Respuestas Taller Problemas Internet PDF

 

  División de Ciencias Biológicas y de la Salud Ingeniería Bioquímica Industrial

INGENIERÍA ENZIMÁTICA PROBLEMARIO

Dr. Sergio Huerta Ochoa NOTA: Los ejercicios presentados en este problemario, son una recopilación de problemas: encontrados en internet en páginas  de libre acceso y de otras Universidades e Instituciones, y pretenden ser una herramienta para reforzar conceptos de cinética enzimática.

 

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1. ECUACIÓNDE MICHAELIS-MENTEN Considera una enzima industrial importante, la cual cataliza la conversión de un sustrato para formar un producto con un valor agregado mayor. La enzima sigue el siguiente mecanismo:

Un análisis inicial de las tasas de reacción para la reacción en solución, con  E0 = 0.10 µM y varias concentraciones de sustrato S0, produce los siguientes parámetros de la ecuación de Michaelis-Menten: V  max = 0.60 µM/s;  K  M  = 80 µM. Un tipo de experimento diferente indica que la constante de la tasa de asociación, k1, es 6

 k1 = 2.0 x 10

 M-1s-1 (2.0 µM-1s-1).

Estima el valor de k2 y k-1. Solución: De la definición de V max max tenemos:

V max  k 2

=

=  k 2 [E 0 ] 

V max 0.6 ⋅ µM/s = [E  ] 0.1 ⋅ µM

-1

= 6⋅s  

0

De la definición de la constante de Michaelis-Menten, K  M , tenemos:

K  M  k −1

= 

K M  k 1 − k 2

=

(

+ k 2 k    −1   k 1

= (80 ⋅ µM ) 2   ⋅ µM s −1

) − (6 ⋅ s ) = 154 ⋅ s

−1  

−1

−1

 

 

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En experimentos de laboratorio, se utilizaron dos decarboxilasas (A y B) obtenidas de diferente microorganismo (ver tabla). Decida cual enzima demuestra un mayor coeficiente de especificidad, (Vmax / Km), recuerde que entre mayor sea el valor del coeficiente de especificidad más específica es la enzima por el substrato. Enzima A

Enzima B

Velocidad (µM/min) 0.3373 0.3364 0.6945 0.6957 1.0764 1.1407 1.9636 1.7706 2.0641 2.0751

[S] (mM) 0.0002 0.0002 0.0005 0.0005 0.001 0.001 0.005 0.005 0.01 0.01

[S] (mM) 0.005 0.005 0.01 0.01 0.05 0.05 0.1 0.1 0.25 0.25

Velocidad (µM/min) 0.3962 0.3857 0.6163 0.6413 1.5606 1.5689 1.9862 1.7909 2.2011 2.2047

Solución:  3.5000

y = 0.5081x + 0.4224 R² = 0.999

3.0000 2.5000

Vmax  =

2.36719094

(µM/min)

KM   =

1.20279143

(μM)

2.0000

Vmax/KM   =

1.5000

1.968

min

-1

1.0000 0.5000 0.0000 0

2

4

6

3.0000 y = 10.814x + 0.4323 R² = 0.9967

2.5000

Vmax  =

2.31346294

(µM/min)

KM   =

25.0185663

(μM)

2.0000 1.5000

Vmax/KM   =

0.092

min

-1

1.0000 0.5000 0.0000 0

0.0 5

0.1

0.1 5

0 .2

0 .25

 

 

  División de Ciencias Biológicas y de la Salud Ingeniería Bioquímica Industrial La Enzima A es más específica

Para un experimento de sustrato una reacción catalizada enzimáticamente, se utilizó una concentración inicial de 20 µM y una concentración de enzima 5 nM, obteniéndose la siguiente curva de progreso: Tiempo (min)

Sustrato (µM)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

20.00 18.32 16.64 14.97 13.30 11.63 9.96 8.31 6.66 5.02 3.40

Calcula la constante de especificidad, α[=] (µM min)-1 definida como: k cat  α  =   K  M  Solución:  Utilizando la ecuación

[S ]0 − [S ] t  = − K  M  + V max [S ]0 [S ]0 ln [S ] ln [S ] y transformando los datos para obtener los ejes adecuados

 

 

  División de Ciencias Biológicas y de la Salud Ingeniería Bioquímica Industrial ln(So/S) x y 0.0 .087 8768 685 5 22. 2.8 80891 089171 71 19. 19.1482 148226 267 7 0. 0.18 1836 3690 9012 12 21.7 21.775 7580 8032 32 18.2 18.270 7059 5913 13 0. 0.28 2897 9748 4888 88 20.7 20.707 0758 5863 63 17.3 17.363 6320 2081 81 0. 0.40 8197 9718 18 04081 .5422 54 2288 881 1 0. 0.69 6967 6742 4291 91 0. 0.87 8787 8788 8828 28 1.10030511 1. 1.38 3829 2912 1271 71 1. 1.77 7726 2654 5446 46

19.5 19 .598 16 18. 8.4 49837 4038 403716 3825 25 17.2 17.222 2299 9954 54 15.9 15.931 3102 0272 72 14.5414212 13.0 13.016 1600 0059 59 11.2 11.282 8251 5147 47

16.4 16 2109 0948 48 15. 15.421 .4376 43 7683 837 7 14.4 14.404 0401 0112 12 13.3 13.307 0728 2822 22 12.128099 10.8 10.834 3442 4243 43 9.36 9.3658 5824 2479 79

      ] 25       )       S       / 20      o       S       ( 15      n       l       [       / 10       )       S         o 5       S       (

y = 0.8488x - 0.2134

0 10

15

20

25

t/[ln(So/S)] 0.8488   µM/min 0.2134   µM

Vmax = Km =

k cat  = α  =

V max 0.8488 µ  M  ⋅ min −1 = = 169.76 min   0.005 µ  M  [E ]t  k cat  169.76 min −1   −1 −1 = = 795.5 µ M  min     K  M  0.2134 µ  M 

 

−1  

En un experimento se midió la tasa inicial de una reacción enzimática, v, a varias concentraciones de substrato [S] . La concentración de la enzima es 3 nM. Se graficó [S]/ v versus [S] y se observó una línea recta en la cual el intercepto- y es 590.6 s y la pendiente es 0.3684 s µM-1. ¿Cuál es el valor de  K  M   y el de V  max  para esta reacción enzimática? ¿Cuál es el valor de k cat para esta enzima? Solución: Se observa que se utilizó la ecuación de Hanes-Woolf K  [S ] 1   = [S ] + M   

v

V max

V max

Los datos del problema son: m = 0.3684 s µM-1 

S /v

KM /Vmax 

-KM 

1/Vmax 

[S]

 

  División de Ciencias Biológicas y de la Salud Ingeniería Bioquímica Industrial b = 590.6 s 1

V max

=

  =

0.3684

  ⋅ µ   M  ⋅ s −1   2 .7144

K  M  = 590.6 ∗ V max = 590.6  ∗ 2.7144 = 1,603.12 ⋅ µ  M    Sabemos que V max at  [E ]t, por lo tanto max = k ccat  V max 2.7144 ⋅ µ  M  ⋅ s  −1 −1 = = 904.8 ⋅ s     k cat  = 0.003 ⋅ µ  M  [E ]t 

Calcule la concentración de sustrato necesaria para observar un 75% de la velocidad máxima de una reacción enzimática con una constante de afinidad, K  M , 3 µM. Solución: Re-arreglando la ecuación de Michaelis-Menten

v V max

=

[S ] K  M   + [S ]

 

despejando [S ] tenemos

[S ] =

 

K M 

  1   v / V max

  − 1   

= 

3 ⋅ µ  M 

    1 − 1   0.75  

= 9 ⋅  µ M   

 

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2.  PROBLEMAS DE INHIBICIÓN i Calcule y el grado de inhibición causado por un inhibidor competitivo bajo las siguientesv  condiciones: a). [S]=2x10-3 M y [I]=2x10-3 M b). [S]=4x10-4 M y [I]=2x10-3 M c). [S]=7.5x10-3 M y [I]=1x10-5 M Asume que K  M =2x10-3 M, K  I =1.5x10-4 M y V  max=270 nM/min.

Solución: En cada inciso calculamos la velocidad sin (v0) y con (vi) efectos de inhibición

a).

vi

=

V max [S ] (270nM / min )(2x10 6 nM ) =   = 135nM / min   v0 = K  M  + [S ] 2x10 6 nM + 2x10 6 nM V max [S ] (270nM / min )(2 x10 6 nM ) =

K  M    1 + [ I ]  + [S ]   K i   i%

     

= 1 −

6

(2x10

6

= 17.61nM / min  

nM )  1 + 2x10 5nM   + 2 x10 6 nM   1.5x10 nM 

vi   17.61nM / min   ∗ 100 =    ∗ 100 = 86.96%   1 −  v0   135 nM  /  min    

b). v0 vi

=

=

V max [S ] (270nM / min )(4x10 5 nM ) =   = 45nM / min   K  M  + [S ] 2x10 6 nM + 4x10 5 nM

V max [S ] (270nM / min )(4x10 5 nM ) =     [ I ]  2 x10 6 nM   6  + 4x10 5 nM K  M  1 +  + [S ] (2x10 nM )1 + 5   1.5x10 nM    K i  

= 3.72nM / min  

   vi     3.72nM / min    i% =   1 − v0   ∗ 100 =   1 −  45nM / min   ∗ 100 = 91.74%  

c). v0 vi

i%

=

     

=

V max [S ] (270nM / min )(7.5x106 nM ) =   = 213.16nM / min   K  M  + [S ] 2x106 nM + 7.5x106 nM

V max [S ] (270nM / min )(7.5x10 6 nM ) =     [ I ]  1x10 4 nM   6  + 7.5x10 6 nM K  M  1 +  + [S ] (2x10 nM )1 + 5   1.5x10 nM    K i  

= 1 −

vi     210.21nM / min   ∗ 100 = 1 −    ∗ 100 = 1.38%   v0     213.16nM / min 

= 210.21nM / min  

 

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(a) ¿Qué concentración de inhibidor competitivo se requiere para producir 75% de inhibición a una concentración de sustrato de 1.5x10 -3 M si K  M =2.9x10-4 M y  K  I =2x10-5  M? (b) ¿Aal qué debe incrementarse el sustrato para re-establecer la velocidad valorconcentración original sin inhibición? Solución: a). La fórmula del grado de inhibición para inhibición competitiva es: 100[ I ]

i%

=

 

K i 1 +  

[S ]  

 

K  M   

 

+ [ I ]

Despejando [ I   I ]

  [S ]    i% K  I  1 + K      M    [ I ] = 100 − i%

b)

v 

  1.5 x10 −3 M    (75)(2 x10  M )1 + −4  x  M  2 . 9 10       = 3.7 x10 − 4 M    −5

=

(100 − 75)

Sin inhibición (Ec. Michaelis)

v 0 

[S ]0

Con inhibición (Inhibidor Competitivo) Competitivo)

v i 

v 0  = v i 

[S ]i

[S ]

 

De la gráfica observamos que v0 = vi , igualando las ecuaciones de velocidad tenemos:

V max [S ]0 K  M  + [S ]0

=

V max [S ]i     [ I ]   + [S ]i K  M  1 + K   I     

Despejando [S ]i  tenemos

    [ I ]    3.7 x10 −4 M  −3  = 2.93x10 −2 M   [S ]i = [S ]0 1 +  = (1.5x10 M )1 + −5 2x10 M       K  I   

 

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Calcule  K  I   para un inhibidor no-competitivo si una concentración de inhibidor [I]=2x10-4 M produce 75% de inhibición de una reacción catalizada enzimáticamente. Solución: Para un inhibidor no-competitivo el grado de inhibición está dado por 100[ I ]   i% =

K i   + [ I ]

despejando K  I  

 100

K  I  = [ I ]

  i%

 

    

(

− 1 = 2 x10

−4

 100   −5 − 1 = 6.67 x10 M     75  

M )

Calcule (a) la velocidad y (b) el grado de inhibición de una reacción catalizada -3 -4 enzimáticamente en presencia de 6x10-4 M de sustrato ( K   K  M =1x10  M) y 2.5x10  M de un -5 inhibidor no-competitivo ( K   K  I =3x10  M). La V  max=515 nM/min. Solución:

V max [S ] (5.15x10-7 M / min )(6 x10−4 M ) -7   -3 = 1.93x10 M / min   = v0 = −4 1x10 M + 6 x10 M K  M  + [S ] V max 5.15x10−7 M   [S ] (6x10− 4 M ) −4   [ I ]    2.5x10 M   1 +  1 + −5 K  3 x 10 M  I   −8     vi =   = = 2.07 x10 M / min   −3 −4 K  M  + [S ] 1x10 M + 6x10 M    vi     2.07x10-8 M / min     ∗100 = 89.29%   i% = 1 −  ∗100 = 1 −   -7   1.93x10 M / min    v0  

Considere una reacción enzimática, en presencia de un inhibidor competitivo. La -4

-5

constante de Michaelis del ( inhibidor ) es 3.5 x 10 la constante inhibición ( ) es 1.7 x 10de  M y la concentración [I]  M, es 7.5 x 10 -5  M.de Calcule la concentración sustrato a la cual la velocidad observada en presencia del inhibidor es 3/4 de la velocidad observada sin inhibición, es decir, una actividad relativa igual a 0.75  K  M   K 

 K i

Solución: Para un inhibidor competitivo la actividad relativa está dada por:

a=

K  M  + [S ] ;   [ I ]   + [S ] K  M  1 + K  i    

despejando [S ]

 

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 

a ⋅ K  M  1 +

[ I ] 

 

[S ] =

− K  M 

K i     a

=4   .28x10

−3

⋅ M   

(1 − ) En un experimento se midió la tasa inicial de una reacción enzimática, v, a varias concentraciones de substrato [S] . . La concentración de la enzima es 10 nM. Se graficó 1/ v versus 1/[S] y se observó una línea recta en la cual el intercepto- y es 0.005 nM-1 seg y la pendiente es 200 seg. ¿Cuál es el valor de  K  M   y el de V  max  para esta reacción enzimática? ¿Cuál es el valor de  k cat para esta enzima? ¿Determine el coeficiente de especificidad? 30 µM de un inhibidor, E, es adicionado y se observó que el intercepto-1  y  es 0.0065 nM   seg y la pendiente es 260 seg. ¿Qué tipo de inhibición se observó? ¿Cuál es el valor de K i para el inhibidor con esta enzima? Solución: Se observa que se utilizó la ecuación de Lineweaver-Burk 1 K  M  1 1   = +

v

V max [S ] V max 1/v

1/Vmax  Los datos del problema son: m = 200 s -1 b = 0.005 s nM  

KM /Vmax 

-1/KM 

V max

1

1/[S]

= 200   ⋅ nM ⋅ s  

−1

  0.005   ∗ 200 = 40,000 ⋅ nM    K  M  = 200 ∗ V max = 200 =

Sabemos que V max = k cat  [  [E ]t, por lo tanto

V  k cat  = max [E ]t 

=

200 ⋅ nM  ⋅ s −1 

 

10 ⋅ nM 

= 20 ⋅ s

−1

 

El coeficiente de especificidad es: α  =

k cat  K  M 

=

20 ⋅ s −1

  −1 −1 ⋅ s nM      = 0.0005 40,000 ⋅ nM 

En presencia del inhibidor tenemos m = 260 s b = 0.0065 s nM-1   app V max

app K  M 

1

= 153   .846 ⋅ nM ⋅ s  

−1

  0.0065 = 260 ∗ V max = 260  ∗ 153.846 = 40,000 ⋅ nM    =

 

  División de Ciencias Biológicas y de la Salud Ingeniería Bioquímica Industrial app , K  M   =  K  M 

Se observa que: Por lo tanto se trata de una

app   V max   > V max

y

Inhibición no competitiva, entonces app V max

=

V max     [ I ]  1 +    K i  

Despejando K i 

K i

=

[ I ] V max −1 app V max

=

30,000   200 153.846

= 100,000 ⋅ nM   

−1

Para una reacción enzimática en presencia de de sustrato un inhibidor de reacción observada a una concentración [S] i =competitivo, 1.5 x 10-3 M la es velocidad igual a la velocidad de reacción sin el inhibidor a una concentración de sustrato [S] 0 = 7.69 x 105  M. Calcule la constante de inhibición, Ki, del inhibidor si su concentración [I] = 3.7 x 10-4 M. Solución: Para un inhibidor competitivo la relación [ S ]0 a [S ]i para observar una misma velocidad es:

[S ]i

    [ I ]   K     i    

= [S ]0 1 +

Despejando K i 

K i

=

[ I ] = [S ]i −1 [S ]0

−4

3.7 x10 M −3

1.5x10 M 7.69x10 −5 M

−1

= 2 x10

−5

M 

 

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Utilice los siguientes datos experimentales para obtener la concentración de sustrato [S] en la cual se obtiene un grado de inhibición del 60 % para una reacción enzimática en presencia de un inhibidor [I]. [S] mM

Velocidad (nM/min) Control [I] = 6 µM

0.200 0.250 0.333 0.500 1.000 2.000 2.500 3.330 4.000 5.000

16.67 20.00 24.98 33.33 50.00 66.67 71.40 76.92 80.00 83.33

6.25 7.69 10.00 14.29 25.00 40.00 45.45 52.63 57.14 62.50

Solución: Primero se determina qué tipo de inhibición se tiene, por lo tanto Analizando los datos cinéticos mediante Lineweaver-Burk se tiene que: app V max  = V max     ,860 ⋅ nM    < K  M  = 999

= 100nM  / min  

K  M app

= 2,999   ,900 ⋅ nM   

Por lo tanto es una inhibición competitiva, y K i se calcula como:

K i

=

[ I ]

=

app

K   M  K  M 

−1

6,000 ⋅ nM    2,999,900nM 

= 2,999.52 ⋅ nM    −1

999,860nM 

Despejando [S ] de:

i%

=

100[ I ]

  [S ]   K i 1 +    + [ I ]   K  M   

 

se tiene:

   [ I ]  100    − 1  − 1 = 333,500 ⋅ nM    [S ] = K  M      K i   i%

 



 

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En un experimento se midió la tasa inicial de una reacción enzimática, v, a varias concentraciones de substrato [S] . La concentración de la enzima es 3 nM. Se graficó v versus [S] y se observó  y es 590.6 s y la [S]/  una línea cual el interceptopendiente es 0.3684 s µM-1. ¿Cuál es elrecta valorendela K   M   y el de V   max  para esta reacción enzimática? ¿Cuál es el valor de k cat para esta enzima? Solución: Se observa que se utilizó la ecuación de Hanes-Woolf K  [S ] 1   = [S ] + M    S /v V  v V  max

max

Los datos del problema son: m = 0.3684 s µM-1  b = 590.6 s

KM /Vmax 

1/Vmax 

-KM 

V max K  M 

=

1

  =

0.3684

[S]   2 .7144 ⋅ µ   M  ⋅ s −1  

= 590.6 ∗ V max = 590.6   ∗ 2.7144 = 1,603.12 ⋅ µ   M   

Sabemos que V max  [E ]t, por lo tanto max = k ccat  at  [

V  k cat  = max [E ]t 

=

2.7144 ⋅  µ  M  ⋅ s  −1

 

0.003 ⋅ µ  M 

= 904.8 ⋅ s

−1

 

El coeficiente de especificidad es:

α  =

k cat  K  M 

=

904.8 ⋅ s −1

 

1,603.12 ⋅  µ  M 

= 0.564 ⋅ s  µ M     

−1

−1