Revista-Microbiologia-2016

ISSN 2415-251X

Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

Revista de microbiologia Volumen No. 1 Enero - Marzo 2016

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

ISSN 2415-251X

Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

Revista de microbiologia Volumen No. 1 Enero - Marzo 2016

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

EDITOR DE LA REVISTA Licda Maria Remey Gordillo Coordinadora General Area de Microbiologia y Hospital Roosevelt Dr. Carlos Mejía Villatoro Jefe de la Clínica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

CONTRIBUCIONES Autores: Licda Maria Remey Gordillo Licda. Julia Mirelia Cali Arriaga Licda. Jackelyn Paola Tol Urizar Licda. Alejandra Castillo Licda. Veronica Itzep Licda. Rosa Alvarez Licda. Diana Baldizòn Licda. Margarita Boloix Sr. Héctor Catú Licda. Lis Jerez Licda. Ana Lucía Lemus

DIAGRAMACIÓN Y DISEÑO Mellross Elswith Salazar Alvarez

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Editorial La Microbiología Clínica tiene como objetivo principal establecer el agente causal de las infecciones que afectan al hombre. El Diagnóstico debe ser certero y oportuno, capaz de dirigir un tratamiento adecuado que conlleve a la recuperación del paciente. El logro del diagnóstico se basa en la estandarización adecuada de los procedimientos y el conocimiento y uso adecuado de diferentes tecnologías dirigidas al tipo de microorganismo sospechoso. En respuesta a las diversas necesidades se tomó la iniciativa de actualizar a los profesionales de diversas áreas de la salud, mediante la información de temas básicos a través de un Diplomado de Microbiología Clínica en el cual se incluyeron temas de resistencia antimicrobiana, biología molecular, diagnóstico y tratamiento de hongos sistémicos y tuberculosis con la participación de conferencistas expertos en los temas. Entre las actividades que se realizaron en el Diplomado se tuvieron: 1. Conferencias teóricas donde se presentaron y discutieron temas en aspectos generales y específicos sobre diagnóstico, procedimientos estándar, tratamiento de infecciones causadas por microorganismos bacterianos. 2. Investigación sobre un tema específico sobre resistencia antimicrobiana. 3. Elaboración y presentación de un manual de procedimientos estándar acorde a las necesidades, capacidades y disponibilidad de recursos para el diagnóstico bacteriano microbiológico. El Diplomado se desarrolló en el Hospital Roosevelt con el apoyo del Programa de Postgrado y Maestría de la Unidad de Enfermedades Infecciosas que funciona en Hospital Roosevelt desde el año 2004 y que es avalado por las autoridades docentes y administrativas del hospital Roosevelt y de la Facultad de Medicina de la Universidad Francisco Marroquín. Tuvo una duración de 6 meses. Los principales objetivos específicos que se deseaba alcanzar fueron: 1. Asistir y fortalecer los conocimientos de los laboratoristas y médicos de instituciones clínicas públicas y privadas sobre los principios y la práctica del diagnóstico de microorganismos bacterianos, pruebas y tratamiento antimicrobiano. 2. Conocer y aplicar los reportes de susceptibilidad correctos para guiar el tratamiento del paciente, logrando que los laboratorios radicados en distintos hospitales y a nivel comunitario sigan con exactitud los mismos procedimientos de pruebas y de control de calidad. 3. Conocer y aplicar el manejo de bases de datos que permitan tener información que pueda ser utilizada por especialistas en enfermedades infecciosas, epidemiólogos y otros funcionarios responsables de la salud para establecer patrones de resistencia a agentes antimicrobianos, promoviendo el tratamiento óptimo e implementando medidas para limitar la difusión de organismos resistentes en los hospitales y la comunidad. Al Diplomado se inscribieron un total de 67 personas, 42 profesionales, de los cuales 4 eran Médicos y 38 Químicos Biólogos, 20 eran estudiantes con pensum cerrado de la carrera de Química Biológica y 4 técnicos de laboratorio clínico. Se retiraron 9 personas, quedando 58. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Dentro de la población de profesionales Químicos Biólogos se tuvo la participación de profesionales que provenían de Quetzaltenango, Sololá, Chimaltenango, Antigua Guatemala, Amatitlán, Mazatenango. El 21% de toda la población estaba trabajando en hospitales en la iniciativa privada. De los 67 inscritos, completaron el diplomado 58 personas, 52 aprobaron el diplomado lo que representó un 90% del total de asistentes, 6 no aprobaron, 10.3% y 9 se retiraron. El puntaje más alto fue de 89 puntos y el más bajo de 61 puntos, con una media de 76 puntos. Únicamente 7 profesionales obtuvieron puntajes por encima de los 80 puntos. El porcentaje de asistencia fue del 86% en los 10 módulos. El porcentaje de puntualidad fue del 48%. El módulo que presentó mayor dificultad fue el de Resistencia Antimicrobiana, lo que se reflejó en los puntajes obtenidos durante el segundo examen parcial que evaluó este módulo, únicamente el 50% de la población aprobó. Debido a la dificultad se tomó la decisión para el II Diplomado ampliar el módulo y reforzar los temas sobre resistencia. En general se puede concluir con los resultados obtenidos que los temas tratados fueron correctamente orientados y asimilados por los participantes. Y la elaboración de manuales contribuyó a una mejor estandarización microbiológica en los lugares de trabajo de donde provenían los profesionales que elaboraron los trabajos. Los profesionales participantes completaron la asistencia a X módulos con diferentes temas microbiológicos y desarrollaron trabajos de investigación. La siguiente edición presenta los trabajos más importantes referentes a la información que proveen. Son el reflejo del esfuerzo de sus realizadores para proporcionar información estandarizada de procedimientos diarios que son básicos en el trabajo diario en Microbiología. Representan un importante aporte en los temas desarrollados y son herramientas fundamentales para los laboratorios que trabajan Microbiología. Licda. Maria Remei Gordillo Dr. Carlos Mejia Villatoro

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Manual de tinciones en Microbiologia Clinica

-1-1-1-1-1-1-

Normas de seguridad en el laboratorio Preparación, fijación y coloración de frotes

-1-1-

Introducción Generalidades

-2-2-3-3-3-3-4-4-4-4-4-4-4-4-5-5-

Tinciones en Microbiología Clínica Tinciones simples Tinción de Azul de Metileno de Loeffler Tinción de Azul de Lactofenol Tinción Naranja de Acridina Tinción de Negro de Clorazol KOH con Tinta Azul Parker Tinciones diferenciales Tinción de Gram Tinción de Wright Tinción de Giemsa Tinción de Ziehl-Neelsen Tinción de Kinyoun Tinción de Ziehl-Neelsen Modificado Tinción selectiva de esporas Wirtz-Conklin Tinción de Ácido Peryódico de Schiff (PAS) Tinciones especiales Tinta China Tinción de Auramina-Rodamina Tinción Blanco de Calcofluor Tinción de Gomori-Grocott

-6-6-6-6-7-7-8-8-8-8-10-10-11-11-11-11-12-12-

Referencias

-16-16-

Manual de Microbiologia Introducción Generalidades Normas Mínimas de Seguridad en el Laboratorio de Microbiología Organización de Área de Trabajo Generalidades de la Estructura Bacteriana Bacterias Gram positivo Bacterias Gram negativo

-13-13-13-13-13-13-14-14-14-14-

-16-16-17-17-17-17-16-16-16-17-18-18-18-18-19-19-

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Tinciones Básicas Tinción de Gram Principio Procedimiento de la Tinción de Gram Tinción Ziehl Neelsen Principio Procedimiento de Tinción de Ziehl Neelsen Tinción de Kinyoun Principio Procedimiento de Tinción Kinyoun Tinción Kinyoun Modificado Principio Procedimiento de Tinción Kinyoun Modificado Observación en Fresco Principio Procedimiento de Observación en Fresco Toma de Muestra y Procedimientos Orocultivo Propósito e importancia Recolección de la muestra y transporte Procedimiento Aislamiento Primario Identificación Streptococcus pyogenes Procedimiento Cultivo de Garganta Especial Propósito Recolección de Muestra y Transporte Toma de muestra para Corynebacterium diphteriae Toma de Muestra para Neisseria meningitidis y Bordetella pertussis Aislamiento primario Corynebacterium diphteriae Neisseria meningitidis Bordetella pertussis Identificación de principales Microorganismos Corynebacterium diphtheriae Neisseria Meningitidis Bordetella pertussis Hemocultivo y Mielocultivo Propósito Recolección de la muestra y transporte Toma de muestra

-19-19-19-19-19-19-19-19-19-19-19-19-20-20-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-22-22-22-22-22-22-22-22-22-22-23-23-23-23-23-24-24-24-24-24-24-24-24-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-27-27-27-27-27-27-27-27-

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Aislamiento primario Procedimiento de incubación Identificación de principales microorganismos Líquido cefalorraquídeo y otros líquidos estériles Propósito Recolección de Muestra y Transporte Aislamiento Primario del Líquido Cefalorraquídeo u otros Líquidos Estériles Identificación de principales microorganismos Coprocultivo Propósito e Importancia Salmonella sp Shigella Vibrio Cholerae Recolección de Muestra y Transporte Aislamiento Primario Procedimiento para aislar Salmonella sp, Shigella sp Procedimiento para aislamiento de Vibrio cholerae Identificación de principales Microorganismo Pruebas Bioquímicas Identificación de Salmonella sp Identificación de Shigella sp Identificación de Vibrio cholerae Urocultivo Propósito e importancia Recolección de la Muestra y Transporte Asilamiento primario Identificación de principales microorganismo Escherichia coli Klebsiela pneumoniae Klebsiella oxytoca Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Secreciones Varias Secreciones de heridas y abscesos Propósito e importancia Recolección de la muestra y transporte Toma de muestra de Herida Toma de muestra de Absceso Toma de muestra en quemaduras Toma de muestra de ojo Toma de muestra de Oído Aislamiento primario

-27-27-27-28-28-29-29-30-30-31-30-31-31-a la-33-33-3333-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-35-35-36-35-36-37-37-37-38-38-39-39-40-40-41-41-41-41-41-41-42-41-41-42-42-42-43-43-43-44-44-44-44-44-44-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-46-46-

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Identificación de principales microorganismos Esquema de identificación de Cocos Gram positivo Identificación de Gram negativo Fermentadores Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae Identificación de Gram Negativo no Fermentador Pseudomonas aeroginosa Secreción Vaginal Propósito Recolección de la muestra y transporte Aislamiento Primario Identificación de principales microorganismo Identificación presuntiva de N. gonorrhoeae Identificación de Gardnerella vaginalis Identificación de Streptococcus agalactiae Identificación de Candida albicans Esputo de cultivo bacteriano Propósito Recolección de la muestra y transporte Aislamiento primario Realización del frote del Esputo Criterio de Murria Identificación de Principales Microorganismo Identificación de Streptococcus pneumoniae Identificación de Haemophilus influenzae Anexos Prueba de Catalasa Prueba de Coagulasa Prueba de Manitol Sal Prueba de DNasa Prueba de Novobiocina Prueba de Bacitracina A Prueba de PRY (pirrolidonilarilamidasa) Prueba de CAMP Prueba de Hidrólisis de Hipurato Bilis Esculina Crecimiento de NaCl 6.5% Prueba de Sensibilidad a Optoquina Solubilidad en Bilis Prueba de Satelitismo Factor de Crecimiento XV Bibliografía

-46-46-46-47-47-47-47-47-47-47-47-47-47-47-48-48-48-48-48-48-48-48-49-49-49-49-49-49-49-49-50-50-50-50-50-50-50-50-50-50-51-51-51-51-51-51-51-51-52-52-53-53-53-53-53-53-53-53-54-54-54-54-54-54-54-54-55-55-55-55-56-56-56-56-56-56-56-56-56-56-57-a la -59

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Manual de Procedimientos Tamizaje, Aislamiento, Identificacion y Sensibilidad de Micobacterias

Introducción Generalidades Propósito e importancia Tuberculosis pulmonar y tuberculosis extrapulmonar Niveles de laboratorio Nivel i Nivel ii Nivel iii Toma de muestra y procedimientos por tipo de muestra Muestras de orina Propósito e importancia Toma de muestra Chorro medio u orina al vuelo Sondas permanentes Punción o aspirado suprapúbico Catéter Procesamiento de la muestra Requerimientos e instrucciones especiales de muestra de orina Preparación de la muestra previo a la elaboración de frotes Muestras de sangre y médula ósea Medio de cultivo para aislamiento de micobacterias de muestras de sangre y médula ósea Toma de muestra de sangre y médula ósea Precauciones para el uso de los frascos Tratamiento de la muestra en el laboratorio Preparación de la muestra previo a la elaboración de frotes Muestras de líquido cefalorraquídeo, lavados y otros líquidos corporales Propósito e importancia Toma de muestra para líquido cefalorraquídeo Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra Preparación de la muestra para la elaboración de frotes Muestras de heces Propósito e importancia Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la Muestra de heces Preparación de la muestra de heces para la elaboración de frotes Muestras de biopsias y secreciones varias Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra Preparación de la muestra para la elaboración de frotes muestras de esputo toma de muestra.

-60-60-60-60-61-61-61-61-61-62-62-62-62-62-62-62-62-62-63-63-63-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-65-65-65-66-66-66-67-67-67-67-67-67-67-68-68-68-68-68-68-68-68-68-68-69-68-69-69-69-69-69-70-70-70-70-70-70-70-71-71-71-

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Procedimiento para obtención de la muestra. Procesamiento de la muestra de esputo Preparación y observación directa de una muestra Preparación de un extendido Procedimientos de tinción alcohol-ácido resistencia Coloración de ziehl-neelsen: Coloración de kinyoun: Interpretación e informe de baciloscopías Pruebas de tamizaje Prueba de lam Genexpert Cultivo de micobacterias en lowenstein jensen Muestras Métodos para decontaminación de muestras. Método de n-acetil-l-cisteína-hidróxido de sodio (nalc-naoh) Método del hidróxido de sodio Método del ácido oxálico Método mycoprep bbl (método comercial) Inoculación de tubo bactec mgit 960 (indicador de crecimiento de micobacterias). Métodos de identificación Test de ácido nicotínico para tb bbl taxo (niacina) Tiras bbl taxo para prueba de nitritos Detección de antígeno mpt64 Identificación de especies comunes de micobacterias (genotype mycobacterium cm) Identificación de especies adicionales (genotype mycobacterium as) Identificación del complejo mycobacterium tuberculosis (genotype mtbc) Sensibilidad antibiótica Introducción Métodos de determinación de sensibilidad antifímica Método de las proporciones de canetii Método de pcr: identificación del complejo mycobacterium tuberculosis (genotype® mtbdrplus) Método de sensibilidad antifímica por bactec mgit 960 sire kit Bibliografia

Normas de Publicación

-71-71-71-72-73-73-73-73-73-74-74-74-75-75-75-75-75-75-76-76-76-77-77-79-80-80-81-82-83-83-83- 84-85-85-86-86-86- 87-89-89-89-92-92-92-92-93-94-107-108-113-114-118-118-118-118-118-119-119-119-125-125-131-131-133-134-134-135-139-

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

MANUAL DE TINCIONES EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Julia Mirelia Cali Arriaga Jackelyn Paola Tol Urizar I. INTRODUCCIÓN El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de Microbiología, con el fin de conocer todas las técnicas de tinciones que sirven de base en las identificaciones bacterianas, a la vez se hace mención de las normas de bioseguridad útiles para mantener la seguridad dentro del laboratorio y de quienes laboran en el, así como también el procedimiento de elaboración de frotes y fijación de los mismos. Además está elaborado de tal manera que sea aplicable al funcionamiento actual de los diferentes procedimientos del Laboratorio en Microbiología II. GENERALIDADES A. Normas mínimas de seguridad en el laboratorio de microbiología 1. Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin. 2. Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer completamente cerrada. 3. Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar el trabajo. 4. Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes. 5. Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las áreas de laboratorio. 6. Evitar llevar al laboratorio, accesorios que podrían ser fuente de contaminación (por ejemplo joyas). 7. Recoger el cabello largo. Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo indispensable. 8. No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse cosméticos ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningún área del laboratorio. .

9. Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades o hacer uso de ellos. Si usted tiene alguna duda, diríjase al supervisor o encargado del área. 10. Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales, exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo. 11. Tener cuidado cuando manipule el mechero. Nunca debe dejar éste desatendido. 12. Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte cualquier daño de los mismos al supervisor. 13. Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin. 14. No usar ningún reactivo que no esté debidamente identificado, verificar las etiquetas de los mismos y estar seguro de cómo emplearlo. 15. No devolver sustancias a sus envases originales. 16. Emplear pipeteador o bomba de vacio al medir líquidos. Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. 17. Realizar solamente aquellas actividades programadas y asignadas, no llevar a cabo experimentos actividades no autorizadas. 18. Reportar inmediatamente cualquier accidente al supervisor o encargado del área (derrame de material contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 1

19. Reducir al mínimo la formación de aerosoles durante la realización de cualquier trabajo. 20. Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculación accidental y la generación de aerosoles durante su manipulación y desecho. 21. Emplear técnicas asépticas para el manejo de cultivos de microorganismos (OMS, 2005) . B. Preparación, fijación y coloración de frotes Debido al pequeño tamaño de la mayoría de microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo oscuro para hacer la descripción morfológica de éstos. El microscopio de uso más común es del de campo claro, en el que la observación de células cicas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz (Aquiahuatl, Pérez, 2004). La observación de frotes teñidos es más recomendable. El frote se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y tiñen los microorganismos. De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son: simples, diferenciales y especiales (Aquiahuatl, Pérez, 2004). Los frotes de cultivos líquidos se deberían fijar con alcohol para evitar residuos del medio, que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmente con calor. Después de la fijación, los frote son teñidos con diferentes colorantes sintéticos derivados de anilina en su mayoría (Aquiahuatl, Pérez, 2004). Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromóforos. Por ejemplo:

Si el cromóforo es un ión positivo el colorante es de tipo básico, pero si la carga es negativa será de tipo ácido. La mayoría de las bacterias son teñidas por colorantes básicos, que permeas la pared celular y se adhieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas negativas de la célula bacteriana. La tinción de las bacterias con azul de metileno, es un ejemplo de tinción simple que facilita la observación de forma, tamaño y arreglo de las células (Aquiahuatl, Pérez, 2004). 1. Preparación de frote: a. Muestras sólidas Tomar la muestra con un hisopo, de preferencia que el material no sea algodón, puede ser dacrón o alginato de calcio. Rodar el hisopo con la muestra sobre una lámina portaobjetos limpia de manera que se obtenga una preparación homogénea (mismo grueso aproximado en toda la lámina) de ésta forma los colorantes penetran de manera adecuada en las estructuras presentes en la muestra. Dejar secar al aire o secar aplicando calor suave debajo de la lámina portaobjetos sin quemar la muestra (Gordillo, 2005). b. Muestras líquidas Tomar una pequeña porción del líquido ya sea con pipeta pasteur estéril, asa en argolla flameada, asa estéril descartable. Colocar en la lámina, NO restregar la muestra. Dejar secar al aire o secar aplicando calor suave debajo de la lámina portaobjetos sin quemar la muestra (Gordillo, 2005). 1) Fijación del frote Fijar los frotes de cultivos líquidos con dos gotas de metanos o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas del mechero).

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 2

Los frotes de cultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto se debe pasar la lámina rápidamente 2 – 3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero, evitando el sobrecalentamiento. Dejar enfriar a hasta alcanzar temperatura ambiente (Aquiahuatl, Pérez, 2004).

Figura 1. Preparación y fijación de frotes bacterianos a partir de cultivos sólidos y líquidos.

III. TINCIONES EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

Este es un colorante catiónico y se combina fuertemente con los componentes celulares cargados negativamente, con los ácidos nucléicos y los polisacáridos ácidos (Koneman, Allen, Janda, Procop, Schreckenberger, Woods, 2008). b. Materiales y Reactivos • Azul de metileno • Alcohol etílico 95% • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Pinzas • Portaobjetos • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biológica • Microscopio • Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro c. Procedimiento • Extender la muestra en un portaobjetos limpio y fijar la muestra. • Cubrir la extensión con azul de metileno de Loeffler durante 1-2 minutos • Retirar exceso de colorante y lavar con abundante agua desmineralizada. • Dejar secar a temperatura ambiente. d. Resultados

A. Tinciones simples Son aquellas en donde se utiliza un solo colorante, es simple y fácil su realización. 1. Tinción de Azul de Metileno de Loeffler a. Principio Es una tinción simple utilizada para una gran variedad de microorganismos, sin embargo su uso es específico para detectar bacterias en frotes de líquido cefalorraquídeo en casos de sospecha de meningitis bacteriana.

Figura 2. Células epiteliales núcleos teñidos de azul oscuro y citoplasma azul pálido, bacterias pequeñas azules apenas visibles (100X).

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 3

2. Tinción de Azul de Lactofenol

d. Resultados

a. Principio La tinción de Azul de lactofenol se emplea para observar hongos. Es una tinción simple (un sólo colorante) y como tal está basada en la afinidad del colorante por componentes de las células, en este caso por las estructuras fúngicas.El azul de lactofenol tiene tres características que lo hacen especial para observar dichas estructuras en los hongos del tipo moho obtenidos en los cultivos por aislamiento. Figura 3. Estructuras fúngicas de coloración azul. El fenol destruye la flora acompañante (algunas veces en los cultivos, juntos a los hongos pueden crecer colonias de bacterias). El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al crear, por decirlo de algún modo, una película que las protege provocado por un cambio de gradiente osmótico entre el interior y el exterior de dicha estructura. El azul de algodón tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios de los hongos microscópicos (García, Beltran, Guzmán, León, Arredondo y Fonseca. 2001). b. Materiales y Reactivos • Solución de azul de lactofenol • Cultivo a evaluar • Asas • Portaobjetos • Cubreobjetos • Microscopio • Aceite de inmersión • Mechero • Agua salina fisiológica

3. Tinción Naranja de Acridina a. Principio El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleído ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. A pH neutro las bacterias, hongos y material celular se tiñen de naranja rojizo, pero a pH ácido las bacterias y los hongos mantienen su color naranja rojizo, pero el material de fondo se tiñe de amarillo verdoso. Se utiliza para la detección de hongos y bacterias en muestras clínicas principalmente (Flores, Albarado, Thomas, Lobo. 2008). b. Materiales y Reactivos • Solución de naranja de acridina 0.7% (naranja de acridina doble sal, buffer de acetatos pH:4,0) •I ncinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Pinzas • Portaobjetos • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biológica • Microscopio de epifluorescencia • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro

c. Procedimiento • Colocar una gota de agua salina fisiológica sobre el portaobjetos. • Con el asa picar el cultivo y expandir por encima de la gota de agua salina fisiológica, hasta que no se seque. • Después seca la muestra, tomar una gota de azul de lactofenol y se añade sobre la muestra. c. Procedimiento • Se cubre la muestra con el cubreobjetos • Se cubrir la lámina • Observar en el microscopio. naranja de acridina • Procurar que no queden burbujas de aire • Lavar con agua de en la preparación, ya que sino lo que se ob• Dejar secar al aire servara mayoritariamente serán las burbuobservación jas.

con la solución de por dos minutos. chorro abundante. para su posterior

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 4

d. Resultados Las láminas deben enfocarse utilizando un microscopio de epifluorescencia, utilizando filtro azul o amarillo estándar.

aproximadamente por dos minutos. • Observar al microscopio en los objetivos de 10X y 40X. d. Resultados La coloración observada es negro con diferente intensidad según el grosor de la quitina.

Figura 4. Tinción de ascosporas.

4. Tinción de Negro de Clorazol a. Principio El colorante negro de clorazol permite visualizar rápida y con claridad las estructuras fúngicas, uniéndose a la quitina, sin embargo, debe tenerse especial cuidado ya que el reactivo se degrada con la luz. Es ideal para coloraciones en fresco y es necesario apoyarse en el hidróxido de potasio (KOH) para la eliminación de la queratina presente en la muestra (Arreaza, 2008). b. Materiales y Reactivos • Negro de clorazol • Dimetil sulfoxido (DMSO) • KOH 40% • Portaobjetos • Cubreobjetos • Bisturí • Muestra biológica • Microscopio • Goteros • Agua desmineralzada c. Procedimiento • Tomar una porción pequeña de la muestra (si es necesario triturar con un bisturí las escamas) y colocar en un portaobjetos. • Agregar una gota de la solución de negro de clorazol. • Colocar el material con una lámina cubre objetos y dejar incorporarse en la muestra

Figura 5. Examen directo con negro de clorazol se observa parénquima y estructuras fúngicas de menos tamaño e intensidad (40X).

5. KOH con Tinta Azul Parker a. Principio La búsqueda de estructuras fúngicas utilizando hidróxido de potasio como aclarante de la queratina es un método sencillo, pero este método clásico ha sido mejorado con el uso de tinta azul Parker lo cual colorea el fondo de la tinción con la estructura fúngica y las contrasta para facilitar su visualización (Pérez, Weiss, Villanueva, s.f.). b. Materiales y Reactivos • KOH/Tinta Parker relación 1.1 • Portaobjetos • Cubreobjetos • Bisturí • Muestra biológica • Microscopio • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro c Procedimiento • Tomar una porción pequeña de la muestra (si es necesario triturar con un bisturí las escamas) y colocar en un portaobjetos. • Agregar una gota de KOH 20% preparado con tinta azul Parker.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 5

d. Resultados

Figura 6. Examen directo de piel con KOH 20% y tinta azul Parker, hifas segmentadas y ramificadas dicotómicamente

B. Tinciones diferenciales Son aquellas donde se utilizan dos o más colorantes y en contaste permite la diferenciación del microorganismo o la visualización de la estructura deseada. 1. Tinción de Gram a. Principio De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (gram positivo y gram negativo), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias gram positivo tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias gram negativo tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las bacterias gram negativo, mientras que en las bacterias gram positivo el colorante queda retenido y permanecerán azules. Las gram negativo se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse, de color rosado al microscopio (López-Jácome y otros, 2014). b. Materiales y Reactivos • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Asa de Siembra en argolla • Pinzas

• Portaobjetos • Cultivos bacterianos de 24 horas • Palillos • Microscopio • Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua destilada • Solución de cristal Violeta • Lugol • Safranina • Etanol 95% • Cronómetro c. Procedimiento • Cubrir el frote con Cristal Violeta durante 3 min. • Retirar el colorante mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el portaobjetos, para no desprender la muestra. • Cubrir ahora con Lugol durante 1 min., realizar otro lavado suave. Todas las células se teñirán de violeta. • Agregar unas gotas de etanol 95%, deslizándolo por el portaobjetos, hasta que las gotas que salen no tengan casi color. Las células gram- pierden el colorante violeta y quedarán incoloras. Las gram + seguirían violeta. • Añadir una el colorante safranina (colorante de contraste) por 2 min. • Lavar el colorante con agua. Este colorante sólo entrará en las bacterias gram –, que quedarán rojas. Las gram + seguirán violetas. • Secar las preparaciones sobre papel de filtro. • Observarlas al microscopio utilizando el objetivo de inmersión d. Resultados

Figura 7. Se observa cocos gram negativo de color rojo por la safranina y bacilos gram positivo de color morado por el cristal violeta.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 6

2. Tinción de Wright a. Principio

bulos sanguíneos. El colorante deberá cubrir completamente el portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes. Deberá agregarse una cantidad adicional si éste se comienza a evaporar. • Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de Wright, para evitar la coloración débil. Esperar la formación de brillo metálico. Puede usarse de igual manera agua desmineralizada. Dejar actuar de 10-15 minutos. • Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensión presente un aspecto rosado al examinarlo a simple vista. • Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante. • Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersión

Esta tinción tiene diversos usos en microbiología; en la parasitología, se le emplea en la búsqueda de hematozoarios como Plasmodium spp. El reactivo de Wright está compuesto por eosina y azul de metileno, cuando éste se oxida se conoce como azur B a una concentración de 0.8 g/L empleando como solvente alcohol metílico. La eosina es un colorante ácido que tiene afinidad por componentes alcalinos. La eosina Y es la más utilizada en procedimientos rutinarios. Es un compuesto ácido cuya propiedad está basada en su polaridad negativa, lo que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva; por esta razón, colorea componentes citoplasmáticos y se les conoce como acidófilos. La tonalidad resultante de la tinción con eosina es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo d. Resultados • Los eritrocitos se observarán de color naintenso en el caso de los eritrocitos. El típico coranja o rosado. lor de los núcleos celulares, mayoritariamente • El citoplasma de los monocitos presentarán morado, se basa en la interacción molecular enuna tonalidad azul grisácea con gránulo rojitre eosina y un complejo azul de metileno-DNA. zos bastante finos y sus vacuolas caracterísLa intensidad de la coloración depende del conticas. El citoplasma de los linfocitos presentatenido de azur B y de la relación con la eosina rá varias tonalidades azules. amarilla (Ortega, Garibaldi. 2009) • Los núcleos de los linfocitos y neutrófilos aparecerán de color púrpura oscuro. Los núb. Materiales y Reactivos cleos de los monocitos de color púrpura algo • Alcohol 96% más claros (lila). • Alcohol Metílico • Los gránulos de los eosinófilos son de color • Portaobjetos rojo-anaranjado intenso. Los gránulos de los • Wright-Giemsa Stain, Modified basófilos púrpura azulado muy oscuro. Los • Cubetas para tinción gránulos de los neutrófilos se aprecian de co• Pizetas con agua desmineralizada lor lila, bastante finos. • Toalla de papel • Las plaquetas toman coloración violeta o • Guantes púrpura. • Microscopio • Libreta • Contador celular • Cronómetro

c. Procedimiento • Colocar el frote secado al aire sobre una rejilla o cubeta de tinción con el frote hacia arriba • Cubrir completamente el portaobjetos con el colorante de Wright gota a gota. • Dejarlo que permanezca en el frote aproximadamente de 5-8 minutos, para fijar los gló-

Figura 8. Frote periférico con parásitos intracelulares, teñidos de color violeta

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 7

3. Tinción de Giemsa

eliminar cualquier resto de colorante. • Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersión.

a. Principio

d. Resultados • Los núcleos celulares se tornan violeta inEs la segunda coloración en uso, luego de la tenso. tinción de Wright, y en importancia de las mez• Es frecuente encontrar en el método de clas de Romanowsky. Es quizás la mejor moGiemsa que la granulación eosinófila no dificación de este tipo de coloraciones para presenta la tonalidad rojo-anaranjada cadescubrir parásitos en la sangre, como en el racterística sino que presenta una tonalidad caso de malaria (Plasmodium spp.) y tripanopardo rojizo. Esta dificultad puede prevenirsomiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de se añadiendo una gota de fucsina fenicada Giemsa también da excelentes resultados para por cada 10ml de alcohol metílico utilizado. la tinción rutinaria de frotes sanguíneos. Cuan• Las granulaciones neutrófilas (lila) y los do se va a teñir con este colorante, debe fijarse hematíes (rojo pálido) se tiñen mal; sin primero la muestra con metanol absoluto por un embargo, esta coloración permite diferentiempo mínimo de tres minutos (cuando la preciar algunas formas de metamielocitos que paración no incluye metanol). El colorante en pueden ser confundidos con los monocitos, solución nunca se utiliza de manera directa, por pues el protoplasma de los monocitos quelo que se debe diluir con la solución amortiguada de color azulado y el de los metamielocidora en una proporción de 1:10 ó 1:20 y el tiemtos de color rosa. po de coloración podrá ser de 10 ó 20 minutos, • El citoplasma de los linfocitos presenta respectivamente (Ortega, Garibaldi. 2009). una tonalidad azul definida y sus núcleos violetas de intensidad variable. b. Materiales y Reactivos • Los gránulos basófilos y las plaquetas se • Colorante de Giemsa (constituido por una tiñen de color azul, no obstante éstas últimezcla de azul de metileno, eosina y varios mas presentan corpúsculos violetas interazures en dilución acuosa). nos. • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Pinzas • Portaobjetos • Muestra biológica • Microscopio • Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro c. Procedimiento • Sumergir el frote verticalmente en una solución de Giemsa preparada temporalmente a partir de 1 volumen de la solución colorante más 9 volúmenes de solución tampón (pBs, pH 6.8) o bien en agua desmineralizada. • Esperar durante 10-20 minutos. • Lavar el frote con abundante agua, directamente del chorro. • Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para

Figura 9. Frote periférico con células sanguíneas de color violeta y eritrocitos de color rosado a rojo.

4. Tinción de Ziehl-Neelsen a. Principio La tinción de Ziehl-Neelsen (Z-N) fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clínicas de pacientes. Esta técnica es capaz de diferenciar los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 8

La técnica de Z-N fuerza la penetración de la fucsina básica en la pared celular mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de ácidos micólicos: el calor “derrite” el componente ceroso y el fenol actúa a modo de disolvente, permitiendo el paso del colorante básico que se une a los ácidos micólicos con carga negativa. Cuando cesa la aplicación de calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las moléculas de fucsina quedan atrapadas en su espesor. Con la coloración de Z-N se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul (López y otros, 2014). b. Materiales y Reactivos • Azul de metileno • Alcohol ácido • Fucsina • Mechero • Portaobjetos • Cubetas para tinción • Pizetas con agua destilada • Toalla de papel • Guantes • Microscopio • Libreta • Cronómetro c. Procedimiento 1) Coloración • Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente 5 cm entre una y otra, una sobre un soporte dentro del lavabo/pileta de coloración. • Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Si el número de baciloscopia a colorear es pequeño, se puede filtrar la fucsina directamente cuando se la deposita sobre el extendido a través de un pequeño embudo con papel de filtro. • Colocar sobre el soporte las láminas fijadas conservando el orden numérico con el extendido hacia arriba y manteniendo una separación de al menos 1cm entre ellas. • Cubrir totalmente la superficie del extendi-

do con fucsina básica fenicada recién filtrada. Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo los extendidos. • Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar con mechero. • En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado. • En el término de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisión de vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus lípidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal. • Con una pinza, levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o un grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior. • Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar diluir los reactivos que se utilizarán a continuación. 2) Decoloración • Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar aproximadamente 3 minutos. • Enjuagar con abundante agua a baja presión. • Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa, volver a cubrir con solución decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos y enjuagar nuevamente. • Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos 3) Coloración de fondo • Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno. • Dejar actuar durante un minuto.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 09

croscopio, un manchado diapositivas Kinyoun mostrará bacilos como organismos rojos y no • Enjuagar las láminas en ambas caras con ácido-rápido como el azul. Se basa en el comagua a baja presión y limpiar parte inferior portamiento ácido-resistente de la cubierta de algunos parásitos como Isospora y Cryptospocon un algodón si ha quedado coloreada. • Observar si las láminas conservan la nu- ridium, los cuales se tiñen de rojo y destacan meración clara y visible. Si no es así volver a sobre un fondo verde o azul, dependiendo del colorante de contraste usado (Ortigoza Gutienumerarlas. •Dejar secar las láminas a temperatura am- rrez, y Cruz Aguilar, s.f.). biente, apoyándolas en posición vertical en un soporte sobre un papel absorbente. No b. Materiales y Reactivos • Fucsina fenicada apoyar papel absorbente sobre el extendido.. • Verde de malaquita o Azul de metileno • Alcohol metílico d. Resultados • Alcohol etílico • Alcohol ácido • Aceite de inmersión • Portaobjetos • Puente de tinción • Microscopio c Procedimiento • Realizar un frote de la muestra. • Dejar secar perfectamente. • Cubrir las gotas con unas gotas de alcohol metílico y dejar que seque. • Cubrir la preparación con fucsina fenicada durante 5 mins. • Lavar con alcohol ácido durante 3 min. Figura 10. Se observa las bacterias alcohol ácido re• Enjuagar con agua corriente sistentes (BAAR) de color rojo fucsia y el resto de mi• Coloración de contraste, agregar verde de croorganismos y demás componentes del campo de malaquita o azul de metileno dejar actuar ducolor azul. rante 1 min. • Lavar con agua corriente y dejar secar. 5. Tinción de Kinyoun • Observar con objetivo de inmersión. a. Principio d. Resultados El Kinyoun mancha es un método para teñir microorganismos resistentes a los ácidos, específicamente Mycobacterium y Nocardia. El procedimiento para la coloración de Kinyoun es similar a la tinción de Ziehl-Neelsen, pero no implica el calentamiento de las diapositivas siendo stained.1 El método de tinción de Kinyoun utiliza carbolfucsina como una mancha principal, seguido de decoloración con una solución de ácido-alcohol y azul de metileno como Figura 11. Se observan los BAAR de color rojo, las contrateñir. Kinyoun carbolfuschsin tiene una demás estructuras se tiñen del color del colorante de mayor concentración de fenol y fucsina básica contraste en este caso verde de malaquita. y no requiere de calefacción con el fin de manchar properly.1 Cuando se observa bajo un miRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 10

6. Tinción de Ziehl-Neelsen Modificado

• Cubrir la lámina con colorante azul de metileno por 30 segundos. • Lavar el exceso de colorante con abundante agua del chorro. • Dejar secar a temperatura ambiente y observar al microscopio.

a. Principio Esta tinción es útil para visualizar quistes de protozoos intestinales que tienen la propiedad de ser ácido-alcohol resistente (AAR). Cryptos- d. Resultados poridium, Cyclospora e Isospora suelen producir diarrea persistente, sobre todo en pacientes inmunocomprometidos o con infección por el VIH. La técnica de Ziehl-Neelsen modificado fuerza la penetración de la fucsina fenicada en la pared celular mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de ácidos micólicos. Con el lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero el colorante fucsina queda dentro del parásito y este se destaca en contraste al fondo azul (EHAS, 2012). b. Materiales y Reactivos • Carbol fucsina (fucsina fenicada) • Azul de metileno • Alcohol-Ácido • Mechero • Portaobjetos • Cubetas para tinción • Pizetas con agua destilada • Toalla de papel • Guantes • Microscopio • Libreta • Cronómetro c. Procedimiento • En una lámina portaobjetos hacer un extendido delgado de la muestra de heces, dejar secar a temperatura ambiente y fijar la muestra con calor pasando dos o tres veces por mechero. • Cubrir la lámina con colorante carbol fucsina y aplicar calor hasta la emisión de vapores y mantener por 5 minutos, evitando la ebullición del colorante. • Lavar el exceso con agua del chorro. • Decolorar con alcohol-ácido durante 20-30 segundos. • Lavar con abundante agua del chorro.

Figura 12. Se observa Quistes de Cryptosporidium (AAR) de color rojo fucsia con contraste azul en el fondo.

7. Tinción selectiva de esporas WirtzConklin a. Principio La producción de endosporas bacterianas es una forma de resistencia de algunos géneros de bacterias gram positivas, debido a la ubicación intracelular las esporas no se tiñen convencionalmente. Por esta razón se utiliza la tinción de Wirtz-Conklin , en donde los microorganismos son teñidos en caliente con el colorante verde de malaquita y que el calor aumenta la permeabilidad de la membrana bacteriana y de la espora, posterior a esto se realiza una decoloración a través del lavado con abundante agua y los extremos de la bacteria son teñidos posteriormente con el colorante de contraste safranina (Vázquez, Martín, Siloniz, Serrano, 2010). b. Materiales y Reactivos • Verde de malaquita • Safranina • Etanol 95% •Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol •Pinzas • Portaobjetos • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biológica • Microscopio

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 11

• Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro

tinción es un método químico muy utilizado en histología y permite la detección de hongos en muestras de tejidos (Pontón, Llovo, 2007).

b. Materiales y Reactivos • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Pinzas • Portaobjetos c. Procedimiento • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra • Fijar la muestra en una lámina portaobjetos. biológica • Cubrir la lámina con colorante verde de • Microscopio malaquita y aplicar calor hasta la emisión de • Aceite de inmersión vapores y mantener por 5 minutos. • Soporte de Tinciones • Lavar el exceso con agua del chorro. • Goteros • Cubrir con la lámina con colorante safrani• Agua desmineralizada na por 1 minuto. • Cronómetro • Lavar el exceso de colorante con abundan• Ácido periódico te agua del chorro. • Reactivo de Schiff • Dejar secar a temperatura ambiente y observar al microscopio. c. Procedimiento • Cubrir el material fijado en la lámina con d. Resultados acido peryodico al 0,5% durante 5 minutos. • Lavar con agua destilada. • Agregar el reactivo de Schiff. 20 minutos. • Lavar con agua del chorro. • Dejar secar al aire para su posterior observación d. Resultados

Figura 13. Tinción de esporas en Bacillus subtilis, la flecha indica la espora teñida en verde. Microscopia de campo claro 100X.

8. Tinción de Ácido Peryódico de Schiff (PAS) a. Principio Se realiza un tratamiento al material con ácido periyódico 0,5%, el cual oxida los 1,2-glicoles formándose grupos aldehídos en los glucanos y mananos de las paredes celulares de hongos, con el reactivo de Schiff (preparación de fucsina básica y metabisulfito de sodio) los aldehídos reaccionan dando un color rojo luminoso. Esta

Figura 14. Se observa dentro del tejido, la presencia de levaduras de Candida spp.

C. Tinciones Especiales Se basan en el hecho que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 12

• Portaobjetos • Cubreobjetos • Pipeta

1. Tinta China a. Principio Fue desarrollada originalmente para micros- c. Procedimiento copia de luz con el fin de rodear y delinear las • En una lámina portaobjetos colocar una bacterias no teñidas u otros materiales biológigota de la tinta china. cos. Utilizamos diferentes métodos para evaluar • Esterilizar el asa y tomar una muestra de estructuras individuales, tan pequeñas como las cultivo del hongo o en el caso de la muestra vesículas sinápticas e incluso de gran tamaño, de LCR colocar con una pipeta una gota socomo los microorganismos unicelulares. Este bre la tinta. método es muy útil, aunque está limitado por la • Con el cubreobjetos mezclar la tinta con la presencia de un fondo oscuro que no permitirá muestra la correcta identificación de forma nítida y deta• Colocar el cubreobjetos sobre la preparallada de los componentes de dichas estructuras. ción • Observar la placa en el microscopio a 40x En microbiología, la tinción de Tinta China proy 10x porciona un resultado presuntivo de la presencia de Cryptococcus neoformans, microorga- d. Resultados nismo causante de meningitis en pacientes con inmunosupresión, siendo la técnica más utilizada para poner de manifiesto su cápsula. Este hongo presenta dos formas durante su ciclo vital: una forma asexual y una forma sexual; en la primera se presenta como levaduras encapsuladas que se reproducen por gemación y puede ser visualizada por medio de la tinta china. El principio es simple, ya que sólo se requiere depositar una gota de la muestra clínica sobre un portaobjetos, posteriormente se coloca el coloFigura 15. Se observa levaduras capsuladas de C. rante y se observa al microscopio sin necesidad neoformans 40X. de fijación, algunas estructuras difundirán el colorante y otras no, lo que permitirá un contraste Tinción de Auramina-Rodamina de las estructuras observadas. Se han utilizado 2. diferentes colorantes: uno de ellos es la mencionada tinta china, la cual tiñe el fondo de la a. Principio muestra de un color oscuro y la cápsula del C. Los ácidos micólicos de las paredes celulares neoformans permanece sin teñir. La principal de las micobacterias poseen afinidad para los dificultad con la tinción negativa es que los mi- fluorocromos auramina y rodamina. Estos colocroorganismos tienden a contraerse durante el rantes se fijan a las bacterias, que aparecen de periodo de secado; para evitarlo, se ha optado color amarillo o naranja brillante contra un fondo por usar la tinción negativa húmeda, en la cual verdoso. El permanganato de potasio, empleado los organismos se suspenden en una película como contraste, evita la fluorescencia inespecíde tinta china o mancha oscura y el contorno de fica. Todos los microorganismos ácido-alcohol la cápsula puede ser observado sin el peligro de resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes. Un aspecto contracción (López-Jácome y otros, 2014). importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frote pueden ser reteñidos con b. Materiales y Reactivos la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun direc• Asa tamente sobre la tinción con el fluorocromo, si • Tinta China se elimina antes el aceite de inmersión. • Mechero Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 13

De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica (García, Beltran, Guzmán, León, Arredondo y Fonseca. 2001). b. Materiales y Reactivos • Microscopio de flourescencia • Fluorocromos: auromina, rodamina • Solución decolorante • Permanganato de potasio (contraste) • Glicerol • Fenol • Agua desmineralizada • Portaobjetos • Cubreobjetos • Mechero c. Procedimiento • Fijar el frote al calor, en un mechero • Teñir el frote 15 minutos con los fluorocromos auramina-rodamina • Aclarar con agua. • Coloración de contraste con permanganato de potasio durante 3 minutos • Aclarar con agua destilada • Lavar con agua y dejar secar al ambiente d. Resultados

Figura 16. Las bacterias alcohol ácido resistentes se observan en el microscopio de flourescencia (luz ultravioleta) como bacterias de color amarillo anaranjado sobre un fondo oscuro.

3. Tinción Blanco de Calcofluor a. Principio Es un método de tinción fluorescente para la detección de hongos incluyendo Pneumocystis

carinii. Maeda & Ishida en 1967, describieron que este blanqueador de algodón fluorescente, podía teñir hongos al exponerlo a la luz UV. Hageage y Harrington lo utilizaron para la tinción de tejidos fijados en parafina, logrando identificar hifas y esporas. La tinción se basa en la capacidad del blanco de calcoflúor para unirse a los ß 1-3, ß 1-4 polisacáridos (celulosa y quitina) de la pared fúngica, y en que el compuesto exhibe fluorescencia cuando se expone a luz ultravioleta, permitiendo delinear claramente elementos fúngicos. Al igual que en un examen directo se observarán hifas anchas, no septadas, con ramificaciones en ángulo recto. Se puede utilizar en tejidos frescos y/o congelados, fijados en parafina y en cultivos puros. Este método no sirve para teñir bacterias. Otros elementos como por ejemplo fibras vegetales (algodón) que pudieran teñirse, deben diferenciarse cuidadosamente por la morfología. Para realizar esta tinción, el tejido debe ser tratado con KOH al 10% e igual proporción de solución de calcoflúor al 0,05%. Para examinar el extendido se requiere un microscopio de fluorescencia. Las estructuras fúngicas se observarán verde claro o azul, dependiendo del filtro UV que se utilice (Ortigoza Gutierrez y Cruz Aguilar, s.f.). b. Materiales y Reactivos • Fenol • Ácido láctico y azul de algodón • Fucsina acida • Rojo allura • Azul brillante • Colorante vegetal • Ácido acético • Glicerina • Agua desmineralizada c. Procedimiento • El tejido a evaluar debe ser tratado con KOH al 10% e igual proporción de solución de calcoflúor al 0,05%. • Para examinar el extendido se requiere un microscopio de fluorescencia. • Colocar en un portaobjetos la muestra • Agregar una gota de KOH dimetil sulfóxido y una gota de calcofluor • Mezclar, colocar el cubreobjetos • Después de hacer ocurrido la clarificación, observar con el microscopio de flourescencia (verde brillante o blanco azulado).

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 14

d. Resultados Las fibras elásticas y colágeno se observan con fluorescencia amarillo verdosa, estas se pueden confundir con hongos y levaduras, se diferencian en la fluorescencia.

Figura 17. Se observarán hifas anchas, no septadas, con ramificaciones en ángulo recto con fluorescencia blanca.

4. Tinción de Gomori-Grocott a. Principio Es una coloración especial para hongos, la coloración está basada en la presencia de ácido crómico, los grupos hidroxilo de los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos y estos a su vez reducen el complejo nitrato-plata metenamina produciendo la coloración café o negra. Utiliza un buffer (bisulfito de sodio) y también un colorante de contraste (cloruro de oro) y uno de fondo (verde brillante) (Pontón, Llovo, 2007). b. Materiales y Reactivos • Ácido crómico • Bisulfito de sodio • Metenamina.-nitrato de plata • Cloruro de oro • Verde brillante • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Pinzas • Portaobjetos • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biológica • Microscopio • Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro

c. Procedimiento • Cubrir la muestra fijada en el portaobjetos con la solución de ácido crómico al 10% durante 10 minutos. • Lavar con abundante agua desmineralizada. • Cubrir con la solución de metabisulfato sódico 1% durante 1 minuto. • Lavar con abundante agua desmineralizada. • Introducir la lámina en un recipiente con la solución de metenamina-nitrato de plata, dicha solución debió ser previamente calentada en baño de maría a 800C por 6 minutos, Una vez introducida la lámina se debe mantener las condiciones durante 5 minutos más hasta observar el cambio de color en solución de marrón a negro. • Lavar con abundante agua desmineralizada. • Cubrir el portaobjetos con la solución de cloruro de oro 1% de 2 a 5 segundos y lavar con agua desmineralizada. • Cubrir el portaobjetos con la solución verde brillante 0.2% en ácido acético glacial durante 1 minuto. • Lavar con abundante agua desmineralizada y dejar secar a temperatura ambiente. d. Resultados

Figura 18. Se observa levaduras de C. neoformans 100X

IV. Referencias A. Aquiahuatl., M. Pérez., M. (2004) Manual de prácticas de laboratorio de microbiología general. Departamento de Biotecnología. Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa, México. pp. 20-24.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 15

B. Arreaza., F. (2008) Onicopatías con parequeratosis determinada por examen directo con negro de clorazol. Consultorio de Dermatología y Micología. Caracas, Venezuela. Rev. Med Cut Iber Lat Am. Vol 36 (2). pp. 72-78. C. Enlace Hispano Americano de Salud –EHAS(2012) Procesamiento de Muestras para Diagnóstico de Parásitos Intestinales. España. pp. 7-8. D. Flores., E. Albarado., L. Thomas., D. Lobo., A. (2008) Comparación de la tinción fluorescencia modificada y gram, en muestras urogenitales y perianales de pacientes asistidos en el área de infecciones de transmisión sexual del ambulatorio Arquímides Fuentes. Universidad de Carabobo, Venezuela. Rev. de la Facultad de Salud. Vol.12 (2). pp. 29-38. E. García., P. Beltran., C. Guzmán., A. León., P. Arredondo., M. Fonseca., X. (2001) Diagnóstico rápido de dos casos de mucormicosis con tinción de blanco de calcoflúor.. Pontificia Universidad Católica de Chile, Facultad de Medicina: Laboratorio de Microbiología. Unidad Docente Asociada Laboratorios Clínicos. Unidad Docente Asociada Otorrinolaringología. Santiago, Chile. Rev. chil. infectol. Vol.18 (4). Pp. 18 F. Gordillo., R. (2005). Manual de Toma de Muestra. Hospital Roosevelt, Área de Microbiología. 2ª. Edición. Guatemala. pp. 5.

I. Ortega., M. Garibaldi., P. (2009) Trabajo práctico n° 4 “Tinción y observación de microorganismos.”FACULTAD REGIONAL ROSARIO DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA CATEDRA DE BIOTECNOLOGIA. Pp. 12 J. Ortigoza., S. Cruz., M. (s.f.) Manual de procedimientos para el laboratorio de la E. E. Parasitología General UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOANALISIS REGION VERACRUZ. pp. 37. K. Organización Mundial de la Salud –OMS(2005). Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Ginebra. pp. 13-15. L. Pérez., R. Weiss., E. Villanueva., L. (s.f) Método rápido para visualización de hifas en el diagnóstico de las dermatomicosis. Instituto de Biomedicina. Caracas, Venezuela. Rev Dermatología Venezolana. pp. 27-34. M. Pontón., J. Llovo., J. (2007) Diagnóstico Microscópico de las Micosis. Asociación Española de Micología. España. Revista Iberoamericana de Micología, Vol. 2. pp. 1-14. N. Vázquez., C. Martín., A. Siloniz., m. Serrano., S. (2010) Técnicas de Microbiología, Observación de bacterias. Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense. Madrid, España. Rev. REDUCA. Vol. 3(5) pp. 15-38.

G. Koneman., E. Allen., S. Janda., W. Procop., G. Scherckenberge., P. Woods., G. (2008) Koneman, Diagnóstico Microbiológico, Texto y Atlas en color. 6a. Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. pp. 21-23. H. López., L. Hernández., M. Colín., C. Ortega., S. Cerón., G. Franco., R. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Laboratorio de Infectología. Centro Nacional de Investigación y Atención a Quemados (CENIAQ), Instituto Nacional de Rehabilitación. Ciudad de México, DF. Vol. 3 (1). pp 10-18.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 16

MANUAL DE MICROBIOLOGIA Alejandra Castillo Veronica Itzep

1 Introducción Las enfermedades infecciosas constituyen un problema de salud pública cada vez en aumento generando costos altos para su tratamiento, esto se ha debido al uso indiscriminado de antibióticos generando la desimanación de bacterias multiresistente en el ámbito hospitalario o comunitario, dificultando el adecuado tratamiento. Los pacientes hospitalizados como no hospitalizados presentan una variedad de sintomatologías, poniendo en evidencia el tipo de enfermedad pero en otros casos dificulta al médico poder diagnosticar, por lo recurren al laboratorio de microbiología para poder obtener diagnósticos certeros y poder tratar al paciente efectivamente. El objetivo del presente manual es poder utilizarlo como una guía de procesos facilitando el diagnostico de algunas enfermedades infecciosas frecuentes, describiendo los procedimientos de aislamiento como las técnicas presuntivas y confirmatorias de identificación.

tes. - El personal de laboratorio debe utilizar equipo de protección apropiados (lentes, mascarilla) para evitar en lo posible aerosoles o salpicaduras de las muestras. Las muestra que se deben centrifugar debe ser tapadas previamente, al destapar algún tubo usar gasas para evitar los aerosoles. - Desinfectar las mesas de trabajo antes y después del manejo de material infeccioso, con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio. - Recipientes adecuados para desechos de materiales como placas, tubos, muestras clínicas.

El personal de laboratorio debe utilizar equipo de protección como, bata, lentes, mascarillas y guantes. Al momento de toma de muestras se debe tener en cuenta las siguientes instrucciones: - Verificar que el área de trabajo esté limpia - Contar con todo los materiales adecuados para la toma de muestras como, medios de transporte, hisopos, lancetas, portaobjetos, jeringas, solución salina, alcohol al 70%, torniquetes, gasas, frascos estériles, bajalengua, etc. 2 Generalidades - Identificar al paciente, verificar si esta con tra2.1 Normas Mínimas de Seguridad en tamiento de antibiótico, revisar el área de toma el Laboratorio de Microbiología de muestra o qué tipo de prueba solicitan el médico. Apuntando las anotaciones. La bioseguridad se refiere a los procesos de - Previo a la toma de muestra verificar y preparar manejo de los agentes infecciosos para evitar el material adecuado para la toma de muestra. o proteger al personal de laboratorio, al medio - Rotular los materiales a utilizar ambiente y a paciente de un riego biológico. El - Lavarse las manos antes del proceso y usar manejo de microorganismos dentro del laborato- guantes limpios rio debe realizarse con mucha precaución para - Realizar la toma de muestra según el procedievitar infecciones accidentales. Debe tenerse miento adecuado. en cuenta las siguientes indicaciones para el manejo de muestras microbiológicas: 2.2 Organización de Área de Trabajo - Acceso limitado al área de trabajo, - Lavar las manos, antes y después del manejar El mobiliario debe ser fuerte y resistente. Los material infeccioso con jabón germicida o con espacios entre mesas, cabinas y equipo han de alcohol a 70% en caso de manejo de microor- ser de fácil acceso para la limpieza. ganismos gram positivo. - No comer, ni beber alimentos dentro del área - Contar con una campana microbiológica tipo de trabajo. No fumar. I o II. - Utilizar descartador para objetos punzocortanRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 17

Membrana Citoplásmica: localizada por debajo de la pared celular, que está formada por una - Contar con asa calibrada de 0.001, asa en ar- bicapa de fosfolípido integral y proteínas perigolla y asa en punta. Para Micología asa en L, féricas empotradas. La membrana citoplásmica pinzas. cumple la función de barrera osmótica, tienen - La superficie de las mesas de trabajo han de permeabilidad selectiva y permite el ingreso de ser impermeables al agua y resistente al calor nutrientes y la salida de desechos por mecanismoderado, solventes orgánicos, ácidos, álcalis mos de transporte activo y pasivo. y otros productos químicos. Citoplasma: en el citoplasma bacteriano se - La silla que se usen deben estar cubiertas por puede dividir en tres partes, región citoplásmimaterial que no sea de tela y que se puede lim- ca de apariencia granular conteniendo RNA, piar fácilmente. región nuclear o cromatinica que contiene DNA - La iluminación será adecuada para todas las y la parte liquida que mantiene disueltos los actividades. Evitar reflejos y brillos molestos. elementos nutritivos. El ARN combinada con - Contar con mechero de Alcohol o Bunsen con proteínas forma una masa densa y compacta gas propano, que la llama sea azul. llamadas ribosomas. - Contar con un microscopio binocular, aceite de inmersión, laminillas, cubreobjetos, palillos. 2.3.1 Bacterias Gram positivo - Contar con colorantes para Gram, Zn, KOH, Giemsa. La envoltura de la bacteria comprende de membrana citoplasmática y una pared celular com2.3 Generalidades de la Estructura puesta por una gruesa capa de peptidoglicano Bacteriana de 20 a 80 nm, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmátiLas diferentes estructuras bacterianas se pue- ca mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La den dividir en elementos obligatorios para poder capa de peptidoglicano confiere gran resistensobrevivir como pared celular, membrana celu- cia a estas bacterias y responsable de retener lar, ribosomas y material genético y elementos el cristal violeta durante la tinción de Gram. El facultativos son los que están presentes en al- ácido teicoico de la pared que está en la supergunas celular y pueden seguir viviendo si pier- ficie y se une solo a la capa de peptidoglicano, den alguna capacidad fisiológica o patológica este ácido es el responsable del determinante como pilis o fimbrias, cápsula y esporas. antigénico del organismo. (fig. 1) Pared Celular: está ubicada por fuera de la membrana plasmática, es una estructura vital para las bacterias que la poseen. Su función es proteger a la bacteria de presión osmótica entre el medio interno de la bacteria y del exterior, barrera contra sustancias toxicas químicas y biológicas y le proporciona rigidez a las bacterias. Está constituida por aminoácidos, aminoazúcares, azúcares y grasas. Todas las bacterias contienen en la pared celular peptidoglicano, que consiste en cadena lineal de dos azúcares alternados, N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico que se halla ligado un tetrapéptido. La pared celular permite clasificar las bacterias en Gram positivo que son capaces de retener el colorante cristal violeta luego de la decoloración con alcohol cetona y Gram negativo que pierden el colorante cristal violeta después de la decoloración. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 18

2.3.2 Bacterias Gram negativo La envoltura de la bacteria está compuesta por una membrana citoplasmática, una pared celular delgada de 2 a 7 nm de peptidoglicano y una membrana externa. Entre la membrana citoplasmática y la membrana externa se localiza el espacio periplásmico, relleno de una sustancia denominada periplásma la cual contiene enzimas para la nutrición, enzimas inactivadora de antibióticos y proteínas de transporte. La membrana externa contiene diversas proteínas: porinas, lipopolisacáridos (LPS) y fosfolípidos. El lipopolisacárido forma tres regiones: polisacárido O (antígeno O), polisacárida central (KDO) y el lipido A (endotoxina). (fig. 2)

2.4 Tinciones Básicas 2.4.1 Tinción de Gram 2.4.1.1 Principio Es el método de tinción diferencial más utilizado en bacteriología, siendo esencial para la clasificación y diferenciación de microorganismos, la cual divide las bacterias en dos grupos, las Gram positivas y las Gram negativas. La reacción de la tinción de Gram está basada en la diferencia en la composición química de la pared celular bacteriana. La tinción consta de 4 reactivos químicos, el primero es el colorante primario cristal violeta, su

función dar color a todas las células. El segundo reactivo el lugol, actuando como mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared celular de la bacteria. El tercer reactivo el decolorante Alcohol-acetona, donde los organismos Gram positivo no se decoloran y los Gram negativo si lo hacen. Y el cuarto reactivo el colorante de contraste Safranina, poniendo de manifiesto las bacterias Gram negativas. 2.4.1.2 Procedimiento de la Tinción de Gram a. Preparación del Frote - Tomar la muestra con un hisopo de dacron o alginato de calcio. - Rodar el hisopo sobre un portaobjeto - En caso de muestras liquidas tomar una porción con un asa en argolla flameada y fría, colocarlo en un portaobjeto. - Dejar secar al aire o acelerar el secado acercando el portaobjeto al mechero, pero con precaución porque el calor puede degradar o deformarse las bacterias. b. Preparación de la tinción - En una bandeja con dos varillas colocar el frote en forma horizontal - Colocar el Cristal Violeta suficiente cantidad, dejar actuar durante 1 minuto - Lavar suavemente con agua - Colocar el mordiente Yodo, dejar actuar por 1 minuto - Lavar suavemente con agua - Decolorar con Alcohol-Acetona, agregando gota o gota hasta que salga casi claro o ligeramente azul - Lavar con agua - Agregar safranina como contraste, dejar actuar por 1 minuto - Lavar con agua - Dejar secar la muestra - Examinar al microscopio con objetivo 100X de inmersión de aceite. Gram Positivo se tiñen de morado y Gram negativo de rosado. (fig. 3)

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 19

- Cubrir el frote con el reactivo Carbón fucsina, - Por debajo del frote calentar con suavidad hasta la aparición de vapores durante 1 minuto - Dejar el colorante durante 4-5 minutos, sin caEs una técnica de tinción diferencial rápida y lentar económica, usada para identificar microorga- - Lavar el frote con agua de chorro y eliminar el nismos patógenos como M. tuberculosis o el exceso de agua género Apicomplexa (coccidios intestinales) en- - Decolorar el frote con alcohol-ácido tre otros. - Lavar el frote con agua de chorro y eliminar el El fundamento de la tinción se basa en resistir exceso de agua a la decoloración con alcohol-acido después de - Cubrir el frote con el reactivo azul de metileno la tinción con colorantes básicos. Las paredes durante 1 minuto celulares de ciertas bacterias contienen ácidos - Lavar el frote con agua de chorro, dejar secar grasos (ácidos micólicos) de cadena larga que al aire les confiere la propiedad de resistir la decolo- - Observar el frote con microscopio con objetivo ración. 100X en busca de BAAR La técnica consiste en la penetración de carbón fucsina en la pared celular mediante el calor como mordiente, luego de cesar la aplicación de calor la pared celular cerosa recupera su consistencia quedando atrapado el colorante. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo observándolo como bastoncitos delgados, ligeramente curvos. (fig. 4) 2.4.2 Tinción Ziehl Neelsen 2.4.2.1 Principio

2.4.2.2 Procedimiento de Tinción de Ziehl Neelsen a. Preparación del frote - Con un palillo o un asa flameada y fría tomar muestra y colocarla en un portaobjeto limpio - Dejar secar a ambiente - Fijar al calor la muestra, con cuidado b Preparación de coloración - En una bandeja con varillas colocar el frote en posición horizontal Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 20

2.4.3 Tinción de Kinyoun 2.4.3.1 Principio La tinción es similar a la tinción de Ziehl Neelsen, siendo una coloración en frio, utilizando un reactivo especial que además de fucsina agrega una concentración alta de fenol. El fenol disuelve los lípidos de la pared celular permitiendo que el colorante primario entre entré, evitando el calentamiento. (fig. 5 ) 2.4.3.2 Procedimiento de Tinción Kinyoun - En una bandeja con dos varillas, colocar la laminilla en posición horizontal - Cubrir la laminilla con carbón fuscina-fenificada durante 5 minutos - Lavar con agua de chorro - Decolorar con alcohol-acido - Lavar con agua de chorro - Cubrir con el colorante de contraste por 1 minuto - Lavar con agua de chorro, secar al aire

2.4.4 Tinción Kinyoun Modificado 2.4.4.1 Principio

2.4.4.2 Procedimiento de Tinción Kinyoun Modificado - Flamear el frote para fijarlo - Colocar el frote en posición horizontal en una bandeja con varillas - Cubrir el frote con fucsina-fenicada durante 5 minutos - Lavar con agua de chorro - Decolorar con un ácido débil ácido sulfúrico, durante aproximadamente 3 minutos - Lavar con agua de chorro - Cubrir el frote con el colorante de contraste Azul de Metileno durante 3 minutos - Lavar con agua de chorro, dejar secar 2.4.5 Observación en Fresco 2.4.5.1 Principio Son todas aquellas formas o métodos de observación, mediante los cuales los objetos a investigarse no sufren cambios o alteraciones en cuando a su forma, estructura o composición química. Es útil para observar especies que se dañarían al teñirla o fijarlas, como espirilos, así como observar movilidad, fenómeno de multiplicación o esporulación. (fig. 6)

3 Toma de Muestra y Procedimientos

Parecida a la coloración de Kinyoun o en frio, haciendo la fijación con alcohol metílico para 3.1 Orocultivo preservar las estructuras celulares y utilizando 3.1.1 Propósito e importancia ácido sulfúrico al 2% en agua destilada remplaEsta prueba se realiza para detectar infecciones zando al alcohol-acido. en la garganta causada por Estreptococos del grupo A causando amigdalitis o faringitis.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 21

El área faríngea puede estar colonizada por varias bacterias como Staphylococcus, Streptococcus, micococos, Moraxella catarrhalis, Corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela, Peptostreptococcus, Actinomyces, levadura, etc., pero el microorganismo más frecuente que causa faringitis es el Streptococcus pyogenes

Carnero al 5% en un extremo de la caja realizando el inoculo. g. Enviarlo inmediatamente al laboratorio 3.1.3 Aislamiento Primario a. Proceder a realizar el estriado en Agar Sangre Carnero al 5%, realizando dos cortadas de aproximadamente 1 cm para aumentar la identificación de la beta hemolisis. Entre cada estriada y cortada no flamear el asa. (fig. 8)

3.1.2 Recolección de la muestra y transporte Previo a la toma de muestra el paciente no debe estar tomando antibióticos, no haber realizado gargarismo con algún antiséptico y no es necesario que el paciente se presente en ayuno. En algunos casos el procedimiento puede causar nauseas o vómitos. 3.1.2.1 Procedimiento a. Que el paciente este sentado, pedirle que trague saliva dos veces b. Indicarle al paciente que vea hacia arriba, abra la boca y diga aahh c. Con ayuda de un bajalengua presionar la lengua hacia abajo y con una linterna observar el área afectada, en busca de áreas inflamada, con pus o ulceras blanquecinas.(fig. 7) d. Con un hisopo estéril de dacrón proceder a la toma de muestra, con el mayor cuidado de no tocar paredes de la boca ni la lengua.

e. Introducir el hisopo en el medio de transporte Todd Hewitt, llevarlo a la brevedad posible al laboratorio. f. En caso de realizar la inoculación directa realizar la inoculación en medio de Agar Sangre de

b. Incubar por 18 a 24 hrs a 35-36 °C introducirlo en una jarra con veladora con el objetivo de crear un ambiente de C02 c.Buscar colonias de pequeñas de 1 a 1.5 mm de diámetro rodeada de un halo de hemolisis completa sospechosas con beta-hemolisis sospechosas de S. pyogenes 3.1.4 Identificación Streptococcus pyogenes Es el principal microorganismo patógeno humano que produce infección local o sistémica y trastornos inmunitarios postestreptocócicos. Puede causar Faringitis, Erisipe, Celulitis, Gangrena estreptocócica, Fiebre puerperal, Piodermia estreptocócica, Síndrome de Choque Toxico, fiebre reumática y glomerulonefritis. La prueba de catalasa es negativa, susceptible al Taxo A (bacitracina 0.04 U) formando un halo de inhibición, resistente al Taxo SXT, la identificación de pirrolidonilarilamidasa (PYR) y la detección del Antígeno A de Lancefield. (fig. 9) 3.1.4.1 Procedimiento a. Después de la incubación de 16 a 24 horas del asilamiento primario, proceder a buscar colonias sospechosas de beta hemolisis.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 22

b. Trasladar una o varias colonias a un agar sangre carnero al 5% en el centro y proceder a realizar un estriado en forma de tapete c. Con una pinza flameada y fría colocar un disco de Taxo A (bacitracina 0.04 U)en el centro d. Incubar por 16 a 24 horas en ambiente de CO2 e. Examinar la caja para observación de un halo de inhibición alrededor del Taxo A. La presencia del halo indica que se aislo S. pyogenes (fig. 10) f. Proceder a realizar la prueba de susceptibilidad y pruebas serologías de aglutinación para confirmación del grupo

3.2 Cultivo de Garganta Especial 3.2.1 Propósito La presencia de las bacterias especiales por cultivo se realiza mediante solicitud e investigación justificada. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 23

• Corynebacterium diphtheriae: conocido como bacilo Klebs-Löffler, causante de la difteria, es investigada por sintomatología que presenta el paciente, siendo: formación de pseudo-membranas (pellejos) de color gris en la garganta, que sangran mucho al desprenderse, fiebre y el paciente se encuentra severamente intoxicado, afectando las amígdalas, garganta, nariz, miocardio, fibras nerviosas o piel. Bacterias Gram Positiva, catalasa positiva, inmóvil, no espurulados, bacilos rectos o ligeramente curvados 2-6 um de largo y 0.5 um de diámetro, a menudo con en forma de V lo que se conoce como forma de letras chinas. • Neisseria Meningitidis: Causante de severa y contagiosa meningitis, y se investiga principalmente el Líquido Cefalorraquídeo, la presencia la bacteria se realiza en cultivo de garganta en personal que han estado en contacto con el paciente, siendo médicos, enfermeras, técnicos de laboratorio, siendo importante identificar y erradicar la bacterias con tratamiento para evitar la desimanación.

3.2.2.2 Toma de Muestra para Neisseria meningitidis y Bordetella pertussis

El cultivo de garganta/nasofaríngeo para el aislamiento de N. meningitidis, debe obtenerse de personal que han tenido contacto directo con algún paciente que se ha detectado la presencia de la bacteria en LCR, se obtiene mayor porcentaje de aislamiento en toma de muestra nasofaríngea que de garganta. Figura No. 12 a. Colocar al paciente con la cabeza inmovili• Bordetella pertussis: Causante de la tos fe- zada rina, también conocida con tos convulsa o co- b. Con el pulgar de la mano, levantar suavequeluche. Se caracteriza por inflamación tra- mente la punta de la nariz queobronquial y accesos típicos de tos violenta c. Introducir un hisopo de alginato de calcio en y espasmódica con sensación a asfixia. Coco- unos de los orificios nasales bacilo Gram Negativo pequeño mide alrededor d. Mover el hisopo hacia atrás y hacia arriba a de 0,3-0,5 μm de ancho y entre 1,0 y 1,5 μm de lo largo del tabique nasal, hasta llegar a la parte largo, aerobios, posee capsulas, presenta fila- posterior de la faringe. mentos similares a pilis. e. Retirar el hisopo con cuidado f. Inocular el hisopo en medio de transporte o 3.2.2 Recolección de Muestra y Trans- directamente en el medio de cultivo. porte g. Con otro hisopo tomar muestra y realizar un 3.2.2.1 Toma de muestra para Coryne- frote gram bacterium diphteriae a. Con buena iluminación examinar la garganta, bajar la lengua con ayuda de un bajalengua, buscar aéreas necróticas o grisáceas (pseudomembrana) Fig. 11 b. Con un hisopo alginato de calcio estéril frotar firmemente las lesiones, retirar el hisopo con cuidado de no tocar las paredes ni la lengua de la boca. Tomar por lo menos 3 muestras con hisopo c. Un hisopo realizar un frote gram d. Inocular en los medios de cultivo. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 24

3.2.3 Aislamiento primario 3.2.3.1 Corynebacterium diphteriae a. Inocular el hisopo en un medio inclinado de Loeffer (suero animal más caldo glucosado coagulado) el medio es de color crema pálido. b. El segundo hisopo inocular en agar Chocolate-Telurito de Potasio c. Proceder a estriar los medios de cultivo d. Incubar ambos medios aerobicamente por 36°C por 18 a 24 horas e. Un tercer hisopo inocular en agar Sangre Carnero al 5% para investigar Streptococcus pyogenes, incubar en ambiente CO2 f. Teñir el frote Gram y buscar características de la bacteria

das en Agar Chocolate-Telurito para realizar las pruebas de Catalasa y Nitritos Catalasa: Positivo Nitritos: Positivo Reporte: Si la morfología del crecimiento en medio Loeffler es típica informar, Se aisló un bacilo gram-positivo, de morfología compatible con Corynebacterium diphtheriae. Si la morfología microscópica de crecimiento en medio Loeffler es típica y hay colonias negras en Agar Chocolate-Telurito reportar: Se aisló Corynebacterium diphtheriae. Identificación preliminar, pendiente de demostrar la producción de toxina en vitro o in vivo

3.2.3.2 Neisseria meningitidis a. Inocular un hisopo en medio de de Thayer Martin b. Estriar el inoculo e incubar a 36°C en ambiente CO2 por 18-24 horas c. Teñir el frote Gram 3.2.3.3 Bordetella pertussis a. Inocular un hisopo en medio de agar Bordet-Gengou o Agar Regan-Lowe b. Estriar el inoculo e incubar a 36° por 4-5 días c. Teñir el frote gram

3.2.4.2 Neisseria Meningitidis a. Después de la incubación observar colonias en Agar Chocolate pequeñas, grises, brillantes y 3.2.4 Identificación de principales Mi- ligeramente mucosas croorganismos b. Realizar un frote Gram con cuidado, observar 3.2.4.1 Corynebacterium diphtheriae diplococos Gram-negativo en forma de granos a. Después de la incubación del medio Loeffler de café, agrupados en pareja con dos a ocho horas, preparar dos frotes uno c. Realizar un subcultivo para obtener un cultivo para gram y otro para Azul de metileno, con cui- puro en agar Chocolate sin inhibidores de colodado de remover lo menos posible nias características y morfología microscópicas b. Tinción de Gram: bacilos gran-positivo pleo- de la bacteria para las pruebas de identificación mórficos y en forma de maza, agrupadas en for- como Oxidasa, utilización de azucares y pruema de letras chinas o en formas de V o Y. bas serológicas. c. Tinción de Azul de Metileno: utilizar Azul de Metileno de la coloración de Ziehl Neelsen ob- Prueba de Oxidasa servar el mismo patrón que el gram, solo que la a. Tomar una porción de la colonia a estudio, con coloración es discontinua en forma de bandas un palillo de madera o un asa plástica, frotar soazules por los corpúsculos metacromáticos de bre un disco con reactivo de oxidasa. polimetafosfato. b. La reacción positiva se da en 10 segundos, d. En agar Chocolate-Telurito se observan colo- con una coloración morado oscuro a negro indinias de color negro intenso. cando prueba positiva. e. Sulcultivar en Agar Sangre de Carnero al 5% colonias características de C. diphtheriae creciRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 25

Utilización de Azucares Método Agar Cistina Tripticasa ACT a. Se utiliza un juego de 4 tubos con agar ACT con distintas azucares (glucosa, maltosa, lactosa y sacarosa) b. Tomar una pequeña cantidad con un asa en punta del crecimiento de un cultivo de N. meningitidis, de un cultivo puro de 24 horas en agar Sangre y Chocolate c. Inocular pinchando varias veces los 10 mm superiores del medio. Y repetir el proceso con los otros tubos usando un asa flameada y fría. d. Cerrar los tubos e incubarlos a 35°C por lo menos 72 horas hasta 5 días antes de descartarlos como negativo e. Si se genera una turbidez visible y un color amarillo en la porción superior del medio, es indicativo de crecimiento y producción de acido, intepretando como positiva la prueba. N. meningitidis, oxida glucosa y la maltosa, pero no la lactosa ni la sacarosa. (Tabla No. 1) Tabla No. 1 Utilización de Azucares

Colonias de B. pertussis Figura No. 14 3.3 Hemocultivo y Mielocultivo 3.3.1 Propósito El hemocultivo sirve para detectar las bacterias que se están reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. El mielocultivo es el cultivo de médula ósea y sirve para detectar bacterias en esta muestra, especialmente Salmonella typhi. El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente estéril, por lo tanto, la presencia de microorganismo o sus productos constituyen un problema para todos los órganos y sistemas que son irrigados por el mismo. La detección e identificación de los diversos microbianos, es de vital importancia desde el punto de vista clínico para instaurar una terapia antimicrobiana adecuada y desde el punto de vista epidemiológico.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 26

f. Dispensar el volumen de sangre obtenido rápida y suavemente en el medio de cultivo líquido 3.3 Hemocultivo y Mielocultivo con anticoagulante 3.3.1 Propósito g. Limpiar con alcohol al 70% para remover el yodo el cual puede causar irritación en algunos El hemocultivo sirve para detectar las bacterias pacientes. que se están reproduciendo en la sangre, lo que Las botellas de hemocultivo inoculadas deben provoca septicemia. El mielocultivo es el cultivo ser enviadas inmediatamente al laboratorio evide médula ósea y sirve para detectar bacterias tando una agitación vigorosa, sin refrigerar. Si en esta muestra, especialmente Salmonella no es posible llevarlas de inmediato, conservartyphi. las a temperatura ambiente por un corto período El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente de tiempo sin alterar la viabilidad de las bacteestéril, por lo tanto, la presencia de microorga- rias. Por un periodo mayor deben conservarse nismo o sus productos constituyen un proble- en incubadora a 35°C. ma para todos los órganos y sistemas que son En sepsis: se recomienda tomar dos muestras irrigados por el mismo. La detección e identifi- de lugares distintos en un lapso de media hora. cación de los diversos microbianos, es de vital En endocarditis, obtener tres muestras de difeimportancia desde el punto de vista clínico para rentes lugares en un lapso de 1 a 2 horas. instaurar una terapia antimicrobiana adecuada y desde el punto de vista epidemiológico. 3.3.3 Aislamiento primario 3.3.3.1 Procedimiento de incubación 3.3.2 Recolección de la muestra y a. Al obtener la muestra en el frasco de hemocultransporte tivo, incubar el frasco a 35-36°C hasta por 7 días b. Examinar visualmente y con luz transmitida El momento ideal para obtención de la muestra los frascos de hemocultivo después de 12 y 24 es justo antes del pico más alto de fiebre, sin horas de incubación. esperar el pico máximo de temperatura, ya que c. Observar si presenta turbidez o lisis de gloen este momento hay mayor destrucción del bulos rojos indicando crecimiento bacteriano, microorganismo. Antes de recibir terapia antimi- entonces realizar una coloración Gram y un subcrobiana, si está recibiendo ya terapia antimi- cultivo., si no presenta cambios seguir incubancrobina tomar muestra en el momento de baja do por 7 días. concentración del antibiótico. 3.3.2.1 Toma de muestra a. Seleccionar el sitio de punción, b. Preparar el sitio, lavar con agua y jabón. Limpiar con alcohol etílico a 70%. Si el paciente no es alérgico al yodo, lavar en forma concéntrica con tintura de yodo por 30 segundos c. Desinfectar las tapas de la botella del hemocultivo con alcohol o yodo. d. Proceder a la venopunción con jeringa, extraer el volumen de sangre necesario para obtener una dilución en una proporción de 1:5 o 1:10 Volumen de muestra: neonatos 0.5 ml Niños 1-5 ml Adultos 10 ml e. Retirar la ligadura y la jeringa al terminar de obtener la sangre, colocar una torunda de algodón

Subcultivo a. Los subcultivos deben realizarse en cabina o cerca de un mechero de bunsen b. Realizar los subcultivos ciegos dentro de las 12 a 24 horas de incubación

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 27

c.Antes de realizar el subcultivo, desinfectar la superficie de la tapa del frasco con alcohol al 70% d. Con una jeringa estéril, extraer a través del tapón de la muestras e. Inocular una gota de muestra del hemocultivo en un extremo de la superficie de las placas de Agar Sangre, Agar MacConkey, Agar Chocolate y Agar Manitol sal. f. También colocar una gota sobe un portaobjeto para la tinción de Gram g. Proceder a realizar la dispersión para obtener colonias aislada h. Incubar las placas de Agar sangre carnero 5% y Agar Chocolate a 35-36°C por 24 horas en ambiente de CO2; las placas de MacConkey y Manitol Sal incuabar en ambiente aerobiosis. i. Observar el gram si se observa morfología bacteriana informar al medico j. Si no hay crecimiento a las 24 horas, seguir incubando hasta por 48 horas. k. Si no hubiera desarrollo bacteriano, repetir el procedimiento de sulbcultivo al 5to y 7 mo dia. l. Streptococcus pneumoniae tiene tendencia a autolisis, deben ser subcultivado a las 12-17 horas de incubación, repetir a las 48 horas y 7mo día de incubación sin presentar cambio de coloración o turbidez.(Tabla No. 2) Tabla No. 2 Alteración del hemocultivo y posible bacteria

3.3.4 Identificación de principales microorganismos Staphylococcus coagulasa negativo, corinebacterias y especies de bacillus son contaminantes frecuetnes y a menudo se aíslan en solo una de tres muestras o el paciente no presenta síntomas. Algunas bacterias frecuente en hemocultivos positivos son: - Salmonella typhi - Escherichia coli - Streptococcus pneumoniae Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 28

Staphylococcus aureus - Streptococcus pyogenes - Pseudomonas aeruginosa - Haemophilus influenzae

3.4 Líquido cefalorraquídeo y otros líquidos estériles 3.4.1 Propósito Demostrar mediante el cultivo de Líquido Cefalorraquídeo (LCR) u otro tipo de líquido el diagnostico microbiológico de una infección. Las infecciones del SNC puede ser causada por bacterias, virus, hongos o parásitos que se hallan en el medio ambiente o que forman parte de la flora normal de la superficies corporales; los agentes causales son introducidos previamente en los tejidos periféricos del hospedero y se dirigen al SNC a través del torrente sanguíneo o ocasionado por traumatismos craneoencefálicos.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 29

Las bacterias que tiene mayor importancia en el líquido cefalorraquídeo son: Bacterias Gram Negativo Neisseria meningitidis Haemophilus influenzae Escherichia coli y otras enterobacterias Pseudomonas aeruginosa Bacterias Gram Positivo Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Lysteria monocytogenes Entre otros microorganismos esta Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans. Los síntomas de irritación de las meninges son fiebre, dolor de cabeza, vómitos, rigidez, dolor de nuca, reflejos aumentados y petequias en la piel.

3.4.2 Recolección de Muestra y Transporte Las muestras de líquido LCR u otro líquido corporal estéril deben ser tomadas por un profesional capacitado, antes de iniciar tratamientos con antibióticos, colectadas en recipientes estériles por lo menos tres frascos para citológico (recuento de glóbulos rojos, recuento de glóbulos blancos, formula diferencial), químico (glucosa, proteína entre otros) y microbiológico. Deben ser transportadas inmediatamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no después de 30 minutos de recolectada. Rotular la muestra adecuadamente y tipo de muestra. Si el médico sospecha de bacilos alcohol acido resistente BAAR o de hongos debe notificarlo para evaluar.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 30

levaduras encapsuladas sembrar en agar Sabourod por 4 semanas Los líquidos o fluidos corporales estériles son: e. Tomar una o dos gotas de líquido con una pi- Líquido cefalorraquídeo peta pasteur estéril o jeringa estéril e inocular - Líquido ventricular (cisternal o craneal) los medios de cultivo sólidos, Agar Sangre Car- Líquido abdominal (peritonel, de diálisis o nero 5%, Agar Chocolate, Agar Manitol Sal, Agar bilis) MacConkey. - Líquido pleural, toracentesis y empiema ( f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero obtenido del torax) al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 y - Líquido pericardio Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente ae-Líquido sinovial La muestra de Líquido Cefalorraquídeo LCR se robiosis, a 36°C, revisar a las 24 horas. obtiene por punción lumbar, se sugiere por lo g. Si el laboratorio cuente con pruebas para demenos la colección de la muestra en tres tubos tección de antígenos, realice estas pruebas con separados para analizar química (glucosa, pro- una pequeña cantidad del LCR o del sobrenateínas entre otros), citológico (glóbulos rojos, dante del LCR. glóbulos blancos y formula diferencial) y cultivo h. Si no se observa crecimiento deben ser reinmicrobiológico de preferencia el tubo no. 2 o el cubados los medios por 72 horas antes de descartados. más turbio para el análisis microbiológico. i.Si presenta desarrollo de microorganismos sobre los medios de cultivo sólidos realizar coloración Gram, de acuerdo a lo observado proceder a montar las pruebas de identificación y antibiograma. Reportar al médico inmediatamente lo observado en la tinción de Gram, ZN o Tinta China. Segunda Porción a Proceder a realizar el examen macroscópico (color, aspecto, volumen ) y citológico del Líquido estéril b. El examen citológico de la segunda porción se analizara - Recuento de glóbulos rojos - Recuento de glóbulos blanco - Formula diferencial Figura No. 16 c Es este tubo también puede realizarse pruebas de latex para identificación de Criptococ3.4.3 Aislamiento Primario del Líquido Cefalorraquídeo u otros Líquidos Esté- cus neoformans, H. influenzae, N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae y del grupo B-hemoriles. litico. Tercera Porción Primera porción a. Tomar un tubo con muestra y Centrifugar la Proceder a realizar el examen químico con evaluación de glucosa y proteínas. muestra a 3,000 rpm durante 10 minutos b.Descartar el sobrenadante y con el sedimen- d. Si en la coloración de Tinta China se obserto proceder a realizar frotes para Gram y Zielh van levaduras encapsuladas sembrar en agar Sabourod por 4 semanas Neelsen ZN; Tinta China c.Si se observan Bacilos Alcohol Acido Resis- e.Tomar una o dos gotas de líquido con una pitente sembrar en Lowenstein Jensen, siguiendo peta pasteur estéril o jeringa estéril e inocular el protocolo para aislamiento e identificación de los medios de cultivo sólidos, Agar Sangre Carnero 5%, Agar Chocolate, Agar Manitol Sal, Agar micobacterias por 60 días d.Si en la coloración de Tinta China se observan MacConkey. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 31

Interpretación Tinción del Gram del sedimento del LCR: f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero - Observar diplococos Gram Negativo, forma de al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 riñon, en parejas como grano de café, compatiy Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente bles con N.meningitidis. aerobiosis, a 36°C, revisar a las 24 horas. - Cocobacilos Gram Negativo pleomórficos, con g.Si el laboratorio cuente con pruebas para de- escasa formas bacilares, compatible con H. intección de antígenos, realice estas pruebas con fluenzae una pequeña cantidad del LCR o del sobrena- - Cocos Gram Positivo, lanceolado, ovalado, disdante del LCR. puestos en parejas o cadena cortas, la capsula h.Si no se observa crecimiento deben ser rein- se insinúa como un halo claro alrededor de las cubados los medios por 72 horas antes de des- bacterias, compatible con S. pneumoniae. cartados. - Bacilos Gram Negativo, compatible con Entei.Si presenta desarrollo de microorganismos so- robacterias o Pseudomonas sp. bre los medios de cultivo sólidos realizar colora- - Levaduras redondas con gemación, Gram poción Gram, de acuerdo a lo observado proceder sitivo, se insinúa cápsula hacer tinta china, para a montar las pruebas de identificación y antibio- verificar la presencia de C. neoformans Tinción de Ziehl Neelsen grama. Reportar al médico inmediatamente lo observa- - Si se observan bacilos alcohol ácido resistente cortos, morfología compatible con M. tuberculodo en la tinción de Gram, ZN o Tinta China. sis o otras micobacterias. Segunda Porción Al observar crecimiento a las 24 o 48 horas y a. Proceder a realizar el examen macroscópico observar crecimiento en distintos medios como (color, aspecto, volumen ) y citológico del Líqui- guía (Tabla No. 4) do estéril b. El examen citológico de la segunda porción Tabla No. 4 se analizara - Recuento de glóbulos rojos - Recuento de glóbulos blanco - Formula diferencial c Es este tubo también puede realizarse pruebas de latex para identificación de Criptococcus neoformans, H. influenzae, N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae y del grupo B-hemolitico. Tercera Porción Proceder a realizar el examen químico con eva- Realizar Frote gram de las colonias para confirmar morfoluación de glucosa y proteínas. logía y proceder a identificación (tabla No. 5) 3.4.4 Identificación de principales miTabla No. 5 croorganismos

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 32

3.5 Coprocultivo 3.5.1 Propósito e Importancia Método utilizado para identificar diferentes microorganismos causantes de enfermedades gastrointestinales, provocando diarreas, vómitos, fiebre y dolores estomacales. Los principales enteropátogenos están: Salmonella sp, Shigella sp y Vibrio cholerae.

identificar más de 40 serotipos. Los factores de virulencia son Endotoxina, que se libera tras la lisis de la bacteria, que contribuye a la irritación de la pared intestinal y la Exotoxina o Toxina Shiga que es una proteína termolábil inmunogénica, su acción afecta tanto al intestino como sistema nervioso central. 3.5.1.3 Vibrio Cholerae

El género Vibrio agrupa a más de 30 especies, pero sólo 12 se consideran patógenas para el ser humano. La especie más patógena es V. 3.5.1.1 Salmonella sp cholerae, según el antígeno somático (O) se subdivide en los grupos O1, O2, O3 y O139. El El género Salmonella se incluye en la fami- Vibrio cholerae grupo O1 presenta 2 biotipos; el lia Enterobacteriaceae, integrada por bacilos Clásico, y Eltor y ambos biotipos pueden perteGram negativo anaerobios facultativos, son fer- necer a dis serotipos principales Ogawa e Inaba. mentadores de glucosa pero no lactosa, suelen Los vibrios causantes de cólera son Vibrio choser móviles por sus flagelos peritricos excepto lerae grupo O1 y grupo O139, fabrican una enS. gallinarum, no esporulados, producen ácido dotoxina que es la determinante de las diarreas sulfúrico y no producen ureasa. secretoras típicas del cólera. Se distinguen tres únicas especies patógenas Son bacilos Gram negativo, con forma de coma, primarias: S. thphi, S. Cholerae-suis y S. en- aerobios y anaerobios facultativos. No esporulateritidis. Según la serotipificación de Kauffman dos, tiene flagelo polar. Fermenta la glucosa sin y White, estas se clasifican en más de 2000 producción de gas, catalasa positivo y la mayoserotipos con base en antígenos flagelares H ría es oxidasa positiva. Tiene Antígeno somático (proteicos) y antígeno somáticos O (fracción po- (O), antígeno flagelar (AgH), sus factores de vilisacárida del lipopolisacaridos bacilar). S. typhi rulencia son mucinasa y la toxina colérica. posee además un antígeno de virulencia (Vi) 3.5.2 Recolección de Muestra y Trans3.5.1.2 Shigella porte a. No estar tomando antibióticos Shigella es un bacilo Gram negativo, inmóvil, no b. Colectar la muestra de heces frescas en un formadoras de esporas e incapaces de fermen- frasco limpio y estéril de boca ancha enviarlo antar la lactosa, que puede ocasionar diarrea en tes de 1 hora al laboratorio especialmente en niños. c. Si no puede emitir muestra de heces se pueExisten varias especies diferentes y son clasifi- de proceder a toma de muestra con hisopo. En cados en cuatro subgrupos niños introducir el hisopo 2.5 cm y en adultos - Serogrupo A: S. dysenteriae (12 serotipos): introducirlo 4 cm; dar 3 vueltas a la derecha y 3 causa disentería bacilar grave y complicaciones vueltas a la izquierda - Serogrupo B: S. flexneri (6 serotipos): causa d. Si la muestra es tomada con hisopo introdudisentería bacilar moderada cirlo en el medio de transporte como Cary Blair, - Serogrupo C: S. boydii (23 serotipos): causa e. Enviar la muestras tomadas lo antes posible disentería bacilar moderada al laboratorio - Serogrupo D: S. sonnei (1 serotipo): causa disentería bacilar leve 3.5.3Aislamiento Primario Shigella tienen un patrón antigénico complejo, 3.5.3.1 Procedimiento para aislar Salla mayor parte de las especies comparten el an- monella sp, Shigella sp tígeno O con otras enterobacterias. El antígeno a. Procesar la muestra lo más pronto posible O (somático) es un lipopolisacárido que permite Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 33

b. Con un hisopo estéril o asa en argolla tomar muestras de heces donde hay presencia de moco, pus o sangre. c. Tomar un hisopo o una asada de muestra y colocarlo en caldo de selenito por 12 a 24 horas a 35-36°C (inhibiendo la flora normal y permite el desarrollo de salmonella sp y Shigella sp. d. Tomar tercer hisopo o asa con muestra e inocular los medios de cultivo selectivos como MacConkey Sorbitol y XLD o SS, realizando un inoculo de 1 cm. e. Con un asa en argolla flameada y fría proceder a estriar f. Incubar por 24 a 48 hrs a 35-36C g. Revisar la presencia de colonias sospechosas tabla no. 1, realizar identificación y antibiograma El Agar MacConkey Sorbitol utilizado para buscar Escherichia coli O 157:H7 en niños menores de 5 años. Características macroscópicas en los medios de cultivo de las bacterias más importantes (Tabla No. 6 y figuras 17) Tabla No. 6

3.5.3.2 Procedimiento para aislamiento de Vibrio cholerae a. Procesar la muestra lo más pronto posible o muestra proveniente en medio de transporte de Cary Blair b.Con un hisopo estéril o asa en argolla tomar muestras de heces donde hay presencia de moco, pus o sangre. c.Tomar un hisopo o asa de muestra y colocarlo en Agua Peptonada Alcalina por 6 a 8 hr a 35-36 °C para enriquecimiento de Vibrio cholerae d.Sulcultivar en medio TCBS (tiosulfato, citrato sales biliares y sacarosa y Agar Sangre e. Con un asa en argolla flameada y fría proceder a estriar. Incubar por 24 hrs a 35-36C f.Revisar la presencia de colonias circulares de borde entero de color amarillo (sacarosa positivo) en medio TCBS y en agar Sangre colonias hemolíticas. (Figura 18)

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 34

- Proceder a picar una vez el medio por el centro al fondo del tubo - Sin sacar el asa recta del tubo estriar el sland del medio - Incubar a 36 C por 18 / 24 hrs - Leer la reacción B. LIA Agar Lisina Hierro Mide la capacidad del microorganismo para descarboxilar un aminoácido (lisina o arginina) para forma una amina con la consiguiente alcalinidad, poniéndose de manifiesto por el viraje del indicador púrpura de bromocresol. El medio es de color púrpura intenso pH 6. Procedimiento - Con un asa recta no flameada del proceso del TSI, - Desenrosque el tubo y flamee la boca del tubo - Proceder a picar el medio tres veces hasta el fondo y estriar el sland - Incubar a 36C por 18 a 24 hrs - Leer la reacción 3.5.4 Identificación de principales Microorganismo

Tabla No. 6 Interpretación TSI y LIA

3.5.4.1 Pruebas Bioquímicas Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos, la cual se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azúcares, presencia de enzimas, degradación de compuestos; con el objetivo de diferenciar bacterias. Para la realización de las pruebas bioquímicas se debe tener cuidado utilizar mesclar bacterias y tomar proceder con aislamientos puros. A. TSI Agar hierro triple azúcar Determinar la capacidad de la bacteria para degradar los azucares y la formación de gas y Acido Sulfhidrico. Color es rojo ladrillo anaranjado pH 7.4. . La fermentación aeróbica se produce en el sland del tubo y la anaeróbica en el fondo del tubo. Procedimiento - Con un asa recta picar una colonia sospechosa que este aislada - Desenrosque el tubo y flamee la boca del tubo Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 35

C.Citrato La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias, se detecta mediante el crecimiento y alcalinización del medio a pH 7.6, el aumento de pH se visualiza con el indicador Azul de Bromotimol que vira el medio de color verde a azul oscuro. Procedimiento - Con un asa flameada y fría tomar una colonia aislada - Desenrosque el tubo y flamee la boca del tubo - Proceda a estriar el sland - Incubar a 36 °C por 18-24 horas - Interpretar Interpretación Positivo: Crecimiento y viraje azul Negativo: Sin viraje el medio (verde) D. UREA La tripteína y la glucosa aportan los nutrientes para el desarrollo del microorganismo, el rojo de fenol es el indicador del pH y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Las bacterias que hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberan amoniaco y dióxido de carbono, esto alcaliniza el medio virando el rojo de fenol de amarillo al Rosado Intenso, esta prueba puede realizarse en medio liquido o sólido. El medio es de color amarillo. Procedimiento - De un cultivo puro tomar una colonia con una asa flameada y fría - Desenrosque el medio y flamee la boca del tubo - Estriar la superficie del sland - Incubar por 18 a 24 hrs a 36C - Leer reacción

2. Descarboxilación de Ornitina, capacidad del organismo de descarboxilar un aminoácido para formar una amina, por consiguiente la alcalinización 3. Producción de Indol El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias formando tres metabolitos, Indol, Escatol, y Indolacetico. Procedimiento - Con un asa en línea flameada y fría tomar una colonia - Desenroscar el frasco y flamear la boca del tubo - Introducir el asa en medio del agar hasta el fondo - Incubar por 18-24 hr a 36°C - Para la prueba de Indol, agregar 5 gotas del reactivo de Kovacs, agitar suavemente - Interpretar Interpretación Producción de Orinitina: Positivo: color purpura Negativo: color amarillo al fondo del tubo Producción de Indol: Positivo: anillo rojo en la superficie Negativo: no produce color Movilidad: Positivo: Los microorganismos móviles migran de la línea de siembre hacia el medio formando turbidez Negativo: crecimiento bacteriano solo en la línea de siembra. 3.5.4.2 Identificación de Salmonella sp

Interpretación Positivo: Rosado intenso Negativo: Sin viraje el medio (Amarillo) E. MIO (Movilidad, Indol y Orinitina) Utilizado para la identificación de enterobacterias sobre la base de: 1. Movilidad: Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 36

- Mezcle la suspensión y el antisuero completamente y a modo de mecedora mueva el portaobjeto repetidamente para observar aglutinación bajo luz brillante y sobre un fondo negro. Si la reacción es positiva en 30 seg a 1 min aparecerá una precipitación. - Si presenta aglutinación en el control se trata de una cepa rugosa, y no puede ser serotipificado. 3.5.4.3 Identificación de Shigella sp a. Reacción bioquímica

b. Tinción de Gram

Salmonella typhi c. Serológica Los cultivos de TSI sospechosa de S. typhi deben analizarse serológicamente con antisueros de Salmonella Vi y “O” del grupo D. El antígeno Vi es capsular puede enmascarar la reacción del grupo somático “O”, por lo que aislamientos de Salmonella typhi serán normalmente positivos tanto Vi como para el antisuero D. Procedimiento - En un portaobjeto límpido colocar tres pequeñas gotas de solución salina - Tomar una porción del crecimiento de la superficie de TSI y suspender cada gota de solución salina, mezclar - Añadir una pequeñas gota de antisuero O del grupo D a una suspensión y una pequeña gota del antisuero Vi a una segunda. La tercera suspensión será control Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 37

b. Tinción de Gram

c. Serología

3.5.4.4 Identificación de Vibrio cholerae a. Reacción bioquímica

b. Tinción de Gram

S. dysenteriae es las mas común en desintería, los aislamientos con reacciones típicas en la pruebas bioquímicas deben estudiarse primero con el antisuero monovalente A1, después con el antisuero polivalente B y por ultimo el antisuero polivalente D. Procedimiento - En un portaobjeto dividirlo y en cada sección colocar una gota de solución salina - Tomar muestra de las colonias sospechosas del TSI u otro medio no selectivo - Emulsifique el crecimiento en cada gota de solución salina, mezcle completamente las suspensión para hacerla moderadamente lechosa - Añadir una gota pequeña de antisuero y una se usara como control - Mezclar bien la suspensión y el antisuero para observar autoaglutinación. - Observar el portaobjeto bajo una luz brillante y sobre un fondo negro. Reacción positiva dentro de 30 seg a 1 min. - Si observar una el control que es la colonia con solución salina, se debe observar una mezcla homogénea, si hay presencia de aglutinación no sirve para serotipificado.

c. Prueba de Cuerda La prueba se utiliza para distinguir cepas de V. cholerae de Aeromonas. El desoxicolato de sodio lisas las bacterias, la solución perderá la turbidez y el ADN se desprenderá de las células causando la viscosidad. Procedimiento - En un portaobjeto colocar una gota de desoxicolato sódico al 0.5 % - Tomar una colonia a analizar previamente incubada en Agar Infusión de Corazón por 18 a 24 hrs - Interpretar Interpretación Positivo: Vibrio cholerae; otros vibrios darán positivo o positivo débil Negativo: Aeromonas

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 38

3.6 Urocultivo 3.6.1 Propósito e importancia El urocultivo es utilizado para la identificación de microorganismos causantes de infecciones urinarias asintomáticas o sintomáticas que van precedidos de leucocitosos y bacteriuria. Bajo condiciones normales no hay bacterias en el tracto urinario. El microorganismo principales de infección urinaria son bacilos gram negativo y con mayor frecuencia es la Escherichia coli, seguido de Klebsiella sp, Enterobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa, de menor importancia están los cocos gram positivos como Enterococcus sp., Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus y hongos. Cultivos de orinas con presencia de 2 a más microorganismos es indicio de una mala limpieza por lo tanto es una contaminación. El criterio de Kass, es útil para interpretar del crecimiento del bacteriano y ser considerada una verdadera infección urinaria, siendo este criterio de igual o mayor a 100,000 UFC/ML (UFC/ml Unidad formadora de colonias por mililitro). 3.6.2 Recolección Transporte

de

la

niños. Llevar la muestra inmediatamente al laboratorio, no pasando más de una hora después de la recolección. Mujeres: a. Realizar la limpieza en el área genital, separando los labios mayores, con gasas estéril con jabón antiséptico limpiar y con otra gasa estéril con agua quitar el jabón b. Dejar secar c. Proceder a recolectar la muestra en un frasco estéril boca ancha, descartando la primera porción de la orina en el sanitario y luego recolectar la otra porción a medio chorro d. Trasladarla inmediatamente al laboratorio. Hombres: a. Realizar la limpieza en la punta del pene con gasa estéril con antiséptico, luego con otra gasa con agua estéril quitar el jabón. b. Dejar secar. c. Proceder a la recolección de la muestra en frasco estéril boca ancha, descartando la primera porción de la orina en el sanitario y recolectarla otra porción a medio chorro. d. Trasladar inmediatamente al laboratorio.

Muestra

y 2. Punción Supra-púbica Esta por ser una técnica delicada debe ser tomada por un médico pediatra. Es la obtención de la De preferencia que el paciente no este con te- muestra por jeringa estéril. Esto solo se hace en rapia antibiótica previa a la recolección de la casos de que los cultivos aerobios dan negativos muestra, la muestra adecuada es la primera de y con sintomatología, malformación de la uretra la mañana, de no ser posible por lo menos pa- o sospecha de infección por un anaerobio. sar dos horas sin orinar para recolectar la muestra. Al momento de tener la muestra enviarla lo más antes posible al laboratorio no mayor de 2 horas. Recolectar en frasco estéril previa limpieza adecuada. Existen varios procesos de recolección de la muestra: 1. Chorro medio Niños: Realizar la limpieza en el área con agua y jabón, secar, colocar la bolsita de recolección de orina pediátrica adecuadamente (varones que el pene quede introducido en el agujero de la bolsita y mujercitas que el agujero quede en el centro donde saldrá la orina). No dejar la bolsita por más de una horas colocada en los Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 39

3. Sondas permanentes Este procedimiento se utiliza en aquellos enfermos con sonda permanente en los que no es posible retirar o reemplazar la sonda. Se desinfecta la parte externa de la sonda en la zona proximal con alcohol yodado y se punza la sonda con aguja y jeringa estéril. Se vuelca el contenido en forma aséptica en un frasco estéril.

Criterio de Kass - Recuentos inferiores a 10,000 UFC/ml, con hallazgos de cultivos polimicrobianos indican que hubo una posible contaminación. - Recuentos de 10,000 a 100,000 UFC/ml, posible bacteriuria - Recuentos igual o mayor a 100,000 UFC/ml 3.6.3 Asilamiento primario - Proceder a sembrar la orina con un asa cali- en pacientes asintomáticos tienen una probabibrada; se utiliza medios de cultivo de Agar San- lidad del 80% de presentar bacteriuria significagre Carnero al 5% permitiendo el crecimiento tiva, probabilidad que aumenta hasta el 96% en de todo tipo de bacterias, Agar MacConkey paciente sintomático. permitiendo el crecimiento de bacterias Gram - Muestras obtenidas por Punción Suprapúbica negativo. También puede usarse Chromocult o cualquier recuento de colonia es significativo. CLED este inhibe el swarming de Proteus sp - Con un asa calibrada de 0.001 ml flameada 3.6.4 Identificación de principales miy fría proceder a tomar la muestra de orina pre- croorganismo viamente agitada y abierta cerca del mechero - Realizar un línea con el asa calibrada en el 3.6.4.1Escherichia coli centro de la placa de Agar Sangre y otra línea Reacción bioquímica con el asa flameada y fría en la placa de MacConkey de igual manera - Con un asa no calibrada realizar las estrías en forma de zigzag. - Incubar el Agar Sangre en jarra con candela ambiente de CO2 y el Agar MacConkey en aerobiosis a 35-36 °C por 18 a 24 hrs. - Interpretación, si no hay crecimiento en un cultivo por 48 horas reportar “Negativo a las 48 horas de Incubación”, si hay presencia de crecimiento contar el número de colonias presentes y multiplicar por 1000 si se usa asa calibrada de 0.001 y multiplicas por 100 si se usó asa calibrada de 0.01 ml realizar la identificación de la bacteria por medio de reacciones químicas. Tener en cuenta el criterio de Kass. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 40

Escherichia coli (gram negativas) con la tinción de Gram.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 41

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 42

- Desinfectar la superficie con alcohol al 70% o yodo 3.7 Secreciones Varias 3.7.1 Secreciones de heridas y absce- - Introducir la aguja a través de la piel o la pared de absceso y aspirar aproximadamente 1 ml del sos material purulento 3.7.1.1 Propósito e importancia - Colocarlo en un frasco estéril o un medio de Está indicado para detectar la presencia de transporte y enviar inmediatamente al laboratobacterias causantes de infecciones en piel, ojo, rio oídos, quemaduras, abscesos y otros. La piel es el órgano más accesible del cuerpo que pue- 3.7.1.2.3 Toma de muestra en quemade tener mayor probabilidad de ser dañado o duras traumatizado, causando dolor, hinchazón, calor - Limpiar y retirar el tejido muerto o quemado any enrojecimiento alrededor de la herida hasta tes de la obtención de la muestra (hisopado del formar abscesos. La infección puede ser mono- exudado o una biopsia) - Llevar la muestra del tejido en frasco estéril microbianas o polimicrobianas. Los microorganismos más frecuentes S. aureus, S. epidermides, Enterococos, E. coli, Klebsiella 3.7.1.2.4 Toma de muestra de ojo sp, Enterobacter sp, P. aeruginosa, Candida al- - Realizar la toma de muestra antes de colocado analgésicos locales, colirio o antibióticos bicans. - Proceder a la toma de muestra con hisopo ro3.7.1.2 Recolección de la muestra y tando suavemente el hisopo en el ángulo interno transporte Previo a tomar la muestra del ojo e introducirlo en el medio de transporte el paciente no debe estar tomando an- - Con un hisopo estéril y húmedo con solución salina tomar la muestra y realizar los frotes gram tibiótico. - Si es para investigar Chlamydia trachomatis, verter el párpado y frotar con una torunda la su3.7.1.2.1 Toma de muestra de Herida - Realizar una buena asepsia de los bordes con perficie conjuntival y teñir con coloración Giemsolución salina estéril, realizando de adentro sa. Observar inclusiones intracitoplasmaticas hacia fuera en forma concéntrica - Separa suavemente los bordes de la herida con el pulgar e índice de la mano. - Con la otra mano, con cuidado de no tocar los bordes cutáneos, introducir la punta del hisopo en la profundidad de la herida, rotando el hisopo y avanzando hacia fuera. - Obtener dos muestras o Una para cultivo, introduciendo en un medio de transporte amies, stuart. o La segunda para realizar una coloración Gram, KOH o ZN realizar inmediatamente. 3.7.1.2.5 Toma de muestra de Oído - Enviar el medio de transporte al laboratorio. - Limpiar el canal auditivo externo con un hisopo 3.7.1.2.2 Toma de muestra de Absceso impregnado con Sol. Salina estéril - Proceder a la toma de muestra con el medio La toma de muestra de absceso debe ser toma- de transporte, de atrás hacia delante y de abajo da por aspiración con jeringa. hacia arriba -Realizar un frote para coloración Gram con un - Realizar una limpieza de la superficie con so- hisopo estéril humedecido con sol. Salina estélución salina, debe realizarse de adentro hacia ril, por sospecha de hongo fuera en forma concéntrica. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 43

3.7.1.3 Aislamiento primario - Realizar el inoculo en los medios de cultivo; si es material purulento colocar una gota en un extremo del medio de cultivo; los medios de cultivo a usar son Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar MacConkey, Agar Manitol Sal - Flamear y enfriar un asa en argolla y proceder a estriar. A modo de obtener aislamiento de colonias. - Incubar el Agar sangre y Agar Chocolate en jara con candela a 37°C y el Agar MacConkey y Manitol sal en aerobiosis a 37°C por 24 horas - Observar crecimiento identificando bacterias patógenas. Realizar antibiograma - Realizar la fijación del frote gram con el mechero y proceder a teñirlo con la coloración Gram o ZN. - Si a las 24 horas no hay crecimiento incubar por 24 horas más.

3.7.1.4 Identificación de principales microorganismos 3.7.1.4.1 Esquema de identificación de Cocos Gram positivo Tabla No. 7 Identificación de Staphylococcus aureus y coagulasa negativa

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 44

Tabla No. 8 Identificación de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y alfa hemolisis

Tabla No. 9 Identificación de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y beta hemolíticos

Tabla No. 10 Identificación de Cocos Gram positivo, catalasa negativa y gamma hemolisis

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 45

3.7.1.4.3 Identificación de Gram Negativo no Fermentador Pseudomonas aeroginosa Pseudomonas aeroginosa es fácil de reconocer en medios de aislamiento primario por la morfología de la colonia que son generalmente plana, algo extendidas, bordes aserrados y tienen un brillo metálico, por la producción de pigmentos difusibles si está presente porque algunas cepas no lo producen y son bastante mucoides y son aislados de pacientes con fibrosis quística y el olor característico.(Tabla No. 12, figura No. 20)

3.7.1.4.2 Identificación de Gram negativo Fermentadores Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae En agar MacConkey visualizar la morfología de las colonias, (Tabla No. 11 Fig. 19) Escherichia coli: lactosa positiva, colonias de borde entero, color fucsia opacas de 2-3mm de diámetro. Usualmente se observa una zona opaca alrededor de la colonia. Klebsiella pneumoniae: colonias de borde entero color rosado a rosado oscuro de 3-4 mm de Tabla No. 12 diámetro y aspecto mucoide. Enterobacter spp: colonias de borde entero, color rosada 2-4 mm de diámetro, no tan mucoide como Klebsiella pneumoniae.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 46

Mujeres adultas - Colocar a la paciente en una camilla en posición ginecológica, introducir el especulo hasta 3.7.2 Secreción Vaginal visualizar el cuello 3.7.2.1 Propósito - Introducir el hisopo tomar una muestra e introducirlo en un medio de transporte Stuart o Amies La mucosa genital es una región vulnerable a la o Amies con carbón infección producida tanto por microorganismos - Proceder a tomar dos muestras con hisopo, constitutivos de la microbiota habitual como por uno para hacer el extendido para la tinción y otro los adquiridos de forma exógena a través del colocarlo en solución salina estéril para observacontacto sexual, están normalmente coloniza- ción en fresco das por diferentes microorganismos que inclu- - Las muestras en medio de transporte deben yen estafilococos coagulasa negativo, corine- ser enviada inmediatamente al laboratorio, si no bacterias, estreptococos, bacterias anaerobias es posible mantenerlo a temperatura ambiente y y con menor frecuencia levaduras. En edad re- no exceder de 18 horas. productiva destaca la presencia de Lactobaci- En mujeres embarazadas, en busca de Strepllus acidophilus, ejerciendo un control biológico tococcus agalactiae (beta-hemolitico del grupo y un mecanismo de defensa para el epitelio va- B) se recomienda la toma de muestra introduginal. Las infecciones del tracto genital femeni- ciendo el hisopo por el canal vaginal sin colocar no pueden ser de origen endógeno, causadas especulo. principalmente por Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae o Candida sp. 3.7.2.2 Recolección de la muestra y transporte Condiciones previas a la obtención de la muestra, no estar en tratamiento de antibiótico, no realizarse ducha vaginales ni relaciones sexuales 24 horas antes de la toma de muestra. Y no bañarse el día de la recolección de la misma. Tabla No. 13

En Niñas En niñas NO utilizar especulo. - Colocar a la niñas en posición ginecológica - Realizar una previa limpieza para evitar contaminación con flora colonizante - Utilizar hisopos finos estériles (Dacron) humedecido con solución salina y proceder a tomar la muestra desde los labios menores, introducirlo en medio de transporte Stuart o Amies o Amies con carbón - Utilizar otro hisopo para el extendido Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 47

Tabla No. 14 3.7.2.3 Aislamiento Primario - Proceder a realizar el inoculo en medios de cultivo como Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar MacConkey, Thayer Martin, Manitol Sal, rotando el hisopo sobre la superficie. - Con asa en argolla flameada y fría proceder a dispersar la muestra en cuatro cuadrantes a modo de tener colonias aisladas. - Incubar las placas de Agar Sangre, Chocolate y Thayer Martin a 3536°C en medio de CO2 por 24 horas Diagrama de identificación de N. gono- Las placas de MacConkey y Manitol Sal incubar- rrhoeae la a 35-#6°C en ambiente aerobiosis por 24 horas - Concluida las 24 horas observar crecimiento de colonias sospechosas, 3.7.2.4 Identificación de principales microorganismo Examen en Fresco: Informar la presencia de células descamativas, leucocitos y bacterias, presencia o ausencia de levaduras y de trofozooitos de Trichomonas vaginalis. Gram: Identificar células clave, que son células descamativas recubiertas por cocobacilos gram variable, Lactobacilos, presencia de polimorfonucleares, levaduras. Giemsa: Observar cuerpos de inclusión sugestivas de C. trachomatis. La técnica citológica tiene baja sensibilidad, pudiendo confirmar por medio de técnicas inmunológicas o ampliación de ácidos nucleídos.

3.7.2.4.2 Identificación de Gardnerella vaginalis Es un bacilo inmóvil no encapsulado de 0.5 por 1.5 a 3 mm, anaerobio facultativo, catalasa y oxidasa negativo. El diagnostico se basa en la presencia de al menos tres de cuatro criterios clínicos por Amsel:1) Descarga fina, blanca adherente y homogénea, 2) pH superior a 4.5, 3) 3.7.2.4.1 Identificación presuntiva de Prueba de Amina Positiva y 4) Células indicadoN. gonorrhoeae ras o célula clave Tabla No. 15 y Fig. 23 Diplococos gram negativo en pareja, tétradas o Prueba de Aminas: olor característico a pescado racimo en la tinción de gram, las colonias de color al añadir 1 gota de KOH a una gota de la secrerosada a café o grisáceas y brillantes de 0.5-1.0 ción. de diámetro en medios agar Thayer Martin, oxidasa positiva. Pruebas suplementarias típicas de N. gonorrhoeae son (Tabla No. 14 figura No. 22)

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 48

Tabla No. 15

3.7.2.4.3 Identificación de Streptococcus agalactiae Streptococcus agalactiae o Estreptococo grupo B de Lancenfield, es aerobio facultativo, gram positivo, diplococo que se agrupan en cadena, en agar sangre carnero al 5% crecen las colonias de color gris a blanquecino, brillantes y un poco más brillantes, produce beta hemolisis Tabla No. 16 y fig. 24.

3.7.2.4.4 Identificación de Candida albicans Se caracteriza por presentar colonias cremosas de color blanco-amarillento, lustroso poco elevado y de bordes bien definidos Figura No. 25 Tubos germinales - Suspender un inóculo de la cepa pura de candida de 24 horas de desarrollo en plasma humano fresco (plasma EDTA) - Incubar por 2 horas aproximadamente a 3536°C - Luego colocar dos gotas en un portaobjeto, cubrir con cubreobjeto, observar al microscopio con objetivo 40X - Interpretación: Positivo: visualiza una estructura elongada que se origina a partir de la levadura. Negativo: se ven las levaduras redondas sin elongación.

Tabla No. 16

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 49

3.8 Esputo de cultivo bacteriano 3.8.1 Propósito El esputo es un material mucoso que se segrega en los pulmones o bronquios. El cultivo de esputo está indicado para investigar infecciones respiratorias inferiores que pueden causar neumonía, bronquitis o tuberculosis. La neumonía bacteriana o infección pulmonar puede ser causada por: a. Neumonía Neumocóccica: el agente causal es el Streptococcus pneumoniae. b. Neumonía No Neumocóccica: el agente causal son Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, y ocasionalmente por otras enterobacterias. La muestra de esputo es muy importante para poder realizar una buena identificación por tal razón la muestra debe ser tomada adecuadamente y rechazar las muestras que estén contaminadas con saliva. 3.8.2 Recolección de la muestra y transporte Condiciones previas antes de la toma de muestra que el paciente no debe estar con terapia antibiótica, de preferencia la primera muestra de la mañana y no realizar gargarismos con antisépticos. Procedimiento - Indicar al paciente que se realice un lavado bucal con agua, no cepillar los dientes con pasta dental - Que el paciente se acuesta en la cama boca abajo, que desgarre con fuerza el esputo - Depositar la muestra en un frasco estéril de boca ancha - Enviar lo más pronto posible al laboratorio

Chocolate, Agar Manitol Sal y Agar MacConkey - Con un asa en argolla flamea y fría proceder a realizar los estriados a modo de obtener colonias aisladas - Incubar el Agar Sangre y Chocolate en medio de CO2 y los medios de Manitol Sal y MacConkey en ambiente aerobios a 35-36°C - Realizar frote para tinción de Gram y Ziehl Neelsen - Proceder a verificar colonias sospechosas de patogenicidad y realizar pruebas primarias y confirmatorias, y el antibiograma Valoración de la muestras es adecuada tomando en cuenta el criterio de Murria con un frote teñido de Gram. 3.8.3.1 Realización del frote del Esputo - Colocarlo una porción de la muestra sobre un portaobjeto y con otro portaobjeto colocarlo encimas y realizar leve presión luego deslizar los portaobjetos en direcciones contrarias, a modo de obtener frotes delgados - Dejar secar, y fijarlos con calor sobre el mechero pasando el portaobjeto tres veces - Realizar la tinciones solicitadas, tinción de gram y/o tinción de ziehl neelsen (ver Sec. 2.4) 3.8.3.2 Criterio de Murria Para evaluar que la muestra este correctamente tomada se debe realizar un frote gram observarlo al microscopio con objetivo seco débil (100x) evaluando las siguientes condiciones según el criterio de Murray y Washington donde son aceptables las muestras del grupo 4 y 5 Tabla No. 17: Tabla No. 17

3.8.3 Aislamiento primario - Proceder a inocular los medios de cultivo teniendo en cuenta todas las medidas de bioseguridad - Con un palillo estéril o asa flameada y fría seleccionar porciones del esputo que contenga sangre o pus - Inocular en Agar Sangre Carnero al 5%, Agar Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 50

3.8.4 Identificación de Principales Microorganismo 3.8.4.1 Identificación de Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae es el agente común de las enfermedades respiratorias bajas y altas, tales como neumonía y otitis media aguda, y meningitis.

3.8.4.2 Identificación de Haemophilus influenzae Es el agente etiológico más frecuente de enfermedades como neumonía, meningitis, otitis media y conjuntivitis. Son bacilos gram negativo, pequeños o cocobacilos, anaerobios facultativos, requieren factores de crecimiento X y V (X = hematin, V = nicotinamide adenine dinucleotide(NAD)), crecen en agar chocolate pero no en agar sangre de carnero y tienen un olor picante a indol, catalasa positivo, oxidasa positiva Figura No. 26

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 51

4 Anexos 4.1 Prueba de Catalasa Útil para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contiene citocromo, excepto Streptococcus sp. Material - Portaobjeto - H2O2 al 30% Procedimiento - En un portaobjeto colocar una gota de H2O2 al 30% - Tomar con una asa una colonia pura de 18-24 horas y extender la colonia sobre el agua oxigenada suave Positivo: formación de burbujas Negativo: no se observan burbujas - Descartar el portaobjeto en recipiente con desinfectante

4.2 Prueba de Coagulasa Prueba usada específicamente para diferenciar las especies del género Estafilococos.

La coagulasa es una enzima producida por S. aureus, estable al calor, resistente a temperaturas arriba de 60°C por 30 minutos. Material - Plasma EDTA - Portaobjeto o tubo Procedimiento En portaobjetos - Preparar una suspensión gruesa y bien homogénea de cada microorganismo en una solución salina estéril. - Colocar una suspensión de la bacteria con

una gota de plasma humano o de conejo sobre un portaobjeto - Mezclar suavemente con el asa y después por rotación - Observar si hay aglutinación microscópica indicando positiva la prueba Positivo hay aglutinación dentro 5 a 20 segundos Negativo no hay aglutinación dentro de 3-4 minutos En tubo - Tubo de vidrio estéril colocar 0.5 ml de una dilución 1:4 de plasma humano o de conejo - Tomar una asada de bacterias, rotar suavemente el tubo sin sacudir - Incubar por 4-6 horas observar a cada 30 minutos a 35°C - No sacudir el tubo en cada chequeo, inclinar el tubo suavemente para ir observando el coagulo. Positivo: formación de un coágulo Negativo: el plasma permanece líquido y no se formó el coágulo.

4.3 Prueba de Manitol Sal Procedimiento - Sembrar la bacteria a estudio en un medio manitol sal -Incubar a 36°C durante 18-24 horas Positivo: Presencia de crecimiento y cambio de color amarillo del medio indica utilización del manitol (S. aureus) Negativo: No hay cambio de color en el medio, permanece rosado o rojizo. (S. epidermidis )

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 52

4.4 Prueba de DNasa El Staphylococcus aureus, produce una DNAasa termoestable que hidroliza DNA. La producción de DNAsa puede determinarse incorporando ácido desoxirrubonucleico (DNA) en agar nutritivo Material - Agar nutritivo o agar DNAsa con azul de toluidina 0.1 gr/l - HCL 1% Procedimiento - Inocular la bacteria a estudio en mancha densa sobre el agar nutritivo - Incubar de 18 a 24 horas - Revelar con HCL 1% que precipita el DNA nativo del medio si se usa solo el agar Nutritivo Interpretación: Colonias rodeadas por una zona clara donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado es una prueba positiva. - Si se utiliza Agar DNasa, realizar una siembra espesa formando un pequeño círculo de aprox. 1 cm - Incubar a 36°C de 18-24 horas ambiente aeróbico Positivo: producción de un halo rosado alrededor de la colonia que produce DNAsa. Negativo: no hay cambio de coloración en el medio. Alrededor de la colonia permanece azul.

4.5 Prueba de Novobiocina Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la novobiocina. Procedimiento - Realizar una suspensión de la bacteria a estudio en caldo de tripticasa soya al 0.5 de MacFarland - Inocular en agar Mueller Hinton con la metodología de Kirby Bauer - Colocar el disco de novobiocina 5ug - Incubar a 37 °C por 24 horas - Un diámetro mayor o igual a 16mm de inhibición considerado como susceptible. Sensible: S. epidermides Resistente: S. saprophyticus

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 53

4.6 Prueba de Bacitracina A Esta prueba útil para el diagnóstico presuntivo de Streptococcus beta hemolítico del grupo A de Lancefield. Material - Agar Sangre Carnero al 5% - Disco de Bacitracina de 0.04 U Procedimiento - De una aislamiento puro de la colonia beta hemolítica, suspender en 1 ml de caldo tripticasa alcanzar una turbidez similar al 0.5 MacFarland - Con un hisopo realizar el inoculo en un agar sangre carnero al 5%, - Proceder a estriar en forma de tapete - Con una pinza flameada y fría colocar un fisco de Bacitracina 0.04 U (Taxo A) en el centro - Incubar por 16-24 horas en jarra con candela - Examinar y observar un halo de inhibición alrededor del disco de Taxo A.

4.7 Prueba de PRY (pirrolidonilarilamidasa) Es una prueba presuntiva tanto Estreptococos del grupo A como del grupo D. Reemplaza la prueba de Bacitracina y la prueba de tolerancia a la sal para Estreptococos del grupo A y especies de Enterococo respectivamente. La enzima detectada es la pirrolidonil arilamidasa Procedimiento - Inocular la bacteria a estudio en caldo de que

contenga PYR L-pirrolidonil-b-naftilamida - Incubar por 4 horas a 35°C - Luego agregar un colorante diazo (NN-dimetil-amino-cinamaldehído) Positivo: un desarrollo de color rojo positivo (Estreptococos del grupo A y Enterococos) Negativo: no hay cambio de color o se observa un color naranja Nota: algunos estafilococos pueden dar positiva la prueba.

4.8 Prueba de CAMP Prueba para identificación presuntiva de Estreptococos del grupo B (Streptococcus agalactiae beta hemolitico), es el único que produce una prueba de CAMP positiva. La prueba detecta una proteína extracelular estable al calor difusible producida por Estreptococos del grupo B que mejora la hemólisis de eritrocitos por el Staphylococcus aureus. Material - Cepa ATCC S. aureus ATCC 25923 - Agar Sangre de Carnero 5% Procedimiento - La cepa de S. aureus ATCC 25923 rayar una línea recta a través del centro de la placa de Agar Sangre Carnero. - Perpendicular a la raya del S. aureus realizar el inoculo de la bacteria a estudio realizando una línea recta de 2-3 cms de longitud, pero sin tocar. - Incubar la placa a 37°C durante 18 – 24 horas, en ambiente aeróbico. Positivo: aparece como hemólisis “punta de flecha” entre la unión del crecimiento del S. aureus y Estreptococos del grupo B. Negativo: no se observa la formación de flecha de hemólisis.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 54

Procedimiento - Una colonia aislada, sembrar en estría en la zona del pico de flauta. - Incubar a 35-36°C durante 24-48 horas Interpretación La aparición de un color castaño oscuro o negro en el medio indica hidrólisis de la esculina. Si no hay cambio se considera negativa la prueba

4.9 Prueba de Hidrólisis de Hipurato Detectar la capacidad de la bacteria de hidrolizar el hipurato mediante la enzima hipuricasa. La hidrólisis de hipurato dará como resultado glicina, que reaccionara con la ninhidrina provocando un cambio de color. Material - Tubos con 0.4 ml de hipurato de sodio al 1% Procedimiento - Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sódio con el microorganismo - Incubar por dos horas 36-37°C - Agregar 0.2 de ninhidrina, si agitar Positivo: Color morado fuerte ( S. agalactiae) Negativo: no hay cambio de color (S. faecalis)

4.11 Crecimiento de NaCl 6.5% Diferenciación de Streptococcus del grupo D con respecto a Enterococos. Procedimiento - Inocular 2 ó 3 colonias del microorganismo en el medio de caldo tripticasa soya + 6.5% de NaCl - Incubar a 35°C por 24-48 horas - Observar el caldo de cultivo Positivo: turbidez (enterococos) Negativo: limpio no se observa crecimiento

4.10 Bilis Esculina Propiedad de algunos microorganismos de hidrolizar el glucósido esculina en esculetina y glucosa, la esculetina producida reacciona con un sal de hierro incorporada al medio, dando un color castaño oscuro o negro. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 55

- Agregar 0.5 ml de solución salina al otro tubo Control 4.12 Prueba de Sensibilidad a Optoqui- - Agitar suavemente ambos tubos e incubarlos a na 35°C por 3 horas La prueba se utiliza un disco de 6mm con 5ug Positivo: Desaparece la turbidez del tubo prueba de optoquina, tiene como objetivo diferenciar (S. pneumoniae) Streptococcus pneumoniae de las de Estrepto- Negativo: permanece turbio. coco viridans. En Agar Procedimiento - Colonias aisladas en un agar sangre de car- Inocular una colonia alfa-hemolítica con un asa nero, agregar una gota de deoxicolato de sodio estéril en una placa de Agar Sangre Carnero al al 2% (diluir el reactivo al 10% 1:10 con agua 5%, extender la bacteria. destilada) - Colocar asépticamente un disco de optoquina - Sin invertir la caja incubar a 35°C por 30 minuo disco P sobre el estriado. tos - Incubar en ambiente de CO2 por 18-24 horas Positivo: las colonias desaparecen dejando una a 36°C. zona de hemólisis parcial en el área donde se - Interpretar los resultados encontraban. (S. pneumoniae) Sensible: presencia de un halo mayor a 14mm Negativo: Las colonias son insolubles y perma(S. pneumoniae), si se usa disco de 10 mm el necen intactas. (Estreptococos del grupo virihalo será mayor o igual a 16mm dans) Resistente: No hay presencia de halo de inhibición son estreptococos viridans

4.13 Solubilidad en Bilis La prueba de solubilidad en bilis es otra prueba para identificación de S. pneumoniae. Procedimiento En tubo - Transferir 0.5 ml de un cultivo de 18-24 horas de un caldo TOdd Hewitt a dos tubos limpios. - Agregar una gota de rojo de fenol a cada uno de los tubos - Ajustar el pH a 7 con NaOH 0.1N - Agregar 0.5ml de doxicolato de sodio al 10% a uno de los dos tubos (Prueba)

4.14 Prueba de Satelitismo Se conoce como satelitismo al fenomeno de H. influenzae de crecer en colonias diminutas cercanas a una bacteria productora de factor V cuando se cultiva en agar sangre de carenro. Esto ocurre generalmente con Staphylococcus beta hemolítico porque produce altas cantidades de factor V (NAD). Procedimiento -En un agar Sangre de Carnero al 5% estriar en toda la superficie en una sola dirección de Haemophilus.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 56

- Tomar una asada de un cultivo de Staphylococcus aureus o beta hemolítico, realizando una estria perpendicular al sembrado. - Incubar en jarro con canderla o en CO” por 24 horas a 36°C, - Luego examinar el crecimiento de pequeñas colonias puntiformes muy cerca de la estria de estafilococo.

5 Bibliografía

4.15 Factor de Crecimiento XV Esta prueba de utilizar medios sin factor X y V, como agar de soya basa triptona o agar caldo infusión de corazón. Material - Caldo de tripticasa soya o Caldo de infusión de Corazón - Agar de Soya base Triptona o Agar Caldo Infusión de Corazón - Discos de Factores X, V y XV Procedimiento - Preparar en un caldo adecuado (caldo tripticasa soya o caldo infusión de corazón) una suspensión densa de células a evaluar al 0.5 del estándar del McFarland - Inocule una placa de Agar de Soya base Triptona o Agar Caldo Infusión de Corazón, con un hisopo o asa estéril, estriar la suspensión sobre el agar en dos direcciones - Colocar los discos de papel que contienen los factores X, V y XV después del inoculo se haya secado - Invertir la placa con cuidad y ponerla a incubar en ambiente de CO2 o en una jarra con vela, durante 18-24 horas a 35°C. - H. influenzae crecerá alrededor del fisco XV

1. Alados, JC., et al. Procedimientos en Microbiología Clínica. Diseño de un laboratorio de Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2009. Disponible en: https://www.seimc.org/contenidos/ documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/ seimc-procedimientomicrobiologia33.pdf 2. Bacteria Gram Negativa. Wikipedia Enciclopedia libre. Disponible en:. https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_ Gram_negativa 3. Bacteria Gram Positiva. Wikipedia Enciclopedia libre. Disponible en: https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_ Gram_positiva 4. BD. XLD Agar (Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar) Instrucciones de uso –Medios en placa listos para usar. Abril 2013. http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8783 5. Bordetella pertusis. Microbios en la Red. Disponible en: http://www.losmicrobios.com.ar/microbios/?page_ id=1258 6. Britania Lab. Chistensen Medio (Urea Agar Base). Disponible en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/ b02/christensemed.htm 7. Candida albicans. Microbiology in pictures. Disponible en: http://microbiologyinpictures.com/bacteria-photos/ candida-albicans-photos/candida-blood-agar.html 8. Cercenado, E. Cantón, R. Diagnóstico Microbiológico de las Infecciones del Sistema Nervioso Central. Procedimientos de Microbiología Clínica. Seimc. 2010. Disponible en: http://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/ procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia36.pdf

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 57

9. Coprocultivo. Bacterias. Disponible en: http://bactteriias.blogspot.com/2010/05/coprocultivo.html 10. Corynebacterium diphteriae, Bordetella pertusis.. Disponible en: https://www.clubensayos.com/Ciencia/ Corynebacterium-Diphteriae/2354004.html 11. Cultivo de Flujo Endovaginal y Endocervical. Laboratorios IDAC. Disponible en: http://www.idac-laboratorios. com.ar/cultivo-de-flujo-vaginal-y-endocervical/ 12. Fernandez, H. Esquema simple para la identificación de bacilos Gram negativos. Disponible en: http://www. researchgate.net/publication/278032874_1978-_Esquema_simple_para_la_identificacin_de_bacilos_Gram_negativos 13. Galería fotográfica de bacterias. Disponible en: http:// www.bacteriainphotos.com/bacteria-photo-gallery.html#proteus 14. Gardnerella vaginalis. Ecured. Disponible en: http:// www.ecured.cu/index.php/Gardnerella_vaginalis 15. Gonzales,S. Pruebas Bioquimicas para Enterobacterias. Presentacion. Disponible en: http://es.slideshare. net/SusanaGG/pruebas-bioqumicas?next_slideshow=1 16. Manual de Diagnostico Bacteriológico. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/6617222/Manual-de-Bacteriologia#scribd 17. Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo . Disponible en: http://www. who.int/drugresistance/infosharing/WHO-CDS_CSR_ RMD_2003_6_Manual_Laboratorio.pdf 18. Manual para la Identificación de Hongos. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/13650507/Manual-PARA-LA-IDENTIFICACION-DE-HONGOS#scribd 19. Martín, I. Diversidad Microbiana y Taxonomía. Departamento de Microbiología de la UGR. Universidad de Granada. Disponible en: http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&view=article&id=39&Itemid=58 20. Medios Diferenciales. Laboratorio Clínico. Perú. 2014. Disponible en: http://andres-laboratorioclinico. blogspot.com/

22. Mycrobiology lab Tutorial. Disponible en: http://iws2. collin.edu/dcain/CCCCD%20Micro/salmonellashigella_ plates.htm 23. Mycrobiology Notes. 2015. Disponible en: http:// www.microbiologyinfo.com/xylose-lysine-deoxycholate-xld-agar-principle-uses-composition-preparation-and-colony-characteristics/ 24. Pachón, D. Tesis: Aislamiento, Identificación, Serotipificación de Enterobacterias del Género Salmonella. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá Colombia. 2009. http://javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis198.pdf 25. Pírez, M., Mota, M. Morfología y Estructura Bacteriana. Uruguay, 2008. Disponible en: http://www.higiene. edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf 26. Sacsaquispe, R., Ventura, G. Manual Procedimientos Bacteriológicos en Infecciones Intra Hospitalarias. Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Series de Normas Técnicas No. 28. Lima, Perú 2005. 27. Salmonella, Shigella, Vibrio y E. coli. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/46120099/Salmonella-Shigella-V-Cholerae-y-E-Coli#scribd 28. Salmonella. Wikipedia Enciclopedia libre. Disponible en: https://es.wikipedia.org/wiki/Salmonella 29. Sanchez, JA., et, al. Diagnóstico clínico, de laboratorio y tratamiento de la vaginosis por Gardnerella vaginalis. Disponible en: http://med.javeriana.edu.co/publi/vniversitas/serial/v48n4/5-VAGINOSIS.pdf 30. Shigella. Wikipedia Enciclopedia libre. Disponible en: https://es.wikipedia.org/wiki/Shigella 31. Staphylococcus aureus, S. epidermidis, y S. saprophyticus. 2011. Disponible en: https://microbitos.wordpress.com/2011/08/03/staphylococcus-aureus-epidermidis-saprophyticus/ 32. Técnicas de tinción. Fundamentos. Disponible en: http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm 33. Tinción de Gram. Disponible en: http://www.pucmmsti. edu.do/websise/estudiante/materias/201220132/ST-BIO231-P-071/BIO-231%20PRACTICA%202%202-12-13. pdf 34. Tinción de Gram. Wikipedia Enciclopedia libre. Disponible en: https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_ de_Gram

21. Merino, L.A. Estructura Bacteriana. Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional del Nordeste. Disponible en: http://ecaths1.s3.amazonaws.com/catmicromed/APUNTE%20Morfologia%20 bacteriana.pdf Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 58

35. Tinción de Ziehl-Neelsen. 2011. Disponible en: http:// estudiemedicina.blogspot.com/2011/06/ziehl-neelsen. html 36. Tinciones Acido Resitentes. Disponible en: http:// www.slideshare.net/davidguevapaza/tm-tinciones 37. Tinciones. Disponible en: doc/109235847/Tinciones#scribd

http://es.scribd.com/

38. Tos ferina. Wikipedia Enciclopledia Libre. Disponible en: https://es.wikipedia.org/wiki/Tos_ferina 39. Vargas,C. Aislamiento, Identificación y Cuantificación de Vibrio Cholerae en Agua Potable, Aguas Superficiales y Residuales. Disponible en: http://www.bvsde.paho.org/ eswww/fulltext/repind41/Aisla/Aisla.html 40. Velasco J., et al. Manual práctico de Bacteriología Clínica. Publicaciones Vicerrectorado académico. 2015. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/274322371/Manual-de-Bacteriologia#scribd 41. Vilchez, H.A. Manual de Prácticas de Microbiología Aplicada. Universidad Inca. Lima Perú 2010. Disponible en: http://es.slideshare.net/Prymer/gua-micro-aplicada?next_slideshow=1

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 59

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TAMIZAJE, AISLAMIENTO, IDENTIFICACION Y SENSIBILIDAD DE MICOBACTERIAS Rosa Alvarez, Diana Baldizon Margarita Boloix, Hèctor Catú Lis Jerez, AnaLucia Lemus

1. INTRODUCCION En la última década, la tuberculosis (TB) ha resurgido como una de las mayores causas de muerte ya que anualmente se registran cerca de 3 millones; en 1995 causó más de 75,000 muertes en Latino América y el Caribe, lo cual significa que cerca de 1,100 personas enfermaron y más de 200 murieron por TB cada día. Se estima que existen 8.8 millones de nuevos casos cada año que corresponden a 52,000 muertes por semana o más de 7,000 cada día, lo que se traduce en más de 1,000 nuevos casos cada hora, cada día. Estas tasas de muerte reflejan solo parcialmente la tendencia global de la TB, ya que más del 80% de los pacientes se encuentran en la edad económicamente activa (15 – 49 años). Se estima que en el año 2000, 2 mil millones de personas se encuentran infectadas con M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium, 3 millones de personas mueren anualmente por complicaciones de tuberculosis en todo el mundo. Se calcula que hay 8 millones de nuevos casos cada año, el 95% de los cuales aparecen en países en vías de desarrollo. En los países industrializados, el 80 % de los casos aparecen en personas mayores de 50 años; en los países en vías de desarrollo el 80% se produce entre los 15 y los 50 años. Se estima que 3 millones de personas que padecen tuberculosis también tienen VIH/SIDA. Existen factores predisponentes en los países en vías de desarrollo como: Inmigración de personas de zonas de alta endemicidad. Condiciones socioeconómicas bajas en ciudades con alta población. Aumento de personas infectadas con VIH/SIDA. Durante las primeras décadas del siglo XX, se dio una disminución progresiva de la incidencia de la tuberculosis, y alcanzó su menor nivel a comienzos de la década de 1980. Muchos microbiólogos pensaron que la tuberculosis estaba por ser vencida, dado que la enfermedad alcanzó la línea basal de cero en muchas partes del mundo a fines de la década de los 70’s. Pero sucedió todo lo contrario. Actualmente las tasas de morbilidad y mortalidad han aumentado, con el aparecimiento de cepas resistentes de Mycobacterium a múltiples drogas y por el VIH/SIDA. Para Guatemala la Organización Mundial de la Salud (OMS) reportó una tasa de incidencia de 80 por cada 100,000 habitantes en el año 2000. La epidemia del Síndrome de Inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y el descenso de los estándares socioeconómicos, entre otros, contribuyen al resurgimiento de la enfermedad en países industrializados. Aunque en la mayoría de los países en desarrollo, la TB ha sido siempre endémica, su severidad se ha incrementado debido a la pandemia del Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) y a los niveles de pobreza imperantes. La situación de la TB a nivel mundial se ha agravado con el aparecimiento de cepas multirresistentes a las drogas antituberculosas, que incrementan las tasas de mortalidad y representan un serio problema para el control de esta enfermedad, por ello la realización de una susceptibilidad antibiótica con un perfil delimitado de antibióticos es de gran ayuda para poder evitar y/o disminuir la multirresistencia y poder brindar tratamientos efectivos. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 60

La TB puede ser tanto pulmonar, que es la más común y ocurre en más del 80% de los casos, 2. GENERALIDADES como extrapulmonar. Es importante mencionar La TB es una enfermedad infecciosa aguda o que aproximadamente un 90% de las personas crónica que en nues- que se infectan nunca desarrollan la enfermetro medio es la infec- dad ya que el bacilo permanece “dormido” dención humana más im- tro del organismo del huésped y su presencia portante causada por (infección) puede determinarse por una reacmicobacterias puede ción positiva a la prueba tuberculínica ó PPD afectar a cualquier (derivado proteico purificado). Además es netejido del organismo cesario poder determinar la presencia de la enpero generalmente se fermedad para poder minimizar la cantidad de localiza en los pulmo- pacientes con cepas resistentes a los medicanes por la inhalación mentos antituberculosos y poder disminuir con del agente causal que por lo general es Myco- ello la cantidad de enfermos bacilíferos crónicos bacterium tuberculosis (muy rara vez M. bovis o en las comunidades. M. africanum). El nombre de Tb deriva de la formación de unas estructuras celulares caracte- 3. PROPÓSITO E IMPORTANCIA rísticas denominadas tuberculomas, donde los bacilos quedan encerrados. Este microorganis- La finalidad primordial es demostrar por medio mo, tiene forma bacilar, es aerobio estricto, de de coloraciones, pruebas de tamizaje, cultivos crecimiento lento, inmóvil, no poseen cápsula especiales y pruebas de identificación la preni producen esporas, se tiñe con dificultad por sencia de bacterias que pertenecen al género su contenido alto de grasas en la pared celular Mycobacterium, especialmente Mycobacterium por lo que el colorante a utilizar debe poseer tuberculosis. Aproximadamente doce especies fenol y/o realizarse con calor por lo que una vez de éste género se asocian a infección humana, teñidas con fuchsina carbólica (fenolada) no se pero en nuestro medio Mycobacterium tubercudecoloran al agregar el alcohol acidificado y de losis es la especie de mayor importancia. allí el término “Bacilos alcohol ácido resisten- La detección de micobacterias es una gran restes” (BAAR). Es resistente al frío, la congela- ponsabilidad para el laboratorio de microbioloción y desecación. Es muy sensible al calor, la gía, ya que un resultado positivo de frote o cultiluz solar y ultravioleta. Se divide lentamente, vo implica serias consecuencias para el paciente y afecta su vida con un tratamiento específico por lo que su crecimiento es lento. por varios meses, o incluso años; por lo que un La TB se transmite de un enfermo con tubercu- resultado positivo debe informarse de inmediato losis pulmonar a otras personas por medio de al médico responsable. Se debe tener todo el pequeñas gotitas que el paciente expulsa, al to- cuidado de no confundir las muestras, especialser o estornudar. El riesgo a infectarse depen- mente cuando hay en grandes cantidades; se de de la concentración de gotitas en el aire y recomienda trabajarlas de cinco en cinco. Esto del período de tiempo que se respire; se reduce evitara que se den resultados falsos ya que los mediante la renovación del aire, por ventilación mismos traerían serias consecuencias para el paciente. del exterior y por la expo3.1. TUBERCULOSIS PULMONAR Y TUsición a la luz BERCULOSIS EXTRAPULMONAR solar o rayos El diagnóstico de la TB extrapulmonar depende ultravioleta. de la probabilidad de encontrar los bacilos en Cada enfermo los sitios de infección, los cuales se encuentran puede contaen cantidades muy pequeñas, excepto si hay giar a 10 a 15 caseificación o formación de cavidades, personas. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 61

4.1. Nivel I las biopsias del tejido pueden rendir resultados positivos en comparación a los fluidos en donde el número de los bacilos se ve disminuido por la dilución. El diagnóstico de la TB extrapulmonar es difícil a menudo por su localización en sitios del organismo de acceso complicado, además el carácter serio de esta forma de tuberculosis se debe frecuentemente a su diagnóstico tardío. Previo a la pandemia del VIH, aproximadamente el 15% de los nuevos casos de TB eran extrapulmonares. Estos casos son de difícil diagnóstico, dado que son menos comunes a los médicos y porque los sitios de infección son menos accesibles y visibles. La TB extrapulmonar más frecuente son la linfática, pleural, genitourinaria, miliar, ósea, meníngea y peritoneal. Los pacientes con TB pulmonar activa son altamente infecciosos para otros pacientes y para el personal de cuidados de salud, como ya se ha mencionado en la parte de introducción del presente trabajo. Este tipo de transmisión se asocia a desarrollo rápido de la enfermedad en unas cuatro semanas, con mal pronóstico. De igual manera este tipo de transmisión contribuye en los casos de alta resistencia. . El aumento de casos de Tb extrapulmonar, crea la necesidad de un mejor diagnóstico y nuevas técnicas para el aislamiento y susceptibilidad micobacteriana, estableciendo como punto crítico el menor tiempo posible para el aislamiento y la información sobre la drogo resistencia de las micobacterias. 4.NIVELES DE LABORATORIO Los niveles de laboratorio en micobacteriología han sido adoptados por la Sociedad Torácica Americana (American Thoracic Society), la cual ha establecido tres niveles de la siguiente manera:

Realiza lo siguiente: a. Recolección de muestras clínicas adecuadas (incluyendo esputo inducido por aerosol). b. Transporte y envío de muestras a un laboratorio de nivel superior para el aislamiento e identificación. c. Puede preparar y examinar frotes para el diagnóstico presuntivo y/o como monitoreo del progreso de los pacientes diagnosticados que están siendo tratados con medicamentos. 4.2. Nivel II Además de todas las funciones del laboratorio Nivel I, realiza lo siguiente: a. Procesa muestras para su cultivo en medios a base de huevo y medios a base de agar y huevo. b. Identificación de Mycobacterium tuberculosis c. Puede realizar estudios de susceptibilidad antimicrobiana con drogas antituberculosas primarias d. Retiene cultivos de micobacterias para test adicionales o repetición de pruebas (se recomiendan 6 meses de retención) 4.3. Nivel III Además de las funciones de los laboratorios I y II, realiza lo siguiente: a) Identificación de todas las especies micobacterianas de muestras clínicas b) Puede realizar estudios de susceptibilidad antimicrobiana de micobacterias c) Puede dirigir investigaciones y brindar entrenamiento. 5. TOMA DE MUESTRA Y PROCEDIMIENTOS POR TIPO DE MUESTRA TOMA DE MUESTRA Actualmente se realiza la implementación de técnicas que producen resultados exactos y precisos en menor tiempo. El motivo principal es el mejoramiento de la calidad del servicio que se le presta al paciente y al sistema hospitalario.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 62

Para lograr esto es necesario que todo el personal médico y de enfermería encargado de la obtención y extracción de muestras conozca los procedimientos estandarizados para tales propósitos, a manera de evitar falsos resultados.

mal que contamina la orina a su paso, de tal manera que la orina por micción contiene un pequeño número de bacterias. Debido a que es necesario distinguir los microorganismos contaminantes de los etiológicamente importantes, se debe de efectuar un examen cuantitativo de orina para que los resultados puedan ser significativos. Para una selección y recogida correctas de material de cultivo es necesario comprender las localizaciones, variedades y papel de la microbiota normal de la región urinaria. 5.1.2. Toma de Muestra La toma de muestra de orina es muy importante, pues la veracidad de los resultados depende casi en un 100% de la forma correcta en la cual se recolectó la muestra.

Es preciso entonces, establecer la responsabilidad e importancia de la TOMA DE MUESTRA, ya que resulta ser la clave en el aislamiento de TABLA No 1. BACTERIAS COMUNES EN cualquier microorganismo, depende de esta en VIAS GENITO-URINARIAS un 100% obtener resultados satisfactorios, en menor tiempo, lo que conduce a un tratamiento efectivo del paciente. Para obtener un buen resultado en el aislamiento de microorganismos, en especial de micobacterias, es preciso comenzar con una buena toma de muestra, tener una buena estandarización en el preparado de medios de cultivo, con los que se hará el aislamiento correcto para tener una identificación posterior. La pureza del aislamiento determinará el éxito de la sensibilidad y por consiguiente del tratamiento del paciente. 5.1. MUESTRAS DE ORINA 5.1.1. Propósito e importancia En la actualidad, el examen de micobacterias en la orina se hace cuando hay signos o síntomas de una tuberculosis renal, insuficiencia renal o hipertensión. Debe hacerse siempre en personas, en que se sospecha infección general y ya ha sido comprobado que no es de tipo bacteriano, o tengan antecedentes de tuberculosis. Washington JA. Bacteriología Médica. En Lynch MM La orina excretada por el riñón es estéril a me- Diagnóstico Clínico por el laboratorio +/- Irregular + común ++ predominante nos que el riñón este infectado. La orina de la vejiga no contaminada también es estéril. Sin embargo, la uretra contiene una microbiota norRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 63

5.1.2.1. Chorro medio u orina al vuelo Hombre: • Limpiar el meato urinario con agua y jabón. • Colectar la orina a la mitad de la micción en un recipiente estéril tratando de que la orina no toque la boca del frasco. • Llevar la orina al laboratorio.

inyectar la muestra en un tubo expulsando las burbujas de aire que pueda contener la jeringa, y se lleva de inmediato al laboratorio. Este tipo de muestra constituye la única muestra de orina aceptable para cultivos anaerobios, se indica únicamente en pacientes con bacteriuria anaerobia. Este tipo de infección es rara y se sospecha su existencia cuando aparecen cultivos negativos de especimenes con frotes positivos para tinción de Gram.

Mujer: • Limpiar la vulva con bastante agua y jabón, teniendo cuidado de quitar bien el jabón. • Secar el área. • Separando los labios, colectar la orina a la mitad de la micción en un recipiente estéril tratando de no topar la boca del frasco con los labios. • Llevar la orina al laboratorio.

5.1.2.4. Catéter

Niños: • En los niños pequeños para evitar al máximo la contaminación es necesario limpiar la región genital con agua y con jabón y/o con solución salina. • Colocar la bolsa estéril sobre la región. • En el momento de obtener la muestra, retirar cuidadosamente la bolsa, de manera que la orina no se escurra. • Cerrar la bolsa y llevar inmediatamente al laboratorio.

Como se mencionó con anterioridad la orina es estéril, pero también puede encontrarse contaminada con alguna bacteria además de encontrarse presente la micobacteria. Por lo que toda muestra de orina debe pasar por un proceso de decontaminación.

5.1.2.2. Sondas permanentes

NO es aconsejable debido al riesgo de bacteriuria asociada al procedimiento. El riesgo es del 1% en hombres y mujeres ambulatorias, y hasta el 20% en mujeres en trabajo de parto. 5.1.3. Procesamiento de la muestra

5.1.4. Requerimientos e instrucciones especiales de muestra de orina a. Recolectar 40 ml de orina como mínimo b. No debe ser recolección por fracciones, ni orina de 24 horas c. La primera orina de la mañana d. Tomarla con todas las medidas asépticas señaladas con anterioridad e. Utilizar un frasco estéril, de boca ancha. f. Si se trata de un bebé se tomará en una bolsita pediátrica. g. El protocolo de evaluación es enviar cinco muestras de forma seriada

En caso de tenerse un catéter a permanencia con un sistema cerrado de colección, obtener la muestra: a. Limpiar el área del catéter o sonda con antiséptico. b. Utilizando una aguja y jeringa estériles introducir en el área desinfectada. c. Dejar la muestra dentro de la jeringa. NO trasvasar a un recipiente estéril. 5.1.5. Preparación de la muestra pred. NO recolectar la muestra de la bolsa o des- vio a la elaboración de frotes conectando el catéter del tubo de recogida. a. Mezclar cuidadosamente la muestra a mane5.1.2.3. Punción o aspirado suprapúbi- ra de obtener una muestra representativa co b. Transferirla a un tubo con tapón de rosca. Utilizar la mayor cantidad posible En este procedimiento se obtiene la muestra. c.Centrifugarla por 15min a 3000rpm Directamente de la vejiga. Se recolecta con aguja y jeringa estériles; se efectúa la punción; Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 64

tivo para la recuperación de micobacterias de muestras sanguíneas y MO. El medio incluye d. Descartar el sobrenadante con cuidado de un agente lítico (saponina), SPS y otros supleno perder la mayor cantidad de sedimento mentos que eliminan el paso de procesamiento, e. Tomar con una pipeta de vidrio 1 gota del se- evitan la coagulación de la sangre y mejoran dimento y colocarla en un portaobjetos, esperar el crecimiento de las micobacterias. Se puede a que se seque dentro de la campana (repetirlo inocular directamente un volumen de 3 a 5 ml por 3-5 veces) a manera de obtener un frote de sangre, y se incuban entre 35°C – 36°C. que contenga una cantidad representativa Las botellas contienen 29 ml de medio y un senf. Esperar a que se seque por lo menos 10 mi- sor interno que detecta dióxido de carbono como nutos para evitar que se lave al teñir indicador de crecimiento microbiano. El sistema registra lecturas cada 10 minutos. 5.2. MUESTRAS DE SANGRE Y MÉDULA ÓSEA REACTIVOS En condiciones normales la sangre y la médula ósea (MO) son estériles. Debido a que la piel normal está cubierta de abundante microbiota normal es muy importante tomar la muestra en condiciones totalmente asépticas. NOTA IMPORTANTE: Todos los especímenes deben de considerarse potencialmente infecciosos, por lo que deben de tenerse en cuenta las medidas universales para su manipulación y desecho adecuado. Observaciones importantes La recuperación de micobacterias en un hemocultivo depende de los siguientes factores: • Obtención de la muestra de sangre en condiciones asépticas. • Cantidad de sangre cultivada y momento de la toma de muestra. • La relación entre la sangre y el caldo de cultivo, la cual debe ser 1:10, es decir sangre al 10%. • Se debe de tomar el hemocultivo antes de iniciar un tratamiento con antibióticos 5.2.1. Medio de cultivo para aislamiento de micobacterias de muestras de sangre y Médula Ósea

a. Botellas de tapón negro BacT/Alert MB: frascos estériles y desechables, contienen 29 ml de medio y un sensor interno que detecta dióxido de carbono como indicador del crecimiento bacteriano. NO AIREAR LAS BOTELLAS. El medio contiene: • Caldo Middlebrook 7H9 (0.47% p/v) • Síntesis pancreática de caseína (0.1% p/v) • Glicerol (1.0% p/v) • SPS (0.025% p/v) • Agua purificada b. Líquido de enriquecimiento MB7BacT: El contenido total del frasco es de 5.5 ml. Se compone de: • Albúmina sérica bovina (14.5% p/v) • Cloruro Sódico (2.5% p/v) • Ácido oleico (0.174 % p/v) • Saponina (4.4% p/v) • Agua purificada c. Suplemento de antibióticos: Requiere de dos componentes los cuales se complementan:

Botellas de tapón negro para aislamiento de micobacterias tanto de sangre como de MO. Las botellas BacT/ALERT MB en combinación con el Líquido de enriquecimiento y el suplemento de antibióticos son un medio de cultivo selecRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 65

vena y obtener asépticamente 3ml-5ml de sangre. g. Inyectar la sangre en la botella que contiene el caldo. Se debe de inyectar la sangre suavemente sin hacer presión en el émbolo, de manera que se evite la hemólisis que puede interferir en el momento de la interpretación de la positividad del cultivo. h. Después de obtenida la muestra, llevar los frascos al laboratorio lo más rápidamente posible. Antes de transcurridos 30 minutos. En el Conservación del medio de cultivo Botellas para transcurso de este tiempo se le debe agregar obtención de la muestra. tanto el suplemento antibiótico como el líquido Conservar los frascos en un lugar seco, fres- de enriquecimiento, una vez transcurrido este co, en oscuridad y a temperatura ambiente. NO tiempo, no tendrá ningún valor para la muestra REFRIGERAR. Una exposición prolongada a el agregar ambos constituyentes. la luz directa podría alterar el indicador fluores- i. NO REFRIGERAR por ninguna razón. cente. j. Colocar la identificación correspondiente en el Por ningún motivo deben de airearse las bote- frasco utilizando ÚNICAMENTE la zona desllas. tinada para ello. NO COLOCAR MASKING TAPE, MICROPORE, o cualquier otro tipo de 5.2.2. Toma de muestra de sangre y tape alrededor del frasco. Médula Ósea Procedimiento para toma de muestra de Médula Procedimiento para toma de muestra de sangre Ósea. por venopunción. a. Las muestras de médula ósea para cultivo a. Tomar la botella para micobacterias. Revisar de micobacterias siempre deben ser obtenidas y examinar los frascos con el fin de eliminar por el médico, quien puncionará el esternón o cualquier frasco que presente signos de con- la cresta ilíaca. Procesar exactamente igual que taminación o defectos. Identificar con los datos para muestra de sangre. del paciente. b. Tomar la muestra tomando todas las medidas b. Tomar la botella, Retirar la cápsula o tapón asépticas necesarias de protección que se encuentra en el tapón del c. De la PRIMERA FRACCIÓN obtenida inofrasco. NO DESCARTARLA, y con algodón cular las cajas de petrí que contienen agar Saempapado en solución yodada al 3% en alco- bouraud, Micosel y Micosel con sangre ya que hol (tintura) limpiar perfectamente bien el tapón ésta es la porción más rica en lo que a celulariperforable. Dejar secar mientras se atiende al dad se refiere. paciente. d. De la SEGUNDA FRACCIÓN inocular un c. Extraer las muestras de manera aséptica con volumen de 3 a 5 ml en las botellas para culel fin de reducir los riesgos de contaminación. tivo BacT/ALERT MB que en combinación con Utilizar en general una jeringa o un dispositivo el Fluido de enriquecimiento y el suplemento de de toma de muestra con cánula antibióticos son un medio de cultivo selectivo d. Colocar la ligadura en el brazo del paciente; para la recuperación de micobacterias de muespalpar la vena y localizar exactamente el sitio tras sanguíneas y otros líquidos de la punción. e. Si va a llevarse en jeringa debe ser la mayor e. Limpiar el sitio exacto donde se localizó la cantidad posible con un anticoagulante como vena con un algodón empapado de tintura de SPS ó heparina en relación 1:1 (No utilizar yodo al 3%. con movimientos en círculo, hacien- EDTA) do una espiral que inicia en el sitio de punción f.Transportarlas a temperatura ambiente al laboy termina en la parte de afuera. NO vuelva a ratorio durante la primera hora luego de la toma palpar la vena. Dejar secar. de muestra (NO REFRIGERARLAS) f. Con aguja y jeringa estériles, puncionar la Manejo del suplemento antibiótico ya reconstituido: • Reconstituir con 10 ml del líquido reconstituyente. • Guardar en refrigeración una vez reconstituido de 2-8ªC • Es estable 7 días después de reconstituido. • Un vial de 10 ml de antibiótico reconstituido alcanza para 20 botellas.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 66

5.2.3. Precauciones para el uso de los frascos a. Los frascos de cultivo de micobacterias son para uso in vitro. b. Antes de utilizarlos los frascos deben ser observados. NO utilizar frascos que presenten signos de contaminación, Ej.: color amarillo o turbidez. No utilizar frascos que presenten algún daño. c. No pegar nada sobre la ventana de lectura, y tampoco sobre el código de barras. Utilizar UNICAMENTE la zona de identificación. d. No descartar la cápsula o tapón de protección. Colocarla en el frasco nuevamente después de haber inoculado éste. e. Antes de inocular la botella desinfectar el tapón con alcohol o solución yodada. f. Inyectar asépticamente con la aguja montada en la jeringa, el volumen necesario de sangre, teniendo cuidado de NO PRODUCIR HEMÓLISIS ya que esta interfiere en la lectura de los frascos. g. Los frascos inoculados deben de ser transportados al laboratorio en el menor tiempo posible. h. NO ABRIR EL FRASCO POR NINGÚN MOTIVO. 5.2.4. Tratamiento de la muestra en el laboratorio Una vez que la botella ha sido ingresada correctamente al laboratorio proseguir de la siguiente manera: a. Chequear que los datos del paciente estén completos, tanto en la papeleta de ingreso como en la botella. b. Identificar las pruebas que se le realizarán a la botella y si es el medio adecuado para ello. Botellas de tapón negro para cultivo y aislamiento de micobacterias. c. Retirar la tapa de protección y limpiar con alcohol el tapón perforable. d. Agregar 1.0 ml de líquido de enriquecimiento con una jeringa estéril en forma aséptica. e. Posterior al líquido de enriquecimiento, agregar 0.5 ml de Suplemento de antibiótico (esta solución debe de sacarse de la refrigeradora y

alcanzar la temperatura ambiente) con una jeringa estéril en forma aséptica. f.NO DEBEN DE TRANSCURRIR MAS DE 30 MINUTOS PARA AGREGAR EL LIQUIDO DE ENRIQUECIMIENTO Y EL SUPLEMENTO ANTIBIÓTICO, DESDE EL MOMENTO EN QUE FUE TOMADA LA MUESTRA. Un mayor tiempo puede alterar los resultados. g. Luego de haber tratado las botellas (líquido de enriquecimiento y suplemento antibiótico) introducir la botella en el equipo BacTAlert 3D y registrarlo, asignándole una posición. h. Registrar la posición y completar la hoja de registro con los datos correspondientes. i. Llenar la hoja de trabajo adjuntando la papeleta y colocarla en su cartapacio respectivo. j. Leer diariamente la botella durante 42 días. k. Si el equipo da alarma de positivo, sacarlo y colocar en la hoja de registro la fecha y la hora a la cual dio positivo. Hacer frote de Ziehl Neelsen y reportarlo. l. Si el cultivo es negativo, luego de 42 días de incubación, hacer un frote de ZN al caldo de la botella, si es negativo, reportarlo negativo. Anotar en la hoja de registro la fecha y la hora. 5.2.5. Preparación de la muestra previo a la elaboración de frotes SANGRE Y MÉDULA ÓSEA a. Transferir a un tubo estéril con tapón de rosca b. Centrifugar la mayor cantidad de la muestra posible por 15min a 3000rpm c. Descartar el sobrenadante con mucho cuidado porque la mayor de la parte como su nombre lo indica es líquida d. Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar el frote e. Si es Líquido Cefalorraquídeo: tomar con una pipeta de vidrio 1 gota del sedimento y colocarla en un portaobjetos, esperar a que se seque (repetirlo por 3-5 veces) f.Hacer la tinción 5.3. MUESTRAS DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO, LAVADOS Y OTROS LÍQUIDOS CORPORALES 5.3.1. Propósito e importancia

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 67

El diagnóstico rápido, temprano y preciso de meningitis tiene un lugar predominante entre las urgencias médicas. Depende en alto porcentaje de mantener un elevado índice de sospecha, de obtener en forma adecuada las muestras y examinarlas a la mayor brevedad. Debido al elevado riesgo de muerte y/o daño tisular irreversible, a menos que se inicie un tratamiento inmediato, rara vez hay una segunda oportunidad de obtener una segunda muestra pretratamiento, lo que hace esencial la primera muestra para el diagnóstico etiológico específico y óptima atención al paciente. El dato diagnóstico más urgente es la diferenciación entre la meningitis bacteriana purulenta y la meningitis granulomatosa y la meningitis viral. Las muestras que se incluyen dentro de Líquidos corporales son: • Líquido cefalorraquídeo (LCR) • Líquido ventricular • Líquido abdominal (peritoneal, de paracentesis, diálisis biliar) • Líquido pleural, toracentesis y empiema (obtenidos de tórax) • Líquido pericárdico • Líquido sinovial 5.3.2. Toma de muestra para Líquido Cefalorraquídeo La punción lumbar se lleva a cabo con técnica aséptica estricta, teniendo cuidado de no provocar compresión del bulbo por extracción rápida del líquido cuando la presión intracraneana esta notablemente elevada.

El LCR usualmente se colecta en 3 o 4 partes, de 2 a 5ml cada una, en tubos o recipientes estériles. Esto permite el examen más conveniente y de más confianza para los distintos valores que determinan la conducta a seguir por el médico. El análisis básico efectuado al LCR y al Líquido pleural y otros líquidos corporales: • Cultivo de rutina • Cultivo para tuberculosis y hongos. • Análisis químico (proteínas y glucosa) • Análisis físico y citológico (aspecto del líquido, recuento de células, fórmula diferencial). • Pruebas de látex para detección de antígeno de Cryptococcus neoformans. 5.3.3. Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra Líquidos corporales • 5-10 ml como mínimo (enviar el máximo de volumen posible) • Obtenido en condiciones asépticas • En recipiente estéril • Enviar la muestra fraccionada para otros exámenes microbiológicos Lavados • 5-10 ml como mínimo • Recipiente estéril y desechable • En ayunas (para asegurar coleccionar la muestra que ha sido tragada durante el sueño) • El Broncoscopio debe estar estéril (evitar contaminar con agua de chorro por las micobacterias saprofíticas) 5.4. MUESTRAS DE HECES 5.4.1. Propósito e importancia Demostrar por medio de cultivo, la presencia de micobacterias. Es decir, micobacterias que infectan el intestino. Esto causa diarrea, dolor abdominal, fiebre y en ocasiones la muerte. Es importante que en pacientes con VIH/SIDA se realice un diagnóstico diferencial de la siguiente manera, utilizando las siguientes tinciones:

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 68

• Recipiente estéril (frasco o caja de petri de vidrio sellado (a)) • No sumergir las muestras en solución salina, formol o formalina

5.4.2. Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra de heces • 1 gr. aproximadamente • En recipiente estéril, desechable y de boca ancha • Llevar inmediatamente al laboratorio 5.4.3. Preparación de la muestra de heces para la elaboración de frotes • Observar las características de la muestra y buscar la parte dónde se encuentre mucoso o con estrías de sangre • De esta muestra suspender 1 gramo aproximadamente en 2-5ml de caldo 7H9 Middlebrook, solución salina o agua destilada estéril en un tubo estéril • Agitar en vórtex por 5min • Centrifugar por 15min a 3000rpm • Descartar el sobrenadante con cuidado de no perder la mayor cantidad de sedimento • Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar el frote • Hacer la tinción • Si no se observan BAAR NO procesar la muestra para cultivo 5.5. MUESTRAS DE BIOPSIAS Y SECRECIONES VARIAS 5.5.1. Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra Biopsias •1 gr. aproximadamente • Obtenido en condiciones asépticas

Secreciones • 0.5 ml como mínimo • En recipiente estéril, de preferencia en jeringas (si se va a coleccionar la muestra por medio de una punción es mejor si se cuenta con las de tipo tuberculina) • El área de toma de muestra debe estar bien limpia • Si son hisopos deben transportarse en Stuart o Amies 5.5.2. Preparación de la muestra para la elaboración de frotes Biopsias de tejido • Colocarla en una caja de petri estéril de vidrio preferentemente • Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, solución salina o agua destilada estéril • Triturar con bisturí la biopsia en partes pequeñas a manera de formar una mezcla homogénea • Transferir la solución a un tubo • Agitar por 5min aproximadamente en vortex • Centrifugar la solución por 15min a 3000rpm • Descartar el sobrenadante • Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar el frote • Hacer la tinción Biopsias de Hueso • Colocarla en una caja de petri estéril de vidrio preferentemente • Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, solución salina o agua destilada estéril • Triturar con bisturí a manera de formar partículas lo más pequeñas posibles. • Hacer por lo menos tres improntas frotando una laminilla contra otra a manera de obtener un frote en cada uno de los extremos y uno en el centro de la lámina portaobjetos • Hacer la tinción 5.6. MUESTRAS DE ESPUTO La muestra de esputo es de utilidad para investigar la causa de infecciones respiratorias inferiores (bronquitis, neumonía) y en la investigacion.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 69

de tuberculosis. Siempre hay bacterias en una muestra de esputo, por la contaminación del material bronquial con saliva. Una muestra de esputo es satisfactoria para estudio si contiene secreciones respiratorias inferiores. Muestras que consisten solo de material hialino o liquido o con abundante saliva son rechazadas por inadecuadas y no ser procesadas (Ver Valor Q.). En casos muy especiales puede estudiarse una punción transtraqueal. Aspirados o lavados bronquiales son adecuados en el paciente intubado o en respirador, si se transporta el material al laboratorio en una jeringa o contenedor estéril. La neumonía bacteriana, o infección del pulmón causada por bacterias puede ser de dos tipos: - Neumocóccica: Causada por Streptococcus pneumoniae - No neumocóccica: Causada por Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae y rara vez por otras bacterias. Los cultivos bacterianos del esputo son un problema importante, suelen ser recolectados sin cuidado, y a menudo son mas representativos de saliva que de las secreciones respiratorias inferiores, además contienen de ordinario gran cantidad de bacterias propias de la cavidad oral y en pacientes graves hospitalizados contienen con frecuencia bacilos gram negativo que han colonizado la orofaringe después de la hospitalización. Este tipo de cultivos carece de sensibilidad y especificidad y son, por lo tanto, difíciles de interpretar. 5.6.1. Toma de muestra.

cualquier muestra que no cumpla con el Valor Q establecido. 5.6.2. Procedimiento para obtención de la muestra. Esputo para infección bacteriana • Obtenerse la primera muestra de la mañana, dado que el la más espesa y no está contaminado con comida. • Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca con agua corriente (sin ningún tipo de antiséptico o pasta dental). Luego acostado en su cama, boca abajo, expectore esputo con fuerza, tosiendo, y lo deposite directamente en un recipiente estéril de boca ancha (proporcionado por el laboratorio), sin mantenerlo en la boca para evitar que se mezcle con saliva. • Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo mucopurulento son suficientes para el gram y el cultivo de rutina, así también para el cultivo de micobacterias (BK). • Llevar la muestra de inmediato al laboratorio. • Realizar el valor Q, para establecer la calidad de la muestra y establecer si es apta para su procesamiento. 5.6.3. Procesamiento de la muestra de Esputo Para que una muestra de esputo, sea válida para su adecuado cultivo, debe de cumplir con ciertos criterios. Estos criterios determinan la Calidad de la muestra, y su representatividad. A continuación se encuentra la tabla para Cálculo de valor Q. Este método se basa en la cuantificación de leucocitos polimorfonucleares y células epiteliales presentes en la muestra, de manera que la relación entre éstos determina el Valor de la calidad del esputo, y por consiguiente su aceptación o rechazo para cultivarse.

La infección bacteriana de tráquea y bronquios produce abundante esputo. En el caso del diagnóstico de neumonía y tuberculosis es crucial obtener una buena muestra. El cultivo de material no satisfactorio (saliva), causa confusión al médico, ya sea porque no se detectó el verdadero patógeno, o se cultivó un patógeno incidental sin importancia como agente etiológico primario. Por esta razón el laboratorio rechaza Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 70

TABLA No. 2 DETERMINACIÓN DEL VALOR Q

TABLA No. 3

Resumen de Requerimientos de Muestras

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 71

6. PREPARACIÓN Y OBSERVACIÓN DIRECTA DE UNA MUESTRA Las tinciones utilizadas para observación directa son Ziehl Neelsen, Kinyoun y Auramina-Rodamina, conocidas como tinciones de alcohol-ácido resistencia y juegan un importante papel en el diagnóstico temprano de infecciones por micobacterias. La baciloscopía ha sido adoptada por la mayoría de los países en desarrollo como el procedimiento diagnóstico de elección en los enfermos sintomáticos respiratorios por ser un método sencillo, rápido, confiable y económico. Las paredes celulares de las micobacterias debido a su alto contenido de lípidos, le confieren la propiedad de ligarse al colorante de carbolfuchsina y ser decolorados con una solución de alcohol ácido, de ahí su nombre Bacilos Alcohol Ácido Resistente (BAAR). Del mismo modo, los ácidos micólicos de la pared celular de las micobacterias tienen afinidad por los fluorocromos auramina-rodamina, los cuales emiten fluorescencia a cierta longitud de onda en el microscopio de fluorescencia, permitiendo observar a las micobacterias fácilmente. Respecto a la especificidad es de 99%, ya que en la mayoría de los casos los BAAR observados en esputo corresponden a Mycobacterium tuberculosis. Pero respecto a su sensibilidad no es óptimo, ya que puede existir variación del 9-46%. Se estima que deben existir de 5,00010,000 bacilos/ml de expectoración para que puedan ser detectados al microscopio. Es por ello que se recomienda que las muestras para tinción sean de forma seriada mínimo tres), y en el caso de orina se recomienda que sean cinco.

La sensibilidad del frote se incrementa de acuerdo al tipo de coloración. Son más sensibles los frotes teñidos con Auramina-Rodamina, tinción fluorescente que necesita de un microscopio fluorescente. Estas técnicas aunque más sensibles resultan ser más costosas y no cualquier laboratorio cuenta con un microscopio de fluorescencia. La importancia de conocer la sensibilidad y la especificidad de la baciloscopía en especímenes de formas pulmonares y extrapulmonares de la tuberculosis, se encuentra en el hecho de que en muchas instituciones de atención médica y servicios de urgencias no cuentan con otros métodos diagnósticos de reconocida sensibilidad y especificidad como el cultivo. Si bien la complejidad del cultivo y su costo resultan ser mayores que la baciloscopía, es mejor alternativa en comparación a otras técnicas sofisticadas. Por lo tanto, la baciloscopía no puede ser utilizada como única opción en el diagnóstico de la tuberculosis extrapulmonar y se debe utilizar el cultivo en todos los especímenes no pulmonares. En un estudio realizado en el Hospital Universitario de la Universidad León, México, se llegó a establecer que únicamente pudieron detectarse el 30% de los casos por medio de un frote directo, y no un 70% como lo señala la literatura. Como sabemos existen muestras en las cuales la cantidad de bacilos se encuentra muy diluida y no llega a ser suficiente para ser detectada mediante un frote directo de la muestra, y ni aun cuando la misma es centrifugada, por lo que no puede confiarse solamente en la baciloscopía y cualquier caso que sea altamente sospechoso debe de ser cultivado y esperar el resultado de éste, para dar como negativo al paciente.

6.1. Preparación de un extendido En la enfermedad extensa donde se eliminan Todas las fases de preparación del extendido grandes cantidades de micobacterias, existe deben ser sistematizadas y estandarizadas; la una buena relación entre frote y cultivo y la sen- disposición del material debe ser siempre la sibilidad es alta. Pero muchos pacientes pre- misma, de manera que se pueda obtener una sentan enfermedad mínima o menos avanzada seguridad máxima y garantizar la calidad de la donde la cantidad de micobacterias es menor técnica. y la correlación disminuye llegando a ser de un Algunas recomendaciones son las siguientes: - Cada serie de muestras a procesar no debe 25–40%. exceder de doce. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 72

• Fijar el extendido pasándolo por encima del incinerador dentro de la campana (es el más - Debe utilizarse un portaobjetos (laminilla) por seguro). cada de las muestras. • Pasar la lámina por el área azul de la llama de - Los portaobjetos deben ser nuevos de prefe- un mechero Bunsen tres o cuatro veces, pero rencia ó en buen estado y desgrasados (sumer- evite el sobrecalentamiento. girlos en alcohol al 95% y pasarlas por la llama • Permita que los frotes se fijen en un calentador del mechero) eléctrico (65 a 70ºC) al menos por 2 horas. - Los colorantes deben conservarse en frascos • Colocar las láminas en un recipiente con mede color ámbar por un máximo de 3 meses. tanol absoluto por un minuto (puede haber contaminación de muestras por micobacterias suelAlgunas muestras necesitan tratamiento previo tas). para poder realizar los extendidos, para esto NOTA: la fijación por calor puede que no mate revise cada una de las secciones por tipo de todas las micobacterias, por lo tanto las láminas muestra, en la sección Preparación de la mues- deben ser manejadas cuidadosamente y destra para la elaboración de frotes. cartadas en un recipiente adecuado después de su observación. Procedimiento h. Antes de sacar las manos de la campana quia. Asignar un número de identificación a la tarse un par de guantes, dejarlo dentro de ella muestra y colocarlo a la laminilla con tinta inde- dentro de una bolsa de descarte. leble i. LOS FROTES TANTO POSITIVOS COMO b. Ordenar las muestras con numeración ascen- NEGATIVOS DEBEN GUARDARSE POR LO dente de forma horizontal. MENOS SEIS MESES. c. Colocar cada laminilla frente al envase correspondiente teniendo el cuidado de no dejar 6.2. Procedimientos de Tinción alcoimpresiones digitales en la parte de la lámina hol-ácido resistencia reservada para el extendido. d. Colocarse la bata, la mascarilla, doble par de El diagnóstico de las micobacterias es basado guantes y lentes de seguridad. en la observación de BAAR en las muestras y su e. Realizar los frotes colocando la muestra uti- cultivo in vitro, para poder observarlos es necelizando un asa bacteriológica, un palillo o una sario realizar coloraciones como la de Ziehl-Nepipeta sobre la laminilla dependiendo el tipo de elsen (utiliza calor) o Kinyoun (no utiliza calor y muestra, haciendo un extendido fino y circu- su fuchsina es más concentrada). lar, de aproximadamente 3 cm. de diámetro y La característica de “alcohol-ácido resistencia” en dos terceras partes de la laminilla (No hacer típica de las micobacterias hace que la bacilosmás de un frote por laminilla para evitar confu- copía tenga una importancia fundamental ya siones), luego se dejan secar dentro de la cam- que se utiliza para seguir el curso del tratamienpana. Para que se sequen se necesita por lo to y para dar de alta al paciente en el hospital, menos esperar de 10 a 15 minutos. para luego poder continuar con su tratamiento f. Si se trata de esputo es preferible hacer el fro- ambulatorio. te con palillo de madera cortado en “L” ya que por la consistencia mucosa de la muestra tien- 6.2.1. Coloración de Ziehl-Neelsen: de a adherirse mayor cantidad de muestra en a) Fijar el frote con calor dentro de la campana él que en un asa. Se debe tener en cuenta que b) Dejar enfriar el lugar en dónde hay más probabilidades de c) Colocar papel filtro encontrar bacilos está en las partículas sólidas, d) Agregar fuchsina carbónica sobre el frote, caverdosas y sanguinolentas de la expectoración lentar cuidadosamente la lámina por debajo, ya y en gran medida el resultado del examen de- sea con un mechero o con un algodón con alpende de la elección de esas partículas. cohol hasta emitir vapores blancos (no hervir) y g. Fijar el frote por alguno de los siguientes mé- dejar reposar por 5 minutos. todos: Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 73

debe repetirse el frote. • En caso de que se observen bacilos con morfología dudosa solicitar una nueva muestra para control. • Si el frote es muy grueso es probable que se desprenda de la lámina durante la coloración por esto debe evitarse la transferencia de BAAR de una preparación a otra por medio del aceite de inmersión, lentes sucios o colorantes (por lo 6.2.2. Coloración de Kinyoun: que debe limpiarse con papel limpialentes entre una y otra muestra) a) Fijar el frote con calor dentro de la campana • Ocasionalmente, la buena selección de las b) Agregar fucshina de Kinyoun sobre el frote y partes anormales de la muestra para preparar el dejar reposar por 4 minutos frote puede dar resultados mucho mejores que c) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso el uso de concentraciones. d) Agregar alcohol-ácido y dejar reposar por 1-2 • Puede ocurrir que la misma muestra sea negaminutos tiva por frote, pero positiva por cultivo pero no lo e) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso contrario, porque la baciloscopía es menos senf) Agregar azul de metileno sible para detectar micobacterias que el cultivo. g) Permitir el reposo del colorante por 1-2 mi- • Un frote para diagnóstico de Tb debe examinutos narse de 8-10 minutos antes de darse por negah) Lavar con agua de chorro tivo. Si se trata de LCR debe observarse aún i) Permitir que el frote se seque al aire por más tiempo. j) Examinar con objetivo de inmersión • La liberación irregular de micobacterias de los focos endotraqueales puede dar frotes positivos 6.3. Interpretación e informe de Baci- y negativos en el mismo paciente. loscopías Hay varias tablas para el reporte de la cuantifi• Los extendidos deben examinarse total y cui- cación de baciloscopía. La siguiente forma de dadosamente con lente de inmersión (100x) y reportar ha sido estandarizada por la Asociación oculares 10x y una gota de aceite de inmersión. Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Res• Se debe limpiar completamente el lente de piratorias de los Estados Unidos. con el objeto inmersión entre una y otra muestra que se ob- de poder comparar los resultados de distintos serve. laboratorios y poder orientar de forma adecua• Los bacilos son aproximadamente de 1 a 10 da al personal médico. μm de largo y aparecen como bacilos ó como Tabla No. 3 Cuantificación de Baciloscopía bastoncitos delgados bien definidos, ligeramente curvos (pueden aparecer doblados) teñidos de rojo brillante (se aprecian mejor con luz intensa), generalmente con gránulos más coloreados en su interior, aislados, en parejas o en pequeños grupos, destacados sobre el azul claro de la tinción de fondo. NOTA: algunas micobacterias distintas a Mycobacterium tuberculosis pueden aparecer pleomórficas que van desde bacilos largos hasta Fuente: Asociación Nacional de Tuberculosis y Enfermeformas cocoides. dades Respiratorias de Estados Unidos. • En el frote pueden aparecer artefactos alcoBAAR (Bacilos alcohol-ácido resistentes) hol-ácido resistentes, especialmente si el frote es grueso o no fue suficientemente decolorado. • En caso que se observen muy escasos BAAR g) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso h) Agregar azul de metileno i) Permitir el reposo del colorante por 1-2 minutos j) Lavar con agua de chorro k) Permitir que el frote se seque al aire l) Examinar con objetivo de inmersión

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 74

trocelulosa capturan este complejo inmunológico que se hace visible gracias a la presencia del marcador de oro coloidal. Un resultado positivo (una banda visible de color púrpura/gris) indica que el antígeno LAM de las micobacterias está presente en la muestra en el límite de detección de la prueba o por encima de él. Fuente: Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social Un resultado negativo (sin banda visible de code Guatemala. lor purpura/gris) indica que este no está presen› (mayor) ‹ (menor) NOTA: De 1-4 BAAR en toda la lámina Repetir muestra te o que se encuentra por debajo del límite de Si la cantidad de BAAR en la nueva muestra sigue sien- detección. Con el fin de garantizar la validez del do la misma el resultado es POSITIVO (+) ensayo se ha incorporado una banda de control de procedimiento en el dispositivo del ensayo. 7. PRUEBAS DE TAMIZAJE Materiales Las pruebas de tamizaje son pruebas que ayu- • Tarjetas de análisis de la prueba Alere Deterdan a dar un diagnóstico presuntivo de infec- mineTM TB LAM Ag 10 tarjetas (10 pruebas por ción por Mycobacterium tuberculosis. Se ob- tarjeta) tiene un resultado más rápido que el cultivo y • Recipientes de recolección de orina generalmente más sensible que las tinciones. • Pipetas con precisión de 60 µL Sin embargo, deben ser interpretadas correla- • Tips descartables cionando la clínica del paciente y los datos de • Temporizador la historia clínica del paciente. Obtención de la muestra 7.1. PRUEBA DE LAM Antes de recoger la muestra de orina, se recoPrincipio mienda limpiar la zona genitourinaria con una La prueba de antígeno de LAM es un análisis toalla limpia. Recoja la orina en un recipiente inmunocromatográfico diseñado para la de- estándar de recolección de orina fresca. tección cualitativa del antígeno lipoarabinoma- Conservación de la muestra nano (LAM) de las micobacterias en orina hu- 1.Si se conservan a temperatura ambiente las mana. La prueba Alere DetermineTM TB LAM muestras de orina fresca pueden utilizarse a lo Ag emplea anticuerpos altamente purificados, largo de las 8 horas siguientes a la obtención. específicos del principal antígeno polisacárido 2. Si el análisis se va a realizar a lo largo de los del género Mycobacterium: lipoarabinomanano 3 días posteriores a la obtención de las muestra (LAM). de orina, estas deben almacenarse a una temperatura de entre 2 y 8 °C. Si el análisis se va a Estos anticuerpos se utilizan tanto como traza- realizar más de 3 días después, se deben condores de captura como de detección. Los an- gelar las muestras a -20 °C o menos. ticuerpos de captura se absorben en la mem- 3. Si las muestras están congeladas o refrigebrana de nitrocelulosa de las tiras reactivas. El radas, se deben poner a temperatura ambiente anticuerpo de detección se marca con un con- una hora antes de utilizarlas. jugado de partículas de oro coloidal. 4.Las muestras congeladas pueden contener agregados. Todas las muestras congeladas se Una vez que la muestra de orina se haya agre- deben centrifugar a 10,000 g durante 5 minutos gado a la sección de muestra, los anticuerpos a temperatura ambiente. La muestra a utilizar conjugados con oro coloidal se adhieren al an- se recoge con cuidado del sobrenadante. tígeno LAM y la muestra los libera de la sección 5.Evitar ciclos de congelado/descongelado repetidos. No se pueden utilizar las muestras que de conjugado. A continuación, los anticuerpos se hayan congelado y descongelado más de anti-LAM inmovilizados en la membrana de nitres veces. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 75

Procedimiento 1. El número deseado de unidades de prueba de las 10 tarjetas de análisis pueden extraerse doblando o rasgando la perforación. NOTA: La extracción de las unidades de prueba debe iniciarse en el lateral derecho de la tarjeta de análisis con el fin de conservar el número de lote que aparece en el lateral izquierdo de esta. El análisis debe iniciarse a lo largo de las 2 horas posteriores a la retirada de la cubierta protectora de aluminio de cada prueba.

Inserto Prueba de LAM, Alere 7.2. GENEXPERT Principio

El sistema GeneXpert integra y automatiza el procesamiento de muestras, la amplificación de ácidos nucleicos y la detección de las secuen2. Retire la cubierta protectora de aluminio de cias diana en muestras sencillas o complejas mediante ensayos de PCR y PCR de transcripcada prueba. tasa inversa en tiempo real. El sistema consta 3. Aplique 60 µL de la muestra (pipeta de pre- de un instrumento, una computadora, un lector cisión) a la sección de muestra (sección blanca de códigos de barras y un software precargado para la realización de pruebas con las muesmarcada con el símbolo de la flecha). tras recogidas y la visualización de los resulta4. Espere un mínimo de 25 minutos y lea el re- dos. Este sistema requiere el uso de cartuchos sultado. Visualice la tira en un entorno con una GeneXpert desechables de un solo uso para iluminación interior estándar o en la sombra. los reactivos y el proceso de PCR. Dado que No la visualice bajo la luz directa del sol. Los los cartuchos son independientes, se elimina resultados permanecen estables hasta unos 35 el riesgo de contaminación cruzada entre las minutos después de haber aplicado la muestra. muestras. Si han transcurrido más de 35 minutos no lea El Xpert MTB/RIF incluye reactivos para la delos resultaos de la muestra. tección de MTB y la resistencia a RIF, así como un control de procesamiento de la muestra Control de calidad (SPC, por sus siglas en ingles) para controlar el En la tira de reacción se debe observar una procesamiento adecuado de las bacterias diabanda control de la prueba. Si, una vez aca- na y detectar la presencia de inhibidores en la bado el ensayo, la banda de control no torna a reacción PCR. El control de comprobación de la un color purpura/gris, el resultado de la prueba sonda (PCC, por sus siglas en inglés) comprueno es válido y no se debe volver a analizar la ba la rehidratación de los reactivos, el llenado del tubo de PCR en el cartucho, la integridad de muestra. la sonda y la estabilidad del colorante. Interpretación de los resultados

Los cebadores del Xpert MTB/RIF Assay amPara facilitar la lectura e interpretación de los plifican una parte del gen rpoB que contiene la resultados cuando éstos se observan muy pá- región central de 81 pares de bases. Las sonlidos, se puede utilizar la Tarjeta de Escala de das son capaces de distinguir entre la secuenReferencia (incluida en el kit), la cual se sostie- cia natural conservada y las mutaciones de la región central que se asocian a la resistencia a ne a la par del resultado. rifampicina.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 76

Materiales • Cartuchos Xpert MTB/RIF con tubos de reacción integrados. • Sistema GeneXpert Dx equipado con el software GX4.0. • Recipientes estériles y herméticos, con tapa para toma de muestra. • Guantes desechables y protección ocular • Etiquetas o rotulador permanente • Pipetas de transferencia para el procesamiento de la muestra Procedimiento • Limpie adecuadamente el área de trabajo (pase un algodón con cloro 10% y luego otro con etanol 70%, secar con algodón) • Remueva un cartucho y un vial del reactivo de muestra del kit GeneXpe rt MTB/RIF • Agregue 2 volúmenes de reactivo de muestra por una de esputo en el recipiente colector (2:1)

3. Aparecerá una pantalla para seleccionar sesión en windows, seleccione “cepheid” e introduzca la contraseña “cphd” 4. Al ingresar a windows, el software de genexpert se iniciara automáticamente, si no, presione el icono de genexpert dx software en el escritorio. 5. Introducir el usuario y contraseña correspondiente para cada usuario. 6. Al ingresar, aparecerá un recuadro preguntando si quiere hacer algún manejo de la base de datos, presionar “no”. 7. Luego aparecerá un recuadro preguntando si quiere hacer un backup, presionar “no”. 8. Al terminar de ingresar los módulos del genexpert deben aparecer en el lado izquierdo como “disponibles”. 9. El equipo está listo para usar.

Actualización de un test (nueva versión) 1. Introduzca el cd que viene con el nuevo kit de reactivos en el lector del cds del computador. NOTA: para este paso, se puede utilizar la muestra di- 2. Dentro del software, presione el botón “definir recta; es decir, sin haber realizado proceso de deconta- ensayo”. minación o se puede utilizar muestra ya decontaminada. En general, todas las muestras se decontaminan primero 3. Presione el botón “importar” en la parte infey únicamente las muestras de líquido cefalorraquídeo se rior de la pantalla. utilizan directas. Para ver el proceso de decontaminación 4. En la ventana que se despliega seleccionar el de muestras previo a este paso, consultar sección 8.2 y directorio del cd en la barra superior. ubicar el método de decontaminación que se esté reali- 5. Abra la carpeta de que corresponde para el zando, de preferencia el método de NALC-NaOH ya sea sistema genexpert (“nombre de la prueba” gecon reactivos preparados in house o comerciales. nexpert system). 6. En la carpeta seleccione el archivo con termi• Enrosque adecuada mente la tapa • Asegúrese que la tapa cierre adecuadamente. nación “.gxa” • Mezcle el contenedor vigorosamente 10- 20 7. Presiona “aceptar” 8. En la parte izquierda de la pantalla “definir veces. • Dejar reposar a temperatura ambiente por 15 ensayo” aparecerá la nueva versión del test actualizado listo para usarse. minutos (al minuto 10 vuelva a mezclar). • Utilizando la pipeta desechable transfiera, CUIDADOSAMENTE la muestra (llene la pipe- Realización del test en el GeneXpert 1. Presione el primer botón en la parte superior ta hasta la marca). • Agregue la muestra al contenedor de mues- del software “crear ensayo” 2. En la ventana que se despliega lea el código tra, despacio, evite salpicaduras. de barras del cartucho del ensayo ya preparado. • Cierre la tapa del cartucho. • Coloque el cartucho en el equipo antes de 30 3. Al leer el código de barras en la ventana aparecerá la información del ensayo a realizar. minutos 4. Coloque la identificación de la muestra en el apartado “id de muestra”. Encendido del equipo 1. Encienda el equipo presionando el switch en 5.Si desea cambiar el modulo en el que será procesada la muestra selecciónelo. la parte posterior del equipo genexpert. 6.Cuando esté listo para procesar la muestra 2. Encienda la computadora. presione el botón “iniciar”. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 77

1. Después de terminar de procesar las mues7. Aparecerá el recuadro para que introduzca tras, saque los cartuchos de los módulos. de nuevo su usuario y contraseña, introdúzca- 2. Cierre el software presionando en la “x” de la los. parte suprior derecha. 8. Al darle “ok” la luz del módulo seleccionado 3. Aparecerá un recuadro preguntando si quiere para procesar la muestra empezara a parpa- hacer algún manejo de la base de datos, presiodear. nar “no”. 9. Introduzca el cartucho en el módulo y cierre 4. Luego aparecerá un recuadro preguntando si quiere hacer un backup, presionar “no”. la compuerta. 10. El equipo iniciara 5. El software se cerrara. 11. a procesar su muestra. El tiempo restante 6. Presione “inicio” en la barra de inicio de windows. dependerá del ensayo a realizar. 7. Presione “apagar” Inserto del test MTB/RIF Cepheid 8. Apague el monitor. Apagado del equipo Resultados e interpretación

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 78

Precauciones y limitaciones • Trate todas las muestras biológicas, incluidos los cartuchos usados, como posibles agentes transmisores de infecciones. •Todas las muestras biológicas deberán tratarse con las medidas de precaución habituales • Utilice guantes protectores desechables, bata de laboratorio y protección ocular cuando manipule las muestras y los reactivos. • Lávese las manos a fondo tras manipular las muestras y los reactivos de la prueba. • Siga los procedimientos de seguridad del centro para trabajar con productos químicos y manipular muestras biológicas. • Si se va a procesar más de una muestra a la vez, abra solo un cartucho, añada la muestra tratada con el reactivo de la muestra (o una muestra liquida descontaminada) y cierre el cartucho antes de añadir la muestra tratada con el reactivo de la muestra al siguiente cartucho. • No abra la tapa del cartucho Xpert MTB/RIF salvo para añadir la muestra tratada. • No use un cartucho que se haya caído o agitado después de añadir la muestra tratada.

malaquita) ó en Middlebrook 7H10 (sales de fosfato y magnesio, vitaminas, cofactores, ácido oléico, albúmina, catalasa, glicerol y dextrosa) cuando es necesario enriquecer las muestras, recuperarlas o para conservación de cepas se utiliza el segundo medio de cultivo que se ha mencionado.

8.1. Muestras

Las muestras para realizarles cultivo de micobacterias están clasificadas dentro de dos categorías: • De origen pulmonar (esputo, liquido y biopsia pleural, hisopados laríngeos, cepillados y lavados bronquiales). 8. CULTIVO DE MICOBACTERIAS EN • De origen extrapulmonar (orina, heces, piel, LOWENSTEIN JENSEN sangre, médula ósea, tejidos blandos, aspirados suprapúbicos de vejiga, biopsias, líquido cefaloLos procedimientos para obtener el crecimiento rraquídeo (LCR), líquido pericárdico, líquido pein vitro de las micobacterias son especializados; ritoneal, secreciones varias, fluidos y muestras deben seguirse estrictamente las instrucciones tisulares en general). para tener éxito en su recuperación. Por lo geneDe estas categorías hay dos niveles: ral, las muestras para cultivo contienen muchas bacterias de las microbiotas, especialmente el Tabla No. 5 Tipos de muestras. esputo que siempre se contamina con microbiota de la boca. Además el esputo es una muestra difícil de manipular por su mucosidad, tenacidad y adherencia. Por estas razones para su cultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo líquido y descontaminarse; es decir darle algún tratamiento químico para destruir las bacterias contaminantes que crecen rápido, pero sin destruir a las micobacterias. El cultivo se realiza en Lowenstein Jensen que es un medio muy nutritivo (Huevos enteros frescos, fécula de papa, glicerol, sales de fosfato y magnesio, L-asparagina, glicerol y verde de Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 79

Las muestras normalmente contaminadas ya sea por microbiota normal que es arrastrada al obtenerla o por su propia naturaleza requieren el paso de digestión-decontaminación, por el contrario las muestras normalmente no contaminadas no lo requieren pero en la mayoría de los casos pueden requerir de concentración. En la tabla No.6 se encuentra la preparación según tipo de muestra previo al procedimiento de decontaminación. * Si se cuenta con triturador para biopsias proceder de la siguiente manera: - Transferir la muestra al triturador de tejido estéril usando un asa o aguja para colocarla en la pared lateral del tubo del triturador - Agregar 10 partes de NaCl 0.85%, albúmina TABLA No. 6

bovina 0.2%, o caldo líquido para micobacterias (Ej. Middlebrook 7H9 ó Dubos) al triturador de tejido. Si la muestra es mucoide puede agregarse N-acetil-L-cisteína (NALC) - Mantener el tubo de lado e insertar el pistilo. Empujar la muestra al fondo del tubo - Detener el tubo en la mano, empujar el pistilo hacia delante y atrás en ángulo 90˚ - Triturar la muestra hasta lograr una suspensión homogénea - Remover cuidadosamente el pistilo del tubo. Utilizar un volumen pequeño de medio para enjuagar la punta del pistilo dentro del recipiente de descarte - Tapar el tubo con un tapón de rosca estéril

PREPARACION DE MUESTRAS PREVIO AL PROCEDIMIENTO DECONTAMINACION

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 80

preparación genera calor. 8.2. Métodos para decontaminación Combinar volúmenes iguales de las soluciode muestras. nes 1 y 2, autoclavear a 121˚C por 15 minutos en balones de preferencia con tapón de rosca. Las micobacterias se recuperan óptimamente NOTA: la solución puede ser guardada a tempede muestras clínicas cuando se utilizan méto- ratura ambiente, pero es preferible que se mandos para liberarlas de células y fluidos corpo- tenga en refrigeración; la desventaja de tenerla rales (digestión) y para remover o reducir los preparada es que el hidróxido de sodio forma organismos competidores (decontaminación). estructuras blancas como precipitado y en éste Ningún método es ideal para todas las mues- caso ya no puede utilizarse; por lo que de pretras clínicas en todas las circunstancias. Algu- ferencia hay que prepararlo el día que va a ser nos métodos utilizan un solo reactivo tanto para utilizado. digerir como para decontaminar, mientras que otros utilizan reactivos separados para estas A continuación se presentan cantidades de didos funciones. Cualquiera que sea el método gestor y decontaminante dependiendo de la elegido, se debe estar prevenido de las limita- cantidad de solución total necesaria para trabaciones inherentes al método por lo que deberá jar un determinado número de muestras: seguir el procedimiento de digestión-decontaminación que maximice la recuperación de mi- Tabla No. 7 Cantidades para la prepacobacterias a partir de muestras no estériles. ración del Digestante-Decontaminante 8.2.1. Método de N-Acetil-L-Cisteína-Hidróxido de Sodio (NALC-NaOH) Principio: La N-acetil-L-cisteína (NALC) es un agente mucolítico que a concentraciones de 0.5 a 2.0% puede digerir rápidamente aún el esputo más tenaz en sólo 2 minutos. La decontaminación se lleva a cabo por medio de una solución preparada con hidróxido de sodio y citrato de sodio. Materiales: Indicar en la etiqueta y en el libro de trabajo la fecha de inicio y expiración. Etiquetar todos los reactivos con fecha de preparación, receta, contenido, concentración, condiciones de almacenamiento. • Solución stock de Citrato de Sodio-NaOH Solución 1 (2.9%) - Citrato de sodio dihidratado 29g - Agua desmineralizada 1000ml Solución 2 (4%) – NaOH en granallas 40g – Agua desmineralizada 1000ml Precaución el NaOH es cáustico y su

• Buffer de fosfatos 0.067 M (pH 6.8) a. Buffer alcalino stock Na2HPO4 (Fosfato disódico anhidro) Agua desmineralizada 1000 ml

9.47 gr

b. Buffer ácido stock KH2PO4 (fosfato monopotàsico) 9.07 gr Agua desmineralizada 1000 ml • Agregar cada sal a balones volumétricos de 1000 mL. • Adicionar agua desmineralizada a la marca de 1000 mL. • Cada buffer puede ser transferido a recipientes con tapón de rosca y esterilizados a 121ºC por 15 min, para ser mezclados después, o pueden combinarse inmediatamente y esterilizarse •La solución puede ser guardada a temperatura ambiente pero es preferible que se refrigere (28ºC).

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 81

c.Solución de trabajo de buffer de fosfatos (pH 6.8) • Combinar volúmenes iguales de los stocks alcalino y ácido ó 640ml del fosfato disódico con 360ml de la solución de fosfato monopotásico y chequear el pH de la solución. • Agregar pequeñas cantidades de buffer alcalino para incrementar el pH o pequeñas cantidades de buffer ácido para disminuirlo. • Solución NALC-NaOH-Citrato de sodio Justo antes de usar, combinar el NALC con la solución de NaOH-Citrato de sodio. La solución detrabajo puede ser utilizada por las 2 horas consecutivas de su preparación, luego debe descartarse. Procedimiento a. Agregar un volumen de la solución de trabajo NALC-NaOH-Citrato de sodio igual al volumen de la muestra en un tubo Falcon con tapón de rosca. b. Mezclar suavemente y de forma invertida para asegurar que la solución tenga contacto con todas las superficies del interior del tubo y tapón. c. Agitar el tubo (muestra + solución de trabajo) en Vortex por 5 a 30 segundos hasta dejar la muestra licuada, se debe evitar una agitación en exceso ya que NALC es inestable en presencia de oxígeno y adquiere un color amarillo por oxidación de NALC, si esta coloración se da el NALC se inactiva. d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a temperatura ambiente por 15 minutos para que se lleve a cabo el proceso de decontaminación. e. Si fuera necesaria una decontaminación más activa, incrementar la concentración de sosa de la tabla al 5% o al 6% en lugar de aumentar el tiempo de exposición al reactivo decontaminante. f. Neutralizar la muestra añadiendo agua destilada estéril ó buffer de fosfatos (pH 6.8) hasta la marca de 45-50; para detener el proceso de decontaminación. g. Mezclar de forma invertida y suave el tubo. h. Centrifugar a 3000rpm en centrífuga refrigerada durante 15 minutos.

i. De preferencia descartar el sobrenadante en un recipiente de descarte que contenga fenol al 5% y del sedimento remover una porción (ya sea una asada grande ó de preferencia 2-3 gotas con una pipeta estéril) para colocar sobre el medio sólido de cultivo. j. Inocular el sedimento de la muestra en 2 tubos de Löwenstein Jensen. k. Incubar los tubos de forma horizontal a 37°C por 2-5 días l. Seguir incubando los tubos de forma vertical en una gradilla. m. Realizar lecturas 2 veces por semana. n. Observar crecimiento de colonias con las siguientes características: color crema, rugosas, secas y bien adheridas al medio. o. Realizar frotes con Zielh Neelsen, para comprobar crecimiento de bacilos alcohol ácido resistentes. p. Si se completan 8 semanas y no hay crecimiento se dejan de incubar y se reportan como negativos para micobacterias. 8.2.2. Método del Hidróxido de Sodio Principio: El hidróxido de sodio es tanto un digestante como un decontaminante, y su efecto es muy bueno. Su actividad mucolítica más efectiva ocurre a una concentración de 4%. Materiales: • Solución NaOH 4% - Granallas de NaOH 40g - Agua desmineralizada 1000ml -Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121˚C. Procedimiento a. Agregar un volumen de NaOH igual al volumen de la muestra en un tubo con tapón de rosca. b. Mezclar suavemente y de forma invertida el tubo. c. Agitar el tubo (muestra + NaOH) en Vortex por 30 segundos. d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a temperatura ambiente por 15 minutos para que se lleve a cabo el proceso de decontaminación. e.Diluir la muestra con agua desmineralizada para detener el proceso de decontaminación.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 82

f. Mezclar de forma invertida y suave el tubo. g. Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos. h. De preferencia descartar el sobrenadante en un recipiente de descarte que contenga fenol al 5% y del sedimento remover una porción (ya sea una asada grande ó de preferencia 2-3 gotas con una pipeta estéril) para colocar sobre el medio sólido de cultivo. El NaOH debe utilizarse a la menor concentración que efectivamente digiera y decontamine efectivamente las muestras. Si ocurre contaminación excesiva con el uso de NaOH 2% hay que incrementar la concentración primero al 3% y luego a 4% antes de aumentar el tiempo de exposición. 8.2.3. Método del Ácido Oxálico Principio:

c. Agitar el tubo (muestra + ácido oxálico) en Vortex por 30 segundos. d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a temperatura ambiente por 30 minutos para que se lleve a cabo el proceso de decontaminación. e. Diluir la muestra con solución salina 0.85% estéril para detener el proceso de decontaminación. f. Mezclar de forma invertida y suave el tubo. g. Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos. h. De preferencia descartar el sobrenadante en un recipiente de descarte. i. Agregar algunas gotas de rojo de fenol al sedimento. j. Neutralizar el sedimento con NaOH 4% hasta obtener un color rosa pálido. k. Del sedimento remover una porción (ya sea una asada grande ó de preferencia 2-3 gotas con una pipeta estéril) para colocar sobre el medio sólido de cultivo.

El ácido oxálico (ácido etanodioico) es común a muchas plantas y vegetales por lo que depende de un viraje de colores para poder decontaminar efectivamente las muestras. Materiales: a. Reactivo de ácido oxálico al 5% • Ácido oxálico 50gr • Agua desmineralizada 1000ml • Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121˚C. b. Indicador de Rojo de fenol • Rojo de fenol 8mg • NaOH 20ml • Agua desmineralizada 000ml • Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121˚C. Disolver el rojo de fenol en NaOH al 4% en un agitador magnético, puede que se requiera de calentamiento leve. Transferir la solución a un balón volumétrico y aforar a 1000ml con agua destilada. Guardar la solución a temperatura ambiente. Procedimiento a. Agregar un volumen de ácido oxálico al 5% igual al volumen de la muestra en un tubo con tapón de rosca. b. Mezclar suavemente y de forma invertida el tubo.

8.2.4. Método MycoPrep BBL (método comercial) Principio La mayoría de las muestras enviadas para confirmación de infección por micobacterias con cultivo están contaminadas por la microbiota normal. Por esta razón deben ser tratadas con un procedimiento de digestión y descontaminación. La solución de N-acetil-L-cisteína-hidróxido sódico (NALC-NaOH) es Cuando el reactivo se diluye con la muestra en cantidades iguales provee digestión y decontaminación con una concentración NaOH al 1 %, el citrato de sodio enlaza los iones de metal pesado presentes en la muestra que pueden inactivar el NALC. El tampón fosfato ph 6.8 disminuye la actividad de la solución de NALC-NaOH y reduce la gravedad específica de la muestra. Materiales Verificar la etiqueta y fecha de expiración.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 83

Materiales Verificar la etiqueta y fecha de expiración. • Reactivo BBL MycoPrep Fórmula aproximada (ajustada y/o enriquecida para satisfacer los criterios de rendimiento) por un litro de agua - NaOH en granallas 20g - Citrato trisódico (Na3C6H5O7.2H2O) 14.5g Cada ampolla de vidrio sellada dentro del frasco contiene un mínimo de 0.370 g de NALC(C5H9NO3S) • Tampón fosfato BBL Mycoprep Fórmula aproximada (ajustada y/o enriquecida para satisfacer los criterios de rendimiento) por 500 ml de agua purificada -Fosfato disódico (Na2HPO4) -Fosfato monopotásico (KH2PO4)

2.37g 2.27g

Ph Final de 6.8 Advertencias y precaución: Para uso de diagnostico in vitro.

si las ampollas están rotas, ausentes o bien si no contienen polvo. No utilice si hay evidencia de deterioro (e. g. el color del reactivo se vuelve amarillo). No utilice el tampón fosfato si los paquetes están desgarrados o abiertos. RECOGIDA Y MANIPULACIÓN DE LAS MUESTRAS Se requiere la utilización de prácticas y procedimientos de bioseguridad de nivel 2 y equipo e instalaciones para contención cuando se manipulen muestras clínicas sin producir aerosoles, como en la preparación de frotis acidorresistentes. Todas las actividades que generen aerosoles deben llevarse a cabo en una campana de flujo laminar nivel II. Se requiere utilización de prácticas de bioseguridad de nivel 3 y equipo e instalaciones para contención en las actividades de laboratorio que incluyan la propagación y manipulación de cultivos de M. tuberculosis y M. bovis. Los estudios en animales también requieren la implementación de procedimientos especiales. Procedimiento

a. Prepare el tampón fosfato BBL MycoPrep El reactivo NALC-NaOH contiene alcalinos según sea necesario, vaciando el contenido de fuertes y causa quemaduras graves. Se debe un paquete en un matraz volumétrico de 500 usar guantes y protección para los ojos y la mL y rellenado con agua purificada. Transfiera cara. El NaOH irrita los ojos y la piel. En caso la solución tampón a un envase con tapa de de contacto con los ojos o la piel, enjuagar in- rosca y póngala en el autoclave a 121° C dumediatamente con un producto para lavado rante 15 minutos con la tapa floja. Déjela enfriar ocular o abundante agua potable durante al a temperatura ambiente y apriete la tapa. menos 15 minutos y consulte al médico. Si es ingerido, tome leche, clara de huevo o abun- b. Con cuidado para no derramarlo, afloje la dante agua y consulte al médico. Mantenga tapa de rosca del frasco de reactivo MycoPrep. fuera del alcance de los niños. Extraiga todo exceso de aire del frasco y asegure la tapa. Coloque el frasco en posición verPrecaución: Rompa la ampolla cerca del tical y apriételo hasta que se rompa la ampolla. centro una sola vez. No siga manipulando la (Nota: el frasco de 150 mL contiene dos ampoampolla ya que el frasco de plástico puede per- llas y se deben romper las dos). Agite suaveforarse y causarle heridas. mente para disolver el NALC. Instrucciones para el almacenamiento: En cuanto se reciba, guardar a una temperatura entre 15 y 30°C. No congelar. No abrir hasta que vayan a utilizarse.

Evite agitar en exceso. UNA VEZ ROTA LA AMPOLLA, EL REACTIVO DEBE USARSE EN UN LAPSO DE 24 HORAS.

Deterioro del producto: No utilice los reactivos Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 84

c. En un gabinete de seguridad biológica, utilice un tubo para centrifuga estéril libre de aerosoles de 50 mL y con tapa de rosca, añada cantidades iguales de la muestra y de la solución de NALC-NaOH activada (aproximadamente 5 mL de cada uno)

cimiento BACTEC MGIT y la mezcla antibiótica BBL MGIT PANTA está destinado para la detección y recuperación de micobacterias utilizando los sistemas BACTEC MGIT 960. Los tipos de muestras aceptables son muestras clínicas digeridas y decontaminadas (excepto orina) y fluidos corporales estériles (excepto sangre).

Principio d. Tape el tubo para centrifuga y mezcle en un vortex hasta que la muestra se licúe. Si la Se tiene un compuesto fluorescente en la parte muestra es muy viscosa añada más solución inferior de los tubos de 16x100 mm de fondo rede NALC-NaOH y vuelva a mezclar. dondo. El compuesto fluorescente es sensible a la presencia de oxígeno disuelto en el caldo. e. Deje reposar la mezcla a temperatura am- Al inicio la gran cantidad de oxígeno disuelto biente durante 15 minutos y agite suavemente apaga las emisiones procedentes del compuesde vez en cuando. Evite tratar la muestra en to y se puede detectar muy poca fluorescencia. exceso. Más tarde, los microorganismos que respiran activamente consumen el oxígeno y permiten f. Añada el tampón de fosfatos ya preparado al que se detecte la fluorescencia. tubo para centrifuga hasta alcanzar los 40 mL y mezcle. Centrifugar entre 15 y 20 minutos a Los tubos que se introducen en el instrumento 3,000 gravedades. BACTEC MGIT son incubados continuamente a 37°C y este controla los tubos cada 60 minutos g. Decante con cuidado todo el fluido sobrenapara detectar un aumento en la fluorescencia. dante El análisis de la fluorescencia, este análisis se h. Añada una pequeña cantidad de tampón de utiliza para determinar si el instrumento detecta fosfatos con un pH 6.8 (0.5 a 2 mL) y vuelva a el tubo como positivo con organismos viables. suspender el sedimento. Utilice la suspensión Cada tubo positivo contiene aproximadamente para preparar frotis y para los procedimientos 105 a 106 UFC/ml. Los frascos de cultivo que permanecen negativos durante un mínimo de micobacteriológicos. 42 días (hasta 56 días) y que no muestran indicios de ser positivos se retiran del instrumenControl de Calidad del Usuario: • Examine los componentes del equipo de cada to como negativos y se esterilizan antes de ser lote o envío que se reciba por Deterioro del Pro- desechados. ducto. • Inocular una caja de agar sangre para bús- El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT se añade a cada tubo MGIT para proporcionar queda de bacterias u hongos contaminantes. • Inocular los reactivos del Mycoprep (buffer y substancias esenciales para el crecimiento rápisolución NaOH-citrato de sodio-NALC en tubo do de micobacterias. El ácido oleíco es usado de medio sólido y tubo de medio líquido para por las micobacterias y es muy importante en el verificar esterilidad. metabolismo micobacteriano. La albúmina actúa como agente protector al ligar ácidos grasos 8.3. Inoculación de Tubo Bactec MGIT libres que pueden ser tóxicos para las especies 960 (Indicador de crecimiento de Mi- de Mycobacterium, ayudando a su recuperacobacterias). ción. La dextrosa es una fuente de energía. El uso del tubo BBL MGIT indicador de crecimiento enriquecido con el suplemento de creRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 85

La catalasa destruye las peroxidasas tóxicas que pueden estar presentes en el medio. La contaminación se reduce al suplementar el caldo de base con el suplemento de crecimiento BACTEC MGIT/mezcla antibiótica BBBL MGIT PANTA antes de la inoculación con una muestra clínica.

Base de caldo Middlebrook 7H) modificado 5.9 g. Peptona de caseína 1.25 g.

El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT contiene 15 mL de Caldo de enriquecimiento Middlebrook OADC. Fórmula aproximada por L de agua purificada: Albumina bovina 50.0 g Materiales y Reactivos Catalasa 0.03 g. 20.0 g El tubo indicador de crecimiento BBL MGIT Dextrosa 0,1 g. contiene: 110 uL de indicador fluorescente y 7 Ácido oléico 1.1g. mL de caldo. El indicador contiene cloruro pen- Estearato de polioxietileno (POES) tahidratado de Tris-4, 7-difenil-1, 10-fenantroli-   na rutenio en una base desilicona. Los tubos MGIT 960 INGRESO O EGRESO DE TUse limpian con un chorro de CO2 al 10% y se BOS O GRADILLAS 1.Ingreso de los tubos o gradillas al equipo (este cierran con tapones de polipropileno. Formula aproximada por L de agua purificada procedimiento no es realizado por nosotros) A.Ingreso desde el instrumento del tubo indicador de crecimiento BBL-MGIT:

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 86

Después del ingreso de los tubos, el instrumento automáticamente realizara la lectura de los tubos cada hora durante el tiempo necesario para la interpretación del procedimiento. MANTENIMIENTO DIARIO MGIT 960 • Verificar luces internas y externas: • Correcto funcionamiento Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 87

• Verificar de Temperatura • Correcto funcionamiento

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 88

• Registrar los resultados

con una amina primaria o secundaria (anilina). Kilburn y Kubica modificaron utilizando una tira 9. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN impregnada con los reactivos. El tiocianato potásico acidificado con cloramina T libera cloruro 9.1. TEST DE ÁCIDO NICOTÍNICO PARA de cianógeno, el cual reacciona con ácido niTB BBL TAXO (NIACINA) cotínico y produce un color amarillo. Si no hay ácido nicotínico no aparece ningún color. Principio Materiales Las tiras de análisis de ácido nicotínico para TB Las tiras de análisis de ácido nicotínico para contienen reactivos para la detección de la pro- TB BBL Taxo son tiras de papel absorbente imducción de ácido nicotínico por micobacterias. pregnadas con tiocianato potásico, cloramina Se utiliza el control de ácido nicotínico para TB T, ácido citríco y aminosalicilato de sodio. BBL taxo como control positivo en el análisis de ácido nicotínico. Los discos de papel control están impregnados con nicotinamida. Cuando se usan siguiendo Todas las micobacterias producen ácido nico- las instrucciones, producen una solución amatínico, o niacina, sustancia que desempeña rilla equivalente aproximadamente a 5 ug de un papel esencial en las reacciones de oxida- ácido nicotínico. ción-reducción. Debido al bloqueo de una vía Medios de cultivos. metabólica, M. tuberculosis y ciertas cepas ais- • Agua destilada o desionizada estéril o soluladaS de M. simiae y de M. chelonae producen ción salina 0.85% estéril. las mayores cantidades de este compuesto. El • Tubos estériles de 13 x 75 mm. ácido nicotínico se acumula en los medios de • Tapones para tubo. cultivo en los que están creciendo los microor- • Pipetas de trasferencia estéril. ganismos y puede extraerse de dichos medios. • Pinzas. El ácido nicotínico producido por el microorga- • Cepas para control de Calidad nismo reacciona con el bromuro de cianógeno y Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 89

jo en cada uno de los tubos (control positivo, control negativo, muestra) y taparlos inmediaAlmacenamiento: Conservar las tiras a 2 a 8° tamente. C. La fecha de vencimiento es vigente para el d. Mezclar gentilmente pero no agitar. Repetir producto cuando está envasado en su recipien- este movimiento después de 5 a 10 min. te intacto y ha sido conservado según las ins- e. Después de 15 min. pero no más de 30 min., trucciones. comparar el color de los extractos f. Autoclavear y descartar los tubos después de Preparación de la muestra completar la prueba. • Agregar 1.5 ml de solución salina 0.85% o agua desmineralizada estéril a un cultivo de 3-4 semanas de crecimiento con al menos 50 a 100 colonias. • Frotar con un asa plástica estéril sobre el crecimiento para permitir la extracción de la niacina. No utilizar cultivos contaminados. • Inclinar los tubos de modo que la superficie del medio esté en posición horizontal y cubierta con el líquido utilizado. Permitir que permanezca en esta posición por 20 a 30 minutos. • Cuidadosamente remover aproximadamente 0.6 ml del extracto de cada muestra con una pipeta estéril y transferirlo a un tubo de 13 x 75 mm. a. Preparación de controles * Positivo: -Colocar 0.6 ml de solución salina 0.85% ó agua desmineralizada estéril en un tubo de 13 x 75 mm -Agregar uno de los discos control de niacina, tapar y agitar moderadamente 3 veces por 15 min. -Rotular como control positivo. *Negativo: -Colocar 0.6 ml de solución salina 0.85% ó agua desmineralizada estéril en un tubo de 13 x 75 mm - Rotular como control negativo. Procedimiento a. Procesar el cultivo como se indica en preparación de la muestra y colocar 0.6 ml del extracto de cada muestra en tubos de 13 x 75 mm b. Mantener a mano los tubos control positivo y negativo c. Utilizando pinzas flameadas, dejar caer una tira del test de niacina, con la flecha hacia aba-

Resultados Un resultado positivo para el test de niacina se evidencia por la aparición de color amarillo en el extracto de la muestra y en el control positivo; la ausencia de color en el control negativo. Precauciones

• Únicamente cultivos de 3 a 4 semanas de crecimiento con al menos 50 a 100 colonias deben usarse en el test de producción de niacina. Una menor cantidad de colonias puede dar resultados negativos o dudosos. • No deben utilizarse cultivos contaminados. • Deben observarse las precauciones para el manejo de Mycobacterium tuberculosis al realizar ésta prueba. • Los tubos tapados deben ser autoclaveados después de completar la prueba. Limitaciones Aunque un resultado fuertemente positivo para el test de niacina en micobacterias no cromogénicas, es altamente indicativo de Mycobacterium tuberculosis se considera únicamente una identificación preliminar de este organismo. La identificación completa y final de Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias clínicamente significativas se basa en los resultados obtenidos en una batería de información que incluye test bioquímicos, patrones de susceptibilidad antibiótica y características morfológicas.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 90

Se considera que los medios de cultivo desarrollados en medios a base de huevo son los que producen los resultados más homogéneos, se obtienen resultados satisfactorios con agar de Middlebrook y Cohn suplementado con ácido aspártico al 0.1 %.

9.2. TIRAS BBL TAXO PARA PRUEBA DE NITRITOS Principio Se utilizan para detectar los microorganismos nitrato reductasa positivos, especialmente micobacterias en la prueba de reducción de nitrato. La capacidad que tiene la micobacteria de reducir los nitratos a nitritos es útil para diferenciarlas. Esta prueba separa las micobacerias de crecimiento lento que son nitrato positivas como ejemplo M. tuberculosis, M. kansasii y M. fortuitum de las de crecimiento rápido que son negativas o débilmente positivas como por ejemplo M. bovis, M. avium complex y M. intracellulare. La presencia de la enzima nitrato reductasa se detecta por la producción de un producto final coloreado. Materiales • Las tiras BBL Taxo para prueba de nitrito son tiras de papel absorbente impregnadas de nitrato sódico tamponado, ácido cítrico, yoduro potásico y almidón. • Medios de cultivos. • Agua destilada o desionizada estéril. • Tubos estériles de 20 x 110 mm con tapón de rosca. • Pipetas de trasferencia o espátula. • Pinzas. • Incubadora. • Cepas para control de Calidad

Almacenamiento Conservar las tiras de 2 a 8° C. No exponer a humedad y temperaturas elevadas. Proteger de la luz, las tiras son fotosensibles. La fecha de vencimiento es vigente para el producto cuando está envasado en su recipiente intacto y ha sido conservado según las instrucciones. Procedimiento a. Utilice un cultivo de 3 – 4 semanas hecho en medio de Lowenstein-Jensen, medio Petragnani u otro medio de huevo coagulado. b. Añada 0.5 ml de agua destilada a un tubo limpio de 20x110mm con tapón de rosca. c. Utilizando una pipeta estéril de 1 mL o una espátula, saque dos agregados de colonias del cultivo. Añada las colonias al agua destilada y disperse las colonias utilizando la pipeta o la espátula. Alternativamente, añada 1.5 ml de solución salina estéril en cada cultivo inclinado y remueva el cultivo para una suspensión espesa. Transfiera 0.5 ml de esta suspensión de cultivo a un tubo vacío y estéril para analizar. d. Con las pinzas esterilizadas al fuego, añada cuidadosamente una tira BBL Taxo para prueba de nitrito al tubo. Oriente la tira para poder introducir primero la parte inferior de la misma, señalada con una flecha, en el tubo. Sostenga el tubo en sentido vertical. e. Cierre el tubo con el tapón e incúbelo a 35 +/2°C durante 2 horas. Agite el tubo suavemente al concluir la primera y la segunda hora de incubación. No incline el tubo f. Después de 2 horas de incubación, incline el tubo cuidadosamente de un lado a otro 6 veces para humedecer la tira entera. Inclínelos tubos a temperatura ambiente para cubrir la tira con el líquido. Deje los tubos en esta posición durante 10 min. Resultados El cambio del color de la parte superior de la tira a azul claro o azul oscuro indica la reducción de nitrato. La ausencia de un cambio de color indica una reacción negativa. Control de Calidad Especificaciones de la identidad, las tiras de papel blancas con flecas negras apuntando hacia abajo. Respuesta del cultivo: Prepare tubos con agua destilada. Inocúlelos con los organismos a analizar.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 91

Introduzca las tiras en los tubos con la flecha apuntando hacia abajo. Incube a 35 +/- 2°C durante 2 horas. La presencia del color azul en la parte superior de la tira indica una reacción positiva.

anticuerpo-conjugado coloide dorado, se une al antígeno MPT64 en la muestra, en medio líquido. El complejo entonces continua fluyendo y se une al anti- MPT64 monoclonal de ratón sobre la fase sólida en la línea de prueba, produciendo una banda de color de rojo a purpura. En ausencia del MPT64 no hay línea en la región de banda de prueba. Materiales y Reactivos

Limitaciones La prueba de reducción de nitrato es valiosa para l identificación de M. tuberculosis y otras micobacterias clínicamente significativas. Sin embargo, esta prueba es sólo una parte de la batería bioquímica necesaria para la identificación preliminar de estos organismos. 9.3. DETECCIÓN MPT64

DE

ANTÍGENO

Principio Prueba de casete que consta de una almohadilla para la muestra, una almohadilla de conjugado dorado, una membrana de nitrocelulosa y una almohadilla absorbente. Los anti-MPT64 monoclonal de ratón están inmovilizados sobre la membrana de nitrocelulosa como material de captura (línea del test). Tiene añadidos otros anticuerpos los cuales reconocen otros epítopes del MPT64, conjugados con las partículas del coloide dorado, fueron usados para la captura del antígeno y la detección en un ensayo tipo sándwich. El dispositivo de la prueba rápida SD BIOLINE Ag MPT64 tiene una letra C (Línea control) y la letra “T” (Línea de prueba) sobre la superficie del casete. Ambas líneas, control y test no son visibles en la ventana de resultado antes de la aplicación de cualquier muestra. La “Línea Control” es usada como control del procedimiento. La línea control debe siempre aparecer si el procedimiento de prueba es realizada adecuadamente y los reactivos de prueba de la línea control están funcionando. Cuando la muestra es aplicada en el pozo de muestras, esta fluye lateralmente a través de la membrana, el

• Dispositivo de prueba individualmente empacado en una bolsa de aluminio con un desecante • Buffer de extracción (para preparación de muestras a partir de cultivos sólidos). • Instrucciones de uso. Procedimiento a. Retirar el dispositivo de prueba de su bolsa de aluminio y ubíquelo sobre una superficie plana y seca. b. Adicionar 100μl del cultivo líquido (o 100μl del cultivo solido suspendido en buffer) dentro del pozo de muestra. c. Cuando la prueba comience a correr, se verá el color purpura desplazándose a través de la ventana de resultados en el centro del dispositivo de prueba. d. Interprete los resultados de prueba 15 minutos después de la aplicación de la muestra.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 92

Resultados

La hibridación incluye los siguientes pasos: desnaturalización química del producto a amplificar; hibridación de amplicones de una sola cadena, marcados con biotina, a sondas unidas a membrana; lavado astringente; adición de conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una reacción de tinción mediada por AP. Una plantilla asegura la interpretación sencilla y rápida del esquema de bandas obtenido.

MATERIALES • Agua destilada (para uso en biología molecular) • Baño de agua • Baño de agua con agitación/TwinCubator • Baño de ultrasonidos • Centrífuga de mesa • Cronómetro • ADN polimerasa termoestable con tampón (recomendación: HotStarTaq DNA Polymerase de Qiagen) • Guantes desechables • Papel absorbente Precauciones Todos los procedimientos se deben realizar en • Pinzas campanas biológicamente seguras. Use tubos • Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μL de ensayo con tapa para evitar infección del • Plataforma de agitación/TwinCubator usuario cuando requiera de cultivos con mues- • Probeta graduada • Puntas de pipeta desechables con filtro tras. • Reactivos para extracción de ADN, así como 9.4. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES equipos necesarios COMUNES DE MICOBACTERIAS (Ge- • Termociclador (rango de calentamiento 3°C/ seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión noType Mycobacterium CM) +/–0,2°C) • Termómetro calibrado PRINCIPIO El kit GenoType Mycobacterium CM (Common • Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa Mycobacteria) está basado en la tecnología DNA•STRIP y permite la identificación de las si- 1. Preparación de muestra y controles (si apliguientes especies de micobacterias: M. avium can controles) ssp., M. chelonae, M. abscessus, M. for- Las muestras para extracción son a partir de tuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, en 300 μL agua ultrapura libre de DNasa y RNaM. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. ulcerans, M. tuberculosis complex, y M. xenopi. Las muestras también pueden extraerse a partir El procedimiento completo se divide en tres pa- de cultivos positivos en medio líquido, se traslasos: extracción de ADN procedente de cultivo da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de (placas de cultivo/medio líquido; los reactivos DNasa y RNasa. necesarios no se suministran), una amplificación múltiplex con primers marcados con biotina (la ADN polimerasa termoestable no se incluye), y una hibridación reversa. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 93

– 5 μL 10x de tampón para incubación de poliPROCEDIMIENTO merasa – no suministrado. – x μL de solución MgCl21) – no suministrado EXTRACCIÓN DE ADN – 1-2 unidades de DNA polimerasa termoestaPuede usarse un crecimiento bacteriano en ble (consulte el manual) – no suministrado placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi- – y μL de agua para obtener un volumen de 45 ddlebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, μl (sin considerar el volumen de enzima) – no MB-Check). Este test no puede usarse para suministrado. detectar micobacterias directamente de mues- – Añada 5 μL de solución de ADN (20-100 ng tras de pacientes. La zona de trabajo ha de es- de ADN) para obtener un volumen final de 50 tar libre de ADN amplificado. Es crucial el ca- μL (sin considerar el volumen de enzima). lentamiento de las muestras a 95°C durante, al menos, 20 minutos con objeto de inactivar 1) Dependiendo del sistema enzima/tampón bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- usado, la concentración óptima de MgCl2 puequier procedimiento de extracción de ADN que de variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta produzca ADN de bacterias amplificable. El si- que algunos tampones para incubación ya conguiente protocolo rápido normalmente produce tienen MgCl2. ADN adecuado para amplificación: La evaluación del rendimiento del ensayo Ge1a. Cuando use crecimiento bacteriano en me- noType Mycobacterium CM fue realizada utilidio sólido, recoja bacterias con un asa de ino- zando la Polimerasa HotStarTaq ADN de Qiaculación y suspéndalas en aproximadamente gen. Las cantidades necesarias por muestra 300 μL de agua (grado Biología Molecular). cuando utilice esta enzima son las siguientes: 1b. Cuando use crecimiento bacteriano procedente de medio líquido, aplique directamente – 35 μL de PNM – suministrado 1 mL. Concentre las bacterias mediante centri- – 5 μL 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (confugación 15 min en una centrífuga de sobreme- tien e 15 mM de MgCl2) – no suministrado sa en un rotor con contenedor de aerosoles y – 2 μL 25 mM de solución MgCl2 – no suminisen una cabina de seguridad de clase II a 10000 trado x g aproximadamente. Deseche el sobrenadan- – 0,2 μL (1 U) de HotStarTaq – no suministrado te y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de – 3 μL de agua (para uso en biología molecular) agua (ver más arriba) con un vórtex. – no suministrado 2 Incube las bacterias procedentes del aparta- – 5 μL de solución de DNA (añada el ADN en do 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño una zona distinta) de agua. – La concentración final de MgCl2 en la mezcla 3 Incube durante 15 min en un baño de ultra- de amplificación será de 2,5 mM. sonidos. 4 Centrifugue durante 5 min a máxima veloci- Determine el número de muestras a amplificar dad y utilice directamente 5 μL del sobrenadan- (número de muestras a analizar más las mueste para la PCR. En caso de que la solución de tras de control). Por ejemplo, un control de conADN haya de almacenarse por períodos pro- taminación contiene 5 μL de agua en lugar de longados de tiempo, transfiera el sobrenadante solución de ADN. Prepare una mezcla que cona un tubo nuevo. tenga todos los reactivos excepto la solución de ADN y mezcle bien. No utilice vórtex. AMPLIFICACIÓN Alicuote la mezcla madre en volúmenes de 45 Prepare la mezcla de amplificación (45 μL) en μl en tubos preparados de PCR. una habitación libre de ADN. La muestra debe añadirse en un área separada. Mezcle por tubo: – 35 μL de PNM – suministrado Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 94

2) Perfil de amplificación

Los productos para amplificación pueden almacenarse entre +8 y –20°C. Para comprobar la reacción de amplificación, aplique directamente 5 μL de cada muestra a un gel de agarosa al 2% sin la adición de tampón de carga. Los amplicones tienen una longitud aproximada de 230 pb (Control de Género) y 200 pb (Control Universal/amplicon especie-específico). HIBRIDACIÓN Preparación Precaliente en baño de agua con agitación o TwinCubator a 45°C; la máxima desviación tolerada en la temperatura idónea es de +/–1°C. Precaliente las soluciones HYB y STR a 3745°C antes de usar. Los reactivos han de estar libres de precipitado (tenga en cuenta, no obstante que la solución CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. Caliente a temperatura ambiente los restantes reactivos, con la excepción del CON-C y el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 con sus tampones respectivos (CON-C con CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperatura ambiente. Para cada tira añada 10 μL de concentrado a 1 mL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El SUB-C diluído es estable durante 4 semanas si se almacena a temperatura ambiente y se protege de la luz. 1.Dispense 20 μL de la Solución de Desnaturalización (DEN, azul) en una esquina de cada

uno de los pocillos usados. 2. Añada a la solución 20 μL de muestra amplificada, pipetee arriba y abajo para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos usando pinzas e identifíquelas marcando bajo el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siempre guantes cuando manipule tiras. 3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL de Tampón de Hibridación (HYB, verde) precalentado. Agite suavemente la bandeja hasta que la solución tenga un color homogéneo. Tenga la precaución de no derramar solución en los pocillos cercanos. 4. Ponga una tira en cada pocillo. Las tiras tienen que quedar completamente cubiertas por la solución y el lado con la sonda hacia arriba (identificable por el marcador coloreado próximo al extremo inferior). Usando pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran haberse girado durante su inmersión. Limpie cuidadosamente las pinzas después de cada uso para evitar contaminación. Ello, es también de aplicación en los pasos siguientes. 5. Ponga la bandeja en el baño de agua con agitación o en el TwinCubator durante 30 minutos a 45°C. Ajuste la frecuencia de agitación del baño de agua para que realice una mezcla completa y constante de la solución. Para obtener una adecuada transferencia de calor, la bandeja debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de su altura. 6. Aspire completamente el Tampón de Hibridación. Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío. 7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astringente (STR, roja) a cada tira e incube durante 15 minutos a 45°C en un baño con agitación o TwinCubator. Desde este paso, en adelante, trabaje a temperatura ambiente. Elimine completamente la Solución de Lavado Astringente. Deseche la Solución de Lavado en un contenedor y elimine todo el líquido restante volcando la bandeja y golpeándola suavemente sobre un papel absorbente. Ello es también de aplicación a todos los demás pasos de lavado.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 95

8.Lave una vez cada tira con 1 mL de Solución de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitado del TwinCubator (elimine el RIN después de la incubación). 9. Añada 1 mL de Conjugado diluído (ver más arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator. 10. Elimine la solución y lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto aproximada- mente con 1 mL de agua destilada (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de agitación del TwinCubator (deseche la solución cada vez). Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua después del lavado anterior. 11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más arriba) a cada tira e incube sin agitación y protegiéndolas de la luz. Dependiendo de las condiciones del test (por ej. la temperatura ambiente), el tiempo de incubación del sustrato puede variar entre 3 y 20 minutos. Tiempos prolongados de incubación del sustrato pueden conducir a una tinción incrementada del fondo y podría dificultar la interpretación de los resultados. 12. Detenga la reacción aclarando brevemente por dos veces con agua destilada. 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bandeja y séquelas entre dos capas de papel absorbente. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la luz. Con cada kit se proporciona un formulario de evaluación. Cuando se utilice este formulario de evaluación, pegue las tiras reveladas en los campos marcados, alineando las bandas CC y UC con las respectivas líneas del formulario. Anote el número de las bandas positivas en la penúltima columna y determine la especie con la ayuda de la tabla de interpretación y registre el nombre de las especies identificadas en la última columna. La plantilla suministrada también sirve como ayuda para evaluación y ha de ser alineada con las bandas UC y CC de la tira. Cada tira tiene un total de 17 zonas de reacción (ver esquema).

Control de Conjugado (CC) Debe aparecer una línea en esta zona, documentando la eficacia del conjugado unido y la reacción del sustrato. Control Universal (UC) Esta zona detecta, como es conocido, todas las micobacterias y miembros del grupo de bacterias gram-positivas con alto contenido de G+C. Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen como positivas, pero el restante esquema de bandas no puede ser asignado a una micobacteria específica, se deben aplicar métodos adicionales para identificar la especie bacteriana correspondiente. Solamente han de considerarse aquellas bandas cuyas intensidades sean tan fuertes, o más fuertes, que la intensidad del Control Universal. Control de Género (GC) La coloración en esta zona documenta, como conocida, la presencia de un miembro del género Mycobacterium. La intensidad de esta banda varía dependiendo de la especie de Micobacteria. La banda del Control de Género puede desaparecer a pesar de la presencia de DNA micobacteriano; sin embargo, siempre que esté presente un patrón de bandeo específico de especie, la reacción de amplificación se llevó acabo correctamente y el resultado del ensayo es válido.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 96

Cuando no aparece patrón de bandas específico de especie, un patrón que indique la presencia de una bacteria gram-positiva con alto contenido en G+C puede, en casos raros, estar originado por una Micobacteria que no puede ser detectada por este kit. Por favor, tenga en cuenta que puede identificar especias adicionales de micobacterias con el kit GenoType Mycobacterium AS.

PRECAUCIONES Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido (PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cualquier fuente potencial de DNA contaminante. Si se requiere almacenar durante más de 4 semanas, almacene a –20°C. A fin de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote el PNM. Almacene el resto de los componentes del kit en 2-8°C. No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad. Los especímenes de los pacientes y los cultivos realizados a partir de especímenes de pacientes deben ser considerados siempre como potencialmente infecciosos. Las muestras de

Otras bandas Sondas Específicas; para la evaluación ver la tabla de interpretación. No todas las bandas de una tira han de mostrar la misma intensidad. Si fue usada una gran cantidad de amplicón, pueden aparecer bandas adicionales. TABLA DE INTERPRETACIÓN

pacientes de riesgo (infectados por microorganismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cultivos realizados a partir de esas muestras deben ser etiquetados y manejados siempre bajo las condiciones de seguridad adecuadas, de acuerdo con las guías institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. El tratamiento y preparación de la muestra, incluyendo el paso de inactivación por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II.

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X

Pág. 97

Antes del paso de inactivación por calor las muestras deben ser centrifugadas en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con contenedor de aerosoles solamente en la cabina de seguridad. Después de la inactivación por calor se puede utilizar un rotor standard para centrifugar las muestras fuera de la cabina de seguridad. Observe las precauciones normales para preparar la amplificación. Es esencial que todos los materiales y reactivos usados para extracción de DNA y amplificación estén libres de DNasas. Cuando manipule los reactivos del kit debe tomar las siguientes medidas especiales de seguridad: La Solución de Desnaturalización (DEN) contiene