Reto Microbiano Facultad de Quimica

 

Módulo 1.A Higiene   Higiene Parecería innecesario señalar la importancia que tiene el manejo sanitario de los alimentos. Se sabe bien que cada año ocurren miles de casos de infecciones, intoxicaciones o toxiinfecciones, transmitidas por ellos y que una proporción considerable tiene un desenla desenlace ce fatal. Estos prob problemas lemas de salud causan también pérdidas económicas por ausentismo e incremento en el costo de los servicios de atención médica. Todo esto sucede debido a que, a pesar de los esfuerzos desarrollados por las autoridades de los servicios de salud, todavía hay volúmenes considerables de productos alimenticios que llegan al consumidor contaminados a causa de un manejo deficiente. El saneamiento de los alimentos significa eliminar o controlar en forma efectiva los microorganismos presentes en ellos y en todo aqu aquello ello con lo qque ue entren en contacto. La presencia numerosa de bacterias indica que algo no se hizo bien al prepararlos o sea, que se manipularon deficientemente. Pero la higiene en su manejo m anejo depende no solamente de la legislación al respecto o del equipo utilizado. El papel que desempeñan quienes preparan y quienes sirven alimentos continuará siendo de gran responsabilidad, pues actúan directamente sobre el aparato digestivo digestivo de millones de consumidores. Ambos iinfluyen nfluyen decisivamente en el grado de salud pública de un país. La inocuidad de lo loss alimentos, es relativos productoalde muchas acciones dentro de las cuales los aspectos manejo higiénico, asídirectas como ele indirectas, monitoreo a través del muestreo y análisis tanto de superficies vivas e inertes como de dell ambiente, son de suma importancia. La tendencia actual en la industria transformadora de los alimentos, es implementar planes y programas de análisis ddee riesgos y puntos críticos de control (siglas en inglés HACCP), y es requisito entrenar a los obreros en buenas prácticas de limpieza e higiene, e instruir un sistema de monitoreo para asegurarse de que se están siguiendo las instrucciones para reducir el riesgo de contaminación. El HACCP es un enfoque moderno cuya pretensión primaria consiste en eliminar de los alimentos los riesgos a la salud asociados a su consumo. Por lo tanto es de suma importancia el conocer metodologías analíticas adecuadas para efectuar (o bien solicitar a laboratorios laboratorios de ap apoyo) oyo) el análisis de superficies inertes, vivas y medio ambiente y, con base en los resultados analíticos, conocer las condiciones de operación operación reales que prevalecen en llaa industria. El análisis de estos resultados permitirá mantene mantenerr o bien emitir e implementar medidas correctivas oportunas cuya finalidad es la obtención de productos alimenticios dentro de estándares de calidad y seguridad alimentaria. A continuación se presenta el sign significado ificado de algunos términos eenn el tema del manejo higiénico de los alimentos: a. Contaminación cruzad cruzada: a: Proceso por el que llos os microorganismos son trasladados por medio de personas, equipos, materiales, de una zona sucia o contaminada a una zona limpia. b. Contaminación: Es la presencia de cualquie cualquierr material extraño en los productos alimenticios que origina que sean inadecuados para el consumo. c. Control de calidad: Signi Significa fica un proced procedimiento imiento planificado y sistemático pa para ra tomar todas las acciones necesarias para prevenir que los alimentos sean adulterados 󰁩  

 

dentro del significado de la legislación del país correspondien correspondiente. te. d. Higiene de los alimentos: Todas las medidas necesarias para garantizar la inocuidad e higiene de los alimentos en todas las fases, desde su cultivo, producción o manufactura hasta su consumo final. e. Higiene: Parte de la medicina que tiene por concepto la conservació conservaciónn de la salud y los medios para prever las enfermedades; limpieza es la primer regla de la Higiene. f. Higiénico: Libre de niveles nocivos de microo microorganismos rganismos y contaminantes. g. Saneamiento: Limpio: libre deSignifica suciedadtratar visible. h. adecuadamente las sup superficies erficies de contacto con los alimentos aplicando un proceso que sea efectivo para destruir las células vegetativas de los microorganismos de importancia en salud pública y para reducir substancialmente el número de otros microorganismos indeseables, sin afectar adversamente el producto o la seguridad del mismo para los consumidores. i. Sanidad: Sig Significa nifica sano y consiste en conserva conservarr la calidad de los productos mediante métodos físicos (frío, calor), químicos (sal, ácidos, conservadores, etc.) manteniendo todas sus propiedade propiedadess nutrimentales inalterables.

Referencias:  Referencias:  Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España. Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products. American Public Health Health Association. Copyright, Washingto Washington, n, D. C. (1972). Técnicas (1972).  Técnicas sanitarias en el manejo de los l os alimentos alimentos.. ed. Pax-México. México, D. F. Harrigan, W. F. & Park, R. W. A. ((1991). Making safe food: A management guide for microbiological quality. Academic Press. U.K. Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994. NOM-093-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Prácticas de Higiene y Sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos. Norma Mexicana NMX-F.605-NORMEX-2000. NMX-F.605-NORMEX-2000. Alimentos Manejo Higiénico en el Servicio de Alimentos Preparados para la Obtención del Distintivo H. Norma Oficial Mexicana NOM-120-SSA1-1994.  NOM-120-SSA1-1994.  Bienes y Servicios. Práctias de Higiene para el Proceso de alimentos, bebidas no alcohólicas y alcohólicas.

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Objetivos: •

Determinar microorganismos viables en superficies inertes y vivas/ambiente, vivas/am biente, con o sin tratamiento de higiene.

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Detectar la presencia de microorganismos indicadores de contaminación de los alimentos.

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Aplicar métodos de enumeración adecuados, según la superficie-ambiente s uperficie-ambiente que se vaya a analizar.

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Relacionar la estimación de llaa cifra de microorgan microorganismos ismos presentes en la superficie/ambiente, con la calidad del producto procesado o manipulado, para concluir acerca de posibles efectos para la salud del consumidor.

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Explicar el efecto de sustancias desinfectantes utilizadas en los procesos de higiene de superficies.

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Comparar la efectividad de diferentes sustancias desinfectantes utilizadas en los procesos de higiene de superficies.

Ejercicio: 1. Con base en bibliografía, qué grupo o grupos de microorganismos se sugiere analizar en las superficies que estarán en contacto durante el proceso del alimento que se le asignó. 2. ¿Cuáles son los llímites ímites o especificaciones microbiológicas rrecomendadas ecomendadas en bibliografía especializada especializada pa para ra considerar uuna na superficie apta para manejar higiénicamente el alimento? 3. ¿Y para considerar un ambiente limpio para manejar higiénicamente el alimento? 4. ¿A qué nicho dey por consumidores se recomendaría la utilización ddee las sustancias desinfectantes qué?. 5. ¿Qué medidas pro propone pone para disminuir la carga microbiana de un ambiente qque ue ponga en riesgo la calidad higiénica del alimento? 6. Qué otras té técnicas cnicas conoce pa para ra realiza realizarr el anál análisis isis de sup superficies? erficies? 7. Los resultados ob obtenidos tenidos ¿concuerdan con lo que usted esperaba? Expli Explique. que.

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ANALISIS DE SUPERFICIES INERTES.

OBJETIVO. Este procedimiento proporciona las reglas para la toma y análisis de superficies inertes por los métodos del hisopo, esponja, enjuague total y placa por contacto ó Rodac. GENERALIDADES. La higiene los alimentos implica una varie variedad dad de accione acciones, s, entre las cuales, el evitar la contaminación ocupa lugar relevante. Cada fuente de contaminación que puede actuar sobre los alimentos presenta sus propias peculiaridades y por ello requiere de métodos especiales para lograr su control. control. Así ocurre con el agu agua, a, los manipuladores, equipo, envases, superficies de trabajo, etc. En el caso del equipo, éste puede ser un vehículo pasivo de microorganismos, o puede constituirse en la base material sobre la cual, debido a un aseo deficiente, entren en actividad y lleguen a introducirse, por millares, en el alimento. La calidad sanitaria de los alimentos, depende de la materia prima utilizada en su preparación y de las condiciones higiénicas en que han sido elaborados, manejados y conservados, incluyendo todas las superficies que están en contacto con ellos. Dinero y esfuerzo invertido en una una planta para sele seleccionar ccionar materias primas e instalar equipo costoso, pueden perderse si la limpieza y desinfección en general, y específicamente en los puntos críticos, no se realiza adecuadamente y/o si no se evalúa su eficiencia correctamente. Existen procesos de lavado y desinfección, que utilizan sustancias y condiciones de tratamiento propios para cada necesidad, en las distintas ramas de la industria de alimentos. Cuando las nor normas mas o recomendaciones par paraa su aplicación se siguen con acierto, los resultados resultados son claramente satisfactorios. El establecimiento ddee sistemas de (lavado y sanitización) adecuados del equipo, debidamente programados en higiene manos de personal responsable y adiestrado, debieran ser una exigencia, motivoy de supervisión especial, dentro de cada industria y por parte de la autoridad sanitaria competente. El laboratorio proporciona un valioso recurso que permite evaluar satisfactoriamente la eficiencia de estos procesos. Para evaluar la eficiencia de la limpieza y saneamiento de las superficies, se han desarrollado métodos y propuesto normas basadas en el número total de microorganismos m icroorganismos por unidad de superficie. Existen muchos métodos para tal t al efecto, el recuento de microorganismos viables en el equipo tratado es sencillo y confiable, aunque necesariamente requiere de tiempo para disponer de los resultados. Los métodos pueden aplicarse ya sea para buscar microorganismos indicadores, o un género especial, cuando se trate de un problema particular. Existen varios procedimientos, dentro de los cuales describiremos los más usuales: PROCEDIMIENTO 󰁩󰁶  

 

MÉTODO DEL HISOPO. Esta técnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas. Consiste en frotar un aplicador de madera u otro material de algodón (hisopo) estéril, humedecido con la solución diluyente que recoge la flora microbiana en un área determinada para finalmente suspenderla en el diluyente.  diluyente.  Siguiendo las instrucciones del método y contando con un valor normativo, es posible decidir sobre el nivel de contaminación que pprevalece revalece sobre un unaa superficie. Hay que tomar en consideración la particular. representatividad que ofrece este ensayo para sugerirlo a una planta o a un proceso PRUEBA LIMITE PERMITIDO Mesofílicos aerobios Coliformes totales

< 400 UFC/cm2 o unidad < 200 UFC/cm2 o unidad

Fuente: Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994. Prácticas de Higiene y Sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos.

MATERIAL • •

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Tubos con tapón de rosca conteniendo 10,0 mL m L de solución diluyente. Hisopos estériles en sobres de pa papel pel manila o tub tubos os de ensayo. Se pueden conseguir en forma comercial. Plantillas aluminio de 12,0 dentro cm pordelado conmanila. un cuadro de 5,0 x 5,0 cm recontadode en papel el centro y esterilizadas papel

TOMA DE LA MUESTRA. Muestreo de superficies. Colocar la plantilla o bien delimitar un área aproximada de 5,0 x 5,0 cm ó 10,0 x 10,0 cm sobre la superficie que se va a muestrear. Sacar el hisopo hisopo asépticamente. Si la superficie está seca, humedecer el hisopo en la solución diluyente y presionar contra la pared del frasco o tubo con un movimiento de rotación para quitar el exceso de líquido, en caso contrario no es necesario hacer esto. Con el hisopo inclinado, frotar la superficie delimitada por la plantilla en 3 sentidos diferentes oblicuo). Regresar el hisopo al tubo o frasco y romper la parte que(horizontal, estuvo en vertical contactoy con los dedos. Este método también puede utilizarse para buscar patógenos, substituyendo la solución diluyente por el caldo de cultivo adecuado. Muestreo de utensilios de comedor. Utilizar tubos con l0,0 mL. Tomar un hisopo, mojarlo en la solución diluyente y exprimir el exceso de líquido sobre la pared del tubo. Tomar la muestra del utensilio con el hisopo tratando de tomar de la superficie que está en contacto con el alimento o con la boca. Regresar el hisopo al tubo y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos. Una vez tomada la muestra, se procede procede a hacer el recuento, por el método más adecuado, generalmente cuenta en placa, con los medios de cultivo recomendados para el grupo bajo estudio. 󰁶  

 

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Superficies. Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el cálculo de las colonias por mL, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre cm 2  de la superficie. superficie. Los resultados se expresan como UFC/cm2. Utensilios de comedor. Hacer el cálculo del número de colonias por mL, multiplicar el volumen total de la solución diluyente de muestreo. Informar UFC/utensilio. MÉTODO DE LA ESPONJA. Esta técnica se puede aplicar eficientemente para tomar muestras de superficies en áreas grandes. Se utilizan espon esponjas jas estériles de espuma de poliuretan poliuretanoo generalmente de 13,0 x 7,5 x 4,0 cm (o de dimensiones requeridas) y bolsas de plástico transparentes estériles de las dimensiones dim ensiones necesarias. Consiste en pasar la esponja sobre toda la superficie del equipo o utensilio que se va a muestrear pudiendo estimar de esta manera el contenido microbiano de toda la superficie y no únicamente de dimensiones limitadas. La bolsa de plástico se invierte a modo de guante sobre la mano del muestreado, haciendo que la parte interna pase a ser la externa y con la mano así protegida, se toma una esponja retirándola de la envoltura de papel manila. Se humedece la esponja con un poco de la solución diluyente estéril y se frota completamente toda la superficie que se va a muestrear. Terminando el muestreo, se vuelve la bolsa a su posición original quedando la esponja en su interior y se adiciona el resto del volumen de la solución diluyente a la bolsa que plástico que contiene la esponja y se homogeniza exprimiend exprimiendoo repetidamente la esponja. Esta suspensión será considerada como la muestra directa y a partir de ella se harán las diluciones necesarias. Las superficies y utensilios a muestrear pueden ser de forma y tamaño muy diverso, tales como, tablas de muestra picar (tratando de llegardel a las hendiduras y esquinas), utensilios demesas, comedor (tomar de la superficie utensilio con excepción del mango, prestando atención a la parte interna como es el caso de los tenedores entre diente y diente), vasos, platos (tomar la superficie expuesta a los alimentos, incluyendo el borde que está en contacto con los labios del usuario), manos (la palma de la mano y parte interna y externa de cada uno de los dedos), etc. MATERIAL •

Esponjas de poliuretano o de celulosa de dimensiones apropiadas a la superficie que se va a muestrear. Envueltas individualmente en papel manila y esterilizadas en autoclave a 121ºC por 30 min. Se puede puedenn conseguir en forma comercial estériles. Bolsas Whirlpack con esponja.

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Frascos con tapa estéril. de rosca con 50,0 mL o 100,0 mL (o el volumen necesario).de solución diluyente

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Bolsas de plástico estériles de la dimensión necesaria.

TOMA DE LA MUESTRA Sacar la esponja utilizando la bolsa invertida a manera de guante, humedecerla con la solución diluyente y frotar vigorosamente con la esponja el área de muestreo . Regresar la esponja a la bolsa de plástico y verter el resto del líquido diluyente. Cerrar la bolsa y homogenizar exprimiendo repetidamente la esponja. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Contar las colonias y calcular el número de UFC/mL multiplicar por el volumen del diluyente y reportar por unidad de superficie (cm 2) o por utensilio. MÉTODO DE PLACA POR CONTACTO, RODAC (Replicate Organism Detection and Counting). Este método se recomienda para obtener datos cuantitativos en superficies planas e impermeables. Idealmente la pla placa ca se debe uutilizar tilizar sobre sup superficies erficies que han sido previamente saneadas y desinfectadas, ya que en lugares con un alto grado de contaminación, resultará un crecimiento masivo en las placas que dificultará los recuentos. En el caso de muestreo de superficies previamente tratadas con desinfectante, es necesario que se agregue al medio de cultivo un agente neutralizante adecuado, por ejemplo, lecitina para neutralizar co compuestos mpuestos cuaternarios de amonio, y poli polisorbato sorbato 80 para neutralizar desinfectantes fenólicos. En superficies en las que se sospeche que se encuentran un poco más contaminadas se deben tomar suficientes muestras para obtener obtener datos representativos. La selección del sitio al azar permitirá comparaciones adicionales y eliminará posibles interferencias. MATERIAL • •

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Las placas RODAC se pueden obtener en forma comercial. Cuando se preparan en el laboratorio, deben vaciarse de 15,0 -16,0 mL de agar para cuenta estándar en cajas de petri desechables. (El agar en la placa debe quedar ligeramente convexo en la superficie del centro, para poder hacer contacto adecuado con la superficie. Se pueden emplear medios de cultivo para determinar indicadores o bien patógenos.

TOMA DE MUESTRA Quitar la tapa de plástico y presionar cuidadosamente el agar contra la superficie, mediante movimiento rotatorio uniforme, presionar sobre la parte de atrás de la placa para efectuar el contacto. Colocar de nuevo la tapa e incubar incubar en posición invertid invertidaa 2448 h a 35+/-1ºC. 󰁶󰁩󰁩  

 

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Efectuar la lectura a las 24 h para prevenir crecimiento incontable, en caso de observar crecimiento pobre incubar 24 h más. Se cuentan las colonias y se informa el número por placa o por cm 2, dividiendo el número de colonias, entre la superficie de contacto de la caja. Debido a que la interpretación es relativa, cada laboratorio o industria, deberá establecer sus propios valores que constituyen un área limpia. El Comité sobre contaminación microbiana de superficies de laboratorios de la APHA establece los siguientes límites: No. colonias por placa Rodac 0-25 25-50 50 ó más

Calidad bien regular pobre

MÉTODO DE ENJUAGUE TOTAL Este método se emplea para tomar muestras de objetos pequeños como son cucharas, tenedores, biberones, etc. o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas y bolsas de plástico, etc. MATERIAL • •

Frascos de boca ancha con 50,0 mL de solución diluyente, o con la cantidad necesaria según el tamaño del objeto que se va a muestrear. Bolsas de plástico estériles de tamaño adecuado al objeto que se va a muestrear. m uestrear.

TOMA DE MUESTRA Utensilios. Sumergir la superficie de los utensilios que estén en contacto con la boca (cucharas, tenedores, etc.) en frascos de boca ancha con la solución diluyente o bien, verter la solución dentro de una bolsa estéril, colocar el objeto que se va a muestrear, enjuagar perfectamente bien el objeto y regresar el líquido al frasco inicial. Superficies interiores. Introducir en el envase o bolsa que se va a m muestrear uestrear 10,0 mL o el volumen adecuado de solución diluyente. Enjuagar haciendo correr el líquido por toda la superficie, agitar bien. Regresar el contenido de los envases al frasco. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS 󰁶󰁩󰁩󰁩  

 

Contar las coloni colonias as y eexpresar xpresar la lass UFC/utensili UFC/utensilioo o envase, tomando en cuenta el el volumen del diluyente y si se efectuaron diluciones posteriores. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS PARA LOS CUATRO MÉTODOS ANTERIORES. Transferir volúmenes de 1,0 mL y 0,1,0 mL o diluciones de la muestra a cajas de Petri marcadasel con la clave, f echa, medio de cultivo y dilución inoculada. Agregar medio de cultivo cultfecha, ivo seleccionado: • Agar triptona extracto de levadura para cuenta de mesofílicos aerobios • Agar bilis rojo violeta para cuenta de organismos coliformes totales. Añadir una doble capa del mismo medio de cultivo una vez solidificada la primera capa, para crear condiciones de anaerobiosis. • Agar papa dextrosa acidificado para cuenta de hongos y levaduras. Acidificar a un pH de 3.5 +/- 0,1 con ácido tartárico estéril a 10,0% (aproximadamente 1,4 mL de ácido tartárico por cada 100,0 mL del medio). SUPERFICIES Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el cálculo de las colonias por mL, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre los cm 2 de la superficie. Los resultados se expresan en UFC/cm 2. EJEMPLO Si se tomó la muestra de 4 superficies de 25,0 cm 2 c/u en un volumen de 10,0 mL de diluyente, multiplicar el número de colonias x 1100 y dividir el resultado entre 100 para obtener las UFC/cm2. UTENSILIOS DE COMEDOR Hacer el cálculo del número de colonias por mL, multiplicar el volumen total de la solución diluyente de muestreo y sacar promedio dividiendo entre el número de utensilios muestreados para informar UFC/utensilio. BIBLIOGRAFIA 

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Manual of Food Quality Control. 12. Quality assurance in the food control microbiological laboratory. laboratory. FAO. Rom Rome, e, 1991. Manual de prácticas. Curso: Toma y manejo de muestras para análisis bacteriológico. Laboratorio Nacional de Salud Pública. México 1992. Standard methods for the examination of dairy products. APHA. 16 th. 1992. Procedimiento para el examen microbiológico m icrobiológico de superficies y utensilios. Secretaría de Salud. Laboratorio Nacional de Salud Pública. México 1990.

 

Medios de Cultivo

Agua Peptonada Peptona Cloruro de sodio

1,0 g 8,5 g

Agua destilada

1,0 L

Disolver los componentes de la formulación en un litro de agua y ajustar la solución a pH de 7,0, con solución de hidróxido de sodio 1,0 N; distribuir en matraces o tubos, de acuerdo a los requerimientos de la técnica y esterilizar a 121°C±1°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, los volúmenes y el pH de la solución deben ser iguales a los iniciales. Bilis rojo rojo vvioleta, ioleta, agar Peptona de carne Extracto de levadura Cloruro de sodio Lactosa Mezcla de sales biliares Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada

7,0 g 3,0 g 5,0 g 10,0 g 1,5 g 0,03 g 0,002 g 13,0 g 1,0 L

Humectar perfectamente los ingredientes del medio en 750,0 mL de agua, posteriormente ajustar el pH a 7,4±0.1 y esterilizar en condiciones suaves: 30 minutos en baño de vapor. No esterilizar en caso de usarlo al momento. Principio de acción

La bilis de buey que contiene una mezcla de sales biliares y que se encuentra en el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes cuyo Gram es negativo. Las sales biliares se presentan como derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química básica es la del ciclo pentano perhidrofenantreno. Métodos Estándar para, agar Peptona de caseína Extracto de levadura Dextrosa Agar 󰁸  

5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g

 

Agua destilada

1,0 L

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullición para disolver por completo y ajustar el pH a 7,0 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en tubos de ensayo con tapón de rosca o en un matraz, después esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando se necesite. Principio de acción La peptona de caseína proporciona aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas complejas necesarias para el crecimiento bacteriano. El extracto de levadura proporciona vitaminas del complejo B y la dextrosa es utilizada por los microorganismos como la fuente f uente de carbono y energía. Es un medio general por lo que no contiene inhibidores. Papa dextrosa agar Infusión de papa, (a partir de 200g de papa) Dextrosa

4,0 g 20,0 g

Agar Agua destilada

15,0 g 1,0 L

Se suspenden los ingredientes en el agua destilada, permitiendo la humectación de los polvos, para evitar la formación de grumos que son difíciles de disgregar, calentar el medio hasta ebullición y finalmente esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar el medio de cultivo en baño de agua hasta 45°C±1°C, después acidificar a un pH de 3,5 3, 5 ± 0,1, con ácido tartárico al 10% previamente esterilizado (1.4 mL de ácido tartárico por cada 100,0 mL m L de medio de cultivo). Después de adicionar el ácido tartárico al medio de cultivo, medir m edir el pH con un potenciómetro. Principio de acción A partir de los hidratos de carbono contenidos en la infusión de papa, se observa que éstos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que a otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido tartárico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo 14,0 mL del ácido.

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ANALISIS DE SUPERFICIES VIVAS. OBJETIVO Monitorear las manos del personal que realice manipulaciones en cualquier punto de la cadena de transformación de los alimentos. MATERIAL METODO DEL HISOPO • •

Tubos con tapón de rosca conteniendo 10,0 mL m L de solución diluyente. Hisopos estériles en sobres de pa papel pel manila o tub tubos os de ensayo. Se pueden conseguir en forma comercial.

PROCEDIMIENTO a) METODO DEL HISOPO. Esta técnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas. Consiste en frotar un aplicador de madera u otro material de algodón (hisopo) estéril, humedecido con la solución diluyente que recoge la flora microbiana en un área determinada para finalmente suspenderla en el diluyente. Siguiendo las instrucciones del método y contando con el siguiente valor normativo, NOM-093-SSA1-1993. Prácticas de higiene y sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos. a) Manos de personal Cuenta total de Mesofílicos aerobios Cuenta de coliformes totales

< 3 000 UFC/mano UFC/manoss  < 1 500 UFC/mano

< 10 UFC/manos UFC/manos  < 5 UFC/mano es posible decidir sobre el nivel de contaminación que prevalece sobre las manos del operario. Tomar un hisopo y sumergirlo en la solución diluyente retirando el exceso de líquido. Limpiar bien la superficie de la palma de la mano, así como la superficie interna de dedos y uñas. Repetir la la operación tomando muestra ddee la otra mano. Regresar el hisopo nuevamente al tubo y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos. Transferir volúmenes de 1,0 mL y 0,1,0 mL o diluciones de la muestra a cajas de Petri marcadas con la clave, fecha, f echa, medio de cultivo y dilución inoculada. Agregar el medio de cultivo cult ivo seleccionado: • Agar triptona extracto de levadura para cuenta de mesofílicos aerobios • Agar bilis rojo violeta para cuenta de organismos coliformes totales. Añadir doble capa del mismo medio m edio de cultivo una vez solidificada la primer capa. 󰁸󰁩󰁩  

 

CÁLCULO Y EXPRESION DE RESULTADOS METODO DEL HISOPO Superficie de manos Calcular el número de colonias por mano o manos mano s, multiplicando por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre 2 en el caso de haber muestreado ambas manos. Reportar como UFC/superficie de mano. BIBLIOGRAFIA Procedimiento para el Examen Microbiológico de Superficies y Utensilios. Secretaria de Salud. Dirección General de Epidemiología. Laboratorio Nacional de Salud Pública. México 1990

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UN DESINFECTANTE INTRODUCCION La eliminación adecuada de los microorganismos constituye una fase importante en la higiene de las plantas que elaboran alimentos, esto se puede considerar como uno de los problemas principales en la presencia de enfermedad para los consumidores, en donde el alimento es el vehículo del microorganismo patógeno. Las superficies contaminadas, los utensilios y el equipo fuente importante de microorganismos patógenos paramal los saneado, alimentos,constituyen por lo queuna es necesaria la utilización de algunos desinfectantes en estas fuentes de contaminación. La utilización de sustancias como desinfectantes sobre los microorganismos patógenos es de gran interés, el conocer el metabolismo microbiano m icrobiano para entende entenderr los mecanismos de acción de los desinfectantes y sus implicaciones prácticas, ha dado lugar a mucha información a fin f in de desarrollar un concepto más claro, sobre todo de la acción de los desinfectantes más comúnmente utilizados en la Microbiología de los Alimentos. 1.- Mecanismos de acción de los desinfectantes comúnmente usados en la industria alimentaria.  alimentaria.  La reacción de los desinfectantes con los constituyentes celulares puede involucrar reacciones de óxido-reducción, hidrólisis, formación de sales, transposición con algunos grupos como los de las proteínas, adsorción en la interface, etc., lo anterior puede suceder en partes fundamentales de los microorganismos: lesióndea las la membrana consecuencia inhibición enzimas. celular, lesión al núcleo, a los genes y en 2.- Lesión a la membrana celular: Algunos desinfectantes, como compuestos nitrogenados, fosforados, y los detergentes rompen la barrera osmótica permitiendo la salida de los componentes celulares metabólicamente activos, destruyendo con esto a los microorganismos. Otros desin desinfectantes fectantes como el peróxido de hid hidrógeno rógeno o los compuestos halogenados ejercen su acción antimicrobiana al reaccionar con los compuestos de la membrana citoplasmática. 3.- Lesión al núcleo y a los genes: Algunos genes: Algunos agentes tienen afinidad particular por los núcleos o genes de las células microbianas, por ej. Se tiene a los colorantes básicos, como el cristal violeta, los cuales reaccionan con los ácidos nucleicos de las nucleoproteínas quizás para la formación de sales. Los desinfectantes que presentan metales pesados reaccionan con los grupos sulfhidrilo (-SH) de las nucleoproteínas inhibiendo la acción enzimática, interrumpiendo con esto el crecimiento microbiano. Cualquier lesión en los genes se traduce t raduce en inhibición de las enzimas que los regulan. Los compuestos como desinfectantes que inhiben a las enzimas se encuentran en el ácido nitroso el cual desamina a ciertas bases del DNA, como a la adenina a la que convierte en hipoxantina, la citosina en uracilo y la guanina en xantina. En este grupo están algunos agentes alquilantes como el óxido de etileno, etilenmetasulfónico y las mostazas nitrogenadas, los cuales actúan por la alquilación de uno o más de los átomos de nitrógeno de las bases del ácido desoxirribonucleico (DNA), causando anomalías en el apareamiento de las bases en la hélice del DNA y también la pérdida posiblemente de una de las bases. Otro grupo de antimicrobianos que reacciona con el DNA y que lo hacen intercalándose entre los pares de las bases son el bromuro de etilo y la proflavina. Los desinfectantes del cloro, iodo y las sales cuaternarias de amonio son los más comúnmente utilizados en la industria de alimentos, presentando ventajas y 󰁸󰁩󰁶  

 

desventajas sobre su utilización. utilización. A continuación se menciona mencionann algunas ddee ellas de los tres grupos de desinfectantes. DESINFECTANTES

VENTAJAS

HIPOCLORITO (oxidación de enzimas esenciales IODOFOROS (inactivación de proteínas por iodinación) -

SALES CUATERNARIAS DE AMONIO (Tenso activo, rompe membrana celular, inactiva enzimas

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DESVENTAJAS

Barato Fáciles de aplicar en pequeñas cantidades Se usa en concentración de 10 ppm Tiempo de exposición corto (2 min 100 ppm) Actúa contra esporas Compatible con detergentes aniónicos Se usa en contracción de 200 ppm No presenta olor ni sabor

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mancha No son irritantes Tienen cualidades humectantes y de penetración Actúa sobre bacterias, hongos y virus Esta incorporado a un detergente tensoactivo aniónico no iónico o catiónico Estables en polvo seco o en pasta Sin olor No es corrosivo No es irritante de la piel Tiene poder residual Se usa en una concertación de 200 ppm de NH4 Es más activo en presencia de materia orgánica Es efectivo contra microorganismos Gram positivos y Gram negativos

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Es corrosivo Se inactiva por materia orgánica Deja olor y sabor desagradable

No actúan contra esporas bacterianas Más claro que el hipoclorito. Se inactiva por materia orgánica

Actividad antibacteriana limitada No es efectivo contra esporas ni muchos virus Es neutralizado por  jabones Pueden crecer microorganismos en él Deja película en superficies

 

OBJETIVOS: Conocer la acción de los agentes destinados para la limpieza y desinfección de equipo, utensilios, superficies, superficies, etc., en una plan planta ta procesadora ddee alimentos. Evaluar la acción de los agentes destinados para lavado y/o desinfección de frutas y verduras. Conocer técnicas utilizadas para evaluar la eficiencia de los desinfectantes. Evaluar la acción de procesos de lavado y/o sanitización o combinación de ellos. PROCEDIMIENTO: Cortar la cantidad necesaria para efectuar evaluaciones de una verdura o fruta cruda sucia, lavada, desinfectada o combinaciones de estas condiciones. Aproximadamente 50,0 g. Utilizar coladera, tabla y un cuchillo limpio par paraa realizar estas operacion operaciones. es. 1. PRODUCTO SUCIO (sin lavar ni desinfectar) Tomar 10,0 g de la verdura o fruta cruda y sucia y colocar en un frasco de dilu dilución ción con 90,0 mL de solución solución diluyente (dilución 1100  –1) practicar diluciones hasta 1100-4 o las que el técnico analista juzgue convenientes, en tubos con 9,0 mL de solución diluyente. Para cada dilución tomar alícuotas de 1,0 mL, m L, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se quiera quiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado según corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10  –1 a10  –4 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y 10  –1 a10  –3 para coliformes totales. 2. PRODUCTO Depositar 10,0 gLAVADO de la verdura o fruta cruda y sucia en una coladera y lavarla con una solución jabonosa preparada con detergente en polvo o líquido, enjuagar con suficiente agua del grifo y depositar los 10,0 g de la verdura o fruta (lavada) en un matraz con 90,0 mL de solución diluyente (dilución 10-1) y realizar diluciones hasta 10-3  o las diluciones que el técnico analista juzgue adecuadas, en tubos con 9,0 mL de solución diluyente. diluyente. Para cada dilució diluciónn tomar alícuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se requiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado según corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10  –1 a10  –3 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y 10  –1 a10  –2 para coliformes totales. 3. PRODUCTO LAVADO Y DESINFECTADO Preparar un desinfectante comercial en cantidad y tiempo de acuerdo con las indicaciones del producto. Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta cruda lavada lavada.. Procedimiento.- Escurrir la solución diluyente del matraz 10 -1 de la verdura o fruta (producto lavado) del paso anterior. Sumergir en la solución desinfectante durante el tiempo indicado en el marbete del producto. Escurrir los 10,0 g (lavados y desinfectados) y adicionar nuevamente 90,0 mL m L de solución diluyente (diluyente 10-1) y realizar diluciones hasta 10-2 o las diluciones que el técnico analista juzgue adecuada adecuadas, s, en tubos con 9,0 mL de solución diluyente. Para cada dilució diluciónn tomar alícuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se requiera determinar y verter el medio de cultivo fundido f undido y enfriado según corresponda. corresponda.  –1  –2 Sugerido: Probar diluciones 10 a10 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y 10  –1 para coliformes totales. PRODUCTO DESINFECTADO (sin lavar) Preparar el desinfectante comercial en cantidad y tiempo de acuerdo con las indicaciones del producto. Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta cruda sucia sucia.. Procedimiento.- Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta sucia en una solución desinfectante durante el tiempo indicado en el marbete del producto. Escurrir los 10,0 󰁸󰁶󰁩  

 

g (desinfectados) y adicionar nuevamente 90,0 mL de solución diluyente (diluyente 101 ) y realizar diluciones hasta 10-3  o las diluciones que el técnico analista juzgue adecuadas, en tubos con 9,0 mL de solu solución ción diluye diluyente. nte. Para cada dilución tomar alícuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se requiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado según corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10  –1 a10  –3 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y 10  –1 a 10  –2 para coliformes totales. NOTA: En cada uno de los casos (sucia, lavada, desinfectada y/o lavada y desinfectada) se utilizarán las diluciones adecuadas según la experiencia del técnico analista, empleando los medios correspondientes para cada uno de los grupos estudiados, y además se pueden realizar las combinaciones que se requieran, es decir, evaluar el desinfectante sobre la superficie o el producto mismo, habiendo previamente lavado o no o las condiciones seleccionadas. INCUBACION Mesófilos aerobios-Agar cuenta estándar. Incubar a 35 ± 2/48 ± 2 h. Organismos coliformes totales-Agar bilis y rojo violeta. Añadir doble capa una vez solidificada la primera primera capa. Incubar a 35± 2 /24 ± 2 h. Hongos y levaduras – Agar papa dextrosa acidificado. Incubar a 26± 2/3-5 días. Incubar a la temperatura y tiempos señalados para cada uno de los grupos microbianos. INTERPRETACIÓN Al finalizar el tiempo de incubación, realizar los recuentos para obtener el % de reducción o efectividad. Interpretación: el producto debe cumplir con el valor de efectividad de 99,0 y 99.9% de reducción en el tiempo de contacto, contacto, dosis y bajo la lass recomendaciones descri descritas tas en el marbete de cada producto. EXPRESIÓN Y CÁLCULO DE RESULTADOS. Utilizar la siguiente fórmula para expresar el % de reducción en cada una de las etapas, sucia, lavada, desinfectada y/o lavada/desinfectada: % de Reducción = 100 – B x 100 A A = Cuenta inicial B = Cuenta final obtenida Ejemplo 1: Cuenta total de mesofílicos aerobios: Cuenta inicial (sucia) 90 x 104 UFC/g :Con solución desinfectante cuenta obtenida (desinfectada)

8 x 102 UFC/g

% de Reducción = 100 – 8 x 10 2 x 100 = 99.9 % 90 x 104  Ejemplode 2: grupo colfirme total: Cuenta 󰁸󰁶󰁩󰁩  

 

Cuenta inicial (sucia)

70 x 103 UFC/g

Lavada y desinfectada: cuenta obtenida (lavada y desinfectada)

10 UFC/g

% de Reducció Reducciónn = 100 – 10 x 100 = 99.9 % 70 x 103  BIBLIOGRAFÍA Instituto Politécnico Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Departamento de Microbiología. Manual de Laboratorio de Microbiología Sanitaria. Association of Official Analytical Analytical Chemist. (1995) (1995).. Official Methods of Analysis. 16 th Ed. AOAC 960,09. Arlington, VA. Instituto Mexicano Mexicano ddel el S Seguro eguro Social. (1990). Actividades Antimicrobianas de Sanitizantes, Germicidas Germicidas y Detergentes. México, D. F. Banwart G. S. (1979). (1979). Microbiología Bá Básica sica de los alimentos. Ed. Bel Bellaterra. laterra. España. Frobisher, Hinsdill, Hinsdill, Cra Crabtree, btree, (197 (1974). 4). Fundamentals of Microbio Microbiology. logy. Ed. W. B B.. Saunders Company. USA. Gamboa, H. J. & Vela, Vela, A. H. (1 (1985). 985). Mecanismo de acción de los desinfectantes comúnmente usados en en las plantas de alimentos. Trabajo de M Microbiología icrobiología de alimentos. Laboratorio de M M.. Sanitaria. IPN: Reddrish, G. F. (1961). Antiseptics, Desinfectants, Fungicides, and Chemical and Physical sterilization. sterilization. Lea and Feb Febiger iger 2a. ed. USA.

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MONITOREO DEL MEDIO AMBIENTE. OBJETIVO El monitoreo e identificación de los microorganismos m icroorganismos del ambiente permitirá conocerlos y probar que desinfectantes germicidasestéri pueden para controlar las áreas, ya sean cuartos limpios, de preparación proeparación estériles les oatacarlos no estériles, y cualquier áárea rea de interés particular. EQUIPO Y MATERIAL • Incubadora a diferentes temperaturas. • Microscopio. • Cuenta colonias. • 1 placa de agar cuenta estándar • 1 placa de agar bilis y rojo violeta • 1 placa de agar papa y dextrosa

PROCEDIMIENTO NOTA: Medios de cultivo.- El medio de cultivo de donde se aíslan principalmente los microorganismos ambientales, es Agar Cuenta Estándar Estándar Tripticaseina. Se utiliza Aga Agarr Sabouraud o Agar Papa Dextrosa, para la investigación específica de hongos y levaduras, Agar BRV, para la investigación del Grupo Coliforme y agares selectivos y/o diferenciales para patógenos. Técnica de sedimentación en placa.- Las placas con los medios de cultivo para monitoreo de los 3 grupos grupos de microorgani microorganismos smos indicadores, se exponen al medio ambiente seleccionado, retirando la tapa de cada pplaca laca y colocando ésta boca abajo. Se sugiere colocar las placas con los medios de cultivo lo más cercanas entre sí, para que la calidad calidad del medio ambiente monitoreado sea hhomogénea. omogénea. Después de 15 minutos de exposición, las placas se tapan e incuban a 35 + 2 ºC/48 + 2 h. (bacterias) o 26 + 2 ºC / 3-5 3-5 días (hongos y levaduras). Considerar qu quee el volumen de aire monitoreado tras exponer durante 15 minutos las placas con los medios de cultivo, equivale a 1 m3. Efectuar el cómputo por placa de medio de cultivo utilizado para cada grupo microbiano. Reportar el cómputo de cad cadaa grupo microbiano en UFC/m3. Opcional: después de registrar características de desarrollo y morfología colonial, hacer un frotis (ver al mismo tiempo, consistencia de colonia, colonia, color, bord bordes, es, elevación, tamaño). Teñir con Gram y cuando sea necesario con otro colorante. Observar al microscopi microscopio. o. Las observaciones microscópicas, identificarán si son microorganismos mic roorganismos Gram positivos ó Gram negativos, a veces se observan mezclados de una sola colonia, cocos Gram negativos con bacilos de diferentes tamaños Gram positivos, negativos ó amorfos. am orfos.

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LÍMITE MÁXIMO PERMITIDO EN MEDIO AMBIENTE Prueba

Límite permitido

Mesofílicos aerobios Coliformes totales Hongos y levaduras

 15 UFC/m3  0 UFC/ m3  3 ≤ 15 UFC/m (para la sumatoria de ambos cómputos) ≤

Fuente: Standard Methods for tthe he examination of Dairy Products.

BIBLIOGRAFIA Manual of Food Quality Control. 12. Quality Assurance in the Food Control Microbiological Laboratory Laboratory.. FAO.- Rome, 1991. 1991.   Standard Methods for the Examination of Dairy Prod Products, ucts, 16 th Ed. (1992). Ro Robert bert T. Marshall, Ph D, Editor. APHA, Washington D. C.  C.  Garantía de Calidad de los Laboratorios de Microbiología Alimentaria. Organización Panamericana de la Salud. Organización Mundial de la Salud. Yolanda Ortega Dávalos. Fernando Quevedo. Copyright 1991. México, D. F.

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PRUEBA DEL RETO MICROBIANO.  MICROBIANO. 

OBJETIVO   OBJETIVO El método se basa en determinar el porcentaje de reducción de un número determinado de microorganismos, cuando se pone en contacto con un germicida bajo condiciones de pruebas específicas. MATERIAL • • • • • • • • •

Matraces Erlenmeyer de 250,0 mL, boca ancha con tapa de rosca. Probetas graduadas. Pipetas serológicas y bacteriológicas. Tubos de ensayo sin labio de 20,0 x 150,0 mm. Cajas Petri. Frasco cuadrado de dilución de boca ancha con tapas t apas de vinilo o baquelita. Baño de agua controlado a 25 ºC. Gradillas para los tubos Asa de 4,0 mm de diámetro y de 5,0-7,0 cm de longitud con porta asa.

MICROORGANISMOS DE PRUEBA  PRUEBA  Staphylococcus aureus   Escherichia coli   Pseudomonas aeruginosa  

ATCC 6538  ATCC 11229  ATCC 15442-2

Nota.- Determinar su resistencia al fenol cada tres meses. La re resistencia sistencia de E.coli   debe ser similar a la de S.typhi  con  con base en la sección 960,09 del AOAC (1995) y la de S.aureus   equivalente a las especificadas para este microorganismo en la sección 960,09 del AOAC (1995) p.70-71. PROCEDIMIENTO 1. Conservación y preparación de los microorganismo microorganismoss de prueba. Conservar las cepas del microorganismo, resembrándolas quincenalmente en tubos de 16,0 x 125,0 mm de agar nutritivo inclinado. Incubar a una temperatura de 35-37 ºC por un periodo de 20-24 horas. Posteriormente mantener los cultivos en refrigeración. Antes de realizar la prueba, efectuar 2 resiembras diarias consecutivas, incubando en las condiciones indicadas anteriormente. A partir de estos cultivos, resembrar 5 tubos de 22 x 175mm que contengan 12,0 mL de agar nutritivo inclinado inclinado e incubar bajo la lass condiciones antes señala señaladas. das. Recuperar 󰁸󰁸󰁩  

 

el crecimiento de cada tubo con 1,5 mL de solución salina estéril 0,85 % y estandarizar est andarizar la suspensión en condiciones condiciones asépticas al 9,0% de transmitancia a 580,0 nm ó 10,0% de transmitancia a 650,0nm para obtener un promedio de cuenta bacteriana de 10,2 x 109  UFC/mL. Verificar por cuenta en placa, conservan conservando do la suspensión origin original al en refrigeración. 2. Preparación de la muestra. Usar producto aylaporconcentración por el fabricante (directo o diluido). Medir el exactamente duplicado 99,0señalada mL del producto o su dilución. Transferir a un matraz Erlenmeyer de 250,0 mL, estéril con c on tapón de rosca. Preparar otros 2 matraces con solución reguladora de fosfatos diluida estéril, los cuales se emplean para determinar el número inici inicial al de microorganismos: (Matraz con 99,0 mL (solución reguladora de fosfatos) + 1,0 mL de cultivo estandarizado (10,2 x 109  UFC/mL= 75-125 x 106  UFC/mL) = Co Control ntrol “Cuen “Cuenta ta Inicial”. 3. Inoculación. Agitar el matraz y suspender la agitación justamente antes de la inoculación para que en el momento de de la misma, aún exista un movimiento residu residual al y así facilitar la incorporación del inóculo. Inocular individualmente 1,0 mL de la suspensión del microorganismo en el centro y sobre la superficie del líquido, evitando tocar con la pipeta el cuello o las paredes del matraz durante la inoculación. Agitar y exactamente a los 30 segundos de la inoculación, transferir 1,0 mL del cultivo expuesto a 9 mL m L de la solución neutralizante; mezclar y transferir alicuotas de 1,0 m mLL y 0,1 a cajas petri estériles por dulicado agregar de 12,0-15,0 mL de medio agar para métodos estándar con neutralizador (C). Homogeneizar, solidificar, invertir e incubar las placas durante 48 horas a 35-37 ºC. 4. Determinación de la cuenta inicial. Transferir 1,0 mL de la suspensión microbiana (1,.2 x 10 9) a 99,0 mL de la solución amortiguadora de fosfatos diluida y efectuar una lectura de 580,0 nm esperando que dé 9,0 % y a 680,0 dé 10,0 % . Hacer las diluciones decimales necesarias para obtener placas que contengan entre 30 y 300 colonias por placa de la dilución inicial (1:100) hacer diluciones 1:99 (aprox.). Colocar alícuotas de 1,0 mL por duplicado de cada dilución en cajas de petri estériles y de la última dilución, transferir alícuotas de 1,0mL 1,0m L y 0,10 mL por duplicado. Agregar 12,0-15,0 mL de agar para métodos estándares solidificar. Invertir e incubar las placas 48 horas a 35-37ºC. Después del periodo de incubación de todas las placas (control de inóculo y del producto), contar las UFC y ver el por ciento ciento de reducción del producto. Para que la prueba sea válida, el número de microorganismos en la suspensión del matraz 1:100, debe estar entre 75 y 125 x 10 6 UFC/mL. Para muestras que se analicen cada día, deben correrse paralelamente con un testigo del inóculo en igualdad de condiciones. 5. Interpretación. El producto debe cumplir con el valor de efectividad de 99,0 y 99.9,0 % de reducción a los 30 segundos de contacto. 󰁸󰁸󰁩󰁩  

 

EXPRESIÓN DE RESULTADOS.  RESULTADOS.  % de Reducción = 100 - B x 100 A En donde, A = Cuenta inicial B = Cuenta obtenida Ejemplo 1: S aureus   En germicida A

Cuenta Inicial Cuenta Obtenida

% de reducción = 100 - 8 x 102  x 100 90 x 106 

90 x 106 8 x 102 = 99,999%

Ejemplo 2: S.aureus   Cuenta Inicial 90 x 106  En germicida B Cuenta Obtenida 8 x 103 % de reducción = 1100 00 - 8 x 103  x 100 = 99 99,98% ,98% 90 x 106  Ejemplo 3: S. aureus   Cuenta Inicial 110 x 106  En germicida B Cuenta Obtenida 50 x 104 % de reducción = 1100 00 - 50 x 104 x 100 = 99,55% 110 x 106 BIBLIOGRAFÍA AOAC Official Me Methods thods of Analysis. 1995 Sección 960,09 16th Ed. pp.70-71. .70-71. Actividades Antimicrobianas de Sanitizantes, Germicidas y Detergentes IMSS-1990.

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MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES

Agar Nutritivo Extracto de carne Peptona de gelatina

3,0 g 5,0 g

Agar Agua destilada pH final 5,8 +/- 0,2

15,0 1,0 Lg

Métodos Estándar para, agar Peptona de caseína Extracto de levadura Dextrosa Agar Agua destilada

5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g 1,0 L

Disolver por los completo ingredientes en unellitro agua destilada, ebullición para disolver y ajustar pH de a 7,0 ± 0,2 a 25°C.calentar Distribuirhasta en tubos de ensayo con tapón de rosca o en un matraz, después esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando se necesite. Medios de agar para cuenta estándar, con neutralizante. Igual que agar para métodos estándar, excepto que hay que adicionar adicionar 25,0 mL de solución neutralizante y preparar. Pesar y re suspender la cantidad de cada uno de los medios indicados por el fabricante para un litro de agua. agua. Disolver por cale calentamiento ntamiento hasta ebullició ebulliciónn durante un minuto. Envasar de acuerdo a las ne necesidades cesidades y esteri esterilizar lizar a 121 ºC dur durante ante 15 minutos. Solución neutralizante Azolecitano (lecitina de soya) Polisorbato 80 Solución amortiguador de fosfatos 0,25 M

40,0 g 280,0 g 1,25 mL

Mezclar los ingredientes, disolverlos en agua destilada hasta obtener un volumen final de un litro; ajustar ajustar el pH a 7,2 y distribuir en porcione porcioness de 9,0 y 99,0 mL. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos.

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Solución amortiguadora de Fosfatos 0,25 M. Fosfato monobásico de po potasio tasio (KH2PO4) Agua destilada. En un matraz volumétrico disolver el KH2PO4 en 500,0 mL de agua destilada ajustar el pH a 7,2 +/- 0,1 utilizando solución de NaOH 0,1 N. Llevar al aforo con agua destilada, mezclar y distribuir en porciones de 100 mL esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos y conservar en refrigeración. Solución amortiguadora de fosfatos diluida.  diluida.   Tomar 1,25 mL de solución solución amortiguado amortiguadora ra de fosfatos 0,25 M y transferirla a un matraz volumétrico volumétrico ddee 1,0 L. Llevar al aforo con agua destilada. Mezclar y distribuir en tubos y matraces proporciones proporciones de 9,0 y 99,0 mL respectivamente esterilizar a 121 ºC durante 15 min.

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