Resumo de Virologia

3º Ano, 2º Semestre

Universidadee do Algarve - Licenciatura em Ciências Biomédicas Universidad  Virologia Aplicada Joana Canadas, Nº42351

Virologia Fora das suas células hospedeiras, os vírus sobrevivem como partículas virais, virais, ou viriões (partícula viral = virião; virião # vírus). O virião é um sistema de entrega de genes, contém o genoma do vírus as suas funções consistem na proteção do genoma e em auxiliar a sua entrada numa célula hospedeira, na qual poderá ser replicado e empacotado em viriões novos. ৺

O genoma é empacotado numa estrutura proteica conhecida como uma cápside. cápside.

Muitos vírus têm também uma componente lipídica, normalmente presente na superfície do virião formando um envelope, que também contém proteínas com funções de auxiliar a entrada nas células hospedeiras. Alguns vírus formam corpos de oclusão de proteção ao redor de proteínas. Virião ou Virion: possui genoma, cápside (natureza proteica), matriz, envelope (pode existir ou não), antirecetores (que lhe permite estabelecer contacto com a célula hospedeira; de onde “entra e sai informação”). É uma partícula viral completa que está fora da célula hospedeira; constitui a forma inativa do vírus. Não são vírus: ৺

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Viróides - são os menores sistemas genéticos capazes de se replicar no interior de uma célula; são moléculas de RNA que se replicam mas não têm genes. Os viroides não codificam proteínas e são denominados "Agentes Subvirais". Priões - é - é um agente infecioso composto por proteínas com forma aberrante. Tais agentes não possuem ácidos nucleicos (DNA e/ou RNA) ao contrário dos outros agentes infeciosos conhecidos (vírus, bactérias, fungos e parasitas). Não tê genoma.

Os vírus infectam organismos vivos para se aproveitarem dele e se poderem replicar.

1. Genoma dos vírus Cada molécula de ácido nucleico é de cadeia simples (ss), ou de cadeia dupla (ds), dando quatro possíveis categorias para o genoma de um vírus: dsDNA, ssDNA, e ssRNA dsRNA . ৺

Os vírus com dsDNA codificam os seus genes no mesmo tipo de molécula que animais, plantas, bactérias e outros organismos celulares, ao passo que os outros três tipos de genoma são únicos para os vírus.

O tamanho máximo de um genoma do vírus está sujeita a restrições, e varia de acordo com a categoria de genoma. À medida que as restrições são menos severas para dsDNA, todos os genomas grandes de vírus passam a ser compostos por dsDNA.

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Os maiores genoma de RNA conhecidos são os de alguns coronavírus, coronavírus, que possuem 33 kb de ssRNA. Os genomas maiores de vírus, tais como o do mimivírus, mimivírus, são maiores do que os mais pequenos genomas dos organismos celulares, tais como alguns micoplasmas1. Tamanho dos vírus: 30-70 nm.

1.1 Modificações das genomas dos vírus

extremidades

dos

Os genomas de certos vírus de DNA e de muitos vírus de RNA são modificados numa ou em ambas as extremidades. Alguns genomas têm uma proteína covalentemente ligada na extremidade 5’. Em pelo menos alguns vírus isto é um vestígio de um primer que foi utilizado para a iniciação da síntese do genoma. Alguns genomas de RNA tem uma ou ambas as modificações que ocorrem no RNA mensageiro eucariótico (mRNA): um cap metilado na extremidade 5 ’ e uma sequência de resíduos de adenosina, cauda poli A na extremidade 3 ’. Genomas de muitos vírus de RNA funcionam como mRNAs depois de terem infetado células hospedeiras. O cap e a cauda poli A de um genoma de RNA pode indicar que a molécula está pronta para funcionar como mRNA. As proteínas não covalentemente associadas com genomas virais ৺

Muitos ácidos nucleicos empacotados em viriões tem proteínas ligadas a elas de forma não covalente.

Papillomavírus e poliomavírus, que são vírus de DNA, possuem histonas celulares ligados ao genoma do vírus. A maioria das proteínas associadas aos genomas de vírus é codificada pelos vírus. Em alguns vírus, como o vírus do mosaico do tabaco (TMV) a proteína de revestimento do genoma constitui a cápside do virião. 1.2 Genomas segmentados

A maioria dos genomas de vírus consistem numa única molécula de ácido nucleico, mas os genes de alguns vírus são codificadas em duas ou mais moléculas de ácidos nucleicos. Estes genomas segmentados são muito mais comuns entre os vírus de RNA do que vírus de DNA. ৺

Exemplos de vírus ssRNA com genomas segmentados são os vírus da influenza, que empacota os segmentos num virião, e vírus do mosaico de brome, que empacota os segmentos em viriões separados.

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Micoplasmas  Micoplasmas  é o nome que foi dado às bactérias às  bactérias do género Mycoplasma, com tamanho do que o apresentado normalmente pelas outras bactérias.

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A maioria dos vírus de dsRNA, como os membros da família Reoviridae, tem genomas segmentados. A posse de um genoma segmentado proporciona a um vírus a possibilidade de novas combinações de genes e, portanto, um potencial de evolução mais rápida. Uma nova célula torna-se infetada apenas se todos os segmentos do genoma entrarem na célula. 1.3 Sequências Repetidas

Muitos genomas virais lineares   têm sequências repetidas nas suas extremidades, caso em que as sequências são conhecidas como repetições terminais. ৺

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Se as repetições estiverem na mesma orientação, são designadas de direct terminal repeats (DTRs); Se estiverem em orientação oposta, são conhecidos como inverted terminal repeats (ITRs) .

Estritamente falando, as sequências referidas como "ITRs" em cadeia simples de ácidos nucleicos não se repete até a segunda cadeia ser sintetizada, durante a replicação. Em moléculas de cadeia simples, as "ITRs" são, de facto, repetições de sequências complementares. 1.4 Diversidade dos Genomas Virais

RNA de sentido positivo (+):   informação pode ser traduzida pelos ribossomas. RNA de sentido negativo (-):  (-):   primeiro é necessário ৺ passar para a cadeia principal. DNA de sentido positivo (+): cadeia (+):  cadeia de DNA igual à do ৺ mRNA. ৺ DNA de sentido negativo (-):  (-):   cadeia de DNA complementar à de mRNA. ৺

Replicação do genoma de RNA:

2. Proteínas Virais À medida que o tamanho do genoma aumenta, o número de espécies de proteínas também tende a aumentar; As proteínas, que são componentes de viriões, são conhecidas como proteínas estruturais. Estas proteínas têm de realizar uma grande variedade de funções, incluindo: ৺ ৺

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Proteção do genoma do vírus; Ligação do virião a uma célula hospedeira (por muitos vírus); Fusão do envelope do virião à membrana da célula (para vírus com envelope).

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Proteínas de vírus podem ter funções adicionais, algumas podem ser proteínas estruturais, e outras proteínas não-estruturais - proteínas sintetizadas pelo vírus numa célula infectada, mas que não são componentes do virião. Estas funções adicionais incluem: ৺ ৺ ৺ ৺

As enzimas como, por exemplo, protéase e transcriptase reversa; Fatores de transcrição; Primers para a replicação dos ácidos nucleicos; Interferência com a resposta imune do hospedeiro.

Num virião, o genoma do vírus é colocado entre uma camada de proteínas, conhecida como cápside.

3. Cápside Genomas virais retirados de suas cápsides são mais suscetíveis à inativação, de modo que a função principal da cápside é, sem dúvida, a proteção do genoma. Uma segunda função importante de muitas cápsides é a de reconhecer e de se ligar a uma célula hospedeira em que o vírus se possa replicar. Embora a cápside deva ser suficientemente estável para sobreviver no ambiente extracelular, deve também ter a capacidade de alterar a sua conformação, de modo a que, no momento apropriado, o vírus possa libertar o seu genoma na célula hospedeira. Envolvendo o ácido nucleico são encontradas proteínas  – capsómeros - codificadas pelo genoma viral, sendo o conjunto destas proteínas denominado de cápside. Em geral, estes possuem forma geométrica bem definida: icosaédrica, helicoidal, cilíndrica, esférica , entre outras. A cápside em associação com o material genético viral compõe a nucleocápside/nucleocapsídeo. ৺

Para a grande maioria dos vírus a simetria presente na cápside é helicoidal ou icosaédrica.

3.2 Cápsides com simetria helicoidal

As cápsides de muitos vírus ssRNA têm simetria helicoidal; o RNA é enrolada sob a forma de uma hélice e muitas cópias das mesmas espécies proteicas são dispostas em torno da hélice. Isto forma uma estrutura alongada, que pode ser uma haste rígida se as ligações presentes entre as proteínas, em voltas sucessivas em torno da hélice, forem fortes, ou uma haste flexível, se as ligações forem fracas. ৺

O comprimento da cápside é determinado pelo comprimento do ácido nucleico.

Para muitos vírus ssRNA, tais como o vírus do sarampo e da gripe (vírus influenza), o ácido nucleico helicoidal revestido com as proteínas forma um nucleocapsídeo, que está dentro de um envelope. ৺

O nucleocapsídeo pode ser enrolado ou dobrado de modo a formar uma estrutura compacta.

Os viriões de alguns vírus de DNA, tais como os fagos filamentosos, também têm simetria helicoidal. 3.3 Cápsides com simetria icosaédrica

Um icosaedro é um objeto com: ৺ ৺ ৺

20 faces, sendo cada uma um triângulo equilátero; 12 vértices, cada um formado onde os vértices de cinco triângulos se juntam; 30 arestas, cada uma onde os lados de dois triângulos se encontram.

As proteínas de cápsides com uma simetria icosaédrica têm menos contacto com o genoma do vírus do que as de uma cápside com simetria helicoidal.

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Para construir um icosaedro a partir de moléculas proteicas idênticas, o número mínimo necessário é de três por face triangular, dando um total de 60 para todo o icosaedro. Nas cápsulas constituídas por mais de 60 moléculas proteicas, é impossível todas as moléculas estarem dispostas de forma completamente simétrica e com ligações equivalentes a todas as suas moléculas vizinhas. As cápsides de muitos vírus com simetria icosaédrica são constituídas por mais do que uma espécie proteica. ৺

Para se adicionar material genético a um vírus com simetria icosaédrica subdivide-se as faces em triângulos.

Capsómeros As cápsides do vírus do papiloma são construídos a partir de 72 capsómeros, que são idênticos, mas as cápsides de alguns vírus são construídas a partir de dois tipos de capsómeros: pentões, que se encontram nos vértices do icosaedro e hexões, que compõem o restante o capsídeo. Um vírus ao encapsidar pode perder parte do seu genoma.

4. Membranas Virais - Envelope Muitos vírus têm um componente de membrana de lípidos. Na maior parte destes vírus a membrana lipídica encontra-se à superfície do virião e está associada a uma ou mais espécies de proteínas do vírus. Esta estrutura lipídica-proteíca é designada de envelope e envolve o nucleocapsídeo (ácido nucleico + capsídeo). Os viriões da maioria dos vírus envelopados são esféricos, ou aproximadamente esféricos, mas existem outras formas. ৺

Alguns vírus têm uma membrana localizado não na superfície do virião, mas dentro da cápside.

Muitos vírus animais possuem envelope, incluindo todos aqueles com simetria helicoidal como, por exemplo, o vírus influenza. Algumas glicoproteínas de superfície do vírus com envelope desempenham a função de fusão da membrana do virião à membrana da célula durante o processo de infecção. ৺

Estas proteínas de fusão possuem uma região hidrofóbica adicional, que desempenha um papel importante no processo de fusão.

Muitos vírus com envelope, incluindo os vírus influenza e retrovírus, possuem uma camada de proteínas entre o envelope e a nucleocápside. Esta camada é frequentemente designada por matriz proteica. 4.1 Lípidos de membrana

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A maioria das membranas de viriões é derivada das membranas das células hospedeiras, que são submetidos a modificação, antes da incorporação em viriões. Quando os viriões são libertados a partir das células hospedeiras, a composição lipídica do envelope pode refletir que tipo de célula foi infetada. 4.2 Outros componentes do virião - RNA do vírus em vírus de DNA

RNA do vírus está presente em alguns viriões de vírus de DNA. Os hepadnavírus e os caulimovírus têm sequências curtas de RNA ligadas de forma covalente aos seus DNAs. Estes RNAs têm funcionado como primers para a síntese de DNA e permanecem anexados ao genoma do virião maduro. ৺

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TMV (Vírus do mosaico do tabaco)  – foi importante para a descoberta dos vírus no início do século 20. Poliovírus – simetria icosaédrica; causa poliomielite. Adenovírus – têm projecções proteicas. Ébola – simetria helicoidal, faz um nó numa das pontas. Influenza – vírus da gripe, tipo A, B e C; 8 helicapsídeos. Vaccinia – partícula viral feita por muitas proteínas, está na origem das vacinas; 200 nm. Mimivírus – quando observados pareciam parasitas. T4 – cabeça tem simetria icosaédrica, cauda e proteínas de adesão às células.

5. Sistema de Classificação de Baltimore O Sistema de Classificação de Baltimore, criado por David Baltimore, é um modo de classificação que ordena os vírus em sete grupos, com base na característica do genoma viral e na forma como este é transcrito a mRNA. Neste sistema, os vírus são agrupados como apresentado a seguir: ৺ ৺ ৺ ৺ ৺ ৺ ৺

Grupo I: Vírus DNA dupla fita (dsDNA); Grupo II: Vírus DNA fita simples (ssDNA); Grupo III: Vírus RNA dupla fita (dsRNA); Grupo IV: Vírus RNA fita simples senso positivo ((+)ssRNA); Grupo V: Vírus RNA fita simples senso negativo ((-)ssRNA); Grupo VI: Vírus RNA com transcrição reversa (ssRNA-RT); Grupo VII: Vírus DNA com transcrição reversa (dsDNA-RT).

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Uma vantagem da classificação Baltimore é a diferenciação entre os vírus RNA positivo (+) que sofreram transcrição reversa (classe VI) e que não sofreram (classe IV) e entre vírus de dsDNA que sofreram transcrição reversa (classe VII) e não sofreram (classe I). Através desta classificação descobriu-se que os retrovírus iam contra o dogma central da biologia.

6. Reconhecimento, adesão e entrada nas células hospedeiras Infeção ৺ ৺

Eclipse

Infeção Produtiva

Partículas virais

Eclipse: fase latente em que se deixa de ver as partículas virais. Infeção produtiva: produção de novas partículas virais.

Reconhecimento bioquímico  –  Reconhecimento e adesão: reconhecimento de moléculas da célula hospedeira e do virião permite o reconhecimento e a entrada do virião na célula. ৺ ৺

Tropismo: preferência de uma partícula viral para um determinado tipo de células. As células possuem recetores naturais, dos quais as partículas virais se aproveitam para conseguirem entrar dentro das células.

6.1 Células permissivas

Para se replicar, um vírus deve ter acesso a uma célula permissiva, ou seja, uma célula que irá permitir a replicação do vírus. ৺

Uma célula considera-se suscetível quando se deixa infetar pelo vírus.

No caso de vírus que se ligam à superfície da célula hospedeira, como primeiro passo de infeção a célula deve ter recetores apropriados a que o vírus se possa ligar. Além disso, todas as exigências do vírus devem ou estar presentes na célula ou serem induzidas pela presença do vírus. Estes requisitos incluem proteínas celulares, tais como fatores de transcrição e enzimas. ৺

Alguns vírus estão limitados a uma gama restrita de tipos de células permissivas, por exemplo, vírus da hepatite B está limitado quase exclusivamente a hepatócitos.

Um outro requisito de uma célula permissiva é a ausência de defesas contra o vírus ou, por outro lado, o vírus deve ter a capacidade de superar as defesas da célula. ৺

As células desenvolveram muitos mecanismos para se defender contra a infeção por vírus e micróbios celulares.

As células de vertebrados respondem à presença de dsRNA, que é produzido durante a infeção por múltiplos vírus, através da síntese de citocinas, incluindo interferões, interleucinas e fator de necrose de tumor. Estas proteínas podem desencadear uma série de defesas anti-virais. 6.2 Replicação dos vírus

Em geral, o processo de replicação de vírus pode ser dividido em sete passos: 1. 2. 3. 4. 5.

Ligação de um virião a uma célula hospedeira; Entrada na célula; Transcrição de genes virais em moléculas de RNA mensageiro (RNAm); Tradução de mRNAs virais em proteínas do vírus; Replicação do genoma;

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6. 7.

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Montagem de proteínas e genomas em viriões; Saída dos viriões a partir da célula hospedeira.

6.3 Vírus de animais 6.3.1 Recetores celulares e co-recetores

A adesão do virião é realizada através de uma ou mais das suas proteínas de superfície a moléculas específicas presentes na superfície de uma célula hospedeira. Estas moléculas celulares são conhecidos como recetores e o reconhecimento de um recetor por um virião é um processo altamente específico. ৺

Verificou-se que alguns vírus necessitam de se ligar a um segundo tipo de molécula de superfície celular, um co-recetor, para infetar uma célula hospedeira.

Recetores e co-recetores  são moléculas de superfície celular, normalmente glicoproteínas, com uma ampla gama de funções que incluem: ৺ ৺

Atuar como receptores para quimiocinas e fatores de crescimento; Mediar o contacto célula-célula e a adesão.

6.3.2 Locais de ligação dos vírus

Cada virião tem múltiplos locais que se podem ligar a recetores  – antirecetores - e cada local é constituído por regiões de uma ou mais moléculas proteicas. Os locais de ligação do vírus, para vírus não encapsulados, são sobre a superfície da cápside, por vezes, no interior de depressões (por exemplo, poliovírus), ou em sulcos. ৺

Os locais de ligação de alguns vírus não encapsulados são em estruturas especializadas, tais como as fibras e os knobs de adenovírus;

Ao passo que os locais de ligação de vírus com envelope são nas glicoproteínas de superfície. Ligação do vírus ao recetor:   inicialmente, um virião está fracamente ligado a uma célula, visto que apenas estabeleceu a ligação com alguns recetores. Nesta fase, a ligação é reversível e o virião pode soltar-se da célula hospedeira. Contudo, se permanecer ligado à célula vão se criando oportunidades para estabelecer novos pontos de ligação com os recetores, tornando a ligação à célula irreversível. 6.3.3 Entrada do vírus nas células animais

Após a ligação a recetores nas células, a partícula viral tem de atravessar a membrana plasmática para entrar na célula hospedeira. ৺

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Muitos vírus, tais como o adenovírus, sofrem endocitose e as suas vesículas são revestidas por clatrina. Alguns vírus, como o SV40, são endocitados por regiões da membrana plasmática revestida por caveolina. Outros vírus são capturados por mecanismos que são independentes de clatrina e caveolina.

A acidificação que se verifica dentro dos endossomas onde os viriões se encontram é importante para os vírus com envelope levarem a cabo a fusão do envelope com a membrana da vesícula, desencadeada pela acidez. Entrada de vírus sem envelope

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É possível que alguns vírus sem envelope entreguem o seu genoma nas suas células hospedeiras através de um poro formado na membrana plasmática , mas para a maioria dos vírus sem envelope a fixação irreversível do virião à superfície das células conduz a endocitose. A membrana plasmática “ flui” em redor do virião. À medida que se estabelecem mais ligações com recetores. O virião é completamente envolvido por membrana, formando um endossoma. Entrada de vírus com envelope Há dois processos através dos quais a infeção da célula pode ocorrer: 1. 2.

Fusão do envelope do virião com a membrana plasmática; Endocitose seguida pela fusão do envelope do virião com a membrana do endossoma.

Ambos os processos envolvem a fusão do envelope do virião com a membrana celular; diretamente com a membrana plasmática ou à membrana da vesícula (=membrana plasmática). ৺

Bicamadas lipídicas não se fundem espontaneamente e cada um dos vírus com envelope tem uma glicoproteína especializada responsável pela fusão das membranas.

Se a sequência de fusão estiver exposta quando o virião entrar em contacto com a superfície da célula, em seguida, a infeção pode ocorrer quer por fusão com a membrana plasmática ou por endocitose. Se, no entanto, a exposição a um pH baixo for necessária para expor a sequência de fusão, a endocitose é a única opção. Existem, por conseguinte, duas categorias de fusão de membrana: ৺

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pH-independente de fusão, por exemplo, herpesvírus e HIV. Fusão desencadeada pela acidez, por exemplo, vírus influenza.

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Imagens da T1: Slide 23: Fusão com a membrana plasmática  – Retroviridae e Herpesviridae. Slide 24: Fusão com a membrana endossomal  – Vírus influenza. Slide 25: Endocitose mediada por Clatrina  – Adenoviridae e Parvoviridae. Slide 26: Lise da membrana endossomal  – Adenoviridae. Slide 27: penetração mediada por poro membranar  –  Picornaviridae, Poliomaviridae e Papilomaviridae.

6.3.4 Transporte intracelular

Após a entrada do vírus na célula, muitos necessitam de ser entregues a determinados locais, nomeadamente o núcleo. Para alguns vírus do destino é alcançado através de um dos sistemas de transporte da célula, os microtúbulos. Vírus de RNA

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A maioria dos vírus de RNA de células eucariotas replicam-se no citoplasma ; a maioria codifica todas as enzimas necessárias para a replicação a partir do seu genoma, não sendo necessária qualquer codificação pelo núcleo da célula para obter enzimas. ৺

O vírus influenza, contudo, constitui uma exceção, visto que requere a maquinaria de splicing das células, para que o seu genoma seja entregue ao núcleo das células.

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Retrovírus também são vírus de RNA que replicam os seus genomas no núcleo. Primeiro copiam o seu genoma de RNA para DNA de cadeia dupla no citoplasma Durante a mitose da célula, a membrana nuclear da célula é temporariamente quebrada e o DNA do vírus (com proteínas associadas) é capaz de entrar no compartimento nuclear. Desta forma, estes vírus só se conseguem replicar em células em replicação. Nota: os lentivírus são um tipo de retrovírus com capacidade de se replicar em células pósmitóticas, ou seja, que não estão em divisão.

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Vírus de DNA Alguns vírus de DNA, tais como iridoviruses e poxvírus, replicam-se no citoplasma das células eucarióticas, mas a maioria dos vírus de DNA replicam-se no núcleo . Para estes vírus (assim como, para o vírus influenza e lentivírus) o seu genoma tem de ser transportado para a membrana nuclear e, de seguida, tem de atravessá-la. As proteínas estruturais de alguns destes vírus têm sequências que lhes permitem anexar-se aos microtúbulos. ৺

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Proteínas, conhecidas como proteínas motores, movem-se ao longo dos microtúbulos com determinada carga que transportam. O tráfego para o núcleo inclui proteínas ribossomais e histonas, enquanto o tráfego para fora do núcleo inclui ribossomas, mRNAs e RNAs de transferência.

Nucleocápsides pequenas/viriões, como o virião parvovírus, podem passar, mas os vírus maiores têm de libertar alguma da sua carga para formar estruturas mais pequenas e uncoating no poro nuclear. 6.3.5 Uncoating (“desencapsulamento”) do genoma

Uncoating pode ser definido como a remoção completa ou parcial da cápside (proteínas que envolvem o genoma) para libertar o genoma do vírus. Dependendo do vírus, o processo pode ter lugar: ৺ ৺ ৺ ৺

Na superfície da célula, a cápside é libertada e permanece no exterior da célula; No citoplasma da célula; Num poro nuclear; Dentro do núcleo.

A entrada com sucesso de um virião numa célula não é sempre seguida por replicação do vírus. As defesas do hospedeiro intracelulares, tais como enzimas lisossomais, podem inativar a capacidade infeciosa do vírus antes ou depois do uncoating. ৺

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Em alguns casos, o genoma do vírus pode iniciar uma infeção latente, em vez de completar o ciclo de replicação. Pelo menos em alguns casos, no entanto, desde que o genoma do vírus uncoating permaneça intacto e na localização correta na célula, em seguida, a sua transcrição (ou, em alguns casos tradução) podem começar.

6.3.6 Bacteriófagos (Fagos)

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Os bacteriófagos é um tipo de vírus que só infecta bactérias.

Assim como os vírus de animais, os fagos ligam-se especificamente a moléculas de superfície celular (recetor-antirecetor). Para muitos fagos estas moléculas estão na superfície da parede da célula hospedeira, mas para alguns fagos podem estar na superfície de outras estruturas (pili, flagelos ou cápsulas). Tal como acontece com vírus de animais, a ligação de um fago ao seu hospedeiro é inicialmente reversível, e torna-se irreversível após ligação a recetores adicionais e/ou co-recetores.

7. Replicação, transcrição e tradução

8. Eventos tardios: montagem da cápside e saída da célula 8.1 Montagem de vírus

Capsídeo helicoidal ৺ ৺ ৺ ৺

Processo espontâneo; As subunidades agregam-se, formando discos duplos; Pode ser produzido in vitro; Formam-se hélices a partir dos discos duplos e o genoma é “puxado lá para dentro”.

Capsídeo icosaédrico ৺ ৺

Necessária energia para atividade enzimática; As moléculas juntam-se à volta do genoma quando este está condensado ou formam um núcleo à volta das proteínas; posteriormente enzimas e eliminam essas proteínas e o genoma é introduzido dentro do icosaedro; não é um processo espontâneo.

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8.2 Saída da célula

Vírus sem envelope: Lise celular Estes vírus não saem da célula à medida que são produzidos, vão se acumulando dentro do citoplasma da célula até que esta atinge o seu limite e sofre lise, libertando todas as partículas virais produzidas até ao momento. Vírus com envelope Este tipo de vírus necessita de adquirir membrana celular, que será o seu futuro envelope. Desta forma sai da célula por exocitose/gemulação/budding. O budding também pode ocorrer na membrana nuclear (Herpes vírus) e depois é exportado para o citoplasma através de vesículas e sai da célula por exocitose. Nota: as células vegetais estão em continuidade entre elas através do citoplasma, desta forma, é através do citoplasma que as partículas virais conseguem infetar novas células vegetais.

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APONTAMENTOS: ৺ ৺

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Podemos encontrar dentro da célula cápsulas icosaédrica sem genoma; são bastante estáveis. Os vírus com envelope não provocam lise celular porque saem da célula por endocitose; contudo a quantidade de membrana celular vai sendo mais reduzida até que a célula morre por apoptose. Os retrovírus fazem integração no genoma da célula hospedeira. Os outros vírus que o fazem, fazem-no acidentalmente e produzem consequências para as células hospedeiras. Os vírus que não conseguem completar o seu ciclo de replicação podem integrar. As ligações entre as proteínas da cápside são fracas para que mais tarde a cápside se possa destruir. Os genomas de cadeia simples de DNA e RNA tendem a formar emaranhados porque há complementaridade de bases entre regiões da mesma cadeia. Maturação: ocorre após o budding, onde as partículas virais com envelope adquirem as suas membranas e proteínas associadas, ou seja, completam a formação da cápside.

9. Mecanismos de defesa celular Algumas infeções virais não são produtivas. ৺

Uma infeção pode tornar-se latente, mas o genoma do vírus persiste na célula hospedeira, possivelmente durante todo o tempo de vida da célula, podendo, talvez, ser passado para as células filhas.

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Uma infeção pode ser abortada, no caso de não ocorrer uma infeção latente nem uma infeção produtiva.

Uma infeção de longo prazo, para alguns vírus, pode levar ao desenvolvimento de cancro no hospedeiro infetado. A célula tem detetores de situações anómalas, que levam à apoptose. Uma delas é a ativação de caspases (proteáses). ৺

Alguns vírus bloqueiam a ativação de caspases ou desencadeiam, por exemplo, a ativação da p53.

9.1 Mecanismos de defesa celular ৺

Mecanismos intracelulares (autónomos):   mecanismos inatos, tais como, RNA interferência, desaminação da citidina e apoptose; a resposta celular depende apenas da célula infetada.

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Mecanismos extracelulares (Não-autónomos):   mecanismos inatos que são induzidos pela exposição ao vírus e outros estímulos, através de fatores solúveis do sistema imunológico; a resposta de uma célula depende da resposta de outras células.

9.1.1 Mecanismo extracelular: Interferão

Os interferões (IFN) são proteínas sintetizadas e secretadas pelas células do sistema imunitário em resposta à infeção por vírus. São citoquinas - proteínas excretadas que induzem uma resposta específica em células que possuem recetor apropriado -, proteínas sinalizadoras.

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Um forte indutor para a produção do interferão é dsRNA, que é produzido não só por vírus dsRNA, mas também por vírus ssRNA, quando se replicam. Indução menos eficiente por bactérias e alguns vírus de DNA. Produzido em quantidades mínimas (10 moleculas/célula).

A função dos interferões é proteger as células adjacentes da infeção e ativar a imunidade mediada por células T. Tipos de interferões: ৺

Interferão Tipo 1: Interferões alfa e beta ( α e β), que são produzidos pela maioria dos tipos de células quando se tornam infetadas com o vírus. Após secreção, as moléculas de interferão difundem-se para as células vizinhas, onde podem provocar diversas atividades anti-virais por ligação a recetores de interferão. Atividades anti-virais desencadeadas por α-e β-interferões incluem: ativação de o células NK e indução de apoptose.

৺

Interferão Tipo 2: Interferão Gama ( γ), produzido principalmente por células T e células NK, na presença de certas moléculas (por exemplo, a interleucina-2), libertadas durante as respostas imunes. Este interferão tem uma série de efeitos, incluindo a estimulação da apresentação de o antigénios e a ativação dos fagócitos e as células NK.

Aparecimento ao fim de 1 hora. Pico entre 5 e 10h. Indução de múltiplos efeitos: ৺ ৺ ৺

Inibição de replicação viral; Modulação de atividade de sistema imunitário; Febre, regulação negativa do crescimento celular

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Diversos vírus desenvolveram mecanismos que bloqueiam a atividade da PKR (Adenovírus, HIV, etc.). Em resumo: A célula infectada produz o interferão que sai desta célula e desencadeia um mecanismo extracelular de defesa , preparando as células vizinhas para uma possivel infecção viral. Esta célula, onde o interferão é activado, posteriormente, morre, mas o mecanismo extracelular transmite a informação às células vizinhas onde há produção de PKR e 2,5-OAS. PKR: inibe a acção dos ribossomas; 2,5  – OAS: promove a ação do siRNA e a degradação do RNA viral. ৺ ৺

9.1.2 Mecanismo intrecalular: RNA silencing RNAsi: sistema inado das células que percebe que deixa de

haver estímulo para a produção de um determinado mRNA, impedindo a sua formação. Constitui também uma forma de defesa contra vírus de RNA. RNA silencing, também conhecido como o silenciamento póstranscricional de genes ou RNA de interferência (RNAi), é um processo intracelular que é induzido por dsRNA.  O processo resulta na destruição de mRNAs que possuem a mesma sequência que o dsRNA indutor, tanto mRNAs celulares como virais podem ser destruídos. Este processo envolve a clivagem do dsRNA em pequenos dsRNAs de interferência (siRNAs) , com 21-25 pb. As clivagens são realizadas por um complexo proteico contendo uma enzima chamada Dicer, que pertence à família RNase III. Cada um dos siRNAs junta-se a um complexo de proteínas para formar o RISC  (RNA induced silencing complex). O siRNA de cadeia dupla é desenrolado e a cadeia negativa de RNA permanece associada com o complexo - RISC ativado. A cadeia negativa de RNA é quem selecciona o mRNA alvo complementar, por emparelhamento de bases, para que, em seguida, este mRNA seja degradado.

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Argonaute tem capacidade de destruir o mRNA e pertence ao RISC. O DICER reconhece RNA de cadeia dupla. Constitui um sistema de defesa porque todos os círus de RNA para passarem para DNA têm de passar por uma faze transitória de dsRNA. É possivel produzir um siRNA especifico para um determinado vírus de RNA.

VSR: são proteínas codificadas por vírus que têm a capacidade de suprimir o sileciamento pelo siRNA. As VSR’s são proteínas de defesa do vírus. ৺

Enquanto os siRNA  são altamente especificos, os supressores (VSR) dos vírus são altamente aleatórios.

Células Vegetais: Em células vegetais e alguns animais (ex.: Caenorhabditis elegans) o siRNA não se restringe apenas a uma células, ou seja, não se trata de um mecanismo intracelular, mas sim extracelular. Há transporte de siRNA entres as células vegetais porque o seu citoplasma está em continuidade e, desta forma, há uma amplificação do silenciamnto e um aumento da produção do siRNA. Slide 8, T2: Experiência 1. 2.

3.

A clorofila quando exposta a UV fica vermelha, enquanto a transgénica com GFP fica verde. Quando à excesso de expressão de mRNA de GFP verifica-se um mecanismo de silenciamento, onde algumas regiões que deveriam estar verdes passam a estar vermelhas, devido à supressão do mRNA do GFP. Na presença de um supressor viral, qie inibe o mRNA, não há silenciamento do mRNA de GFP, mantendo a cor verde.

O RNAi contribui para o mecanismo de defesa antiviral em células de mamíferos? Os mamíferos evoluíram para sistemas altamente sofisticados e eficazes de reconhecimento inata e adaptativo. Além disso, o dsRNA activa de forma não específica a degradação de RNA e uma repressão generalizada da síntese de proteínas, primariamente mediada pela proteína cinase R (PKR) e RNase L. ৺

Pode-se afirmar que as células de mamíferos não precisam de uma resposta antiviral baseada em RNAi, e que o papel principal de RNAi em mamíferos é a regulação da expressão de genes endógena.

9.2.Morte celular programada

A infecção viral de uma célula pode dar início a um processo que provoca a morte da célula, antes de vírus descendentes serem produzidos, impedindo a propagação da infecção a outras células. Nas células animais, este mecanismo de suicídio é conhecido como apoptose. 9.3 Infecções não produtivas

Em algumas circunstâncias, um vírus infecta uma célula, mas o ciclo de replicação não é concluído . Se o genoma do vírus persistir na célula infectada então diz-se que está en estado latente, caso contrário, trata-se de uma infecção abortiva. 9.3.1 Infecções latentes

Quando uma infecção latente é iniciada, o genoma do vírus é mantido na célula infectada integrado no genoma da célula ou como múltiplas cópias de DNA circular  – forma epissomal.

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Em células eucarióticas, o DNA do vírus está associado com histonas da célula hospedeira, que desempenham papéis na manutenção da latência.

Muitas infecções latentes podem sofrer reactivação e torneram-se em infeções produtivas, num processo designado de indução. 9.3.2 Infecções abortivas

Uma infeção abortiva é uma infeção não produtiva, na qual o genoma do vírus não persiste na célula, ao contrário de uma infecção latente. Um vírus pode iniciar infeções produtivos em alguns tipos de células (células permissivas) e infecções abortivas em outros tipos de células (células não permissivas). Algumas infecções abortivas podem matar a célula hospedeira. Alguns viriões podem conter genomas mutantes que podem ser capazes de iniciar o ciclo de replicação, mas podem não ter o conjunto completo de genes funcionais necessários para o completar. Tais viriões são ditos ser defeituosos. ৺

Há um número de tipos de vírus defeituosos. Um tipo é conhecido como uma partícula defeituoso interferente (DIP).

10. Replicação e expressão de vírus de DNA Classe I - dsDNA: ৺ ৺ ৺

Genomas pequenos 80Kbp. 

Alguns vírus de DNA de classe I replicam-se no citoplasma, contudo a maioria replica-se no núcleo. Os vírus com replicação no citoplasma levam as suas enzimas necessárias à replicação na particula viral. Ao contrário dos vírus de RNA, em que as enzimas de replicação e as enzimas de expressão são as mesmas, nos vírus de DNA, as enzimas são fiderentesm as enzimas de replicação sºao DNA polimerases e as enzimas de expressão são RNA polimerases. Num vírus o DNA é replicado muito mais vezes do que nas células de humanos, o que acresce o problema de haver uma diminuição das extremidades com o aumento das replicações em genomas linearizados, ou seja, o genoma vai encurtando. Para compensar isto os vírus possuem um genoma linearizado ou o genoma linera sifre circularização antes da replicação. 10.1 Dois modelos básicos de replicação

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No strand displacement apenas uma cadeia funciona como molde para a produção de novas cadeias de DNA. Este tipo de replicação não ocorre em células eucariotas. 10.2 Transcrição

O adenovírus, hepadna, herpes, papiloma e polioma  entram no núcleo.

10.3 Genomas de classe I de dsDNA de tamanho pequeno 10.3.1 Simian vírus 40 – SV10 (Polyomaviridae) ৺ ৺ ৺ ৺ ৺ ৺

Modelo muito simples, utilizado em laboratório. Vírus sem envelope; Genoma circular de dsDNA e com 5Kb; Capsídeo icosaédrico constituído por proteínas VP1, VP2 e VP3; Antigénio T – oncoproteína; Não é letal para símios.

Hospedeiro natural: macacos asiáticos, especialmente o macaco rhesus Doença:  infeções assintomáticas persistentes em hospedeiros naturais, doença neurológica em imunodeprimidos; tumores em roedores experimentalmente infetados. ৺

SV40 tem capacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica.

Replicação:  em certas células de rim de primata; núcleo; estimula a síntese celular de DNA; ciclo de crescimento longo Nota histórica:  Contaminantes nas primeiras poliovacinas administradas a milhões de pessoas; primeiros estudos de biologia molecular em carcinogénese.

Genoma:  associado com histonas celulares como um complexo de cromatina. Codifica cerca de 5-9 proteínas. Expressão génica: transcrição é nuclear e tem duas fases: fase early  – replicação - fase late  –  montagem e saída do virião. As 5-9 proteínas são expressas a partir de dois pré-mRNA por splicing alternativo. ৺

Todos os genes são transcritos por uma RNA polimerase II do hospedeiro.

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Região de controlo: PE – Promotor early  – controla toda a transcrição que ocorre antes da replicação do genoma. Possui caixa TTA e enhancers. PL  – Promotor late  – controlo após a replicação do genoma. Codifica para proteínas da cápside. Não possui caixa TATA. ৺ ৺

Origem de replicação (ori); Local de ligação do antigénio T.

 Antigénio T:

LT-Ag (Antigénio T grande)  – proteína chave na interação entre o vírus e a célula. Este vírus necessita da DNA polimerase da sua célula hospedeira para se replicar. Isto constitui um problema para a replicação do vírus se a célula não se encontrar em replicação, mais precisamente na fase S, onde à disponibilidade de DNA polimerase para a produção de novas cópias de DNA. ৺

৺

p53: associada à indução da apoptose, quando há replicação descontrolada a p53 é ativada e há indução da apoptose. Rb: desencadeia a entrada da célula na fase S, levando à produção de DNA polimerase.

Ligação do Antigénio T ao Rb e p53 (supressor de tumores) ৺

৺ ৺ ৺ ৺

Ativação da replicação do DNA celular

Promovem a ativação da síntese de DNA e RNA celular ligando-se a produtos do gene de controlo celular, Rb e p53. Esta ligação bloqueia estas proteínas de controlo de manterem as células inibidas pelo contacto. Esta função permite à célula infetada começar nova replicação do DNA. Bloqueia a apoptose que é normalmente induzida quando o p53 é inativado. Ligação ao ori do SV40 para iniciar a replicação v iral e bloquear a transcrição viral. Desliga a transcrição viral early ligando-se a regiões no e perto do promotor early. Ativação da transcrição late.

As oncoproteínas de DNA viral (caixas pretas) atuam nos supressores de tumores Rb e p53, levando a uma inativação da sua função e a uma desregulação do ciclo celular e da via de resposta apoptótica. ৺

O Antigénito T bloqueia o p53 impedindo que ocorra apoptose e bloqueia o Rb para impedir que se converta em Rb-P, para que haja inicio do ciclo de replicação.

O antigénio T auto regula-se. Quando se inicia a replicação do DNA viral, o antigénio T liga-se ao PE, promotor dos genes early, nomeadamente no LT-Ag, bloqueando-o. Replicação do SV40:

Teta e o sigma são duas formas de replicação do DNA do polyomaviridae. A estrutura teta consiste na replicação através de dois “garfos”, numa replicação bidirecional a partir da ori; a estrutura sigma é uma

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replicação unidirecional (interna) que poderá eventualmente dar origem a uma replicação teta. (slide 16, T2.1) 1. 2. 3. 4. 5.

Entrada do DNA viral no núcleo (endocitose, com perda do capsídeo), onde a RNA polimerase transcreve os gene early para produzir o antigénio T. A ativação do antigénio T permite a indução do ciclo celular, com entrada na fase S e produção de DNA polimerase. DNA viral é replicado pela DNA polimerase, formando dsDNA. Os genes late codificam para as proteínas estruturais, VP1, VP2 e VP3, por meio da RNA polimerase. Montagem das partículas virais ocorre no núcleo.

Existe uma região no DNA do SV40 com um palíndroma, que é onde se inicia a replicação. É este local onde se inicia a replicação porque é necessária uma região de DNA com cadeia simples, que se forma nessa região devido ao estabelecimento de complementaridade de bases entre o palíndroma.

Expressão tardia: ৺ ৺

É mais abundante (mais DNA); Consiste, essencialmente, na produção de proteínas do capsídeo.

Infeção de células não permissivas

O SV40 bloqueia o p53 o que poderia, eventualmente, provocar o desenvolvimento de tumores. Isto não se verifica porque a replicação do genoma viral leva à destruição da célula hospedeira, impedindo que esta se replique indefinidamente, podendo desenvolver cancro. Contudo quando o vírus infecta uma célula não permissiva não ocorre divisão celular mas há transcrição dos genes early (anteriores à replicação), que incluem o antigénio T. O antigénio T bloqueará a p53 mas, nesta caso, como não há produção de novas partículas virais, que provocariam a destruição da célula hospedeira, esta continua em divisão celular, podendo desenvolver um tumor. No caso de infeção de uma célula não permissiva, o genoma viral pode permanecer na sua forma epissomal no núcleo, acabando por desaparecer com as divisões celulares e a célula volta ao seu estado normal, ou, eventualmente, e de forma aleatória, poderá integrar de forma estável no genoma da célula, sendo transmitido à descendência. ৺

Ver imagem, slide 23, T2.1

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Em 72 horas consegue obter-se entre 10 000 a 100 000 partículas virais/célula.

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10.3.2 Human papiloma vírus – HPV (Papilomaviridae) ৺ ৺

Genoma dsDNA pequeno; HPV-16 contém um genoma circula de 7Kbp. Assim como o SV40 não possui DNA polimerase, o que significa que também bloqueia o p53 e o Rb para a célula hospedeira entrar na fase S.

Contrariamente ao poliomavírus, papilomavírus codifica todas as suas proteínas a partir de uma única cadeia de DNA. Os pormenores relativos à expressão do mRNA dependem do papilomavírus em causa. ৺

HPV-16 possui apenas um promotor conhecido, que parece controlar a expressão tante dos transcritos early como dos late.

E6 e E7  – transformam proteínas; E1 e E2  –  reguladores da transcrição e replicação viral; E4 e E5  – fatores late; L1 e L2 – proteínas estruturais virais.

Os genes E6 e E7, E7, são classificados como oncogenes devido à sua capacidade de induzir a transformação maligna das células infetadas. O E6 e E7 codificam oncoproteínas que têm como alvo as proteínas Rb e p53 respetivamente, que são proteínas codificadas por genes supressores tumorais. ৺

৺

৺

Rb (gene do retinoblastoma) impede a célula de prosseguir a divisão celular, ao bloquear o factor de transcrição E2F. p53 tem o mesmo efeito ao aumentar a expressão de p21, além de também desencadear a apoptose em casos de dano extenso do DNA. Basicamente, os genes E6 e E7 induzem a divisão celular e evitam a apoptose, assim como o Antigénio T no paliomavírus.

O HPV infecta apenas células do epitélio basal estratificado, inserindo o seu DNA no núcleo de forma a haver replicação do genoma viral à medida que há divisão das células epiteliais. Nesta fase são expressos os apenas os genes early. Quando uma das células migra para longe da membrana basal e atinge um maior estado de diferenciação para produzir queratina, estabelece-se o sinal para a expressão dos genes late, codificando as proteínas L1 e L2 responsáveis pela síntese da cápside para criação de novos vírus.

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Integração no genoma

A integração do DNA de HPV resulta em elevados níveis de expressão de E6 e E7. Em pequenas lesões, o genoma viral permanece no núcleo na sua forma epissomal, estando associado a baixos níveis de expressão de E6 e E7. Contudo, quando há integração no genoma da célula hospedeira, que ocorre em caso de cancro, geralmente está associado com a deleção de porções do genoma viral, com retenção preferencial da região LCR (long control region) - E6 - E7 e elevados níveis de expressão de E6 e E7.

EM RESUMO: SLIDE 31, T2.1

10.4 Genomas classe I de dsDNA de tamanho médio - Adenovírus ৺ ৺ ৺

৺ ৺

Capsídeo icosaédrico; sem envelope. Provoca doenças respiratórias; Necessidade de estimular e utilizar muitas funções celulares, nomeadamente promover a divisão celular para haver DNA polimerase; Capacidade de transformar as células através de infeção abortiva; Interação com p53 e Rb.

Os grupos A e B de adenovírus humanos podem ser oncogénicos em ratinhos; os serotipos 2 e 5 do grupo C são utilizados como vetores virais. A sua cápside é cápside é constituída por 3 proteínas principais. (Ver resumo de TGC, página 12) ৺

Hexão: aglomerados de proteínas; ligam-se a 6 proteínas à sua volta e têm uma região mais variável. É com base nesta região variável que o vírus consegue escapar ao sistema imunitário.

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Na extremidade da fibra encontra-se fibra encontra-se o antirecetor do adenovírus, que se vai ligar a recetores CAR na superfície de células, para permitir a entrada do vírus.

Genoma ৺ ৺ ৺ ৺

dsDNA linear com, aproximadamente, 36 Kbp; 100bp de ITR (inverted terminal repeats) em cada extremidade; Sinal de empacotamento – psi. Ambas as cadeias de DNA codificam; uso de splicing alternativo com bastante frequência;



o

Existem muito mais ORF’s e, por isso, existe uma interação muito mais completa.

Expressão do genoma

Proteínas E1A e E1B  E1B   são semelhantes em função ao antigénio T grande do SV40. O E1A e E1B em conjunto vão levar a célula hospedeira a entrar em fase S do ciclo celular. ৺

৺

E1A  – bloqueia a atividade supressora de crescimento do Rb e regula a transcrição do E2, E3 e E4. E2E2- componentes da DNA polimerase. o E3 – funções imunossupressoras; lise celular o E4 E4 - inibe o transporte de transcritos celulares para citoplasma; promove o transporte o de transcritos virais tardios. Proteínas codificadas pelas regiões E2 e E4 são necessárias para a transcrição de genes o tardios. E1B E1B - inibe a apoptose, interagindo com o p53.

L: transcritos L: transcritos tardios; proteínas estruturais, essencialmente do capsídeo. ৺ Região L3: hexão; Região L5: fibra; ৺ Região L2: pentão. ৺

Entrada na célula e desencapsulamento

Este vírus só infecta células com o recetor CAR à superfície.

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Replicação do Genoma

A replicação do DNA em adenovírus realiza-se pelo modelo strand displacement Neste tipo de replicação não se utiliza um primer para a iniciação da replicação, mas sim uma proteína  que se liga na extremidade do DNA, mas não ocupa nenhum nucleótido da cadeia molde. Desta forma, a replicação é completa e não é necessário voltar ao lugar ocupado pelo primer para completar a cadeia. DBP:  proteínas que se ligam ao DNA de cadeia simples.

 Adenovírus induz lise celular

Adenovírus replica-se no núcleo e induz a morte celular por lise. Uma lise celular e eficiente do adenovírus a partir da célula infetada requere uma proteína designada de ADP  –  Adenovirus Death Protein. O gene desta proteína está localizado na região de transcrição early E3, mas o gene é expresso primeiramente apenas numa fase mais tardia da infeção. ৺

৺

Desta forma, uma overexpression da proteína ADP (E3-11.6KDa) aumenta a lise celular e a dispersão de adenovírus. Obtêm-se 10 000 viriões após 24-36 horas da infeção.

EM RESUMO: SLIDE 10, T3 VA RNAs  –  160 nucleótidos, altamente estruturado, ricos em G-C. ৺

৺

৺

Saturam o PKR e DICER, impedindo que o sistema imunitário reconheça o genoma do adenovírus e o destrua, através do DICER. O número de moléculas por célula aproxima-se do dos ribossomas (10^8). VA RNAs bloqueiam os mecanismos do Interferão e do siRNA.

 Adenovírus como Vetor Viral ৺ ৺

Expressão transitória: dia, semana; Células alvo limitadas às que possuem recetores CAR; existem ainda certas células que mesmo com o recetor CAR o adenovírus não consegue infectar;

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Infetam células quiescentes, u seja, que não estão em replicação; Elevados títulos. Subgrupo C, serotipo 5 ou 2 (não têm atividade oncológica).

Pontos essenciais para construir o vetor: ৺ ৺

Impedir capacidade de replicação; Possuir espaço para a inserção do transgene no genoma viral. Tamanho do genoma total tem de ser > 75% e 75% e