Nº2 VOL 42 2010
REVISTA ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA
PUBLICACIÓN DE LA ASOCIACIÓN ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA
PUBLICACION DE LA ASOCIACION ARGENTINA DE MICROBIOLOGIA Aparece en Biological Abstracts, Chemical Abstracts, Veterinary Bulletin, Index Veterinario, EMBASE (Excerpta Medica) Medline (Index Medicus), Tropical Diseases Bulletin, Abstracts on Hygiene and Communicable Diseases, Literatura Latinoamericana en Ciencias de la Salud (LILACS), Periódica, LATINDEX, SciELO y Science Citation Index Expanded. DIRECTORA Silvia Carla Predari Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari - UBA
SECRETARIO DE REDACCIÓN Gerardo A. Leotta Facultad de Ciencias Veterinarias - UNLP - CONICET
COMITÉ EDITOR Alicia I. Arechavala
Claudia I. Menghi
Hospital Francisco J. Muñiz - GCBA
Hospital de Clínicas - Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA
José A. Di Conza
Elsa C. Mercado
Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA - UNL - CONICET
Instituto de Patobiología - INTA
Ana M. Jar
Héctor R. Morbidoni
Facultad de Ciencias Veterinarias - UBA
Facultad de Ciencias Médicas - UNR - CIUNR
ASESORES CIENTÍFICOS C. Bantar J. C. Basilíco M. I. Berría H. M. Bianchini N. Binsztein M. M. Bracco R. Campos G. Carballal A. Cataldi
J. J. Cazzulo S.R. Costamagna C. Coto M. D’ Aquino R. de Torres A. H. Frade A. Gentile A. Giri J. E. González
S. González Ayala N. Leardini H. Lopardo W. P. Mac Cormack D. Masih M. Mollerach R. Negroni F. Nicola T. Orduna
R. Raya V. Ritacco H. R. Rodríguez A. P. de Ruiz Holgado A. Schudel L. Scolaro F. Sesma R. Soloaga H. Terzolo G. Vaamonde
ASESORES EN EL EXTERIOR A. Amoroso (Bélgica) J. Arbiza (Uruguay) J. A. Ayala (España) P. Feng (EE.UU.) E. García López (España)
M. Gottschalk (Canadá) R. Guerrero (España) M.J.Mendes Giannini (Brasil) M. Philipp (EE.UU.) F. Queiroz Telles (Brasil)
A. Restrepo (Colombia) G. San Blas (Venezuela) G. Schmunis (EE.UU.) A. Steinbüchel (Alemania) M. Tolmasky (EE.UU.) J. Vila Estape (España)
Secretaría: Deán Funes 472, C1214AAD Buenos Aires; Tel/FAX: 54-11-4932-8858, 54-11-4932-8948; E-mail:
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Franqueo Pagado Concesión Nº 4195 Tarifa Reducida Concesión Nº 628
AAM INFORMA CURSOS Y TALLERES Para mas información visite nuestra pagina web (www.aam.org.ar), sección Cursos y Talleres MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS RÁPIDOS: SU VALIDACIÓN
21 de Octubre 2010 Organiza: Subcomisión de Buenas Practicas-DAMyC TALLER INTERNACIONAL DE RIZOSFERA, BIODIVERSIDAD Y AGRICULTURA SUSTENTABLE (TIRBAS 2010)
21 y 22 de Octubre 2010 Organiza: DiMAyA ACTUALIZACION SOBRE BOTULISMO DEL LACTANTE Y ALIMENTARIO. USOS DE LA TOXINA BOTULINICA
5 de Noviembre 2010 Organiza: DAMyC XVIII CURSO DIAGNOSTICO VIROLOGICO RAPIDO
8 al 26 de Noviembre 2010 Organiza: SAV IX CURSO DE ACTUALIZACIÓN EN INTEGRONES
1 al 10 de Noviembre 2010 Organiza: Microbiología General CURSO BIOSEGURIDAD
4 al 11 de Noviembre 2010 Organiza: Filial Rosario SONRÍELE A LOS PAPERS EN INGLÉS
5-12-19 Y 26 de Abril 2011 Organiza: Comisión Directiva AAM
CONGRESOS Y JORNADAS Para mas información visite nuestra pagina web (www.aam.org.ar), sección Congresos y JornadasCongresos y Jornadas VI REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE BACTERIOLOGÍA, MICOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA CLÍNICAS: BACTERIEMIAS, FUNGUEMIAS Y PARASITEMIAS
22 de Noviembre 2010 XXX REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE SAV 2010
8 al 11 de Diciembre 2010 BRUCELLOSIS 2011 INTERNATIONAL RESEARCH CONFERENCE
21 al 23 de Septiembre 2011 X CONGRESO ARGENTINO DE VIROLOGÍA, III SIMPOSIO DE VIROLOGÍA CLÍNICA
26 al 29 de Septiembre 2011 XIV JORNADA ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA 3ª JORNADA DE MICROBIOLOGÍA E INFECTOLOGÍA DEL NEA - MINEA 2011. RESISTENCIA CHACO
29 de Septiembre al 1 de Octubre 2011
XII CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGÍA VI CONGRESO DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE BACTERIOLOGÍA, MICOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA CLÍNICA (SADEBAC) I CONGRESO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y AMBIENTAL (DiMAyA)
17 al 20 de octubre de 2010 Palais Rouge
Jerónimo Salguero 1433/49 (C1177AFA) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
COMITÉ ORGANIZADOR DEL XII CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGÍA Presidente: Ricardo Negroni Vicepresidentes: Marta Tokumoto Jorge Reinheimer Isabel Bogado Secretarias Generales: Alicia Arechavala María Alejandra Picconi Prosecretaria: Cristina Iovannitti Tesorera: Adriana De Paulis Protesorera: Paula Gagetti Secretaria de Relaciones Institucionales: Daniela Centrón Secretaria Técnica: Adriana Sucari Colaboradores Secretaria Técnica: María Soledad Ramírez María Paula Quiroga Secretarios Científicos: Liliana Guelfand Horacio Salomón Comité Científico División DiMAyA: Susana Vázquez e Inés García División DAMYC: Virginia Fernández Pinto y Guillermo Guirín División SADEBAC: Carlos Vay y Magdalena Pennini División SAV: Victoria Preciado, Viviana Mbayed y Oscar Taboga Vocales: Filial Córdoba: Marina Bottiglieri Filial Cuyo: Alejandro Sturniolo Filial NOA: Aída Suárez Filial NEA:Luis Merino Filial Sur: Ana Paris de Baeza Filial Rosario: Perla Hermida Lucena Filial Santa Fe: Francisco Salamone Comité Organizador VI Congreso de SADEBAC Presidente: Jorgelina Smayevsky Vicepresidente: María I. G. de Fernández Secretarios Científicos: Horacio Lopardo, Carlos Vay Comité Científico: Magdalena Penini, Paula Gagetti, Angela Famiglieti, Viviana Ritaco, Sonia Arduino, Marta Rocchi, Emilce Ménze, Rodolfo Casero, Gabriela Santiso, Comité Organizador I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental Presidente: Fabricio Cassan Vicepresidente: Claudio Penna Comité Científico Asesor: Susana Vázquez, Inés García de Salamone, Diego Sauka, Lucas Ruberto
XII Congreso Argentino de Microbiología 2010
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COMISIÓN DIRECTIVA ASOCIACIÓN ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA
Presidente Manuel Gómez Carrillo Vicepresidente Marta Rocchi Secretaria María Cecilia Freire Secretaria de actas María I. G. Fernández Prosecretaria María Alejandra Picconi Tesorera Adriana De Paulis Protesorero Claudio Penna Vocal Titular 1° Jorge Santoianni Vocal Titular 2° María José Gallego Vocal Titular 3° Marta Rivas Vocal Titular 4° María Soledad Ramírez Vocal Suplente 1° Adriana Sucari Vocal Suplente 2° Diego Sauka Vocal Suplente 3º Manuel Boutureira Vocal Suplente 4º Gustavo Giusiano
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Revista Argentina de Microbiología (2010) 42 - Supl. 1
COMISIÓN DIRECTIVA SOCIEDAD ARGENTINA DE BACTERIOLOGÍA, MICOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA CLÍNICA - SADEBAC
COMISIÓN DIRECTIVA DIVSIÓN AGRÍCOLA Y AMBIENTAL - DiMAyA
Presidente Horacio Lopardo
Presidente Fabricio Cassán
Vicepresidente Angela Famiglietti
Vicepresidente Claudio Penna
Secretaria general Nora A. Gómez
Secretario Diego Sauka
Prosecretario Marcelo Galas
Tesorera Inés García de Salamone
Secretaria de actas Patricia Vidal
Secretaria de actas Susana Vázquez
Tesorera María Adelaida Rosetti
Vocal Titular 1º Lucas Ruberto
Protesorera María José Rial
Vocal Titular 2º Rosana Massa
Vocal Titular 1º Adriana Sucari
Vocal Suplente 1º Mónica Baldini
Vocal Titular 2º Paula Gagetti
Vocal Suplente 2º Diego Libkind
Vocal Titular 3º Magdalena Pennini Vocal Titular 4º Gabriela Santiso Vocal Suplente 1º Marta Rocchi Vocal Suplente 2º Marta Hofman Vocal Suplente 3º Patricia Paulin Vocal Suplente 4º Ana María Togneri
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XII Congreso Argentino de Microbiología VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica (SADEBAC) I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental (DiMAyA) INDICE
Comité Organizador Comisión Directiva de la Asociación Argentina de Microbiología Comisión Directiva SADEBAC y DiMAyA Mensaje del Presidente de la Asociación Argentina de Microbiología Mensaje de la Presidente del VI Congreso de SADEBAC Mensaje del Presidente del XII Congreso Argentino de Microbiología Mensaje del Presidente del I Congreso Agrícola y Ambiental Comunicaciones Orales Posters Índice de Autores Instrucciones para Autores
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VOLUMEN 42 O SUPLEMENTO 1 2010
XII Congreso Argentino de Microbiología VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica (SADEBAC) I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental (DiMAyA) INDEX
Conference Organizing Committee Executive Board of the Argentine Society for Microbiology Executive Board of SADEBAC and DiMAyA Argentine Association for Microbiology President’s Message VI SADEBAC Conference President’s Message XII Argentine Microbiology Conference President’s Message I DiMAyA Conference President’s Message Oral Sessions Poster Sessions Author Index Instructions for Authors
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XII Congreso Argentino de Microbiología
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XII Congreso Argentino de Microbiología
Mensaje del Presidente de la Asociación Argentina de Microbiología Estimados Colegas Es para mí un gran honor, en nombre de la Asociación Argentina de Microbiología, darles la bienvenida a nuestro XII Congreso Argentino de Microbiología que desarrollaremos en la Ciudad de Buenos Aires. Como ocurre cada tres años, la AAM organiza un congreso de carácter nacional de nuestra especialidad con el firme objetivo de brindar un escenario que permita la expresión de la producción científica y técnica más destacada de la microbiología. Fundada en 1948, la AAM incorporó siete filiales desde 1961, logrando hoy en día una amplia representación en todo nuestro territorio nacional. Al comenzar la década de los ochenta se incorporó como división la Sociedad Argentina de Virología (SAV) y se crearon las divisiones Sociedad Argentina de Bacteriología Clínica (SADEBAC) y Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (DAMyC). Desde el 2005, la microbiología agrícola y ambiental se ve representada en la división DiMAyA. La AAM tiene una larga historia en la capacitación continua de microbiólogos no solo a través de sus cursos y talleres sino también por medio de sus congresos y jornadas. El primer congreso de la AAM, organizado en 1976 tuvo este objetivo y desde ese momento se viene organizando de manera ininterrumpida.
Para una Asociación que reúne diversas disciplinas como la nuestra, que crece día a día y que tiene representación en amplias regiones del país, nuestros congresos deben ser también un marco para conocernos, intercambiar conocimiento y propiciar colaboraciones. Sin duda es una oportunidad de crecimiento y progreso para todos nosotros. Hace casi tres años la Comisión Directiva confió al Dr. Ricardo Negroni la presidencia y conformación del Comité Organizador de nuestro congreso, invitando además a nuestras Divisiones a sumarse y compartir este mismo escenario en la medida de sus posibilidades. El interés mostrado por todas las Divisiones, Filiales, Subcomisiones y Grupos de Trabajo, que han contribuido con la labor de sus integrantes, sus ideas y participación, ha culminado con la conformación de un programa científico que no dudo hará de este congreso un encuentro especial. Quiero agradecer al Dr. Negroni, a las Divisiones SADEBAC y DiMAyA que están organizando sus congresos de manera conjunta y a todos los miembros que integran sus Comités Organizadores por haber desarrollado un magnífico marco para alcanzar nuestro objetivo. Sólo nos queda aprovecharlo. Manuel Gómez Carrillo Presidente Asociación Argentina de Microbiología
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XII Congreso Argentino de Microbiología
Mensaje de la Presidente del VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica (SADEBAC) La Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica, división de la Asociación Argentina de Microbiología, convoca nuevamente a los profesionales involucrados en el diagnóstico, tratamiento y prevención de las enfermedades infecciosas a participar de nuestra actividad científica más importante del año 2010, el VI Congreso de SADEBAC. Este evento tiene una significación especial ya que se realiza en el marco del XII Congreso de la Asociación Argentina de Microbiología, con el espíritu de poder brindar a nuestros asistentes una visión global de la Microbiología en nuestro país. Pese a los continuos avances de la ciencia, las infecciones continúan siendo en el mundo, una de las causas más frecuentes de morbi-mortalidad. En muchos casos, estas muertes serían evitables mediante diagnósticos rápidos, certeros, políticas eficientes de prevención y uso adecuado de los antimicrobianos. Esta función es atri-
buto del microbiólogo clínico integrado en el equipo multidisciplinario de salud. El comité científico ha planificado un ambicioso programa enfocado desde las patologías a los microorganismos, en el cual conviven en un mismo nicho ecológico las bacterias, los hongos, los virus y los parásitos, peleando palmo a palmo con los nuevos y viejos antimicrobianos, los inmunomoduladores, las vacunas y los programas de control de infecciones y de mejora continua de la calidad. Les agradecemos a todos por acompañarnos a transitar estos primeros 29 años de nuestra sociedad y los invitamos a participar y colaborar activamente en la misma. Sus inquietudes y aportes serán bienvenidos y su invalorable presencia contribuirá al éxito de este Congreso. Cordialmente, Jorgelina Smayevsky Presidente VI Congreso SADEBAC
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Mensaje del Presidente del XII Congreso Argentino de Microbiología
La Comisión Directiva de la Asociación Argentina de Microbiología (AAM) me ha conferido el alto honor de designarme Presidente del próximo Congreso Argentino de Microbiología, que tendrá lugar en la ciudad de Buenos Aires entre los días 17 y 20 de octubre de 2010. Es la reunión científica más importante organizada por la AAM y se lleva a cabo cada tres años. La AAM ha sobrepasado ya las seis décadas de existencia y su finalidad es mejorar y difundir los conocimientos microbiológicos en las más diversas áreas. Durante este prolongado lapso su desarrollo ha sido constante y hoy agrupa a más de 2000 cultores de las distintas ramas de la Microbiología. La AAM es una organización federal, que cuenta con siete filiales en el interior del país y posee cuatro divisiones: la Sociedad Argentina de Virología, la Sociedad Argentina de Bacteriología Clínica (que recientemente incluyó a micólogos y parasitólogos), la División de Microbiología de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (DAMyC) y la nueva División de Microbiología Agrícola y Ambiental. Tanto las filiales como las divisiones gozan de una cierta autonomía y organizan diversas actividades científicas propias. La AAM publica la Revista Argentina de Microbiología que ha editado ya 41 volúmenes, emite cuatro números por año y su nivel científico ha permitido que sea citada por las más prestigiosas organizaciones dedicadas a la recopilación de bibliografía como Chemical Abstract, Science Citation Index Expanded, Medline (Index Medicus), etc. Es la segunda vez que me toca organizar un Congreso Argentino de la especialidad. En esta oportunidad, la propia complejidad de la Asociación y la evolución de los conocimientos de la microbiología, ha tornado indispensable contar con una Comisión Organizadora amplia, laboriosa y capaz, que sirva a la vez de órgano consultor y de ejecutor de las acciones necesarias para que el Congreso pueda llegar a buen fin. Es así como he elegido un plantel de colaboradores que, a primera vista, puede parecer muy extenso, pero que es representativo de las distintas áreas de nuestra especialidad y cuya capacidad individual y colectiva estoy seguro que será probada en esta oportunidad. Debe tenerse en cuenta además que en esta oportunidad se llevarán a cabo, simultáneamente
con esta reunión científica general, los Congresos Argentinos de dos de nuestras divisiones, SADEBAC y Microbiología Agrícola y Ambiental. Sobre el Programa Científico, procuramos organizar las actividades de forma tal que no existan sesiones simultáneas de asuntos relacionados, para ello procuramos que las actividades de cada división estén dispuestas en el tiempo de una forma lineal, sin superposiciones y que existan a la vez conferencias plenarias en donde se junten miembros de distintas divisiones para considerar temas de interés general. Estas conferencias estarán a cargo de personalidades científicas de reconocido prestigio y procurarán mostrar el impacto social de la microbiología en sus distintas facetas. La situación económica del país y del mundo, así como la de la propia AAM, no va a permitir contar con un número elevado de invitados extranjeros. Hemos procurado sin embargo, que los expositores locales sean del más alto nivel y traer al mayor número de personalidades internacionales para las cuales podamos conseguir financiación de sus gastos. El local seleccionado para la realización de este evento científico es cómodo y adecuado a las necesidades de un Congreso de la magnitud del que estamos organizando. Estoy seguro que dejará satisfecho a los concurrentes en cuanto a la comodidad de sus ambientes, aislamiento acústico y servicios esenciales. Deseo agradecer muy especialmente la cooperación del Sr. Presidente de la Asociación Argentina de Microbiología y a su Comisión Directiva durante este proceso de organización del Congreso. En nombre del Comité Organizador del Congreso Argentino de Microbiología invito a todos los interesados en la Microbiología a participar de esta Reunión Científica para contribuir al éxito de la misma. Por último nuestro reconocimiento las entidades oficiales de la República Argentina y del exterior, así como a las empresas comerciales que apoyaron económicamente esta reunión científica, sin cuya decidida colaboración este Congreso no podría realizarse. Dr. Ricardo Negroni Presidente del XII Congreso Argentino de Microbiología
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Mensaje del Presidente del I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental (DiMAyA)
Estimados colegas: La Comisión Organizadora del I Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental, así como la Comisión Directiva de la División de Microbiología Agrícola y Ambiental (DiMAyA), quieren darles la bienvenida al primer congreso nacional en la especialidad, en el Marco del XIII Congreso de Argentino de Microbiología (XIII CAM). Para tal fin, hemos asumido un altísimo compromiso de trabajo y desde hace más de dos años hemos esculpido lenta y detalladamente cada una de las facetas de nuestro Congreso, que esperamos sea de la calidad y del nivel académico-científico que todos ustedes anhelan. Las actividades que se desarrollarán en el marco de nuestro Congreso fueron acordadas sobre la base de dos grandes áreas de conocimiento de la Microbiología General, hoy altamente demandantes y en plena emergencia en nuestro país. Dentro de la especialidad de la Microbiología Agrícola hemos planificado el desarrollo de dos conferencias plenarias y dos mesas redondas que abar-
caran principalmente las comunidades microbianas en suelos agrícolas, las bacterias promotoras del crecimiento vegetal y la microbiología dentro de un esquema de agricultura sustentable. En el área de la Microbiología Ambiental, hemos planificado dos conferencias plenarias y cinco mesas redondas que abarcaran la microbiología de aguas y suelos, la bioremediación de ambientes contaminados y el estudio de la estructura y funcionalidad de comunidades microbianas en el medio ambiente. Adicionalmente, hemos considerado la presentación de trabajos científicos seleccionados, que serán expuestos y defendidos por sus autores, en el marco de dos mesas redondas, una de cada especialidad. Nuestra joven División les da la bienvenida y los invita a participar de nuestras actividades en el marco del XIII CAM y permanentemente, en el marco institucional de la Asociación Argentina de Microbiología. Fabricio Dario Cassán Presidente I Congreso de DiMAyA
XII Congreso Argentino de Microbiología - Presentaciones Orales
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XII Congreso Argentino de Microbiología
PRESENTACIONES ORALES LUNES 18/10/2009 ALIMENTOS, MEDICAMENTOS Y COSMÉTICOS O1 - 27110 INFLUENCE OF GROWTH CONDITIONS AND THE FOOD MATRIX ON THE FUNCTIONALITY OF Bifidobacterium animalis subsp. lactis INL1. VINDEROLA, GABRIEL (1); BOCKELMANN, WILHEM (2); NEVE, HORST (2); ZACARIAS, MARIA FLORENCIA (1); REINHEIMER, JORGE (1); HELLER, KNUT (2) (1) Instituto de Lactología Industrial (UNL-CONICET), (2) MRI, KIEL, Alemania Introduction: Bifidobacterium animalis subsp. lactis INL1 is a probiotic strain isolated from human breast milk with the capacity of enhancing the gut defences through the increase of the number of IgA+ cells in the small and large intestine of mice. Recent studies suggest that cell viability might not always be a full indicator of cell functionality when strains undergo technological treatments like biomass production and drying for storage. Aim: To study, as a criterion of cell functionality, the influence of growth conditions and storage in different food matrixes of Bifidobacterium animalis subsp. lactis INL1 on its resistance to simulated gastric digestion. Materials and Methods: The strain was grown in MRS broth in a biofermentor at 37 °C at pH 6.5 and pH 5 for 12 h and 22 h with the influx of CO2. Cells were harvested, washed twice with PBS buffer, resuspended in 10% lactose and freeze-dried for 22 h in a Christ Beta 2-16 freezedrier. Scanning electron microscopy studies were carried out for the freeze-dried cultures obtained. Freeze-dried cultures were added (ca. 108 CFU/ml) to six different commercial dairy and non-dairy food products: orange juice (1), banana-carrot juice (2), mixed-fruits juice + fiber (3), vanilla milk drink (4), apple-banana puree (5) and applepeach puree (6). Samples were kept at 5 °C for 4 weeks. Cell viability and resistance to simulated gastric digestion (pH 2 + 0.5% NaCl + 0.3% pepsin, 37 °C for 90 min) was assessed at time 0 and at the end of the storage period. Results: No significant differences were observed in cell viability for cultures grown for 12 or 22 h at pH 6.5 or 5. However, cell losses after 90 min of exposure to simulated gastric acidity were higher than 4 log cycles for cultures grown at pH 6.5 compared to the negligible cell losses observed for cultures grown at pH 5. Scanning electron microscopy studies showed that only cultures grown at pH 6.5 for 22 h presented an exopolysaccharide-like matrix around freeze-dried cells. No significant differences in cell counts were observed among food products after 4 weeks of storage compared to counts at zero time. However, resistance to simulated gastric digestion differed among the commercial food products analyzed by the end of the shelf life: after 90 min of digestion, reductions in cell counts were negligible for products 2 and 4, for products 3 and 6 cell losses were around 1 log order, whereas for products 5 and 1 cell losses were 2 and 3 log orders, respectively. For the development of functional foods, appropriate conditions for biomass production must be chosen and a careful selection of food matrix must be performed in order to preserve not only viability but also cell functionality of probiotic strains.
O2 - 27124 DISTRIBUCIÓN DE LISOGENIA EN CEPAS COMERCIALES, DE COLECCIÓN Y SALVAJES DE Lactobacillus DEL GRUPO casei. MERCANTI, DIEGO (1); ROSSETTI, LIA (2); REINHEIMER, JORGE (1); QUIBERONI, ANDREA (1) (1) Instituto de Lactología Industrial, UNL-CONICET, (2) CRA-FLC
Antecedentes: La lisogenia se encuentra muy difundida en cepas de Lactobacillus. Los profagos no son entidades inertes y pueden contribuir o dar origen a fagos que pueden ser virulentos aún para la cepa de la cual derivan. En la industria láctea fermentativa, los ataques fágicos pueden tener consecuencias muy graves, siendo el impacto económico especialmente alto contra bacterias probióticas que por sus propiedades específicas resultan de difícil o casi imposible reemplazo. Objetivo. Determinar la presencia de profagos inducibles por mitomicina C en cepas de Lactobacillus del grupo casei de diverso origen, con énfasis en aquéllas actualmente usadas en la industria láctea. Materiales y Métodos: Se realizó la inducción con mitomicina C de 30 cepas de Lactobacillus del grupo casei: 11 comerciales, 11 de colección, 7 aisladas de quesos y 1 de heces. Las cepas fueron reclasificadas mediante reacciones de PCR específicas para cada especie que conforma el grupo casei (casei, paracasei, rhamnosus, zeae), y se determinaron sus perfiles de RAPD-PCR con 3 primers; los perfiles se analizaron construyendo un dendrograma con el software BioNumerics. De los sobrenadantes de inducción filtrados se extrajo ADN el cual, en los casos positivos (presencia de profagos), se sometió a restricción con BglII. Los perfiles se analizaron utilizando BioNumerics, y se compararon con el dendrograma obtenido por RAPD-PCR. Los sobrenadantes de inducción filtrados se enfrentaron con cepas de Lactobacillus del presente estudio en tests de turbidez, con el fin de evidenciar fagos virulentos derivados de las cepas lisógenas. Resultados: Aproximadamente la mitad de las cepas presentaron muy alta homología (>80% por RAPD-PCR), entre ellas la mayoría de las cepas comerciales. Numerosas cepas de Lb. casei fueron reclasificadas como Lb. paracasei o Lb. rhamnosus. La correlación entre perfiles de RAPD-PCR y especie fue muy buena considerando la nueva clasificación. En 25 de las 30 cepas estudiadas se encontraron profagos, demostrando su amplia distribución dentro del grupo casei. Además, 10 de las 11 cepas comerciales contenían profagos, con el mismo perfil de restricción para 6 de ellas (5 muy relacionadas y 1 moderadamente por RAPDPCR). Otra cepa comercial homóloga a las anteriores contenía otro profago con perfil de restricción igual que 3 cepas de colección (2 ATCC y 1 del INLAIN), mientras otras 3 cepas comerciales contenían profagos diversos. Esto señala que los lactobacilos del grupo casei utilizados en la industria están, en general, muy emparentados entre sí y poseen profagos de más de un tipo, con el riesgo de recombinaciones y generación de nuevos fagos virulentos que esto implica. Por otro lado, a partir de los sobrenadantes de inducción se aislaron 2 nuevos fagos líticos que fueron capaces de lisar la mayoría de las cepas comerciales. Los resultados obtenidos evidencian un factor de riesgo de infecciones fágicas latente pero potencialmente muy peligroso para los lactobacilos probióticos del grupo casei usados industrialmente en la actualidad.
O3 - 27231 EVALUACIÓN DE LA DINÁMICA DE LA POBLACIÓN MICROBIANA DURANTE LA ELABORACIÓN Y MADURACIÓN DEL QUESO ITALIANO GRANA PADANO. SANTARELLI, MARCELA; BOTTARI, BENEDETTA; GATTI, MONICA; NEVIANI, ERASMO Università Di Parma Introducción: El Grana Padano (GP) es un queso duro, cocido y de lenta maduración reconocido con la “Denominación de Origen Protegida”. Es elaborado con leche de vaca cruda y con
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suero fermento natural compuesto por distintas cepas de bacterias lácticas termófilas fuertemente acidificantes. La microflora secundaria (NSLAB) originaria principalmente de la leche cruda y aquella del suero fermento (SLAB) constituyen la compleja microflora que contribuyen al desarrollo de sus características organolépticas. Diversos trabajos han estudiado la composición microbiana de los fermentos naturales, mientras se conoce poco sobre las dinámicas durante la elaboración y maduración. Objetivos: Estudio de la dinámica de la población microbiana de SLAB y NSLAB durante la producción y maduración del queso GP a través de un enfoque independiente de cultivo. Materiales y Métodos: Fueron involucradas 6 diferentes queserías de 6 provincias de la zona de producción del GP (norte de Italia). Por cada quesería fueron colectadas 6 muestras constituidas por: leche cruda, suero fermento natural, cuajada a las 48 horas y quesos a distintos tiempos de maduración (2, 6 y 9 meses). Cada muestra fue analizada mediante la técnica “Length heterogeneity-PCR” a través de un analizador genético. Para los quesos de 2, 6 y 9 meses la metodología se desarrolló de manera de distinguir la fracción de células enteras y autolisadas. Resultados y Conclusiones: La composición de las diferentes muestras de leche cruda resultó ser variable en relación a la composición de especies. L. delbrueckii subsp. lactis y S.thermophilus fueron identificadas en todas las muestras. Las especies L. helveticus, L. delbrueckii subsp. lactis y S.thermophilus fueron identificadas en todos los suero fermentos, mientras las cuajadas y quesos no dieron la señal correspondiente a S.thermophilus. En los quesos de 2, 6 y 9 meses L. helveticus y L. delbrueckii subsp. lactis fueron encontradas ya sea como células enteras y lisadas. En algunas muestras de cuajadas se observó la presencia de la especie heterofermentante L. fermentum, que además fue revelada solo como células lisadas en la totalidad de las muestras de queso de 2 meses. A partir del segundo mes de maduración se detectó la presencia de la especie mesófila L. rhamnosus predominante en la fracción de células enteras. Además algunos quesos de 6 y 9 meses mostraron, en la fracción de células enteras, la presencia de la especie P. acidilactici. Fue observada una continua evolución de las características de la microflora en examen en el interior de cada matriz analizada. La dinámica de las especies del suero fermento, L. helveticus y L. delbrueckii subsp. lactis en las primeras horas de producción y sus permanencias hasta el queso de 9 meses de maduración ya sea como células enteras como lisadas, evidencia el rol de dicho fermento en la fase de acidificación de la cuajada como en la maduración del queso. El desarrollo y la presencia de células enteras de NSLAB como L. rhamnosus y P. acidilactici subrayan el aporte de la leche cruda y del ambiente de producción a la definición del ecosistema microbiano del GP y por consiguiente a las características del producto final.
O4 - 27469 VIGILANCIA DE ENFERMEDADES DE TRANSMISIÓN ALIMENTARIA BASADA EN LABORATORIO: BASE DE DATOS NACIONAL DE SUBTIPOS DE Salmonella spp. CAMPOS, J; PICHEL, M; CAFFER, MI; BINSZTEIN, N Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas - ANLIS “Carlos G. Malbrán” Salmonella spp. es uno de los agentes causales de enfermedades de transmisión alimentaria más frecuentes del mundo. El uso de técnicas de subtipificación molecular permite identificar grupos de aislamientos relacionados, para la detección y confirmación de brotes desde el laboratorio. En el marco de la Red PulseNet América Latina y Caribe se ha establecido en Argentina la Base Nacional de Subtipos de Salmonella spp., con 1019 aislamientos de 2005 a 2010. En el Laboratorio Nacional de Referencia se realiza la subtipificación de Salmonella enterica ser. Typhimurium (STM) y S. enterica ser. Enteritidis (SE), junto con una selección de aislamientos de otras serovariedades menos frecuentes. El objetivo de este trabajo es presentar la relación genética y distribución de subtipos de STM y SE circulantes en Argentina entre 2005 y 2010 contenidos en la Base de Datos Nacional. Los aislamientos fueron serotipificados siguiendo el esquema de Kauffmann-White, con antisueros provistos por el
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Servicio Antígenos y Antisueros del Instituto Nacional de Producción de Biológicos, ANLIS “Carlos G. Malbrán”. La diversidad genética se determinó por electroforesis en campo pulsado (PFGE) con las enzimas XbaI y BlnI según el protocolo de la Red PulseNet Internacional. Los perfiles obtenidos fueron analizados con el programa BioNumerics (Applied Maths), aplicando el coeficiente de Dice y UPGMA. Para SE, se identificaron 13 patrones de XbaI-PFGE entre 164 aislamientos de origen humano, de alimentos y animales, de 16 provincias. El patrón ARJEGX01.0001 agrupó 137 (83,5%) de los aislamientos, encontrándose en todas las provincias y tipos de muestra y a través de los años. Todos los brotes estudiados en este período (n=11) fueron causados por este subtipo, que presentó además un mismo patrón con BlnI. Entre los subtipos restantes de XbaI-PFGE, 7 se encontraron sólo en aislamientos de origen humano, 3 en aislamientos humanos y de alimentos y 1 en alimentos. Para STM, se identificaron 94 patrones de XbaI-PFGE entre 543 aislamientos de 16 provincias. Se encontraron tres patrones predominantes, distribuidos en todas las provincias: ARJPXX01.0007, con 32 aislamientos (5,9%); ARJPXX01.0065, con 43 (7,9%) y ARJPXX01.0194, con 19 (3,5%). Estos dos últimos estuvieron asociados a dos brotes cada uno. De los 94 patrones, 30 se identificaron en los cinco años, mientras que el resto sólo se presentaron en alguno de los años. Los aislamientos de STM mostraron una alta diversidad genética. En el caso de SE, la clonalidad de esta serovariedad es conocida mundialmente y se identificó también en el país. La Base Nacional de PFGE de Salmonella spp. crece continuamente y el análisis de subtipos circulantes y su distribución provee una herramienta fundamental para la vigilancia basada en el laboratorio, permitiendo identificar cepas emergentes, detectar y confirmar brotes, fuentes de infección y vías de transmisión. La aplicación de los protocolos estandarizados de la Red PulseNet permite además comparar los subtipos circulantes en el país con aquellos identificados en otros países, para la vigilancia de Salmonella spp. a nivel global.
O5 - 7821 EFECTO DE INTERMEDIARIOS BIOSINTETICOS SOBRE LA PRODUCCION DE VITAMINA B12 EN BACTERIAS LACTICAS. VANNINI, MV; DE CARVALHO, K; FONT DE VALDEZ, G; TARANTO, MP; SESMA, F Centro de Referencia para Lactobacilos - CERELA La cobalamina (vitamina B12 o CBL) es una macromolécula no polimérica cuya estructura contiene un anillo tetrapirrólico ligado a un átomo de cobalto, denominado anillo de corrina. Además presenta una base como ligando axial inferior, el dimetilbenzaimidazol (DMB), y un ligando superior (adenosil), ambos ligados al átomo de cobalto. Su síntesis es compleja, e involucra al menos 25 enzimas diferentes y se halla restringida a ciertas especies bacterianas y arqueas. Estudios previos en nuestro laboratorio demostraron que Lactobacillus (Lb.) reuteri CRL 1098 es capaz de producir cobalamina (y su variante pseudo-CBL) y se caracterizó el operón Cob involucrado en su síntesis. Asimismo los extractos celulares (EC) de Lb. curvatus CRL 1000, Lb. coryniformis CRL 1001 y Lb. murinus CRL 1104 presentaron actividad de tipo cobalamina. En base a los resultados previos, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de varios intermediarios de la vía biosintética de B12 en su producción, por las diferentes cepas de lactobacilos previamente mencionados. Se evaluó la producción de CBL por las cepas lácticas CRL 1098, CRL 1000, CRL 1001 y CRL 1104, en presencia de diferentes precursores de su síntesis: ac. aminolevulinico (ALA) (25ng/ul), porfobilinógeno (25ng/ul), uroporfirinógeno III (25ng/ul), CoCl2 (25ng/ul), DMB (20ng/ul) y O-fosfotreonina (50ug/ul) y en medios de cultivo libres de la vitamina. Una estimación del contenido en B12 se llevó a cabo inicialmente mediante un ensayo biológico utilizando la cepa mutante en la enzima metionina sintasa independiente de cobalamina, Salmonella enterica serovar Typhimurium AR2680 (metE cbiB) y a continuación se cuantificó el nivel de la vitamina obtenida en cada una de las condiciones ensayadas empleando un inmunoensayo enzimático (RIDASCREEN-FAST Vitamin B12, R-Biopharm). Todos los ensayos fueron realizados por triplicado. Los resultados indican que Lb. reuteri CRL 1098 y Lb. coryniformis
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CRL 1001 presentan los mayores niveles de producción de cobalamina (25-35 ug/L y 20-30 ug/L respectivamente) y con relación a los intermediarios, se observó que la adición de Ofosfotreonina incrementó la producción de la vitamina en ambas cepas, mientras que el agregado de ALA y CoCl2 afectaron positivamente la producción de este compuesto por CRL 1098. El porfobilinógeno tuvo un efecto negativo en la síntesis de esta vitamina para ambas cepas. Los demás intermediarios no presentaron efectos significativos sobre la biosíntesis de esta vitamina. Las cepas Lb. murinus CRL 1104 y Lb. curvatus CRL 1000 presentaron valores de B12 entre 0,5 y 2 ug/L. No se observó diferencia significativa en la producción de vitamina B12 con el agregado de los intermediarios ensayados, lo cual podría deberse a los bajos niveles en la producción. En vista de los resultados expuestos, podemos concluir que Lb reuteri CRL 1098 y Lb coryniformis CRL 1001 son cepas potencialmente aplicables en el desarrollo de alimentos bio-enriquecidos en vitamina B12.
O6 - 27871 PREVALENCIA Y DIVERSIDAD DE Escherichia coli NO-O157 EN ARGENTINA 2000-2008. CARBONARI, C; CHINEN, I; DEZA, N; MILIWEBSKY, E; BASCHKIER, A; MANFREDI, E; D ASTEK, B; RIVAS, M Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas - ANLIS “Carlos G. Malbrán” Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno emergente, asociado a enfermedad severa en humanos. STEC O157:H7 es el serotipo prevalente a nivel mundial, siendo en Argentina el principal agente causante de síndrome urémico hemolítico (SUH). Sin embargo, existen más de 200 serotipos descriptos, y en nuestro país cepas de diferentes serotipos noO157 producen alrededor del 30% de los casos de SUH que se registran por año. Los serogrupos O26, O103, O145, O111 y O121 han sido reconocidos como un grupo de riesgo para la salud pública ya que poseen el mismo potencial patogénico que O157. Con el fin de destacar la importancia de los serogrupos de relevancia en el país, se compararon todos los patrones de cepas STEC no-O157 obtenidos por electroforesis de campo pulsado e incorporados a la Base de Datos Nacional (n=1203) entre los años 2000 y 2008. En total, más de 50 serogrupos se encuentran incorporados a la Base. Los cinco serogrupos prevalentes fueron los siguientes: a) O145, con 157 aislamientos que presentaron un 64,9% de similitud. El serotipo prevalente fue O145:NM (95,5%) y en menor frecuencia a O145:HNT y O145:H25, con el mismo perfil de virulencia stx2/eae/ehxA. El 97,5% de los aislamientos correspondieron a casos clínicos, y el resto a reservorios, algunas cepas de ambos orígenes presentaron el mismo patrón. En Argentina, STEC O145 está generalmente asociado a casos esporádicos. Sin embargo, se describieron dos brotes y un conglomerado de casos asociados a O145:NM. b) O8: con 58 aislamientos con 65% de similitud. El serotipo más frecuente fue O8:H19 (72,4%), seguido de O8:H16, O8:H21, O8:H25, O8:H7 y O8:HNT. Los aislamientos fueron de origen bovino, alimentos y humanos. Los perfiles de virulencia en orden de frecuencia fueron stx1/stx2/ ehxA/saa, stx1/stx2/ehxA y stx2/ehxA. c) O26 con 46 aislamientos con 65,7% de similitud. El principal serotipo fue O26:H11 (65,2%), seguido por O26:HNT, O26:NM, O26:H2, y O26:H21. El perfil genético más frecuente fue stx1/eae/ehxA. Algunas cepas aisladas de casos de SUH portaron un perfil poco frecuente: stx2/ stx2c(vh-a)/eae/ehxA. Los aislamientos fueron de origen clínico, alimentos y bovinos. Se describió un brote asociado a O26:H11. d) O113: con 36 aislamientos con 69,1% de similitud. El serotipo prevalente fue O113:H21 (83%) seguido por O113:NM, O113:HNT y O113:H7. Los aislamientos fueron de origen bovino, alimentos y casos clínicos incluyendo SUH. El perfil genético más frecuente fue stx2/ehxA/saa. e) O103 con 35 aislamientos con 70,5% de similitud. El principal serotipo fue O103:NM (74%) y le siguen O103:H2, O103:H25 y O103:HNT. Los aislamientos son de origen bovino y casos clínicos incluyendo SUH. El perfil genético más frecuente fue stx1/eae/ehxA. Se describió además un brote asociado a O103:H2. Los resultados obtenidos hasta el momento en cuanto a detección en enfermedad severa, reservorios y alimentos, indicarían que en Argentina los serotipos STEC no-O157 re-
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presentan un desafío por la magnitud de la prevalencia y la importancia que adquiere este patógeno en Salud Pública.
O7 - 28008 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens DE GRÁNULOS DE KÉFIR ARGENTINOS. AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN REOLÓGICA DEL PRODUCTO FERMENTADO. HAMET, MARIA FERNANDA(1,2); LONDERO, ALEJANDRA(1); PIERMARIA, JUDITH(1,2); GARROTE, GRACIELA LILIANA(1,2); ABRAHAM, ANALIA GRACIELA(1,2) (1) Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. (2) Facultad de Ciencias Exactas, UNLP El gránulo de kefir está constituido en un 8 % por kefiran, un exopolisacárido (EPS) producido por Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens. Este EPS posee propiedades funcionales comprobadas, actúa como gelificante, espesante y forma películas comestibles. Además posee capacidad de proteger el epitelio y actividad inmunomodulatoria. El aislamiento de Lb. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens es dificultoso ya que es anaerobio estricto y de crecimiento lento. El objetivo del trabajo fue aislarlo de gránulos de kefir argentinos y analizar las propiedades reológicas de sus cultivos en leche. La presencia del Lb. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens en 9 gránulos de kefir se analizó mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). Se extrajo ADN de gránulos de kefir y de las cepas de referencia Lb. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens JCM 6985 y subsp. kefirgranum JCM 8572 y se amplificó con los oligunucleótidos sintéticos 518r y GC-338f. Los productos obtenidos fueron analizados por DGGE (urea/formamida 40-60%, 16 horas, 100 Voltios y 60 °C). Las bandas coincidentes con la cepa JCM 6985 fueron cortadas, amplificadas y secuenciadas. Luego, se procedió al aislamiento mediante tres técnicas de disgregación de los gránulos: ruptura con ultraturrax, congelamiento y corte mecánico y disolución del gránulo en agua a 40 °C. A partir de cada una de las suspensiones se realizaron aislamientos directos y con previo enriquecimiento (MRS pH 5 en anaerobiosis). Se obtuvieron 23 aislados que fueron caracterizados mediantes coloración de Gram, presencia de catalasa, crecimiento en leche, producción de gas a partir de glucosa y perfil de proteínas totales. En base a los perfiles de proteínas se construyó un dendrograma en el cual 8 aislados provenientes de los gránulos AGK1, 2, 3, 5 y 6 agruparon con el microorganismo buscado. Su identidad se confirmó mediante DGGE, secuenciación y contraste con una base de datos. Como resultado de su secuenciación se obtuvo una homología de 98 a 100% con Lb. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens. La distancia relativa recorrida por ambas susbespecies en los perfiles de DGGE es diferente, mostrando todos los aislados un perfil equivalente a Lb. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens. La evaluación reológica de las leches fermentadas se realizó en un reómetro Haake Rheostress 600 en modo rotacional. Todas presentaron un comportamiento pseudoplástico con importantes áreas de histéresis. Los valores de viscosidad aparente a 300s-1 variaron entre 17,82 ± 1,05 y 35,96 ± 10,15 mPa.s y las áreas de histéresis entre 745,2 ± 35,64 y 1861 ± 613,77 Pa/s. Sólo dos de las cepas presentaron viscosidad equivalente a la cepa de referencia. Es importante destacar que es la primera vez que se aisla Lb. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens de gránulos de kefir argentinos que son capaces de fermentar la leche obteniéndose productos con diferentes características reológicas. Estas cepas podrían presentar potencialidad para su aplicación en nuevos desarrollos tecnológicos.
O8 - 28068 FACTORES DE VIRULENCIA ASOCIADOS A Escherichia coli PRODUCTOR DE TOXINA SHIGA. ANGEL VILLEGAS, N(1); POLIFRONI, R(2); ETCHEVERRIA, AI(2); PADOLA, NL(2); PARMA, AE(2); ALBESA, I(1); BECERRA, MC(1); PARAJE, MG(1) (1)Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencias Químicas, UNC. (2)Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires
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Introducción: Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) se asocia a brotes de diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH). La patogenicidad está asociada con varios factores de virulencia, entre los que se incluyen la producción de la toxina Shiga (vt1, vt2). Las cepas más virulentas de STEC además poseen otros como enterohemolisina (ehxA) e intimina (eae). Un nuevo factor de virulencia podría ser la capacidad que poseen las STEC para formar biofilms, lo cual se encuentra menos caracterizado. Entre los factores importantes para la formación del biofilms se pueden mencionar a la fimbria tipo I “curlina”. Objetivo: Determinar genotípica y fenotípicamente la presencia de distintos factores de virulencia en cepas productoras de toxina Shiga aislada de pacientes con SUH. Materiales y Métodos: En este estudio se analizaron ocho cepas clínicas (siete E.coli O157:H7 y una O111:H-) provistas por Hospitales pediátricos de Córdoba y una cepa de referencia (EDL 933). Análisis Genotípico: la presencia de los genes que codifican para los factores de virulencia (vt1, vt2, ehxA, eae) y para la proteína curlina (csgD, csgA y crl) se estudiaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Análisis Fenotípico: mediante un Inmunoensayo óptico (OIA SHIGATOX) se estudió la expresión de las toxinas Shiga 1 y/o 2. La expresión de la curlina se analizó mediante Rojo Congo. La capacidad de formar biofilms de las cepas de E.coli se determinó mediante la adhesión a placas de poliestireno de 96 wells y su posterior coloración con cristal violeta determinando la densidad óptica a 595 nm. Resultados: Mediante el análisis genotípico se observó la presencia de los genes vt1, vt2, ehxA, eae, csgD, csgA y crl en todas las cepas estudiadas, excepto en la E.coli O111 que no presentó el gen vt2 que codifica para la toxina Shiga 2. En cuanto al análisis fenotípico, todas las cepas expresaron ambas toxinas en el sobrenadante de cultivo, excepto E.coli O111 (solo Shiga 1). Cuando se realizó la determinación de curlina se apreció el desarrollo de colonias lisas y rosadas, interpretándose este resultado como negativo. Todas las cepas estudiadas fueron débiles formadoras de biofilms, presentando valores entre 0,15 y 0,25 de densidad óptica. Conclusiones: las cepas regionales aisladas de pacientes con SUH presentaron la co-expresión de diversos factores de virulencia, tanto genotípica como fenotípicamente. En cuanto a la capacidad de las cepas de formar biofilms, si bien se observó la presencia de los genes que codifican para la fimbria tipo I, no se obtuvieron las características colonias negras indicativas de la expresión de la proteína. Asociado a lo antes mencionado, todas las cepas en estudio mostraron una débil formación de biofilms in vitro lo que parece indicar que los genes que codifican la formación necesitan condiciones in vitro no requeridas para que otros factores de virulencia se expresen.
VIROLOGÍA O9 - 27088 EFECTO DE LA PROTEÍNA X DEL VIRUS HEPATITIS B (HBV) SOBRE LA SUPERFAMILIA DE TRANSPORTADORES ABC: UN NUEVO ROL EN LA PATOGÉNSIS VIRAL. CUESTAS, ML(1); RIVERO, C(1); ROSSO, N(2); GENTILE, E(3); CASTILLO, A(3); MINASSIAN, ML(1); ANDREETTA, A(1); TRINKS, J(1); TIRIBELLI, C(2); OUBIÑA, JR(1); MATHET, V(1) (1) CONICET, (2) Centro Studi Fegato, (3) Laboratorio De Hepatitis Introducción: Los carcinomas hepatocelulares (HCC) representan el 4% de los tumores de todo el mundo siendo la quinta causa de cáncer en el hombre. Cerca del 80% de los pacientes con este cáncer se encuentran crónicamente infectados con HBV. La proteína X de HBV desempeña un rol principal en la oncogénesis hepática. Las mutantes K130M y V131I exhiben una actividad transactivadora mayor que la salvaje, contribuyendo significativamente a la hepatocarcinogénesis. Las proteínas ABC son bombas transmembrana que transportan sustratos en contra del gradiente de concentración, utilizando la hidrólisis de ATP. Su sobreexpresión está asociada a la resistencia a múltiples drogas, a la inhibición de la vía intrínseca de la apoptosis y al cáncer. Objetivo: Analizar el efecto de la expresión de las proteínas X salvaje y mutada de HBV sobre los niveles de ARNm y sobre los
niveles de expresión de diversas proteínas ABC. Materiales y Métodos: Se transfectaron transitoriamente células HeLa y Huh7 con plásmidos que codificaban para la proteína X salvaje y mutada (K130M/V131I) de HBV. Al cabo de 24 h se les evaluó mediante RT-PCR en tiempo real la variación en la expresión relativa de los genes que codifican para las proteínas ABC BCRP, MDR1, MRP1 y MRP2. La detección de la expresión de dichas proteínas se realizó mediante Western blot utilizando anticuerpos monoclonales específicos. Resultados: En las células HeLa se evidenció: 1) una disminución en la expresión del gen mrp1 debido a la expresión de la proteína X salvaje; 2) un incremento en la expresión de los genes bcrp y mrp2 debido a la expresión de la proteína X mutada; 3) No se documentó variación en la expresión de mrp1 debido a la proteína X mutada, ni de bcrp y mrp2 debido a la proteína X salvaje. En las células Huh7 se evidenció: 1) un aumento en la expresión de los genes mrp1 y mrp2 debido a la expresión de la proteína X mutada; 2) un incremento en la expresión del gen bcrp debido a la expresión de la proteína X salvaje; 3) no se observó variación en la expresión del gen mdr1 por la proteína X salvaje ni por la mutada, ni de bcrp por la mutada ni de mrp1 y mrp2 por la salvaje. Los resultados en el Western blot se correlacionaron con los de RT-PCR en tiempo real. Conclusiones: Al estudiar el efecto de las proteínas X salvaje y mutada sobre los niveles de ARNm correspondientes a los genes bcrp, mdr1, mrp1 y mrp2 por RT-PCR en tiempo real, se observó un comportamiento dependiente de la estirpe celular estudiada (hepatocitaria vs epitelial) y de la naturaleza salvaje o mutada de la proteína X. Merece especial consideración la observación de un aumento en los niveles de expresión de los genes mrp1, mrp2 y bcrp en células Huh7, con potenciales nuevas implicancias en la oncogénesis hepática y en la resistencia a drogas antivirales y antitumorales.
O10 - 27686 ORIGEN Y DIVERSIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C GENOTIPO 2C EN CÓRDOBA, REPÚBLICA ARGENTINA. CULASSO, ACA(1); RE, V(2); CONTINGIANI, M(2); CAMPOS, RH(1) (1) Cátedra de Virología Fac. de Farmacia y Bioquímica, UBA. (2) Instituto de Virología Dr. J. M. Vanella Fac. Ciencias Médicas, UNC La infección crónica con el virus de la hepatitis C (HCV) está asociada a patologías hepáticas severas. El HCV se clasifica taxonómicamente en genotipos 1 a 6 y subtipos a, b, c, etc. Los HCV-1, 2 y 3 son cosmopolitas. Los subtipos de HCV-2 son comunes en África occidental y en el sur de Europa. El HCV-2c es ubicuo como genotipo minoritario pero en Italia es el segundo en prevalencia (después del 1b). En la provincia de Córdoba se detecta HCV-2c en 50% de las infecciones e incluso en Cruz del Eje es el principal genotipo (90%). El objetivo de este trabajo es el estudio del origen y la diversificación del HCV-2c en la provincia de Córdoba utilizando análisis filogenéticos y de coalescencia. Se analizaron 92 muestras de suero de personas de Cruz de Eje (positivas para HCV) en un estudio epidemiológico previo (año 2004) y 53 muestras de suero de pacientes concurrentes al Servicio de Virología del Instituto Dr J. M. Vanella desde distintos puntos de la provincia de Córdoba. A partir del ARN viral del suero se realizó una reacción de RT-PCR anidada para amplificar un fragmento de 367 pb de la región NS5B que luego fue secuenciado de manera directa. Análisis filogenéticos: las secuencias obtenidas y otras provenientes de África y Europa (Genbank) se analizaron por métodos de Distancia (MEGA 4), Máxima Verosimilitud (PhyML 3.0) y Parsimonia (TNT). Análisis de Coalescencia: se infirió por métodos Bayesianos la edad del ancestro común más reciente y la demografía del HCV-2c (BEAST 1.4.8) calibrando un reloj molecular relajado con una tasa de 5x10-4 sustituciones por sitio por año. Como resultado, los tres métodos filogenéticos reprodujeron una topología en donde todas las muestras cordobesas junto con las europeas (Francia e Italia, principalmente) y las africanas conforman un único grupo sin subgrupos internos. El análisis de coalescencia se realizó sobre tres grupos de secuencias: Cruz del Eje (CdE), otras ciudades cordobesas (OCC) y Francia. La edad estimada de los ancestros comunes
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para los tres grupos fue de ~150 años (~1860 D.C.) y en todos los casos el modelo demográfico presentó su fase exponencial entre 1890 y 1950. La filogenia sugiere la ausencia de diversidad asociada al espacio geográfico (no hubo subgrupos de secuencias de CdE, de OCC ni de Francia o de Italia), compatible con un proceso de diversificación reciente. El crecimiento exponencial observado en la demografía de los tres grupos de secuencias analizados coincide con la emergencia mundial de otras infecciones, como HCV-1b y con el proceso de “globalización” de principios del siglo XX (transfusiones, uso de inyectables, migraciones masivas, tránsito, drogadicción). El análisis filogenético y de coalescencia, la epidemiología y la historia inmigratoria sugieren que los HCV-2c detectados en CdE y OCC serían el resultado de la introducción del virus desde Italia durante el proceso migratorio de 1880-1920. Luego de la migración de los ancestros, se produjo un fenómeno de diversificación simultáneo en cada espacio geográfico como consecuencia del proceso de “globalización”. Sin embargo, se observó la falta de identidad geográfica debido a la intensa corriente migratoria Italia-Argentina o a que aún no se ha cumplido el tiempo necesario para producir este fenómeno.
ca, indujo respuestas inmunes humorales específicas de tipo IgA en muestras de lavados nasales y broncopulmonares y de tipo IgG en muestras de suero. Los virus recombinantes MVA-gDs pueden ser utilizados como inmunógenos en animales de experimentación con el propósito de desencadenar respuestas inmunes específicas a nivel sistémico y de mucosas. En el futuro, su utilización como vacuna contra el virus BoHV-1 se evaluará en bovinos.
O11 - 27276 DESARROLLO DE UN CANDIDATO VACUNAL CONTRA HERPESVIRUS BOVINO BASADO EN UN VIRUS VACCINIA ANKARA RECOMBINANTE. FERRER, M FLORENCIA (1,2); DEL MEDICO ZAJAC, M PAULA (1); CALAMANTE, GABRIELA(1)
La relación entre el origen étnico, la infección genital por virus papiloma humano (HPV) y el desarrollo del cáncer cervical ha sido sugerida por algunos autores. Estudios epidemiológicos en comunidades multiétnicas de los EEUU atribuyeron estas diferencias a la baja cobertura médica en minoridades socio-culturales (principalmente afroamericanos y amerindios). Sin embargo estos trabajos clasificaron las pacientes en base a los apellidos, la coloración de la piel y la auto-denominación étnica. El valor predictivo de estas características puede ser bajo en poblaciones mezcladas, como las latinoamericanas. Los marcadores moleculares ofrecen una herramienta útil para identificar el componente étnico de los individuos, siendo el ADN mitocondrial (ADNmt) uno de los más ampliamente utilizados. La provincia de Misiones posee una de las tasas de mortalidad por cáncer más altas del país y una prevalencia de infección por HPV del 40% para población femenina asintomática. Estas diferencias han sido atribuidas a un menor acceso al sistema de salud por parte de las mujeres de la región, y a sus rasgos socio-culturales y demográficos especiales. Sin embargo las características genéticas no han sido exploradas. Con el fin de identificar potenciales marcadores moleculares de susceptibilidad, se procedió a la caracterización genética (ADNmt) de mujeres caucásicas de la región. Se analizaron 140 mujeres (66 infectadas y 74 negativas) que no manifestaron ascendencia indígena. Los linajes mitocondriales se determinaron por PCR y secuenciación de la (HVS-1) de la mitocondria. Como blanco de amplificación se empleó ADN extraído de cepillados cervicales. El posible rol del ADNmt como factor de riesgo en la infección por HPV fue establecido mediante análisis de OR. Resultados: Los linajes mitocondriales indicaron un patrón tri-híbrido para la muestra, con un 72% de aporte amerindio; 23% europeo y 5% africano. Las infecciones por HPV fueron más frecuentes en mujeres portadoras de ADNmt amerindio comparadas con aquellas que presentaban ADNmt europeo (OR 1.8 IC95% 0,84). Los linajes africanos fueron excluidos del análisis debido a sus bajas frecuencias. Una de las características más significativas de Misiones es su composición poblacional multiétnica; esto se atribuye a factores diversos, entre ellos su ubicación geográfica, la presencia de indígenas Guaraníes, las sucesivas corrientes inmigratorias europeas y más recientemente los fenómenos de migraciones internas y con países vecinos. Este escenario se constituye en un modelo epidemiológico particular, que permite evaluar marcadores genéticos asociados a su población. En este contexto, la frecuencia de linajes amerindios de ADNmt ha sido mayor que la reportada para ciudades como La Plata y Córdoba (40%). La potencial asociación entre el linaje amerindio y la infección cervical por HPV deberá ser confirmada mediante un diseño de casos y controles. Financiado por ANPCyT (PICTR 311/2).
(1) Instituto de Biotecnología CICVyA-INTA Castelar, (2) CONICET Los poxvirus se utilizan eficientemente como vacunas seguras y efectivas contra enfermedades infecciosas. En particular, los poxvirus recombinantes se evaluaron en numerosos ensayos clínicos de vacunas contra el cáncer, malaria, tuberculosis y sida. La cepa MVA (virus vaccinia Ankara modificado) es una cepa del virus vaccinia altamente atenuada, que no replica en la mayoría de las células de mamíferos, siendo un buen candidato para el desarrollo de vacunas a virus vivo no replicativo. El fenotipo atenuado de MVA es el resultado de numerosas mutaciones que particularmente afectaron a las proteínas que interactúan con el hospedador, a los genes con motivos tipo anquirina y a algunas proteínas estructurales. La infección con herpesvirus bovino de tipo 1 (BoHV-1) puede producir conjuntivitis, neumonía, desórdenes genitales, abortos y una infección en el tracto respiratorio superior denominada fiebre del transporte. Para controlar las enfermedades causadas por BoHV-1 es necesario disponer de vacunas efectivas y que permitan diferenciar animales naturalmente infectados de animales vacunados. El objetivo de este trabajo es la evaluación de un inmunógeno basado en MVA capaz de expresar in vivo la glicoproteína D de BoHV-1. Primeramente, se construyó un vector de transferencia (VT) que porta las secuencias de interés (genes gDs y uidA bajo regulación de promotores tempranos de poxvirus) flanqueadas por regiones correspondientes al gen viral MVA086R. Los virus MVA-gDs se obtuvieron por recombinación homóloga in vitro entre el VT y el genoma viral, y se aislaron por su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia del sustrato X-Gluc. Mediante análisis molecular se confirmó la correcta expresión, antigenicidad y N-glicosilación de la glicoproteína D expresada a partir de dichos virus. posteriormente, se evaluó la capacidad inmunogénica de los virus MVAgDs en animales de experimentación, determinando la presencia de anticuerpos específicos anti-gD mediante ELISA. En el modelo de ratón, se observó que los virus MVA-gDs desencadenaron una respuesta inmune humoral específica que se mantuvo en niveles similares durante un período de siete meses. Además, se demostró que la síntesis de novo de la glicoproteína D a partir del vector viral no replicativo MVA-gDs fue la responsable de la inducción de dicha respuesta. La inoculación de conejos con MVAgDs desencadenó una respuesta inmune humoral específica observándose la máxima respuesta a los 9 días post dosis refuerzo. En un ensayo de desafío de conejos con BoHV-1, se observó que la inmunización por vía intramuscular con virus MVA-gDs disminuyó la cantidad de animales que excretaron el virus de desafío. Finalmente, se demostró que la inmunización de ratones por vía intranasal con virus MVA-gDs, combinado con toxina coléri-
O12 - 27596 DETERMINACIÓN DE LINAJES MITOCONDRIALES EN MUJERES CAUCÁSICAS RESIDENTES DE LA PROVINCIA DE MISIONES Y SU RELACIÓN CON LA INFECCIÓN POR VIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV). BADANO, INES(1); RUBINSTEIN, SAMARA(2); SCHURR, THEODORE(2); PICCONI, ALEJANDRA(3); CAMPOS, RODOLFO(4); LIOTTA, JAVIER(1) (1) Laboratorio de Biología Molecular Aplicada. Universidad Nacional de Misiones; (2) Department of Anthropology, University of Pennsylvania. EEUU; (3) Servicio Virus Oncogénicos, INEI-ANLIS “Dr. Carlos Malbran”; (4) Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA.
O13 - 27600 ACTIVIDAD ANTI-HIV DE NUEVAS PRODROGAS DE DIDANOSINA (DDI). TURK, GABRIELA(1); DECANDIA, CRISTIAN(1); RAVETTI, SOLEDAD(2); GUALDASI, MARIA SOLEDAD(2); PAMPURO, SANDRA(1); BRIÑON, MARIA CRISTINA(2); SALOMON, HORACIO(1)
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(1) Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Fac de Medicina (UBA), Bs As. (2) FCQ, UNC. Introducción. El diseño de nuevos inhibidores del HIV es un objetivo de interés, considerando el problema de la toxicidad y resistencia a los antiretrovirales existentes. Debido a que el ddI (2´,3´-dideoxiinosina) presenta algunos efectos indeseados tales como bajo grado de unión a proteínas plasmáticas (< 5%) y un tiempo de vida media de eliminación de 1,4 hs., se planteó el diseño de nuevos 5´-O-carbonatos de ddI. De este modo, se esperan propiedades farmacocinéticas más favorables que garantizarán una concentración adecuada del antiviral en el sitio de acción. Por ello, se sintetizaron prodrogas de ddI por conjugación del grupo 5´-OH de ddI con n-butanol, n-pentanol y n-hexanol, utilizando N,N-carbonildiimidazol (CDI) en condiciones anhidras. MÉTODOS. Células: se utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) activadas, cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino. Virus: stock de HTLVIIIB obtenido a partir de células H9 crónicamente infectadas. Se infectaron PBMC con una moi de 6,45x103 TCID50/106 células. Al día 7 se cosechó el sobrenadante y se evaluó la producción de antígeno p24 mediante el ensayo de ELISA para calcular el IC50. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron sobre células no infectadas, mediante recuento de células viables, para calcular la CCID50. Finalmente se calculó el Índice de Selectividad (IS=CCID50/ IC50). RESULTADOS. Se obtuvieron nuevas prodrogas de ddI con buenos rendimientos. Tanto los derivados obtenidos como su precursor, fueron caracterizados por técnicas de RMN tales como COSY (homo y heteronucleares) y DEPT. Los derivados de ddI estudiados mostraron, en PBMC, poseer un IS similar al de la droga madre excepto el derivado ddIPenta el cuál mostró un IS 100X mayor, principalmente mediado por su baja toxicidad. R H -O-C(O)-(CH2)-CH3 -O-C(O)-(CH2)3-CH3 -O-C(O)-(CH2)4-CH3 -O-C(O)-(CH2)5-CH3 -O-C(O)-(CH2)6-CH3
Compuesto ddI ddI-Eta ddI-Buta ddI-Penta ddI-Hexa ddI-Hepta
La introducción de un grupo carbonato (alcoxicarbonilo), en nucleósidos activos, resulta de interés tanto por su utilidad como grupo protector como por la capacidad de otorgarle ventajas fisicoquímicas y farmacocinéticas, lo que redundará en una mayor capacidad para atravesar membranas lipídicas y optimizar su llegada al receptor. El mejoramiento de estas propiedades es un aspecto fundamental en el diseño de nuevas prodrogas de compuestos farmacológicamente activos.
O14 - 27662 DINÁMICA DE CUASIESPECIES A NIVEL DEL GEN DE LA POLIMERASA DEL VIRUS DE HEPATITIS B (HBV) TRAS 11 AÑOS DE SEGUIMIENTO EN UN PACIENTE CRÓNICAMENTE INFECTADO EXPUESTO A DIVERSAS ALTERNATIVAS TERAPÉUTICAS. CASSINO, L(1); BENETTI, S(2); FAY, F(2); TANNO, H(3); QUARLERI, J(1) (1) Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Fac de Medicina (UBA), Bs As. (2) Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad (CIBIC), Rosario. (3) Servicio de Gastroenterología y Hepatología del Htal. Provincial de Centenario, Rosario. Introducción. La infección por HBV es un proceso dinámico en el que diferentes variantes virales se seleccionan en respuesta a la presión ejercida por la terapia. Objetivo: Analizar la dinámica de cuasiespecies virales a lo largo de 11 años (1998-2009) desde un paciente crónicamente infectado que recibió secuencialmente tratamiento con interferón (IFN) como monoterapia, luego se le adiciona lamivudina (LMV). Se reemplaza por adefovir (ADV) y, finalmente se trata con entecavir (ETV) solo y asociado a tenofovir (TDF). Métodos. Se seleccionaron 4 muestras de suero colectadas a lo largo del período de estudio de un paciente con historia de infección por HBV, genotipo A2. Para cada punto de análisis se determinó la expresión del HBeAg (EIA, Roche) y, los niveles de carga viral plasmática (COBAS TaqMan HBV, Roche
Diagnostics; rango de detección: (2,7x10²-2,7x108 copias/ml) como medida de la capacidad replicativa. Adicionalmente se dispuso de parámetros bioquímicos de funcionalidad hepática (ALT, ALT, GGT). El análisis de la heterogeneidad de cuasiespecies del HBV a nivel del gen pol implicó la extracción de DNA viral mediante lisis alcalina, amplificación genómica por PCR, con posterior clonado y secuenciación nucleotídica de 20 clones. Cada una de las secuencias nucleotídicas se inspeccionó visualmente para verificar la presencia de mutaciones de resistencia a análogos núcleosidos. Resultados. En ausencia de presión por IFN o drogas antivirales, no se observaron mutaciones primarias de resistencia. Tras tres años de exposición a LMV, se detectó la mutante M204I presente en todos los clones de la población a expensas de una ostensible pérdida de la capacidad replicativa (carga viral: 5,4x10² copias/ml). Posteriormente y concomitante con el surgimiento de la mutación L180M mayoritaria y sostenidamente en el tiempo, se advierte una recuperación del fitness viral (carga viral: 4,5 x105 copias/ml). Ambas mutaciones (M204I, L180M) se establecen a pesar del cambio en la terapia. No se evidenciaron mutaciones primarias de resistencia a ADF, ETV o TDF. Desde la muestra basal, se observa la mutación L217R en todas las cuasiespecies virales. No se evidencia la presencia de mutaciones primarias de resistencia a ADV, ETV o TDF ante su administración. La expresión del HBeAg evidenció conversión/ reversión hacia/desde anti-HBe con fluctuaciones paralelas en los niveles de carga viral, que persisten detectables. CONCLUSIONES. Las mutaciones primarias a LMV M204I/L180M se establecieron en la población del HBV aún luego de interrumpido su uso. Se identifica la presencia de la mutación L217R recientemente asociada a resistencia a adefovir, irrespectivamente de la presión de selección. El estudio de la dinámica de cuasiespecies de HBV por más de una década deja ver el impacto la composición de cuasiespecies de HBV ante la presión ejercida por el tratamiento antiviral y sus implicancias en el perfil serológico y capacidad replicativa viral.
O15 - 27933 DETECCIÓN DE LOS PRIMEROS PERÍODOS DE VENTANA EN DONANTES DE SANGRE CON EL ENSAYO PROCLEIX ULTRIO. ACEVEDO, ME; OTERO, A; FRANCESCHI, V; PALACIOS, G; NEIROT, R; RODRIGUEZ, E; FERNANDEZ, RJ F. Hemocentro Buenos Aires Introducción. La detección de ácidos nucleicos virales en donantes de sangre por NAT disminuye el riesgo residual, acortando el período de ventana serológica. En nuestro centro se testean por NAT para HIV y HCV todas las unidades a transfundir desde junio de 2004. A partir de septiembre de 2008 comenzamos a testear las unidades con el ensayo Procleix Ultrio de Chiron que detecta simultáneamente HIV-1, HCV y HBV. Objetivo. Detectar y descartar precozmente las unidades de sangre de donantes con viremia para HIV, HCV o HBV con pruebas serológicas no reactivas. Materiales y Métodos. Los ensayos de NAT HIV-1/HCV/ HBV se realizaron en muestras de plasma de donantes en paralelo con las técnicas de serología. La metodología NAT utilizada detecta simultáneamente ARN de HIV-1 y HCV; y ADN de HBV en plasma humano. La amplificación de ácidos nucleicos se realizó por TMA (transcription mediated amplification) con reactivos Procleix Ultrio de Chiron. Todas las unidades reactivas por NAT fueron estudiadas con ensayo discriminatorio para identificar el virus presente en la muestra. El ensayo de carga viral de HBV se llevó a cabo en el Hospital Italiano de Buenos Aires por el método COBAS Taq Man HBV (Real Time). La carga viral de HIV se realizó en el Centro Nacional de Referencia para el SIDA con Versant HIV-1 RNA 3.0 ASSAY (bDNA) Bayer. Resultados. Desde la implementación de Procleix Ultrio (Novartis-Chiron, USA) se testearon por NAT en nuestro centro 68.654 donantes, entre propios y derivaciones externas. Se obtuvieron en este período 5 unidades NAT reactivas con serología no reactiva para los marcadores HBcAc, HBsAg, HCV y HIV/P24. Al realizar los test discriminatorios correspondientes se detectaron 3 unidades reactivas para HBV, 1 HCV y 1 HIV. Todas las pruebas serológicas y moleculares fueron repetidas de bolsa de plasma obteniéndose idéntico resultado.. Sólo pudimos realizar el seguimiento de dos
XII Congreso Argentino de Microbiología - Presentaciones Orales
donantes NAT HBV reactivos y del donante NAT HIV reactivo. De los donantes HBV reactivos uno de ellos fue retesteado a los 17 días de la muestra índice con un resultado HBsAg reactivo y HBcAc negativo. El otro donante a los 28 días tuvo serología no reactiva, seroconvirtiendo recién 17 días después, pero sólo para HBcAc y HBsAc. Este donante fue vacunado para hepatitis B entre la primera y la segunda muestra. Las cargas virales de HBV fueron 30 UI/ml y 146 UI/ml respectivamente. La segunda muestra del donante NAT HIV reactivo fue no reactiva a los 7 días y la tercera fue reactiva a los 14 días con ELISA cuarta generación HIV Ag/Ac. La carga viral de HIV fue de 297 copias/ml. CONCLUSIONES. A partir de estos casos detectados con viremia para HBV, HIV y HCV y serología no reactiva, toma relevancia la importancia de la inclusión de NAT dentro del testeo de rutina de unidades a transfundir y la ampliación del screening incluyendo el HBV para aumentar la seguridad transfusional. Al no tener registros anteriores en nuestro país de HBV en ventana serológica en donantes de sangre podemos concluir que son los primeros casos de período de ventana de HBV detectados en Argentina y que exitosamente se evitó su transfusión gracias a las técnicas de Biología molecular a pesar de no existir normas para su implementación en nuestro país.
O16 - 27938 EFECTO DE VARIACIONES ESTRUCTURALES DE LA PROTEÍNA VPU DE HIV-1 SOBRE LA CAPACIDAD REPLICATIVA VIRAL. DE CANDIA, C; ESPADA, C; TURK, G; SALOMON, S; CAROBENE, M Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Facultad de Medicina, UBA, Argentina Introducción. La proteína Vpu de HIV-1 cumple con dos funciones biológicas diferentes durante el ciclo replicativo viral: incrementar la producción de partículas virales e inducir la degradación de CD4. Aunque una gran diversidad de secuencias entre subtipos virales ha sido extensamente documentada, poco se sabe acerca de variaciones funcionales relacionadas con esta diversidad y menos sobre la inherente a variantes recombinantes intersubtipo de dicha proteína. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de variaciones en la proteína Vpu sobre la replicación viral. Para ello se realizó un ensayo in vitro de evaluación de la capacidad replicativa relativa o fitness de un variante viral quimérica portadora de Vpu recombinante BF, respecto de una variante viral tipo salvaje subtipo B. Materiales y Métodos. El vector pNL4-3, que contiene el genoma completo de una variante subtipo B de HIV-1, se utilizó para la generación de una quimera viral portadora de la secuencia codificante para Vpu proveniente de un aislado viral recombinante intersubtipo BF (CRF_12BF). Mediante mutagénesis sitio-dirigida, se generaron sitios de restricción en el genoma viral tipo salvaje, lo que permitió el reemplazo de la región codificante para Vpu de un subtipo por otro. Los stocks virales se prepararon por transfección de cultivos de la línea 293T y posterior propagación en la línea MT2. El ensayo de competición in vitro fue realizado infectando cultivos de la línea CEM, con la variante viral subtipo B de referencia (NL4-3 Vpu B) y la variante quimérica mencionada anteriormente (NL4-3 Vpu BF), en una relación de MOI 1:1. Las infecciones fueron mantenidas durante 21 días, realizándose toma de muestra de células y sobrenadante de cultivo a días 1, 12 y 21 post-infección. El DNA genómico celular fue extraído usando un kit comercial, y se amplificó por PCR la región proviral codificante para Vpu. Se clonó y secuenció el amplicón obtenido, para luego establecer la proporción de cada variante presente en cada muestra, y la variación de dicha proporción en función del tiempo. Las infecciones fueron realizadas por duplicado. Las diferencias estadísticas fueron calculadas por t-student. Resultado. El análisis de la composición de la población en cada día analizado mostró un predominio de la variante subtipo B al D1 (relación B/BF: 1.52), sin embargo dicha relación varió con el tiempo en favor de la variante quimérica portadora de la secuencia Vpu recombinante BF, en donde la relación a D12 y D21 fue B/BF: 1.16 y B/BF: 0.99, respectivamente. Conclusión. El resultado obtenido en el presente trabajo proporciona clara evidencia de la relación existente entre los cambios genómicos introducidos por la recombinación
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intersubtipo a nivel de la proteína Vpu y la funcionalidad de la misma. Los cambios presentes en la variante recombinante intersubtipo BF de Vpu son suficientes para manifestarse a corto plazo como una ventaja biológica durante la replicación viral en células susceptibles, sugiriendo que cambios en su estructura podrían desempeñar un papel fundamental en la diseminación de una variante recombinante intersubtipo, como se observa en varias regiones del mundo, incluyendo América del Sur.
BACTERIOLOGÍA, MICOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA CLÍNICA O17 – 27426 - Neisseria gonorrhoeae RESISTENTE A CIPROFLOXACINA EN ARGENTINA ENTRE 1996-2006: UNA COMPARACIÓN DE ANÁLISIS FENOTÍPICO Y GENOTÍPICO. GALARZA, P (1); VACCHINO, M (1); ENRIQUEZ, R(2); PAGANO, I(1); ACCARINO, C(1); OVIEDO, C(1); VAZQUEZ, J(2); RED, ITS(3) (1) Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas -INEI-ANLIS “Dr. CG Malbrán”, (2) Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), (3) Programa Nacional de Vigilancia de la Sensibilidad Antimicrobiana de Gonococo (PROVSAG) En 1996 se detecta la 1ª cepa con sensibilidad disminuida a ciprofloxacina (Cip). Durante los 10 años posteriores fueron derivados por el PROVSAG 3837 aislamientos (ais) de los cuales 51 presentaron cambios en las regiones determinantes de resistencia a quinolonas (QRDR) mostrando un incremento paulatino, alcanzando el 8% en el año 2006. El objetivo fue caracterizar los ais con reducida sensibilidad y resistentes a Cip derivados al CNR, entre 1996-2006 por métodos fenotípicos y genotiípicos de tipeo y describir la epidemiología de la gonorrea con resistencia a Cip. Los ais fueron caracterizados por axotipo, serogrupo, sensibilidad antibiótica, perfil plasmídico, N. gonorrhoeae multiantigen sequence typing (NG-MAST) y por secuenciación de QRDRs para gyrA, parC, parE, y mtrR de la bomba de eflujo. En aquellos ais con CIM a Cip 1. Las sustituciones más frecuente en gyrA con 43 ais fueron Ser91-Phe y Asp95-Gly, de las cuales 23 contenían una mutación en parC de Ser87-Arg con valores de CIM entre 2 y 32µg/ml, seguida por 11 ais con una sustitución de Asp86-Asn con valores de CIM entre 2 y 16µg/ml. Cabe destacar que 9 ais con dos mutaciones en parC de Gly85-Asp y Ser87-Arg presentaron CIM entre 8 y 16µg/ml. Las mutaciones en parC fueron encontradas únicamente en aquellas cepas conteniendo mutaciones en gyrA. Dos ais con mutaciones en gyrA Ser91-Tyr, Asp95-Asn mostraron una mutación en parE Pro456-Ser sin mutaciones en parC. Se encontraron 28 ST, 16 no descriptos. Estos últimos abarcan 24 ais (47%). Los ST más prevalentes fueron el 225 (16%), 4444 (10%) y el 292 (8%). Considerando las regiones del país, en la zona centro se detectaron 6 ST distribuidos en 10 ais; en Buenos Aires y CABA 16 ST en 22 ais; en el NEA un solo ais con ST característico, todos propios de cada región. Seis QRNG fueron beta-lactamasa positiva y presentaron el mismo perfil plasmídico 2,6+3,05+24,5 MDal distribuidos en 4 provincias. En la tabla siguiente se muestra la caracterización auxotipo/ serotipo (A/S) según las distintas concentraciones inhibitorias. A/S
A/IB NR/IB NR/IA P/IB PA/IB Total
Nº (%) de aislamientos 5 (9,8) 17 (33,3) 3 (5,9) 18 (35,3) 8 (15,7) 51 (100)
0.125
2 (11,8)
Nº (%) de aislamientos con CIM (µg/ml) a CIP 0.25 2 4 8 16
2 (11,8)
2 (11,1) 4 (7,8)
2 (3,9)
1 (20,0) 5 (29,4) 1 (33,3) 1 (5,6)
1 (20,0) 1 (5,9) 3 (17,6) 1 (33,3) 4 (22,2) 3 (16,7)
8 (15,7)
7 (13,7) 6 (11,7)
3 (60,0) 4 (23,5) 1 (33,3) 8 (44,4) 5 (62,5) 21 (41,2)
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Total
5 (100) 17 (100) 3 (100) 18 (100) 3 (37,5) 8 (100) 3 (5,9)
Se observa una gran variedad de ST distribuidos en todo el territorio, si bien se vio predominancia de algunos por regiones. El ST 225 predominante, se ha descripto en Inglaterra, Escocia, Francia y Suecia entre otros. Segun el GeneBank, obtuvimos dos mutaciones no descriptas en parC y parE y una combinacion de
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mutaciones nunca asociadas. Las mutaciones en parE no se pueden relacionar con el aumento de la CIM. Se descarta que el A/S PA/IB englobe las CIMs a Cip más elevadas.
O18 – 27471 - Klebsiella pneumoniae PRODUCTORA DE SERINCARBAPENEMASA TIPO KPC (KPKPC): COMUNICACIÓN DE 4 AISLAMIENTOS. EVALUACIÓN DEL CHROMAGAR KPC (CHROM) PARA ESTUDIOS DE PORTACIÓN RECTAL. ERRECALDE, LAURA(1); TUTZER, SILVIA(1); JORDA VARGAS, LILIANA(1); COGUT, SANDRA(1); CATTANI, EUGENIA(1); ELBERT, GABRIELA(2); PASTERAN, FERNANDO(3); CORSO, ALEJANDRA(3); KAUFMAN, SARA(1) (1)Sección Microbiología y (2) División Infectología- Hospital General de Agudos J. Fernández. (3) Servicio Antimicrobianos. INEIANLIS “Dr C. G. Malbrán” Introducción: las KpKPC representan un serio problema para el sistema de salud debido a que presentan pocas opciones terapéuticas y rápida diseminación. Los estudios de colonización rectal permiten identificar y aislar a los pacientes portadores para prevenir la transmisión. Objetivos: describir los 4 primeros aislamientos de KpKPC en nuestro hospital. Reportar los resultados de los estudios de vigilancia de colonización rectal. Comparar el desempeño del CHROM con el método propuesto por el Centers for Disease Control and Prevention (CDC) para el estudio de colonización rectal. Materiales y métodos: los 4 aislamientos fueron estudiados mediante sistema automatizado Phoenix y difusión en agar según CLSI. Se realizó la prueba de inhibición de imipenem con ácido 3-aminofenil borónico (APB) reconocido como inhibidor de carbapenemasas de clase A. Las cepas fueron caracterizadas en el INEI para blaKPC por PCR. Para el estudio de colonización se tomaron 2 hisopados rectales de pacientes de: clínica médica (37), terapia intensiva e intermedia (29), ginecología (2), cirugía (12) y cardiología (1) y se sembraron respectivamente en CHROM (preparado según instrucciones del fabricante) y caldo tripteína soya (5ml) con el agregado de un disco de meropenem (método CDC). Se incubaron 24 h a 37°. Se estudiaron las colonias azules del CHROM y se repicó 0,1 ml del caldo a medio Levine. Se incubó 24 h a 37°. A las 24 h se estudiaron las colonias mucosas fermentadoras del medio Levine. Resultados: se aislaron 4 KpKPC: 1 en abril, 1 en mayo y 2 en junio de 2010. Los aislamientos sólo presentaron sensibilidad a fosfomicina, tigeciclina, minociclina y tetraciclina, 2 aislamientos fueron sensibles a colistina. Todos fueron aislados de orina y pertenecientes a un hombre y 3 mujeres. Edades: 25, 68, 75 y 88 años. Todos presentaron co-morbilidades: diabetes (2), SIDA (1), hipertensión arterial (1), hiperplasia prostática benigna (1) y como factores de riesgo se identificaron: sonda urinaria (4), catéteres (4), tratamiento antibiótico previo (4), postración (1), intervenciones quirúrgicas (2), internación prolongada (mayor a 1 mes) (4), asistencia respiratoria mecánica (1). Los hisopados rectales fueron positivos en 9/81 (11,1%) pacientes (3 de clínica médica y 6 de terapia intensiva). El CHROM detectó los 9 positivos y el CDC detectó sólo 6/ 9. El CHROM presentó 2 falsos positivos por Acinetobacter spp. y K. pneumoniae sensible a carbapenemes. El CDC tuvo desarrollo de colonias en 29/81 en su mayoría Acinetobacter spp., lo que dificultó la observación de otras colonias. Describimos la emergencia de KpKPC en un hospital general de agudos de la CABA. Los hisopados rectales revelaron que varios pacientes estaban colonizados lo que permitió aislarlos tempranamente. El CHROM mostró mejor rendimiento que el método del CDC, menor porcentaje de contaminaciones y una disminución de 24 h para obtener el resultado.
O19 – 27488 - Proteus mirabilis PRODUCTOR DE AmpC-PLASMÍDICO CON FENOTIPO INUSUAL DE SENSIBILIDAD A CEFOXITINA. COGUT, SANDRA (1); FACCONE, DIEGO (2); RAPOPORT, MELINA (2); ERRECALDE, LAURA (1); KAUFMAN, SARA (1); PASTERAN, FERNANDO (2); CORSO, ALEJANDRA (2) (1) Hospital Fernández, (2) Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas-INEI- ANLIS “Dr. CG Malbrán”
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Introducción: en las últimas décadas se ha reportado, con creciente frecuencia a nivel mundial, la adquisición de plásmidos portadores de ß-lactamasas de tipo AmpC en bacterias que naturalmente carecen de dicho mecanismo de resistencia (MR) codificado a nivel cromosomal o lo expresan en muy bajo nivel. La prevalencia de este mecanismo en enterobacterias de nuestro país no es bien conocida, en parte por lo dificultoso de su detección. Hasta la fecha, la resistencia (R) a cefoxitina (FOX), era el principal marcador de la presencia de este MR. Objetivo: caracterizar el mecanismo de resistencia responsable de un fenotipo inusual en aislamientos de P. mirabilis y evaluar la relación clonal entre estos. Métodos: entre agosto de 2007 y julio de 2008 se aislaron 8 P. mirabilis de pacientes internados en el Hospital Fernández a partir de muestras de urocultivo (7) y lavado bronco alveolar (1). El estudio de sensibilidad por difusión (CLSI) de todos los aislamientos mostró R a cefalotina (CTN) y cefpodoxima (POD), sensibilidad (S) a cefotaxima (CTX) y ceftacidima (CAZ), test confirmatorio de B-lactamasa de espectro extendido (BLEE) negativo y valores entre 18-20mm para FOX (S=18mm; CLSI). Estos aislamientos fueron derivados al CNR para su caracterización. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) por dilución en agar a ß-lactámicos solos y con el agregado de ácido 3aminofenil-borónico (APB). Se realizó ensayo microbiológico con FOX para evaluar la actividad enzimática de los aislamientos y se ensayaron sinergias entre los discos de FOX y APB (300ug). Se empleó una PCR-multiplex para la detección de distintas familias de AmpC-plasmídico. La relación genética de los aislamientos se determinó por electroforesis en campo pulsado (PFGE) con la enzima de restricción SmaI. Resultados: se confirmó la S a CTX (1-2mg/l) y CAZ (1-4mg/l) por CIM, el agregado de APB redujo los valores de CIM entre 3-5 diluciones. En 7 aislamientos la CIM a FOX fue S (8mg/l) y en el restante intermedio (I) (16mg/l). Los ensayos microbiológicos fueron positivos para FOX, confirmando la actividad enzimática y se observó efecto sinérgico entre los discos de FOX y APB. En todos los aislamientos se obtuvo amplificación para la familia de AmpC tipo CMY-2. Por SmaI-PFGE se discriminaron 4 clones (n), A (3), B (3), C (1) y D (1). Conclusiones: a pesar de que la presencia de la enzima plasmídica tipo CMY-2 en enterobacterias confiere usualmente un fenotipo de resistencia a FOX, estamos reportando los primeros aislamientos de P. mirabilis portadores de esta enzima con fenotipo inusual de S a FOX. Frente al fenotipo de alto nivel de resistencia a CTN y POD, S a CTX y CAZ y test negativo para BLEE, se recomienda la búsqueda de AmpC plasmídico independientemente de la S a FOX, empleando los ensayos de sinergia entre los discos de FOX y APB y el microbiológico para FOX. Este hallazgo estuvo asociado a 4 clones, sugiriendo la diseminación horizontal intrahospitalaria de los plásmidos involucrados. La aparición de este MR con un fenotipo inusual requiere de la atención y el seguimiento por parte de los integrantes del sistema de salud.
O20 – 27553 - DISEMINACIÓN DE Enterococcus faecium CON RESISTENCIA A GLICOPÉPTIDOS (VREFM) DEL COMPLEJO CLONAL 17 EN ARGENTINA. FACCONE, DIEGO (1); ABEL, SOFIA (1); LOPEZ RUITTI, PAULA (1); GAGETTI, PAULA (1); CORSO, ALEJANDRA (1) (1) Servicio Antimicrobianos. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. INEI-ANLIS “Dr. CG Malbrán” Introducción: los enterococos son patógenos causantes de infección nosocomial que han adquirido resistencia a casi todos los antibacterianos, incluyendo los glicopéptidos. Las infecciones nosocomiales por VREfm se han asociado con la diseminación de aislamientos genéticamente relacionados al complejo clonal 17 (CC17). Actualmente el CC17 está integrado por aislamientos con diversos Sequence Type (ST) definidos por MLST, pero conserva dos características fuertemente asociadas a este complejo clonal: i) el alelo 1 del gen purK (según MLST) y ii) la presencia del gen esp (proteína de superficie). En un estudio previo caracterizamos molecularmente los primeros 189 VREfm de Argentina
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y determinamos que la resistencia a VAN estaba mediada primariamente por el gen vanA. Por SmaI-PFGE se discriminaron 35 tipos clonales, sin embargo el 57% de los aislamientos se agrupó en un único clon dominante A. Objetivo: el presente trabajo tuvo como finalidad evaluar la posible relación genética entre los clones de VREfm de Argentina y el CC17. Materiales y métodos: los 189 VREfm estudiados procedían de 30 hospitales, 20 de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires (n: 125/66.1%), 6 de la provincia de Buenos Aires (n: 52/27.5%) y 4 de Córdoba, Santa Fe y Chaco (n: 12/6.4%). Las cepas fueron colectadas de muestras de hisopado rectal (n/%) (145 /77), orina (17/9), sangre (9/5) y otros (18/9); 186/189 aislamientos portaban el gen vanA y los 3 restantes el gen vanB. Los VREfm fueron resistentes: 98% ampicilina, 100% vancomicina, 98% teicoplanina, 100% eritromicina, 99% ciprofloxacina, 96% estreptomicina, 77.2% gentamicina, 6.3% tetraciclina y 3.7% cloranfenicol. El gen esp se detectó por PCR (Leavis H., et al. JCM 44:1059-64, 2006). La secuenciación de los genes purK, atpA, ddl, gdh, gyd, pstS y adk se realizó según el esquema definido para la técnica de MLST para esta especie. Resultados: analizando un aislamiento representativo del clon mayoritario A y uno de cada uno de los 34 tipos clonales restantes, se determinó que 25 de estos clones portaban el gen esp, representando el 92,3% del total de los aislamientos. Al secuenciar el gen purK de los dos clones mayoritarios A (57%) y B (7%) y comparar con la base de datos de MLST (http://efaecium.mlst.net/) se confirmó que las secuencias presentaban 100% de homología con la correspondiente al alelo 1, asociada al CC17. Las secuencias de los 6 genes restantes del esquema de MLST en los mismos clones confirmó que ambos pertenecen al ST=17. Conclusión: el análisis de los resultados de los genes esp y purK en los 2 clones mayoritarios, A y B (64%), sugiere que el CC17 es el principal responsable de la emergencia y diseminación de VREfm en Argentina. Estos resultados fueron confirmados al determinar que ambos clones corresponden al ST=17, genotipo fundador del CC17. En el mismo sentido, la presencia del gen esp en la mayoría de los VREfm (>90%) indicaría que estos clones hospitalarios tienen como origen común el CC17. Nuestros resultados concuerdan con la hipótesis de que todos los aislamientos de VREfm causantes de infección hospitalaria circulantes en la actualidad comparten un origen ancestral con el CC17. O21 – 27636 - METICILINO RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD A VANCOMICINA EN Staphylococcus COAGULASA-NEGATIVA (SCN): EVALUACIÓN DE DISTINTAS METODOLOGÍAS. GAGETTI, P (1); CERIANA, P (1); SOLOAGA, R (2); RODRIGUEZ, M (1); CORSO, A (1) (1)Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS “Dr. CG Malbrán”. (2) Hospital Naval de Buenis Aires Introducción: SCN ha emergido como agente causal de bacteriemia en inmunocomprometidos y en niños. El aumento en la meticilino resistencia (MR) y la resistencia a otras drogas, convirtieron a vancomicina (VAN) en el último recurso para el tratamiento de infecciones por SCN. La detección precisa de MR y sensibilidad a VAN mediante las pruebas de sensibilidad de rutina en SCN es un desafío desde hace años. En 2004, el CLSI estandarizó la difusión con disco de cefoxitina (FOX) como predictor de MR en S. aureus (SAU) y SCN. En 2008 se publicaron los puntos de corte de CIM para FOX en SAU, pero aún no se han establecido para SCN. En 2009, se eliminaron los puntos de corte de difusión para VAN en SAU y SCN. A la fecha el disco de FOX y la CIM a VAN serían los únicos métodos disponibles en los laboratorios clínicos para evaluar de rutina MR y sensibilidad a VAN en SCN. Los sistemas automatizados podrían evaluar la sensibilidad a VAN, pero se desconoce el desempeño de los equipos en la detección de MR en SCN. Objetivos: 1-Evaluar el desempeño del disco de FOX y el sistema Vitek2 en la detección de MR en SCN, 2-Establecer puntos de corte para FOX por el método de agar dilución (AD) en SCN y 3- Evaluar la concordancia de la CIM a VAN entre Vitek2 y AD. Materiales y métodos: se estudiaron 100 SCN de la colección del INEI, representados por 10 especies: 49 S. epidermidis, 14 S. saprophyticus, 13 S.
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hominis, 7 S. haemolyticus, 6 S. simulans, 4 S. auricularis, 3 S. capitis, 2 S. warneri, 1 S. cohnii y 1 S. xylosus. Se incluyeron 54 mecA positivos y 46 mecA negativos. Se realizó difusión con disco de FOX (30 ug), CIM a FOX y VAN por AD según CLSI y sensibilidad por Vitek2 (AST-P577) según recomendaciones del fabricante. Se usó la PCR del gen mecA como método de referencia para MR. Se comparó la sensibilidad a VAN por Vitek2 con respecto al AD usado como referencia. Las discrepancias con el método de referencia fueron confirmadas. Resultados: 1-La sensibilidad (SE) del disco de FOX fue 96% (2 cepas con 25mm) y la especificidad (ES) 100%, con valor predictivo positivo (VPP) 100% y valor predictivo negativo (VPN) 96%. El resultado de Vitek2 (considerando CIM a oxacilina, screening con FOX y sistema experto) dio una SE y ES de 100% para MR. 2- El mejor punto de corte para FOX y SCN por AD se estableció en d” 2 para sensible y e” 4mg/l para MR con SE 94%, ES 91%, VPP 93% y VPN 94%. 3-El rango de CIMs a VAN fue 0,12-2 mg/l por AD y d” 0,5-4 mg/l por Vitek2. La CIM50 y CIM90 de VAN por ambos métodos fue 1 mg/l y 2 mg/l, respectivamente. La concordancia en la categoría de interpretación y la concordancia esencial (CIM±1dil) entre Vitek2 y AD fue 100% para VAN. De acuerdo a lo previamente descripto, el disco de FOX presentó muy buena SE y ES para la detección de MR en SCN. El sistema Vitek2 mostró ser altamente SE y ES para Ia detección de MR en todas las especies de SCN ensayadas. Si bien se evaluaron SCN con CIM VAN ≥ 4 mg/l, Vitek2 mostró 100% de concordancia con AD. El punto de corte de CIM de FOX propuesto para SCN de ≤ 2 y ≥ 4mg/l, presentó una buena SE y ES pero no logró superar al disco de FOX en el diagnóstico de MR en SCN.
O22 – 27726 - PREVALENCIA NACIONAL DE Staphylococcus aureus RESISTENTE A METICILINA (MRSA) ASOCIADO A LA COMUNIDAD (CA-MRSA) EN ARGENTINA: ESTUDIO 2009. SOLA, C(1); LAMBERGHINI, R(2); PAGANINI, H(3); GAGETTI, P(4 ); EGEA, A L(5); LUCERO, C(4); FACCONE, D(4); GRUPO CA MRSA, ARGENTINA; BOCCO, JL(5); CORSO, A(4) (1) CIBICI-CONICET-UNC, (2) Hospital Militar de Córdoba, (3) Hospital Nacional de Pediatría “Dr. JP Garrahan”, (4) Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. INEI-ANLIS “Dr. CG Malbrán”, (5) CIBICI-CONICET-UNC En los últimos años, CA-MRSA emergió y se diseminó, produciendo infecciones desde leves a muy graves, en diferentes países del mundo, con valores de prevalencia variables, alcanzando el 50% o más en algunas regiones. Estas cepas son sensibles a la mayoría de los antibióticos no ß-lactámicos (ANß) además de ser genéticamente distintas a los MRSA asociados al hospital. En los países de alta prevalencia, estas cepas transmisibles y virulentas, comenzaron a introducirse en los hospitales. En Argentina, se reportaron valores regionales de CA-MRSA de 16% en Córdoba (2005) y un rango entre 30% y 75% en pediatría, en provincias del norte, este y centro (2007). Objetivo: establecer la prevalencia nacional de MRSA en infecciones asociadas al ámbito hospitalario (HA-MRSA) y a la comunidad (CAMRSA). Materiales y métodos: se analizaron todas las infecciones por S. aureus [MRSA o S. aureus meticilino-sensible (MSSA)] producidas durante el mes de noviembre del año 2009 en 66 hospitales distribuidos en 21 provincias y CABA. Se definió como infección de inicio en el hospital (HO), a aquellas que no estaban presentes al ingreso del paciente y que se diagnosticaron luego de las primeras 48 h de internación. Se utilizó el criterio microbiológico para diferenciar CA-MRSA (MRSA con resistencia (R) a no más de un ANß) de HA-MRSA. Resultados: se obtuvieron 591 aislamientos de S. aureus, de los cuales el 54% fueron MRSA, 37% CA-MRSA y 17% HA-MRSA. La prevalencia de CA-MRSA varió entre el 5% y el 81%, con una tendencia a los valores más altos en el norte (Formosa, Jujuy, Salta y Catamarca) disminuyendo hacia el centro y sur del país. Se diagnosticaron 373 infecciones de inicio en la comunidad (CO), 53 % producidas por CAMRSA, 5% por HA-MRSA y 44% por MSSA. Las restantes 218 fueron infecciones HO, 37% producidas por HA-MRSA, 11% por CA-MRSA y 52 % por MSSA. La mayoría (76%) de las infecciones por CA-MRSA fueron de piel y tejidos blandos. El 24%, 60%
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y 43% de las infecciones por CA-MRSA, HA-MRSA y MSSA respectivamente fueron infecciones invasivas (Iinv). El tipo de muestras en IInv producidas por CA-MRSA/HA-MRSA fue (en %): sangre 55/57, líquido pleural: 12/18, tejido óseo: 18/3 y LCR: 8/1. El 34% de los CA-MRSA presentó R acompañante a un ANß: 21% ERY-CLI, 1.5% CIP, el 1.2% GEN, 0.6% RFA, y 0.3% CMP. Entre los HA-MRSA la R fue: 84% ERY-CLIN, 90% GEN, 74% CIP, 25% RFA, 8% TMS y 6% CMP. La prevalencia de MRSA en Argentina ha alcanzado el 54%, con predominio del fenotipo CAMRSA (37%) sobre HA-MRSA (17%). Las cepas CA-MRSA están diseminadas por todo el país, alcanzando los valores mayores de prevalencia en las provincias del norte. Una cuarta parte de las infecciones por CA-MRSA son invasivas. El 11% de las infecciones de inicio en el hospital son producidas por CA-MRSA. La epidemiología de las infecciones por MRSA esta cambiando drásticamente en nuestro país y en el mundo. Evaluar las estrategias para el control de la diseminación de MRSA tanto en el medio hospitalario como en la comunidad es el gran desafío de los efectores de salud.
O23 – 27753 - DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CARBAPENEMASAS EN Bacteroides grupo fragilis EN ARGENTINA. LITTERIO, M(1); FERNANDEZ CANIGIA, L(1); CEJAS, D(2); LEGARIA, MC(1); CASTELLO, L(1); PREDARI, SC(1); DI MARTINO, A(1); ROSSETTI, A(1); ROLLET, R(1); CARLONI, G(1); BIANCHINI, H(1); RADICE, M(2); GUTKIND, G(2); OTROS PARTICIPANTES DE LA VIGILANCIA(3) (1) Subcomisión de Bacterias Anaerobias - SADEBAC (2) Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA (3) Bottiglieri M, Rocchi M, Márquez MI, Machain M, Mauro MC, Núñez MR, Ballester D. Introducción: Bacteroides grupo fragilis (BGF) son los bacilos gram-negativos anaerobios más frecuentemente implicados en infecciones en humanos. Se destacan del resto de los anaerobios por su amplia resistencia a los antibióticos de uso habitual. Aunque la actividad de algunos antibacterianos se ha mantenido inalterable a lo largo de los diferentes relevamientos efectuados en nuestro país, en estudios recientes hemos detectado la emergencia de aislamientos con resistencia o sensibilidad reducida a los carbapenemes [imipenem (IMI), ertapenem (ERT) y doripenem (DOR)]. La producción de una metalo-ß-lactamasa codificada por el gen cfiA ha sido descripta en la literatura como la responsable de la resistencia a estos antibióticos. Objetivos: evaluar fenotípicamente la presencia de metalo-carbapenemasas en aislamientos de BGF resistentes o con sensibilidad disminuida a los carbapenemes (CIM =4 ug/ml) y detectar genotípicamente la presencia de cfiA. Materiales y métodos: se determinó la sensibilidad a ERT, IMI y DOR de 363 aislamientos de BGF por el método de dilución en agar según las normas del CLSI. En los aislamientos que mostraron resistencia o sensibilidad disminuida a IMI, ERT o DOR (CIM= 4 ug/ml) se determinó la CIM a IMI con el agregado de EDTA (0,4 mM) para evaluar la posible presencia de metalo-carbapenemasas del grupo 3 de K. Bush. Se investigó la presencia del gen cfiA por amplificación por PCR empleando genes específicos en dichos aislamientos. Resultados: en 20 aislamientos se observó una CIM = 4 ug/ml para los carbapenemes. El gen cfiA codificante de la metalo-ß-lactamasa se detectó en 8 aislamientos de Bacteroides fragilis: tres de ellos presentaron alta resistencia a los tres carbapenemes, la cual revirtió por el agregado de EDTA (disminución de la CIM de IMI = 3 títulos). En los 5 restantes, con sensibilidad disminuida a ERT y DOR, pero sensibles a IMP, la inhibición con EDTA sólo se observó en 3 de ellos. No se detectó la presencia de cfiA en otras especies de Bacteroides grupo fragilis, ni en una cepa de Bacteroides ovatus/ thetaiotaomicron resistente a los tres carbapenemes en el cuál tampoco se observó inhibición con EDTA. Conclusiones: el ensayo de detección fenotípica empleando EDTA permitió la detección de metalo-carbapenemasas en 6/8 microorganismos productores de la enzima cfiA (en todos aquellos que presentaron resistencia y en 3/5 que presentaron sensibilidad disminuida). La detección del gen codificante de dicha metaloenzima no siempre correlaciona altos valores de CIM para los carbapenemes, por lo tanto, es necesario determinar la presencia de elementos que
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regulen la expresión de este gen, la presencia de mecanismos concomitantes y los mecanismos que median la resistencia en otras especies diferentes a B. fragilis.
O24 – 27947 - RESISTENCIA A CARBAPENEMES EN Pseudomonas aeruginosa: UN EJEMPLO DE COOPERACIÓN. SANTELLA, GISELA (1); POLLINI, SIMONA (2); GUTKIND, GABRIEL (1); ROSSOLINI, GIAN MARIA (2); RADICE, MARCELA (1) 1. Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA, Argentina, 2. Dpto. Biologia Molecolare, Universitá di Siena, Italia La expresión de carbapenemasas, la sobreexpresión de enzimas de tipo AmpC, el aumento en la expresión de las bombas de eflujo, la disminución en la permeabilidad de la membrana y la presencia conjunta de estos mecanismos pueden ser reponsables de la multirresistencia en Pseudomonas aeruginosa (Pae). En este trabajo se analizó la contribución a la resistencia de los distintos mecanismos mencionados. Métodos: se incluyeron 20 aislamientos de Pae recuperados en el período 2004–2005, en un hospital de Buenos Aires. Si bien todos los aislamientos presentaron el mismo nivel de expresión de la enzima IMP-13 y pertenecieron al mismo tipo clonal, sólo 5/20 fueron resistentes a carbapenemes (grupo-R), resultando el resto sensibles (grupo-S). La identificación de las proteínas de la membrana externa fue realizada por SDS-PAGE y MALDI-TOF. Se secuenciaron en forma completa OprD y AmpC y se compararon con bases de datos. Se determinaron los niveles de expresión de los genes codificantes de OprD, de AmpC y de los sistemas de eflujo de tipo Mex por RT-PCR. Se determinó la frecuencia de obtención de mutantes resistentes a carbapenemes en el grupo-S, en Pae ATCC 9027 y en aislamientos clínicos no productores de metalo beta lactamasas (MBL) por crecimiento en concentraciones crecientes de carbapenemes. Resultados: la ausencia de OprD observada por SDS-PAGE fue confirmada por espectrometría de masa en todos los aislamientos del grupo-R, sin embargo no se observaron variaciones en los niveles de expresión de los genes codificantes. La secuencia de OprD en el grupo-S fue idéntica a la variante OprD-TS. Por el contrario las secuencias de OprD en 2/5 aislamientos del grupo-R presentaron una deleción puntual que se traduce en una terminación prematura de la proteína, mientras que 3/5 presentaron una deleción de 27 pb que origina una proteína de menor tamaño afectando probablemente su conformación funcional. La frecuencia de selección de mutantes resistentes a carbapenemes en los aislamientos del grupo-S fue de 2 x 108 a 1.6 x 107; no se obtuvieron mutantes a partir de Pae ATCC 9027 ni de aislamientos clínicos no productores de MBL. En todos los aislamientos (grupo-S y grupo-R) se observó el mismo nivel de producción de una enzima de tipo AmpC, PDC-5, que correspondió a una variante que presenta una débil actividad de carbapenemasa. Con respecto a la expresión de sistemas de eflujo sólo se observó un ligero aumento en el sistema de eflujo MexAB-OprM en el grupo-R. Conclusiones: diversas mutaciones responsables de la ausencia de OprD en membrana externa, así como la sobreexpresión de MexAB-OprM y la presencia de la enzima PDC-5, contribuyen a la resistencia a carbapenemes en aislamientos productores de IMP-13. El aumento en la frecuencia de selección de mutantes en los microorganismos productores de MBL respecto de los no productores pone de manifiesto el riesgo de falla terapéutica en presencia de aislamientos productores de IMP-13 categorizados como sensibles de acuerdo a los puntos de corte del CLSI.
MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y AMBIENTAL O25 - 27080 DIVERSIDAD Y ABUNDANCIA DE BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL EN SUELOS URUGUAYOS CON ROTACIÓN DE CULTIVOS Y SIEMBRA DIRECTA. BAJSA, NATALIA(1,2); AZZIZ, GASTON(1); COUTINHO, HEITOR DA C(3); ROSADO, ALEXANDRE S(4); ARIAS, ALICIA(1) (1) Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Uruguay, (2) Universidad de la República, Uruguay, (3) Empresa
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Brasileira de investigación Agropecuária, Brasil, (4) http:// www.ufrj.br/Universidade Federal do Rio de Janeiro La rotación de cultivos y la siembra directa son prácticas agrícolas que han sido adoptadas por los productores uruguayos como alternativas más sustentables que el cultivo continuo y el laboreo convencional, debido a sus efectos sobre la productividad y parámetros fisicoquímicos del suelo. Sin embargo, poco se sabe sobre el impacto de estos sistemas de manejo sobre las bacterias edáficas promotoras del crecimiento vegetal (PGPB). El objetivo de este trabajo fue evaluar el impacto del cultivo continuo de granos o su rotación con pasturas sobre comunidades de PGPB. Se utilizó un ensayo de larga duración instalado en INIATreinta y Tres (Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Uruguay), que cuenta con tratamientos con diferentes intensidades de uso del suelo bajo siembra directa. Se tomaron muestras de suelo en otoño y primavera, durante 2 años y se analizaron las poblaciones cultivables por técnicas clásicas de recuento, así como la estructura de la comunidad por métodos moleculares independientes de cultivo. La población de actinobacterias fue más abundante en campo natural y en las rotaciones con mayor presencia de pasturas que bajo agricultura continua. La abundancia de Pseudomonas fluorescentes y esporulados aerobios (principalmente Bacillus spp.) no presentó diferencias significativas entre los tratamientos. Se analizó la diversidad del dominio Bacteria por DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) de fragmentos del gen del ARNr 16S. Se observó una clara relación entre la estructura de la comunidad y el tratamiento agronómico. Las muestras de campo natural resultaron más similares a las muestras con pasturas que a las de cultivo continuo de granos. Los patrones correspondientes a las rotaciones fueron intermedios entre el tratamiento de mejoramiento permanente y el de agricultura continua. Los resultados de este trabajo aportaron conocimiento sobre la abundancia y diversidad de bacterias presentes en suelos uruguayos, y permitieron establecer que los sistemas de manejo agrícola alteran la estructura de las comunidades bacterianas edáficas. Financiación: PDT-DICYT, UNU-BIOLAC, PEDECIBA.
O26 - 27332 CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA Y MOLECULAR DE Pseudomonas EN SUELO Y RIZOSFERA DE LOTES AGRÍCOLAS CULTIVADOS BAJO SIEMBRA DIRECTA. ORIGEN DE NUEVOS AISLAMIENTOS PGPR. AGARAS, BETINA(1); FERNANDEZ, LETICIA A(2); WALL, LUIS G(1); VALVERDE, CLAUDIO(1) (1) Universidad Nacional de Quilmes, (2) Universidad Nacional del Sur Antecedentes: Con el fin de evaluar los efectos de prácticas agrícolas en siembra directa sobre la biología del suelo y su productividad, se ha constituido el consorcio de investigación público-privado BIOSPAS (Biología del Suelo y Producción Agraria Sustentable). Entre los microorganismos con reconocidas propiedades promotoras del desarrollo vegetal (PGP), se encuentran especies del género Pseudomonas. Comprender los efectos de las prácticas agrícolas, del cultivo, de sitio geográfico y tipo de suelo sobre la diversidad de Pseudomonas, así como su correlación con otras variables físicas, químicas y biológicas, podría contribuir a la identificación de indicadores biológicos de calidad de suelo. Por otra parte, estas muestras constituyen fuentes invaluables de aislamientos adaptados localmente a condiciones de suelo y a la rizosfera de las variedades cultivadas. Objetivos: 1) Analizar la carga y diversidad de Pseudomonas spp. en muestras de suelo y rizosfera; 2) obtener aislamientos del mismo género con potenciales actividades PGP. Material y Métodos: Muestras de suelo (0-10 cm) y de sistemas radiculares de plantas sanas de lotes con historia de siembra directa y diferentes manejos, y de ambientes naturales vecinos, en Córdoba, Entre Ríos y Buenos Aires. Se cuantificó la carga de Pseudomonas totales y fluorescentes por plaqueo en medio selectivo Gould’s S1. La diversidad se analizó mediante PCR-RFLP de marcadores génicos oprF y gacA. Sobre aislamientos en medio S1, se realizaron ensayos de actividad en placa (antagonismo, producción de exoproteasas y HCN, solubilización de Ca3PO 4). Por otra parte,
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diluciones de muestras de suelo se plaquearon en medio NBRIP para cuantificar y aislar microorganismos con capacidad de solubilizar Ca3PO4; aquellas colonias con halo que además crecieron en medio S1, se confirmaron como Pseudomonas spp. mediante PCR-RFLP, y se evaluó su capacidad solubilizadora en medio líquido. Resultados: Se observó una correspondencia absoluta entre el crecimiento en medio S1 y la detección de los marcadores oprF y gacA, lo que permite la comparación directa de recuentos y de diversidad del grupo en las muestras. El análisis conjunto de carga (UFC/g) de Pseudomonas y de diversidad molecular permitieron revelar: a) efectos cuantitativos y cualitativos de enriquecimiento en rizosfera en comparación a suelo entre líneas de siembra; b) efectos de las prácticas agrícolas sobre la diversidad. Se obtuvo un conjunto de aislamientos de Pseudomonas a partir de suelo y rizosfera, con capacidad de inhibir in vitro el desarrollo de fitopatógenos, y de solubilizar Ca 3PO4 en cultivo líquido. El monitoreo de los sitios de muestreo a lo largo de varios ciclos de cultivo mediante estas técnicas microbiológicas y moleculares, permitirá evaluar la influencia de la estacionalidad y del manejo agrícola sobre las poblaciones de Pseudomonas y analizar su correlación con otras variables edáficas y agronómicas dentro del consorcio BIOSPAS. Asimismo, se comenzó a generar una colección de aislamientos de Pseudomonas spp. con potenciales propiedades PGP que deberán ser evaluados in planta.
O27 - 27566 CONSTRUCCIÓN DE UN NUEVO TRANSPOSÓN MINI-Tn5 PORTADOR DE UN ORIGEN DE REPLICACIÓN BACTERIANO PARA SU USO EN ESTUDIOS RIVET EN RIZOBIOS. SALAS, M EUGENIA; LOZANO, MAURICIO; MARTINI, CARLA; SALTO, ILEANA; TORRES TEJERIZO, GONZALO; GIUSTI, ANGELES; DEL PAPA, FLORENCIA; PISTORIO, MARIANO; LAGARES, ANTONIO Instituto de Biotecnología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata Introducción: Los rizobios son bacterias gram-negativas que habitan el suelo y se caracterizan por fijar nitrógeno atmosférico cuando se asocian en simbiosis con plantas leguminosas. Dicha asociación es el resultado de un conjunto de eventos de señalización cuyos genes asociados no han sido aun del todo caracterizados. La técnica RIVET (Recombination based In Vivo Expression Technology) permite identificar genes que, en una condición particular, se expresan de modo diferencial respecto de una condición fisiológica de referencia. En nuestro laboratorio se ha desarrollado una variante de la técnica RIVET que usa un transposón derivado del Tn5 como herramienta para generar fusiones transcripcionales a lo largo del genoma al gen de una resolvasa (tnpR) localizada en un extremo del transposón. La expresión de TnpR en clones específicos resultará en la escisión de un cassette de DNA que cambiará el fenotipo de la bacteria indicando que el gen fusionado a la resolvasa en dicho clon se ha expresado. Objetivos: Construcción de un nuevo mini-Tn5 portador de un origen de replicación (oriV) bacteriano funcional en Escherichia coli que facilite la recuperación de secuencias flanqueantes al transposón en clones que resulten de interés luego de la aplicación de la técnica RIVET. Materiales y Métodos: Medios de cultivo complejos TY, LB. Conjugaciones bacterianas siguiendo protocolos clásicos. Técnicas moleculares según Maniatis et al. (1982). Resultados: Se clonó un origen de replicación funcional en E. coli proveniente del plásmido pSM10 dentro del sitio NotI presente en un transposón mini-Tn5, haciendo uso de oligonucleótidos como adaptadores, dando como resultado el plásmido llamado pRIVET-miniTn5-ori. Teniendo en cuenta que el vector pRIVET-miniTn5 no posee capacidad de replicarse en cepas de E. coli que no poseen la proteína pi, la recuperación de clones que poseen el oriV clonado dentro del sitio NotI del vector se realizó mediante la selección de aquellos clones que poseían la capacidad de crecer en un medio selectivo conteniendo tetraciclina, resistencia codificada por el vector. Los clones obtenidos fueron verificados por su fenotipo, su patrón de restricción y su secuencia. Para la nueva herramienta RIVET analizamos la capacidad de transposición en Sinorhizobium meliloti y la funciona-lidad de la resolvasa codificada por el transposón. Conclusio-
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nes: Hemos construido un nuevo transposón portador de un oriV funcional en E. coli. Hemos verificado que la nueva construcción mantiene la capacidad de transponer en S. meliloti y que, como es esperable, en muchas de sus inserciones da lugar a escisiones del cassette de DNA blanco de TnpR. El sistema presentado es el primero en su tipo, y constituye una herramienta práctica muy eficiente para generar fusiones génicas a tnpR para estudios RIVET evitando la construcción de bibliotecas genómicas de fusión en vectores plasmídicos.
O28 - 27671 ANÁLISIS FENOTÍPICO DE UNA BIBLIOTECA DE TRANSFORMANTES INSERCIONALES POR ADN-T DEL HONGO MICORRÍCICO MODELO Laccaria bicolor. ALVAREZ CRESPO, M CECILIA; KEMPPAINEN, MINNA J; PARDO, ALEJANDRO G Laboratorio de Micología Molecular, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes Laccaria bicolor es el primer hongo micorrícico cuyo genoma ha sido secuenciado completamente. Contando con esta útil información, es posible desarrollar estudios de análisis funcional en este organismo modelo, gracias a la aplicación de metodologías previamente desarrolladas en nuestro laboratorio. En estudios previos realizados sobre la cepa dicariótica S238N, se demostró que L. bicolor es susceptible a la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, obteniéndose un patrón de integración azaroso en copia única en el genoma fúngico. Por otra parte, no se encontró homología o microhomología entre las secuencias de los bordes del ADN-T y los sitios de integración. Si bien, en principio, la integración no parece estar dirigida, se observó que de las secuencias obtenidas 71% correspondían a genes y 29% a regiones intergénicas. Esto podría sugerir un direcciona-miento de integración hacia regiones génicas o ser un reflejo directo de la alta proporción de genes que contiene el genoma de Laccaria. A la luz de estos resultados, surge la posibilidad de utilizar esta metodología para la generación de mutantes por perdida de función en la cepa monocariótica S238N-H82. Esto permitiría analizar los mutantes fenotípicos obtenidos, así como evaluar si el patrón de inserción en el monocarión concuerda o no con el observado en la cepa dicariótica. Para ello, se construyó una biblioteca de 1000 mutantes insercionales independientes de L. bicolor con la finalidad de caracterizar funcionalmente genes de importancia biológica. El rendimiento obtenido durante la transformación fue del 90%. La cepas transgénicas fueron obtenidas por transformación con el vector binario de rescate génico pHg/pBks, lo que permite la posterior recuperación del transgen para analizar el sitio de inserción en el genoma. Las cepas obtenidas fueron evaluadas en medio completo y en medio mínimo para la búsqueda de fenotipos. Aquellas cepas que difirieron en su crecimiento respecto a la cepa silvestre (7% de la biblioteca), fueron cruzadas con la cepa compatible S238N-H107 y la suficiencia del dicarión fue evaluada en medio completo y medio mínimo. La transferencia de ADN-T por medio de A. tumefaciens a mono-cariones de L. bicolor permite la obtención de cepas mutantes fenotípicas.
O29 - 27677 RESPUESTA SISTÉMICA DE Solanum lycopersicum INOCULACIÓN CON Azospirillum brasilense. RIBAUDO, C(2); HUESO, G(1); PONDS, C(1); GRANELL, A(1); CURA, J(2); CANTORE, M(2) (1) Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Valencia, España, (2) Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires La capacidad de las PGPRs para desencadenar procesos benéficos para el desarrollo de las plantas o para el gatillado de mecanismos de resistencia frente a diferentes generadores de estrés, depende de que las bacterias puedan colonizar a la planta. Para que esta relación benéfica planta/bacteria se establezca es necesario que la compleja red de reacciones defensivas de la planta discrimine de alguna forma, no conocida por el momento, a las PGPRs como no patógenos. Con el objetivo de profundizar en la comprensión de los mecanismos moleculares y bioquímicos involucrados en esta interacción se llevó a cabo un análisis global de los transcriptos en la parte aérea de plantas de tomate ino-
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culadas con Azospirillum brasilense a los 7 y 14 días después de la inoculación (DDI). Materiales y Métodos: Se utilizaron semillas de Solanum lycopersicum CvF36 que se cultivaron en frascos de vidrio conteniendo 40 mL de medio Hoagland agarizado al 0,8%. Cada planta se inoculó con 50 µL de la suspensión bacteriana de A. brasilense (2x105 UFC). Las plantas se mantuvieron en cámara de cultivo a 25 °C hasta el momento de la cosecha para la extracción de ARN (7 y 14 DDI). Se asignaron 25 plantas a cada uno de los tratamientos. Para la extracción de ARN, síntesis de ADNc y marcación e hibridación de micromatrices se siguieron protocolos detallados en http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/array/ basicsearch.cgi. Para la amplificación de los genes de interés se utilizaron los pares de cebadores diseñados en base a secuencias depositadas en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1% en buffer TAE. Se utilizaron 8 micromatrices de ADNc Tom 1, Cornell USA. Resultados: Finalizados los procesos de filtrado y normalización quedaron para el análisis 5494 ADNcs. De los genes que fueron estadísticamente expresados en forma diferencial se eligieron algunos que resultaron especialmente interesantes para nuestro estudio y se confirmó su expresión diferencial por RT-PCR. Se identificaron 224 genes que fueron diferencialmente regulados al menos dos veces, en respuesta a la inoculación con A. brasilense. De estos, 33 aparecieron diferencialmente expresados a los 7 DDI y 191 a los 14 DDI. Los genes se clasificaron en 10 categorías funcionales de acuerdo a la similitud de secuencias con genes conocidos: asociados a pared celular, PRs, relacionados con la defensa, con el metabolismo, con la biosíntesis de hormonas, con el transporte, genes de factores de transcripción, genes desconocidos, genes relacionados con la fotosíntesis y con la señalización. En la respuesta de la planta a la inoculación participan varios genes descriptos en interacciones planta/patógeno como Pti 4, pero a diferencia de estas interacciones, se ha visto un apagado en forma secuencial de los genes involucrados en la repuesta HR. El uso de la técnica de micromatrices permitió el análisis simultáneo de los genes cuya expresión cambia en plantas de tomate como resultado de la interacción con A. brasilense. Pese a la respuesta defensiva que la inoculación provocó, tiene lugar una colonización beneficiosa y fructífera por esta bacteria. De alguna forma aún no conocida, la planta puede diferenciar un microorganismo patógeno de otro que no lo es, generando respuestas defensivas más débiles y tardías.
O30 - 27918 INFLUENCIA DE LOS EXUDADOS DE SEMILLAS DE ALFALFA SOBRE LOS LPS, PROTEÍNAS EXTRACELULARES Y MOLÉCULAS SEÑALES DE DOS CEPAS DEL GÉNERO Pseudomonas. GUIÑAZU, LORENA BELEN(1); ROVERA, MARISA(1); ROSAS, SUSANA(1); ESPINAR MARCHENA, FRANCISCO(2); BELLOGIN IZQUIERDO, RAMON(2); ESPUNY GOMEZ, MARIA DEL ROSARIO(2) (1) Universidad Nacional de Rio Cuarto, Córdoba, (2) Universidad de Sevilla, España Numerosas investigaciones reportan un efecto positivo en el crecimiento de las leguminosas por la inoculación con bacterias de vida libre del género Pseudomonas. Las cepas P. aurantiaca SR1, P. putida SP22 fueron aisladas de la rizosfera de soja (Glycine max L.) y son capaces de solubilizar compuestos insolubles de fósforo, movilizar hierro a través de la producción de sideróforos e inhibir el crecimiento de diferentes especies fúngicas. El objetivo de nuestro trabajo fue ampliar el estudio de estas cepas en características claves en el establecimiento de la relación planta-bacteria y estudiar la influencia de los exudados de semillas de alfalfa (Medicago sativa L.) sobre estas características. Para ello se realizó el análisis electroforético de lipopolisacáridos (LPS) de la pared mediante la extracción y análisis de los mismos en medio TY y en medio TY suplementado con exudados de semillas de alfalfa y con el flavonoides luteolina (característico de los exudados de alfalfa). El perfil electroforético de proteínas extracelulares se obtuvo a partir del cultivo de las bacterias en presencia y ausencia de exudados axénicos de semillas de alfalfa o de luteolina y se determinó la existencia del sistema de se-
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creción Tipo III en ambas cepas por hibridación en heterología con una sonda de genes conservados. En los ensayos de percepción de quórum se empleó como biosensor Agrobacterium tumefaciens NT1 pZLR4 y los sobrenadantes de bacterias de 1, 2 y 3 días de crecimiento en TY (adicionado con flavonoides o exudados de semillas). Se observó un perfil de LPS en escalera, distinto entre P. aurantiaca y P. putida, pero similar al que presentan las especies de Salmonella. No se observaron cambios significativos en este modelo de perfil por la adición de exudado o de luteolina. No se detectó ninguna alteración significativa en el perfil de proteínas extracelulares de P. putida SP22 cuando fue cultivada en presencia de exudados de semillas de alfalfa o de luteolina, pero sí en el caso de P. aurantiaca SR1, donde apareció una nueva banda y se intensificaron otras dos. La secreción de estas proteínas no se realizaría a través del sistema de secreción de Tipo III, dado que ninguna de las cepas presentó señal tras la hibridación con una sonda de genes conservados de este aparato de secreción. Las cepas fueron productoras de señales tipo Acil Homoserino Lactonas (AHL’s), destacándose P. aurantiaca SR1. Cuando se emplearon flavonoides o exudados, no se observaron cambios destacables. La cepa P. aurantiaca SR1 presentó cambios en los perfiles de secreción de proteínas cuando fue cultivada en presencia de exudados de semillas de alfalfa. Futuros estudios nos permitirán determinar si estos han sido propiciados por la planta hospedadora o sus derivados.
MARTES 19/10/2009 ALIMENTOS, MEDICAMENTOS Y COSMÉTICOS O31 - 27224 DETERMINACION DE LA CAPACIDAD SECUESTRANTE DE AFLATOXINA B1 POR MICROORGANISMOS AISLADOS DE KEFIR. LEON, A(1); GAMBA, R(1); SERNA, C(2); QUINTERO, E(2); CARASI, P(1); SEDAN, D(1); ANDRINOLO, D(1); SERRADELL, M(1); GARROTE, G(1); GIANNUZZI, L(1); DE ANTONI, G(1) (1) Universidad Nacional de La Plata, (2) UDEA Las Aflatoxinas (AFs) son metabolitos secundarios de hongos filamentosos Aspergillus flavus, A.parasiticus y A.nomius que contaminan los alimentos, siendo la aflatoxina AFB1 (AFB1) el mutágeno y carcinógeno natural mas potente conocido. Se ha demostrado que las bacterias ácido lácticas (BAL) capturan AFs de forma cepa dependiente y que esto ocurre en la superficie celular, donde participan componentes celulares como peptidoglicano, polisacáridos y proteínas. El kefir es una leche fermentada proveniente del Cáucaso euroasiático y se ha demostrado la capacidad de sus sobrenadantes y de sus microorganismos de prolongar la fase de adaptación (Lag) de A.flavus a pH entre 3.5 y 3.3 y de inhibir su crecimiento a pH 3.0. El objetivo del presente trabajo fue Investigar la capacidad de captura de AFB1 por bacterias ácido lácticas y levaduras aisladas de gránulos de kefir y determinar si la misma varía al cultivar los microorganismos en dos medios diferentes: caldo MRS® y permeado de suero comercial (Ilolay®) al 5%(PS). Los microorganismos cultivados en MRS o en PS, por 18 h a 30 °C, se lavaron con PBS y agua bidestilada y se resuspendieron en PBS. Una mezcla 2.5ml:2.5ml de suspensión de microorganismos y AFB1 se incubó durante 4 h agitando a 30°C. La mezcla se centrifugó a 2500 g, 10 min y se determinó la concentración AFB1 en el sobrenadante en un equipo HPLC Shimadzu LC-20 ATcon detector UV de arreglo de diodos, columna de reparto C18 HYPERSIL flujo:1.2 ml/min de acetonitrilo 30%,metanol 10% y agua 60 %. El % de captura se calculó con la fórmula: 100%×(1–área del pico del sobrenadante AFB1/área del pico de AFB1 control). Se evaluaron cepas de Lactobacillus kefir; L.plantarum; Saccharomyces cerevisiae; Kluyveromyces marxianus; S. boularddii(comercial) y K. lactis. Resultados: L. kefir CIDCA 83111,83113 y 8321 capturaron entre 10 y 20% de AFB1; L. kefir CIDCA 8348, 83115,8325 y L. kefirJCM 5818 capturaron entre 30 y 40%. S.cerevisiae CIDCA 8112 y K. lactis cultivadas en MRS capturaron entre 40 y 50%; S.cerevisiae CIDCA 81103 y 8116 capturaron entre 20 y 30%;K .marxianus CIDCA 8154 entre
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10 y 20%, mientras que no se observó captura por S.boularddii.El cultivo en PS indujo un cambio en el % de captura, la cual aumentó para S.cerevisiae 81103, 8116 y K.marxianus 8154 (entre 50 y 60%),disminuyó alrededor del 20% para K.lactis y no presentó variación significativa para S.cerevisiae 8112 (p 0,9999, KruskalWallis). 2- Los 3 aislamientos fueron productores de biofilm (p > 0,9999, Kruskal-Wallis). 3- Desecación: se partió de un inóculo promedio = 2,4 x 1010 UFC/ml. A las 24 h la genoespecie [C] no resistió el proceso (0 UFC/ml), mientras que las genoespecies [A] y [B] dejaron de ser viables a las 48 h (p= 0,8693, Kruskal-Wallis). Sin embargo, la bactericidia se logró recién a los 12 días. 4 y 5-
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Supervivencia en agua post-ósmosis (AP) y en baño de diálisis (BD) (conteo de colonias en UFC/ml): genoespecie [A] tiempo 0= 3,85 x 108. A los 21 días en el AP= 4,2 x 108 y en el BD= 1,3 x 107. Genoespecie [B] tiempo 0= 4,3 x 107. A los 21 días en el AP= 8,5 x 107 y en el BD= 1,8 x 10 6. Genoespecie [C] tiempo 0= 3,7 x 108. A los 21 días en AP= 1,2 x 10 9 y en BD= 5 x 10 8. Se observaron diferencias muy significativas en la supervivencia tanto en el BD (p< 0,0007) como en el AP (p 5 leucocitos/campo 40X). En primera instancia, los cultivos en los medios de CLDE y CPS resultaron negativos. La coloración de Gram en los 3 casos mostró la presencia de BGP (> 5/cpo 1000x). Las muestras fueron sembradas en agar sangre y agar chocolate con atmósfera de 5% de CO2 y en agar sangre en atmósfera anaerobia. Al 5° día desarrollaron en aerobiosis colonias puntiformes mientras que en anaerobiosis, las mismas presentaban mayor tamaño. Los microorganismos fueron identificados fenotípica y genotípicamente como Bifidobacterium/Alloscardovia en 2 de los casos y Actinobaculum schaalii en el otro. Sendos aislamientos fueron sensibles a penicilina. El tratamiento con amoxicilina fue favorable en los tres pacientes y los urocultivos de control resultaron negativos. Se destaca la necesidad de realizar la coloración de Gram sin excepción en orinas con sedimento patológico y cultivo negativo y la siembra en medios y atmósferas especiales con incubación prolongada para detectar la presencia de patógenos urinarios emergentes. Dado el lento desarrollo y las características fenotípicas similares a las de los géneros Lactobacillus/Gardnerella/ Actinomyces es común que estos agente se interpreten como microbiota genital habitual sin atribuirle su verdadero significado clínico.
MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y AMBIENTAL O55 - 27383 UTILIZACIÓN DE HONGOS PARA LA BIODEGRADACIÓN DE HAPs Y FRACCIONES PESADAS REMANENTES EN SUELOS DESPUÉS DE LA BIORREMEDIACIÓN. MEDAURA, MARIA CECILIA(1); GUIVERNAU, MIRIAM(2); PRENAFETA BOLDU, FRANCESC (2); MORENO VENTAS, XABIER(3); ERCOLI, EDUARDO(1); VIÑAS CANALS, MARC(2) (1) Universidad Nacional de Cuyo, Mendoza (2) GIRO, (3) Universidad de Cantabria, España La presencia de compuestos de estructura compleja y concentraciones extremas, así como la diversidad en las condiciones climáticas y heterogeneidad de características texturales en suelos contaminados con petróleo, hace que muchos de los procesos de biorremediación actuales se vean limitados en su aplica-
ción. Compuestos recalcitrantes como hidrocarburos aromáticos policíclicos de alto peso molecular (HAPs con más de tres anillos bencénicos), alcanos pesados (fracción alifática saturada, rango C30-C40) y fracción saturada no resuelta, suelen permanecer después de la biorremediación en concentraciones superiores a los valores límites exigidos por diferentes regulaciones. La utilización de hongos productores de enzimas ligninolíticos constituye una alternativa complementaria para la biorremediación de suelos con este tipo de contaminantes. En este estudio se presentan resultados de ensayos de bioestimulación y bioaumentación fúngica para evaluar el potencial de la degradación por hongos sobre un suelo contaminado con una matriz compleja de hidrocarburos del petróleo, rica en fracciones saturadas pesadas y HMW-PAHs, previamente biorremediado. Se aislaron e identificaron 19 cepas fúngicas, la mayoría de ellas pertenecientes a la división Ascomycota, que se emplearon como inóculo fúngico para bioaumentación. Cepas de Fusarium oxysporium y Alternaria alternata presentaron actividad polifenoloxidasa (lacasa), capaz de oxidar compuestos aromáticos sin necesidad de cofactores. Se realizó una caracterización química (GC-MS y GC-FID), microbiológica (perfilado de genes ribosomales mediante DGGE) y ecotoxicológica (Microtox) en diversos ensayos de biorremediación. Usando bioaumentación fúngica se logró una degradación de hidrocarburos totales del petróleo del 39,90% y de HAPs 86,03% a 28,27% en los compuestos de 3 a 6 anillos respectivamente, causando una disminución de la toxicidad de los lixiviados del suelo (Microtox) y un cambio en las poblaciones eubacteriana y fúngica, determinada por DGGE. Las diferencias con respecto a los ensayos de bioestimulación demuestran las potenciales ventajas que ofrece la utilización de hongos para la biorremediación de suelos con HMW-HAPs.
O56 - 27392 MICROBIODETERIORO DEL PATRIMONIO DOCUMENTAL DE ARCHIVOS DE ARGENTINA Y CUBA. GUIAMET, PATRICIA(1, 2, 6); LAVIN, PAOLA(1, 3, 6); BORREGO, SOFIA(4); PERDOMO, IVET(4); GOMEZ DE SARAVIA, SANDRA(1, 5, 6) (1) INIFTA, Dto. de Química, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, CCT La Plata-CONICET, (2) Facultad de Ciencias Veterinarias, CONICET, (3) Facultad de Ciencias Exactas, CONICET (4) Laboratorio de Conservación Preventiva, Archivo Nacional de la República de Cuba, (5) Facultad de Ciencias Naturales y Museo, CICBA, (6) Universidad Nacional de La Plata Introducción: El patrimonio documental está expuesto a factores extrínsecos e intrínsecos, los que pueden causar alteraciones físicas, químicas y/o biológicas, las cuales inciden en su estado de conservación. Entre los daños de carácter biológico, el microbiodeterioro puede definirse como cambios indeseables en las características de un material, provocados por la actividad de microorganismos (bacterias y hongos), los cuales son capaces de adherir a diferentes sustratos formando biofilms. Estos afectan al acervo documental, constituido por materiales higroscópicos, como el caso del papel. En condiciones ambientales óptimas, la microbiota del aire puede coexistir con las colecciones de valor histórico y artístico sin causar grandes daños. Sin embargo, a medida que se producen cambios en las condiciones ambientales, los microorganismos pueden ejercer efectos negativos, tanto desde el punto de vista del microbiodeterioro como de la patogenicidad. Objetivo: El objetivo de este trabajo fue evaluar el microbiodeterioro del material documental y la calidad del aire en cuatro archivos: i) Archivo Histórico del Museo de La Plata, ii) Archivo del Colegio de Escribanos de la Provincia de Buenos Aires, iii) Archivo de Geodesia, Ministerio de Obras Públicas, ubicados en La Plata, Argentina y iv) Archivo Nacional de la República de Cuba (ARNAC), ubicado en La Habana, Cuba. Metodología: Las muestras del aire fueron obtenidas por la técnica de sedimentación en agar y mediante hisopado en los documentos. Los recuentos microbianos, los aislamientos de los microorganismos y su posterior tipificación se realizaron sembrando en medios de cultivo apropiados. La formación de biofilms fue ensayada sobre el sustrato (papel) inoculándolo con Bacillus sp., Scopulariopsis sp., entre otros, a diferentes tiempos de contacto. Las muestras se analizaron mediante MET (microscopía electrónica de transmisión)
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y MEB (microscopía electrónica de barrido). Resultados: En los archivos i) ii) y iii), los géneros más comúnmente aislados fueron Aspergillus y Penicillium. En el ARNAC estos géneros predominaron en los meses secos y Cladosporium prevaleció en los meses más lluviosos. Sobre los documentos el género predominante fue Bacillus sp. Staphylococcus sp. fue detectado en dos de los cuatro archivos investigados. Ensayos de laboratorio permitieron comprobar a través de MEB y MET la formación de biofilms y los daños estructurales producidos sobre el papel por los microorganismos aislados de los archivos. Algunos de los géneros fúngicos aislados, Aspergillus, Alternaria, Fusarium y Penicillium pueden actuar como alergenos que afectan la salud de las personas que trabajan en archivos.
O57 - 27420 DESARROLLO DE CULTIVOS HETEROTRÓFICOS DE MICROALGAS EN ALTA DENSIDAD PARA LA PRODUCCIÓN DE ACEITE UNICELULAR. SUEN, ELISA(1); MARQUEZ, VANINA(1); SELUY, EDUARDO(2); BECCARIA, ALEJANDRO(1) (1) Laboratorio de Fermentaciones, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, UNL, Santa Fe, Argentina, (2) LESSEL SH, Gálvez, Santa Fe, Argentina Introducción: El ácido docosahexaenoico (DHA) es un ácido graso poliinsaturado (PUFA) omega-3, que posee reconocidos efectos benéficos para la salud humana. Crypthecodinium cohnii, microalga marina heterotrófica capaz de acumular aceites con alto contenido de DHA y bajo contenido de otros PUFAs, es un microorganismo adecuado para su obtención, destinada a la industria alimenticia, farmacéutica y nutracéutica. Objetivos: Optimizar la composición de un medio de cultivo para la obtención de altas densidades celulares y la acumulación de aceite unicelular. Implementar el medio optimizado en el desarrollo de cultivos en biorreactor. Materiales y métodos: Se realizaron cultivos de C. cohnii ATCC 30772 en placas policubetas. Se tomaron muestras a diferentes tiempos para la determinación de biomasa -mediante densidad óptica (DO) a 492 nm- y lípidos totales (LT) intracelulares -por espectroscopia de fluorescencia-. Se aplicaron diseños factoriales completos para la evaluación del efecto y selección de los siguientes factores: sales de mar, hidrolizado de caseína, extracto de levadura y fuentes de carbono (glucosa, glicerol, acetato de sodio y etanol). Para la optimización de la composición del medio se empleó un diseño central compuesto. Además, se realizaron cultivos en un biorreactor tanque agitado (1 L), operado en modo batch, empleando un medio descripto en la bibliografía (control) y el medio optimizado. Resultados: Para los rangos de concentraciones estudiados, la glucosa (G) fue la fuente de carbono que permitió alcanzar mayores DO respecto a las otras fuentes ensayadas. Este nutriente y el extracto de levadura (YE) fueron los factores que presentaron efectos significativos (p
