SEGUNDO PREMIO MICROBIOLOGÍA 2012-MARIELA REYES

Escuela Técnica Superior de Ingenieros de Caminos, Canales y Puertos Departamento de Ingeniería Hidráulica y Medio Ambiente

Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

Trabajo de investigación Autor:

Mariela Beatriz Reyes Sosa Directores: José Ferrer Polo Luis Borrás Falomir Fotografías: Mariela Beatriz Reyes Sosa

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Agradecimientos Le doy las gracias antes que nada a mi familia, por que a pesar de la distancia me expresan su apoyo y me motivan a continuar. También expreso mis agradecimientos a todas las personas que de alguna manera han estado conmigo en la realización de este trabajo: En primer lugar a mis tutores, Jóse Ferrer y Luis Borrás por su tiempo y dedicación. Luis te agradezco la paciencia que me has tenido y espero sigas con ella para lo que continua. A la Doctora Aurora Seco esencial de este trabajo.

por su apoyo y orientación en el punto

A todos y cada uno de los chicos del laboratorio, ya que hicieron mas agradable el tiempo que pasé en el laboratorio. Simplemente gracias por esta alli y por estar pendientes. A todos mis amigos tanto de México como los de Valencia, que estan pendientes de mis avances y de mi, gracias por que no pasan el momento para motivarme a seguir, por sus consejos y aportaciones. En especial quiero agradecer a Rosa que siempre ha estado conmigo escuchandome y aconsejandome. A Marcos por que es tan objetivo que siempre me hace observaciones en mi trabajo. A Carles por ejercer cierta presión y ayudarme con el resumen en Valenciano. A Mariam por que es mi compañia en las buenas y en las malas, en las alegrías y en las decepciones. A todas las demás personas que por falta de espacio omito nombres.

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RESUMEN La creciente industrialización y desarrollo de las poblaciones ha producido un importante aumento del uso del agua y una mayor contaminación de la misma. Por ello, se ha visto la necesidad de depurar las aguas residuales. La depuración de las aguas residuales domésticas y/o urbanas se ha basado principalmente en la aplicación de procesos biológicos. Estos procesos dependen de las poblaciones microbianas presentes en las aguas residuales y en los sistemas de tratamiento. En función del tipo de proceso (Fangos activados y Digestión aerobia y/o anaerobia), varía la población microbiana así como su abundancia, que se puede ver favorecida de alguna u otra manera por las características del proceso de tratamiento (Aerobio, Anaerobio y/o Anóxico). En este trabajo se han identificado y cuantificado las poblaciones microbianas más características de los procesos biológicos llevados a cabo en la EDAR (Estación Depuradora de Aguas Residuales) de la Cuenca del Carraixet (Valencia), que incluye un proceso de Fangos Activados y de Digestión Anaerobia. Con este trabajo se pretende conocer de forma global las poblaciones microbianas y las diferencias que existen en cuanto a presencia y abundancia en los procesos biológicos que se realizan en una misma EDAR. Para poder llevar a cabo la determinación de las poblaciones microbianas se adaptó la técnica molecular FISH (Fluorescent in situ hybridization) a las muestras examinadas, ya que, en el caso de muestras procedentes de digestores anaerobios, las muestras no presentaban una señal con suficiente intensidad, por lo que se modificarón los tiempos de fijación e hibridación con el fin de optimizar las señales de hibridación. En los Fangos activados se detectaron bacterias amonio-oxidantes, nitritooxidantes, PAO (bacterias acumuladoras de poli-fosfatos), GAO (bacterias acumuladoras de glucógeno), bacterias desnitrificantes, bacterias metanotróficos, organismos metanogénicos y bacterias sulfato-reductores (SRB). Entre estos organismos, los que presentaron una mayor abundancia fueron las bacterias sulfatoreductoras con un 27% (destacando el orden Desulfobacterales seguidas de las Desulfovibrionales) seguidas de las bacterias desnitrificantes con 19% (en su mayoria Azoarcus-Thauera-Castellaniella seguidas de Paracoccus). Los organismos metanogénicos supusieron el 11% (Methanomicrobiales y Methanobacteriales), las bacterias nitrificantes el 9%, las GAO el 4%, las PAO un 2% y las Metanotrófas un 1%. El resto de bacterias no identificadas, supuestamente heterótrofas, corresponde a un 27%. En la Digestión anaerobia se detectó un 30% de organismos metanogénicos (Methanosarcinales, Methanomicrobiales y Metahanobacteriales), un 20% de bacterias sulfato-reductoras (Desulfovibrionales y Desulfobacterales) y un 10% de bacterias desnitrificantes (Thiobacillus denitrificans, Paracoccus y Azoarcus-ThaueraCastellaniella). El resto de bacterias no identificadas (supuestamente acidogénicas) corresponde a un 40%. Cabe destacar que no era de esperar encontrar presencia de bacterias desnitrificantes en el digestor anaerobio, ni bacterias sulfato reductoras y archaeas

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metanogénicas en el reactor aerobio. Por lo que su presencia e interacciones resultan un punto importante dentro de la población microbiana y los diferentes ciclos que se realizan durante el proceso biológico. El conocimiento de las interacciones que tienen las bacterias en los diferentes procesos de una EDAR nos permiten avanzar en las modelaciones y simulaciones de los procesos para aproximarnos más a la realidad, y poder mejorar la operación de las plantas.

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RESUM La creixent industrialització i desenvolupament de les poblacions ha produït un important augment de l’ús de l’aigua i una major contaminació de la mateixa. Per això, s’ha vist la necessitat de depurar les aigües residuals. La depuració de les aigües residuals domèstiques i/o urbanes s’ha basat principalment en l’aplicació de processos biològics. Estos processos depenen de les poblacions microbianes presents en les aigües residuals i en els sistemes de tractament. En funció del tipus de procés (Fangs activats i Digestió aeròbia i/o anaeròbia), varia la població microbiana així com la seua abundància, que es pot veure afavorida d’alguna o una altra manera per les característiques del procés de tractament (Aerobi, Anaerobi i/o Anòxic). En este treball s’han identificat i quantificat les poblacions microbianes més característiques dels processos biològics duts a terme en l’EDAR (Estació Depuradora d’Aigües Residuals) de la Conca del Carraixet (València), que inclou un procés de Fangs Activats i de Digestió Anaeròbia. Amb este treball es pretén conéixer de forma global les poblacions microbianes i les diferències que existeixen en quant a presència i abundància en els processos biològics que es realitzen en una mateixa EDAR. Per a poder dur a terme la determinació de les poblacions microbianes es va adaptar la tècnica molecular FISH (Fluorescent in situ hybridization) a les mostres examinades, ja que, en el cas de mostres procedents de digestors anaerobis, les mostres no presentaven un senyal amb suficient intensitat, per la qual cosa es van modificar els temps de fixació i hibridació a fi d’optimitzar els senyals d’hibridació. En els Fangs activats es van detectar bacteris amoni-oxidants, nitrit-oxidants, PAO (bacteris acumuladors de poli-fosfatos), GAO (bacteris acumuladors de glucogen), bacteris desnitrificants, bacteris metanotròfics, organismes metanogènics i bacteris sulfat-reductors (SRB). Entre estos organismes, els que van presentar una major abundància van ser els bacteris sulfat-reductors amb un 27% (destacant l’orde Desulfobacterals seguides de les Desulfovibrionals) seguides dels bacteris desnitrificants amb 19% (en la seu majoria Azoarcus-Thauera-Castellaniella seguides de Paracoccus). Els organismes metanogènics van suposar 11% (Methanomicrobials i Methanobacterials), els bacteris nitrificants el 9%, les GAO el 4%, les PAO un 2% i les Metanotròfes un 1%. La resta de bacteris no identificats, suposadament heteròtrofes, correspon a un 27%. En la Digestió anaeròbia es va detectar un 30% d’organismes metanogènics (Methanosarciales, Methanomicrobiales i Metahanobacteriales), un 20% de bacteris sulfat-reductors (Desulfovibrionales i Desulfobacterales) i un 10% de bacteris desnitrificants (Thiobacillus denitrificans, Paracoccus i Azoarcus-ThaueraCastellaniella). La resta de bacteris no identificats (suposadament acidogènics) correspon a un 40%. Cal destacar que no era d’esperar trobar presència de bacteris desnitrificants en el digestor anaerobi, ni bacteris sulfat reductors i archaeas metanogènics en el reactor aerobi. Pel que la seua presència i interaccions resulten un punt important dins de la població microbiana i els diferents cicles que es realitzen durant el procés biològic.

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El coneixement de les interaccions que tenen els bacteris en els diferents processos d’una EDAR ens permeten avançar en les modelacions i simulacions dels processos per a aproximar-nos més a la realitat, i poder millorar l’operació de les plantes.

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SUMMARY Increasing industrialization and development of populations has produced a significant increase in water usage and pollution. Therefore, the need to purify wastewater has become a major priority. The purification of domestic and urban wastewater has been based mainly on the application of biological processes. These processes depend on microbial populations. Depending on the type of process (activated sludge and aerobic or anaerobic digestion), the microbial populations and their abundance vary. This microbial populations can be favored in some way or another by the characteristics of the treatment process (aerobic, anaerobic or anoxic). In this work, most characteristic microbial populations that are present in the biological processes of a WWTP (Wastewater Treatment Plant) have identified and quantified. The WWTP (Cuenca del Carraixet) is placed in Valencia (Spain), and includes an activated sludge process and anaerobic digestion. This work is aimed to determine the overall microbial populations and the abundance differences between the biological processes that take place in a WWTP. As samples from the anaerobic digester examined by FISH (Fluorescent in situ hybridization) resulted in alow signal, it was necessary to adapt this molecular technique to this kind of samples. As a result, the fixation and hybridization times were changed. In the activated sludge process, ammonia-oxidizing bacteria, nitrite-oxidizing, PAO (poly-phosphates accumulating bacteria), GAO (glycogen accumulating bacteria), denitrifying bacteria, methanotrophic bacteria, methanogenic organisms and sulfatereducing bacteria (SRB) were detected. Among these organisms, the highest abundance was achieved by sulfate-reducing bacteria with a 27% (mainly Orders Desulfovibrionales and Desulfobacterales) followed by denitrifying bacteria with a 19% (mostly Azoarcus, Thauera, Castellaniella and Paracoccus). Methanogenic organisms accounted for 11% (Methanomicrobiales and Methanobacteriales), nitrifying bacteria were 9%, 4% of GAO, 2% of PAO 2%, 2% and 1% of methanotrophs. The other unidentified bacteria, presumably heterotrophic, corresponding to 27%. In the anaerobic digestion it was detected 30% of methanogenic organisms (Methanosarciales, Methanomicrobiales and Metahanobacteriales), 20% of sulfatereducing bacteria (Desulfovibrionales and Desulfobacterales) and 10% of denitrifying bacteria (Thiobacillus denitrificans, Paracoccus, Azoarcus, Thauera, and Castellaniella). The other unidentified bacteria (supposedly acidogenic bacteria) was 40%. It should be noted that it was not expected to find denitrifying bacteria in the anaerobic digester or sulfate reducing bacteria and methanogenic archaea in the aerobic reactor. So their presence and interactions are an important point in the microbial population and the different relationships that take place during the biological process. Knowledge of the interactions between bacteria in the different biological processes taking place in the WWTP allow us to advance on modeling and simulation

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of the biological processes. This information is usefull to get closer to reality and to improve plant operation.

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INDICE RESUMEN ....................................................................................................................................... I RESUM ................................................................................................................................................. III 1

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 1

1.1 1.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.3.5 1.3.6 1.3.7 1.3.8 1.4

CARACTERÍSTICAS TÍPICAS DE LAS AGUAS RESIDUALES ............................................................... 1 PROCESOS BIOLÓGICOS EN AGUAS RESIDUALES ........................................................................... 2 MICROORGANISMOS ..................................................................................................................... 3 Bacterias amonio-oxidantes (AOB) y bacterias nitrito-oxidantes (NOB) ................................ 5 Bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAO) ....................................................................... 7 Bacterias acumuladoras de glucógeno (GAO) .......................................................................... 8 Bacterias desnitrificantes ........................................................................................................ 10 Bacterias acidogénicas/acetogénicas ...................................................................................... 12 Bacterias metanotrófas........................................................................................................... 18 Bacterias sulfato-reductoras (SRB)......................................................................................... 19 Organismos metanogénicos .................................................................................................... 24 TÉCNICA MOLECULAR PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS. HIBRIDACIÓN MOLECULAR FLUORESCENTE IN SITU (FISH) ......................................................................... 29 1.4.1 Fijación de la biomasa para la hibridación ............................................................................. 30 1.5 SONDAS ...................................................................................................................................... 32 2

OBJETIVOS .......................................................................................................................... 33

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MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 35

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6

PROCEDENCIA DE LA MUESTRA .................................................................................................. 35 TOMA DE MUESTRA .................................................................................................................... 35 HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU, FISH .............................................................................. 36 PROCEDIMIENTO ........................................................................................................................ 36 SONDAS ...................................................................................................................................... 39 CUANTIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS ........................................................................... 44

4 ADAPTACIÓN DE LA TÉCNICA FISH PARA MUESTRAS DE UN DIGESTOR ANAEROBIO ........................................................................................................................................... 45 4.1 4.2 4.3 4.4

RECOMENDACIÓN A PROBLEMAS ASOCIADOS CON LA DETECCIÓN DE LA FLUORESCENCIA ........ 45 DETERMINACIÓN DE LOS TIEMPOS DE FIJACIÓN Y DE HIBRIDACIÓN ÓPTIMOS ............................. 46 CUANTIFICACIÓN DE LA SEÑAL DE HIBRIDACIÓN ....................................................................... 47 ANÁLISIS CUANTITATIVO ........................................................................................................... 48

5 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LOS DISTINTOS GRUPOS BACTERIANOS PRESENTES EN LOS PROCESOS DE FANGOS ACTIVADOS Y DIGESTIÓN ANAEROBIA............................................................................................................................................ 51 5.1 5.2

DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS NITRIFICANTES ........................................... 51 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS ACUMULADORAS DE POLI-FOSFATOS (PAOS) Y ACUMULADORAS DE GLÚCOGENO (GAOS) .............................................................................................. 53 5.3 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS DESNITRIFICANTES .................................... 55 5.4 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS METANOTROFAS ........................................ 57 5.5 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS (SRB) .................. 58 5.6 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS METANOGÉNICAS ...................................... 62 5.7 COMPARACIÓN DEL TOTAL DE LAS POBLACIONES BACTERIANAS ENCONTRADAS EN EL FANGO ACTIVADO Y EN LA DIGESTIÓN ANAEROBIA ................................................................................................ 64 6

CONCLUSIONES ................................................................................................................. 69

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RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 71

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REFERENCIAS .................................................................................................................... 73

ANEXO .......................................................................................................................................... 85

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INDICE FIGURAS Figura 1. Reacciones llevadas a cabo en los fangos activados……………………………………...4 Figura 2. Reacciones que se llevan a cabo en la Digestión anaerobia. García 1991. ........................ 5 Figura 3. Clasificación de las Sondas metanogénicas en relación con las bacterias metanogénicas que detectan . .............................................................................................................................................. 27 Figura 4. Esquema de la Hibridación Fluorescente in situ FISH. www.iqb.es................................ 30 Figura 5. Diferencia estructural celular entre las gram positivas y las gram negativas . ................. 31 Figura 6. Representación esquemática de los peptidosglicanos . ................................................... 32 Figura 7. Esquema de la EDAR del Carraixet. ................................................................................ 35 Figura 8. Hibridación Fluorescente FISH sin modificación de tiempos.......................................... 46 Figura 9. Esquema de trabajo para la adaptación de la técnica FISH a muestras del Digestor anaerobio.47 Figura 10. Hoja de calculó que genera el programa de cuantificación. ........................................... 48 Figura 11. Hibridación Fluorescente FISH con modificación de tiempos de fijación y de hibridación.. ................................................................................................................................................ 49 Figura 12. Bacterias amonio-oxidantes en el Reactor aerobio.. ...................................................... 52 Figura 13. Bacterias nitrito-oxidantes en el Reactor aerobio.. ........................................................ 52 Figura 14. Bacterias PAO en el Reactor aerobio.. ........................................................................... 54 Figura 15. Bacterias GAO en el Digestor anaerobio.. ..................................................................... 54 Figura 16. Bacterias desnitrificantes.. ............................................................................................. 56 Figura 17. Bacterias Metanotrofas en el Reactor aerobio ............................................................... 58 Figura 18. Bacterias Sulfato-reductoras en el Digestor anaerobio. ................................................. 59 Figura 19. Bacterias Sulfato-reductoras en el Reactor aerobio.. ..................................................... 60 Figura 20. Bacterias Metanogénicas en el Digestos anaerobio.. ..................................................... 63 Figura 21. Bacterias Metanogénicas en el Reactor aerobio............................................................. 64 Figura 22. Comparación de los grupos de bacterias en cada proceso analizado.. ........................... 65

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INDICE DE TABLAS Tabla 1. Bacterias acidogénicas hidrolíticas de la digestión Anaerobia ......................................... 14 Tabla 2. Bacterias acidogénicas fermentativas de la digestión anaerobia ...................................... 15 Tabla 3. Bacterias acetogénicas sintróficas obligatorias de la digestión anaerobia ........................ 16 Tabla 4. Bacterias homoacetogénicas de la digestión anaerobia ..................................................... 17 Tabla 5. Grupos nutricionales de las bacterias metanogénicas........................................................ 28 Tabla 6. Cantidades de Formamida y agua para la preparación de la solución de hibridación ..... 38 Tabla 7. Cantidades de NaCl para la solución de lavado ............................................................... 39 Tabla 8. Sondas Generales .............................................................................................................. 40 Tabla 9. Sondas específicas para grupo Nitrificantes ...................................................................... 40 Tabla 10. Sondas específicas para el grupo PAO y GAO ............................................................... 41 Tabla 11. Sondas específicas para el grupo de las bacterias desnitrificantes .................................. 42 Tabla 12. Sondas específicas para el grupo de las bacterias metanotroficas ................................... 42 Tabla 13. Sondas específicas para las SRB ..................................................................................... 43 Tabla 14. Sondas específicas para las arqueas metanogénicas ........................................................ 44 Tabla 15. Promedio de las áreas (pixeles) ocupadas por las bacterias y error en la cuantificación de la señal detectada en la muestra del digestor anaerobio para las bacterias SRB ................................... 49

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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

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Introducción

El agua como recurso natural se ha vuelto cada vez más escasa con la creciente población mundial. El déficit del agua es debido, sobre todo, al aumento de las necesidades surgidas del desarrollo económico y de la explotación demográfica. El hombre ha utilizado el agua para fines cada vez más numerosos, por lo que ha crecido la dependencia que tenemos hacia ella. El agua al precipitar durante su ciclo, arrastra impurezas del aire, al circular en la superficie se le añade otros contaminantes, más la contaminación generada por el hombre, esta ultima sea por la actividad agrícola, ganadera o industrial, hace sobrepasar el poder de autodepuración de la naturaleza. A causa de esto se hace necesario tomar medidas para mitigar el problema de la contaminación del agua. Para ello se lleva a cabo tratamientos físicos, químicos, mecánicos y biológicos para depurar las aguas contaminadas generadas por las actividades humanas. A las aguas contaminadas por las actividades del hombre se le denomina agua residual. Las aguas residuales son el líquido recogido mediante la red de alcantarillado para su envío a una planta de depuración (Mujeriego, 1990). Se considera aguas residuales a las aguas provenientes de las zonas habitadas y que son generadas principalmente por el desarrollo humano y por las actividades comerciales o domésticas de limpieza y alimentación (Barajas, 2002). Las aguas residuales urbanas (ARU), son generadas cuando dentro de la misma red de alcantarillado que transporta el agua proveniente de las zonas habitadas, se vierte aguas residuales de origen industrial. Estas últimas provienen de las instalaciones de manufacturado y elaboración de alimentos. Así mismo las ARU pueden contener aguas de escorrentía que acceden a la red de alcantarillado a través de los pozos de registro y aguas subterráneas que se infiltran en la red a través de uniones deterioradas o de grietas en las conducciones (Barajas, 2002). 1.1

Características típicas de las aguas residuales

La composición de un agua residual muestra un amplio margen de variación entre las diferentes poblaciones. Esto se debe no solo a las influencias de origen industrial, comercial y fluvial que pudiera presentar si no también a los usos públicos del agua en función de la naturaleza de la población residente. En términos generales, la mayor parte de los componentes presentes en un agua residual son materia orgánica, nutrientes, metales, materia inorgánica y microorganismos. Una considerable parte de estos componentes se encuentran en forma particulada.

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Mariela Beatriz Reyes Sosa

1.2

Procesos biológicos en aguas residuales

Las sustancias orgánicas que se encuentran en las aguas residuales, sufren cambios debido a la acción de los organismos vivientes que se encuentran en ellas. Todos los procesos biológicos llevados a cabo en la depuración de las aguas contaminadas con materias orgánicas biodegradables, se basan, en el proceso natural de autodepuración de las aguas y por tanto en los requerimientos nutricionales de los microorganismos (Catalán, 1997). Los microorganismos en ausencia o presencia de oxígeno libre, descomponen la materia orgánica obteniendo la energía necesaria para sus necesidades metabólicas y para elaborar otros materiales que incorporan a sus propias células (Catalán, 1997). El resultado final de la degradación total de la materia orgánica, en presencia de oxígeno libre, es la formación de compuestos oxidados como fosfatos, nitratos, sulfatos, anhídrido carbónico, etc. Cuando la degradación se realiza en ausencia o escasez de oxígeno libre, o sea en un medio anaerobio, se obtienen compuestos intermedios como amoniaco, metano, sulfuros, etc. (Catalán, 1997). El objetivo fundamental del tratamiento biológico de las aguas residuales con materias orgánicas biodegradables es estabilizar la materia orgánica. La estabilización de la materia orgánica presente en el agua se realiza mediante la intervención de microorganismos, por lo que el éxito de éste tratamiento radicará en favorecer la proliferación de los mismos (Catalán, 1997). Los tratamientos biológicos se prestan a diversas clasificaciones. Cabe distinguir entre dos tipos claramente diferenciados (Ferrer, 2007): 1. Procesos Biológicos de cultivo en suspensión 2. Procesos Biológicos de soporte sólido En todos estos procesos es preciso retener en el sistema la biomasa creada con el objeto de que se produzca el proceso. En los de cultivo en suspensión se suele recurrir a una decantación y recirculación de la biomasa, mientras que en la de soporte sólido la retención de la biomasa queda asegurada por las características del propio proceso (Ferrer, 2007). Los sistemas más característicos de los procesos de cultivo en suspensión son los fangos activados, las lagunas aireadas, el lagunaje y el tratamiento de fangos. Entre los procesos de soporte sólido se encuentran los filtros percoladores, los biodiscos y los lechos de turba (Ferrer, 2007). Los fangos activados son los más usados en las depuradoras de aguas residuales, así como también el tratamiento de fangos a través de la digestión. En los sistemas de fangos activados, con las aguas residuales son introducidas muchas especies de organismos. Muchas de ellas encuentran en ellas un medio inadecuado y, como consecuencia de ello mueren; otras en cambio al ser favorables

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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

persisten y se multiplican. La composición específica de los fangos activados estará determinada por la velocidad relativa de crecimiento de las especies, la disponibilidad de alimento en competición con otras especies del mismo nivel trófico y el efecto de la prelación de los organismos de niveles tróficos más altos. Otros factores importantes son, la disponibilidad de oxígeno, el pH, la temperatura y la presencia de agentes inhibidores o tóxicos. De todas las especies de un mismo nivel trófico que compiten por el mismo alimento la más fuerte y mejor adaptada de ellas se convertirá en dominante. Esta situación debería conducir a la eliminación de las otras especies que compiten. Esto no ocurre debido a las condiciones cambiantes que se dan conforme los fangos pasan a través del sistema, que favorecen sucesivamente a diferentes especies, y a la introducción constante de una población microbiana mixta que mantienen la competición por el alimento (Ferrer, 2007). Los microorganismos que se pueden encontrar en los sistemas de tratamiento de aguas residuales son, bacterias, protozoo, algas, hongos, rotíferos y nemátodos. Siendo las bacterias las que constituyen el 95% de la biomasa en el proceso de fangos activados (Ferrer, 2007). Este trabajo se ha centrado en estudiar la población bacteriana presente en los procesos biológicos de una EDAR (Estación Depuradora de Aguas Residual), describiendo algunos grupos funcionales de bacterias que se encuentran comúnmente en las diversas aguas residuales en las plantas de tratamiento. Para la realización del trabajo nos basamos en la filogenia bacteriana y en la técnica molecular FISH (Fluorescence in situ Hybridization ). 1.3

Microorganismos

Las bacterias son microorganismos unicelulares, que se multiplican por escisión celular, y son las principales responsables de la mineralización de la materia orgánica. Desde el punto de vista metabólico, se clasifican en autótrofas y heterótrofas. La principal ventaja competitiva de las bacterias, reside en su extraordinaria facultad metabólica, es decir, su capacidad de adaptación a condiciones ambientales y sustratos orgánicos muy variados. Ciertos alimentos o sustratos orgánicos estimulan selectivamente la acción metabólica de algunas bacterias. De la misma forma, las sustancias resultantes del metabolismo de un grupo de bacterias, estimulan a otros grupos de bacterias a multiplicarse (Catalán, 1997).

Principales grupos de bacterias presentes en los procesos biológicos (fango activado y digestión anaerobia) de una Estación depuradora de aguas residuales:      

Bacterias amonio-oxidantes (AOB) Bacterias nitrito-oxidantes(NOB) Bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAO) Bacterias acumuladoras de glucógeno (GAO) Bacterias desnitrificantes Bacterias acidogénicas/acetogénicas

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  

Organismos metanogénicos Bacterias metanotróficas Bacterias sulfato-reductoras (SRB) Los 5 últimos grupos corresponden a bacterias características de la digestión anaerobia. En la figura 1 se muestran las reacciones llevadas a cabo por las bacterias dentro de los fangos activados.

Figura 1. Reacciones llevadas a cabo en los fangos activados. En las reacciones que llevan a cabo las bacterias desnitrificantes son por enzimas estas son: 1. nitrito reductasa, 2. nitrito reductasa, 3. oxidonitrico reductasa y la 4. oxidonitroso reductasa.

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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

En la figura 2 se muestran las reacciones que se dan dentro de un digestor anaerobio. Polímero Biológico

Bacterias hidrolíticas

HIDROLISIS Y ACIDOGENESIS

Monómeros

Bacterias fermentativas BHA

NO3 -

SO4 2Piruvato, Succionato Lactato, Etanol

CO2+H2O

CH4 + CO2

Acetato BMA

Bacterias nitrato-reductoras NO2+ N2O+N2 NH4+

Bacterias Sulfato-reductoras BSR Bacterias fermentativas

Formato H 2+CO2

Acetato

SO4 2-

Propionato Butirato Valerato Caproato

SO42BSR

CO2 + H2O

BSR

ACETOGÉNESIS Bacterias homoacetogénicas BHA

Bacterias sincrónicas SO 4 2-

SO4 2CO2+H2O

Acetato

H 2+CO2

Acetato

BSR Bacterias metanogénicas acetoclasticas BMA CH4 + CO2

BMA CH4 + CO2

Bacterias metanogénicas hidrogenotróficas.

CH4 + CO2

METANOGÉNESIS

Figura 2. Reacciones que se llevan a cabo en la Digestión anaerobia. García 1991.

En los apartados siguientes se describe cada grupo de las bacterias escritas anteriormente.

1.3.1 Bacterias amonio-oxidantes (AOB) y bacterias nitrito-oxidantes (NOB) Un grupo muy limitado de microorganismos autótrofos (bacterias nitrificantes) lleva a cabo el proceso de la nitrificación. La nitrificación se produce en dos pasos, cada uno de ellos realizado por un tipo específico de bacterias. El primer paso se consiste en oxidar el amonio a nitrito, cuya reacción es (Ferre, 2007): NH4+ + 3/2 O2 → NO2- + 2H+ + H2O El grupo de bacterias que lleva a cabo esta oxidación son las bacterias del género Nitrosomonas, Nitrosospira y Nitrosococcus (Teira, 1996).

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La clasificación taxonómica de estas bacterias basada en la segunda edición del manual Bergey’s (Garrity et al., 2001) es la siguiente: Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: β-proteobacteria Orden V: Nitrosomonadales Familia I: Nitrosomonadaceae. Género I: Nitrosomonas Gérero II: Nitrosospira Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase III: γ-proteobacteria Orden I: Chromatiales Familia I: Chromatiaceae Género X: Nitrosococcus

El segundo paso consiste en la oxidación de nitrito a nitrato. La reacción que se lleva a acabo es la siguiente (Ferre, 2007): NO2- + ½ O2 → NO3El grupo de bacterias que participan en este proceso son las bacterias del género Nitrobacter y Nitrospina (Teira, 1996). La clasificación taxonómica es la siguiente (Garrity et al., 2001): Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase I: α-proteobacteria Orden VI: Rhizobiales Familia VII: Bradyrhizobiaceae Género I: Nitrobacter Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase IV: δ-proteobacteria Orden III: Desulfobacterales Familia III: Nitrospinaceae Género I: Nitrospina Las bacterias nitrificantes se caracterizan por una baja tasa de crecimiento. Esto es debido a la poca energía obtenida con las oxidaciones para la nitrificación en las plantas de tratamiento biológico de aguas residuales (Teira, 1996).

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Tanto las nitrosomonas como las nitrobacter son bacterias autótrofas quimiosintéticas. Esto significa que obtienen la energía necesaria para sintetizar tejido celular mediante reacciones de oxidación-reducción, y que la fuente de carbono que utilizan para este fin es CO2 (inorgánico) que tiene que ser reducido antes de pasar a formar parte de la biomasa celular. La desaparición de estos organismos por muerte o lisis da lugar a la aparición en la disolución de sustrato lentamente biodegradable, que es hidrolizado y consumido por los organismos heterótrofos (Ferrer, 2007). 1.3.2 Bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAO) Se ha comprobado que la eliminación biológica de fósforo es llevada a cabo por un grupo de bacterias denominadas PAO (Polyphosphate Accumulating Organisms). Estas bacterias liberan y toman fósforo en condiciones anaerobias y aerobias alternadas. En condiciones anaerobias la materia orgánica fácilmente biodegradable es descompuesta por las bacterias acidogénicas a ácidos grasos volátiles de cadena corta. Estos ácidos grasos son absorbidos por las bacterias PAO y almacenados como polihidroxi-butirato (PHB) y otros polihidroxialcanoatos (PHA). La energía necesaria para el almacenamiento de los ácidos grasos, es obtenida de la descomposición de los polifosfatos en condiciones anaerobias. Durante este proceso es cuando se produce la descarga de fosfatos al medio. Bajo condiciones aerobias, las bacterias PAO pueden utilizar el sustrato almacenado (PHB) dando lugar a un crecimiento de las mismas. Así mismo, utilizan parte de este sustrato almacenado para acumular fósforo intracelular en forma de polifosfatos, asegurando las reservas de energía necesaria para la etapa anaerobia. En un estudio en 1994 se utilizó la técnica FISH (Fluorescence in situ Hybridization) para estudiar la comunidad microbiana en una planta de tratamiento de aguas residuales en las que se producía el fenómeno de la eliminación biológica de fósforo (Wagner et al., 1994). La población bacteriana resultó en su mayoría Actinobacteria y β-proteobacteria, seguida de γ-proteobacteria, y en un mínimo de la población la especie Acinetobacter. Al año siguiente se realizaron estudios comparando la estructura de la comunidad bacteriana de fangos con y sin eliminación de fosfatos (Bond et al., 1995). Se operaron dos reactores de laboratorio con diferentes capacidades para la eliminación de fosfatos. En ambos reactores, el grupo dominante de bacterias pertenecía a la clase βproteobacteria y dentro de esta clase, el genero Rhodocyclus se encontraba en mayor proporción en el reactor que experimentaba mejor la eliminación de fósforo. En 1999 un estudio indicó la posición filogenética definitiva del subgrupo βproteobacteria, como muy cercano al género Rhodocyclus. A este se le llamó “Candidatus Accumulibacter Phosphatis” (Hesselmanm et al., 1999). Otro estudio realizado un año mas tarde comprobó que Accumulibacter era capaz de realizar el transito de los polifosfatos en el medio (Croccetti et al., 2000). Estos estudios

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demostraron que Accumulibacter correspondía con el fenotipo de las PAO y que predominan en los reactores tanto de laboratorio como los industriales. Se han desarrollado diversas sondas para detectar los principales miembros de Accumulibacter en las muestras de aguas residuales. Algunas de estas sondas son: PAO462, PAO651, PAO846 (Croccetti et al., 2000). El uso conjunto de las sondas forman la sonda PAOMIX que cubriría todas las secuencias conocidas de las bacterias Accumulibacter en las muestras de fangos activados. Las taxonomías de las algunas bacterias PAO según la segunda edición del manual Bergey’s (Garrity, et al., 2001) son: Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: β-proteobacteria Orden VI: Sin clasificación en β-proteobacteria Familia I: Candidatus Accumulibacter Género: Candidatus Accumulibacter Phosphatis Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: β-proteobacteria Orden VI: Rhodocyclales Familia I: Rhodocyclaceae Género I: Rhodocyclus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase III: γ-proteobacteria Orden IX: Pseudomonadales Familia II: Moraxellaceae Género II: Acinetobacter

La reacción de la degradación de polifosfato en condiciones anaerobias es (Ferrer, 2007): 2C2H4O2 + (HPO3) + H2O → (C2H4O2)2 + PO4-3 + 3H+ La reacción de la toma de fosfatos en condiciones aerobias es (Ferrer, 2007): (C2H4O2)2 + 0.2 PO4-3 + 1.2 O2 + 0.16 NH4+ → 0.16C5H7NO2 + 1.2 CO2+ 0.2 (HPO3) + 0.44 OH- + 1.44 H2O

1.3.3 Bacterias acumuladoras de glucógeno (GAO) Las bacterias GAO (Glycogen Accumulating Organisms) son bacterias que compiten con las PAO. Poseen un metabolismo muy similar al de las PAO, ya que al

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igual que ellas, utilizan los ácidos grasos volátiles para la producción de PHA en las zonas anaerobias, y sintetizan glucógeno en las zonas aerobias. El término GAO fue propuesto en 1995, definido como el fenotipo de organismos que acumulan glúcogeno aeróbicamente, y lo consumen anaeróbicamente como fuente de energía. Esto lo realizan con el fin de tomar fuentes de carbono y almacenarlas en forma de PHA (Mino et al., 1995). Existe gran diversidad filogenética entra las GAO, entre ellas Amaricoccus spp. y Defluviicoccus vanus, de la clase de α-proteobacteria; Quadracoccus spp, de la clase βproteobacteria; algunas bacterias de la clase γ-proteobacteria y algunas Actinobacteria como Tetrasphaera spp., Micropruina glycogenia y Kinosphaera limosa (Maszenan et al., 1997; Shintani et al., 2000; Kong et al., 2001; Hanada et al., 2002; Liu et al., 2002). En 1999 se diseñaron dos sondas FISH (Gam1019 y Gam1278) para hibridar sobre las bacterias GAO pertenecientes a la clase γ-proteobacteria (Nielsen et al., 1999). Estas sondas fueron utilizadas para un fango deteriorado de un proceso de eliminación de fósforo y encontraron que el 35% de la población microbiana coincidían con las bacterias GAO. Años mas tarde se realizo un estudio donde se utilizó un fango enormemente deteriorado de un proceso de eliminación de fósforo (Crocetti et al., 2002). Como resultado se diseño dos nuevas sondas (GAOQ431 y GAOQ989) que hibridaban sobre bacterias pertenecientes a la clase γ-proteobacteria. Estas sondas hibridaban bacterias pertenecientes al mismo grupo que se hibridaban con las sondas diseñadas en 1999. Sin embargo se identificó claramente el fenotipo GAO en este grupo de bacterias y las llamaron “Candidatus Competibacter phosphatis” (Crocetti et al., 2002). En el 2002 se realizó in minucioso estudio en el que se identificaron un nuevo grupo de GAO compuesto por siete subgrupos dentro de la clase de γ-proteobacteria (Kong et al., 2002). Se diseñaron 10 sondas FISH para hibridas específicamente sobre este nuevo grupo de bacterias a diferentes niveles jerárquicos: GB, la sonda para el nivel más general, fue dividida en GB_G1 (idéntica a GAOQ989), GB_G2 y GB_1-GB_7. Las bacterias que hibridaban estas sodas mostraban morfologías de cocos y bacilos. Otros dos subgrupos de la clase α-proteobacteria y próximos a Defluviicoccus vanus, han sido relacionados con el fenotipo GAO. El primero de los subgrupos comprende las bacterias que hibridan con las sondas TFO_DF218 y TFO_DF618 (Wong et al., 2004). Este grupo de bacterias mostró una importante presencia en los reactores de laboratorio, pero no en plantas de tratamiento reales. A este grupo se le conoce como “Defluviicoccus vanus Cluster 1”. El segundo subgrupo correspondía con bacterias encontradas en reactores alimentados con propionato (Meyer et al., 2006). Las sondas diseñadas para hibridar sobre este subgrupo fueron DF988 y DF1020. A este grupo se le ha llamado “Defluviicoccus vanus Cluster 2”. Las taxonomías de las bacterias GAO según la segunda edición del manual Bergey’s (Garrity, et al., 2001) son: Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase I: α-proteobacteria 9

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Orden III: Rhodobacterales Familia I: Rhodobacteraceae Género III: Amaricoccus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase I: α-proteobacteria Género: Defluviicoccus vanus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: β-proteobacteria Género: Quadracoccus spp. Dominio: Bacteria Phylum BXIV: Actinobacteria phy. nov. Clase I: Actinobacteria Subclase V: Actinobacteridae Orden I: Actinomycetales Suborden: Micrococcineae Familia X: Intrasporangiaceae Género VIII: Tetrasphaera Dominio: Bacteria Phylum BXIV: Actinobacteria phy. nov. Clase I: Actinobacteria Subclase V: Actinobacteridae Orden I: Actinomycetales Suborden IX: Propionibacterineae Familia II: Nocardioidaceae Género VI: Micropruina

Las reacciones que llevan a cabo son (Oehmen et al, 2005): Condiciones anaerobias C2H4O2 + 1.12CH10/6O5/6 → PHA(1.358PHB + 0.456PHV + 0.0367PH2MV) + 0.27CO2 Condiciones aerobias 4/3CH1.5O0.5 + 4/6 ATP + 5/6 H2O → CH10/6O5/6 1.3.4 Bacterias desnitrificantes Existe un gran número de bacterias capaces de llevar a cabo el proceso de desnitrificación, ya que muchas bacterias aerobias pueden utilizar los nitratos para su respiración en condiciones anaerobias (anóxicas) (Barajas, 2002). Las bacterias que

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llevan a cabo la desnitrificación pueden ser, tanto bacterias heterótrofas (utilizan el Carbono de la materias orgánica para la síntesis celular y como fuente de energía) como anaerobias facultativas (utilizan el oxígeno y el nitrato como aceptor de electrones) (Barajas, 2002). Aunque existen bacterias autotrofas que también son capaces de llevar a cabo la desnitrificación (Ferrer, 2007). Las bacterias desnitrificantes son filogenéticamente diversas y están distribuidas ampliamente en ecosistemas acuáticos y terrestres. El proceso de desnitrificación ocurre en muchas especies de Eubacteria y en unas pocas Arqueobacterias. Las Proteobacterias y las Enterobacterias son anaerobias facultativas, debido a que cambian el aceptor de electrones como el oxígeno por óxidos de nitrógeno (NO2, NO3) bajo condiciones anóxicas (Benavides et al., 2006). Los típicos géneros desnitrificantes organotróficos de los sistemas de fangos activados son: Achromobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Flavobacterium, Hypomicrobium, Moraxella y Pseudomonas (Wanner, 1994). La estructura de la comunidad de bacterias desnitrificantes se ve afectada por las diversas fuentes de carbono. Esto se demuestra por el enriquecimiento de las diversas bacterias desnitrificantes con metanol y acetato (Ginige et al., 2004, 2005; Hallin et al., 2006; Osaka et al., 2006; Morgan et al., 2008). Se sospechaba que en las plantas de lodos activados para la eliminación de carbono, nitrificación y desnitrificacion dominaban entre las desnitrificantes la βproteobacteria del género Aquaspirillus, seguidas de las Thauera y Azoarcus (Thomsen et al., 2007). Sin embargo se ha observado que las Zoogloea junto con Azoarcus y Thauera abundan y se cree que son las dominantes en la desnitrificacion de las plantas de tratamiento industrial (Juretschko et al., 2002). Las β-proteobacteria del orden Methylophilales del género Dechloromonas y Thauera fueron las bacterias desnitrificantes dominantes en fangos activados con metanol (Ginige et al., 2004) y acetato (Ginige et al 2005) respectivamente. Recientemente se han hallado otras βproteobacteria capaces de desnitrificar en el tratamiento de lodos activados, estas son: Comamonadaceae y algunas Alphaproteobacterias Rhodobacteraceae (Osaka et al., 2006). Muchos investigadores han estudiado desnitrificar en presencia de azufre y tiosulfato como donadores de electrones, esto con cultivos puros de Thiobacillus desnitrificans y Paracoccus (Lee, et al., 2008). Thiobacillus desnitrificans es capaz de crecer como anaerobios facultativos quimiolitotrofos, de oxidar compuestos inorgánicos de azufre, nitrato y otros compuestos nitrogenados (Lee, et al., 2008). Las taxonomías de los microorganimos desnitrificantes según la segunda edición del manual Bergey’s (Garrity, et al., 2001) son:

Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase I: α-proteobacteria Orden III: Rhodobacterales Familia I: Rhodobacteraceae 11

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Género XI: Paracoccus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: β-proteobacteria Orden II: Hydrogenophilales Familia I: Hydrogenophilaceae Género II: Thiobacillus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: β-proteobacteria Orden VI: Rhodocyclales Familia I: Rhodocyclaceae Género II: Azoarcus Género IX: Thaurea

Las reacciones que se llevan a cabo en la desnitrificación son por vía enzimática de las bacterias desnitrificantes (Sunil et al., 2010). Estas son: 1

2

3

4

NO3- → NO2- → [NO] → N2O → N2 1. 2. 3. 4.

Enzima nitrato reductasa Enzima nitrito reductasa Enzima oxido nitrico reductasa Enzima oxido nitroso reductasa

La reacción de reducción del nitrato a nitrógeno gas, utilizando metanol como fuente de carbono puede representarse de la siguiente manera (Ferrer, 2007): Primera fase: 6NO3- + 2CH3OH → 6NO2- + 2CO2 + 4H2O Segunda fase: 6NO2-+ 3CH3OH → 3N2 + 3CO2 + 3H2O + 6OH-

1.3.5 Bacterias acidogénicas/acetogénicas Las bacterias acidogénicas o fermentativas producen ácidos grasos volátiles, lactato, etanol, formato, hidrógeno y bióxido de carbono (Ramírez, 1992). En el caso de la celulosa se pueden representar en tres niveles (Guyot, 1988):

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Primer nivel: bacterias primarias. Son las que hidrolizan la celulosa a celobiosa, glucosa, etanol, lactato, acetato, hidrógeno y bióxido de carbono. Segundo nivel: bacterias secundarias. Son las que hidrolizan celobiosa + glucosa a etanol, lactato, hidrógeno y bióxido de carbono, Tercer nivel: bacterias auxiliares. Son las que transforman el etanol o el lactato a acetato, hidrógeno y bióxido de carbono. Además de las bacterias celulolíticas existen bacterias proteolíticas y lipolíticas (Ramirez, 1992). Dentro de las especies celulolíticas anaerobias más numerosas se encuentran el género Clostridium (tabla 1). La población bacteriana fermentativa varía mucho con el sustrato, en la tabla 2 se muestran diversas bacterias y sus productos. Las bacterias acetogénicas son a menudo llamadas bacterias homoacetogénicas. Estos son organismos estrictamente anaerobios (Brauman et al., 1992), que utilizan la vía del acetil-CoA para reducir las emisiones de CO2, y tienen como acetato su producto principal de la respiración (Wood y Ljunadahl 1991; Drake 1994). La mayoría de las bacterias acetogénicas se han aislado de hábitats anaerobios estrictos, tales como, en sedimentos marinos o de estuarios, estanques de agua dulce o los lodos de depuradoras anóxicas (Drake 1994; Schink 1994). Filogenéticamente las bacterias acetogénicas no forma una unidad distinta, pero están incluidas dentro del gran grupo filogenético de las Clostridios Gram-positivas (Tanner y Woese 1994). Las bacterias acetogénicas son muy particulares, ya que solamente pueden crecer en presencia de otras bacterias anaerobias estrictas consumidoras de hidrógeno, como las metanogénicas hidrogenotrofas o algunas sulfato-reductoras en presencia de sulfato. El descubrimiento de estas bacterias puso en evidencia el proceso de transferencia de interespecies de hidrogeno. En la tabla 3 se muestra algunas bacterias acetogénicas y las reacciones que llevan a cabo.

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Tabla 1. Bacterias acidogénicas hidrolíticas de la digestión Anaerobia (García, 1983)

Especie Acetivibrio cellulolyticus Bacteroides succinogenes Butyrivibrio fibrisolvens Cillobacterium cellulosolvens Ruminococcus Albus Ruminococcus flavifaciens

Sustrato Celulosa

Bacteroides ruminicola Butyrivibrio fibrisolvens

Hemicelulosas

Bacillus spp. Bacteroides spp. Clostridium butyricum Clostridium spp. Lactobacillus spp. Micrococcus spp. Pseudomonas spp.

Almidón

Clostridium butyricum

Pectinas

Anaerovibrio lipolytica Bacillus spp.

Lípidos

Clostridium acidi urici Clostridium cylindrosporum Micrococcus aerogenes Micrococcus lactilycus

Compuestos nitrogenados

Bacillus spp. Clostridium spp. Bifidobacterium spp. Peptococcus anaerobus Staphylococcus spp.

Proteínas

Termofílicas Clostridium thermocellum

Celulosa

Clostridium thermohydrosulfuricum

Almidón y Pectinas

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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia Tabla 2. Bacterias acidogénicas fermentativas de la digestión anaerobia (García, 1983)

Especie

Metabolitos

Acetobacterium woodii Clostridium aceticum Clostridium formiaceticum

Acetato

Butyribacterium methylotrophicum Eubacterium sp. Acidaminococcus sp.

Acetato, Butirato

Clostridium sp.

Acetato, Butirato, Etanol

Propionibacterium sp. Anaerovibrio sp. Veillonella sp.

Acetato, Propionato

Lactobacillus sp.

Acetato, Etanol, Lactato

Bifidobacterium sp.

Acetato, Lactato

Ruminococcus sp.

Acetato, Lactato, Formato

Leptotrichia sp. Streptococcus sp.

Lactato

Succinivibrio sp.

Succinato

Butyrivibrio sp. Fusobacterium sp.

Butirato

Megasphaera

Butirato, Isobutirato, Valerato, Isovalerato, Caproato

Termofílicas Clostridium thermo-aceticum Acetogenium kivui

Acetato

Thermo-anaerobium brockii

Lactato, Acetato, Etanol

Thermo-bacteroides acetoethilicus

Etanol, Acetato, Butirato, Isobutirato

Thermo-anaerobacter ethanolicus

Etanol, Acetato, Lactato, Isobutirato, Isovalerato Etanol, Acetato, Lactato, Butirato, Formato

Clostridium thermo-saccharolyticum

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Tabla 3. Bacterias acetogénicas sintróficas obligatorias de la digestión anaerobia (García, 1991)

Bacterias

Reacción

Organismos “S” (Pelobacter sp.)

Etanol+H2O→acetato+H2O

Syntrophobacter wolinii

Propionato+3 H2O→acetato+3 H2O+CO2

Syntrophomonas bryantii sapovorans wolfei sub. sp. saponavida wolfei sub. sp. Wolfei Syntrophospora bryantii

Butirato+2 H2O→2 acetato+2 H2O

Syntrophus buswellii

Benzoato+7 H2O→3 acetato+3 H2O+CO2

Existen otras bacterias fermentativas (tabla 4) cuyas características son (Eichler y Schink, 1984): a). tres moles de acetato deben de ser formados a partir de la glucosa y fructosa. b). no hay hidrógeno molecular producido. c). el bióxico de carbono es necesario para el crecimiento. d). el bióxico de carbono es incorporado al acetato dependiendo del sustrato utilizado.

Estas bacterias se dividen en dos grupos, en la tabla 4 se divide los dos grupos de acuerdo a la reacción para la formación del acetato.

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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia Tabla 4. Bacterias homoacetogénicas de la digestión anaerobia (García, 1991)

Grupo 1: H+ (reducción de un compuesto carbonado) + CO2 → acetato Género Especie Butyribacterium

rettgeri

Clostridium

acidiurici cylindrospermum formicoaceticum magnum thermoaceticum

Peptococcus

glycinophilus

Grupo 2: H2 + CO2 → acetato Género

Especie

Acetoanaerobium

noterae

Acetobacterium

carbinolicum malicum termitida wieringae Woody

Acetofilamentum

rigidum

Acetohalobium

arabaticum

Acetothermus

paucivorans

Acetitomaculum

ruminis

Clostridium

aceticum ljungdahlii mayombii thermoautotrophicum

Eubacterium

limosum

Sporomusa

acidovorans malonica ovata paucivorans sphaeroides termitida

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1.3.6 Bacterias metanotrófas Las bacterias oxidantes de metano (metanotrófos) son un único grupo de bacterias metilotróficas que utilizan el metano y compuestos pequeños de carbono como su fuente de energía (Murrell, 1994; Hanson and Hanson, 1996). Tras el análisis de 16s rADN se definió las relaciones filogenéticas y ocho géneros de organismos metanotrofos: Methylococcus, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylobacter, Methylocaldum, Methylosphaera, Methylocystic y Methylosinus. Estos géneros se dividen en dos distintos grupos filogenéticos. Tipo I (Methylomonas, Methylomicrobium, Methylobacter, Methylocaldum, Methylosphaera), este grupo capaz de asimilar el formaldehído producido a partir de la oxidación del metano a través del metanol, y Tipo II (Methylocystis y Methylosinus), utilizan el grupo de la serina para la asimilación del formaldehído (Hanson and Hanson, 1996; Bourne et al., 2000). Los miembros del género Methylococcus poseen una combinación de características tanto del Tipo I como del Tipo II metanotrofos. El Tipo I (incluyendo Methylococcus) se encuentra en la subdivisión de γproteobacteria de la clase proteobacteria, mientras que el grupo II se encuentra en a subdivisión α-proteobacteria (Tsien et al., 1990; Brusseau et al. 1994; Bourne et al., 2000). Existen pocos estudios utilizando FISH para la detección específica de las metanotroficas. Recientemente se ha aplicado la técnica FISH para determinar la abundancia de diferentes grupos filogenéticos de metanotrofos en una turba de Sphagnum al oeste de Siberia (Dedysh et al., 2001). El conjunto de sondas metanotroficas incluyo sondas especificas para el Tipo I MOB (Methane Oxidising Bacteria) (sonda M-84 y M-705) o para el grupo de Tipo II MOB Methylosinus/Methylocystis (sondas Ma-464 MA-221 y M-450), así como las sondas (Mcell_1026 y Mcell-181) para el methanotroph acidófilas palustris Methylocella (Dedysh et al., 2000; Dedysh et al., 2003). Hasta hace poco, las secuencias de genes de 16s rRNA de Tipo II MOB eran muy poco representadas en la base de datos del dominio público. Esto hizo imposible formular sondas permitiendo la diferenciación entre Methylocystis spp. y especies de Methylosinus (Dedysh et al., 2003). Incluso una publicación reciente ha trabajado con sondas de oligonucleótidos 16s rRNA dirigidas a un solo grupo (Gulledge et al., 2001). La base de datos de las secuencias de 16s RADN del Tipo II MOB fue descrita en un estudio en el 2002 (Heyer et al., 2002). La reacción que se lleva a cabo por las bacterias metanotrofas es (Modin et al., 2007): CH4 + 1.02 O2 + 0.786 NO3- + 0.786 H+ → 0.393 N2 + 2.39 H2O + CO2 Las taxonomías de los distintos géneros de las bacterias metanotroficas según el manual Bergey’s (Garrity, et al., 2001) son:

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Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase I: α-proteobacteria Orden VI: Rhizobiales Familia V: Methylocystaceae Género I: Methylocystis Gérero III: Methylosinus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase III: γ-proteobacteria Orden VII: Methylococcales Familia I: Methylococcaceae Género I: Methylococcus Género II: Methylobacter Género III: Methylocaldum Género IV: Methylomicrobium Género V: Methylomonas Género VI: Methylosphaera 1.3.7 Bacterias sulfato-reductoras (SRB) Llevan a cabo el ciclo del sulfuro, son importante reguladores de una variedad de procesos esenciales como: descomposición de materia orgánica, biodegradación de contaminantes cloro-aromáticos, metilación del mercurio (Fauque, 1995; Barton, 1995) y remediación ambiental en diversos ambientes. La reducción desasimilatoria del sulfato es un proceso clave en los ciclos biogeoquímicos del azufre, del carbono y del hierro, oxidándose la materia orgánica de forma anaerobia (Pallud & Van Cappellen, 2006). Los sustratos a partir de los cuáles las bacterias sulfato reductoras obtienen energía directamente van desde el hidrógeno hasta compuestos aromáticos, aunque la mayoría utiliza sustratos tales como acetato, lactato, piruvato y etanol, que son compuestos comunes en los ecosistemas (Pallud & Van Cappellen, 2006). Las bacterias sulfato-reductoras que se conocen están divididas entre oxidadores completos y en oxidadores incompletos. Las bacterias que se conocen como oxidadores incompletos, tales como los Desulfovibrionales y la familia Desulfobulbeceae y aquellas conocidas como oxidadores completos, principalemente representados por la familia Desulfobacteraceae pueden vivir en ambientes extremos halófilos, esto indica que existen SRB halofílicas tolerantes a las sales, las cuales posiblemente poseen nuevas vías metabólicas, siendo capaces de degradar anaeróbicamente compuestos complejos tales como la celulosa (Foti et al., 2007). Las SRB también son importantes miembros de la comunidad microbiana involucrada en la reducción de metales que ocurre en una variedad de ambientes incluyendo plantas productoras de aceites y gas, aguas de desecho de origen doméstico, industrial y de minas (Singleton, 1993).

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El sulfato es utilizado como un aceptor terminal de electrones, pero la mayoría de las SRB también son capaces de crecer sobre una amplia variedad de otros aceptores de electrones, tales como tiosulfato, sulfito, azufre elemental y nitrato (Bak et al., 1991). Entre los dadores de electrones simples tenemos al etanol, lactato e hidrógeno hasta compuestos más complejos como los hidrocarburos (Jorgensen, 1982; Rabus et al., 1996; Krekeler et al., 1998; Krumholz et al., 1999; Steger et al., 2002; Kaksonen et al., 2004). Se conocía la imposibilidad de las SRB de utilizar carbohidratos, sin embargo, se han encontrado cepas de Desulfovibrio capaces de utilizar poliglucosa y nitrocelulosa como fuente de carbono (Petrova et al., 2002). Además son capaces de oxidar acetato a CO2 y reducir el sulfato a sulfuro (Krumholz et al., 1999) mediante el ciclo modificado de ácidos tri-carboxílicos y vía acetil-CoA, siendo este ultimo el más empleado por las SRB (Krumholz et al., 1999). También se sabe que muchas cepas SRB pueden fijar N2 y usar el nitrógeno de los aminoácidos como fuente de nitrógeno, algunas Desulfovibrio son capaces de utilizar nitrato como aceptor final de electrones, otras reducen el nitrato a amonio (Lie et al., 1999). Adicionalmente las SRB pueden tolerar una variedad de metales pesados y sulfuro disuelto, algunos de estos organismos son capaces de reducir Fe +3 a magnetita (Fe3O4) o siderita (FeCO2) y U+4 a uranito (UO2), aunque no generen energía a partir de estos procesos (Lovley et al., 1992; Chang et, al., 2001). Los dadores de electrones utilizados por las SRB son principalmente compuestos de bajo peso molecular y a la mayoría de estos son conocidos como productos fermentativos de la degradación bacteriana de carbohidratos, proteínas y otros compuestos de detritos. Unas pocas SRB son capaces de degradar complejos moleculares como compuestos aromáticos (Widdel, 1988), siendo los dadores de electrones más importantes el H2, acetato, lactato, butirato y propionato (Sorensen et al., 1981; Postgate, 1984; Hao et al., 1996; Fukui et al, 1999). Algunas de las reacciones más importantes que llevan a cabo las bacterias sulfatoreductoras (Ruel et al. 2002) son: C2H4O2 + SO42- → S2- + 2H2O + 2CO2 Ac. Acético C3H6O2 + 3/4 SO42- → 3/4 S2- + C2H2O2 + H2O + CO2 Ac. Propiónico C4H8O2 + 3/2 SO42- → 3/2 S2- + C2H2O2 + 2 H2O + 2 CO2 Ac. Butírico

Clasificación filogenética y taxonomía Según los análisis de secuencias de RNAr permitió realizar la clasificación de varias especies de SRB (Castro et al., 2000).

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SRB gram-negativas mesofilicas.- Desulfobulbus, Desulfomicrobium, Desulfomonas, Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfomonile, Desulfonema, Desulfosarcina. SRB gram-positivas formadoras de esporas.- Desulfotomaculum SRB termofilicas.- Thermodesulfobacterium SRB arqueas termofilicas.- Archaeoglobus Todos estos grupos se caracterizan por que utilizan el sulfato como aceptor de electrones durante la respiración anaerobia con la consecuente producción de sulfuro de hidrógeno H2S. Daly et al., 2000, clasificó a las SRB más conocidas y representativas, restringiéndose a géneros mesofílicos dentro de la subdivisión delta-proteobacteria y gram (-/+), agrupándolos en seis grupos filogenéticos distintos: Grupo 1. Desulfotomaculum (DFM). Grupo 2. Desulfobulbus (DBB). Grupo 3. Desulfobacterium (DBM). Grupo 4. Desulfobacter (DSB). Grupo 5. Desulfococcus, Desulfonema, Desulfosarcina (DCC). Grupo 6. Desulfovibrio, Desulfomicrobium (DSV). Grupo 1. Desulfotomaculum (DFM): son bacilos rectos o curvados, móviles por la presencia de flagelos perítricos o polares, con pared celular, mesófilas, son las únicas SRB gram-positivas de bajo contenido GC, no contienen desulfoviridina, además forman esporas volviéndose de este modo resistentes a condiciones adversas (desecación y oxidación del medio ambiente) y le permite subsistir en una gran variedad de medios (Londry et al, 1997; Castro et al., 2000). Son capaces de utilizar hidrógeno como fuente de energía, que les otorga un carácter quimiolitótrofo (Imachi et al., 2000). Este genero tiene además la capacidad de realizar la dismutación de tiosulfato (Jackson y Mclnermey, 2000). Grupo 2. Desulfobulbus (DBB): ese grupo esta estrechamente relacionado con los géneros Desulfocapsa, Desulforhopalus y Desulfofutis dentro de la familia Desulfobacteriaceae. Este grupo presenta tres especies Desulfobulbus elongatus, Desulfobulbus Marinus y Desulfobulbus propionicus, se caracteriza por ser células ovoides, no forman esporas, no contiene desulfoviridina, presentan un flagelo polar único, algunas especies presentan motilidad y otras no, tiene una posición dentro de la subclase delta de las proteobacterias. A diferencia del grupo 1 de las Desulfotomaculum, las Desulfobulbus es mesofilica de gram-negativo al igual que los demás grupos de SRB (Balows et al., 1992), por lo que se desarrollan entre 20 a 40 ºC. Utilizan propionato como donador de electrones oxidándolo de manera incompleta hasta acetato, además son capaces de subsistir con lactato, etanol, H2, acetato, formato y bicarbonato (Benoit et al., 2001; Ito et al., 2002), utilizando alguno de estos compuestos incluso en ausencia de sulfato (Balows et al., 1992). También se ha visto que este grupo puede utilizar nitrato (Ito et al., 2002) como aceptor final de electrones por lo que es capaz de competir con las bacterias nitrificantes. Además, utilizan oxígeno adquiriendo un carácter aerotolerante y probablemente facultativo (Ito et al., 2002), además el efecto del oxigeno durante la formación de microcapas, produce etapas de latencia que preceden una composición predominante de Desulfobulbus y Desulfovibrio, lo explica su presencia en diversos ambientes debido a su adaptabilidad a la química de su entorno 21

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(Santegoeds et al., 1999). Este grupo puede realizar la dismutación de azufre, sulfuro, sulfito y tiosulfato (Finster et al., 1998), con azufre elemental como compuesto intermediario. Por otra parte se ha reportado que Desulfobulbus propionicus realiza la mutilación del mercurio en cultivos puros (Widdel y Bak 1991; Benoit et al., 2001). Grupo 3. Desulfobacterium (DBM): este es un grupo nutricionalmente versátil, con formas semejantes a bastoncillos de forma oval o casi esférica, presenta capacidades especiales en cuanto a degradación de compuestos orgánicos, como la descomposición de hidrocarburos. Las especies de este género son fundamentalmente marinas y requieren elevadas concentraciones de cloruro de sodio. Al igual que Desulfobacter, Desulfobacterium es potencialmente importante para la metilación del mercurio y no tolera condiciones aerobias (Widdel y Bak, 1991; King et al., 2000). Grupo 4. Desulfobacter (DSB): una de las características más sobresalientes de este grupo es su capacidad de oxidar de manera completa y efectiva al acetato debido a que poseen toda la maquinaria funcional para realizar el ciclo del ácido cítrico (Balows et al., 1994). Además se ha visto la versatilidad de este grupo de utilizar gran variedad de substratos. Son bacterias ovoides o semiesféricas parecidas a las Desulfovibrio, normalmente motiles y se desplazan mediante un flagelo polar único, mesófilicas, no producen esporas y no tienen desulfoviridina. Además se ha identificado al género Desulfobacter com uno de los principales metiladores de mercurio en medios que contienen lactato y acetato (Widdel y Bak 1991; King et al., 2000). Grupo 5. Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina (DCC): los tres géneros de este grupo son estructuralmente diferentes, Desulfococcus y Desulfosarcina se agrupa en células coloides virtualmente inmóviles y Desulfonema es el único genero de SRB multicelular filamentosa motil por deslizamiento. Sin embargo, el análisis mediante 16S de RNA relaciona a este grupo de manera estrecha con la familia Desulfobacteriaceae en el orden Desulfobacterales que comparte con los géneros Desulfobacterium, Desulfobacter, y de manera mas distante con Desulfobulbus. Morfológicamente presentan formas de bastoncillos ovalados. La característica metabólica de este grupo implica oxidación completa de substratos (Castro et al., 2000) tales como formiato, acetato, acetona, propionato, butirato, isobutirato, valerato, metilbutirato, caproato, malato, piruvato, succinato, fumarato, malato benzoato, etanol, propanol, butanos, hidrógeno y CO2 (Fukui et al., 1999). Algunas cepas han sido aisladas de medios contaminados por hidrocarburos. Desulfococcus ha sido aislado de sedimentos de aguas dulces y también se desarrolla en medios salinos; mientras que la desulfosarcina es primordialmente en medio marino. Este grupo ha sido detectado en la quimioclina, entre ambientes aerobio y anaerobio, por lo que podría tener la capacidad de tolerar el oxígeno (Widdel y Bak, 1991). Desulfococcus es uno de los géneros más importantes en cuanto a la metilación del mercurio, tercero después de Desulfomicrobium y Desulfobacter (Widdel y Bak, 1991; King et al 2000). Grupo 6. Desulfovibrio-Desulfomicrobium: la familia Desulfovibrionaceae incluye a los géneros Desulfovibrio y Desulfomicrobium, aunque otros dos géneros podrían ser incorporados dentro de la misma (Desulfohalobium y Desulfonatronum). Morfológicamente son en general vidrioides, espiralados u ovoides, no forman esporas contienen desulfoviridina, son motiles (Castro et al., 2000). Siendo la característica más

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sobresaliente su capacidad de adaptarse a diversos hábitats gracias a sus intrincadas estrategias metabólicas que les permite subsistir. Metabolitamente se diferencia de la familia Desulfobacteriaceae por realizar la oxidación incompleta de los substratos con la formación final de acetato durante la fermentación (Voordouw et al., 1995). Una de sus características más importantes es su capacidad para tolerar oxígeno y en algunos casos, incluso consumirlo (Zinkevich y Beech 2000; Loubinoux et al., 2002; Fournier et al., 2006), son capaces de subsistir bajo estrés oxidante en presencia de incluso 20 uM de O2 (la mayoría no sobrevive por encima de 0.24 a 0.48 uM) en el torrente sanguíneo humano (Schoenborn et al. 2001). El género se encuentra desde ambientes salinos, donde han sido más estudiados hasta los sedimentos de agua dulce y son selectivamente aislados en medios que contienen H2 y CO2, piruvato, malato, lactato y fumarato (Widdel y Bak 1991; Voordouw 1995; Luca et al 2001; Steger et al., 2002; Foti et al., 2007). El género Desulfomicrobium en cuanto a sus características fisiológicas y nutricionales es muy similar a Desulfovibrio, tiene forma de bastoncillo y carece de desulfoviridina. Según el manual Bergey’s la taxonomía de algunas sulfato reductoras queda de la siguiente manera (Garrity et al., 2001): Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria Clase VI: δ-proteobacteria Orden II: Desulfovibrionales Familia I: Desulfovibrionaceae Género I: Desulfovibrior Familia II: Desulfomicrobiaceae Género I: Desulfomicrobium Familia III: Desulfohalobiaceae Género II: Desulfomonas Orden III: Desulfobacterales Familia I: Desulfobacteraceae Género I: Desulfobacter Género II: Desulfobacterium Género III: Desulfobacula Género V: Desulfococcus Género VI: Desulfofaba Género VII: Desulfofrigus Género VIII: Desulfonema Género IX: Desulfosarcina Familia II: Desulfobulbaceae Género I: Delsulfobulbus Género II: Desulfocapsa Género III: Desulfofustis Género IV: Desulforhopalus Orden IV: Desulfuromonadales Familia I: Desulforomonadaceae Género I: Desulfomonas 23

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1.3.8 Organismos metanogénicos La característica común de los organismos metanogénicos y de otros organismos litotrófos, es el uso de hidrógeno como fuente de energía, y el dióxido de carbono como aceptor de electrones. Este modo de generación de energía se ajusta a los definidos como quimiolitótrofos. Los organismos metanogénicos juegan un papel muy importante en el circuito degradativo del ciclo del carbono. Estos utilizan como sustrato para generar metano, el producto de degradación de las bacterias formadoras de ácidos. (Catalán, 1997). El proceso que comprende la formación del metano a partir de acético y a partir de hidrógeno se le llama metanogénesis. La metanogénesis es la única vía por las cuales los organismos metanogénicos pueden obtener energía para su crecimiento y estos son los únicos productores de metano como un producto catabólico final. Estas bacterias solo pueden utilizar el acetato, H2, CO2, y/u otras fuentes de carbono como sustratos de energía (Salazar 2008). La clasificación taxonómica de las metanógenos se ha realizado mediante varios métodos, entre los que se incluye el estudio de su morfología, motilidad, imágenes por microscopia electrónica, morfología de la colonia, características nutricionales, tasa y condiciones de crecimiento, productos metabólicos finales, tinción Gram, susceptibilidad a lisis, análisis de lípidos, distribución de poliaminas, hibridación de ácidos nucleicos, secuenciación del 16s rRNA entre otros estudios (Boone y Whitman, 1988). En 1977 (Woese, et al., 1997) clasificó a los metanogénicos como del domino Archaea. Originalmente, sólo se clasificaron los metanógenos en este nuevo dominio, y las arqueas eran consideradas extremófilos que sólo vivían en hábitats como aguas termales y lagos salados. Se han definido 5 órdenes, 10 familias, 26 géneros y 74 especies validas (Boone et al., 1993; Salazar 2008). 

Orden Methanobacteriales

Incluyen a dos familias, la familia Methanobacteriaceae y la familia Metanothermaceae. La familia Methanobacteriaceae tiene cuatro géneros morfológicamente distintos. Estos incluyen especies recuperadas de una variedad de hábitats (agua dulces, rumen bovino, madera, intestino de termitas, etc.), las cuales son capaces de utilizar sustratos como H2/CO2, 2-propanol, formato y metanol para producir CH4. La familia Metanothermaceae consiste de un único género termófilo extremo hidrógenotrofo. 

Orden Methanococcales

Incluye a dos familias, Methanociccaceae y Methanocaldococcaceae, cada familia con dos géneros, los cuatro géneros son hidrógenotrofos principalmente de ambientes marinos y costeros. La mayoría de las especies son capaces de utilizar H2 y formato como donadores de electrones.

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

Orden Methanomicrobiales

Comprende a tres familias y nueve géneros de matanogénicas hidrógenotrofas. La familia Methanomicrobiaceae incluye a especies aisladas de varios ambientes. La familia Methanocorpusculaceae incluye a tres géneros que utilizan H2/CO2 y formato como sustrato. La famila Methanospirillaceae es una familia nueva con un único género, sus miembros se han reportado en varios hábitats y son capaces de utilizar diferentes donadores de electrones para la metanogénesis del CO2. 

Orden Methanosarcinales

Boone (Boone et al., 1993) propuso reagrupar a todos las metanogénicas acetotroficas y/o metilotroficas dentro de dos familias en este orden. La familia Methanosarcinaceae que incluye a seis géneros de matanógenicas muy versátiles aisladas de varios hábitats y que son capaces de utilizar H2/CO2, acetato o compuestos metil como sustratos. La familia Methanosaetaceae incluye a un único género de metanógena acetotrofica obligada. 

Orden Methanopyrales

Es un nuevo arden de matanogenicas hipertermofilicas, las cuales no están relacionadas con todas las otras metanogénicas conocidas. El orden incluye una única Methanopyraceae y una especie Methanopyrus kandleri. Se ha determinado la secuencia del DNA del genoma total Methanococcus jannaschii (Bult et al., 1996) y Methanobacterium thermoautotrophicum (Smith et al., 1997). Recientemente, la secuencia del DNA para archaeoglobul fulgidus también ha sido publicado (Klenk et al 1997). Esta arquea sulfato-reductora filogenéticamente esta estrechamente relacionada con el género Methanosarcinales, con quien comparte muchas características bioquímicas en común. Basándonos en el manual Bergey’s (Garrity, et al., 2001), tenemos la siguiente taxonomía de los organismos metanógenos: Dominio: Archaea Phylum AII: Euryarchaeota phy. nov. Clase I: Methanobacteria class. nov. Orden I: Methanobacteriales Familia I: Methanobacteriaceae Género I: Methanobacterium Género II: Methanobrevibacter Género III: Methanosphaera Género IV: Methanothermobacter Familia II: Methanothermaceae Género I: Methanothermus Clase II: Methanococci class. nov.

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Orden I: Methanococcales Familia I: Methanococcaceae Género I: Methanococcus Género II: Methanothermococcus Familia II: Methanocaldococcaceae Género I: Methanocaldococcus Género II: Methanotorris Orden II: Methanomicrobiales Familia I: Methanomicrobiaceae Género I: Methanomicrobium Género II: Methanoculleus Género III: Methanofollis Género IV: Methanogenium Género V: Methanolacinia Género VI: Methanoplanus Familia II: Methanocorpusculaceae Género I: Methanocorpusculum Familia II: Methanospirillaceae Género I: Methanospirillum Orden III: Methanosarciales Familia I: Methanosarcinaceae Género I: Methanosarcina Género II: Methanococcoides Género III: Methanohalobium Género IV: Methanohalophilus Género V: Methanolobus Género VI: Methanomicrococcus Género VII: Methanosalsum Familia I: Methanosaetaceae Género I: Methanosaeta Clase VII: Methanopyri class. nov. Orden I: Methanopyrales Familia I: Methanopyraceae Género I: Methanopyrus

Las archaes metanogénicas fueron el primer grupo microbiano en tener su taxonomía basada en la filogenia deducida por la secuencia de 16s rRNA (Balch et al. 1979; Raskin et al. 1994). La distribución limitada filogenética de las metanogénicas sugirió que una base de datos de secuencia de rRNA podría ser la base para el diseño de sondas que abarquen la mayoría de los miembros del grupo. Para esto se desarrolló y caracterizó una colección de sondas metanogénicas (figura 3). Entre las bacterias metanogénicas podemos distinguir 3 principales grupos nutricionales (tabla 5):

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1. Archaeas metanogénicas hidrogenotrofas: Estas archaeas utilizan como sustrato el hidrógeno más bióxido de carbono y algunas el formato. 2. Archaeas metanogénicas acetoclásticas: Estas archaeas utilizan el acetato como sustrato y según las especies hidrógeno más bióxido de carbono y metilaminas. 3. Archaeas metanogénicas metilotrofas: estas utilizan como sustrato metanol, metilaminas y metildisulfuros. En las especies descritas hay 67% de hidrogenotrofas, 13% de acetoclásticas, 27% de metilotrofas obligadas y el 3% son hidrógeno.metilotrofas y usan el hidrógeno para reducir el metanol a metano. Algunas especies son alcoholotrofas y producen metano en presencia de ciertos alcoholes como donadores de hidrógeno. El monóxido de carbono puede también ser convertido en metano, pero no constituye un sustrato importante en la metanogénesis.

Figura 3. Clasificación de las Sondas metanogénicas en relación con las bacterias metanogénicas que detectan (Crocceti et al., 2006).

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Tabla 5. Grupos nutricionales de las bacterias metanogénicas (García, 1991)

1. Hidrogenotróficas H2 + CO2 + formato según especies → CH4 Methanobacterium Methanothermus Methanococcus Methanolacinia Methanogenium Methanospirillum Methanoplasma Methanobrevibacter Methanopyrus Methanomicrobium Methanoculleus Methanocorpusculum Methanoplanus 2. Acetoclásticas Acetato + según especies H2 + CO2 + Formato, Metanol y Metilaminas → CH4 Methanosarcina Methanosaeta Methanothix 3. Metilotroficas Metanol + Metilaminas → CH4 Methanolobus Methanohalophilus Methanohalobium Methanococcoides Methanohalococcus Methanobacterium Methanogenium Methanospirillum Methanocorpusculum 4. Hidrogeno-metilotroficas H2 + Metanol → CH4 Methanosphaera 5. Alcoholotróficas CO2+ alcohol (2-propanol, 2-butanol, etanol) Methanobacterium Methanogenium Methanospirillum Methanocorpusculum

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1.4

Técnica molecular para la determinación de las poblaciones microbianas. Hibridación molecular fluorescente in situ (FISH)

En la actualidad se hace uso de técnicas de biología molecular que permiten estudiar la diversidad taxonómica y la estructura de comunidades microbianas, ya que brindan la posibilidad de identificar poblaciones microbianas especificas en su hábitat natural (sin necesidad de cultivarlas) generando resultados confiables y rápidos (Cárdenas et al, 2006). La hibridación molecular es una de las técnicas que permite la detección del rRNA 16s empleando sondas marcadas con fluorocromos. Las células de muchos microorganismos son muy ricas en RNA. En las bacterias constituye el 20-25 % del peso seco. El RNA predominante es el ribosómico (rRNA) que se presenta en varias especies moleculares (23s, 16s y 5s) que constituye el 80% del RNA total (Parés Ramón/ Juárez Antonio). La presencia del 16S rRNA en grandes cantidades en procariotas (Amman, R. I. et al., 1995), permitió desarrollar sondas específicas para la secuencia 16S rRNA permitiendo el procesamiento de un gran número de muestras requeridas para el estudio ecológico, al mismo tiempo que posibilitó la detección directa de microorganismos concretos en las muestras (Salazar 2008). La hibridación permitió mejorar las estimaciones de la abundancia microbiana, mostrando una estratificación de los diferentes grupos filogenéticos de las comunidades microbianas (Devereux et al., 1996; Ramsing et al., 1996). La hibridación molecular fluorescente in situ (FISH) consiste en la detección de una secuencia de nucleótidos dentro del genoma. Esta técnica utiliza fragmentos de DNA (sondas) marcadas con fluorocromos, basandose en la hibridación específica de dos secuencias de ácidos nucleicos complementarios entre la sonda marcada y la bacteria diana, formando un hibrido DNA: RNA fácilmente detectable mediante un microscopio de fluorescencia (Cárdenas et al 2006). La hibridación del 16S rRNA genera valiosa información acerca de la caracterización y abundancia de comunidades microbianas y en algunos casos acerca de la actividad bacteriana. La fluorescencia se produce mediante el uso de los fluorocromos que son sustancias que tienen la propiedad de absorber energía de una longitud de onda específica y volverla a emitir con una determinada longitud de onda mayor (menor energía). La cantidad de energía emitida y su longitud de onda depende del propio fluorocromo. Los fluorocromos de última generación emiten señal fluorescente más intensa y son más foto estables (Roncero, 2009). En la figura 4, se muestra en que consiste generalmente la técnica de hibridación FISH.

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Figura 4. Esquema de la Hibridación Fluorescente in situ FISH. www.iqb.es

1.4.1

Fijación de la biomasa para la hibridación

La fijación debe realizarse inmediatamente después de coger la muestra procedente de la planta de tratamiento de aguas residuales, para evitar las lesiones que producirían cambios osmóticos y alteraciones estructurales y bioquímicos, fenómeno conocido como autolisis. La fijación de las células depende mucho de la estructura de su membrana celular, la cantidad y la clase de proteínas de una membrana celular especifica depende del ambiente en el que actúe la célula (Mc kee, et al., 2003). Las Células gram positivas tienen paredes celulares de capa gruesa de peptidoglucano, por el contrario de las células gram negativas que poseen una capa fina de peptidoglucano (Mc kee,et al., 2003)(Figura 5). Para explicar la estructura de la membrana celular en las bacterias y la diferencia entre gram positivas y gram negativas, se describirán cuatro moléculas importantes: la mureína, el lipopolisacárido, los ácidos teicoicos y los ácidos lipoteicoicos.

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Figura 5. Diferencia estructural celular entre las gram positivas y las gram negativas (Saenz 1998-2008).

La mureína es un peptidoglicano que se encuentra en todas las bacterias, con excepción de las arqueobacterias y los mollicutes (micoplasmas). Constituye la mayor parte de la pared celular y es responsable de la forma de la célula y de su integridad estructural, proporcionando rigidez a la misma. La mureína esta compuesta de restos de N-acetilglucosamina (NAG) y de ácido N-acetil murámico (NAM) (Figura 6), unidos alternativamente por enlaces β-1,4-glucosídicos. Hay un tetrapéptido unido al NAM que puede unirse a su vez con el tetrapéptido de una cadena adyacente (Parés, et el., 1997). La estructura del liposacárido (LPS) varía de una bacteria a otra, e incluso entre diferentes cepas, pero se presenta en todas las bacterias gram negativas. El lípido A es un disacárido de glucosamina fosforilado y esterificado con distintos ácidos (docecanoico, tetradecanoico, hexadecanoico y 3-hidroxitetradecanoico). El núcleo es un oligosacárido que comúnmente incluye L- glicero-d-manoheptosa y ácido cetodesoxi-octanoico. El lípido A y el núcleo corresponden al LPS de las distintas enterobacteriáceas (Parés, et al., 1997). Las gram positivas no tienen LPS, pero pueden presentar ácidos teicoicos asociados a la mureína. Se trata de polímeros del glicerol o del ribitol unidos por

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enlaces fosfodiéster y con uno o más aminoácidos como sustituyentes (Parés, et al., 1997). Tambien en las gram positivas se encuentran moléculas más complejas llamadas ácidos lipoteicoicos (LTA) y los lipoglucanos, los cuales tienen carácter macroanfifílico y están anclados en la membrana protoplamatica por interacción hidrofóbica con el resto acil-grasos (Parés, et al., 1997). Por las diferencias en las estructuras celulares de las bacterias, a la hora de fijar las bacterias gram negativas se puede hacer con paraformaldehído, con un período de tiempo menor que el necesario para fijar las bacterias gram positivas. Las bacterias gram positivas no solo necesitan de mayor tiempo para fijar, si no al ser hidrofóbicas es necesario fijarlas con etanol como se describe en el capitulo de materiales y métodos.

Figura 6. Representación esquemática de los peptidosglicanos (Saenz 1998-2008).

1.5

Sondas

Las sondas o cadenas de oligonucleótidos son segmentos cortos de DNA de cadena simple que contienen de 18 a 24 nucleótidos. Estas sondas solo hibridan con sus secuencias complementarias en condiciones estrictas de hibridación (Hernández, 2005). Mediante el análisis de las secuencias parciales del 16s rRNA, es posible encontrar patrones de secuencias específicos para grupos y especies de bacterias concretas. Para la identificación de los microorganismos a ese nivel, se han desarrollado pequeñas sondas específicas. La hibridación con sondas específicas permite la identificación rápida y directa de un gran número de microorganismos usando un extremo de acido nucleico como diana. El uso combinado de sondas universales y específicas permite estimar la fracción de determinados microorganismos dentro de un conjunto (Hernández, 2005).

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2

Objetivos

El desarrollo de este trabajo tiene como objetivo principal identificar y cuantificar las poblaciones microbianas presentes en los procesos biológicos (Fangos activados y Digestión anaerobia) de la EDAR del CARRAIXET. Los objetivos específicos que se pretenden alcanzar son:

1. Adaptación de la técnica molecular FISH a las muestras procedentes de la Digestión anaerobia. 2. Identificación de las poblaciones microbianas en ambos procesos: fangos activados y digestión anaerobia. 3. Cuantificación de los grupos de microorganismos en cada proceso estudiado. 4. Comparación de la población microbiana general entre ambos procesos.

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3 3.1

Materiales y Métodos

Procedencia de la muestra

Las muestras provienen de las instalaciones de la planta de tratamiento de aguas residuales urbanas de la Cuenca del Carraixet, ubicada en la Comunidad Valenciana con una capacidad de 100 000 habitantes-equivalentes. El caudal de funcionamiento de la planta de tratamiento es de 38.551 m3/dia, el rendimiento del tratamiento es del 98% de eliminación de los sólidos suspendidos, del 97% del DBO5 y el 94% de DQO. El tratamiento biológico que se realiza es de fangos activados, en la línea de fangos esta constituida por un espesador de gravedad y otro por flotación, que alimentan la entrada del fango al tanque de digestión anaerobia (figura 7).

Figura 7. Esquema de la EDAR del Carraixet.

3.2

Toma de muestra

La toma de muestra se realizó en el reactor aerobio y en el digestor anaerobio. La muestra de ambos procesos es del mismo día. Después de tomar la muestra, esta fue transportada para su posterior tratamiento (fijación de las células y aplicación de la técnica de hibridación fluorescente in situ FISH), a las instalaciones del laboratorio de química de la Universidad de Valencia.

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3.3

Hibridación Fluorescente in situ, FISH

Para hacer uso de la hibridación fluorescente in situ FISH con sondas marcadas con fluorocromos se debe preparar la muestra. Esto implica la fijación y permeabilización de la pared celular para inactivar las células microbianas y la actividad enzimática. La permeabilización de la células tiene como objetivo ayudar a la penetración de la sonda (Nielsen et al., 2009). Una vez fijada las células se aplica la técnica de hibridación FISH, lo que permite realizar un análisis cualitativo de la población microbiana presente en la muestra tratada. La hibridación se realiza mediante diferentes sondas (fragmentos de DNA), el uso de cada sonda depende de cada grupo de bacterias y permite identificar las bacterias presentes en la muestra. 3.4

Procedimiento La fijación celular se realiza de la siguiente manera:

Para las bacterias Gram negativas se realiza la fijación con Paraformaldehído (PFA al 4%). -

-

Añadir 3 volúmenes de PFA (750 µl) a 1 volumen de muestra (250 µl) y mantener a 4 ºC durante 1-3 horas Someter las células a centrifugación (5000 x g durante 3 minutos) y eliminar el paraformaldehído Lavar las células PBS 1X (fosfato búfer salino), centrifugar (5000 x g durante 3 minutos) y eliminar el sobrenadante Repetir el paso anterior si es necesario Resuspender las células en PBS 1X (añadir 500 µl) para tener una concentración de 108-109 células/ml en la muestra fijada y añadir 1 volumen (500 µl) de etanol absoluto frío (4ºC) Guardar a -20ºC

Para las bacterias Gram positivas se realiza la fijación con etanol absoluto frío. -

-

-

Añadir 1 volumen de etanol absoluto (500 µl) a 1 volumen de muestra ( 250 µl muestra + 250 µl de PBS, para mantener la misma concentración de células que las gram negativas) y mantener a 4 ºC durante 4-16 horas Centrifugar ( 5000 xg durante 3 minutos) y eliminar el fijador Lavar las células con PBS 1X (500 µl) dos veces Resuspender en PBS 1X (añadir 500 µl), para tener una concentración de 108-109 células/ml en la muestra fijada y añadir 1 volumen (500 µl) de etanol absoluto frío (4ºC) Guardar a -20ºC

Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón

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El tratamiento de los portaobjetos tiene como objetivo el poder mantener sobre el mismo la mayor cantidad de células posibles y por más tiempo, evitando la perdida de las células por los lavados posteriores a la visualización en el microscopio. El tratamiento se lleva a cabo de la siguiente manera: -

Lavar con agua y detergente neutro Enjuagar con agua destilada Secar en estufa a 46 ºC (es importante secar completamente) Cubrir con gelatina por inmersión en la solución de gelatina 0.1% con sulfato potásico cromato 0.01% (preparada en el momento, T= 60 ºC) Secar al aire (proteger del polvo ambiental)

Hibridación in situ FISH 1. Aplicación de la muestra en los portaobjetos cubiertos de teflón -

Poner un volumen de 5 µl de muestra fijada en cada pocillo del portaobjetos Secar al aire Deshidratar en etanol al 50% durante 3 minutos por inmersión Deshidratar en etanol al 80% durante 3 minutos por inmersión Deshidratar en etanol al 98% durante 3 minutos por inmersión Después del deshidratado se deja secar y los portaobjetos pueden ser conservados indefinidamente a -20ºC

2. Hibridación “in situ” Las reacciones de hibridación se hacen a concentraciones altas de sal y en presencia de agentes desnaturalizantes (formamida). La sal y el porcentaje de formamida hacen que la hibridación sea estable. Para ello se prepara la solución de hibridación: a). Preparar solución de hibridación (tubo eppendorf 2 ml) -

Añadir 360 µl de NaCl 5M Añadir 40 µl TrisHCl 1M Añadir formamida según tabla 6 Añadir agua MilliQ según tabla 6 Añadir 2 µl de SDS al 10% Mezclar cuidadosamente

37

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Tabla 6. Cantidades de Formamida y agua para la preparación de la solución de hibridación

Cantidad de formamida (µl) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200

% formamida para la sonda 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Cantidad de agua MilliQ (µl) 1598 1498 1398 1298 1198 1098 998 898 798 698 598 498 398

Una vez preparada la solución de hibridación se procede del siguiente modo: -

-

Poner 8 µl de la solución de hibridación en cada pocillo del portaobjeto que lleve muestra Poner 1 µl de la sonda a utilizar y repartir homogéneamente por todo el pocillo Introducir el portaobjetos con la solución de hibridación y las sondas a la camara de hibridación (tubo tipo falcon de 50 ml previamente preparado con papel de celulosa dentro). Una vez dentro el portaobjetos a hibridar el tubo se debe mantener siempre en posición horizontal Incubar a 46ºC durante 1-2 horas

Con el fin de eliminar los restos de sondas no hibridadas y la formamida de los portaobjetos se prepara una solución de lavado. b). Preparación de solución de lavado -

-

En un tubo tipo falcon de 50 ml añadir según tabla 7, las cantidades indicadas de NaCl 5M dependiendo del porcentaje de formamida utilizada en la solución de hibridación. Añadir 1 ml de TrisHCl Añadir EDTA si según tabla 7 se requiere Aproximar a 50 ml con aguan MilliQ Añadir 50 µl de SDS 10% Mezclar cuidadosamente

38

Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia Tabla 7. Cantidades de NaCl para la solución de lavado

% formamida de la sonda 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

NaCl (M)

NaCl 5M (µl)

EDTA 0.5 M (µl)

0.900 0.636 0.450 0.318 0.225 0.159 0.112 0.080 0.056 0.040 0.028 0.020 0.014

9000 6300 4500 3180 2150 1490 1020 700 460 300 180 99 41

--------500 500 500 500 500 500 500 500 500

Terminado el tiempo de incubación del portaobjetos donde están las células a hibridar se procede a: -

-

3.5

Sacar de la incubadora el portaobjetos. Con la ayuda de un cuentagotas y la solución de lavado previamente preparada eliminar la formamida que aun este en los pocillos, para eliminar las sondas no hibridadas introducir el portaobjetos dentro del tubo con la solución de lavado y mantenerlo en un baño de agua a 48 ºC durante 10- 15 min, protegido de la luz. Una vez concluido el tiempo de lavado, se saca el portaobjetos de la solución de lavado y se sumerge en un vaso con agua MilliQ fria durante 1 segundo Secar el portaobjetos a temperatura ambiente protegiéndolo de la luz Si no se observa inmediatamente en el microscopio, guardar a -20ºC

Sondas

Las sondas utilizadas en este trabajo, se han adquirido ya marcadas, a través de Thermo Scientific. En la tabla 5, se muestran las sondas generales usadas en este trabajo así como su referencia de uso.

39

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Tabla 8. Sondas Generales

Sonda

Secuencia

Organismo

Referencia

EUB 338

GCTGCCTCCCGTAGGAGT

Muchas bacterias

Amman, et al., 1990

EUB 338II

GCAGCCACCCGTAGGTGT

Planctomycetales

Daims, et al., 1999

EUB 338III

GCTGCCACCCGTAGGTGT

Verrucomicrobiales

Daims, et al., 1999

ARCH915

GTGCTCCCCCGCCAATTCCT

Archaeas

Stahl y Amman 1991

Para el uso de las sondas EUB 338, EUB 338II y la EUB 338III, se realizó una mezcla de ellas, la sonda EUB MIX, la mezcla tiene como fin cubrir el mayor número de bacterias posibles en la muestra. Las hibridaciones para la población general del flóculos se utilizó EUM MIX + ARCH915. En la tabla 9, 10, 11, 12, 13 y 14 se describen las sondas específicas de cada grupo de bacterias estudiadas en el presente trabajo.

Tabla 9. Sondas específicas para grupo Nitrificantes SONDA

SECUENCIA

BACTERIA

NSO 1225 LNA

TACGGATTTCAC TCCT

Betaproteobacterial ammonia.oxidizing bacteria

Ntspa712

CGCCTTCGCCACCGGCCTTCC

Muchos miembros de Nitrospirae

Ntspa712 compet

CGCCTTCGCCACCGGCCTTCC

%FA

REFERENCIA

45

Alonso, et al., 2009

50

Daims et al., 2001

40

Wagner et al., 1996

Nitrobacter spp. NIT3

CCTGTGCTCCATGCTCCG

NIT3 compet

CCTGTGCTCCATGCTCCG

Las sondas de la tabla 9 se usan con un alto porcentaje de formamida, lo cual son muy restrictivas en el momento de la hibridación. Mientras mas restrictivas son las hibridaciones es más confiable el resultado hibridado.

40

Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

Tabla 10. Sondas específicas para el grupo PAO y GAO SONDA

SECUENCIA

BACTERIA

%FA

REFERENCIA

35

Crocetti et al., 2000

PAO462

CCGTCATCTACWCAGGGTATTAAC

Candidatus Accumulibacter phosphstis

CCCTCT GCCAAACTCCAG

Candidatus Accumulibacter cluster

35

PAO651

Crocetti et al., 2000

GTTAGCTACGGCACTAAA AGG

Candidatus Accumulibacter phosphstis

35

PAO846

Crocetti et al., 2000

GAOQ431

TCCCCGCCT AAAGGGCTT

Candidatus "Competibacter phosphatis"

TTCCCCGGATGTCAAGGC

Candidatus "Competibacter phosphatis"

35

GAOQ989

Crocetti et al., 2002

CGATCCTCTAGCCCACT

grupo gammaproteoba cterial

35

GB

Kong 2002

TFO_DF218

GAAGCCTTTGCCCCTCAG

Defluviicoccus cluster 1

TFO_DF618

GCCTCACTTGTCTAACCG

Defluviicoccus cluster 1

2535

Wong et al., 2004

DF 988

GATACGACGCCCATGTCAAGGG

Defluvicoccus vanus cluster 2

35

Meyer et al., 2004

DF 1020

CCGGCCGAACCGACTCCC

Defluvicoccus vanus- cluster 2

35

2535

35

Crocetti et al., 2000

et

al.,

Wong et al., 2004

Meyer et al., 2004

35 H966 (DF 988 compet)

CTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGC

35 H1038 (DF 988 compet 2)

AGCAGCCATGCAGCACCTGTGTGG CGT

Las sondas de la tabla 10, tienen un porcentaje de trabajo muy similar, con lo que para facilitar su uso, se mezclan en grupos: La sonda PAOMIX, es una mezcla de las sondas: 1. PAO462 2. PAO651 3. PAO846

41

Mariela Beatriz Reyes Sosa

La sonda GAOMIX es una mezcla de las sondas: 1. GAOQ431 2. GAOQ989 3. GB Las sondas DEFMIX 1 es una mezcla de las sondas: 1. TFO_DF218 2. TFO_DF618 La sonda DEFMIX 2 es una mezcla de las sondas: 1. DF988 2. DF1020

Tabla 11. Sondas específicas para el grupo de las bacterias desnitrificantes SONDA

SECUENCIA

BACTERIA

%FA

Azoarcus-ThaueraCastellaniella

50

ACCTCTCTCGAACTCCAG

Paracoccus

40

ACTTCTGCCAGATTCCAC

Thiobacillus denitrificans

50

AT1458

GAATCTCACCGTGGTAAGCGC

PAR651

TBD1419

REFERENCIA

Rabus et al., 1999 Neef et al., 1996 Fernández et al., 2008

En la tabla 11 podemos observar que las tres sondas para la detección de las desnitrificantes de interes tienen un alto porcentaje de trabajo, esto nos da mayor confianza de hibridación.

Tabla 12. Sondas específicas para el grupo de las bacterias metanotroficas SONDA

SECUENCIA

BACTERIA

%FA

REFERENCIA

Ma464

TTATCCAGGTACCGTCATTA

Tipo II methanotrophs. Methylocystaceae

20

Eller et al., 2001

Mg84

CCACTCGTCAGCGCCCGA

Tipo I methanotrophs. Methylococcaceae

20

Eller et al., 2001

42

Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

Tabla 13. Sondas específicas para las SRB SONDA

DSV687

SECUENCIA

TACGGATTTCACTCC T

BACTERIA Desulfovibrio spp., Desulfomonas, Desulfuromonas, Desulfomicrobium Some Desulfobacteraceae (Desulfobacter, Desulfosarcina, Desulfocccus)

%FA

REFERENCIA

15

Devereux et al. 1992

10

Devereux et al. 1992

Dsb804

CAACGTTTACTGCGTGGA

DNMA657

TTCCGCTTCCCTCTCCCATA

some Desulfonema

30

Fukui et al. 1999

DBB660

GAATTCCACTTTCCCCTCTG

some Desulfobulbus

60

Devereux et al. 1992

10

Hristova et al. 2000

35

Amann et al. 1990

30

Rabus et al. 1996

Dtm230

TAATGGGACGCGGACCCA

SRB385

CGGCGTCGCTGCGTCAGG

SRB385Db

CGGCGTTGCTGCGTCAGG

Many Desulfotomaculum cluster I and other Firmicutes (G+) Most Desulfovibrionales and other Bacteria Desulfobacteracea (Desulfobacterales, Desulfuromonales, Syntrophobacterales, Myxococcales, and other Bacteria)

En la detección del grupo de las SRB, la bibliografia describen como sondas generales para este grupo en particular, las sondas SRB385 y SRB385Db, estas sondas se han usado junto con otras sondas para la detección de familias o especies de las SRB.

Para las hibridaciones de las Arqueas Metanogénicas se usarón sondas por ordenes de estas arqueas. En general estas sondas tienen porcentajes altos de formamida para la hibridación.

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Tabla 14. Sondas específicas para las arqueas metanogénicas SONDA

SECUENCIA

BACTERIA

%FA

REFERENCIA

MSMX860

GGCTCGCTTCACGGCTTCCCT

Methanosarcinales

45

Devereux et al., 1992.

MG1200b

CRGATAATTCGGGGCATGCTG

Methanomicrobiales

20

Devereux et al., 1992

MB311

ACCTTGTCTCAGGTTCCATCTCC

Methanobacteriales

30

Devereux et al., 1992

MC504

GGCTGCTGGCACCGGACTTGCCCA

Methanocaldococcaceae

55

Devereux et al., 1992

MC504 Compet

GGCTGCTGGCACCGGACTTGCCCA

MC1109

GCAACATAGGGCACGGGTCT

Methanococcales

45

Fukui 1999

3.6

et

al.,

Cuantificación de los Microorganismos

Para la cuantificación de las células después de la aplicación de la técnica FISH, se lleva a cabo la observación en el microscopio y toma de imágenes. La observación se realiza en un microscopio de fluorescencia modelo Leica DM2500, con cámara digital integrada (Leica 420 C), cuyos filtros usados son N2.1 y I3 La toma de imágenes se realiza a 20 campos distintos y representativos de la muestra hibridada. Se realiza un análisis de las imágenes, para esto se hace uso de un programa (MATLAB 7.1), el programa descompone la imagén capturada en escala de grises, donde los valores irán de 0 (Negro) a 255 (blanco). El cambio de las imágenes de color a escala de grises facilita el conteo de pixeles (figura 8). Las imágenes capturadas son introducidas en el software de cuantificación desarrollado para este fin en la tesis doctoral de Borrás, 2008. El software realiza un informe donde se da los porcentajes de las áreas ocupadas por las bacterias hibridadas acompañado del error de la medida. Este último se calcula como

 , donde: n

σ: desviación estándar n: número de campos

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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

4

Adaptación de la técnica FISH para muestras de un digestor anaerobio

Las muestras provenientes de la digestión anaerobia presentan diversos obstáculos asociados con el método FISH, los principales son: la permeabilidad de la célula, insuficiencia en el contenido de los ribosomas, inaccesibilidad al ribosoma por la sonda y muestras que emiten auto fluorescencia (suciedad en la muestra). En las muestras procedentes de la digestión anaerobia, la aplicación del protocolo estándar FISH para la visualización de las bacterias, da señales de hibridación muy débiles (figura 8). Esto se debe a varios de los obstáculos que ya se han mencionado. 4.1

Recomendación a problemas asociados con la detección de la fluorescencia

La inaccesibilidad de las sondas al ribosoma puede causar señales con ausencia o baja fluorescencia. Esto puede remediarse mediante la aplicación de sondas helpers (sondas de ayuda). Las sondas helpers se diseñan para hibridar sin marcar sobre secuencias de rRNA junto a la sonda FISH en su lugar de destino. Las sondas de ayuda abren las estructuras secundarias y terciarias de la base de los nucleótidos para que con ello se aumente la accesibilidad de la sonda FISH (Nielsen et al., 2009). Otra solución para hibridar sobre los sitios de difícil acceso ha sido alargar el tiempo de hibridación (hasta 72 horas), lo cual mejora la difusión de la sonda en la célula y disminuye las barreras cinéticas de la accesibilidad del lugar de destino. De esta forma se consigue una mejor eficiencia de hibridación y, en general, las señales de fluorescencia aumentan de intensidad (Nielsen et al., 2009). La señal de hibridización también puede incrementarse debido a la unión no específica de las sondas a los contaminantes unidos sobre la membrana celular, como pudieran ser sustancias húmicas y trozos de DNA unidos a la membrana celular. Esto inmoviliza al rRNA y puede producir un incremento de la hibridización (falsos positivos) debido a la unión no específica de la sonda. También es posible, sin embargo, que las sutancias húmicas o los trozos de DNA interfieran con la hibridización de la sonda al rRNA. De esta manera la señal de hibridización disminuye (Salazar 2008). Para no perder la intensidad de fluorescencia se debe evitar la exposición demasiado larga a fuentes de luz fuertes, almacenar siempre los portaobjetos FISH en la oscuridad, retirar con cuidado todas las trazas de etanol de muestras almacenadas, ya que el etanol puede hacer desaparecer la señal de fluorescencia. Por último, se debe evitar los tiempos de fijación demasiado largos (sobre todo para la fijación mediante PFA), ya que los tiempos excesivos pueden reducir la permeabilidad de la célula por la sonda (Nielsen et al., 2009). Basándonos en las recomendaciones antes descritas y los problemas presentes en las muestras, se modificaron los tiempos requeridos para la fijación e hibridación en el protocolo FISH para poder aumentar las señales de hibridación (figura 9).

45

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En este capitulo se pretende optimizar los tiempos de fijación y de hibridación en las muestras procedentes del Digestor Anaerobio de la planta de tratamiento de aguas residuales Carraixet, para establecer los tiempos requeridos en las hibridaciones posteriores. Para llevar a cabo el establecimiento de los tiempos se ha realizado una cuantificación de la señal detectada en cada tiempo evaluado.

Figura 8. Hibridación Fluorescente FISH sin modificación de tiempos. A) Hibridación con sonda específica SRB385 en el canal rojo. B) hibridación con sonda general de bacterias EUBMIX en el canal verde. Imágenes capturadas a 630x.

La figura 8 esta compuesta de dos imágenes. En la primera imagen (A), podemos observar la poca intensidad fluorescente al aplicar la sonda para bacterias sulfatoreductoras (SRB385), lo que dificulta enormemente la cuantificación de los microorganismos. En la imagen B, podemos ver que el problema de baja fluorescencia en la hibridación es también notoria para la sonda general de bacterias (EUBMIX); también se observan señales rojas que corresponden a la sonda específica y que se deben a falsos positivos presentes en la muestra. 4.2

Determinación de los tiempos de fijación y de hibridación óptimos

Mediante la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) y utilizando sondas marcadas con fluorocromos (FAM y TAMRA) que emiten fluorescencia bajo condiciones apropiadas de excitación, se hace posible la visualización de los microorganismos con secuencias de oligonucleotidos determinados, dependiendo de las sondas utilizadas (análisis cualitativo). Para ello se ha utilizado un microscopio de fluorescencia (Leica DM 2500) con cámara integrada (Leica DFC 420 C), y las sondas SRB385 (bacterias sulfato reductoras, SRB) y EUBMIX (dominio eubacteria). Para determinar los tiempos requeridos en la ténica FISH (el de fijación y el de hibridación), se ha realizado en este trabajo evaluaciones y análisis de una misma muestra (Digestor anaerobio Carraixet) a diferentes tiempos. En la fijación se evaluaron los tiempos de 30, 45, 60, 90, 120 y 180 min. De las muestras resultantes de las fijaciones se evaluaron los tiempos de hibridación 60, 90 y 120 min a cada una. En la figura 9, se muestra el esquema de los análisis realizados para las muestras del digestor anaerobio.

46

Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

Figura 9. Esquema de trabajo para la adaptación de la técnica FISH a muestras del Digestor anaerobio.

4.3

Cuantificación de la señal de hibridación

Para el propósito de la cuantificación de la señal emitida por la florescencia de los microorganismos se realizó la evaluación de la intensidad captada mediante el software MATLAB 7.1 y el algoritmo de cuantificación, realizando fotos a 20 campos distintos y en los dos canales, verde y rojo (cada canal con el filtro correspondiente para cada fluorocromo). Un canal es para las sondas de interés marcadas con el fluorocromo TAMRA (rodamina) con una longitud de onda de absorción de 555 nm y de emisión 580 nm (de color rojo), y el otro canal para la sonda general marcada con el fluorocromo FAM (fluoresceína) con una longitud de onda de 494 nm y de emisión de 518 nm (de color verde). Las imágenes se tomaron de campos representativos de la hibridación (con presencia bacterias). Las imágenes se introducen en un software de cuantificación (Borrás 2008) y el programa realiza un promedio de la intensidad detectada en el canal de la sonda de interés con respecto al canal de la sonda general.

47

Mariela Beatriz Reyes Sosa

4.4

Análisis Cuantitativo

El programa genera una hoja de cálculo, donde se pueden ver el informe detallado de los resultados de la cuantificación (áreas ocupadas por las bacterias presentes en la muestra hibridada) para cada campo y para el total de las imágenes, así como también un gráfico de los porcentajes hibridados (figura 10). El resultado final es un número que representa el porcentaje en área de una especie bacteriana en la muestra, acompañado del error de cuantificación (Borrás, 2008).

Figura 10. Hoja de calculó que genera el programa de cuantificación.

En la tabla 9, se muestran los resultados obtenidos de la cuantificación realizada con la ayuda del software de cuantificación (Borrás 2008). Para los tiempos de fijación y de hibridación evaluados, en la tabla se muestra la media aritmética y la incertidumbre de las áreas detectadas para las SRB (bacterias sulfato reductoras detectadas con la sonda SRB385, orden desulfovibrionales), con respecto al total de bacterias detectadas con la sonda EUBMIX (general para las bacterias que comprende EUB338; EUB338II y EUB338III, dominio eubacteria). Con los resultados obtenidos y reportados en la tabla 15, podemos observar que entre los tiempos de fijación hay un incremento de los promedios de las áreas (pixeles) conforme aumentamos el tiempo de fijación. Este incremento llega hasta los 90 min, luego hay un decremento hasta los 180 min. Esta tendencia de la señal detectada se presenta para los tres tiempos de hibridación evaluados. En cuanto a los tiempos de hibridación evaluados, hay un incremento de la señal detectada (expresada como promedio de las áreas) entre el tiempo de 60 min y el de 90 min, sin embargo entre los tiempos de 90 min y el de 120 min la señal detectada decrece.

48

Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia Tabla 15. Promedio de las áreas (pixeles) ocupadas por las bacterias y error en la cuantificación de la señal detectada en la muestra del digestor anaerobio para las bacterias SRB

Tiempo hibridación

60 min

90 min

120 min

30 min

8 +/- 2

6 +/- 1

8 +/- 2

45 min

8 +/- 3

9 +/- 2

7 +/- 2

60 min

11 +/- 3

12 +/- 2

6 +/- 1

90 min

9 +/- 3

14 +/- 2

9 +/- 3

120 min

8 +/- 2

12 +/- 2

8 +/- 2

180 min

10 +/-2

9 +/- 2

10 +/- 4

Tiempo fijación

En el tiempo de hibridación de 90 min se registran las incertidumbres más estables y las mayores señales detectadas (figura 11). Entre los tiempos de fijación, el de 90 min reporta mayor señal detectada. Por tanto se ha decidido trabajar con tiempos de hibridación de 90 min y de fijación de 90 min ya que estos tiempos se obtiene la señal más alta.

Figura 11. Hibridación Fluorescente FISH con modificación de tiempos de fijación y de hibridación. A) Hibridación con sonda específica SRB385.Vista en el canal rojo. B) Hibridación con sonda general de bacterias EUBMIX. Vista en el canal verde. 630x.

La figura 11 esta compuesta de dos imágenes: la imagen A correspondiente a la sonda específica y de interés (SRB385), y la imagen B correspondiente a la hibridación con la sonda general. Si comparamos las dos imágenes de la figura 11 con las de la figura 8 se observa un notable incremento de la intensidad de fluorescencia.

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50

Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

5

Detección y cuantificación de los distintos grupos bacterianos presentes en los procesos de Fangos activados y Digestión anaerobia

En este capitulo se describen para cada grupo bacteriano, los resultados obtenidos en las hibridaciones asi como en el análisis de cuantificación realizado. La detección de cada uno de los distintos grupos de bacterias se realizó tanto en las muestras del Fango activado como en las de la Digestión anaerobia. Los resultados de las cuantificaciones se expresan como porcentajes de abundancia del grupo funcional de interes. 5.1

Detección y cuantificación de las bacterias nitrificantes

Para las hibridaciones correspondientes a la detección de las bacterias nitrificantes, tanto amonio-oxidantes como nitrito-oxidantes, se usaron las sondas específicas que se mencionan en la tabla 9 descrita en el apartado de materiales y métodos. La sonda NSO1225 LNA, detecta bacterias amonio-oxidantes, mientras las sondas Ntspa712 y NIT3 detectan las bacterias nitrito-oxidantes. Las tres tienen un porcentaje alto de formamida por lo que son muy restrictivas en la hibridación, lo que las hace muy fiables. En las muestras procedentes del Digestor anaerobio las tres sondas usadas dan resultados negativos. Las bacterias que llevan a cabo la nitrificación tienen una tasa de crecimiento lento, y estas solo crecen cuando las condiciones son las adecuadas para ellas (temperatura, pH, edad del fango, oxígeno disuelto, etc.). La nitrificación se da en la mayoría de los tratamientos aerobios cuando las condiciones ambientales y las de funcionamiento son las adecuadas (Ferrer, 2007). Para las muestras del reactor biológico de fangos activados, fueron positivos los resultados de las hibridaciones con la sonda NSO1225LNA y Ntspa712. En la detección de estas bacterias se observó que las amonio-oxidantes se agrupan en flóculos definidos y gruesos (figura 12), mientras que las nitrito-oxidantes se agrupan en flóculos pequeños (figura 13).

51

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Figura 12. Bacterias amonio-oxidantes en el Reactor aerobio. Las señales en verde corresponden a diversas bacterias mientras que las señales en rojo corresponden a las AOB. Imagen a 630x.

Figura 13. Bacterias nitrito-oxidantes en el Reactor aerobio. Las señales en verde corresponden a las diversas bacterias presentes en la muestra, mientras que las señales en rojo corresponden a las NOB. Imagen a 630x.

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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

Comparando las figuras 12 y 13 podemos ver que hay más abundancia de las Amonio-oxidantes que de las nitrito-oxidantes. Sin embargo ambas forman el grupo de las bacterias nitrificantes, que es el grupo de interés. Las bacterias nitrificantes en el reactor aerobio estan presentes en un 9% (+/- 1%). Este grupo de bacterias se disponen en el flóculos de manera aglomeradas entre ellas, dentro del mismo floculo. 5.2

Detección y cuantificación de las bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAOs) y acumuladoras de glúcogeno (GAOs)

Las sondas específicas usadas para este análisis se muestran en la tabla 10, como ya se ha mencionado antes y para facilitar las hibriaciones se han usado mezclas de las sondas, tanto para las PAO como para las GAO. Las hibridaciones se realizaron tanto en las muestras del Digestor anaerobio como para la muestra procedente del Reactor aerobio. En el digestor anaerobio no se detectó presencia de las bacterias PAO y GAO, lo que parece lógico, ya que estas bacterias no son capaces de crecer en condiciones anaerobias. Así, estas bacterias presentan una clara desventajas con respecto a otros grupos bacterianos capaces de utilizar los ácidos grasos volátiles presentes en la digestión anaerobia. En el reactor aireado de fangos activados se ha obtenido señal positiva para las PAO y para las GAO pertenecientes a los organismos defluvicoccus cluster II. Con ayuda del programa de cuantificación, se hizo el análisis cuantitativo de las muestras que resultaron positivas. Las bacterias PAO resultarón un 2% (+/- 1), mientras que las GAO fuerno un 4% (+/- 2) del total de las bacterias hibridadas con las sondas generales de dominio eubacteria y archaea (EUBMIX + ARCH915). Como se puede observar, hay mayor porcentaje de la presencia de las GAO cluster II que las PAO, sin embargo entre las dos tienen poca presencia en la población microbiana. Realizando el análisis cuantitativo de la presencia de estas bacterias podemos observar que no hay un porcentaje alto de ellas, en total representan un 6% de la población total de bacterias que hay en el fango activo. En cuanto a las observaciones ambas bacterias son pequeñas de tamaño, la diferencia es que las PAO se agrupan de froma muy densa, mientras que las GAO están de más dispersas (figura 14 y 15). La presencia de estas bacterias en el tanque aerobio puede deberse a que existen zonas anaerobias dentro del reactor.

53

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Figura 14. Bacterias PAO en el Reactor aerobio. La señal en verde corresponde a diversas bacterias presentes en la muestra. La señal en rojo corresponde a las bacterias PAO. Imagen a 630x.

Figura 15. Bacterias GAO en el Digestor anaerobio. La señal en verde corresponde a la población bacteriana presente en la muestra. La señal en rojo corresponde a las bacterias GAO. Imagen a 630x.

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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

5.3

Detección y cuantificación de las bacterias Desnitrificantes

Para las hibridaciones de las bacterias desnitrificantes se usaron 3 sondas específicas que se muestran en la tabla 11 descrita en materiales y métodos. En ambas muestras (Digestor anaerobio y Reactor aerobio) se detectó presencia de las bacterias desnitrificantes. Existen muchas bacterias con capacidad para cambiar su metabolismo pasando de utilizar oxígeno como aceptor final de electrones a utilizar nitrato (Ferrer, 2007). La utilización de oxígeno se ve favorecida frente a la de nitrato, por lo que si existen ambos compuestos, no se producirá la desnitrificación. Sin embargo bajas concentraciones de oxígeno disuelto se pueden encontrar en determinadas zonas del reactor, debido a la configuración que pudiera tener, o dentro del flóculos (fango granular) debido a una limitación en la transferencia de oxígeno en el interior del mismo. En ambos casos aparecen zonas donde se da la desnitrificación (Ferrer, 2007). Utilizando el software de cuantificación, se realizó el análisis cuantitativo de las muestras que resultaron positivas, tanto en el digestor anaerobio como las del reactor aerobio. En el Digestor anaerobio la presencia de las bacterias dsnitrificantes es del 10% (+/- 5), mientras que para el Reactor aerobio estas bacterias estan presentes con un 19% (+/- 2) del total de bacterias hibridadas con las sondas EUB MIX y ARCH 915. Las bacterias desnitrificantes tanto en el reactor aerobio como en el digestor anaerobio se encuentran dispersas y algunas formando flóculos, excepto para las bacterias Thiobacillus que son filamentosas (figura 16). La presencia de bacterias desnitrificantes se puede ver afectada por varios factores, siendo alguno de ellos: 1. Presencia de oxigeno disuelto: las concentraciones superiores a 0.3-1.5 mg O2/l inhiben el mecanismo de la desnitrificación. El oxígeno impide la formación de la nitrato reductasa, enzima que cataliza el paso de nitrato a nitrito bloqueando el proceso de desnitrificación (Barajas, 2002).

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Figura 16. Bacterias desnitrificantes. A) Bacterias Azoarcus-Thauera-Castellaniella cluster en el Digestor anaerobio. B) Bacterias Azoarcus-Thauera-Castellaniella cluster en el Reactor aerobio.C) Bacterias Paracoccus en el Digestor anaerobio. D) Bacterias Paracoccus en el Reactor aerobio. E) Bacterias Thiobacillus en el Digestor anaerobio. Las señales en verde son la población bacteriana mientras q las señales en rojo son las bacterias desnitrificantes. Imagenes a 630x.

2. Fuente de carbono orgánico: diversos grupos de bacterias compiten con las desnitrificantes para utilizar el nitrato y transformarlo en otros productos distintos al N2. Por tanto es importante la existencia de una relación C/N adecuada y una fuente de carbono fácilmente biodegradable. Las fuentes de carbono propuestas (García, 1997) para llevar a cabo la desnitrificación son variadas y entre ellas destacan el metanol, el acido acético, el etanol, la acetona y algunos azúcares, así como fuentes de carbono interno del proceso como la materia orgánica del agua residual, el carbono endógeno e incluso el metano que se produce en el proceso anaerobio. Se han llevado a acabo estudios para utilizar fango hidrolizado para llevar a cabo el proceso de desnitrificación ya que contiene fuentes de carbono fácilmente biodegradables (Henze, 1991).

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3. Temperatura: Henze (1991) encontró que a medida que aumenta la temperatura, el rendimiento de la desnitrifiacion aumenta. La desnitrificación es el proceso que tolera un rango de temperatura amplio, ya que existen bacterias con temperaturas óptimas de crecimiento de 28 a 32ºC (Kelly et al., 2000). En el digestor anaerobio las bacterias desnitrificantes hallan las condiciones para su crecimiento ya que no hay oxígeno que inhiba su proceso, cuentan con fuente de carbono fácilmente biodegradable, se encuentran en temperaturas óptimas, así como también influye que en el reactor aerobio se produce la nitrificaión, de forma que al digestor le llegan nitratos, lo cual favorece el desarrollo de las desnitrificantes en el digestor. Se realizó un análisis de corroboración de los resultados obtenidos en la muestra del digestor anaerobio, por lo que se tomó una muestra de la EDAR CARRAIXET con 6 meses de diferencia con la primera muestra. A esta nueva muestra se le realizó el mismo procedimiento de fijación y de hibridación que a la primera muestra y se analizó cuantitativamente obteniendo los resultados muy similares a los de la primera muestra hibridada. Por lo que la presencia de las bacterias desnitrificantes en el Digestor Anaerobio no se debe a algo puntual.

5.4

Detección y cuantificación de las bacterias Metanotrofas

Con las dos sondas que se reportan en la tabla 12 se cubre todos los géneros conocidos y reportados en bibliografia como bacterias metanotrofas. Estas bacterias no es muy común hallarlas en los sitemas convencionales de fango activo. Las hibridaciones correspndientes se realizaron para ambas muestras (Digestor anaerobio y Reactor aerobio). Para las muestras del digestor anaerobio, las hibridaciones resultaron negativas. En las muestras del reactor aerobio la sonda Ma464 que pertenecen a las metanotrofas del tipo II, da señal positiva, mientras que con la otra sonda, se detecta tan solo una muy baja presencia. Con el software de cuantificación, se realizó el análisis cuantitativo de las muestras que resultaron positivas del reactor aerobio. Las bacterias metanotrofas se encuentran en la muestra del Reactor aerobio con una abundancia del 1 +/- 1% (figura 17). Se ha reportado que la temperatura óptima para la metano oxidación es de 25ºC (Hanson et al., 1996). Las Metanotrofas del tipo II se ven favorecidas frente a las del tipo I en condiciones de bajo contenido de metano. Además, tambien influye si está limitado el medio en nitrógeno (Hanson et al., 1996). La hipótesis es que la concentración de metano y oxígeno combinado con nitrógeno, son los factores determinantes del tipo de metanotrofa que se encuentre (Hanson et al., 1996).

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Figura 17. Bacterias Metanotrofas en el Reactor aerobio. La señal en verde corresponde a la población de bacterias presentes en la muestra. La señal en rojo corresponde a las bacterias metanotrofas presentes en la muestra. Imágenes a 630x.

5.5

Detección y cuantificación de las bacterias Sulfato-reductoras (SRB)

Para la detección de las bacterias Sulfato reductoras se hace uso de las sondas de la tabla 13 antes descrita. Las sondas SRB385 y la SRB385Db son sondas que detectan tipos de bacterias sulfato reductoras de la clase deltaproteobacteria, pero no todas las deltaproteobacteria y demás sulfato reductoras fuera de la clase deltaproteobacteria (Ashelford et al 2002; Loy et al 2002; Lücker et al 2007). Rabus (1996) comparó la detección de ambas sondas entre una gran cantidad de bacterias. El resultado fue que la sonda SRB385Db detecta más familias de sulfato reductoras que la sonda SRB385. Las demás sondas son mas restrictivas en cuanto a la detección de familias o géneros de las bacterias sulfato reductoras dentro de la clase deltaproteobacteria. Se detectaron señales positivas para ambas muestras (Digestor anaerobio y Reactor aerobio), con las sondas generales de sulfato reductoras. La diferencia entre ambas muestras es la abundancia de bacterias (figura 18 y 19).

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Figura 18. Bacterias Sulfato-reductoras en el Digestor anaerobio. A) Muchas Desulfovibrionales y otras Bacterias. B) Desulfobacteracea (Desulfobacterales, Desulfuromonales, Syntrophobacterales, Myxococcales, y otras Bacterias. C) Desulfonema. Las señales en verde corresponden a la poblción bacteriana presente en la muestra, mientras q las señales en rojo corresponden a las bacterias SRBs. Imágenes a 630x.

En las anteriores imágenes se puede ver que las bacterias, en su mayoría, se encuentran dispersas, y unas pocas agrupadas en pequeños flóculos. El análisis cuantitativo se realiza con la ayuda del software de cuantificación para todas las muestras que dieron un resultado positivo. Las sulfato reductoras en el Digestor anerobio es un 20% (+/- 4) de la población de bacterias total hibridada con las sondas generales de dominio (EUBMIX + ARCH915). Mientras que la presencia de bacterias sulfato reductoras en el Reactor aerobio es de un 27% (+/- 4). Ambos resultados son significativos.

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Figura 19. Bacterias Sulfato-reductoras en el Reactor aerobio. A) Muchas Desulfovibrionales y otras Bacteria. B) Desulfobacteracea (Desulfobacterales, Desulfuromonales, Syntrophobacterales, Myxococcales, y otras Bacterias. C) Desulfonema. Las señales en verde corresponden a la poblción bacteriana presente en la muestra, mientras q las señales en rojo corresponden a las bacterias SRBs. Imágenes a 630x.

En general, en las muestras del Digestor Anaerobio, las señales de hibridación eran menos intensas que las del Reactor Aerobio. También en las muestras del Digestor anaerobio se detectan menores señales fluorescentes en comparación con las del Reactor aerobio. En principio, no cabría esperar una presencia tan elevada de bacterias SRB en el reactor aerobio (27%), que incluso es mayor que en el digestor anaerobio (20%). A continuación, se discuten las posibles causas de este hecho. Aunque tradicionalmente se considera a las SRB anaerobias estrictas, en los ultimos años se ha reportado actividad sulfato reductora en ambientes aerobios, demostrando el amplio rango ecológico de las SRB (Baumgartner et al., 2006). Un estudio realizado en 1985, demuestra que varias cepas de SRB pueden sobrevivir periodos largos en zonas óxicas y mantener su capacidad para la reducción del sulfato (Cypionka et al., 1985). Más tarde se estudió la capacidad de las SRB para reducir el oxígeno y el nitrato en los procesos aerobios (Dillin y Cypionka 1990; Dannenburg et al., 1992). En otro estudio realizado años más tarde, se demostró que las SRB utilizan distintos aceptores de electrones en función de su rendimiento energético:

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el oxígeno en primer lugar, a continuación el nitrato/nitrito y luego los compuestos de azufre (sulfato, sulfito, tiosulfato y azufre elemental) (Krekeler y Cypionka 1995). Otros estudios realizados se centraron en los procesos bioquímicos durante la reducción del oxigeno por SRB (Baumgartner et al., 2006). Chen et al., (1993) descubrieron que Desulfovibrio gigas utiliza un par de proteinas para reducir el oxigeno mientras oxida NADH (dinucleotido de nicotiamida adenina oxidada). Otros estudios demostrarón que las SRB contienenen superoxidos que protegen a la célula cuando se encuentra en ambientes de estrés oxidativo (Louro, 2009). Estos superóxidos reductasas participan en las reacciones redox (Carvajal, et al., 2008), y los que podemos encontrar en las SRB son, neelaredoxina, desulfoferredoxina y rubredoxina (Fauque y Olliver, 2004). En ausencia de sulfatos, ciertas SRB pueden utilizar compuestos carbonatados simples como dadores y aceptores de electrones por un proceso llamado dismutación. Es decir, ciertas SRB son capaces de desproporcionar compuestos intermediarios de azufre. Las desproporción se refiere a desintegrar compuestos reducidos de azufre, tales como tiosulfato, sulfito o azufre elemental (S0), a un nuevo compuesto, el cual está más oxidado y/o reducido comparado con el substrato original (Salazar, 2008). Por otro lado, al igual que las archaeas metanogénicas, algunas SRB se agrupan, por lo que pueden quedar en las capas mas profundas de los gránulos en microambientes anaerobios. Sin embargo, en ninguna de las muestras se observó fango granular. La presencia de estas bacterias en el reactor aerobio, como en el caso de las archaeas metanogénicas, se debe, entre otras causas, a la existencia de la recirculación del fango del digestor al decantador primario. Tambien se debe tomar en consideración que las aguas de la zona son ricas en sulfatos, lo que proporciona una relación DQO/S baja, favoreciendo la proliferación de las SRB. Por otr parte, existe en el proceso un paso de sulfato a sulfuro (proceso biológico) pero tambien existe un paso de sulfuro a sulfato (proceso químico), dando así un ciclo continuo y proporcionando el medio adecuado para la existencia de las SRB. Para corroborar los resultados obtenidos en el Reactor aerobio, se repitió el análisis con fango procedente de la planta del CARRAIXET con 6 meses de diferencia con la primera muestra. A esta nueva muestra se le sometió al mismo procedimiento que a la primera muestra en cuanto a fijación e hibridación. Los resultados son muy similares, esto queda confirmado que en ambas muestras se detectan las sulfato reductoras de manera muy abundante.

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5.6

Detección y cuantificación de las bacterias Metanogénicas

Las sondas específicas correspondientes para las hibridaciones de las archaeas metanogénicas se detallan en la tabla 14 descrita en el capitulo de materiales y métodos. En las muestras del Digestor anaerobio tres de las sondas (MSMX860, MG1200b y MB311) dan señal positiva y de mucha intensidad, por lo que se ha de suponer que el porcentaje de presencia de las bacterias metanogénicas es significativo en la población microbiana total. En las muestras del Reactor aerobio dos de las sondas dan resultados positivos (MG1200B y MB311), aunque las dos sondas dan poca señal de hibridación en comparación a la hallada en el Digestor anaerobio. Utilizando el software de cuantificación, se realizó el análisis cuantitativo de las muestras que dieron señales positivas tanto del digestor anaerobio como las del reactor aerobio. Los resultados de la cuantificación para el Digestor anaerobio muestran un 30% (+/- 6) de abundancia y un 11 % (+/- 2) de abundancia para el Reactor aerobio. Los resultados muestran porcentajes de presencia altos en ambos procesos. Cabría esperar una ausencia total de organismos metanogénicos en el Reactor aerobio, sin embargo, un 11% supone una presencia importante de estos organismos. A continuación se discuten las causas más probables de este hecho. En el digestor anaerobio, la mayoría de estas bacterias, se agrupan de forma muy peculiar, pues aparentan racimos no muy grandes. También hay algunas bacterias que forman cadenas y otra parte que están dispersas (figura 20). En el reactor aerobio se visualizan bacterias agrupadas y bacterias dispersas. Los organismos metanogénicos encontrados en el reactor aerobio parecen ser de menor tamaño que los encontrados en el digestor anaerobio (figura 21). En el Reactor aerobio una concentración de O2 disuelto inferior o igual a 0.1-1 mg/l, puede inhibir el crecimiento de las bacterias aerobias, pero se sabe que concentraciones alrededor de 0.01-0.001 mg/l, puede inhibir el crecimiento de algunos organismos metanogénicos hidrogenotróficos y la producción de CH4 (Macarie, et al., 1996). Sin embargo, un número elevado de organismos metanogénicos, así como bacterias acetogénicas anaerobias estrictas, han sido encontrados en los fangos activados de varias plantas de tratamiento aerobio (Macarie, et al., 1996). La presencia de microorganismos anaerobios estrictos en ambientes aerobios corresponde a la formación de micronichos anaerobios. Los micronichos se relacionana con la formación de los gránulos en los que se ve limitada la transferencia de O2 al interior de él (Macarie, et al., 1996). Varios trabajos han demostrado que los flóculos desarrollados presentan una organización multicapas de su población bacteriana (Macarie, et al., 1996). Las bacterias fermantativas, las cuales son en parte anaerobias facultativas, se encuentran exclusivamente en la parte externa del gránulo, mientras que los microorganismos más 62

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sensibles al O2 (metanogénicos, tanto acetoclásticos como hidrogenotroficos) se ubican en las capas más profundas del gránulo (Macarie, et al., 1996).

Figura 20. Bacterias Metanogénicas en el Digestos anaerobio. A) Methanosarcinales. B) Methanomicrobiales. C) Methanobacteriales. Las señales en verde corresponden a toda la población bacteriana presente en la muestra, mientras que las señales en rojo corresponden a las archaea metanogénicas. Imágenes a 630x.

En los resultados de un estudio realizado por Anzola (Anzola, et al., 2008) sobre reactores anaerobios-aerobios de lecho fijo, se muestra que el contenido del O2 disuelto en una de las zonas del reactor no afectó la metanogénesis, sino que aumentó la velocidad y mejoró la producción de CH4. Sin embargo en las muestras analizadas en el presente trabajo no se visualizó fango granular. Por lo que la causa más probable de la presencia de estas archaeas se debe a que en la EDAR existe la recirculación de los fangos del digestor hasta la decantación primaria. Llegamos a detectar estas archaeas debido que el tiempo de retención celular del reactor aerobio es bajo, por lo que no da tiempo a que desaparezcan todas estas especies. Se realizó una prueba para corroborar los resultados obtenidos en el Reactor aerobio en cuanto a la presencia de los organismos metanogénicos.

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Se tomo una muestra del reactor aerobio de la planta del CARRAIXET con una diferencia de fechas de 6 meses. La muestra se sometío al mismo procedimiento de fijacion e hibridación que las muestras anteriores y se le realizó la cuantificación.

Figura 21. Bacterias Metanogénicas en el Reactor aerobio. A) Methanomicrobiales. B) Methanobacteriales. Las señales en verde corresponden a toda la población bacteriana presente en la muestra, mientras que las señales en rojo corresponden a las archaea metanogénicas. Imágenes a 630x.

Los resultados de estas pruebas fueron similares a las primeras hibridaciones con lo que se corrobora la presencia y porcentajes significativos en ambas muestras. En las figuras 20 y 21 podemos observar que las metanogénicas podemos encontrarlas dispersas, aglomeradas y formando filamentosas. 5.7

Comparación del total de las poblaciones bacterianas encontradas en el Fango activado y en la Digestión anaerobia

En la figura 22 se puede ver la comparación de los distintos grupos de bacterias tanto en la muestra del Reactor aerobio como en la del Digestor anaerobio. Comparando los microorganismos detectadas en las hibridaciones realizadas se ha encontrado que la población bacteriana con la que cuenta el reactor aerobio (figura 22) es: 1. Bacterias nitrificantes 2. Bacterias PAO 3. Bacterias GAO 4. Bacterias desnitrificantes 5. Bacterias metanotrofas 6. Bacterias sulfato-reductoras 7. Archaeas metanogénicas 8. Restos de población heterotrofa

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Mientras que la población microbiana del Digestor anaerobio (figura 22) esta formado por: 1. 2. 3. 4.

Bacterias desnitrificantes Archaeas metanogénicas Bacterias sulfato-reductoras Resto de población anaerobia

Presencia por grupo de bacterias en la poblacion microbiana en el Reactor aerobio 9% 27%

2%

4% 19%

1% 27%

Bacterias Nitritrificantes

11%

Bacterias PAO

Bacterias GAO

por grupo de bacterias la poblacion microbianaArchaeas en el Digestor BacteriasPorcentaje Desnitrificantes BacteriasenMetanotrofas Methanogénicas anaerobio

Bacterias SRB

Resto de bacterias 10%

Porcentaje 40% por grupo de bacterias en la poblacion microbiana en el Digestor anaerobio 10%

30%

40% 20%

30%

20%

Figura 22. Comparación de los grupos de bacterias en cada proceso analizado. En la gráfica de arriba, población microbiana en el Reactor aerobio. En la gráfica de abajo, población microbiana del Digestor anaerobio.

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Los resultados obtenidos están dentro de lo esperado, sin embargo, existen tres grupos de microorganismos (desnitrificantes, metanogénicos y sulfatoreductores) que a priori no deberían aparecer en ambos procesos simultáneamente. A continuación, se exponen las razones que justifican la presencia de estos organismos en ambos procesos: a) Bacterias Desnitrificantes.- se observan 3 grupos de desnitrificantes (Azoarcus-Thauera-Castellaniella, Paracoccus y Thiobacillus) en el Digestor anaerobio con un porcentaje de abundancia de 10%, mientras que en el Reactor aerobio tan solo se han encontrado 2 grupos (Azoarcus-Thauera- Castellaniella, Paracoccus) con un 19% de abundancia. El grupo de estas bacterias del que carece el reactor (Thiobacillus) forma filamentosas. En principio, no se esperaba la presencia de bacterias desnitrificantes en el digestor anaerobio. La elevada presencia de bacteris desnitrificantes en el digestor anaerobio se debe, principalmente, a que se detectó una alta concentración de nitratos a la entrada del digestor anaerobio, lo que favorecería el desarrollo de estas bacterias. En cuanto a las especies concretas, la bacteria Paracoccus puede crecer bajo diferentes concentraciones de O2, utilizando N-óxidos como aceptores de electrones y con una variedad de fuentes de carbono incluyendo aminas y alcoholes (Beker et al., 1998). Se ha visto que especies como Paracoccus solventivorans crecen con acetona, Paracoccus aminovorans y aminophilus con dimetilformamida, Paracoccus thiocynatus con tiocinato y Paracoccus desnitrificans puede usar disulfuro como fuente de carbono (Beker et al., 1998). La Paracoccus denitrificans usa tanto compuestos de sulfuro como tiosulfato como dadores de electrones en la desnitrificación (Lee et al, 2008). Su capacidad de utilización de diferentes dadores de electrones hace posible encontrar estas bacterias en ambientes anóxicos. Las bacterias Azoarcus y Thauera consumen una amplia gama de acidos grasos de cadena corta (Morgan et al., 2008). Esta característica permite encontrarlas tando en el reactor como en el digestor anaerobio. Sin embargo la abundancia de la bacteria Azoarcus en los reactores de plantas a gran escala varia entre un 3-16% de la biomasa total (Thompsen et al., 2007). Si además las plantas cuentan con adición de Metanol como fuente de carbono, esta abundancia puede llegar a superar el 30% (Hagman et al., 2008). La abundancia de la Thaurea en plantas a gran escala varia entre un 2-11% del total de la biomasa (Thompsen et al., 2007). La bacteria Thiobacillus puede crecer tanto en medios aerobios como anaerobios, sin embargo, su temperatura óptima es de 28 a 32ºC con un pH de 6 a 8 (Kelly et al., 2000). Como la temperatura del reactor aerobio es de aproximadamente 20 ºC, no se favorece el desarrollo de Thiobacillus en él. Estas bacterias se han encontrado en aguas residuales, lagunas de tratamiento de residuos industriales y en los tanques de digestión especialemente bajo condiciones de anoxia (Kelly et al., 2000). La especie Thiobacillus denitrificans crece como los organismos autótrofos quimiosintéticos en medios anaerobios (anóxicos) utilizando tiosulfato, tetrationato, tiocinato, sulfuro o azufre elemental mediante el uso de nitrato, nitrito u óxido nitroso como aceptores de electrones (Kelly et al., 2000; Lee et al, 2008).

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Por otra parte, las bacterias Thiobacillus y Paracoccus juegan un papel importante en el digestor anaerobio ya que participan en el ciclo del azufre estableciendo una relación con la presencia de las SRB. Por lo que su presencia en el Digestor anaerobio es justificable.

b) Archaea Metanogénicas.- Se observan que son 3 grupos de estos microorganismos (Methanosarcinales, Methanomicrobiales y Methanobacteriales) en el Digestor anaerobio y tan solo 2 en el Reactor aerobio (Methanomicrobiales y Methanobacteriales). El grupo del que carece el Reactor aerobio (Methanosarcinales), forma filamentosas y se agrupa, a diferencia de todos los demás microorganismos hallados en las muestras, en forma de racimos. En principio, no cabría esperar la presencia de organismos metanogénicos en el reactor aerobio. Sin embargo, la existencia de una recirculación de fangos del digestor anaerobio al decantador primario de la EDAR, hace que sea posible su presencia en el reactor aerobio. Estos microorganismos no llegan a desaparecer completamente en el reactor aerobio debido a que el tiempo de retención celular es bajo, aunque se llega a obtener una disminución aproximada de un 60% (30% de estas archaeas en el digestor y 11% en el reactor). En cuanto a la diferencia de especies, hay que decir que los microorganismos Methanosarcinales son acetotróficos. Etos estan presentes en el Digestor anaerobio pero no en el Reactor aerobio, lo que se puede deber a que en el Reactor aerobio no exista acético sufiente para la proliferación de estas archaeas, ya que pueden entrar en competencia por el acético con las bacterias PAO, GAO y otros organismos. Además, la velocidad de crecimiento de los organismos metanogénicos acetotróficos es más lenta que la de los hidrogenotróficos. c) Bacterias Sulfato-reductoras.- encontramos los mismos grupos de estas bacterias (Desulfovibrionales y Desulfobacteraceae) en los dos procesos estudiados (Digestor anaerobio y Reactor aerobio). La diferencia está en que las bacterias del Reactor aerobio son más grandes y abundantes (27%) que las que aparecen en el Digestor anaerobio (20%). En principio, se puede pensar que no debería haber muchas de estas bacterias en el Reactor aerobio. Sin embargo, existen una serie de factores que hacen posible su proliferación en este tipo de ambientes. En primer lugar, ya se ha comentado que existe una recirculación de los fangos del digestor anaerobio al decantador primario, lo que hace posible la presencia de estas bacterias en el reactor. En segundo lugar, las aguas residuales que llegan a la EDAR del Carraixet contienen gran cantidad de sulfatos, dando una relación DQO/S baja, lo que favorece el desarrollo de estos microorganismos en el reactor aerobio. Además, cabe destacar que el sulfato que es transformado a sulfuro por estas bacterias, pasa de nuevo a sulfato por la presencia de oxígeno en el reactor aerobio. Esto hace que siempre exista una fuente de sulfatos en el reactor, favoreciendo así el crecimiento de las SRB, lo que no ocurre en el digestor anaerobio.

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Por otra parte, algunas SRB no son completamente dependientes del sulfato. Estas pueden usar como aceptor de electrones alternativamente Fe(III) y nitrato, pueden desproporcionar compuestos sulforados y pueden crecer bajo condiciones fermentativas (Ravenschlang et al, 2000). Se ha observado que las SRB tienen la capacidad de utilizar diversos dadores de electrones para la reducción de sulfatos. Entre estos dadores cabe destacar: hidrógeno, ácidos grasos y subproductos orgánicos formados por las bacterias aerobias durante su crecimiento (Rabus et al. 1996). En el anexo se muestran algunas de las reacciones más importantes que se llevan a cabo durante el ciclo del azufre. Es de suponer que las bacterias no detectadas mediante las sondas utilizadas corresponden al “resto de población bacterian”, probablemente bacterias heterótrofas. Em el caso de la población de las bacterias em el Digestor anaerobio, las bacterias no detectadas y reportadas como “Resto de población bacteriana” están asociadas con bacterias acidogénicas. A la vista de los resultados obtenidos, cabe destacar que la diversidad de microorganismos es mayor en el reactor aerobio que en el digestor anaerobio.

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Conclusiones

Las principales conclusiones que se pueden extraer de este trabajo se detallan a continuación. Debido a la falta de intensidad en la señal de hibridación, la cuantificación de los microorganismos en el reactor aerobio es más fácil que la cuantificación de los microorganismos del digestor anaerobio. Las muestras del digestor anaerobio emiten poca fluorescencia debido a obstáculos como suciedad (material no biodegradable inerte) y el poco contenido de ribosomas. Variando los tiempos de fijación e hibridación se puede llegar a mejorar la fluorescencia emitida por las muestras del digestor anaerobio (aumento de la intensidad lumínica). Esto ayuda en el momento de la cuantificación de los microorganismos. Los tiempos óptimos para nuestra muestra son 90 min. de fijación y 90 min. de hibridación. En el reactor aerobio las especies más abundantes de microorganimos identificados son: 27% de bacterias SRB, 19% de bacterias desnitrificantes, 11% de archaeas metanogénicas, un 9% de bacterias nitrificantes, 4% de bacterias GAO, 2% de bacterias PAO, 2% y un 1% de metanotrofas. Los microorganismos identificados en el digestor anaerobio son: 30% de archaeas metanogénicas, 20% de bacterias SRB y 10% de bacterias desnitrificantes. Muchas de las poblaciones presentes en el digestor anaerobio, como los microorganismos metanogénicos y las bacterias sulfato reductoras, llegan a los Fangos activados por la recirculación de los fangos que se lleva cabo en la planta. Sin embargo estas permanecen con abundancias importantes por diversas razones: Las archaeas metanogénicas son detectadas con una abundancia del 11% en el reactor aerobio y un 30% en el digestor anaerobio. Esto se debe, entre otras cosas, a que el tiempo de retención celular del reactor aerobio es bajo y por tanto no es tiempo suficiente para que estos microorganismos lleguen a desaparecer completamente. En el caso de las bacterias sulfato reductoras, estas estan presentes en el fango activado debido a que muchas especies toleran el oxigeno, llegando a detectar un 27% en el reactor aerobio y un 20% en el digestor anaerobio. En el reactor aerobio se detecta incluso mayor porcentaje de SRB por que las aguas son ricas en sulfatos. Además, su capacidad para utilizar una gran diversidad de dadores de electrones hace que el medio sea apropiado para su proliferación y que puedan entrar en competencia con las demás bacterias. Tambien en el digestor anaerobio se observa la presencia de las bacterias desnitrificantes. Esto se debe principalmente a que al digestor llega una elevada concentración de nitratos. Además, existe una gran diversidad de bacterias desnitrificantes entre las que podemos encontrar, aerobias o anaerobias facultativas, esto hace que las podamos encontrar tanto en el Reactor aerobio como en el Digestor anaerobio. En el caso de la especie Thiobacillus su rango de temperatura (28-32ºC) es

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un poco más alto que las temperaturas normales que se encuentran en los reactores aerobios, por lo que es más fácil encontrarlas en los digestores. Las bacterias Paracoccus tienen un amplio rango de sustratos, crecen bajo diferentes condiciones de O2 utilizando nitratos como aceptores de electrones, esto hace posible encontrarlos tanto en el reactor aerobio como en el digestor anaerobio con presencia de nitratos (anóxicos). Un punto muy importante sobre las desnitrificantes Thiobacillus y Paracoccus es que pueden realizar la desnitrificación usando como dadores de electrones compuestos inorganicos de azufre, por lo que juegan un papel importante en el ciclo del azufre y tienen relación con la presencia de SRB en los procesos anaerobios. En el reactor aerobio hay más diversidad de grupos de microorganismos que en el digestor anaerobio. Comparando las distintas poblaciones, en cada uno de los procesos estudiados (Fango activado y Digestor anaerobio), se comprueba la diversidad de los microorganismos y la abundancia de cada especie desarrollada. Además, es posible relacionar la presencia de algunas especies, ya que subproductos de alguna especie pueden ser el sustrato o el aceptor de electrones de otras especies, estableciendo una relación simbiotica entre ellas.

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Recomendaciones

Con la información y los datos obtenidos es un poco difícil dar una explicación concreta de lo que está sucediendo en los procesos biológicos, por lo que se recomienda hacer un análisis de los grupos de microorganismos faltantes en cada uno de los procesos, tales como las bacterias acidogénicas y demás organismos heterótrofos que no se realizaron en este estudio. Esto nos ayudaría a detallar más la población y ver si exiten especies de bacterias que no se han detectado de los grupos estudiados en el presente trabajo. También se recomienda realizar analisis de sulfatos, nitratos y oxígeno en las entradas de los procesos estudiados (reactor aerobio y digestor anaerobio). La realización de un estudio más amplio sobre las poblaciónes microbianas en los procesos biológicos en otras plantas de tratamiento de aguas residuales con distintas características de agua residual (con y sin sulfatos) y esquemas de tratamiento (con y sin recirculación de fangos desde el digestor), permitiría establecer las relaciones entre las especies bacterianas presentes y así entender mejor lo que ocurre durante cada proceso biológico. El conocimiento de las relaciones simbióticas entre los microorganismos dentro de la población total, es importante por que con ello se obtendría la información necesaria para poder completar los modelos matemáticos que permiten simular el comportamiento de los procesos biológicos, permitiendo optimizar el funcionamiento de las plantas de tratamiento de aguas residuales. Por último se recomienda no sólo una busqueda exhaustiva de sondas para analizar los microorganismos faltantes en este trabajo, si no la realización y diseño de sondas específicas nuevas para detectar las especies de interés. Esto permitirá afinar el análisis de las posibles bacterias y archaeas que pudieran encontrarse en los procesos biológicos de las aguas residuales y que no estan reportadas en la bibliografía.

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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

Anexo Reacciones de las Bacterias Amonio-oxidantes NH4+ + 3/2 O2 → NO2- + 2H+ + H2O (Ferrer et al, 2007) Bacterias: Nitrosomonas Nitrosospira Nitrosococcus Nitrito-oxidantes NO2- + ½ O2 → NO3-

(Ferrer et al, 2007)

Bacterias: Nitrobacter Nitrospira PAO Condiciones anaerobias 2C2H4O2 + (HPO3) + H2O → (C2H4O2)2 + PO4-3 + 3H+

(Ferrer et al, 2007)

Condiciones aerobias (C2H4O2)2 + 0.2 PO4-3 + 1.2 O2 + 0.16 NH4+ → 0.16C5H7NO2 + 1.2 CO2+ 0.2 (HPO3) + 0.44 OH- + 1.44 H2O (Ferrer et al, 2007) HPO3= Poli-p C2H4O2= Acido acético C5H7NO2= Biomasa GAO Condiciones anaerobias C2H4O2 + 1.12CH10/6O5/6 → PHA(1.358PHB + 0.456PHV + 0.0367PH2MV) + 0.27CO2 (Oehmen et al, 2005) Condiciones aerobias 4/3CH1.5O0.5 + 4/6 ATP + 5/6 H2O → CH10/6O5/6 (Oehmen et al, 2005) CH10/6O5/6 = Glicógeno CH1.5O0.5 = PHA Desnitrificantes 6NO3- + 2CH3OH → 6NO2- + 2CO2 + 4H2O (Ferrer et al, 2007)

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6NO2-+ 3CH3OH → 3N2 + 3CO2 + 3H2O + 6OH-

(Ferrer et al, 2007)

CH3OH= Metanol Bacterias: Paracoccus.- Fuentes de carbono: glicerol, glucosa, succinato, citrato, acetato, etanol, metanol, formiato (Takaya et al., 2003). Azoarcus y Taurea.- Tienen una amplia gama de acidos grasos de cadena corta como fuente de carbono como el acetato (Morgan et al., 2008) y metanol (Hagman, 2008). Thiobacillus.- Su fuente de carbono son compuestos inorgánicos (Kelly et al., 2000). Reaccion enzimática que se realiza por las desnitrificantes es (Sunil et al., 2010): Nitrato reductasa NO3-

→

Nitrito Oxido nitrico Oxido nitroso reductasa reductasa reductasa

NO2-

→

[NO]

→

N2O

→

N2

Metanotrofas CH4 + 1.02 O2 + 0.786 NO3- +0.786 H+ → 0.393 N2 + 2.39 H2O + CO2 (Modin et al., 2007) Metanogénicas Bacterias: Hidrogenotrofas H2 + CO2 + formato según especies → CH4 (García, 1991) Grupo Methanomicrobiales y Methanobacteriales (Methanobrevibacter) Acetoclásticas Acetato + según especies H2 + CO2 + Formato, Metanol y Metilaminas → CH4 (García, 1991) Grupo: Methanosarciales Metilotroficas Metanol + Metilaminas → CH4 (García, 1991) Grupo: Methanobacteriales (Methanobacterium) Hidrogeno-metilotrófica H2 + Metanol → CH4 (García, 1991) Grupo: Methanobacteriales (Methanosphaera) Alcoholotróficas CO2+ alcohol (2-propanol, 2-butanol, etanol) (García, 1991) Grupo: Methanobacteriales (Methanobacterium)

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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biológicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestión Anaerobia

Methanomicrobiales (Methanogenium, Methanocorpusculum, Methanospirillum) Sulfato Reductoras (SRB) CH3COO- + SO42- → HS- + 2HCO3- (Hidalgo et al., 2001) 4H2 + H+ + SO4 2- → HS- + 4H2O (Hidalgo et al., 2001) Pueden tener variedad de aceptores de electrones, tales como tiosulfato (S2O32-); sulfito (SO32-); azufre y nitrato, de hecho pueden usar el Fe (III) y disproporcionar compuestos de azufre (Ravanschlag et al., 2000). Como fuente de carbono usan una variedad de ácidos grasos volátiles, alcoholes y compuestos aromáticos. Sin embargo en el ciclo del azufre podemos encotrar una gran variedad microorganismos, tales como Thiobacillus y Paracoccus.

de

Procesos que ocurren en el ciclo del azufre (Kelly, 1999; Kelly et al., 2000; Peréz. 2008): Oxidación del azufre Este proceso consiste en: H2S → S0→ SO42Las reacciones de la sulfuro oxidación son: H2S+1/2 O2 → S0 +H2O S0+3/2 O2 +H2O → SO4H4 Algunas bacterias que realizan este proceso son: Thiobacillus S2- → S0 S2- + 3H2O → SO32- +6H+ + 6e- →SO42Paracoccus S2O3 2-- +2 O2+ H2O→ 2SO4 2- + 2H+ El paso del tiosulfato a sulfato puede darse de dos maneras estas son: →S0 → SO42S2O32→SO32- + SO42S2O32- = Tiosulfato SO32= Sulfito

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Reducción del Azufre Este proceso es el paso de un compuesto oxidado a otro menos oxidado: SO4- - → H2S S0 → H2S SO4 -- →R-SH→H2S Reacciones de la sulfato reducción: H2+SO4 2→ H2S+2H2O+OH CH3COOH+2H2O+S0→4 H2S+2CO2 CH3COOH= Ácido acético Estas reaciones son las de las SRB. Desproporción del Azufre (algunas SRB) S2O3 2-+ H2O → SO4 2- + H2S 4SO3 2- + 2H+ → 3SO4 2- + H2S 4S0+2H2O + MnO2→ 3H2S+SO42- +2H+ + Mn2+ + 2OH-

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