SCC Verificacion de La Micropipeta

 

investigación JL&B-aet* 1998; 10:115-»

Programa de evaluación de la calidad entre laboratorios.  X X . Verificación Verificación del uso y funcionamiento de micropipetas micropipetas Sergio I. Alva-Estrada,1Esther del Carmen Uhthotf-Brlto,2Lilia M. Fuentes-Mancilla,1Elvla M. Cabañas-Cortés1

 Abstractt  Abstrac The usefulness and reliability of clinical tests depend on variation sources control. One of the most important variation causes is the volume measurement and it is controlled by periodically monitoring and/or calibration of the used instruments. instrumen ts. Micropipettes can be verified using gravimetric or photocoiorimetric methods. The first one requires an analytical balance and the second one calibrated pipettes, which are not available for some clinical laboratories. This paper presents a photocoiorimetric procedure that allows to evaluate simultaneously, of o f reliable reliable and simple way, the right use, precision and accuracy of micropipettes, without the dependency of mentioned resources.

Keywords. Quality control. Quality assurance. External quality control. Internal quality control. R e s v u a t e n

La utilidad y confiabilidad de los análisis clínicos dependen del control de las fuentes de variación, entre ellas, ellas, la m edición de volúmenes es de e especial special importancia y se debe realizar a ttravés ravés de la verificación y/o calibración periódica de los instrumentos utilizados. Las micropipetas pueden ser verificadas por ei método gravimétrico o el fotocolorimétrico; para el primero se necesita, balanza analítica y para el segundo, pipetas previamente previament e calibradas; recursos limit limitantes antes para al algunos gunos laboratorios. En este traba trabajo jo se presenta un método fotocolorimétrico, que perm ite evaluar si simultáneamente multáneamente de manera confiable

' Profesores investi investigadores gadores del Departamento de Bioquím ica, ENCB-IP ENCB-IPN; N; becarios de COFAA y del Programa de Estímulo Estímulo al Desempeño D ocente. ! Profesora investigadora del Departamento de Asistencia Técnica, ENCB ENCB-IPN. CORRESPONDENCIA: Dr. en C. Sergio I. Atva Estrada. Departamento de Bioquímica, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Prol. De Carpió y Plan de Ayala, Colonia Sto. Tomás, 11340, México, D.F.

y sencilla, el uso correcto, la precisión y la exactitud de las micropipetas, sin la dependencia de los recursos antes mencionados.

Palabras Clave. Calidad. Variaciones analít analíticas. icas. Con trol de ca lidad lidad interno. C ontrol de c alidad extemo. I n t ro d u c c ió n

La utilidad y confiabilidad de los análisis clínicos dependen de que se controlen o limiten las diversas fuentes de variación.'1^ En la etapa analítica, analítica, la medición me dición de volúmenes es una de las fuentes fuentes de variación v ariación más importantes important es y debe ser c controlada ontrolada con la verificación verificación y/o calibración periódica de ios distintos instrumentos que se utiliz ti liz an.141 Dentro de las actividades actividades del Programa de Evaluación Evaluación de la Calidad Entre Laboratorios (PECEL) se han realizado numerosas visitas visitas de trabajo traba jo a diferentes laboratorios. Comúnmente, la causa de imprecisión y/o y /o inexactit inexa ctitud ud en sistemas analíticos analíticos manuales es qu que e no verifican verifican periódicamente el uso y funcionamiento de sus micropipetas. En consecuencia, al hacerlo h acerlo se obtienen coeficientes de variación (CV) (CV) y porcentajes de error elevados (hasta 15 y 40% respectivamente). También se han identificado identificado CVs elevados por po r el manejo de las mismas. misma s. Se ha observado que entre las razones por las que no se verifican las micropipetas es porque no saben cómo hacerlo y/o carecen de (os recursos necesarios para llevar a cabo el método gravimétrico'44»o el fotoco foto colorim lorim étrico .( .(4 4) Para el primero se necesita balanza analítica, con la que muchos laboratorios no cuentan actualmente y que tiene un costo elevado (30,000 pesos o 300 USD). Para el método fotocolorimétrico se requiere de una pipeta previamente calibrada con el método gravimétrico'41y en consecuencia co nsecuencia requieren igualmente de la balanza analítica. En este trabajo se presenta un método fotocolorimétrico que permite evaluar simultáneamente simult áneamente y de m anera sencilla, el uso correcto de las pipetas (CV del usuario) y el funciona funcionamiento miento de las mismas (CV y error de la pipeta), eliminando la carencia de la balanza analítica analítica y de micropipetas previamente calibradas. lABORAT-met» Vol. Vol. 10 No. 4 1998 115

 

Sergio /. Alv  Alvaa-E Estr tra ada y co cois is

Material  y  Métodos Para Par a claridad del método fotocolorimétrico q que ue se propone, se describen paso a paso, los procedimientos para la verificación de la precisión y exactitud del sistema de medición y posteriormente po steriormente el procedimiento realizado para la validación validación del método. Se necesita únicamente una solución de dicromato de potasio al 8% en agua destilada, un fotómetro y el material de vidrio que se señala.

Procedimient Proced imiento o p ara verificar la precisión  de los usuarios y las micropipetas

 A promedio x VNP VNP VOLUMEN DE LA PIPETA EN pL = ---- - ------------------- A del estándar estándar rel relati ativo vo La La A  A promed pr omed io es el valor obtenido durante la verificación de la precisión. VNP es el valor nominal nom inal de la pipeta. Por ejempl ejemplo, o, si la pipeta es de volumen fijo entonces VNP es el volumen que especifica el fabricante; si es de volumen variable y se miden mide n 20 ju uL L el VNP = 20, si se m miden iden 50 pL el VNP = 50.  A del Estándar Relativo es la absorbanc abs orbancia ia del estándar estándar relativo. • Calcular el % de error con la fórmula: % Error = (Vobs-Vesp) x 100/Vesp

• En cada uno de 20 tubos de 10 x 75 m mm, m, colocar la solución del dicromato, con la micropipeta que se desee verificar y agua en proporciones de 10 //L por cada mL, respectivamente, y mezclar por inversión. La medición del volumen de agua debe hacerse con el máximo cuidado util u tilizando izando una pipeta adecuada para el volumen deseado. des eado. (Evitar medir con la parte ffinal inal de la pipeta.) • Leer Leer la absorbancia absorbanc ia de cada ttubo, ubo, frente a blanco de agua y a 500 nm de longitud lon gitud de onda. Asegurarse que el equipo puede medir el volumen utilizado.

Vobs es el volumen de la pipeta, determinado con la primer fórmula y Vesp es el valor nominal de la pipeta. • Interpretación de resultados: el % de error de la pipeta debe ser menor de 2%. Si es mayor la pipeta debe calibrarse. Al respecto hay que señalar que algunas pipetas se calibran pero otras no. Esto deberá consultarse en el instructivo del fabricante.

 Validación del de l método

•• Con las las absorbancias obtenidasElcalcular el C CV. V. la Interpretació n de resultados: CV representa imprecisión acumulada del usuario y de la pipeta. Si el CV es menor o igual al 2%, entonces el usuario la usa bien y la pipeta funciona correctamente. Si el valor es mayor, la imprecisión puede ser debida a mal manejo de la pipeta, al incorrecto funcionamiento de la misma o a ambos. Entonces se deberá investigar la causa, haciéndolo con más cuidado, con otra pipeta o por otro usuario. • Si la pipeta es la que tiene imprec imprecisión, isión, tal vez se corrija dándole mantenimiento, pero habrá que verificarla después de efectuarlo. Los instructivos de las pipetas señalan cómo realizarlo e incluyen información para limpieza, limpieza, lubricación y s ubstitución de empaques o piezas.

Para evaluar la linealidad, dos usuarios prepararon un una a serie de 15 tubos de 10 x 75 mm, a los que se adicionaron 2.0 mL de agua destilada y volúmenes de la solución de dicromato dicroma to de potasio, desde desd e 10 hasta 50 ju juL, L, con intervalos intervalos de 2 f j L para los primeros prim eros 11 tubos tub os y de d e 5 juL para los 4 siguientes. Se leyó la absorbancia de cada dilución, frente a blanco de agua y a 498 nm, en un fotómetro BM4010. Se construyó una gráfica con los volúmenes utilizados y las absorbancias correspondientes y se calculó la pendiente, el intercepto y el coeficiente de regresión lineal. Multiplicando la absorbancia de cada tubo, por el factor de dilución correspondiente y dividiendo entre 101 (factor de dilución del estándar relativo), se calculó la absorbancia que daría cada tubo si se hubiera hecho una dilución equivalente a la del estándar y con los resultados

Procedimiento para verificar la exactitu Procedimiento exactitud d  de las micropipetas

se estableció el CV del procedimiento.

La técnica se basa en la utilización de lo que hemos denominado estándar relativo. Este se prepara utilizando múltiplos enormes (para evitar el error) de la misma proporción de 10 / j L del dicromato por cada mL de agua.• agua.•

Para evaluar la eficiencia del método fotocolorimétrico, en la determinación del volumen de las micropipetas, dos usuarios realizaron el procedimiento antes descrito y, con los resultados se construyó una gráfica del volumen obtenido contra el esperado. Se calculó la pendiente, el intercepto intercept o y los coeficientes coeficientes de correlación correlación V y de determinación “ R2” .

• Preparar el estándar relativo depos depositar itar 5 mL de la solución de dicromato y llenar hasta el aforo con agua destilada un matraz de 500 mL. • Leer la absorbanc absorbancia ia (A) del estándar relativo,  relativo,  simultáneamente simult áneamente con los tubos con los que se determinó la imprecisión.

Se comparó la eficiencia del método fotocolorimétrico con la del método gravimétrico (éste se llevó a cabo pesando 20 veces el agua depositada con la pipeta). Con ambos métodos se determinó la precisión y la exactitud de 6 pipetas de 20 pL (o igual volumen en aquéllas de volumen variable), que estaban en uso en diferentes laboratorios.

• Calcular el volumen que la pipeta está midiendo con lla a fórmula siguiente.

Los resultados de ambos métodos se compararon estadísticamente, Con la prueba "t” de Student se investigó

116

LA BO RA T-ae ta Vo Vol, l, 10 No. 4 199 1998 8

 

PECE PECEL L en funcionam iento de m lcropipetas

ouauwvoi  A  AU UHMW02

Gráfica 2. Estudio del valor pred ictivo del sist sistema ema de verificación de la exactitud de las micropip^tas.

Gráfica 1. Unealidad del método coJorimétr coJorimétrico ico para verificación de micropipetaa, se usaron 2 m L de agua po r cada volumen de dicromato.

(volumen esperado). La pendiente de la recta fue de 1.0 (volumen 1.002, 02,   el intercepto de “0" y el coeficiente de determinación de   0.999.

el significado de las diferencias entre los promedios  promedios  (diferencias en la exactitud), y con la prueba de "F" el de  de  las varianzas varianzas (diferencias en la precisió precisión).m n).m

En la tabla 1 se presenta presentan n los resultados experimentales,  experimentales,  obtenidos con los métodos fotocolorimótrico y  y  gravimétrico. Se incluyen los resultados d e los análisis  análisis  estadísticos esta dísticos correspondientes.

RemUadoe

En la gráfica 1 se presenta la a absorb bsorb ancia obtenida para para   cada dilución del dicromato de potasio. dede la   la  recta fue de 0.0166, el intercepto de *0" La y elpendiente coeficiente de  determinación 0.999. En la gráfica 2 se relaciona el volumen calculado co n el el   método fotocolorimétrico y el volumen nominal de la pipeta

Dfaenaióa Los datos mostrados en la gráfica 1 sugieren qu e el  el  fotómetro utilizado, utilizado, la pip eta y el procedimiento seguido seguido   para las diluciones funcionan correctamente, lo que se

Tabia 1. Comparación da los resultados ds la verificación verificación d s mlcrop ipeta ipetas s con tos tos   métodos gravimétrico y fotocolorimótrico Método Gravimétrico

Promedio D.E. C %.Ve.rror

Pipeta 1

Pipeta 2

Pipeta 3

Pipeta 4

Pipeta 5

P ip e ta d

17,42 0.11

19.48 0.08

19.65 0.08

19.63 0.05

20.47 0.07

19.57 0.12

60 5 -1 20..9

40 0 -20..6

3 -10..745

5 -10..825

0 2..3 33 5

0.59 -2.15

Método Fotocokrrlmé Fotocokrrlmétrtco trtco

Promedio D.E. C.V. % error 

Pipeta 1

Pipeta 2

Pipeta 3

Pipeta 4

Pipeta 5

P ip e ta d

17.53 0.22 1.23 -12.35

19.54 0.14 0.74 -2 .2 8

19.72 0.13 0.64 -1.41

19.69 0.21 1.05 -1 .5 6

20.52 0.22 1.07 2.61

19.55 0.25 1.29 -2 .2 5

Resultados Resulta dos de la pru eba de “t” d e Student Probabilidad S*g. estadístico

0.18 NS

0.24 NS

0.18 NS

0.46 NS

0.82 NS

0.001

0.02 S

0.40 NS

Resultados Result ados ds la prueba de **r  Probabilidad Sig. estadístico

0.04 S

 

0.04

s

0.12 NS

0.0001 S

 

s

LA BO K A X* «te Vol Vol.. 10 No. 4 19 1996 96 11 117 7

 

Sergio I. Alva-Estrada y cois

ia precisión de los usuarios y la precisión de las micropipetas.

confirma con los datos de la recta (R2= 0.999, b = 0) y del coeficiente de variación del procedimiento que fue de 1.4 por ciento.

Finalmente, conviene recordar que si la pipeta Finalmente, pipe ta tiene tiene precisión pero carece de exactitud, el problema se compensa si junto con las muestras problema se procesa un estándar, pero que en aquellos métodos en los cuales no hay estándar (enzimas, bilirrubinas y colesterol), el error de la pipeta se sumará a los de otras fuentes de inexactitud.

Los datos de la gráfica 2 muestran que el método fotoco lori métrico tiene la capacidad de establece establecerr el volumen que mide una pipeta, al menos en el intervalo de 10 a 50pL (R2= 0.999). En la la tabla 1 se observa que el método foto fotocolori colori métrico proporciona resultados equivalentes a los del método gravimétrico, ya que al compararlos estadísticamente, no se encontraron diferencias significativas en la exactitud (p>0.05 en la prueba de “t" de Student), a pesar de que las diferencias en la precisión sí fueron significativas (p