Saccharomyces cerevisiae

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 Saccharomyces cerevisiae

Clasificación científica

Reino:: Reino

Fungi

División:: División

Ascomycota

Clase:: Clase

Hemiascomycetes

Orden:: Orden

Saccharomycetales

Familia:: Familia

Saccharomycetaceae

Género:: Género

Saccharomyces

Especie:: Especie

 S. cerevisiae

Nombre binomial

 Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen

La levadura de cerveza (  Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen ) es un hongo unicelular , un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. El ciclo de vida de las levaduras alterna dos formas, una haploide y otra diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemación. En condiciones muy determinadas la forma diploide es capaz de reproducirse sexualmente. En estos casos se  produce la meiosis en la célula formándose un asca que contiene cuatro ascosporas haploides. S. cerevisiae es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas biológicos.

Es un sistema eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de la bacteria  pero que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas. Además de su rápido crecimiento, la dispersión de las células y la facilidad con que se replican cultivos y aíslan mutantes, destaca por un sencillo y versátil sistema de transformación de ADN. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulación con las mínimas precauciones. S. cerevisiae es un sistema genético que, a diferencia de la mayoría de los otros

microorganismos, presenta dos fases biológicas estables: haploide y diploide. La fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de complementación. Una levadura haploide contiene 16 cromosomas que varían en tamaño de 200 a 2200 kilobases (kb). Una ventaja adicional de este microorganismo consiste en que se conoce la secuencia completa de su genoma y se mantiene en constante revisión. Ello ha permitido la manipulación genética de los casi 6600 genes que codifica el genoma de levadura, el uso extensivo de micromatrices de ADN para investigar el transcriptoma y estudios a escala genómica de, entre otros muchos aspectos, la expresión génica, localización de proteínas y la organización funcional del genoma y el proteoma. La maquinaria molecular de muchos procesos celulares se encuentra conservada tanto en levaduras como en plantas y en mamíferos. Esto se ilustra con el hecho de que rutinariamente se han introducido genes de eucariotas superiores en levaduras para el análisis sistemático de su función. Por estas razones, S. cerevisiae se ha convertido en una importante herramienta a gran escala de análisis de genómica funcional, proporcionando un punto de partida para el análisis de organismos eucariotas más complejos. Al ser un organismo unicelular con una tasa de crecimiento rápida, la levadura se puede utilizar para los estudios de células que resultarían muy complicados o costosos en organismos multicelulares. Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producc ión de cerveza,  pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el  proceso de fermentación. Básicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se

encuentra en un medio muy rico en azúcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metabólicas que le permiten obtener un mayor rendimiento energético, y por tanto no realiza la fermentación. Desde el punto de vista científico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple de la célula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de división celular (aproximadamente dos horas). Contenido

[ocultar ] y y

1 Nutrición de S. cerevisiae 2 Apareamiento en levaduras 2.1 Ciclo sexual de Saccharomyces cerevisiae 2.1.1 Diferencias entre células a y  2.1.2 Diferencias entre células haploides y diploides 2.2 Cambio sexual en Levaduras 2.2.1 HML y HMR  2.2.2 Mecanismo del cambio sexual 2.2.3 Direccionalidad del cambio sexual 3 Genoma de S. cerevisiae 3.1 Patogenia 4 Referencias 5 Enlaces externos o

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[editar] Nutrición de S. cerevisiae Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varían desde los carbohidratos hasta los aminoácidos. Además, la capacidad de utilizar ciertos tipos de azúcares ha sido tradicionalmente empleada para la caracterización de las distintas razas que esta especie  presenta. Entre los azúcares que puede utilizar están monosacaridos como la glucosa, fructosa, manosa y galactosa, entre otros. También son capaces de utilizar disacáridos como la maltosa y la sacarosa y trisacáridos como la rafinosa. Uno de los azúcares que no puede metabolizar es la lactosa, utilizándose este azúcar para distinguir esta especie de Kluyveromyces lactis . También es capaz de utilizar otras fuentes de carbono distintas a carbohidratos y aminoácidos. Entre las más destacadas se encuentra la capacidad de utilizar  tanto etanol como glicerol. Por norma general, las levaduras mantienen dos tipos de metabolismo muy bien diferenciados. Por una parte, en condiciones en las que existen altas concentraciones de glucosa, fructosa o maltosa, la tendencia es a realizar una fermentación alcohólica de estos, es decir, se realiza la glucólisis y posteriormente se forma etanol. Una vez que estos azúcares escasean, se produce la respiración del etanol, víaciclo de Krebs. Evolutivamente esto es un proceso que, a priori, no es ventajoso por ser energéticamente desfavorable para la reproducción del organismo, dado que se obtiene mucha menos

energía en el primer proceso que en el segundo. No obstante, la gran mayoría de los organismos son muy sensibles al etanol, por lo que se ha entendido como un proceso de competencia por sustrato. Las levaduras, además de necesitar una fuente de carbono, necesitan tanto fuentes de nitrógeno ²como podrían ser el amonio, la urea o distintos tipos de aminoácidos ² como fuentes de fósforo. Además, son necesarias vitaminas como la Biotina, también llamada Vitamina H, y distintos elementos traza

[editar] Apareamiento en levaduras El apareamiento sexual de las levaduras sólo puede ocurrir entre células haploides de distinto sexo. Se definen por tanto dos tipos sexuales de levaduras, las células a y las células alfa. En el caso de las levaduras, la determinación sexual no se debe a un cromosoma distinto entre sexos sino más bien a una diferencia en un único locus. Dicho locus se conoce con el nombre de  MAT  y gobierna el comportamiento sexual entre células haploides y células diploides. [editar] Ciclo sexual de Saccharomyces cerevisiae

Ciclo sexual de Saccharomyces cerevisiae. Las levaduras pueden ser haploides o diploides según el estadio del ciclo. No obstante, ambos tipos celulares son estables y se pueden reproducir de forma asexual mediante mitosis. La división es por gemación, es decir, las células hijas son de tamaño inferior al de las células madre. Como ya se ha comentado antes, sólo las celulas haploides se pueden reproducir sexualmente, por lo que si una célula de tipo a se encuentra con una célula de tipo  se fusionarán en una sola célula, la cual también sufrirá una fusión de núcleos,

formándose un diploide estable que también es capaz de reproducirse de forma asexual. Cuando las condiciones exteriores son desfavorables para las células diploides, sobreviene la meiosis, que provocará la aparición de cuatro esporas haploides, dos de las cuales serán de tipo sexual a y las otras dos de tipo sexual . [editar] Diferencias entre células a y 

Las células a producen el "Factor a", que es una feromona peptídica que indica la presencia de células de ese mismo tipo a células del sexo opuesto. Las células a no responderán en ningún caso al factor a, pero sí lo harán si en las inmediaciones existe Factor . Este tipo de respuesta desencadena la formación de una protuberancia en las células hacia la fuente de las feromonas de sexo contrario y es recíproco. En la actualidad se conocen las bases moleculares que rigen este comportamiento, el cual se debe a la transcripción o represión de genes en los dos tipos sexuales de levaduras. Las células a transcriben los genes que  producirán el factor a, además de un receptor de membrana que se conoce con el nombre de Ste2p. Dicho receptor es capaz de unirse al factor  y desencadenar una serie de señales intracelulares mediadas por la proteína G. Además, las células a reprimen la expresión de los genes que formarán las proteínas necesarias para la síntesis del factor  y el receptor de membrana Ste3p. En las células  ocurre exactamente lo contrario a lo descrito. Todas estas diferencias entre activación y represión transcripcional son causadas por la presencia de uno de los dos alelos de un locus denominado MAT:  MAT a o  M at. El alelo  M at a codifica  para una única proteína denominada a1. El alelo  M at codifica para 1 y 2, que en los haploides dirigen la transcripción del programa específico de las células . miguel angel  paramo [editar] Diferencias entre células haploides y diploides

Las células haploides de cualquiera de los sexos responde a la feromona producida por el sexo contrario. Las células de sexo opuesto podrán fusionarse, formando una célula diploide. Las células haploides nunca podrán realizar la meiosis en condiciones normales. Por el contrario, las células diploides no producen ni responden a ninguno de los dos tipos de feromonas, pero sí pueden realizar meiosis bajo condiciones ambientales muy determinadas. Al igual que existen patrones de expresión génica entre células a y , también existen diferencias entre la expresión génica entre células haploides y diploides. Un ejemplo de esto último es el caso de la endonucleasa HO, que es expresada en las células haploides, o el caso de IME1, cuya expresión está reprimida en los diploides. Las diferencias entre los patrones de expresión entre haploides y diploides son producidas por  el locus  MAT . Las células haploides sólo contienen una copia del locus MAT , en cualquiera de sus varientes alélicas, y esta determinará el sexo de la célula. Los diploides resultan de la fusión celular entre células de distinto sexo, por lo que presentan los dos loci. La combinación en la información contenida en ambos loci genera el programa transcripcional, es decir, la combinación entre las proteínas a1, 1 y 2. [editar] Cambio sexual en Levaduras

Una levadura haploide es capaz de cambiar de sexo. De tal forma que si una única célula de tipo a o  está en un medio sin la presencia del sexo contrario, al cabo de unas cuantas generaciones se advierte la presencia de la feromona contraria y un incremento en células diploides. Esta aparición de diploides puede ser tan alta que desplaza la población de haploides, ya que esta última población tiene una alta tendencia a aparearse. Las cepas de levaduras utilizadas en los laboratorios no suelen realizar este cambio de sexo debido a que están alteradas en el gen  HO, que es determinante para el cambio de sexo. Esto genera una  propagación estable de cualquiera de los tipos celulares de los haploides, y nunca se llegan a formar diploides, en condiciones normales. [editar] HML y HMR 

Localización de los loci  H  ML y  H  MR con respecto al locus activo  MAT  en el cromosoma III de Saccharomyces cerevisiae. ¿Cómo pueden cambiar las levaduras de sexo si este fenotipo viene dado por un único locus  MAT ? La respuesta es simple: las levaduras poseen copias del locus MAT  que están silenciadas y por tanto no interfieren en la determinación sexual. Cuando se produce un cambio en el sexo de las levaduras, se produce un reemplazamiento génico del locus MAT   por una de las copias adicionales. Las copias silenciosas se denominan  H  ML (que generalmente llevan una copia silenciosa del alelo MAT ) y  H  MR (que generalmente lleva una copia silenciosa del alelo  MAT a). Ambos loci se encuentran en el cromosoma III y están situados a derecha ( H  MR, donde la R es de right ) y a izquierda ( H  ML, donde la L es de l eft ) del locus  MAT  en cualquiera de sus variantes alélicas. [editar] Mecanismo del cambio sexual

El proceso de cambio sexual en las levaduras viene dado por la conversión génica iniciada  por la endonucleasa  HO. La expresión de dicha endonucleasa está regulada específicamente en los haploides y sólo es activa en las células haploides durante la fase de ciclo celular G1. La endonucleasa  HO genera un corte específico en el ADN del locus  MAT . Una vez se realiza el corte, los extremos libres generados son atacado s por exonucleasas,  produciéndose la degradación del locus MAT en ambos sentidos. Esta ausencia de parte de un locus genera la activación de sistemas de reparación del ADN que conllevan el reemplazamiento del locus ausente por una de las copias adicionales H  MR o  H  ML. [editar] Direccionalidad del cambio sexual

Por razones que todavía no se conocen muy bien, la reparación del locus MAT  cortado por  la endonucleasa  HO permite el cambio sexual, ya que, por norma general, se reemplaza por  el alelo contrario al que estaba en un principio. De esta forma cuando una célula a decide realizar un cambio sexual, el alelo  MAT a es degradado y reemplazado por la copia H  ML. Esto da como resultado el cese de la expresión del antiguo  MAT a y el inicio de la expresión del nuevo  MAT , con todo lo que esto conlleva.

[editar] Genoma de S. cerevisiae El genoma de esta levadura contiene un conjunto de dieciséis cromosomas completamente caracterizados. Sus tamaños oscilan desde 200 a 2.200 kb. Se calcula que aproximadamente debe contener unos 6200 marcos abiertos de lectura, o genes. [editar] Patogenia Saccharomyces cerevisiae no se considera un patógeno común. Actualmente cobra

importancia su papel oportunista en sepsis en enfermos de leucemia y otras infecciones oportunistas en enfermos de sida.

Microscopio compuesto

Un microscopio compuesto es un microscopio óptico que tiene más de una lente de objetivo. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está conformado por tres sistemas: y

El sistema mecánico está constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar  y detener los instrumentos a observar.

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y

El sistema de iluminación comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas de tal manera que producen las ranuras de luz. El sistema óptico comprende las partes del microscopio permiten un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".

Parte mecánica del microscopio

Esquema de un microscopio óptico. La parte mecánica del microscopio comprende el pie, el tubo, el revólver, el asa, la platina, el carro y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen la parte óptica y de iluminación; además, permiten los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto. y

y

y

El pie y soporte: Constituye la base sobre

la que se apoya el microscopio y tiene  por lo general forma de Y o bien es rectangular. La columna o brazo: llamada también asa, es una pieza en forma de C, unida a la  base por su parte inferior mediante una charnela, permitiendo la inclinación del tubo  para mejorar la captación de luz cuando se utilizan los espejos. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie. El tubo: tiene forma cilíndrica y está ennegrecido internamente para evitar los reflejos de la luz. En su extremidad superior se colocan los oculares y en el extremo inferior el revólver de objetivos. El tubo se encuentra unido a la parte superior de la columna mediante un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos.

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El tornillo macrométrico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del

microscopio, deslizándose en sentido vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rápido de la preparación. El tornillo micrométrico: mediante el ajuste fino con movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y nítido de la preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm., que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor  de los objetos. La platina: es una pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u objeto que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje óptico del tubo, que permite el  paso de los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija, en cuyo caso  permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. Las pinzas: son dos piezas metálicas que sirven para sujetar la preparación. Se encuentran en la platina. Carro móvil: es un dispositivo que consta de dos tornillos y está colocado sobre la  platina, que permite deslizar la preparación con movimiento ortogonal de adelante hacia atrás y de derecha a izquierda. El revólver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en  posición de trabajo, lo que se nota por el ruido de un piñón que lo fija.

[editar] Sistema óptico El sistema óptico es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Está formado por el ocular y los objetivos. El objetivo  proyecta una imagen de la muestra que el ocular luego amplía. y

y

se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercanía de la pieza con el ojo del observador. Tiene como función aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micrométrica; estos últimos tienen la finalidad de medir el tamaño del objeto observado. Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revólver y producen el aumento de las imágenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión. Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Así, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y su apertura numérica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número de objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los El ocular:

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aumentos de los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. El objetivo de inmersión está compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a través de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

sistema: sistema de enfoque: Base:

[editar] Sistema de Iluminación Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos: y

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y

Fuente de iluminación: se trata clásicamente de una lámpara incandescente de

tungsteno sobrevoltada; en versiones más modernas con leds. Por delante de ella se sitúa un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que permite controlar el diámetro de la parte de la preparación que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observación produciendo luces  parásitas. El espejo: necesario si la fuente de iluminación no está construida dentro del microscopio y ya alineada con el sistema óptico, como suele ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cóncava se emplea de preferencia con iluminación artificial, y la plana, para natural (luz solar). Los modelos más modernos no poseen espejos sino una lámpara que cumple la misma función que el espejo. Condensador: está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar  los rayos luminosos sobre el plano de la preparación, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo del objetivo. El condensador se sitúa debajo de la  platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior   plana en contacto con la preparación cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliación); existen condensadores de inmersión, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparación. La abertura numérica máxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se logrará aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un to rnillo, bajándose para su uso con objetivos de poca potencia. Diafragma: el condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrándolo más de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolución del sistema óptico.

y es que produce la luz para poder ver mejor las bactearias que nos rodean

[editar] Trayectoria del rayo de luz a través del

microscopio El haz luminoso procedente de la lámpara pasa directamente a través del diafragma al condensador. Gracias al sistema de lentes que posee el condensador, la luz es concentrada sobre la preparación a observar. El haz de luz penetra en el objetivo y sigue por el tubo hasta llegar al ocular, donde es captado por el ojo del observador. Propiedades del microscopio y

y

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Poder separador. También llamado a veces poder de resolución, es una cualidad del microscopio, y se define como la distancia mínima entre dos puntos próximos que  pueden verse separados. El ojo normal no puede ver separados dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de milímetro. En el microscopio viene limitado  por la longitud de onda de la radiación empleada; en el microscopio óptico, el poder  separador máximo conseguido es de 0,2 décimas de micrómetro (la mitad de la longitud de onda de la luz azul), y en el microscopio electrónico, el poder separador  llega hasta 10 Å. Poder de definición. Se refiere a la nitidez de las imágenes obtenidas, sobre todo respecto a sus contornos. Esta propiedad depende de la calidad y de la corrección de las aberraciones de las lentes utilizadas. Ampliación del microscopio. En términos generales se define como la relación entre el diámetro aparente de la imagen y el diámetro o longitud del objeto. Esto quiere decir que si el microscopio aumenta 100 diámetros un objeto, la imagen que estamos viendo es 100 veces mayor linealmente que el tamaño real del objeto (la superficie de la imagen será 1002, es decir 10.000 veces mayor). Para calcular el aumento que está proporcionando un microscopio, basta multiplicar los aumentos respectivos debidos al objetivo y el ocular empleados. Por ejemplo, si estamos utilizando un objetivo de 45X y un ocular de 10X, la ampliación con que estamos viendo la muestra será: 45X x 10X = 450X, lo cual quiere decir que la imagen del objeto está ampliada 450 veces, también expresado como 450 diámetros.

Campo

del microscopio

Paramecium aurelia. Microscopio óptico. El mejor conocido de los ciliados. Las burbujas que se ven son vacuolas. Todo el cuerpo está cubierto de cilios, que se ven borrosos debido a sus rápidos movimientos. Se denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa a través del microscopio. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través del microscopio. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir  que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. Para medir el diámetro del campo del microscopio con cualquiera de los objetivos se utiliza el micrómetro, al que se hará referencia en el siguiente punto.

Tipos de microscopios Existen diversas clases de microscopios, según la naturaleza de los sistemas de luz, y otros accesorios utilizados para obtener las imágenes. El microscopio compuesto u óptico utiliza lentes para ampliar las imágenes de los objetos observados. El aumento obtenido con estos microscopios es reducido, debido a la longitud de onda de la luz visible que impone limitaciones. El microscopio óptico puede ser  monocular, y consta de un solo tubo. La observación en estos casos se hace con un solo ojo. Es binocular cuando posee dos tubos. La observación se hace con los dos ojos. Esto  presenta ventajas tales como mejor percepción de la imagen, más cómoda la observación y se perciben con mayor nitidez los detalles. Microscopio estereoscópico: el microscopio estereoscópico hace posible la visión

tridimensional de los objetos. Consta de dos tubos oculares y dos objetivos pares para cada aumento. Este microscopio ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeños aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se encuentra entre 2 y 40X o aumento total del microscopio. Microscopio de campo oscuro. Este microscopio está provisto de un condensador 

 paraboloide, que hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparación. Los objetos aparecen como puntos luminosos sobre un fondo oscuro.

Microscopio de f luorescencia. La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas

sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas. El tratamiento del material biológico con flurocromos facilita la observación al microscopio

Los medios de cultivo en microbiología Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los

microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 1-

disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente

pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2-

consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio. 3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- condiciones adecuadas de humedad Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5-

Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. 6- pH La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. 7- Temperatura Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios. 8- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

La

evolución de los medios de cultivo

Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexión en su evolución.

La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido. Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas. En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.

T ipos

básicos de medios de cultivo

atendiendo a su estado físico: líquidos

semisólidos sólidos

atendiendo a su utilidad práctica: Medios para aislamientos primarios: Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc) selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina) enriquecidos:

ralentizan/suprimen

el

crecimiento

de

la

flora

competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein). Medios para identificación: diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación)

Bibliografía

http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html