible en: http://biblioteca.unirioja.es/tfe_e/TFE000189.pdf 10. Sistema Web accesado el 07 de setiembre,2013. Disponible en: http://www.qi.fcen.uba.ar/materias/cqi/2010/practicas/practica2

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