Sebenta de Biologia Molecular da Celula Joao Milhano .pdf

FACULDADE DE MEDICINA DE LISBOA Mestrado Integrado em Medicina 2012/2013

Biologia Molecular da Célula Módulo I.I – Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento Humano e Genética

João Coutinho de Almeida Milhano 14651

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SEBENTA DE BIOLOGIA MOLECULAR DA CÉLULA João Coutinho de Almeida Milhano

ÍNDICE INTRODUÇÃO......................................................................................................................................... 4 BLOCO 1: INTRODUÇÃO À CÉLULA ......................................................................................................... 5 BLOCO 2: GENES, GENOMA E ENGENHARIA GENÉTICA .......................................................................... 5 DNA E CROMOSSOMAS............................................................................................................................ 6 TRANSCRIÇÃO ........................................................................................................................................ 8 CONTROLO DA TRANSCRIÇÃO ................................................................................................................... 11 TRADUÇÃO .......................................................................................................................................... 11 CONTROLO DA TRADUÇÃO ...................................................................................................................... 13 ENGENHARIA GENÉTICA .......................................................................................................................... 13 BLOCO 3: MEMBRANAS E COMPARTIMENTOS INTRACELULARES ........................................................ 14 PROTEÍNAS MEMBRANARES ..................................................................................................................... 14 ORGANELOS MEMBRANARES .................................................................................................................... 15 TRANSPORTE VESICULAR ......................................................................................................................... 20 VIAS DE SECREÇÃO ................................................................................................................................ 23 BLOCO 4: A ORIGEM DA VARIAÇÃO GENÉTICA..................................................................................... 28 BLOCO 5: RELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO ........................................................................................... 28 REPLICAÇÃO DO DNA ............................................................................................................................ 28 REPARAÇÃO DO DNA ............................................................................................................................ 31 RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA ................................................................................................................... 34 ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVEIS E VÍRUS..................................................................................................... 35 BLOCO 6: IMUNOLOGIA ....................................................................................................................... 37 DIVERSIDADE DE VRM ........................................................................................................................... 37 DESENVOLVIMENTO DE CÉLULAS B ............................................................................................................ 38 DESENVOLVIMENTO DE CÉLULAS T............................................................................................................. 39 DOENÇAS ............................................................................................................................................ 40 BLOCO 7: DIFERENÇAS GENÉTICAS ENTRE O HOMEM E A MULHER...................................................... 42 MEIOSE .............................................................................................................................................. 42 DIFERENÇAS GENÉTICAS .......................................................................................................................... 44 DNA MITOCONDRIAL ............................................................................................................................. 45 BLOCO 8: DOS GENES AO ORGANISMO................................................................................................ 48 CONTROLO DA TRANSCRIÇÃO ................................................................................................................... 49 PROCESSAMENTO DE MRNA TRANSCRITO ................................................................................................... 52 CONTROLO DA DEGRADAÇÃO DE MRNA ..................................................................................................... 52 CONTROLO DA TRADUÇÃO ...................................................................................................................... 53 ACTIVAÇÃO DE PROTEÍNAS....................................................................................................................... 54 BLOCO 9: PROLIFERAÇÃO E MORTE CELULAR....................................................................................... 55 SISTEMAS DE CONTROLO DO CICLO CELULAR................................................................................................ 56 FASE S ............................................................................................................................................... 58 FASE M .............................................................................................................................................. 60 CONTROLO DO NÚMERO E TAMANHO DAS CÉLULAS ........................................................................................ 61 CANCRO ............................................................................................................................................. 66

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SEBENTA DE BIOLOGIA MOLECULAR DA CÉLULA João Coutinho de Almeida Milhano BLOCO 10: CITOESQUELETO ................................................................................................................. 68 MICROTÚBULOS ................................................................................................................................... 68 FILAMENTOS INTERMÉDIOS ...................................................................................................................... 71 FILAMENTOS DE ACTINA OU MICROFILAMENTOS ........................................................................................... 73 ANEXO A: AULAS TEÓRICO-PRÁTICAS .................................................................................................. 77 AULA TEÓRICO-PRÁTICA 1: MOLÉCULA DE DNA E CLONAGEM MOLECULAR........................................................ 77 AULA TEÓRICO-PRÁTICA 2: TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE ................................................................... 77 AULA TEÓRICO-PRÁTICA 3: TÉCNICA DE PCR ............................................................................................... 78 AULA TEÓRICO-PRÁTICA 4: SEQUENCIAÇÃO DE DNA ..................................................................................... 79 AULA TEÓRICO-PRÁTICA 5: TÉCNICAS DE DETECÇÃO DE PROTEÍNAS E ÁCIDOS NUCLEICOS....................................... 79 AULA TEÓRICO-PRÁTICA 6: ANEMIA DE FANCONI ......................................................................................... 79 AULA TEÓRICO-PRÁTICA 7: TESTES GENÉTICOS ............................................................................................ 80 AULA TEÓRICO-PRÁTICA 8: DIAGNÓSTICO E MONITORIZAÇÃO DO DOENTE COM HIV ............................................. 81 ANEXO B: TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR E CELULAR ................................................................. 82 MICROSCOPIA ...................................................................................................................................... 82 DIFRACÇÃO POR RAIOS-X........................................................................................................................ 83 ELECTROFORESE ................................................................................................................................... 83 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ....................................................................................................... 84 DETECÇÃO DE PROTEÍNAS E ÁCIDOS NUCLEICOS ........................................................................................... 86 TÉCNICA DO DNA RECOMBINANTE (RDNA) ................................................................................................ 88 SEQUENCIAÇÃO DE DNA ........................................................................................................................ 89

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INTRODUÇÃO Antes de mais: muitos parabéns. Se estás a ler esta sebenta, é porque conseguiste entrar na melhor faculdade: a FMUL. O curso de Medicina, no primeiro ano (pelo menos, é o único do qual tenho experiência para falar), consegue ser bastante árduo. Prepara-te para o que aí vem! No entanto, posso garantir que as cadeiras difíceis, aquelas que te desafiam, aquelas cujas notas finais até querias que fossem melhores porque te esforçaste, são as mais interessantes. E, talvez por isso, eleves tanto as tuas expectativas. Primeiro conselho: dedica-te a aprender. Sim, as notas são importantes e deves tentar lutar pela melhor possível mas se no fim não te lembrares das bases, de que te serviu? Bem, mas falemos de Biologia Molecular da Célula (vulgo BMC). Se gostaste de Biologia no 12.º ano e ao longo do secundário, fantástico. Se não, bem, prepara-te para o maior banho celular que vais  apanhar…  Agora  a  sério,  BMC  é  das  cadeiras  que  parecem  mais  fáceis  ao  início  porque  já  falaste de DNA e cromossomas. Mas não é. É muito interessante mas puxa por ti. Especialmente a Carmo.  Sim,  a  pessoa  que  vos  aparecer  à  frente  é  “A”  Carmo  e  não  “O”  Carmo  (depois  perceberás  a   razão deste esclarecimento). As aulas dela são muito muito boas. São, por experiência (e arrependimento), das poucas teóricas às quais vale a pena assistir. Até porque (segundo conselho!) as perguntas do exame final andam muito à volta dos pormenores que ela vai debitando nas aulas. Vão. Os slides são normalmente disponibilizados antes da aula por isso até os podem levar e apontar ao lado os pormenores dela. Ora, era aqui mesmo que queria chegar. Esta  “sebenta”  não  é  bem  uma  sebenta.  Ela  é  a  transcrição  de  uns  resumos  que  fiz  ao  estudar   para o exame de BMC de 2.ª fase e que achei que poderiam dar um bom apanhado geral da matéria. Por isso, ela foi feita para vocês, caloiros, a levarem para as teóricas (e também teóricopráticas, já que um dos anexos é um resumo do que têm de saber das teórico-práticas) e apontarem ao lado os pormenores dela. Sigam este conselho. Há coisas que mudam todos os anos, nomeadamente os exemplos que a Carmo usa para explicar alguma parte da matéria e que ela depois aproveita para o exame. A sebenta está organizada por Blocos, já que é assim que a Carmo organiza as aulas dela. Se detectarem algum erro, científico ou ortográfico, ou se tiverem alguma sugestão a fazer, contactem-me por email ([email protected]). Atenção, o Acordo Ortográfico não conta (sou  da  ‘velha  guarda’). Em termos de agradecimentos, tenho alguns a fazer. Ao Ricardo, à Cat e à Teresa: obrigado por me terem aturado neste ano de stress (meu e vosso). Vos adoro como pessoas. Ao padrinho mais nervoso, inseguro e hilariante: obrigado, João. À bibliografia que mais consultei enquanto eu próprio estudava: obrigado, Rafael e Raminhos (não sei se isto vos irá alguma vez chegar mas ficam aqui feitos). À principal autora do anexo sobre Técnicas de Biologia Molecular e Celular: obrigado, Catarina (minha outra metade da unidade funcional de RP). À fornecedora de apontamentos das teóricas: obrigado, Mafalda. À minha revisora científica: obrigado pela tua paciência e disponibilidade, Catarina. Aos Mega! Estejam onde estiverem, foram a melhor turma que podia ter no primeiro ano. Ao melhor tutor desta faculdade (sim, está ocupado e não, ele não aceita mais ninguém): obrigado por tudo, David. À melhor pessoa com quem fritar: obrigado, Rambo. Finalmente,  gostaria  só  de,  tal  como  Camões,  oferecer  a  minha  “obra”.  Esta  é  para  ti,  O.

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BLOCO 1: INTRODUÇÃO À CÉLULA BLOCO 2: GENES, GENOMA E ENGENHARIA GENÉTICA

Microscopia: surge no século XVII, com Robert Hooke. Teoria celular: postulada por Schleiden e Schwann, em 1839. → A célula é a unidade básica, estrutural e funcional dos seres vivos; → Todas as células provêm de células pré-existentes; → A célula é a unidade de hereditariedade, reprodução e desenvolvimento dos seres vivos. Seres procariontes: seres muito simples, unicelulares, desprovidos de organelos e de membrana nuclear (não têm núcleo! É o que os identifica como procariontes!). Poderão ter uma cápsula, semelhante à parede celular, que envolve a membrana celular. Seres eucariontes: seres cujas células apresentam núcleo individualizado, delimitado por uma membrana nuclear. Podem ser unicelulares (como as leveduras) ou pluricelulares. Existem organelos que desempenham uma acção especializada. → Núcleo: fechado pela membrana nuclear, ou envelope nuclear, ou invólucro nuclear (bicamada lipídica que invagina sobre si própria, permitindo a formação de uma membrana nuclear interna e de uma membrana nuclear externa) e contém moléculas de DNA (informação genética do indivíduo). São visíveis cromossomas durante a mitose ao MOC (microscópio óptico composto). → Mitocôndria: revestida por duas membranas, uma interna e uma externa, que delimitam um espaço intermembranar. A interna invagina para o interior do organelo, formando cristas mitocondriais. Contém DNA próprio (mtDNA) e consegue replicar-se independentemente. Terá sido uma bactéria aeróbia que não sofreu heterofagia, vivendo assim em endossimbiose. É responsável pela obtenção de energia celular (produção de ATP através do catabolismo glicídico e também lipídico). Consome oxigénio e liberta dióxido de carbono. → Retículo endoplasmático: conjunto de cisternas achatadas, túbulos e vesículas que forma um sistema contínuo entre o invólucro nuclear e a membrana plasmática. Existem duas formas: o rugoso (maior região de síntese de proteínas, possuindo ribossomas ligados à sua face externa/citoplasmática) e o liso (síntese de fosfolípidos e, sobretudo, elaboração de novas membranas). → Aparelho de Golgi: conjunto de todos os dictiossomas (sáculos ou cisternas achatadas na periferia das quais partem vesículas). Tem uma face convexa – Golgi cis (fase de formação), virada para o retículo, e uma face côncava – Golgi Página 5 de 89

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→

→ → → →

trans (fase de maturação), virada para a membrana plasmática. Está envolvido na síntese e secreção de diversas substâncias, como glicoproteínas e polissacarídeos. Importante local de modificações pós-traducionais, tornando funcionais certas proteínas, como enzimas. Lisossoma: vesícula que contém vários tipos de enzimas, como as hidrolases e a β-glucocerebrosidase. Formam-se no Golgi trans e podem unir-se a vesículas endocíticas (formando um vacúolo digestivo), onde ocorre digestão (heterofagia). São também responsáveis pela digestão dos próprios organelos (autofagia). Peroxissoma: vesícula com um ambiente interno propício a reacções de síntese/degradação de peróxido de hidrogénio (H2O2). Citosol: espaço entre os organelos, preenchido por água, iões, aminoácidos, precursores de ácidos nucleicos, enzimas e proteínas. Membrana plasmática: ver BLOCO 3. Citoesqueleto: ver BLOCO 10.

DNA e Cromossomas Reconhecimento do DNA como portador da informação genética, sendo a sua estrutura determinada por James Watson e Francis Crick (1953), pelo método da difracção por raios-X (ver ANEXO B). DNA: macromolécula com duas longas cadeias polinucleotídicas dispostas em hélice e ligadas por pontes de hidrogénio. Os nucleótidos são compostos azotados de oses: açúcar com cinco carbonos – pentose, sendo que no DNA é a desoxirribose e no RNA é a ribose; um grupo fosfato (PO43-); uma base azotada, que permite distinguir quatro tipos de dNTPs: → Adenina (A) → Guanina (G) → Timina (T) → Citosina (C) A adenina e a guanina são bases púricas/purínicas/de anel duplo e a timina e a citosina são bases pirimídicas/de anel simples. Existe complementaridade de bases: emparelhamento de nucleótidos de Adenina com os de Timina (A=T) e dos nucleótidos de Guanina com os de Citosina (G≡C). Daí se retira a Regra de Chargaff: A+G ≈1 T+C

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Os nucleótidos de uma mesma cadeia ligam-se entre si através de ligações fosfodiéster,   sendo   estas   estabelecidas   entre   o   grupo   fosfato   (carbono   5’)   e   a   pentose   (grupo  hidroxilo  do  carbono  3’),  formando  o  sugar-phosphate backbone. Estas ligações conferem polaridade ao DNA, permitindo a distinção de duas extremidades: extremidade   5’ (fosfato) e extremidade   3’ (grupo hidroxilo). As cadeias são antiparalelas (orientam-se com polaridades inversas), permitindo a formação da dupla hélice. Esta conformação é favorável visto que as bases azotadas, hidrófobas, são protegidas do contacto com a água, encontrando-se no núcleo da dupla hélice. Gene: unidade fundamental da hereditariedade. É um segmento de DNA que codifica informação que leva à produção de uma proteína (ou polipéptido ou péptido) ou RNA não codificante. Inclui regiões que antecedem e que sucedem a região codificante, bem como sequência que não são traduzidas (intrões) que estão intercaladas com segmentos codificantes (exões), que se mantêm na sequência de RNA maduro e poderão ser traduzidos. Existem, no ser humano, cerca de 25.000 genes. Genoma: sequência nucleotídica completa presente nos 24 cromossomas humanos (22 autossomas e 2 heterossomas/cromossomas sexuais). É constituído por cerca de 3,2x109 nucleótidos (cromatina), sendo que apenas 2% é composta por exões e sequências reguladoras. Cariótipo: disposição de todos os 46 cromossomas humanos. Cromossoma: estrutura condensada do DNA encontrando-se este associado a proteínas: histonas e proteínas não-histonas. O complexo de histonas (H2A, H2B, H3 e H4) é responsável pela formação dos nucleossomas, devido à sua carga positiva. As regiões que contêm genes expressos estão menos compactadas. → Heterocromatina: forma mais condensada da cromatina, geralmente associada aos telómeros e centrossomas. Resulta de uma modificação sobretudo na cauda da histona H3 que compacta genes que não são ou são menos expressos. A condensação é promovida, por exemplo, por histona-deacetilases (HDAC ou HD). → Eucromatina: forma descondensada da cromatina. Permite uma maior acessibilidade a proteínas e a factores de transcrição. A descondensação é promovida, por exemplo, por histona-acetiltransferases (HAT), que adicionam grupos acetil a resíduos de lisina. No genoma humano, distinguem-se dois tipos de elementos genéticos: → Sequências únicas Genes (intrões e exões); Sequências reguladoras. Página 7 de 89

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→ Sequências repetidas Genes duplicados; Repetições simples; Elementos genéticos móveis (LINEs – Long-interspersed nuclear elements, SINEs – Short-interspersed nuclear elements, transposões e retrotransposões); Elementos retrovirais. Polimorfismo: alteração genética presente em mais de 1% da população. Distinguese da mutação por esta se verificar em menos de 1% da população. SNP (single-nucleotide polymorphism): polimorfismos mais frequentes no DNA que envolvem a modificação de apenas um nucleótido. Tratam-se de substituições, sendo que também podem tratar-se de inserções ou delecções em casos mais raros. Possuem dois alelos, sendo que podem causar alterações nas sequências de restrição enzimática (sequências que podem ser reconhecidas por determinadas enzimas de restrição), originando fragmentos de restrição de comprimento variável (RFLP). Alguns SNPs relacionam-se com sequências associadas a metabolismos, podendo causar respostas diferentes de pessoa para pessoa à mesma dose do mesmo fármaco.

Transcrição Dogma central da Biologia Molecular: quando é necessária uma proteína, a sequência de nucleótidos do DNA é copiada para sequências de RNA que irão produzir, através dos ribossomas, cadeias polipeptídicas que irão originar proteínas. Isto acontece em todas as células. Transcrição: copiar a sequência de DNA em RNA. → Abertura e desenrolar de uma pequena porção de DNA. → Uma das cadeias actua como molde para síntese de RNA. → Adição de ribonucleótidos à cadeia de RNA (RNA não se liga por pontes de hidrogénio ao DNA; à medida que os ribonucleótidos são adicionados, o RNA desliga-se e o DNA volta a enrolar). RNA polimerase: catalisa a formação de ligações fosfodiéster que unem os ribonucleótidos. Move-se ao longo da cadeia de DNA, desenrolando a hélice. A união dos nucleótidos faz-se no sentido  5’→3’, utilizando energia de ribonucleótidos trifosfatados. Em eucariotas, existem três tipos, responsáveis pela transcrição de diferentes classes de RNA: Página 8 de 89

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→ RNA polimerase I e III: tRNA, rRNA e RNA de importância estrutural e catalítica. → RNA polimerase II: maioria dos genes da célula. A forma como as RNA polimerase procariota e eucariota actuam é diferente: → Procariotas Adesão pouco intensa ao DNA; Desliza até encontrar o promotor (sequência de reconhecimento para o qual tem afinidade e que indica o ponto de partida); Ligação do factor  σ, abrindo a dupla hélice; Escolha da cadeia-molde (liga-se às duas cadeias, sendo que fica bloqueada aquela com quem estabelece uma ligação mais forte); Solta-se o factor σ e dá-se elongação da cadeia de RNA, por complementaridade; Encontra o sinal terminador: solta-se o complexo (liga-se um factor σ e procura novo promotor).

Figura 1 – Ciclo de transcrição da RNA polimerase bacteriana.

→ Eucariotas Dependente de factores de transcrição: proteínas acessórias que se reúnem ao nível do promotor (TATA box, é uma sequência constituída sobretudo por T e A, estando a montante do local de início da transcrição), posicionam a polimerase, abrem a dupla hélice, expõem a cadeia molde e activam a RNA polimerase. Ligam-se a uma proteína mediadora. Ligação do factor TFIID: causa uma distorção no DNA que serve como local de referência para outras proteínas. Fosforila o complexo enzimático, activando-o (tem actividade de cinase). Página 9 de 89

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Sequências reguladoras dispersas ao longo do DNA, separadas por mais de 100.000 nucleótidos: gene é controlado por várias sequências reguladoras. Transcrição no núcleo: maturação do pré-mRNA. Capping – adição de uma guanina metilada à  extremidade  5’  (quando a cadeia formada já tem 25 nucleótidos); Poliadenilação – clivagem  da  extremidade  3’,  adicionando-lhe uma cauda poli-A; Splicing – remoção dos intrões e aglutinação dos exões. Identificação de sequências de consenso de splicing perto dos intrões, sobretudo nas extremidades, e que são iguais em todos os intrões. Clivagem da sequência não-codificante através da reacção entre uma adenina e a extremidade 5’  do  intrão,  formando-se um anel que é removido e ligando-se as extremidades dos exões. catalisado pelo spliceossoma, constituído por proteínas e snRNA (small nuclear RNA). O splicing alternativo permite produção de proteínas diferentes a partir do mesmo gene, a partir da junção de exões de várias maneiras (vários mRNA a partir do mesmo pré-mRNA). Faz-se por ligação de um repressor a sequências de consenso de splicing, que bloqueia a ligação de factores do spliceossoma. Migração para o citoplasma: Ligação de um receptor de transporte nuclear (factor de exportação); Troca  do  5’  cap por um factor de iniciação da síntese proteica. Depois de usado, o mRNA é degradado: encurtamento da cauda poli-A, remoção  do  5’  cap e degradação através de nucleases.

Figura 2 – Transcrição em Eucariotas.

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Controlo da Transcrição → Ver BLOCO 8 Tradução Tradução: descodificação da linguagem nucleica em linguagem proteica. Baseia-se no código genético, que é: → Universal: todos os organismos o respeitam; → Redundante: mesmo aminoácido é codificado por codões diferentes; → Não ambíguo: um codão codifica um e um só aminoácido. Codão: tripleto de mRNA. Anticodão: tripleto de tRNA, complementar ao codão. Codogene: tripleto de DNA, complementar ao codão. tRNA: RNA de transferência. Tem uma forma de trevo tridimensional, adquirindo duas porções específicas: → Anticodão: três nucleótidos complementares aos do mRNA. → Extremidade  3’-OH: local de ligação do aminoácido ao tRNA. A reacção é catalisada pela aminoacil-tRNA sintetase, existindo uma isoforma para cada aminoácido. Estabelece-se uma ligação forte, através da hidrólise de ATP. Ribossoma: complexo proteico associado a rRNA (RNA ribossomal). É constituído por duas subunidades proteicas: menor (correspondência entre tRNA e codões de mRNA) e maior (ligações peptídicas entre os aminoácidos na cadeia polipeptídica). Cada ribossoma, responsável pela captura e posicionamento de tRNA e ligação entre aminoácidos, contém um local de ligação à molécula de mRNA e três para monitorização de tRNA: → Local A: ligação ao tRNA; → Local P: ligação ao aminoácido; → Local E: ejecção do tRNA, após ligação do aminoácido à cadeia em formação.

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Etapas da tradução → Ligação do tRNA de iniciação (transporta metionina) à pequena subunidade do ribossoma, com factores de iniciação da tradução, no local P. → Ligação da pequena subunidade ao 5’  cap do mRNA. → Movimentação ao longo do mRNA, à procura do primeiro codão AUG. → Dissociação dos factores de iniciação, ligando-se as duas subunidades do ribossoma. → Elongação: ligação de um novo tRNA ao local A; formação da ligação peptídica; avanço de três nucleótidos, à conta da hidrólise de GTP. → Alcança-se um codão stop (UAA, UAG, UGA) que é reconhecido por um tRNA não ligado a aminoácido. → Ligação de factores de libertação ao codão stop que alteram a peptidil-transferase (adição de água – é necessária água!). → Dissociação de todo o complexo, libertando-se a cadeia polipeptídica no citosol. Em eucariotas, dão-se alterações pós-traducionais: → Estruturais: folding das proteínas na sua estrutura nativa, através de chaperones. → Modificações covalentes: fosforilações. → Ligação a co-factores → Associação a outras proteínas

Figura 3 – Etapas da Tradução.

Por cada molécula de mRNA traduzida, existem duas regiões não-traduzidas, as UTR: → 5’  UTR: nucleótido +1 → codão de iniciação; → 3’  UTR: codão stop → cadeia poli-A. Diferenças para os PROCARIOTAS → mRNA   sem   5’   cap: os ribossomas ligam-se a sequências de Shine-Dalgarno (sequências de seis nucleótidos que antecedem o codão AUG, podendo ligar-se directamente ao codão de iniciação). → Não necessitam de factores de iniciação. → mRNA policistrónico: mesma molécula de mRNA codifica vários tipos diferentes de proteínas.

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Polirribossoma: amplificação e economização da tradução através da leitura do mesmo mRNA por vários ribossomas.

Controlo da Tradução → Ver BLOCO 8 Engenharia Genética → Ver ANEXO B

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BLOCO 3: MEMBRANAS E COMPARTIMENTOS INTRACELULARES

Membrana plasmática: bicamada fosfolipídica associada a proteínas, assumindo a sua importância como barreira fomentadora de consistência celular. Impede o extravasamento da célula e fornece-lhe forma. Em eucariontes, existem várias membranas internas que delimitam e constituem organelos celulares. Os lípidos nas membranas (fosfolípidos) são moléculas anfipáticas visto que na mesma molécula combinam uma porção hidrofílica (contém grupos polares; estabelecem atracções electrostáticas ou pontes de hidrogénio com a água, dissolvendose nela) e uma porção hidrofóbica (grupos apolares, não estabelecendo interacções favoráveis com água). O conflito entre forças hidrofílicas e hidrofóbicas é resolvido pelo efeito entrópico, através da formação de uma dupla camada, na qual as porções hidrofílicas estão em contacto com a água e as hidrofóbicas estão em contacto umas com as outras (face interna da dupla camada). Na membrana, os fosfolípidos ainda se encontram ligados entre eles por forças de Van der Waals. A membrana não é estável: as moléculas trocam de lugar na própria camada (difusão lateral) e entre as duas camadas (flip-flop), podendo ainda ocorrer movimentos de rotação no próprio fosfolípido. A fluidez da membrana depende de factores como temperatura, pH e composição da membrana (teor em colesterol - ↑[colesterol] = ↑ rigidez e ↓ permeabilidade). As duas faces da bicamada apresentam conjuntos diferentes de fosfolípidos. Os novos fosfolípidos que são introduzidos na face citosólica da membrana têm de ser transferidos para a face extracelular. Esse processo é catalisado por flipases.

Proteínas membranares

As proteínas membranares desempenham importantes funções, tais como transporte de moléculas, ancoragem de moléculas à membrana, reconhecimento de sinais químicos do meio e actividade enzimática. Dependendo do tipo de membrana e função celular, o conjunto de proteínas membranares é diferente e reflecte a especialização funcional da membrana. → Proteínas transmembranares: atravessam a membrana de um lado ao outro (porção hidrofóbica em contacto com as porções hidrofóbicas da membrana). Podem ser α-hélices ou barris-β. Página 14 de 89

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→ Proteínas associadas a monocamada: ancoradas à superfície citosólica por uma α-hélice anfipática. → Proteínas ligadas a lípidos: ligadas a um dos lados da membrana através de ligações covalentes a moléculas lipídicas. → Proteínas associadas a proteínas: ligadas por ligações relativamente fracas (não covalentes) a outras proteínas de membrana. Porinas: proteínas responsáveis pela formação de poros na membrana (especialmente na mitocôndria), permitindo a passagem de pequenos iões e nutrientes e prevenindo a entrada de moléculas maiores, como antibióticos e toxinas. A sua estrutura nativa é barril- β. Córtex celular: rede de proteínas associadas a proteínas transmembranares, encontrando-se na superfície citosólica da membrana. Tem como principais funções: manutenção da forma da célula, resistência mecânica da célula, locomoção celular e impedimento da saída de determinadas proteínas através da membrana. No caso específico dos eritrócitos, o seu córtex é constituído maioritariamente por espectrinas, estando ligadas à membrana através de proteínas de ancoragem intracelulares. Uma deficiência nas espectrinas faz com que os eritrócitos apresentem forma esférica (esferocitose), sejam frágeis e surjam em pequenas quantidades (anemia, pela diminuição consequente da concentração de hemoglobina no sangue, por haver menor número de eritrócitos). A superfície celular está revestida por glícidos, nomeadamente por glicoproteínas (proteínas associadas a oligossacarídeos), proteoglicanos (polissacarídeos associados a oligopéptidos) e glicolípidos, localizando-se na monocamada não citosólica, formando a camada glicídica. Esta camada protege a membrana de danos (mecânicos e químicos), lubrifica a célula e permite o reconhecimento e adesão por outras células. As lectinas são proteínas especializadas no reconhecimento de cadeias específicas de oligossacarídeos. São extremamente importantes em caso de resposta a infecções: os glícidos da membrana dos neutrófilos são reconhecidos por lectinas das células endoteliais próximas da infecção. O reconhecimento conduz à adesão dos neutrófilos aos vasos e à migração para o local de infecção (diapedese).

Organelos membranares

Organelos: estruturas membranares que contêm moléculas únicas e específicas para determinada função celular. A existência de uma membrana que os delimita permite a ocorrência de reacções que envolvem determinadas enzimas sem que haja interferência de outras reacções que ocorrem noutros compartimentos celulaPágina 15 de 89

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res. São eles a membrana nuclear, o retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi, a mitocôndria, os lisossomas, os peroxissomas e os endossomas. Aquando da divisão celular, os organelos têm de ser duplicados, sendo para isso necessárias novas moléculas, como proteínas. Essas proteínas têm de ser transportadas para o organelo correspondente. O sistema endomembranar recebe as proteínas via retículo endoplasmático, nomeadamente do rugoso. O invólucro nuclear e a mitocôndria recebem as proteínas produzidas no citosol, por importação. À excepção de proteínas produzidas na mitocôndria (via mtDNA), a síntese proteica inicia-se no citosol, sendo depois importadas para o organelo correspondente. O local para onde a proteína se vai dirigir depende de um sorting signal na sequência de aminoácidos.

1. Transporte por Poros Nucleares

Figura 4 – Transporte por Poros Nucleares.

Poro nuclear: estrutura proteica larga e complexa, altamente selectiva, que transporta activamente macromoléculas específicas e contém locais hidrofílicos que permitem a difusão livre de água e de pequenas moléculas.

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Sinal de localização nuclear: sequência de aminoácidos que sinaliza a direcção da proteína do citosol para o núcleo. Consiste numa sequência curta de aminoácidos carregados positivamente (lisinas e argininas). A estes sinais liga-se uma proteína citosólica específica, o receptor de transporte nuclear, que ajuda a proteína a atravessar o poro nuclear. O transportador liga-se a sequências de aminoácidos do poro, puxando até atingir o núcleo. Aí, dissocia-se da proteína e volta a atravessar o poro em direcção ao citoplasma. Este transporte é energeticamente alimentado pela hidrólise de GTP. Uma característica importante deste tipo de transporte é o facto de a proteína ser transportada dobrada (folded) na sua conformação final.

2. Transporte para a Mitocôndria

Figura 5 – Transporte para a Mitocôndria.

As proteínas importadas para a mitocôndria têm a sequência sinalizadora no seu Nterminal, sendo transportadas através das duas membranas simultaneamente, em locais específicos nos quais as duas membranas estão em contacto. Cada proteína tem de ser desdobrada (unfolded) à medida que é transportada e o seu sinal é removido depois do transporte. Mecanismo de transporte: a sequência sinalizadora é reconhecida por um receptor na membrana externa da mitocôndria. O complexo receptor-proteína difunde-se lateralmente na membrana até um local de contacto, onde a proteína é transportada simultaneamente através das membranas externa e interna, por meio de um translocador. Uma peptidase cliva o sinal. As chaperones ajudam no transporte e no rearranjo da conformação tridimensional da proteína após o transporte.

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Os fosfolípidos necessários ao crescimento e homeostasia mitocondriais são transportados individualmente por proteínas transportadoras de lípidos, que extraem fosfolípidos da membrana do retículo endoplasmático para a membrana mitocondrial.

3. Transporte para o Retículo Endoplasmático

Retículo endoplasmático (RE): local de entrada para proteínas destinadas a outros compartimentos celulares, exceptuando as do núcleo e as da mitocôndria, ou para a membrana plasmática e para o exterior da célula. Uma vez no lúmen do RE ou incorporadas na sua membrana, as proteínas já não saem para o citosol durante o seu percurso: são transportadas por vesículas de organelo em organelo. Existem dois tipos de proteínas que passam do citosol para o RE: → Proteínas hidrossolúveis: atravessam facilmente a membrana do RE, alcançando o seu lúmen. Podem ser posteriormente excretadas ou integradas no interior de outro organelo. → Futuras proteínas transmembranares: atravessam parcialmente a membrana do RE, ficando incorporadas na sua membrana. Farão parte da membrana do RE, da membrana plasmática ou da membrana de outro organelo. A sequência sinalizadora do RE é um pequeno segmento de aminoácidos hidrofóbicos que também está envolvido na translocação através da membrana. A maioria das proteínas que atravessam a membrana do RE não estão completamente sintetizadas, o que implica que o ribossoma se associe à membrana do RE (retículo endoplasmático rugoso). Existem, assim, dois tipos de ribossomas: associados ao lado citoplasmático do RE e livres no citoplasma.

Figura 6 – Ribossomas associados à membrana do RE e livres no citoplasma.

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SRP (signal-recognition particle): liga-se ao sinal da proteína quando esta é exposta no ribossoma e impede a continuidade da tradução. Na membrana do RE existe um receptor de SRP que irá reconhecer o SRP, o qual se desliga da sequência sinalizadora e abre um canal de translocação. Proteínas solúveis no lúmen do RE: → Ligação do SRP ao sinal, interrompendo a síntese proteica; → Ligação do SRP ao seu receptor; → Libertação do SRP, recomeçando a síntese proteica (proteína atravessa o canal de translocação rumo ao lúmen do RE); → Clivagem do sinal (peptidase de sinal), sendo este prontamente degradado e fechando-se o canal de translocação; → Assim que o C-terminal do polipéptido atravessa a membrana do RE, a proteína é libertada e dissemina-se no lúmen.

Figura 7 – Transporte de proteínas hidrossolúveis para o lúmen do RE.

Proteínas transmembranares → Em proteínas transmembranares, existe uma porção que se fixa na membrana. O início da translocação destas proteínas é igual ao início das proteínas hidrossolúveis. Todavia, estas proteínas possuem uma sequência de aminoácidos hidrofóbicos, designada por stop-transfer sequence. Quando esta sequência alcança o canal de translocação, no plano da bicamada lipídica, forma uma αhélice que ancora a proteína na membrana. Assim, o C-terminal localiza-se no lado citosólico da membrana do RE, enquanto o N-terminal fica no lado do lúmen. → Em proteínas cujos domínios atravessam mais do que uma vez a bicamada lipídica, existe um sinal interno, a start-transfer sequence, que é usado como Página 19 de 89

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início da translocação proteica, nunca sendo removido do polipéptido. Assim, a start-transfer sequence inicia a translocação que continua até se atingir a próxima stop-transfer sequence, ficando estas integradas na bicamada, onde estabelecem ligações com os lípidos (α-hélice).

Figura 8 – Translocação de proteínas transmembranares para a membrana do RE.

Transporte vesicular Para as proteínas atingirem os organelos, utilizam a translocação para o RE e, daí, partem para o aparelho de Golgi. Como? Por vesículas de transporte. Via secretória principal para fora da célula: membrana do RE → lúmen do RE → aparelho de Golgi → superfície celular. Via secretória principal para dentro da célula: membrana plasmática → endossomas → lisossomas. Cada vesícula tem de conter apenas as proteínas apropriadas ao seu destino e tem de fundir apenas com a membrana-alvo. Estes processos dependem de proteínas associadas à membrana da vesícula.

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Figura 9 – Vias secretórias principais.

Coated vesicles: vesículas que nascem de membranas com uma camada proteica na sua superfície citosólica. Esta camada é formada por coating proteins, como a clatrina. Após emergirem da membrana, perdem a sua camada proteica, permitindo a interacção directa com a membrana com a qual se vão fundir. Clatrinas: proteínas que se ligam a receptores de membrana, contribuindo para a formação de vesículas. As moléculas de clatrina associam-se em redor da superfície do organelo ou da superfície interna da célula, ligando-se aos receptores, e formam uma rede. Induzem a formação de uma curvatura que se vai afastando da membrana. A dinamina é uma proteína que hidrolisa GTP e que, juntamente com outras proteínas, corta a ligação entre a vesícula e a membrana de origem. A vesícula perde a sua capa de clatrinas e forma-se a vesícula de transporte. As clatrinas estão envolvidas no transporte do aparelho de Golgi para o meio extracelular e da membrana plasmática, numa via endocítica. No entanto, as clatrinas não têm capacidade de capturar moléculas a transportar. As adaptinas são outra classe de coating proteins, que mantêm as clatrinas unidas à membrana da vesícula e que ajudam na selecção de moléculas cargo para transporte, através da fixação do receptor. As adaptinas são específicas para cada organelo, reconhecendo apenas os receptores do organelo em que actuam.

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Figura 10 – Formação de vesículas endocíticas com redes de claterina.

Depois da libertação da vesícula, esta é transportada activamente por proteínas motoras que se movimentam ao longo do citoesqueleto. Quando chega ao alvo, a vesícula tem de ser reconhecida pelo organelo. O processo de identificação depende das proteínas Rab, que se encontram na superfície da vesícula e que são reconhecidas por tethering proteins na superfície citosólica da membrana-alvo. As Rab e as tethering proteins são também únicas e específicas de cada organelo e vesícula. SNAREs: família de proteínas transmembranares que conferem reconhecimento adicional. Assim que as tethering proteins capturam uma vesícula (através da ligação à Rab), as SNAREs da vesícula (v-SNARE) interagem com as SNAREs da membrana-alvo (t-SNARE), ancorando a vesícula na membrana. Após o docking, a vesícula tem de se fundir à membrana para exportar a sua carga. As SNAREs desempenham um papel importante nesse processo: depois de emparelharem, as v-SNAREs e as tSNARES enrolam-se uma na outra, exercendo uma força que obriga as moléculas de água a saírem do espaço de fusão (se a água ficasse no espaço, a reacção seria energeticamente desfavorável, visto haver porções hidrofóbicas envolvidas), o que favorece a fusão lipídica.

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Figura 11 – Reconhecimento e fusão de membranas, envolvendo Rab, tethering proteins e SNAREs.

Vias de secreção 1. Modificação covalente de proteínas no RE

Ligações dissulfito: oxidação dos pares de cisteínas das cadeias laterais. São importantes para a estabilização das estruturas proteicas que vão entrar em contacto com pH baixo ou enzimas hidrolíticas quer ao abandonarem a célula quer ficando na membrana da mesma. Têm poder redutor, pelo que não podem ser formadas no citoplasma. Glicosilação: ligação de proteínas a cadeias de oligassacarídeos, por ligação covalente, sendo convertidas a glicoproteínas. Este processo confere à glicoproteína várias funções, como protecção contra degradação, ancoragem ao RE para recuperar a sus estrutura ou transporte até ao organelo apropriado (vesícula de transporte). Quando estão na superfície celular, os oligossacarídeos fazem parte da camada glicídica, permitindo a distinção entre células. É um processo de maturação proteica. → Etapas da glicosilação Proteína está a ser translocada para o lúmen do RE; Oligossacarídeo ligado a um dolicol (lípido na membrana do RE); Liga-se ao grupo amina de uma asparagina da proteína do lúmen (oligosaccharide protein transferase); Página 23 de 89

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O processo termina no aparelho de Golgi, para onde a proteína migra (vesícula de transporte).

Figura 12 – Glicosilação de proteínas no lúmen do RE.

A acumulação de proteínas no RE induz a activação de um programa de transcrição, o UPR (unfolded protein response) que actua sobretudo quando os níveis de proteínas danificadas aumentam, impelindo a célula a produzir mais RE, recrutando toda a maquinaria molecular necessária para recuperar o folding apropriado e o processamento das proteínas. No aparelho de Golgi, os sinais glicídicos são alterados consoante o seu destino. Por exemplo, se uma proteína tem de ir para o lisossoma, o seu sinal glicídico é alterado de forma a que, no final, seja um sinal de manose 6-fosfato.

Figura 13 – Alterações dos sinais glicídicos no aparelho de Golgi.

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2. Exocitose

Figura 14 – Processos de Exocitose.

Exocitose: as proteínas abandonam o Golgi trans em vesículas de transporte para a membrana plasmática, onde se fundem, permitindo o crescimento desta (essencialmente quando está prestes a dividir-se) e levando lípidos e proteínas essenciais à membrana. → Secreção constitutiva: secreção contínua em todas as células de muitas proteínas solúveis. Esta via fornece continuamente à membrana lípidos e proteínas recém-sintetizados. → Secreção regulada: ocorre apenas em células especializadas. Proteínas específicas (hormonas, enzimas, muco, entre outras) produzidas no Golgi trans são acumuladas e armazenadas em vesículas. São libertadas após um estímulo provocado por um sinal extracelular, que estimula a fusão à membrana. É importante referir que o tamanho da célula não aumenta apesar do constante fornecimento de lípidos à membrana, provenientes das vesículas exocíticas. A manutenção do tamanho da membrana deve-se à remoção de porções equivalentes de membrana pela endocitose.

3. Endocitose

Endocitose: internalização de matéria por parte da célula, havendo formação de vesículas endocíticas. → Pinocitose: ingestão de fluidos e partículas pequenas, formando uma vesícula. A formação das vesículas é feita através das clatrinas, por invaginações da Página 25 de 89

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membrana celular. Depois da libertação das clatrinas, as vesículas fundem-se com endossomas. A pinocitose é realizada por todas as células. → Fagocitose: internalização de partículas de maiores dimensões (como microrganismos), formando-se fagossomas. Não existe intervenção de clatrinas, sendo um processo realizado por apenas algumas células (fagócitos ou células fagocitárias). O fagócito reconhece, com a ajuda de receptores, a partícula estranha, estando esta coberta por anticorpos ou proteínas do sistema de complemento 1 (opsonização). Através da emissão de prolongamentos citoplasmáticos (pseudópodes), o fagócito engloba a partícula a partícula, formando-se uma fagossoma que se funde com lisossomas, ocorrendo digestão intracelular. → Endocitose mediada por receptores: consiste numa pinocitose via vesículas revestidas por clatrinas; no entanto, é um processo com uma elevada especificidade. As macromoléculas a captar ligam-se a receptores de membrana e entram na célula como complexos receptor-macromolécula. Um exemplo deste tipo de endocitose é a captura de LDL. O LDL liga-se a receptores de membrana e é internalizado em vesículas de clatrina. As vesículas perdem o seu revestimento e fundem-se com endossomas. No ambiente ácido do endossoma, o LDL dissocia-se do receptor. Enquanto que o LDL permanece no endossoma e avança para o lisossoma (onde é degradado, libertando colesterol livre), os receptores são devolvidos à membrana, via vesículas de transporte, onde são reciclados.

Figura 15 – Endocitose mediada por receptores (exemplo do LDL).

Hipercolesterolémia familiar: doença autossómica dominante, caracterizada por níveis de colesterol séricos elevados (hipercolesterolémia), devido a deficiências nos receptores de LDL. Se o receptor de LDL não é normal, o colesterol acumula-se no 1

Sistema de complemento: o sistema complemento ajuda ou "complementa" a capacidade de anticorpos e células fagocíticas eliminarem agentes patogénicos. Faz parte do sistema imunitário inato. Consiste num conjunto proteínas encontradas no sangue, sobretudos sintetizadas no fígado, que normalmente circulam sob a forma de precursores inactivos.

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sangue (por não ser internalizado), o que aumenta a colesterolémia. Assim, por não entrar colesterol, a enzima HMG-CoA redutase, envolvida na síntese de colesterol, não é inibida, continuando a síntese. Aumenta ainda mais a colesterolémia, aumentando o risco para aterosclerose e, consequentemente, para enfarte do miocárdio e AVC. As estatinas são fármacos anti-dislipidémicos que se ligam aos centros-activos da HMG-CoA redutase, inibindo a síntese endógena de colesterol. Endossoma: principal local da via endocítica. Revela-se como um complexo conjunto de tubos membranares e vesículas interligadas. O seu interior é um meio ácido, sendo este mantido por uma bomba de protões ATPase que importa H+ para o lúmen do endossoma. A acidez faz uma triagem, decidindo qual o trajecto dos receptores após a sua entrada no endossoma: voltam ao mesmo domínio da membrana (reciclagem), fundem noutros locais da membrana (transcitose) ou dirigemse para o lisossoma (degradação). Lisossomas: vesículas originadas no aparelho de Golgi, contendo várias hidrolases. As enzimas hidrolíticas do lisossoma só actuam a baixo pH, o que protege a célula caso haja uma ruptura da membrana lisossomal. Apresentam transportadores na membrana para permitir a passagem do resultado da digestão. O meio ácido é mantido, de igual forma, por uma ATPase que bombeia H+. As enzimas e proteínas importadas pelo lisossoma são marcadas com manose 6-fosfato no RE e no Golgi cis. Os sinais de manose 6-fosfato são reconhecidos à saída do Golgi trans por receptores que vão induzir a formação de vesículas que originam/se fundem com lisossomas.

Figura 16 – Esquema de um lisossoma.

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BLOCO 4: A ORIGEM DA VARIAÇÃO GENÉTICA BLOCO 5: RELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO Existem, no organismo humano, 1012 células humanas sendo que, em cada uma delas, existe uma cópia do genoma, constituído por 109 pB. Devido a este tamanho, é bastante provável que ocorram erros e alterações que conferem variabilidade genética às populações.

Replicação do DNA

Replicação semi-conservativa: produção de duas duplas hélices completas a partir da molécula de DNA original, sendo cada nova hélice idêntica à dupla hélice original na sequência nucleotídica (excepto em casos de erro). Cada cadeia da hélice original serve de molde a uma nova cadeia, fazendo com que cada nova dupla hélice fique com uma cadeia original e uma cadeia recém-sintetizada. A molécula de DNA é muito estável, visto as bases azotadas das duas cadeias estarem unidas por pontes de hidrogénio. Para essas ligações se quebrarem, seria necessário atingirem-se a elevadas temperaturas, o que seria inconcebível para a célula. O processo de replicação inicia-se então através de DNA helicases, proteínas de iniciação que quebram ligações de hidrogénio, separando as duas cadeias. Origem de replicação: zona de separação inicial das cadeias, sendo marcada por sequências específicas de nucleótidos de adenina e timina, visto a ruptura de pontes de hidrogénio entre estes nucleótidos ser menos dispendiosa energeticamente (mais fácil quebrar A=T do que G≡C). Ao nível das origens de replicação, existem duas junções em forma de Y onde se dá a replicação propriamente dita: as forquilhas de replicação. As forquilhas movem-se nos dois sentidos da origem (processo bidireccional).

Figura 17 – Origem de replicação e abertura inicial das cadeias da dupla hélice.

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DNA polimerase: enzima preponderante e central do processo de replicação do DNA, sintetizando novas cadeias utilizando uma pré-existente como molde. Catalisa a adição  de  nucleótidos  na  extremidade  3’ da nova cadeia, através da formação de ligações  fosfodiéster  entre  o  grupo  OH  do  carbono  3’  do  antigo  nucleótido  e  o  grupo   fosfato   do   carbono   5’   do   novo   (sintetiza   no   sentido   5’   → 3’). Impõe-se uma questão: não existindo enzima que adicione nucleótidos no sentido 3’  → 5’, o que acontece à outra cadeia? Fragmentos de Okasaki: pequenos primers de RNA são adicionados à outra cadeia, por uma primase. A DNA polimerase liga-se a estes primers de RNA e catalisa fragmentos de DNA (Okasaki) até atingir o primer anterior, no sentido 5’   → 3’. Uma nuclease retira depois os primers de RNA, a sequência é lida para a detecção de erros e, caso não os haja, os fragmentos de Okasaki são unidos por uma ligase. A cadeia sintetizada continuamente é designada leading strand e necessita de apenas um primer. A cadeia sintetizada descontinuamente, por meio de fragmentos de Okasaki, é designada lagging strand, precisando de um primer por cada fragmento de Okasaki.

Figura 18 – Replicação do DNA. A cadeia sintetizada continuamente é a leading strand e a sintetizada descontinuamente (por fragmentos de Okasaki) designa-se de lagging strand.

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A DNA polimerase é extremamente precisa, cometendo apenas um erro a cada 107 nucleótidos que copia. No entanto, podem ocorrer erros de ligação (como G-T e CA) que, não sendo tão frequentes, têm de ser reparados. A DNA polimerase possui duas características que aumentam a exactidão na replicação do DNA: → Monitorização do emparelhamento de bases: apenas quando a complementaridade é bem estabelecida é que é catalisada a adição de um novo nucleótido. → Proofreading: mecanismo de correcção que ocorre ao mesmo tempo que a síntese de DNA. Antes de ser adicionado um novo nucleótido, a enzima confirma se o nucleótido anterior está correcta e apropriadamente colocado. Caso não esteja, a polimerase sofre uma alteração conformacional e, através de um domínio com função de nuclease, retira o nucleótido e tenta substituí-lo por outro. A DNA  polimerase  α comete muitos erros. No entanto, as DNA  polimerases  δ (lagging strand) e ε (leading strand) realizam proofreading por comparação com nucleótidos existentes. Na síntese da lagging strand, o DNA necessita de vários primers de RNA que não se ligam à cadeia-molde de forma contínua (existem intervalos entre eles). À extremidade   3’ do primer a DNA polimerase adiciona um desoxirribonucleótido (dNTP), continuando a elongação até ao primer seguinte. Posteriormente, a nuclease quebra as ligações entre o primer e a cadeia de DNA recém-sintetizada. O RNA é substituído por DNA (polimerase de reparação) e, finalmente, a DNA ligase une o fosfato 5’  do  novo  fragmento  de  DNA  ao  grupo  hidroxilo  3’  do  fragmento  seguinte. Single-strand binding proteins: após a acção da DNA helicase, mantêm a cadeia polinucleotídica simples alongada. Sliding clamp: mantém a cadeia molde ligada à DNA polimerase e permite o deslizamento da polimerase, como o próprio nome indica. Na leading strand é necessária apenas uma; na lagging strand é necessária uma por fragmento de Okasaki. A clamp loader hidrolisa ATP cada vez que a sliding clamp se associa ao DNA.. Na lagging strand, quando a forquilha de replicação se aproxima do fim do cromossoma, não há espaço para que se forme o primer de RNA, de modo a que se forme o último fragmento de Okasaki. Desta forma, seria de esperar a perda de uma porção do cromossoma cada vez que ocorresse replicação. Este problema é resolvido, nos eucariotas, pela existência de uma sequência específica de nucleótidos incorporada na extremidade dos cromossomas, as sequências teloméricas2. Estas sequências 2

Sequências teloméricas e não telómeros, visto que os telómeros não são apenas as sequências mas incluem também várias proteinas que lhes estão associadas.

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atraem a telomerase. Usando um molde de RNA que faz parte da própria enzima, a telomerase repõe os nucleótidos que são perdidos cada vez que o cromossoma se replica, adicionando múltiplas cópias da mesma curta sequência de DNA às extremidades do cromossoma. Esta multi-sequência actua como molde que permite que a replicação da lagging strand fique completa. Para além disso, os telómeros são reconhecidos como as extremidades reais dos cromossomas, permitindo a distinção entre estas e as quebras da dupla cadeia acidentais a meio dos cromossomas e que devem ser reparadas. A sequência dos telómeros humanos são 2.000 repetições da sequência TTAGGG.

Figura 19 – Actividade da telomerase.

Reparação do DNA

Mutação: alteração permanente no DNA, podendo ter consequências severas. Uma mutação que afecte apenas um par de nucleótidos pode comprometer gravemente a homeostasia de um organismo se essa alteração ocorrer numa posição vital da sequência de DNA. Drepanocitose/Anemia falciforme: doença que resulta de uma modificação genética no gene da beta-globina, num único nucleótido, alterando a sequência de aminoácidos da proteína. Os eritrócitos adquirem forma de foice, sendo a hemoglobina menos solúvel e formando precipitados fibrosos, o que confere aos eritrócitos a sua forma característica. Os eritrócitos falciformes têm dificuldades na difusão de oxigénio e são mais frágeis, lisando na corrente sanguínea. Estes pacientes terão eriPágina 31 de 89

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tropenia, o que causa fraqueza, tonturas, cefaleias, dor e falência orgânica. A mutação encontra-se nas células da linha germinativa, sendo por isso hereditária, sendo uma doença autossómica recessiva. Há assim uma necessidade de proteger as células da linha germinativa. Também as células somáticas têm de ser protegidas durante toda a vida do organismo (existe o risco de desenvolvimento de cancro). Apesar de a maioria dos erros ser prevenida pela maquinaria de replicação durante a replicação do DNA, a célula não está totalmente isenta de erros. Esses erros têm de ser reparados antes que se tornem permanentes. É esse o papel do complexo de reparação (DNA mismatch repair), que consegue reparar 99% dos erros. Detecta os erros e remove a porção afectada, sintetizando-a de novo. É importante referir que a reparação recai sobre a cadeia recém-sintetizada; caso contrário, a alteração propagar-se-ia nas replicações seguintes.

Figura 20 – Reparação do DNA. Na primeira situação, não há reparação e, por isso, a mutação é transmitida á descendência; na segunda situação, a reparação faz-se na cadeia-molde, o que também propaga a mutação; na terceira situação, a reparação faz-se na cadeia recém-sintetizada, o que repara o erro e evita a transmissão da mutação à descendência.

Quando se forma um erro, a geometria da dupla hélice é distorcida, sendo esta distorção reconhecida pelas proteínas do complexo de reparação, que removem parte da cadeia recémsintetizada. O espaço (gap) formado é substituído pela DNA polimerase que faz proofreading à medida que sintetiza uma nova cadeia e é fechado pela DNA ligase. Os nicks, mais frequentes na lagging strand, são usados como sinais que permitem a distinção entre a cadeia recém-sintetizada e a antiga, por parte das proFigura 21 – Complexo de reparação do DNA.

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teínas do complexo. Os nicks permanecem num curto espaço de tempo após a passagem da forquilha, pelo que o complexo tem de actuar rapidamente. O mecanismo do complexo de reparação envolve três etapas: → Reconhecimento e remoção do DNA danificado (nucleases); → Preenchimento do gap através da complementaridade de bases (polimerase); → União dos nucleótidos (ligase). Um tipo perigoso de dano no DNA ocorre quando ambas as cadeias da dupla hélice são afectadas, não deixando qualquer template intacto para guiar uma reparação apropriada. Estas modificações podem ser causadas por radiação ionizante, erros nas forquilhas de replicação, agentes oxidativos e metabolitos produzidos pelas células. Se estes danos não forem prontamente reparados, podem levar à fragmentação do cromossoma e à perda de genes quando a célula se dividir. Nonhomologous end joining: uma nuclease provoca uma delecção de uma curta sequência de nucleótidos nas extremidades originadas pela quebra das cadeias, sendo essas posteriormente unidas por uma ligase. A delecção poderá ser aceitável porque o genoma do ser humano contém apenas uma pequena parte de genes codificantes de proteínas. No entanto, também poderá ter consequências negativas, dependendo do que seja afectado.

Figura 22 – Nonhomologous end joining.

Xeroderma pigmentosum: doença causada por mutações em qualquer um dos nove genes que codificam proteínas de reparação. Assim, os organismos afectados são menos eficazes na reparação de danos provocados pela radiação UV, como os dímeros de timina. Consequentemente, desenvolvem-se lesões graves, sobretudo na pele, nomeadamente cancro devido à acumulação de mutações. Os indivíduos com Xeroderma pigmentosum têm um risco mil vezes maior de desenvolver cancro. Página 33 de 89

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Recombinação homóloga Recombinação homóloga: pode ser usado como processo de reparação do DNA quando este se encontra quebrado, não havendo perda de material genético, usando o cromossoma homólogo como molde.. Este mecanismo recorre à troca de informação genética entre um par de moléculas de DNA homólogas (contêm sequências de DNA similares entre si), constituindo também uma fonte de variabilidade genética. O processo é iniciado quando ambas as cadeias são quebradas logo após a replicação do DNA (nessa altura, as duas hélices ainda estão próximas). Para começar, a nuclease digere as extremidades  5’ a partir da região quebrada. Com a ajuda  de  enzimas  especializadas,  uma  das  cadeias  “invade”  a  cadeia  complementar,   formando ligações entre as bases azotadas. Se houver emparelhamento extenso, forma-se um branch point onde as cadeias homólogas se cruzam. Neste ponto, a DNA polimerase promove a elongação, usando a cadeia complementar como molde. O branch point migra ao longo da cadeia-molde. A reparação completa-se através da síntese de DNA, seguida pela ligação das cadeias reparadas. O resultado final são duas hélices de DNA intactas, onde a informação genética de uma cadeia é usada como molde para reparar a outra. Durante a meiose, pode ocorrer um processo de recombinação homóloga semelhante, aumentando a variabilidade genética dos gâmetas originados.

Figura 23 – Recombinação homóloga.

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Elementos genéticos móveis e Vírus

Transposões: elementos genéticos móveis (pequenos segmentos de DNA que se conseguem mover de uma região do genoma para outra). No genoma humano, existem dois tipos de transposões: → Os transposões propriamente ditos, que se movimentam através de mecanismos de “corte-e-costura”; → Retro-tranposões: movimentam-se através de um intermediário de RNA, através da transcriptase reversa. LINE-1: família de retro-transposão mais comum no genoma humano. É convertido a RNA pela RNA polimerase, sendo o RNA transformado em cDNA pela transcriptase reversa (esta enzima é codificada pelo próprio LINE-1). Estes elementos constituem cerca de 15% de todo o genoma humano, embora muitas destas cópias sejam imóveis devido a mutações (uma pequena parte mantém a sua capacidade de se deslocar). O seu movimento pode resultar em doença: mudança de elementos L1 para o gene que codifica o factor VIII (factor de coagulação) causou hemofilia num indivíduo sem história familiar nem antecedentes desta doença hereditária. Sequência Alu: tipo de retro-transposão com cerca de um milhão de cópias no nosso genoma. Não produzem a sua própria transcriptase reversa, estando dependentes da existente na célula para as ajudar a deslocarem-se. Retrovírus: vírus de RNA que, através da transcriptase reversa contida no próprio vírus, consegue sintetizar DNA, que se pode integrar no genoma do hospedeiro. O HIV é um retrovírus. → Síntese de cDNA a partir de RNA viral, através da transcriptase reversa; → Remoção do RNA e síntese da cadeia complementar à sintetizada anteriormente; → Integração do cDNA no genoma do hospedeiro (integrase); → O vírus pode ficar latente durante muito tempo, passando uma cópia do genoma viral a células-filhas da original; → A transcrição activa do genoma viral, dependente do recrutamento da maquinaria da célula hospedeira, permite a produção das proteínas virais (cápsula, transcriptase reversa e outras proteínas) e do RNA viral. Assim, é possível a replicação do retrovírus. Quando dois elementos genéticos móveis se inserem numa molécula de DNA em locais separados, limitando, por exemplo, um exão, caso estes elementos sejam muito semelhantes entre si, o mecanismo de transposição usa as suas terminações Página 35 de 89

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que delimitam o exão para remover o transposão (em vez de usar as terminações de cada um dos elementos). Assim, é removida uma sequência de DNA que contém um exão. Esta sequência é depois inserida noutro local do genoma, alterando, pelo menos, um gene.

Figura 24 – Ciclo de vida de um retrovírus.

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BLOCO 6: IMUNOLOGIA Origem das células do sistema imunitário num indivíduo adulto: células hematopoiéticas da medula óssea. → Linfócitos B: permitem o reconhecimento do meio extracelular e são responsáveis pela imunidade humoral, mediada por anticorpos, sendo estes secretados para a circulação quando os linfócitos B se diferenciam em plasmócitos. → Linfócitos T: responsáveis pela imunidade celular (reconhecem o meio intracelular ao reconhecer moléculas expressas por células – tumorais, infectadas por vírus, etc.). Estas células têm o seu genoma modificado quando comparado com o do resto das células somáticas, o que afecta a sua produção de proteínas. Expressam receptores nas suas membranas plasmáticas: → BCR (B-cell receptor): heterodímeros constituídos por quatro cadeias (duas leves e duas pesadas). Apresentam dois locais de ligação a proteínas. → TCR (T-cell receptor): heterodímeros  (αβ  ou  γδ)  constituídos  por  duas  cadeias.   apresentam apenas um local de ligação a proteínas. Os linfócitos T-αβ  podem   ser CD4+ (células T-helper) ou CD8+ (células T-cytotoxic). Associam-se a proteínas CD3. Os receptores são VRMs (Variable Region Molecules), visto possuírem um domínio variável para além de um domínio constante. É o domínio variável que confere especificidade a cada antigénio. Paradoxo de Landsteiner: “como  é  que  um  organismo  finito  (ser  humano  tem  10 5 genes no genoma) consegue reconhecer uma infinidade de moléculas (existem 1012 isoformas  de  VRM)?”.  A  resposta:  existe um conjunto de células que são selecionadas por serem as mais aptas (teoria evolucionista de Darwin).

Diversidade de VRM

Recombinação somática/Rearranjo VDJ → A geração de proteínas VRM do sistema imunitário não corresponde à simples transcrição e tradução de genes. → Não herdamos dos progenitores a sequência nucleotídica que codifica os receptores: herdamos então o mecanismo enzimático que permite a produção de proteínas e enzimas funcionais.

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→ Três fragmentos génicos: V: variável. Tem acoplado o promotor. D: diversidade. J: junção. Tem acoplado o enhancer. → Os fragmentos localizam-se num locus específico, sendo que existem 7 loci. → Mecanismo: justaposição dos fragmentos, formando uma sequência (gene funcional). Excisão de uma molécula circular de DNA com o material que não interessa, sendo os fragmentos unidos por uma ligase. Dá-se apenas em células B e T, acontecendo apenas uma vez por célula. A activação da recombinação é feita por duas enzimas RAG (Recombination Activation Gene): RAG-1: junção dos fragmentos D e J. RAG-2: junção dos fragmentos V e DJ. → VDJ recombinase: endonuclease que reconhece sequências de restrição específicas, as RSS (Recombination Signal Sequences). → Obtenção de 106 isoformas diferentes de VRM. → Ausência de RAG funcional/ausência total de RAG: Doença de Omenn.

Figura 25 – Rearranjo VDJ ou Recombinação Somática.

Inserção aleatória de nucleótidos → Inserção aleatória de nucleótidos nos locais de junção dos fragmentos génicos. → TdT (terminal deoxinucleotidyl transferase): introduz sequências ao acaso entre os blocos V e J, contribuindo para a diversidade juncional. → Obtenção de 1012 isoformas diferentes de VRM.

Desenvolvimento de células B Derivam de células hematopoiéticas estaminais, sendo diferenciadas na medula óssea.

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Figura 26 – Desenvolvimento de células B.

Hipermutação somática: alteração de nucleótidos individuais no locus da região variável. Permite a maturação e afinidade de cada imunoglobulina. Catalisada pela AID (activation-induced deaminase). Mudança de classe: IgM é o primeiro anticorpo a ser produzido. Para se obterem as outras classes, é necessária a alteração da região constante (o efector). Catalisada também pela AID.

Desenvolvimento de células T

Células hematopoiéticas estaminais que sofrem diferenciação no timo (fígado, no feto). Células-mãe apresentam o receptor c-Kit e IL-7 para factores de crescimento.

Figura 27 – Desenvolvimento de células T.

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Foxn1: regulador de transcrição importante para diferenciação de epitélios, nomeadamente o epitélio tímico.

Doenças

Síndrome de Omenn → Imunodeficiência primária, caracterizada pela ausência de RAG funcional ou ausência total de RAG. → Doença autossómica recessiva associada a mutações nos genes activadores da recombinação (RAGs). → Ausência de células B e T, devido à impossibilidade/disfunção ao nível dos rearranjos VDJ. Logo após o nascimento, os níveis séricos de IgG são normais visto que estes são transmitidos pela mãe (cordão umbilical e colostro). → Tratamento: transplante de medula óssea. Agammaglobulinémia → Total ausência de anticorpos com presença de células T. → Doença heterossómica recessiva (ligada ao X – homens têm maior prevalência) associada a mutações no gene que codifica a BTK (tirosina cinase de Bruton). A BTK é responsável por sinalizações para o interior da célula a partir do pré-BCR; assim, não se formam células B maduras (desenvolvimento estagnado em préB). → Tratamento: transfusão de anticorpos; transplante de medula com imunossupressão de células T já existentes (visto que reagem ao transplante, rejeitandoo). Síndrome de híper-IgM → Níveis séricos de IgM acima dos normais, combinados com níveis anormalmente baixos ou ausentes de outras classes de imunoglobulinas (IgA, IgD, IgE e IgG). → Mutação no cromossoma 12, afectando a enzima AID, tornando-a disfuncional. → A AID não consegue alterar a região constante da IgM, não havendo mudança de classes de imunoglobulinas. Síndrome de DiGeorge/Nude-SCID → Ausência de células T diferenciadas e epitélios desdiferenciados (ausência de pelos na pele – nude). → Mutação nonsense no nucleótido 792 no cromossoma 22, afectando o gene foxn1, que codifica um factor de transcrição essencial à diferenciação de células epiteliais, nomeadamente de células do epitélio tímico. Página 40 de 89

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→ As células do epitélio tímico (juntamente com células dendríticas e macrófagos existentes no timo) providenciam a diferenciação das células T. Ao não estar diferenciado o epitélio tímico, as células pré-T não sofrem maturação (não há apresentação de moléculas estranhas e do próprio organismo – antigénios – por parte da MHC às células pré-T). → Tratamento: transplante de timo (sendo este previamente colocado num meio de cultura que elimina linfócitos T existentes). X-linked SCID → Ausência de células T e contagem normal de células B. → Mutações no cromossoma X que afectam a cadeia gama do receptor da interleucina-7 (IL-7). → Tratamento: transplante de medula óssea.

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BLOCO 7: DIFERENÇAS GENÉTICAS ENTRE O HOMEM E A MULHER Reprodução sexuada: mistura de genomas de dois indivíduos geneticamente diferentes (regra geral). Organismo diplóide: cada célula contém dois conjuntos de cromossomas, um de cada progenitor. Alelos: várias versões do mesmo gene. Cada gene apresenta, no genoma, dois alelos, podendo estes ser iguais (homozigotia) ou não (heterozigotia). O locus representa a localização dos alelos no cromossoma. Um organismo que se reproduza sexuadamente produz células altamente especializadas, haplóides (metade do número de cromossomas) – os gâmetas. O gâmeta feminino é o óvulo e o gâmeta masculino é o espermatozóide, sendo estes originados de células diplóides por meiose. Fecundação: fusão dos gâmetas haplóides, formando uma célula diplóide (zigoto) com uma nova combinação de cromossomas. A principal vantagem da reprodução sexuada é a variabilidade genética que advém do encontro aleatório de gâmetas e das recombinações e fenómenos de crossingover que ocorrem durante a meiose. Excluindo estes dois últimos acontecimentos, na meiose podem gerar-se 223 (duas possibilidades em cada par de cromossomas, por parte de cada progenitor) conjuntos diferentes de cromossomas, logo 223 gâmetas diferentes. A variabilidade genética é favorável à sobrevivência e adaptação das espécies.

Meiose Meiose: processo de divisão nuclear através do qual, a partir de uma célula com núcleo diplóide, se formam células com núcleo haplóide. Ocorrem duas divisões: → Meiose I – Divisão Reducional: redução do número de cromossomas a metade (separação dos homólogos – [4n] → [2n]). Profase I: emparelhamento dos homólogos, formando-se bivalentes cromossómicas/tétrades cromatídicas, surgindo pontos de cruzamento entre os homólogos (pontos de quiasma). É a nível destes pontos que pode haver trocas recíprocas de segmentos de cromatídeos entre os homólogos (cros-

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sing-over). Desintegra-se o invólucro nuclear e diferenciase o fuso acromático. Metafase I: os filamentos do fuso ligam-se aos centrómeros das bivalentes, dispondo-se no plano equatorial os pontos de quiasma. Os bivalentes orientam-se ao acaso relativamente aos polos da célula. Anafase I: separação dos homólogos e migração polar dos cromossomas (cada um com dois cromatídeos). Telofase I: os homólogos atingem os polos. O fuso acromático desaparece e forma-se o invólucro nuclear (ou não, podendo os núcleos passar directamente para metafase II). → Meiose II – Divisão Equacional: redução da quantidade de DNA por célula a metade ([2n] → 2[n]). Igual à Figura 28 – Comparação entre Meiose e Mitose. mitose. No início da meiose I, em humanos, existem 92 cromossomas (23 pares duplicados). Sendo a meiose um processo falível, não é surpreendente que ocorram erros. Aneuploidia: alteração numérica de cromossomas numa célula. No zigoto, pode ser decorrente da fusão de gâmetas que não transportavam o número correcto de cromossomas. Deve-se à não disjunção dos homólogos (em anafase I) ou à não disjunção dos cromatídeos (em anafase II). → Síndrome de Down (47,XX/XY+21): trissomia do cromossoma 21. É caracterizada por atraso mental e características físicas anormais, sendo mais frequentemente decorrente da não disjunção de cromossomas 21. → Síndrome de Turner (45,X0): apenas um cromossoma sexual, sendo indivíduos do sexo feminino. → Síndrome de Klinefelter (47,XXY): três cromossomas sexuais, sendo indivíduos do sexo masculino. → Síndrome de Jacobson (47,XYY): recebe dois cromossomas Y paternos. As aneuploidias anteriores permitiram discernir a importância do cromossoma Y na determinação do sexo do indivíduo. Retiraram-se as seguintes conclusões: → Presença de Y (com SRY): homem. → Ausência de Y: mulher. Página 43 de 89

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→ Um X: não é obrigatoriamente homem. → Dois X: não é obrigatoriamente mulher.

Diferenças genéticas

O homem e a mulher diferem, a nível cromossómico, no par dos cromossomas sexuais, sendo que a mulher tem dois cromossomas X e o homem tem um cromossoma X e um cromossoma Y. O cromossoma X contém cerca de 2.500 genes enquanto o cromossoma Y contém cerca de 70 genes. Os genes do cromossoma Y, nomeadamente o SRY (sexdetermining region of Y), são responsáveis pela diferenciação sexual masculina, expressando proteínas responsáveis pela diferenciação de embriões, desenvolvimento testicular, produção de testosterona, entre outros. Uma mulher, possuindo dois cromossomas X, iria produzir o dobro das proteínas codificadas pelo X; pelo menos, seria o esperado. No entanto, isto não se verifica, sendo assegurado pelo silenciamento de um dos cromossomas X na mulher. A escolha de qual dos homólogos será silenciado é aleatória (células com cromossoma X materno activo e outras com o paterno activo – mulher é um mosaico genético), sendo esta escolha feita no 10.º dia do desenvolvimento embrionário. Existe uma sequência no cromossoma X, a XIST (X-inactive specific transcript), cujo RNA (não codificante) promove a desacetilação e metilação de histonas e metilação do DNA; o resultado é uma estrutura fortemente heterocromática, especialmente visível em neutrófilos (corpúsculo de Barr). Doenças ligadas ao cromossoma X: as recessivas apresentam maior incidência em indivíduos do sexo masculino, já que estes apresentam células com apenas uma cópia do cromossoma X. Se essa cópia se encontrar mutada, o indivíduo manifesta a doença. As mulheres podem manifestar a doença (em homozigotia) ou podem ser portadoras (uma cópia mutada – heterozigotia), não manifestando a patologia ou manifestando um grau diminuído desta. → Hemofilia: ausência de factor de coagulação (na hemofilia A, factor VIII; na hemofilia B, factor IX). No homem com hemofilia A, todas as células se encontram mutadas, não produzindo factor VIII. Na mulher portadora (heterozigótica), se em oito células das dez que originam o fígado ao 10.º dia de embriogénese for silenciado o alelo saudável, a mulher produzirá quantidade insuficiente de factor VIII.

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→ Daltonismo: ausência de alelos normais nos cones da retina. O homem não é capaz de distinguir cores, por exemplo o verde do vermelho. A mulher heterozigótica não tem grande definição (depende do grau de mosaicismo genético). → Distrofia muscular de Duchenne: o gene da distrofina é afectado. Uma das mutações verificadas em doentes é a delecção do exão 50 no cromossoma 50 devido a uma alteração numa sequência de consenso de splicing. O tratamento passa por introduzir uma proteína que inibe o splicing entre os exões 49 e 52, removendo o exão 51. A proteína formada não é igual à original mas é funcionalmente idêntica. → Calvície.

DNA mitocondrial

Mitocôndria: organelo com papel crucial na produção de energia metabólica em células eucarióticas através de processos como   β-oxidação, ciclo de Krebs (ou do ácido cítrico ou tricarboxílico) e respiração aeróbia (cadeia transportadora de electrões). O proteoma mitocondrial (conjunto de proteínas e variantes de proteínas que podem ser encontrados na mitocôndria quando esta está sujeita a um certo estímulo) é constituído por: → Proteínas codificadas no mtDNA e sintetizadas na mitocôndria; → Proteínas codificadas por genes nucleares, traduzidas em ribossomas no citosol e importadas para a mitocôndria (aminácidos preferenciais, como lisina e arginina).

Figura 29 – Representação do mtDNA.

A mitocôndria possui o seu próprio DNA, o mtDNA, que possui certas particularidades: → Genoma extranuclear e circular (característico de procariotas), com cerca de 16,6 kB. Página 45 de 89

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→ Possui 37 genes, que codificam: 13 proteínas da cadeia transportadora de electrões (CTE). 2 rRNA (12S e 16S). 22 tRNA. → Não possui intrões. → Código genético ligeiramente diferente do universal (não respeita a universalidade do mesmo). → Elevada taxa de mutação (cerca de cem vezes superior ao DNA nuclear), por falta de mecanismos de reparação de DNA (↑ espécies reactivas de O2 → afecta mtDNA → afecta CTE → ↓ ATP → stress oxidativo → apoptose). Os loci HV1 e HV2 são altamente polimórficos. → Existem múltiplas cópias por organelo (% mtDNA > % nDNA). → Herança exclusivamente materna (as mitocôndrias presentes no zigoto são exclusivamente provenientes do oócito II – Herança uniparental materna). Na mitose, as mitocôndrias são aleatoriamente repartidas pelas células-filhas. Desta divisão, poderá ocorrer a presença de um maior ou menor número de mitocôndrias mutadas. → Homoplasmia: presença de um genoma idêntico em todas as mitocôndrias presentes numa célula; → Heteroplasmia: presença de genomas mitocondriais diferentes dentro da mesma célula. A carga mutacional (proporção de mitocôndrias mutadas/normais) definirá o efeito de cada mutação particular.

Figura 30 – Representação da transmissão de genes mitocondriais. Como se pode ver, dependendo da carga mutacional mitocondrial dentro da mesma célula, os indivíduos com mitocôndrias mutadas podem manifestar ou não a doença.

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LHON/Leber’s Hereditary Optic Neuropathy/Neuropatia Óptica Degenerativa: perda súbita da visão central, provocada pela degeneração do nervo óptico (elevadas necessidades energéticas). Deve-se a mutações no mtDNA que afectam a NADH desidrogenase (complexo I da CTE), provocando decréscimo na produção de ATP e a acumulação de espécies reactivas de oxigénio. Estas desregulações culminam em apoptose celular. Apesar da herança uniparental materna, as doenças mitocondriais podem ser transmitidas de forma autossómica dominante ou recessiva se as mutações se encontrarem ao nível dos genes nucleares que codificam proteínas importadas pela mitocôndria. As opções terapêuticas para doenças mitocondriais passam por: → Tratamento de sintomas (diabetes, correcção da ptose, substituição de lentes intraoculares, etc.); → Reduzir o stress celular: Dieta baixa em gorduras e hidratos de carbono complexos; Exercício físico controlado e moderado; Evitar stress físico e mental (diferenças de temperatura, álcool, nicotina, fármacos, etc.); Suplementos vitamínicos que estimulam a CTE (aceitadores e cofactores, como o ácido ascórbico e a riboflavina/vitamina B2); → Terapia génica (substituição do alelo mutado pelo normal); → Inibir a replicação do DNA mutante/promover a replicação do wildtype. O mtDNA tem ainda outras aplicações: → Identificação individual (muito limitada), → Análise de parentesco (associação de mutações num grupo de indivíduos); → História demográfica e migratória da Humanidade.

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BLOCO 8: DOS GENES AO ORGANISMO Expressão génica: utilização selectiva de genes, activando ou inibindo alguns, expressando um conjunto de mRNA e proteínas definidoras de uma diferenciação celular, essencial à estabilidade de organismos e comunidades multicelulares. Em 1962, realizou-se uma experiência que pretendia responder à questão “Terão  as   células a capacidade de escolher quais os genes a expressar sem alterar a sequência nucleotídica  do  DNA?” → Remoção de um núcleo de uma célula da pele de um sapo adulto; → Injecção do núcleo num oócito maduro, exposto a radição UV (destruição do núcleo do oócito); → Desenvolveu-se um girino normal → o DNA nas células especializadas contém o mesmo conjunto de instruções necessárias ao desenvolvimento de todo o organismo. É a expressão de diferentes genes em cada célula que permite a produção de um tipo especializado de proteínas responsáveis por propriedades distintivas entre células (tamanho, forma, comportamento e função). A regulação genética ocorre em várias etapas ao longo da síntese proteica. → Controlo da transcrição; → Processamento do RNA transcrito; → Controlo do transporte e localização do RNA; → Controlo da degradação de mRNA; → Controlo da tradução; → Controlo da actividade proteica.

Figura 31 – Etapas da regulação genética ao longo da síntese proteica.

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Controlo da Transcrição

Para que se dê transcrição, é necessário: → Promotor: região do gene que atrai a RNA polimerase, orientando-a na direcção correcta a transcrever. Contém uma sequência de 50 nucleótidos, antes do local de iniciação da transcrição, que promove a ligação da RNA polimerase (TATA box em eucariotas). → Sequências reguladoras: utilizadas na activação/desactivação do gene. São reconhecidas por proteínas, os reguladores da transcrição, que se ligam a elas (encaixam na perfeição na superfície nucleica da dupla hélice, maioritariamente nas major groove) por ligações fracas mas que, no seu conjunto, são fortes e altamente específicas. Os DNA-binding motifs ligam-se e controlam a expressão de uma grande variedade de genes. A regulação génica está associada à resposta celular a estímulos externos.

1. Procariontes: Operões

Operão: conjunto de genes transcritos numa única molécula de mRNA. → Triptofano: produção de triptofano (↓[Trp] = operão activo). O operador é uma sequência que é reconhecida por reguladores da transcrição; ao ligar-se uma proteína, a acção da RNA polimerase é bloqueada. O regulador é então um repressor: a ligação do triptofano causa uma mudança conformacional (alosteria) que permite a sua ligação ao operador. Ao diminuir a concentração de triptofano livre, o repressor desliga-se do triptofano e liberta-se do operador, permitindo a actividade da RNA polimerase e a produção de triptofano.

Figura 32 – Operão do triptofano.

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→ Lactose: digestão de lactose em casos de falta de glicose (↑[lac] = operão activo). Os reguladores deste operão são dois – um repressor Lac e uma proteína activadora CAP. A proteína CAP tem de se ligar a cAMP antes de se conseguir ligar ao DNA: os genes regulados por CAP são activados face a um aumento dos níveis de cAMP (sinal de que não existe glicose disponível). Para efeitos de rentabilidade energética, o operão só está activo em situações de ↓[glicose] e ↑[lactose]: ↑[glicose] e ↑[lactose]: a proteína CAP não se liga (↑[glicose]) nem o repressor Lac (↑[lactose]). O operão está inactivo. ↑[glicose] e ↓[lactose]: a proteína CAP não se liga (↑[glicose]) mas o repressor Lac está ligado (↓[lactose]). O operão está inactivo. ↓[glicose] e ↓[lactose]: a proteína CAP está ligada (↓[glicose]) e o repressor Lac também (↓[lactose]). O operão está inactivo. ↓[glicose] e ↑[lactose]: a proteína CAP está ligada (↓[glicose]) mas o repressor Lac está desligado (↑[lactose]). O operão está activo.

Figura 33 – Operão da lactose.

2. Eucariontes

Os reguladores são também activadores ou repressores, todavia ligam-se a locais específicos (enhancers). Descobriu-se que os reguladores podem regular a trancrição à distância (milhares de pB entre enhancer e promotor) e podem encontrar-se antes ou depois do próprio gene.

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Modela   de   “actuação   à   distância”: a proteína activadora liga-se ao enhancer e promove uma alteração de conformação no próprio DNA, favorecendo uma torção da molécula entre o enhancer e o promotor. A proteína activadora consegue interagir com as proteínas na vizinhança do promotor (RNA polimerase II e factores de transcrição). Para além disso, pode haver uma proteína mediadora que estabelece a ligação entre todas as proteínas e o DNA. A transcrição dá-se quando os activadores estão ligados e os repressores estão inibidos. → Activador: ajuda na organização dos factores de transcrição e da RNA polimerase no promotor (histona-acetiltransferases). → Repressor: sabotagem na organização do complexo proteico (histonadeacetilases).

Figura 34 – Modelo  de  “actuação  à  distância”.

Controlo combinatório: várias proteínas reguladoras que actuam em conjunto na regulação da expressão de um determinado gene. Memória celular: a especialização da célula provoca modificações na expressão génica que, em condições normais, não podem ser esquecidas. A expressão de uma proteína pode influenciar a expressão de outra, o que prova a importância da transcrição durante o processo de diferenciação celular.

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Figura 35 – Exemplo da importância da transcrição para a diferenciação músculo/osso. Da mesma célula precursora (neste caso, um fibroblasto), obtêm-se duas linhas celulares: através do factor de transcrição Myo-D, obtêm-se células musculares (miócitos); a partir de células que expressam o factor Sonic hedgehog, obtêm-se células ósseas.

Processamento de mRNA transcrito → Ver BLOCO 2 Controlo da degradação de mRNA

miRNA: microRNA. Controlam a expressão génica através da ligação (entre bases azotadas) a mRNA específicos, controlando a sua estabilidade e tradução. Tal como outros RNA não codificantes (tRNA e rRNA, por exemplo), sofre processamento específico para formar miRNA funcional. Associa-se posteriormente a proteínas específicas, as do complexo RISC (RNA-induced silencing complex). Este complexo patrulha o citosol em busca de mRNA complementar ao miRNA que transporta. Quando estabelece ligação, o mRNA é destruído por uma nuclease do RISC ou a sua tradução é bloqueada, sendo lançado no citosol onde é degradado por outras nucleases. As duas características do miRNA que o tornam um bom regulador são: → Um único miRNA consegue regular um grande conjunto de mRNA desde que contenham uma sequência comum (normalmente encontradas na UTR); → Os genes que codificam informação para miRNA Figura 36 – Formação e actuação de miRNA. Página 52 de 89

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são pequenos e ocupam muito menos espaço no genoma quando comparados com genes que codificam reguladores de transcrição. RNAi: RNA de interferência. Método de reconhecimento e de destruição de RNA. Pode ser um mecanismo de defesa contra potenciais invasores, em certos organismos, ao detectar dsRNA (RNA de cadeia dupla) exógeno. A presença de dsRNA atrai um complexo proteico que contém uma nuclease, a Dicer, que cliva o dsRNA em fragmentos pequenos, com 23 nucleótidos – os siRNA (small interfering RNA). Os siRNA são incorporados em RISC, sendo uma das cadeias de siRNA descartada e a outra servirá como localizaFigura 37 – Mecanismo do RNAi. dora de cadeias complementares de RNA, degradando rapidamente as que encontrar (semelhante ao miRNA).

Controlo da Tradução

Riboswitches: pequenas sequências reguladoras em moléculas de mRNA, que podem alterar a sua conformação quando ligadas a moléculas como metabolitos. Encontrando-se em mRNA, permitem a regulação da sua própria transcrição e tradução. Em procariontes, a sequência de reconhecimento do mRNA por parte do ribossoma encontra-se alguns nucleótidos antes do codão de iniciação. O bloqueio/exposição dessa sequência promove a inibição/activação da tradução. Em eucariontes,   o   mRNA   possui   o   5’   cap que permite a ligação dos ribossomas. Existem  reguladores  que  se  ligam  na  5’  UTR,  impedindo  o deslizamento do ribossoma para os exões.

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Activação de proteínas

Existem proteínas que, após o processo de tradução, ainda não são funcionais. Para que se dê a sua activação, é necessário ocorrer um conjunto de processos como alteração da conformação (por chaperones), fosforilações, acetilações, glicosilações ou até mesmo associação a outras proteínas.

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BLOCO 9: PROLIFERAÇÃO E MORTE CELULAR Ciclo celular: ciclo de duplicação do conteúdo celular (ver BLOCOS 4 e 5) e posterior divisão do conteúdo duplicado pelas duas células-filhas. Para isso, é necessária a coordenação e regulação da maquinaria envolvida nestes processos. Função básica da célula: duplicar fielmente a grande quantidade de DNA dos cromossomas e distribui-la equitativamente (cópias) às células-filhas geneticamente idênticas. Fase M: fase mitótica do ciclo celular. Compreende a mitose (ou cariocinese, corresponde à divisão nuclear) e a citocinese (divisão do citoplasma). Interfase: intervalo entre duas fases M. Caracteriza-se por um período de elevada biossíntese, sendo composta por três fases: → Fase G1: intervalo entre o final da fase M e o início da fase S; → Fase S: duplicação do DNA (pré-requisito para a divisão celular); → Fase G2: intervalo entre o final da fase S e o início da fase M.

Figura 38 – Ciclo celular.

Sistema de controlo do ciclo celular: garante que os eventos do ciclo celular (replicação do DNA, mitose e outros) decorram numa determinada sequência e que cada processo está terminado antes de o seguinte se iniciar. Para isso, o sistema de controlo é regulado em pontos críticos do ciclo celular (checkpoints) por feedback do processo em curso. Os checkpoints servem como paragens moleculares, onde o ciclo celular consegue ser interrompido. Existem três checkpoints que controlam a progressão do ciclo celular: → G1: confirmação da favorabilidade do ambiente. A proliferação celular necessita de suficientes nutrientes e sinais extracelulares. Se as condições extracelulaPágina 55 de 89

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res forem adversas, atrasa-se G1, entrando num estado de latência (G0). Certas células, como células nervosas e do músculo esquelético, permanecem em G0 durante toda a vida do organismo. Este checkpoint é importante visto também ser regulado por sinais de outras células. → G2: garante que a célula não entra em mitose até que todo o DNA seja replicado e que todos os erros que danifiquem o DNA sejam reparados. → Mitose: garante que os cromossomas replicados estão devidamente associados ao fuso acromático antes de serem segregados e distribuídos pelas duas células-filhas.

Sistemas de Controlo do Ciclo Celular

O sistema de controlo do ciclo celular actua sobre a maquinaria responsável pela produção de componentes para a célula em crescimento e pela movimentação desses componentes para os seus locais correctos, activando-a ou inibindo-a nas alturas correctas, permitindo a coordenação de vários passos do ciclo. O sistema actua activando e depois inactivando proteínas e complexos proteicos que iniciam ou regulam a replicação do DNA, a mitose e a citocinese. Essa sequência de activação/inactivação é feita através de fosforilações/desfosforilações, sendo mediadas por proteínas cinases e fosfatases. A activação das cinases que actuam ao longo do ciclo celular depende de outras proteínas, as ciclinas. Estas não têm actividade enzimática nelas próprias mas têm de se ligar às cinases do ciclo celular para que estas possam ser enzimaticamente activas; assim sendo, as cinases do sistema de controlo são cinases dependentes de ciclina (Cdk). A variação das suas concentrações ao longo do ciclo celular, que valeu às ciclinas o seu nome, promove a associação e activação dos complexos ciclinaCdk, desencadeando vários processos do ciclo (como a entrada na fase S ou M).

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Figura 39 – Variação das concentrações das ciclinas ao longo do ciclo celular e da actividade das cinases dependentes de ciclina (Cdk).

O aumento/diminuição dos níveis de ciclina regulam a actividade das Cdk ao longo do ciclo celular. As concentrações de ciclina aumentam gradualmente, mas a actividade dos complexos ciclina-Cdk tende a ser activada abruptamente num determinado momento do ciclo. Essa activação abrupta deve-se à fosforilação do complexo num determinado local, por uma cinase, e à desfosforilação noutro local, por uma fosfatase. Existem vários tipos de complexos ciclina-Cdk que controlam diferentes etapas do ciclo celular: → M-Cdk: compostos por ciclina M (como a ciclina B) e Cdk1. Actua ao nível de G2, catalisando a entrada na fase M. → G1-Cdk: compostos por ciclina G1 (como a ciclina D) e Cdk4 e Cdk6. Actua numa fase prévia de G1, ajudando na progressão até à fase S. → S-Cdk: compostos por ciclina S (como a ciclina A) e Cdk2. Actua numa fase tardia de G1, despoletando a entrada na fase S. → G1/S-Cdk: compostos por ciclina G1/S (como a ciclina E) e Cdk2. Actua previamente ao complexo S-Cdk.

Figura 40 – Actuação dos diferentes complexos ciclina-Cdk ao longo do ciclo celular e variação das suas concentrações.

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A queda abrupta das concentrações de ciclinas em certos pontos do ciclo resulta da degradação selectiva de ciclinas. Complexos enzimáticos específicos adicionam ubiquitina à ciclina apropriada, sinalizando-a para degradação no proteossoma. Esta degradação de ciclinas é bastante rápida e permite a inactivação da Cdk respectiva. A inactivação de Cdk também pode desencadear transições de uma fase do ciclo para outra. Por exemplo, a degradação de ciclina-M inactiva o complexo M-CdK, o que indica à célula a finalização da mitose.

Figura 41 – Degradação das ciclinas e transições do ciclo associadas.

Alguns dos checkpoints dependem de proteínas inibidoras de Cdk que bloqueiam a organização ou actividade de um ou mais complexos ciclina-Cdk. Algumas destas proteínas ajudam a manter inactivas Cdk em G1, atrasando a entrada na fase S (mais tempo para aumentar o seu tamanho e esperar por condições extracelulares mais favoráveis). Mitogénios: sinais extracelulares produzidos por outras células que estimulam a divisão celular, passando por cima dos mecanismos intracelulares que tendem a bloquear a progressão ao longo do ciclo. Se a célula não receber estes sinais, fica bloqueada em G1; quando a ausência de mitogénios é prolongada, a célula entra em G0, sendo que pode ser um G0 irreversível (por exemplo, as células nervosas). Nesse caso, a grande maioria do sistema de controlo é desmantelado.

Fase S

Antes da célula se dividir, tem de replicar o DNA (ver BLOCOS 4 e 5).

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As origens de replicação recrutam proteínas específicas que controlam o início e completam a replicação do DNA. Um complexo multiproteico, o complexo de reconhecimento da origem (ORC), mantém-se ligado às origens de replicação durante todo o ciclo celular, onde serve como sinalizador para outras proteínas que se venham ligar antes do início da fase S. Uma dessas proteínas é a Cdc6, estando presente em baixos níveis ao longo da maior parte do ciclo celular mas que aumenta transitoriamente numa fase precoce de G1. Quando se liga ao ORC em G1, promove a ligação de outras proteínas, formando um complexo pré-replicativo, que sinaliza o início da replicação, através da activação do complexo S-Cdk. Este complexo pré-replicativo previne ainda a rereplicação do DNA: ajuda na fosforilação da Cdc6, promovendo a dissociação do complexo pré-replicativo e a degradação da Cdc6.

Figura 42 – Entrada na fase S por meio do complexo pré-replicativo.

Coesinas: proteínas que asseguram a coesão dos cromatídeos-irmãos nos cromossomas replicados. Asseguram a segregação cromossómica apropriada, sendo apenas quebrada numa fase tardia da mitose permitindo a separação dos cromatídeos pelo fuso acromático em anafase. O sistema utiliza diversos mecanismos de checkpoint para impedir a progressão do ciclo celular caso o DNA esteja danificado. → G1: danos no DNA causam um aumento da concentração da proteína p53, reguladora da transcrição que activa a transcrição do gene que codifica a pro-

Figura 43 – Coesina.

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teína p21. Esta proteína é inibidora de Cdk2, 4 e 6 e liga-se aos complexos G1S/Cdk e S-Cdk, impedindo a progressão para a fase S. Se o DNA estiver demasiado danificado, a p53 pode induzir apoptose. → S: durante a replicação do DNA, impedindo a entrada em fase M com DNA incompleto ou danificado. Para que a célula entre em fase M, o complexo MCdk tem de ser activado por fosfatases e cinases específicas. Quando o DNA está danificado, as fosfatases auto-inibem-se, os complexos M-Cdk estão inactivos e a fase M não começa enquanto os erros não forem reparados.

Fase M

Reorganização de todos os componentes celulares de forma a distribuí-los equitativamente pelas células-filhas. M-Cdk: induz a condensação dos cromossomas e correcto alinhamento dos mesmos no plano equatorial, para que possam ser correctamente segregados. Induz também a formação do fuso acromático. É activado pela fosfatase Cdc25, sendo essa activação mediada por feedback positivo.

Figura 44 – Activação do complexo M-CdK.

Condensinas: complexos proteicos que ajudam na condensação dos cromossomas. São activadas, por fosforilação, por acção indirecta do complexo M-Cdk e actuam conjuntamente com as coesinas, contribuindo para a formação de anéis à volta dos cromossomas.

Figura 45 – Condensinas.

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A fase M pode ser dividida em seis fases: → Profase: condensação dos cromossomas (2 cromatídeos-irmãos) e formação do fuso acromático entre os dois centrossomas. → Prometafase: fosforilação dos poros nucleares e lâminas nucleares, quebrandose o invólucro nuclear. Os microtúbulos do fuso acromático ligam-se aos cinetocoros (complexos proteicos que medeiam a ligação dos filamentos aos centrómeros). → Metafase: alinhamento dos centrómeros no plano equatorial da célula. → Anafase: segregação dos cromatídeos-irmãos através de migração polar. Os microtúbulos vão diminuindo o seu comprimento (anafase A) e os pólos do fuso movem-se em sentidos opostos (anafase B). → Telofase: reformação do invólucro nuclear (desfosforilação dos poros e lâminas nucleares) à volta de cada conjunto de cromossomas. Formação do anel contráctil de actina. → Citocinese: separação do citoplasma, através da contractilidade do anel de actina.

Figura 46 – Formação e quebra do invólucro nuclear.

Controlo do número e tamanho das células

As células de um organismo multicelular são reguladas ao nível da divisão mas também a nível da morte celular. Quando uma célula já não é necessária ou, por alguma razão, se torna perigosa, pode provocar a sua própria morte – morte celular programada, sendo a apoptose o processo mais comum em animais. A apoptose não prejudica as células vizinhas visto que a célula encolhe e condensase, sendo rapidamente fagocitada por macrófagos, que reconhecem fosfatidilPágina 61 de 89

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serina expressa, em apoptose, na face externa da membrana plasmática. O citoesqueleto colapsa e o material genético é fragmentado.

Figura 47 – Exposição de fosfatidil-serina numa célula apoptótica.

Caspases: proteases provenientes de precursores inactivos (pró-caspases). Têm como principais acções: destruir as proteínas inibidoras da DNase, clivar as lâminas nucleares e proteínas do citoesqueleto, levando à fragmentação do núcleo, destruição do citoesqueleto e fragmentação celular. As pró-caspases são activadas por clivagem proteolítica em resposta a sinais indutores de apoptose. Dá-se uma cascata proteolítica amplificada: as caspases clivam pró-caspases, activando-as e tornando-as em caspases efectoras que podem actuar no seu substrato ou continuar a clivar outras pró-caspases.

Figura 48 – Vias de activação de caspases. (A) Clivagem proteolítica. (B) Cascata proteolítica amplificada.

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Caspase 9: caspase iniciadora nos mamíferos que é activada aquando da formação do apoptossoma, um complexo com 7 subunidades, sendo, cada uma delas, constituída por uma pró-caspase 9, uma proteína adaptadora Apaf-1 e uma molécula de citocromo C. O citocromo é libertado pela mitocôndria por estímulos próapoptóticos. Uma vez activada pelo apoptossoma, a caspase 9 cliva/activa caspases efectoras que levam à morte celular. Activa as caspases 3 (fragmenta DNA), 7 e 8 (activa proteínas pró-apoptóticas da família Bcl2).

Figura 49 – Formação do apoptossoma. As proteínas Bax e Bak são responsáveis pela abertura de poros na membrana mitocondrial, levando à libertação do citocromo C.

Família Bcl2: grupo de proteínas intracelulares que regulam a activação de procaspases e, consequentemente, a activação de processos que desencadeiam morte celular programada. Alguns membros promovem a activação de procaspases e morte celular enquanto outros inibem esses processos. → Bax e Bak: activam procaspases indirectamente ao ligarem-se à membrana externa mitocondrial, promovendo a libertação de citocromo C e formação do apoptossoma. → Bcl2: a própria proteína Bcl2 inibe a activação de procaspases e apoptose, ao bloquear a actividade de Bax e Bak. → Existem ainda outros membros que inibem os inibidores (inibem a Bcl2), ou seja, são pró-apoptóticos. Um exemplo dessas proteínas é a proteína Bad. Face a danos irreparáveis no DNA, a proteína p53 também é indutora de apoptose. A existência desses erros provoca a activação de cinases (ATM, ATR e CHK2) que fosforilam e estabilizam a p53, permitindo o aumento dos seus níveis. A p53 induz a transcrição de genes que codificam proteínas pró-apoptóticas BH3-only3 (Puma e Noxa), culminando na apoptose. 3

As proteínas BH3-only da família Bcl2 são iniciadores essenciais da morte celular programada e são necessárias para apoptose induzida por estímulos citotóxicos.

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O processo de morte celular programada pode ainda ser regulado por sinais provenientes de outras células, podendo promover ou inibir o processo. → Factores de sobrevivência: promovem a sobrevivência da célula, suprimindo a apoptose. Se as células não receberem esses factores, activam o seu programa intracelular de morte. Ligam-se a receptores na superfície celular que suprimem o programa de morte, podendo usar para esses efeitos a proteína Bcl2.

Figura 50 – Modo de actuação de um factor de sobrevivência.

→ Mitogénios: ligam-se a receptores na superfície celular, iniciando transduções de sinais que indicam que a célula se deve dividir. Podem actuar ao libertarem do bloqueio e permitindo a transição de G1 para S. Um dos molecular brakes é a proteína Retinoblastoma (Rb) que se liga a reguladores de transcrição específicos, impedindo-os de estimularem a transcrição de genes necessários à divisão e proliferação celular. Os mitogénios activam vias de sinalização intracelular que conduzem à activação dos complexos G1-CdK e G1/S-CdK, que fosforilam a Rb, alterando a sua conformação e libertando o regulador de transcrição. Um exemplo de mitogénio, que activa outra via de sinalização, é o PDGF (plateletderived growth factor), que pode ser libertado por plaquetas incorporadas em coágulos sanguíneos. O PDGF liga-se a receptores tirosina cinase (RTK), activando a proteína Ras que vai iniciar uma cascata de fosforilação que actua sobre um módulo de sinalização: a Ras activa a MAP-cinase-cinase-cinase (MAP-KKK), que activa a MAP-cinase-cinase (MAP-KK), que activa a MAPcinase (MAP-K), que fosforila reguladores de transcrição responsáveis pela proliferação celular na zona danificada. Da mesma forma, o factor de crescimento de hepatócitos estimula a proliferação de hepatócitos num fígado danificado (cirurgia ou ferida). Página 64 de 89

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Figura 51 – Modo de actução da proteína Rb face a um estímulo mitogénico.

→ Factores de crescimento: ligam-se a receptores na superfície celular, activando vias de sinalização intracelular. Levam à acumulação de proteínas e outras macromoléculas através de dois mecanismos – aumento da biossíntese e diminuição da sua taxa de degradação. O PDGF é um factor de crescimento e um mitogénio, estimulando tanto o crescimento celular como a progressão ao longo do ciclo celular. Ajuda as células a manter um tamanho apropriado enquanto proliferam.

Figura 52 – Modo de actuação do PDGF.

Algumas proteínas de sinalização extracelular inibem a divisão, crescimento e sobrevivência da célula. Um exemplo dessas proteínas é a miostatina que inibe o crescimento e proliferação celular de mioblastos , que se fundem para formar as Página 65 de 89

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fibras musculares durante o desenvolvimento embrionário. Quando o gene se encontra danificado, as células musculares crescem e proliferam, hipertrofiando os músculos.

Cancro

Cancro: patologia resultante da proliferação anormal de qualquer tipo de célula (tumor). O tumor maligno é aquele que tem capacidade de se metastizar. → Carcinoma: com origem em células epiteliais (90%); → Sarcoma: a partir de células do tecido conjuntivo, como osso, cartilagem e tecido fibroso; → Leucemia e linfoma: a partir de células hematopoiéticas e do sistema imunitário (8%). A proliferação desmedida das células deve-se a mutações em genes reguladores críticos que controlam a proliferação, a diferenciação e a sobrevivência. → Proto-oncogene: genes reguladores que promovem a proliferação celular normal e inibem a apoptose. A presença de uma mutação em um dos alelos é suficiente para ser induzida proliferação celular e desenvolverem-se tumores. Assim, o proto-oncogene transforma-se num oncogene. As alterações que originam um oncogene podem ser: Mutação numa sequência codificante: pode conduzir à produção, em níveis normais, de uma proteína hiperactiva. Pode provocar alterações no centro activo ou na conformação, alterando a ligação ao substrato. É o caso dos RTK (receptores tirosina cinase) ou da Ras. Amplificação génica: amplificação do gene, o que faz com que haja superprodução de proteína. Pode acontecer com factores de crescimento (como o c-Myc). Rearranjo cromossómico: translocação do proto-oncogene para uma região com várias sequências reguladoras e promotoras upstream, aumentando a transcrição. Pode ainda haver fusão com um gene activamente transcrito, havendo produção de uma proteína híbrida hiperactiva (é o caso do Bcr-Abl, leucemia mielóide crónica, cromossoma Philadelphia).

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Figura 53 – Processos de obtenção de um oncogene a partir de um proto-oncogene.

→ Gene supressor de tumor: genes reguladores que inibem a proliferação celular e o desenvolvimento tumoral e promovem a apoptose celular. A presença da mutação têm de se encontram em ambos os alelos para se verificar completa ineficácia do gene. Os genes que codificam as proteínas Rb, p53 e p21 são oncossupressores, tal como os genes BRCA1 e BRCA2 (muito comuns em casos hereditários de cancro da mama e do ovário). Os tumores encontraram outras formas de proliferação, como a secreção de factores de crescimento que promovem a angiogénese e a reactivação da telomerase.

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BLOCO 10: CITOESQUELETO Citoesqueleto: complexa rede dinâmica de filamentos proteicos que se estende pelo citoplasma, reorganizando-se em resposta ao meio e funcionando como o “sistema músculo-esquelético”   da   célula.   De   uma   forma   geral,   tem   funções   como:   adaptabilidade de formas celulares, suporte de volume citoplasmático, organização dos componentes celulares, interacções mecânicas com o meio ambiente, obtenção de movimentos, segregação dos cromossomas durante a mitose e meiose, entre outras. O citoesqueleto é constituído por três tipos de filamentos proteicos: → Microtúbulos, cuja subunidade são heterodímeros de tubulina; → Filamentos intermédios, cuja subunidade podem ser diferentes proteínas; → Filamentos de actina ou microfilamentos, cuja subunidade é o monómero de actina.

Microtúbulos

Os microtúbulos são tubos ocos constituídos por 13 protofilamentos de heterodímeros de tubulina. Os heterodímeros são compostos por uma unidade de α-tubulina e outra de βtubulina, ligadas fortemente por ligações não-covalentes. Ao adquirirem essa conformação, o microtúbulo adquire duas extremidades: uma extremidade α-tubulina (minus end) e uma extremidade β-tubulina (plus end), havendo assim polaridade do microtúbulo. Esta polaridade é de extrema importância não só para o seu crescimento como para a função que desempenham: → Transporte intracelular; → Manutenção de organelos no mesmo local; → Geração de força (fuso mitótico – segregação dos cromossomas/cromatídeos); → Movimento celular (cílios e flagelos).

Figura 54 – Microtúbulos.

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Os   heterodímeros   αβ-tubulina são adicionados em qualquer extremidade. No entanto, a polimerização na plus-end é mais rápida. MTOC: microtubule-organizing center. O centrossoma é o principal MTOC, localizando-se perto do núcleo quando a célula não se encontra em mitose e controla o número e disposição dos microtúbulos no citoplasma. O centrossoma é constituído por subunidades de γ-tubulina, às quais se ligam as minus ends dos microtúbulos. Servem de ponto de início (nucleation site) à polimerização dos microtúbulos. No centrossoma, encontra-se um par de centríolos.

Figura 55 – Centrossoma e crescimento de microtúbulos a partir deste. A plusend dos microtúbulos fica virada na direcção contrária à do centrossoma.

Instabilidade dinâmica: crescimento dos microtúbulos (a partir dos sítios de nucleação por adição de subunidades de αβ-tubulina) e, repentinamente, decrescimento dos mesmos (perda de subunidades), podendo voltar a crescer; podem também desaparecer completamente, sendo substituídos por um novo microtúbulo do mesmo  anel  de  γ-tubulina. Esta dinâmica é possível à actividade de GTPase da tubulina. Cada dímero de tubulina livre contém uma molécula de GTP associada fortemente, que é hidrolisada a GDP, depois do dímero ser adicionado ao microtúbulo. Quando a ligação entre as subunidades do microtúbulo (adição de dímeros) ocorre mais rapidamente do que a hidrólise de GTP, a extremidade crescente é constituída apenas por subunidades ligadas a GTP – GTP cap. Nesta situação, o microtúbulo continuará a crescer. Devido à aleatoriedade dos processos químicos, contudo, ocasionalmente a tubulina na extremidade livre do microtúbulo hidrolisa o seu GTP antes de a próxima subunidade ser adicionada. O facto de a extremidade ser agora constituída por subunidades de GDP-tubulina promove a despolimerização, sendo que, uma vez iniciada, a despolimerização tem tendência a continuar.

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Figura 56 – Instabilidade dinâmica dos microtúbulos. A polimerização depende da presença de tubulina associada a GTP e a despolimerização de tubulina associada a GDP.

Existem fármacos que inibem a polimerização ou a despolimerização e têm um efeito notório na organização do citoesqueleto, nomeadamente no fuso acromático. → Colchicina: inibe a polimerização, ligando-se à tubulina livre. → Taxol/Paclitaxel: inibe a despolimerização, ligando-se aos microtúbulos (utilizado em tratamentos oncológicos). A maioria das células é polarizada, isto é, uma extremidade é estrutural e funcionalmente diferente da outra. Esta polaridade provém da organização dos organelos pelos microtúbulos. É o caso dos neurónios, cujos microtúbulos dispõem a minus end para o núcleo e a plus end para a periferia. Os microtúbulos estão envolvidos no transporte intracelular, cujos movimentos são gerados por proteínas motoras que usam energia proveniente da hidrólise de ATP. Estas proteínas ligam-se aos componentes celulares que querem transportar e aos filamentos, transportando os componentes ao longo dos últimos. → Cinesinas: movimento no sentido da plus end. À medida que a célula cresce, as cinesinas ligam-se à membrana do retículo endoplasmático e puxam-no para fora. → Dineínas: movimento no sentido da minus end. Ligam-se ao aparelho de Golgi e puxam-no para dentro. Figura 57 – Proteínas motoras envolvidas no transporte intracelular.

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Cílios: estruturas microtubulares estáveis que se estendem da superfície apical de algumas células. Contêm um conjunto nuclear de microtúbulos associado a proteínas específicas (axonema) que surgem dos corpos basais do citoplasma, na base do cílio. Têm como função mover o fluido das superfícies celulares, sendo encontrados, por exemplo, nas mucosas das vias aéreas superiores e das trompas de Falópio. Flagelos: assemelham-se estrutural e bioquimicamente aos cílios; no entanto, são muito mais longos. Servem para mover a célula inteira, através de movimentos ondulares. Encontram-se nos espermatozóides.

Filamentos intermédios

Características principais: resistência estrutural e elasticidade. → Apresentam uma enorme força tênsil, o que permite à célula resistir ao stress mecânico que sofre quando é esticada; → São mais resistentes que os outros filamentos do citoesqueleto, sendo capazes de resistir a soluções não-iónicas e a meios concentrados. Ao contrário dos outros filamentos do citoesqueleto, os filamentos intermédios não estão directamente envolvidos no movimento celular. Apresentam função estrutural e são compostos por uma grande variedade de proteínas. Essas proteínas apresentam um domínio central em hélice-α, uma cabeça globular N-terminal e uma cauda globular C-terminal. A região α-helicoidal permite que duas subunidades se envolvam, formando um dímero.

Figura 58 – Constituição dos filamentos intermédios. Os filamentos são constituídos por subunidades proteicas que se associam em dímeros paralelos. Os dímeros formam tetrâmetros antiparalelos (sendo estes a unidade funcional dos microtúbulos). Oito tetrâmeros sofrem torção, originando um filamento em forma de corda.

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Os filamentos intermédios são apolares, dado que não apresentam extremidades positivas/negativas distintas. São por isso mais estáveis, não apresentando o comportamento dinâmico associado aos outros elementos do citoesqueleto. Encontram-se ao longo do citoplasma, rodeando o núcleo e estendendo-se até à periferia, onde ficam ligados à membrana plasmática nas zonas de comunicação entre células (desmossomas) ou em zonas de comunicação com a membrana basal (hemi-desmossomas). Podem encontrar-se também dentro do núcleo. Os filamentos intermédios podem ser divididos em quatro tipos: → Queratinas: encontram-se em células epiteliais, sendo que cada tipo de epitélio apresenta o seu próprio conjunto de queratinas. Localizam-se no interior das células epiteliais, atravessando a célula. Juntam-se aos filamentos de células adjacentes através de desmossomas. A importância destes filamentos é perceptível através da doença epidermolysis bullosa simplex: mutações genéticas nos genes das queratinas que interferem com formação destes filamentos na pele, que a tornam susceptível a rupturas mesmo com aplicação de uma força fraca. → Vimentinas: tecido conjuntivo, células musculares e células da glia. → Neurofilamentos: neurónios. → Lâminas nucleares: revestimento e reforço da superfície interna da membrana nuclear interna. As proteínas que constituem as lâminas são as lâminas. Os filamentos da lâmina nuclear separam-se e ligam-se durante a divisão celular, sendo este mecanismo controloda por fosforilações e desfosforilações. Certos defeitos nas lâminas nucleares estão associados a certos tipos de progeria: envelhecimento prematuro que, pensa-se, estará associado a uma divisão celular problemática (instabilidade nuclear ou diminuta capacidade de regeneração tecidular).

Figura 59 – Tipos de filamentos intermédios. Para além dos descritos em cima, pode considerar-se a existência de dois grupos maiores: os filamentos intermédios citoplasmáticos (queratinas, vimentinas e neurofilamentos) e os filamentos intermédios nucleares.

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Filamentos de actina ou Microfilamentos

Características principais: → Cadeia de moléculas de actina que se dispõem de forma organizada e na mesma direcção em torno do eixo da cadeia, sendo que esta sofre uma torção sobre si mesma a cada 37 nm; → Mais flexíveis e finos que os microtúbulos; → Frequentemente surgem associados numa rede que é mais forte que os filamentos isolados; → Apresentam polaridade (têm uma plus end e uma minus end); → Se não se associarem a proteínas, são bastante instáveis e podem sofrer despolimerização em ambas as extremidades.

Figura 60 – Filamento de actina. A cada 37 nanómetros, a cadeia sofre uma torção sobre si mesma.

Os filamentos de actina localizam-se por todo o citoplasma e no córtex celular. Tal como nos microtúbulos, a polimerização dá-se por adição de monómeros (de actina) em ambas as extremidades, sendo mais rápida na plus end. Cada molécula de actina está associada a ATP que é hidrolisado a ADP quando se liga ao filamento. A hidrólise de ATP diminui a estabilidade de polímero, pois a força de ligação entre os monómeros diminui, promovendo a despolimerização. Sendo assim, o que impede que os monómeros de actina polimerizem todos? → Pequenas proteínas, como a timiosina e a profilina, que se ligam aos monómeros de actina existentes no citosol, criando reservas de actina sob a forma de monómeros e, assim, impedindo a adição de monómeros nas extremidades dos filamentos; → Apenas quando a polimerização é necessária, surgem proteínas como as forminas e as Arp (actin-related proteins) que promovem a adição de monómeros. As proteínas que se associam aos filamentos de actina modificam o seu comportamento: → Fimbrinas: estabilidade em filamentos paralelos; → Filaminas: formação de redes de filamentos cruzados; → Cofilina: quebra dos filamentos; → Arp 2/3: ramificações; Página 73 de 89

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→ Miosinas (I e II): proteínas motoras que conferem contractilidade; → Integrinas e caderinas: proteínas transmembranares que se ligam aos filamentos.

Figura 61 – Conjunto de proteínas associado a filamentos de actina.

Movimento celular por arrastamento: emissão de uma protusão (por meio de filamentos de actina) que adere ao substrato. O córtex fica sob tensão. A parte de trás da célula contrai (com auxílio de miosina II), arrastando a célula para a frente. Formam-se novos pontos de ancoragem e os antigos vão sendo libertados.

Figura 62 – Movimento celular por arrastamento.

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Lamellipodia: prolongamentos citoplasmáticos finos e lamelares. A formação de redes de actina com várias ramificações depende da proteína Arp 2/3. Filopodia: prolongamentos citoplasmáticos alongados. A formação de filamentos rectilíneos depende de proteínas como as forminas. Figura 63 – Disposição dos filamentos de actina em (A) Feixes contrácteis, (B) Lamellipodia e (C) Filopodia.

Miosina I: associa-se aos filamentos de actina e liga-se a vesículas (transporte vesicular) ou à membrana plasmática (deformação desta). Move-se sempre no sentido da plus end.

Figura 64 – Miosina I e sua actuação. (A) Molécula de miosina I. (B) Transporte vesicular. (C) Deformação da membrana plasmática.

Miosina II: responsável pela contracção muscular. Cada molécula é um dímero composto por duas moléculas de miosina ligadas através das suas caudas. Tem duas cabeças globulares com actividade ATPásica numa extremidade e uma cauda em forma de mola. As caudas associam-se, formando um filamento bipolar no qual as cabeças se projectam para fora em direcções opostas.

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Figura 65 – Miosina II e contracção muscular. (A) Músculo relaxado. (B) Músculo contraído.

Figura 66 – Resumo das características gerais de cada elemento do citoesqueleto.

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ANEXO A: AULAS TEÓRICO-PRÁTICAS Aula Teórico-Prática 1: Molécula de DNA e Clonagem Molecular

Molécula de DNA: ver BLOCO 1. Clonagem Molecular e DNA recombinante: ver ANEXO B. AZT: análogo do nucleótido de timina. É utilizado como inibidor da transcriptase reversa do HIV. Em termos de estrutura, o AZT é semelhante ao nucleótido de timina com excepção do carbono   3’, onde, em vez de se encontrar ligado um grupo hidroxilo, se encontra um grupo azida (N3). Assim, como o AZT é incorporado preferencialmente à timina, é dificultada (ou mesmo impossibilitada) a elongação da molécula  de  DNA  viral,  visto  que  grupo  fosfato  5’  não  se  consegue  ligar  ao  grupo  N 3. Ocorre paragem de síntese de DNA viral, fazendo com que o HIV deixe de conseguir infectar linfócitos T CD4+. O DNA genómico bacteriano não é digerido pelas suas próprias enzimas de restrição porque as sequências de restrição correspondentes a essas nucleases estão protegidas por metilação

Aula Teórico-Prática 2: Tecnologia de DNA Recombinante

Tecnologia de DNA recombinante: ver ANEXO B. Plataformas de produção de medicamentos recombinantes: bactérias, culturas de células eucarióticas (leveduras, por exemplo) e animais transgénicos. A utilização de diferentes plataformas permite ultrapassar determinadas limitações que condicionam a capacidade de expressão dessas proteínas (por exemplo, modificações póstraducionais), sendo essas limitações levantadas pelas características específicas da plataforma ou pela incapacidade de estas produzirem quantidades comercialmente exploráveis do produto recombinante. → Bactérias: não fazem modificações pós-traducionais (glicosilação, fosforilação, oligomerização e clivagem proteolítica). → Sistemas eucariotas unicelulares: resolvem o problema das modificações póstraducionais; no entanto, por vezes, as modificações não são eficientes e a quantidade produzida não é economicamente rentável e explorável. → Organismos transgénicos: resolvem ambos os problemas. Página 77 de 89

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As proteínas recombinantes podem ser utilizadas em: → Vacinas; → Falta ou disfunção de proteínas ou tratamento de doenças hereditárias (substituição enzimática ou hormonal); → Biomedicamentos (factores proteicos humanos, factores de crescimento, entre outros). Doença de Gaucher: é causada por falta da enzima glucocerebrosidase nos lisossomas, sendo estes incapazes de digerir os glucocerebrósidos. Estes acumulam-se, levando a um aumento de volume dos lisossomas (corpos de inclusão), especialmente nos macrófagos (porque têm de degradar grandes quantidades de membrana, pela sua função fagocítica). Assim, nesta doença é comum a presença de hepatoesplenomegália e de alterações ósseas (por causa dos macrófagos existentes na medula óssea). É tratada através de terapia de reposição enzimática, em que a glucocerebrosidase é produzida por DNA recombinante num vector de expressão eucariota (que lhe adiciona o sinal de manose 6-fosfato). A terapia resulta nesta doença visto que, uma vez na corrente sanguínea, a glucocerebrosidase é endocitada pelos macrófagos, incluída no endossoma que depois se junta ao lisossoma. No entanto, com outras doenças (como as dos peroxissomas), esta abordagem não é possível pois as enzimas endocitadas têm como destino o lisossoma, onde seriam degradadas. Ainda não é possível o reencaminhamento para outros organelos. A glucocerebrosidase recombinante encontra-se no mercado sob o nome de Cerezyme.

Aula Teórico-Prática 3: Técnica de PCR

Técnica de PCR: ver ANEXO B. Fibrose Quística: doença autossómica recessiva causada por uma mutação no gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), que codifica uma proteína dos canais de cloro e que regula outros canais iónicos e, por isso, os tecidos afectados apresentam um transporte iónico anormal. A mutação impede a saída de cloro das células, havendo um aumento da pressão osmótica. A água das mucosas entra para dentro das células, fazendo com que o muco fique mais espesso. Verificam-se complicações ao nível dos brônquios (drenagem anormal dos fluidos, havendo proliferação de microrganismos e consequente risco de infecção), do tubo digestivo (obstipação) e no suco pancreático (lipases não chegam ao intestino, o que faz com que a emulsão lipídica não ocorra, provocando o aparecimento de fezes gordurosas). Nas glândulas sudoríparas, as células dos ductos são incapazes de absorver NaCl e, portanto, o suor fica salgado (base de teste de diagnóstico). Página 78 de 89

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Aula Teórico-Prática 4: Sequenciação de DNA

Sequenciação de DNA: ver ANEXO B.

Aula Teórico-Prática 5: Técnicas de Detecção de Proteínas e Ácidos Nucleicos

Técnicas de detecção de proteínas e ácidos nucleicos: ver ANEXO B.

Aula Teórico-Prática 6: Anemia de Fanconi

Anemia de Fanconi (AF): doença autossómica recessiva ou associada ao cromossoma X (gene FANCB). Caracteriza-se por mutação nos genes FANC que produzem proteínas do sistema de reparação do DNA. Apresenta-se uma falência medular que conduz a pancitopenia progressiva (diminuição do número de eritrócitos, leucócitos e trombócitos) e malformações congénitas graves ou ligeiras que podem afectar o esqueleto, o coração, os rins e as vias urogenitais. Os indivíduos com AF apresentam predisposição ao desenvolvimento de leucemia mielóide e tumores sólidos, dada a existência de uma fase G2 do ciclo celular aumentada e por apresentarem instabilidade cromossómica espontânea. A confirmação do seu diagnóstico pode ser feita através de dois testes laboratoriais: → Detecção da hipersensibilidade a agentes genotóxicos; → Determinação do grupo de complementação. Grupo de complementação: subgrupo genético comum. Mutações que conduzem a igual fenótipo podem afectar: → Diferentes genes; → Um mesmo gene, mas com a possibilidade de as mutações serem diferentes entre os alelos. Caso a doença seja recessiva, pode realizar-se um teste de complementação. Mutações que afectam o mesmo gene não são complementares. Mutações que afectam genes diferentes são complementares. Se um alelo do gene FANCA estiver mutado e um alelo do gene FANCD1 estiver mutado, não há manifestação da doença – existe complementação. No entanto, se ambos os alelos do gene FANCA estiverem mutados, não há complementação, manifestando-se a doença.

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Abordagens terapêuticas: → Transplante de medula óssea (quer seja autólogo ou heterólogo), embora corrija apenas as alterações hematológicas, não alterando a susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro. → Terapia génica: inserção de células estaminais hematopoiéticas alteradas geneticamente, de modo a expressarem, num dos alelos, a proteína funcional. A anemia de Fanconi, por resultar de alterações num único gene, conhecido e isolado como principal responsável da doença (grupos de complementação) e por ser recessiva (um alelo não mutado é suficiente para que haja compensação da produção da proteína mutada – exibe haplossuficiência), será um bom alvo de terapia génica. No entanto, poderá não ser suficiente: a taxa de transfecção de células estaminais por vírus pode não ser suficiente para produzir um número significativo de proteínas funcionais. Em alguns casos, por não se conseguir ainda controlar o local de inserção do gene no genoma, podem desenvolver-se leucemias por inserção do gene terapêutico entre genes associados a cancro. A terapia génica só actua sobre doenças recessivas (pelo menos para já), não curando (apenas torna o indivíduo doente em portador).

Aula Teórico-Prática 7: Testes Genéticos

Teste genético: análise de DNA, RNA, cromossomas, proteínas e certos metabolitos com o objectivo de identificar uma doença genética. → Diagnóstico: identificação da condição genética em indivíduos que apresentam sintomas. → Preditivo: detecção de mutações em indivíduos assimptomáticos e cálculo do risco de desenvolvimento da doença. → Farmacogenética: permite a identificação de metabolizadores rápidos/lentos ou de indivíduos com maior susceptibilidade a fármacos terapêuticos. → Aconselhamento reprodutivo: baseia-se na estimativa da probabilidade de transmissão da mutação à descendência e de estes serem doentes. → Pré-implantatório/Pré-natal: efectuados quando teste do portador sugere risco. No pré-implantatório, faz-se selecção dos embriões que seguem para implantação (sem mutação). O pré-natal serve para determinar se o feto terá ou não a doença. → Rastreio do recém-nascido: pesquisa da presença/ausência de mutação causadora de doença genética. → Testes de paternidade: análise de regiões polimórficas do DNA dos supostos pai e filho. Página 80 de 89

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Aula Teórico-Prática 8: Diagnóstico e Monitorização do doente com HIV Monitorização do estadiamento: contagem de células T CD4+ e contagem da carga viral em circulação (por RT-PCR). Também o estado de saúde do doente é importante (assimptomático, sintomático ou com doenças definidoras de SIDA). Terapia HAART: Highly Active AntiRetroviral Therapy. Consiste numa combinação de três medicamentos: dois inibidores de nucleosídeos análogos da transcriptase reversa e um inibidor da protease. A HAART não cura nem reduz equitativamente todos os sintomas mas diminui significativamente as taxas de mortalidade e morbilidade por infecção por HIV. Reduz a carga viral em circulação. Não é possível suspender (acção curta) e existe probabilidade elevada de surgirem resistências virais ou reacções adversas. Se surgirem resistências, aconselha-se a fazer a genotipagem da estirpe viral (sequenciação das regiões codificantes das proteínas virais alvo da terapia). Pesquisam-se mutações e define-se uma nova estratégia terapêutica a seguir. Proteínas virais: → Glicoproteína gp120: ligação às moléculas CD4 do linfócito T, permitindo o contacto da gp41 com a membrana da célula (fusão das membranas e libertação do conteúdo viral). → Transcriptase reversa: produção de DNA viral a partir do RNA viral. → Integrase: catalisa a entrada do genoma viral no genoma hospedeiro (função de nuclease e ligase). → Protease: cliva as proteínas formadas, tornando-as maturas e activas.

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ANEXO B: TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR E CELULAR Microscopia

Conceitos → Ampliação: aumentar o tamanho da imagem. → Resolução: nível de detalhe que uma imagem comporta. → Limite de resolução: distância mínima entre dois pontos que permite que estes sejam percebidos como dois pontos distintos. Tipos de microscopia → Microscópio óptico: utiliza luz branca para iluminar preparações. Os microscópios tradicionais utilizam um conjunto de lentes convergentes que ajudam na formação de imagens ampliadas. → Microscópio de fluorescência: possui um filtro que permite a selecção de um determinado comprimento de onda (UV – IV) para iluminar a preparação. A radiação excita os fluorocromos (moléculas fluorescentes) presentes na amostra que vão, por sua vez, emitir radiação visível. Técnica muito utilizada em biologia molecular, já que permite distinguir diversos componentes/moléculas dentro da célula. → Microscópio electrónico: tem maior poder de resolução que o microscópio óptico. Utiliza um feixe de electrões que incide sobre as amostras e um conjunto de sistemas electromagnéticos para focar a radiação emitida pelas preparações. Existem dois tipos: De varrimento/scanning – as amostras são tratadas com metais pesados que reflectem os electrões, originando imagens tridimensionais dos objectos. De transmissão – os electrões atravessam fisicamente a amostra (impossibilidade de ver a amostra viva). Vantagens da microscopia de fluorescência vs. electrónica → Permite observar células vivas, o que com o microscópio electrónico é impossível, já que as células não sobrevivem ao feixe de electrões. → Permite ver mais que o corte muito fino característico do microscópio electrónico. Isto faz com que seja possível uma melhor ideia da aparência real da célula e não apenas do seu corte.

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Difracção por Raios-X

Utilizado quando se quer ver a composição de moléculas isoladas, de resolução superior à da microscopia electrónica. Consiste em três passos: 1) Formação de cristais da molécula em questão (por exemplo, proteínas). 2) Difracção do feixe de raio-X pela molécula. 3) Determinação da localização exacta de cada átomo, a partir do padrão de difracção.

Electroforese

Técnica com várias aplicações, que permite separar e identificar moléculas (proteínas, RNA e DNA). NOTA: para realizar electroforese, é  necessário  um  “substrato”  para  pôr a correr no gel. Para isso, recorre-se à preparação de homogenatos de células (“batidos  de  células”)   em   que   todos   os   constituintes   se   encontram   em   solução.   Para   os   separar   e   retirar os constituintes celulares a analisar, procede-se a lises e centrifugações a velocidades diferentes consoante o material que se quer aproveitar. Electroforese propriamente dita: colocam-se as  amostras  a  “correr”  num  gel,  isto  é,   colocam-se as amostras num gel, em poços, e, de seguida, faz-se uma corrente eléctrica atravessar o gel. Desta forma, os vários componentes das amostras vão migrar a diferentes velocidades, dispondo-se em várias bandas, sendo que cada uma delas é constituída pelo mesmo tipo de moléculas, com o mesmo tamanho e/ou carga. Quando se analisa uma pista/lane, está a analisar-se todas as proteínas/DNA presentes na amostra colocada no poço correspondente. Factores que influenciam a velocidade da migração: → Tamanho da molécula; → Carga eléctrica da molécula; → Viscosidade do meio ([agarose] ou [poliacrilamida]); → pH; → Temperatura; → Intensidade da corrente eléctrica. A electroforese pode ser em gel de agarose ou gel de poliacrilamida ou, ainda electroforese capilar. A diferença entre estes dois géis é a precisão (poliacrilamida é muito mais preciso, detectando varições de um único nucleótido). Página 83 de 89

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Na electroforese de DNA em gel de agarose é necessário corá-lo. Para tal, recorrese a corantes fluorescentes, como o brometo de etídio (tem grupos químicos que se intercalam entre as bases de DNA, fluorescendo com mais intensidade que o corante livre quando iluminado com radiação UV). Na electroforese de proteínas, podemos ter electroforese com base no ponto isoelétrico da proteína (pH no qual a proteína não apresenta carga). Neste isoelectric focusing, as amostras sofrem electroforese em gel de poliacrilamida, no qual está estabelecido um gradiente de pH (conseguido com recurso a vários buffers), de tal forma que, quando se dá a passagem de corrente eléctrica, as proteínas vão migrar até alcançarem o seu ponto isoeléctrico. Podemos ter ainda o SDS-PAGE, isto é, o SDS-polyacrilamide gel eletroforesis, em que as proteínas são sujeitas à acção de um detergente com carga negativa (o SDS), formando complexos negativamente carregados entre cadeias polipeptídicas e as moléculas de SDS. De seguida, são submetidas a uma electroforese em gel de poliacrilamida normal. Desta forma, a migração das proteínas vai traduzir o seu peso molecular.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Objectivo: obtenção de inúmeras cópias de um segmento de DNA/gene com características de interesse. Baseia-se na utilização de uma DNA polimerase termoestável que irá formar uma nova cadeia, tendo como molde uma cadeia existente. O início da síntese é definido pela ligação a um primer (segmento de DNA com cerca de 23 nucleótidos, preferencialmente  único  no  genoma,  que  se  liga  à  extremidade  3’  de  cada  uma  das  cadeias;   o forward tem a mesma sequência que a porção inicial da cadeia dada e o reverse é complementar dos nucleótidos  do  final  da   cadeia,  sendo   lido   no  sentido  5’   → 3’).   Esta técnica assume particular importância visto que todas as técnicas que se baseiam na análise de DNA utilizam, numa primeira fase, a reacção de PCR visto ser necessária grande quantidade de DNA para serem obtidos resultados mais verosímeis. Etapas de uma PCR 1) Isolamento da sequência a copiar (por electroforese, por exemplo); 2) Colocação na preparação da sequência isolada, DNA polimerase, dNTP (nucleótidos livres) e dois primers (forward e reverse); 3) Elevação da temperatura a 90ºC, desnaturando a dupla cadeia de DNA em duas cadeias simples;

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4) Redução da temperatura, permitindo a hibridização/annealing dos primers por complementaridade em extremidades opostas da sequência; 5) Elevação leve da temperatura, permitindo a ligação da polimerase e o início da síntese de DNA, a partir dos primers por extensão, no sentido 5’  → 3’; 6) Promoção de ciclos sucessivos dos passos 3, 4 e 5, resultando numa amplificação exponencial da sequência inicial. Fases de uma PCR → 1.ª fase (crescimento exponencial): crescimento exponencial do produto amplificado (cada ciclo duplica a quantidade de produto); → 2.ª fase: diminuição da velocidade de reação, deixando de se poder correlacionar o aumento de produto com a quantidade inicial de amostra; → 3.ª fase (plateau): esgotamento dos reagentes, deixando de haver amplificação. Variantes de PCR → RT-PCR (reverse transcription PCR): análise e ampliação de fragmentos de mRNA. Os passos são iguais aos descritos para a técnica normal, havendo apenas uma etapa prévia: o molde é uma molécula de mRNA, tendo por isso de ser transcrito em cDNA (transcriptase reversa). Esta técnica é utilizada para deteção da expressão génica de células (o mRNA indica quais os genes que estão activos nessa célula). → Real-time PCR: produto da reacção é marcado com fluorescência, sendo analisado durante a fase de crescimento exponencial. Torna a quantificação da amostra inicial mais fácil uma vez que a quantidade de produto obtido é directamente proporcional à quantidade de moléculas na amostra inicial. → PCR-RFLP (PCR restriction fragment length polymorphism): tratamento do produto com nucleases de restrição, obtendo-se fragmentos (ou não, se a sequência não tiver uma sequência de reconhecimento) mais pequenos de DNA que, por exemplo, podem ser submetidos a electroforese em gel de agarose (determinação de uma certa sequência associada a patologia).

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Detecção de Proteínas e Ácidos Nucleicos 1. Detecção de proteínas

Técnicas de detecção de proteínas: baseado na relação antigénio-anticorpo. Ensaio imunológico (imunoassay): testes baseados na ligação específica que existe entre uma imunoglobulina/anticorpo e a molécula que reconhece especificamente, o antigénio. Os anticorpos utilizados nestes testes são obtidos de animais de laboratório, que os produzem em resposta a uma imunização com o antigénio específico. Blotting: após uma electroforese em gel de poliacrilamida, pode recorrer-se a um blotting, em que se faz uma transferência do material sujeito a electroforese para uma membrana, uma folha de nitrocelulose, com a ajuda de corrente eléctrica. Existem três tipos de blotting: → Southern blotting: feito com DNA. Incubação com uma sonda específica, permitindo detectar a presença ou ausência de uma dada sequência. → Northern blotting: feito com RNA. Incubação com uma sonda específica, permitindo detectar a presença ou ausência de uma dada sequência. → Western blotting: feito com proteínas. Após sofrerem um SDS-PAGE e o blotting, as proteínas são incubadas com anticorpos específicos, que se vão ligar a proteínas específicas. As proteínas são assim identificadas pela sua massa molecular e anticorpo anti-proteína. O western blotting é muito utilizado em investigação laboratorial mas com muitas limitações para a prática clínica. Exemplo – teste à infecção por HIV. A electroforese é feita com as proteínas virais e, após o blotting, a folha de nitrocelulose é incubada com soro do paciente. Se este já tiver estado exposto ao vírus, vai possuir anticorpos contra as proteínas virais, que se vão ligar às mesmas. Depois adiciona-se um anticorpo anti-imunoglobulina humana associado a uma enzima e também um substrato desta enzima. Caso haja ligação antigénio-anticorpo, no local do antigénio irá aparecer um produto corado (pela degradação do substrato por acção da enzima). ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay): tem como objectivo detectar a presença ou quantificar antigénios ou anticorpos numa amostra biológica. → Detecção de um anticorpo específico: aplicação em testes para HIV ou à eficiência da vacina contra a hepatite B. 1) Antigénio específico é imobilizado numa superfície sólida (adsorção do antigénio). 2) Solução contendo soro do paciente é adicionada. Página 86 de 89

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3) Se anticorpo estiver no soro, vai ligar-se ao antigénio imobilizado. 4) Remove-se o soro. 5) Adiciona-se uma solução com anticorpos (anti-imunoglobulina humana) ligados covalentemente a uma enzima. 6) Se o anticorpo se ligar, a enzima, na presença do seu substrato, promove a formação de um produto corado, quantificável no espectrofotómetro. → Detecção de um antigénio: aplicação em quantificação de fármacos, de níveis hormonais ou de antigénios tumorais. 1) Anticorpo específico é imobilizado numa superfície sólida (adsorção do anticorpo). 2) Solução contendo soro do paciente é adicionada. 3) Se antigénio estiver no soro, vai ligar-se ao anticorpo imobilizado. 4) Remove-se o soro. 5) Adiciona-se uma solução com anticorpos semelhantes aos iniciais ligados covalentemente a uma enzima. 6) Se o anticorpo se ligar, a enzima, na presença do seu substrato, promove a formação de um produto corado, quantificável no espectrofotómetro. Imunocitoquímica (célula) e Imunohistoquímica (tecidos): células ou tecidos bem preservados morfologicamente são incubados com uma solução contendo um anticorpo específico para um determinado antigénio. Estes anticorpos específicos de antigénio (anticorpos primários) podem estar directamente acoplados a um fluorocromo ou a uma enzima (imunodetecção directa). Alternativamente, os anticorpos primários podem não estar marcados e ser detetados por um anticorpo antiimunoglobulina acoplado a um fluorocromo ou a uma enzima (imunodetecção secundária). Estas técnicas são utilizadas na detecção de marcadores tumorais em biópsias e na identificação de auto-anticorpos nas doenças auto-imunes.

2. Detecção de ácidos nucleicos Técnicas de detecção de ácidos nucleicos: suportada pela biologia – complementaridade de bases. Hibridação in situ: tem como objectivo detectar e/ou localizar a presença de sequências específicas de DNA ou de RNA em células, tecidos ou cromossomas de preparações de citogenética, usando uma sonda nucleotídica, isto é, um fragmento de DNA ou RNA (normalmente 100 a 1000 bases de comprimento) com sequência específica, que inclui nucleótidos modificados para permitir a sua detecção. A sonda de cadeia dupla de DNA tem de ser primeiro desnaturada em cadeias simples de DNA e depois incubada com a amostra biológica contendo o DNA alvo, também Página 87 de 89

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desnaturado. A sonda liga-se à sequência alvo na amostra biológica por complementaridade de bases. A detecção de sequências com maior ou menor grau de complementaridade depende de quão exigentes são as condições de hibridação usadas. As modificações mais comuns na preparação de sondas são a biotina ou a digoxigenina, que podem ser detetados por anticorpos específicos conjugados com fluorocromo ou enzimas. FISH (fluorescence in situ hybridization): caso particular da hibridação in situ em que são usados marcadores fluorescentes, detectados diretamente, recorrendo a microscopia de fluorescência. Tem a sua aplicação na detecção de sequências específicas em cromossomas mitóticos: genes, translocações, trissomias, entre outros.

Técnica do DNA Recombinante (rDNA)

Técnica de rDNA: conjunto de passos pelos quais segmentos de DNA de diferentes proveniências são combinados para fazer novo DNA. O DNA obtido (DNA recombinante), pode ser usado na clonagem de genes e modificações genéticas em organismos, permitindo, por exemplo, a produção de novas proteínas. Fases da técnica de rDNA 1) Isolamento da sequência de mRNA correspondente à proteína de interesse; 2) Utilização da transcriptase reversa para obter cDNA, sendo esta molécula seccionada em duas extremidades (coesivas ou cegas) por nucleases de restrição; 3) Seccionamento de um vector com a mesma nuclease (só pode ser seccionado uma única vez); 4) Introdução do cDNA seccionado no vector, por meio de ligases; 5) Introdução do vector numa célula hospedeira (eucariotas – transfecção, procariotas – transformação); 6) Multiplicação do vector na célula hospedeira; 7) Seleção das células hospedeiras com vector (antibiótico, por exemplo); 8) Produção de proteínas. Características de um bom vector: origem de replicação (permite replicar-se independentemente), zona de reconhecimento de várias nucleases de restrição, promotor da célula hospedeira (permite ligação à RNA polimerase), gene que confira resistência a antibiótico.

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Sequenciação de DNA Objectivo: determinar a ordem dos nucleótidos numa amostra de DNA. Método enzimático: produção de sucessivas cópias da molécula pela DNA polimerase, de forma a serem terminadas prematuramente por incorporação de dideoxinucleótidos (sem grupo hidroxilo na extremidade  3’).  Correlaciona-se tamanho das diversas cadeias e o último nucleótido incorporado, deduzindo-se a sequência de nucleótidos original. Actualmente, os didNTPs são marcados com fluorocromos, permitindo uma única reacção de sequenciação, no mesmo tubo, sendo a leitura determinada por electroforese capilar.

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