sac ky loc gel

2.4. Sắc ký gel [6, 9] Sắc ký gel đã được Mould D.L. phát triển từ năm 1954 để tách các hợp chất không mang điện tích theo thứ tự trọng lượng phân tử của chúng. 2.4.1. Nguyên tắc cơ bản của sắc ký lọc gel Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này được phủ đầy dung môi dùng làm pha động. Các lỗ rỗng phải có kích thước đồng nhất vì kích thước của lỗ đóng vai trò quan trọng trong quá trình sắc ký. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân tử khác nhau có thể tách riêng được hay không là tùy thuộc vào kích thước lỗ rỗng. Các phân tử có kích thước to hơn lỗ rỗng, không thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng, nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột. Các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ toàn phần hoặc bán phần lọt vào lỗ rỗng, cuối cùng theo dòng chảy đi ra khỏi cột.

Hình 20: Nguyên tắc của sắc ký gel [6] Như vậy, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký gel, sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trọng lượng phân tử, phân tử lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử nhỏ đi ra khỏi cột sau. Lực hấp thu trên bề mặt hạt gel không được kể đến, vì thế sắc ký gel được xem là sắc ký phân chia. 2.4.2. Các loại hạt gel của sắc ký gel

Việc tách trong sắc ký gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ không gian ba chiều. Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ học, các lỗ rỗng trong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất. Muốn tách một hỗn hợp chứa nhiều loại hợp chất có trọng lượng phân tử khác nhau thì phải sử dụng nhiều loại gel khác nhau, để mỗi loại sẽ tách riêng một nhóm hợp chất có khoảng trọng lượng phân tử xác định. 2.4.2.1. Gel dextran ( tên thương mại là gel Sephadex) Gel dextran là polysaccharid thiên nhiên, mạch thẳng, nghĩa là chuỗi dây polyglucose nối với nhau bởi nối α - 1,6. Nguyên liệu này không hòa tan trong nước. Một chuỗi dây polysaccharid của dextran được tạo mạng ngang, bởi nối glyceryl, giữa các nhóm - OH khi cho phản ứng với hợp chất epiclorohydrin trong dung môi hữu cơ ở điều kiện kiềm. Sản phẩm tạo thành là chất rắn, dạng hình cầu, không tan trong nước, nhưng có tính ái nước cao. Trong quá trình thực hiện phản ứng, thay đổi tỷ lệ giữa dextran và epiclorohydrin, sẽ làm thay đổi độ tạo mạng ngang, từ đó có thể điều chế các loại gel với lỗ rỗng kích cỡ khác nhau. Gel Sephadex không tan trong nước, bền trong các dung dịch nước muối, dung dịch kiềm, cả trong dung môi hữu cơ. Chỉ khi tiếp xúc lâu với acid vô cơ mạnh mới bị phân hủy. Gel ổn định an toàn trong khoảng pH = 2 - 12. Gel Sephadex thương mại thường có ghi kèm chỉ số để chỉ lượng nước mà gel khô cần hút lấy để thành gel trương nở. Bảng 9: Thời gian cần thiết để làm trương nở gel Sephadex Loại gel

Thời gian cần để gel trương nở ( giờ) Ở nhiệt độ phòng

Ở trên bếp cách thủy 1000C

G - 10, G - 15, G - 25, G - 50

3

1

G - 75

24

3

G - 100, G - 150, G - 200

72

5

Bảng 10: Một số loại gel dextran Sephadex G và tính chất của gel Loại

gel Kích

Sephadex G

thước Lượng nước Thể tích gel Khả năng tách các hợp chất

hạt gel khô gel có thể hút nở (µ)

( ml/g)

trong theo trọng lượng phân tử

nước

Peptit, protein Các

phân

( ml/g)

hình cầu

đoạn dextran

G - 10

40 - 120

1,0 ± 0,1

2–3

0 - 700

0 - 700

G - 15

40 - 120

1,5 ± 0,1

2,5 - 3,5

0 - 1.500

0 - 1.5700

G - 25, thô

100 - 300

2,5 ± 0,2

4–6

0 - 1.500

100 - 1.500

G - 25, trung 50 - 150 bình G - 25, mịn

20 - 80

LH - 20

25 - 100

2,1

4,0 - 4,5

-

-

G - 50, thô

100 - 300

5,0 ± 0,3

9 – 11

1- 30.000

500 - 10.000

G - 50, trung 50 - 150 bình G - 50, mịn

20 – 80

G - 75

40 - 120

7,5 ± 0,5

12 – 15

3 – 70.000

1 - 50.000

G - 100

40 - 120

10 ± 1

15 – 20

4 - 150.000

1 - 100.000

G - 150

40 - 120

15 ± 1,5

20 – 30

5 - 400.000

1 - 150.000

G - 200

40 - 120

20 ± 2

30 – 40

5 - 800.000

1 - 200.000

2.4.2.2. Gel polyacrylamid ( gel Bio - gel loại P) Là loại polymer tổng hợp dưới dạng hạt hình cầu, chế tạo từ acrylamid ( CH 2 = CH - CONH2) với N, N - metylenbisacrylamid. Thay đổi tỷ lệ của hai cấu phần monomer nên trên sẽ làm thay đổi kích thước của lỗ rỗng. Hạt gel có kích thước trung bình 45 - 180 µm. Bio - gel tương đối trơ, nhưng kém bền hơn Sephadex. Gel ổn định bền ở môi trường pH = 2 - 11. Trong môi trường kiềm mạnh, các nối amid bị thủy giải thành acid carboxylic, điều này khiến cho gel có tính chất gần giống nhựa trao đổi ion, vì thế không nên sử dụng Bio - gel cho trường hợp sắc ký thực hiện thời gian dài, trong điều kiện pH < 9.

Gel polyacrylamid có tính chất ái nước mạnh nhờ các nhóm - NH2. Muốn gel trương nở tốt, cần để hạt gel tiếp xúc với nước trong thời gian nhất định tùy thuộc vào loại gel. 2.4.2.3. Gel stryragel Gel này là polyme được tổng hợp từ styren và divinylbenzen. Hạt gel có đặc tính không trương nở. Hạt gel hình cầu, kích thước 40 - 80 µm. Với loại gel này, nên giải ly cột với các dung môi tetrahydrofuran, o - diclorobenzen, toluen, ...và không nên sử dụng dung môi phân cực như nước, metanol, aceton hoặc acid formic. 2.4.3. Các nguyên tắc cơ bản về thực hành sắc ký gel 2.4.3.1. Nhồi gel vào cột Cột sử dụng cho sắc ký gel cũng giống như cột sắc ký cổ điển, là cột bằng thủy tinh. Các hạt gel đã được làm trương nở cho vào cột theo kỹ thuật nhồi cột sệt. Sau khi rót huyền phù gel vào cột, cân bằng cột bằng cách cho dung môi giải ly ( loại khởi đầu cho việc giải ly) chảy ngang qua cột, lượng dung môi có thể tích bằng 2 - 3 lần thể tích cột. Kiểm tra sự chặt chẽ của cột bằng cách cho một lượng mẫu thử vào đầu cột. Mẫu thử thường được chọn là dextran blue 2000, có màu xanh dương, để có thể quan sát bằng mắt thường sự di chuyển của mẫu trong cột. Thể tích dung dịch mẫu < 10% thể tích cột. Cho dung môi giải ly để đuổi hoàn toàn lượng mẫu thử này ra khỏi cột. Trong suốt quá trình nạp gel cũng như triển khai sắc ký, không được để khô lớp mặt gel trên đầu cột. 2.4.3.2. Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel: Dung dịch mẫu cần tách phải được lọc bỏ những hợp chất còn ở dạng rắn, cặn. Dung dịch mẫu được hòa tan vào dung dịch đệm, đặt lên đầu cột giống như trong sắc ký cột cổ điển. 2.4.3.3. Triển khai sắc ký gel: Chỉ sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nồng độ. Giải ly có thể bằng trọng lực nhưng tốt nhất là sử dụng bơm đẩy từ đầu cột. Hứng dung môi giải ly trong những lọ nhỏ, mỗi lọ có một thể tích nhất định. Các chất tan sẽ ra khỏi cột theo thứ tự trọng lượng phân tử giảm dần. 2.4.3.4. Ví dụ cụ thể về sắc ký gel Sephadex LH - 20

Gel Sephadex LH - 20 là gel Sephadex G - 25 đã được hydroxylpropyl hóa nghĩa là biến đổi một số nhóm - OH trong gel dextran thành nhóm - O - CH2 - CH2 CH2 - OH. Việc điều chế dẫn xuất này giúp cho gel có thêm tính thân dầu bên cạnh tính ái nước sẵn có. Bên cạnh việc gel trương nở trong nước, gel có thể trương nở trong dung môi hữu cơ có tính phân cực như dimetylsulfoxid, pyridin, metanol, tetrahydrofuran,... Nhờ khả năng gel có thể trương nở trong dung môi hữu cơ phân cực, gel Sephadex LH - 20 được dùng trong việc tách các hợp chất thiên nhiên, loại tan trong dung môi hữu cơ. Gel Sephadex LH - 20 tách hợp chất theo hai kỹ thuật sắc ký khác nhau tùy vào dung môi giải ly. Khi giải ly cột với đơn dung môi, gel Sephadex LH - 20 tách hợp chất bằng kỹ thuật sắc ký gel nhờ vào sự khác biệt về trọng lượng phân tử. Các hợp chất có trọng lượng phân tử khoảng 4000 dalton thường không bị giữ lại trong gel Sephadex LH 20 nên được giải ly ra khỏi cột ngay trong thể tích trống của cột. Khả năng gel tách các hợp chất theo trọng lượng phân tử khoảng 100 - 4000. Khi giải ly cột gel với hỗn hợp dung môi, gel Sephadex LH - 20 tách hợp chất bằng kỹ thuật phân chia, các hợp chất được tách riêng ra tùy vào ái lực của hợp chất đó đối với một trong hai pha lỏng trong cột. Khi sử dụng hỗn hợp hai dung môi (tốt nhất là một dung môi phân cực và một dung môi có tính kém phân cực), gel Sephadex LH - 20 có ái lực với dung môi có tính phân cực mạnh hơn, đưa đến hệ quả tạo thành hai pha, pha động lỏng và pha lỏng. Kích cỡ cột: Thường chọn cột bằng thủy tinh, có chiều dài khoảng 40 - 100 cm, đường kính cột 1,5 - 2,5 cm. Kích thước cột được chọn tùy theo thể tích gel sử dụng. Lượng mẫu phân tích và lượng gel: Trong thực nghiệm, sắc ký đạt kết quả tốt khi sử dụng 1 mg mẫu chất cần 1 ml gel đã trương nở. Gel Sphadex LH - 20 có thể trương nở trong nhiều loại dung môi hữu cơ. Nhờ khả năng này, gel Sephadex LH - 20 thường được dùng trong việc tách các hợp chất thiên nhiên, loại tan được trong dung môi hữu cơ.

Bảng 11: Lượng dung môi hữu cơ gel Sephadex LH - 20 có thể hấp thu Lượng dung môi hấp thu

Thể tích hạt gel

( ml/g gel khô)

( ml/g)

Dimetylformamid

2,2

4,0 - 4,5

Nước

2,1

4,0 - 4,5

Metanol

1,9

4,0 - 4,5

Etanol

1,8

3,5 - 4,5

Clorofom ( 1% metanol)

1,8

3,5 - 4,5

Clorofom

1,6

3,0 - 3,5

n- Butanol

1,6

3,0 - 3,5

Tetrahydrofuran

1,4

3,0 - 3,5

Aceton

0,8

-

Etyl acetat

0,4

-

Toluen

0,2

-

Dung môi

Nạp gel vào cột: Cột được bắt thẳng đứng trên giá. Mở van khóa ở bên dưới, mở một phần, rót dung dịch huyền phù gel vào cột. Đồng thời để bên dưới có dung môi chảy ra. Rót dung dịch gel vào cột thành dòng nhỏ đều, rót một lần đầy cột. Tránh rót gel thành nhiều đợt, sẽ làm lớp gel nén không đều trong cột. Cân bằng gel trong cột: Sau khi gel được nạp hoàn tất vào cột, tiếp tục cho dung môi chảy ngang qua cột với vận tốc 1 - 5 ml/ phút trong vài giờ để cột được nén đều. Lưu ý là phải luôn có dung môi ở trên đầu cột, không được để gel trên mặt cột khô. Lượng dung môi cần để hòa tan mẫu: Mẫu được hòa tan trong dung môi phù hợp. Nếu mục đích là loại bỏ muối, lượng dung dịch mẫu nạp trên đầu cột có thể chiếm khoảng 30% thể tích cột gel. Nếu mục đích sắc ký gel là tách riêng các hợp chất, lượng dung môi dùng để hòa tan mẫu phải vào khoảng 1 - 5% thể tích cột gel. Nạp mẫu cần sắc ký lên đầu cột: - Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột, để hạ mức dung môi trong cột xuống sát mặt thoáng của chất hấp thu trong cột.

- Đóng khóa lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột. Dùng pipet hút dịch mẫu, cho dung dịch mẫu chảy dọc thành trong của cột, chạm xuống bề mặt của chất hấp thu. - Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột. - Cho một lớp bông, giấy lọc, ...phủ lên bề mặt của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. - Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly. Giải ly cột: sử dụng kỹ thuật giải ly với dung môi đơn nồng độ. Giải ly nhờ vào trọng lực với vận tốc dòng chảy 2 - 4 ml/ phút ( cho cột gel 200 ml). Có thể sử dụng bơm nhẹ. Thu dung dịch giải ly trong các lọ nhỏ 2.4.4. Các ứng dụng của sắc ký gel Để xác định trọng lượng phân tử của một hợp chất đại phân tử Để tách một hỗn hợp nhiều chất thành các nhóm hợp chất riêng rẽ Để loại bỏ muối ra khỏi một hợp chất hoặc dung dịch Để loại bỏ các chất màu tạp bẩn ra khỏi hợp chất đang khảo sát. Amino acid homopolymes occurring in natural