SEMANA 5- Toma de Muestra

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

SEMANA 5: Procesamiento y colección de muestras ambientales: Suelos y sedimentos, agua y aire. Identificación de microorganismos: Técnicas de cultivo

SUELOS Y SEDIMENTOS

CARACTERÍSTICAS • Ambiente heterogéneo • Microorganismos varían con la profundidad y tipo de suelo.

• Se necesita tomar más de una muestra para obtener muestras microbianas representativas. • Muestras compuestas. • Muestreos secuenciales.

ESTRATEGIAS DE MUESTREO MUESTRAS SUPERFICIALES: • Barrenos o Nucleadores manuales (hasta 180 cm).

• Toman muestras a la misma profundidad. • Muestras para análisis microbiológicos: -Contaminación superficial.

-Limpieza con agua + etanol 75% + ADE -Muestras compuestas -Almacenamiento en coolers con hielo. -Traslado al laboratorio.

ESTRATEGIAS DE MUESTREO TOMA DE MUESTRAS SUPERFICIALES: • Muestreos bidimensionales.

• Disminuye el número de muestras. • El muestreo se hace más representativo. • Para conocer sobre comunidades microbianas en profundidad se necesita un análisis tridimensional. • Ejem: muestreo de suelo rizosférico (210 mm)

ESTRATEGIAS DE MUESTREO TOMA DE MUESTRAS NO SUPERFICIALES: • Para ambientes insaturados. • Perforadores giratorios (aire y lodo). • Puede llegar a varios cientos de metros.

• Se obtienen pocas muestras (núcleos). • Aire es filtrado (HEPA). • Las muestras son congeladas.

• El análisis microbiológico se realizará dentro de las 18 horas luego de la colección.

ESTRATEGIAS DE MUESTREO TOMA DE MUESTRAS NO SUPERFICIALES: • Para ambientes saturados • Perforador hueco. • Las muestras son colectadas en tubos. • Luego son retirados. • Luego de la colecta el núcleo es almacenado de forma estéril y congelado. • Traslado al laboratorio.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Y ALMACENAMIENTO • Realizar el análisis microbiológico lo más pronto posible luego de la colección. ALMACENAMIENTO EN CONDICIONES DE HUMEDAD DE CAMPO A 4°C POR 3 MESES: REDUCÍÓN DE NÚMERO Y ACTIVIDAD DE COMUNIDADES BACTERIANAS, PERO NO HUBO CAMBIOS EN COMUNIDADES DE ACTINOMICETOS • Pasos a seguir: Secado (sin que la humedad del suelo disminuya tanto), tamizado (cernidor 2mm), almacenamiento a corto plazo (4°C)

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Y ALMACENAMIENTO Pasos a seguir: • PRIMER: Secado (sin que la humedad del suelo disminuya tanto).

• SEGUNDO: tamizado (cernidor 2mm). • TERCERO: Almacenamiento a corto plazo (4°C) de ser necesario. • CUARTO: Si las muestras son almacenadas no permitir que se sequen ni crear ambientes anaeróbios (21 días es un tiempo óptimo). NOTA: no es necesario esterilizar muestra.

PARA EL MUESTREO DE SUELOS NO SUPERFICIALES TENER EN CUENTA: -Baja cantidad de microorganismos. -Los sedimentos no son expuestos a la atmósfera. - Es más complicado y costoso el obtener estas muestras.

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE SUELO Y SEDIMIENTOS PARA BACTERIAS • El elección del medio de cultivo es crucial.

AGUA

MÉTODOS Y ESTRATEGIAS DE MUESTREO • Más homogéneo que las muestras de suelo. • La toma de muestras es físicamente más sencilla.

• ¿Mayor diversidad que en el suelo?

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE AGUA VIRUS: • PRIMERO: Colección de la muestra, concentrados del agua mediante adsroción usando filtro. • SEGUNDO: Elución, recuperación de los virus • TERCERO: Reconcentración, reducción de la muestra antes del ensayo. • CUARTO: Detección, mediante cultivos celulares, PCR

PROCESOS – COLECCIÓN DE LA MUESTRA • VIRADEL (Virus adsorption-elution)

PROCESOS - ELUCIÓN • Solución de extracto de carne 1.5% a pH 9.5: este pH incrementa las cargas negativas tanto en los virus como en el filtro (desorción del virus).

PROCESOS - RECONCENTRACIÓN • Reducción de la muestra (de 1 - 2 litros a 20 – 30 ml)

PROCESOS - DETECCIÓN • Cultivos celulares: efectos citopatogénicos (CPE). • Por enumeración de zonas claras o unidades formadoras de placas (PFU).

MÉTODOS Y ESTRATEGIAS DE MUESTREO • BACTERIAS: Filtración, NMP • PROTOZOARIOS: Colección de la muestra, Elución, Centrifugación y concentración.

MÉTODOS Y ESTRATEGIAS DE MUESTREO • SEPARACIÓN INMUNOMAGNÉTICA • TINCIÓN CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES

MÉTODOS Y ESTRATEGIAS DE MUESTREO • EXAMINACIÓN/DETECCIÓN

AIRE

DISPOSITIVOS DE MUESTREO PARA MUESTRAS DE AIRE • Recolección en una matriz acuosa (Impingement).

• Deposición forzada de partículas aerotransportadas en medio sólido (impactación). • Deposición forzada mecánicamente de partículas en el aire mediante fuerzas inerciales (centrifugación). • Atrapamiento de partículas aerotransportadas por exclusión de tamaños (filtración). • Colección de partículas usando fueras de deposición naturales (deposición).

IMPINGEMENT • Volumen de entrada: 12.5 L/min a una altura de 1.5 m • Volumen de muestra: 20 ml (solución NaCl 0.85%, Sol. de peptona 1%)

• Duración: 15 – 20 min.

IMPACTACIÓN • Impactador de Andersen 6 – STG (Impactador multinivel, multioroficio y en cascada). • Flujo de entrada: 28.3 L/min • Acero inoxidable, placas Petri. • Las partículas más grandes quedan en el primer nivel. • Las partículas más pequeñas pasan al siguiente nivel.

CENTRIFUGACIÓN, DEPOSICIÓN CENTRIFUGACIÓN • El ciclón

• Volúmenes de muestreo: 1 – 400 L/min • Entrada de aire: tangencial. • Forma cónica. DEPOSICIÓN • Placas expuestas al interperie • En suelo • A 1.5 m