Reporte-FOSFATASA (Deleted 04a4e195a8258b4787f2ea0d787481d3)

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL. 2013-2

PRÁCTICA 2. CINÉTICA ENZIMATICA DE LA FOSFATASA ALCALINA

INTEGRANTES: Ensina Hernández Marina Jiménez Guevara K. Victoria Jiménez Rodríguez Omar Ortega Pérez Christian I. Sánchez García Gabriela G.

OBJETIVO El alumno será capaz de analizar las respuestas que se observan en la velocidad de la reacción enzimática, en función de diferentes factores como son el progreso de la reacción, el pH, la temperatura, la concentración de sustrato e inhibidores. Así mismo establecerá las condiciones de ensayo para determinar la actividad enzimática. HIPÓTESIS Al modificar ciertos factores físicos (temperatura), químicos (concentración de sustrato) o fisicoquímicos (pH), se verá modificada la actividad enzimática, reflejado en la velocidad de reacción, debido a cambios de tipo conformacionales, de carga, entre otros. RESULTADOS Como sustrato de la fosfatasa alcalina se utilizó un compuesto artificial: p-nitrofenilfosfato que, al poseer un resto orgánico con un grupo fosfato unido, puede ser hidrolizado por la enzima. La hidrólisis del sustrato forma un cromógeno, el p-nitrofenol, compuesto amarillo que, en solución alcalina, absorbe a una longitud de onda de 415 nm, por lo que su aparición en el transcurso de la reacción (FIGURA 1) puede seguirse colorimétricamente. Para detener la reacción se añadirá NaOH, ya que un pH demasiado alcalino desnaturaliza la proteína y, por ende, inhibe la actividad enzimática.

FIGURA 1. Hidrólisis de p-nitrofenilfosfato. Esta reacción enzimática produce p-nitrofenol, que presenta un máximo de absorción a λ = 415 nm.

1. CURVA PATRÓN DE P-NITROFENOL Se rotularon siete tubos de ensayo (seis muestras más el blanco) y a cada uno se le agregó un volumen distinto de p-nitrofenol 2x10-4 M y de agua destilada (TABLA 1), además de 250 µL de buffer de glicina pH 10 y 750 µL de NaOH 0.25 M. Se realizó la lectura a λ = 415 nm, utilizando celdas de plástico para hacer las mediciones. TABLA 1. Curva patrón de p-nitrofenol. Se muestran los volúmenes de p-nitrofenol y agua agregados a cada tubo para la construcción de la curva patrón, así como los datos de absorbancia obtenidos a distintas concentraciones. Las mediciones se realizaron a λ = 415 nm. REACTIVOS

BLANCO

1

2

3

4

5

6

p-nitrofenol 2x10-4 M (L)

0

50

100

150

200

250

300

H2O (L)

500

450

400

350

300

250

200

0.000

0.106

0.211

0.339

0.451

0.550

0.683

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

ABSORBANCIA =415 p-nitrofenol (mol)

2

Se muestra a continuación la curva graficada con los datos obtenidos. 0.800 Absorabancia l = 415 nm

0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 -0.100

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

Cantidad de p-nitrofenol (µmol)

FIGURA 2. Curva patrón de p-nitrofenol. La ecuación de la recta se obtuvo a partir de la regresión lineal y resultó ser: y = 11.3464x – 0.0061 con r2 = 0.9989.

2. PROGRESO DE LA REACCION ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA ALCALINA Se rotularon seis tubos de ensayo y se les agregó 250 µL de p-nitrofenil-fosfato de sodio 2x10-3 M, 245 µL de agua destilada y 250 µL de buffer de glicina pH 10; tras lo cual se pre-incubaron aproximadamente dos minutos a 37 ºC antes de agregar 5 µL de fosfatasa alcalina en cada tubo (excepto en el blanco). Inmediatamente después de agregar la enzima, se comenzó a medir el tiempo de incubación, establecido para cada tubo, a 37 ºC (TABLA 2). Una vez transcurrido el tiempo se adicionaron 750 µL de NaOH 0.25 M para desnaturalizar la enzima y detener la reacción. Hasta este momento se agregaron 5 µL de enzima en el blanco para que la mezcla fuese análoga a la de los demás tubos. Finalmente, se realizó la lectura a λ = 415 nm, utilizando celdas de plástico para hacer las mediciones. TABLA 2.- Progreso de la reacción enzimática de la fosfatasa alcalina. Se muestra el procedimiento seguido para la construcción de la curva de progreso de la reacción enzimática (tubos 1-5) y los datos de absorbancia obtenidos a distintos tiempos. La última fila presenta los resultados obtenidos al utilizar la ecuación lineal para calcular la cantidad de producto de la reacción (p-nitrofenol) catalizada por enzima fosfatasa alcalina. REACTIVOS Tiempo (min) ABSORBANCIA =415 Cantidad pnitrofenol (mol)

BLANCO

1

2

3

4

5

5

5

10

15

20

30

0.000

0.189

0.363

0.532

0.647

1.038

5.38x10-4

0.0172

0.0325

0.0474

0.0576

0.0920

La ecuación obtenida con la curva patrón permite calcular cantidad de p-nitrofenol en diferentes muestras a partir de la medición de absorbancia bajo distintas condiciones. Por ejemplo, para el tubo 2, cuyo valor de absorbancia es 0.363: Tomando la ecuación y = 11.3464x – 0.0061, sustituyendo el valor de absorbancia (Y) y despejando la cantidad de p-nitrofenol en µmol (X) ( ) ( ) La actividad de una enzima se determina conociendo la velocidad de la reacción que cataliza. La velocidad de reacción se define como la cantidad de sustrato consumido o de producto formado por unidad de tiempo (Bárcena, s/a). Conociendo la cantidad de p-nitrofenol y el tiempo al que se realizó la lectura es posible calcular la velocidad inicial (vi) de la reacción como la pendiente de la sección lineal de la curva de progreso de la reacción (FIGURA 3).

3

Cantidad de producto (µmol)

0.100 0.090 0.080 0.070 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000

0

5

10

15

20

25

30

Tiempo (min)

FIGURA 3. Progreso de la reacción enzimática de la fosfatasa alcalina. La pendiente de la recta es la vi de la reacción. La ecuación que se ajusta es y = 0.00298x + 0.00150 con r2 = 0.9964. De esta forma, vi = 0. 00298 µmol/min.

3. EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA FOSFATASA ALCALINA Se rotularon trece tubos de ensayo y a todos se les agregó 250 µL de p-nitrofenil-fosfato de sodio 2x10-3 M, 245 µL de agua destilada y 250 µL del buffer respectivo (TRIS, glicina o carbonatos); tras lo cual se pre-incubaron aproximadamente dos minutos a 37 ºC antes de agregar 5 µL de fosfatasa alcalina en cada tubo (excepto en los blancos). Inmediatamente después de agregar la enzima, se comenzó a medir el tiempo de incubación, que fue de cinco minutos a 37 ºC. Una vez transcurridos los cinco minutos se adicionaron 750 µL de NaOH 0.25 M para desnaturalizar la enzima y detener la reacción. Hasta este momento se agregaron 5 µL de enzima en el blanco para que la mezcla fuera análoga a la de los demás tubos. Finalmente, se realizó la lectura a λ = 415 nm, utilizando celdas de plástico para hacer las mediciones. Los blancos se ajustaron con el pH más elevado de cada amortiguador, de acuerdo con el intervalo de pH en el que se trabajó (glicina pH 10.4, TRIS pH 9 y carbonatos pH 11.5). Las TABLAS 3.1, 3.2 y 3.3 muestran los valores de absorbancia obtenidos y la cantidad de pnitrofenol calculada a partir de esos valores. TABLA 3.1. Efecto del pH en el intervalo de pH 7-9. Para mantener estable este intervalo de pH se utilizaron diferentes amortiguadores de TRIS. BLANCO TRIS pH 7 ABSORBANCIA 0.000 =415 Cantidad de p-nitrofenol 5.38x10-4 (mol)

TRIS pH 7

TRIS pH 8

TRIS pH 9

0.012

0.021

0.078

1.59x10-3

2.39x10-3

7.41x10-3

TABLA 3.2. Efecto del pH en el intervalo de pH 9-10.4. Para mantener estable este intervalo de pH se utilizaron diferentes amortiguadores de glicina. BLANCO GLICINA pH 9 ABSORBANCIA 0.000 =415 Cantidad de p5.38x10-4 nitrofenol (mol)

GLICINA pH 9

GLICINA pH 9.6

GLICINA pH 10

GLICINA pH 10.4

0.089

0.141

0.154

0.170

8.38x10-3

0.0130

0.0141

0.0155

TABLA 3.3. Efecto del pH en el intervalo de pH 10.4-11.5. Para mantener estable este intervalo de pH se utilizaron diferentes amortiguadores de carbonatos. BLANCO CARBONATOS CARBONATOS pH 10.4 pH 10.4 ABSORBANCIA 0.000 0.133 =415 Cantidad de p-nitrofenol 5.38x10-4 0.0122 (mol)

CARBONATOS pH 10.8

CARBONATOS pH 11.5

0.115

0.092

0.0142

8.64X10-3

4

Velocidad (µmol/min)

0.0035 0.003 0.0025 0.002 0.0015 0.001 0.0005 0 6

7

8

pH

Glicina

9

TRIS

10

11

12

Carbonatos

FIGURA 4. Efecto del pH en la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina. Es evidente que la velocidad aumenta progresivamente hacia pH alcalino, para luego descender, y que, a pesar de que dos amortiguadores mantienen el pH en 10.4, la reacción ocurre con mayor rapidez si se utiliza glicina.

EFECTO DE LA TEMPERATURA Se rotularon ocho tubos de ensayo y a todos se les agregó 250 µL de p-nitrofenil-fosfato de sodio 2x10-3 M, 245 µL de agua destilada y 250 µL de buffer de glicina pH 10; tras lo cual se pre-incubaron aproximadamente dos minutos a 37 ºC antes de agregar 5 µL de fosfatasa alcalina en cada tubo (excepto en el blanco). Inmediatamente después de agregar la enzima, se comenzó a medir el tiempo de incubación, que fue de cinco minutos, a la temperatura establecida para cada tubo (TABLA 4). Una vez transcurrido el tiempo se adicionaron 750 µL de NaOH 0.25 M para desnaturalizar la enzima y detener la reacción. Hasta este momento se agregaron 5 µL de enzima en el blanco para que la mezcla fuese análoga a la de los demás tubos. Finalmente, se realizó la lectura a λ = 415 nm, utilizando celdas de plástico para hacer las mediciones. TABLA 4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina. Se muestran las diferentes temperaturas de trabajo para cada tubo y los valores de absorbancia registrados luego de la medición. La última fila presenta los resultados obtenidos al utilizar la ecuación lineal para calcular la cantidad de producto de la reacción (p-nitrofenol) catalizada por enzima fosfatasa alcalina. REACTIVOS

1

2

3

4

5

6

7

4

4

20

30

37

45

50

60

0.000

0.016

0.054

0.056

0.079

0.102

0.139

0.008

5.38x10-4

1.95 X10-3

5.29 X10-3

5.47 X10-3

7.5 X10-3

9.52 X10-3

0.0128

1.24 X10-3

Velocidad (µmol/min)

Temperatura (˚C) ABSORBANCIA =415 Cantidad de p-nitrofenol (mol)

BLANCO

0.003

0.0025 0.002

0.0015 0.001

0.0005 0 0

10

20

30

40

50

60

Temperatura ˚C FIGURA 5. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina. La velocidad de reacción aumenta conforme lo hace la temperatura y se observa un máximo de velocidad en la temperatura de 50 ºC, tras el cual desciende abruptamente.

5

0.003 -5.5

0.0031 0.0032 0.0033 0.0034 0.0035 0.0036 0.0037

LN V

-6 -6.5 -7 -7.5 -8

1/T (˚K)

FIGURA 6. Energía de activación. La energía de activación se calculó con base en la ecuación de Arrhenius. , La ecuación de la recta se obtuvo a partir de la regresión lineal y = -0.00028x +0.00139 con r = 0.978897618. Al graficar ln k vs 1/T ,la pendiente es igual –Ea/R. Se debe recordar que R es la constante de los gases ideales (8.314 J mol-1 K-1), por lo tanto, al sustituir los datos se tiene: m=-Ea/R -0.00028 mol K =-Ea/8.314 J mol-1 K-1 0.00028 mol K =Ea/8.314 J mol-1 K-1 Ea=0.00028 mol K*8.314 J mol-1 K-1 Ea=0.002367767 J

FIGURA 6.1.-Relacion de la energia de activacion con el valor de la pendiente. Una energía de activación alta corresponde con una velocidad de reacción muy sensible a la temperatura (la representación de Arrhenius tiene una pendiente grande) y al revés, una energía de activación pequeña corresponde con una velocidad de reacción relativamente insensible a cambios de temperatura.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO Se rotularon ocho tubos de ensayo y a cada uno se le agregó un volumen distinto de p-nitrofenilfosfato de sodio 2x10-3 M y de agua destilada (TABLA 5), además de 250 µL de buffer de glicina pH 10; tras lo cual se pre-incubaron aproximadamente dos minutos a 50 ºC antes de agregar 5 µL de fosfatasa alcalina en cada tubo (excepto en el blanco). Inmediatamente después de agregar la enzima, se comenzó a medir el tiempo de incubación, que fue de cinco minutos, a 50 ºC. Una vez transcurrido el tiempo se adicionaron 750 µL de NaOH 0.25 M para desnaturalizar la enzima y detener la reacción. Hasta este momento se agregaron 5 µL de enzima en el blanco para que la mezcla fuese análoga a la de los demás tubos. Finalmente, se realizó la lectura a λ = 415 nm, utilizando celdas de plástico para hacer las mediciones.

6

TABLA 5. Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina. Se muestran los diferentes volúmenes de p-nitrofenil-fosfato y agua agregados a cada tubo, así como los valores de absorbancia registrados luego de la medición. La última fila presenta los resultados obtenidos al utilizar la ecuación lineal para calcular la cantidad de producto de la reacción (p-nitrofenol) catalizada por enzima fosfatasa alcalina. REACTIVOS

BLANCO

1

2

3

4

5

6

7

p-nitrofenilfosfato (L)

0

50

75

100

250

300

400

450

H2O (L)

545

495

470

445

295

245

145

95

0.000

0.195

0.201

0.271

0.376

0.426

0.522

0.384

5.38x10-4

0.0177

0.0182

0.0244

0.0336

0.0380

0.0465

0.0343

Velocidad (µmol/min)

ABSORBANCIA =415 Cantidad de p-nitrofenol (mol)

0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 0.0000

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

0.0005

0.0006

[S] (µmol/mL)

FIGURA 7. Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina. La velocidad de reacción aumenta de manera más rápida a bajas concentraciones, esto puede verse en la pendiente tan pronunciada al inicio (desde 0.000 hasta 0.001 µmol/µL), frente a la pendiente menos evidente conforme aumenta la concentración de sustrato (a partir de 0.005 µmol/µL, aproximadamente).

350 300

1/[V]

250 200 150 100 50 0

5000

1/[S]

10000

15000

FIGURA 8. Representación de los dobles recíprocos (1/V frente a 1/[S]) o ecuación de Lineweaver-Burk. Por medio de esta representación es posible calcular parámetros cinéticos como Km y Vmax. La ecuación que se ajusta es: y = 0.01268x + 106.98485 con r2 = 0.9091.

7

DETERMINACIÓN DE LA Km [E] = constante [S] = variarla y llevarla a altas concentraciones

Km ↑ = baja unión al sustrato, baja afinidad por el sustrato Km ↓ = alta unión al sustrato, alta afinidad por el sustrato

De acuerdo con la gráfica anterior, que representa la ecuación de Lineweaver-Burk

que no es más que el recíproco de la ecuación de Michaelis-Menten

De acuerdo con la gráfica de la ecuación de Lineweaver-Burk, se puede calcular lo siguiente: (

)

Igualando Y (1/Vmax) a cero, y despenjando a X, es posible calcular Km:

Y con este dato se calcula la Vmax (

)

8

DISCUSIÓN La fosfatasa alcalina es una enzima del grupo de las hidrolasas (monoéster ácido ortofosfórico fosfohidrolasa, EC 3.1.3.1.) es una especie enzimática relativamente inespecífica. Cataliza la transferencia de grupos fosfato de un éster fosfato orgánico a un alcohol o al agua. Cuando el aceptor del fosfato es agua, la reacción constituye escencialmente la hidrólisis del éster a alcohol y el grupo HPO42- (Bennington, 2000). Se realizó un estudio cinético que consistió en realizar un ensayo de progreso de reacción enzimática y analizar la respuesta de la fosfatasa alcalina frente a diferentes factores, tales como el pH, la temperatura y la concentración de sustrato. Esto, dado que las propiedades catalíticas de las enzimas y, por ende, su actividad reciben la influencia de numerosos factores, como los ya mencionados, que deben ser controlados y optimizados en su totalidad si se desea que las mediciones de la actividad enzimática tengan sentido y sean reproducibles (Koolman, 2004). La manera más usual de medir actividad de una enzima es incubar la preparación enzimática, generalmente a 37 ºC, por periodos variables de tiempo, y medir el producto de la reacción enzimática en un tiempo dado. Si la reacción es lineal en el tiempo, hasta un periodo determinado, se puede expresar la actividad enzimática en términos de velocidad, es decir, la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (Peña, 2004), este comportamiento justifica la medición de actividad enzimática expresada en términos de velocidad de reacción. La Figura 3 es la gráfica de una recta que se conoce como progreso de reacción. A partir de estos resultados se decidió que el tiempo de cinco minutos sería el utilizado para posteriores analisis, ya que es un tiempo corto, fácilmente medible y forma parte de la linealidad registrada en la gráfica. Esta fue una reacción a punto final, ya que la mezcla fue incubada durante un periodo fijo, al cabo del cual se interrumpió la reacción enzimática, al adicionar NaOH para desnaturalizar la proteína, y se midió la cantidad de producto formado (Díaz, 1997). La fosfatasa alcalina es una enzima activa únicamente en medio alcalino con un pH alrededor de 9.05-10.05 (Bennington, 2000). Esto pudo comprobarse al realizar el experimento, ya que la velocidad de reacción comenzó un aumento progresivo respecto al tiempo, hasta llegar al punto de velocidad máxima, que se registró a pH 10.4 (Figura 4), sin embargo, a pesar de que dos de los buffers utilizados mantenían fijo este valor de pH, la enzima mostró cierta preferencia por el de glicina. Esto hace suponer que las velocidad enzimática no sólo depende de pH en que se realice la catálisis, sino también del buffer que fije este valor. Cabe mencionar que el pH óptimo de la fosfatasa alcalina también depende de la naturaleza del sustrato; con sustancias de bajo peso molecular el pH está comprendido entre 9 y 10, por ejemplo con la fosfoserina; por el contrario, la desfosforilización de la caseína es más rápida a pH cercano a 7 (Alais,1985). Respecto a la temperatura, fue posible notar que la velocidad de reacción aumenta con el incremento de temperatura. La velocidad comenzó a incrementarse conforme lo hacía la temperatura hasta llegar a un máximo a 50 ºC (Figura 5), momento en el cual comenzó a descender de manera pronunciada, muy probablemente por la pérdida de estructura funcional. Este comportamiento coincide con el descrito por (Koolman, 2004) pues la dependencia de la actividad enzimática de la temperatura resultó ser asimétrica; cuando aumentó la temperatura se observó una aceleración inicial de la reacción debida al aumento del calor generado por el movimiento de las moléculas, hasta llegar a un punto en que la ezima se tornó inestable y luego de un corto intervalo a esa temperatura su actividad comenzó a decrecer por desnaturalización hasta perderse totalmente. Svante Arrhenius observó que la mayoría de las reacciones mostraba un mismo tipo de dependencia con la temperatura; lo cual expresó en lo que hoy se conoce como ecuación de Arrhenius (Avery, 2002). De lo resultados obtenidos se puede ver que la energía de activación de 0.00237 J es lo sufientemente baja para que la formación de productos no tenga mayores complicaciones en cuanto a la barrera energética necesaria para comenzar. Además, al observar el valor de la pendiente (0.00028), puede decirse que corresponde con una velocidad de reacción muy sensible a la temperatura (la representación de Arrhenius tiene una pendiente grande) que se verifica en la Figura 6.

9

Posteriormente se analizó el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimatica de la fosfatasa alcalina (Figura 7), en la gráfica puede verse un incremento en la velocidad de transformación respecto a la concentraciónde sustrato, sin embargo, este aumento no es lineal y, aparentemente comienza a disminuir a concentraciones elevadas, aunque esto probablemente se debe a un error experimental. En la parte inferior de la curva, la reacción se aproxima a una cinética de primer orden, lo que significa que la velocidad es una función directa de la concentración de sustrato porque los sitios activos de las moléculas de enzima no están saturados (Bradley, 1982), por otro lado, en la porción superior de la gráfica, que podría parecerse a una meseta, la reacción se aproxima a cinética de orden cero porque los sitios acticos de todas las moléculas de enzima están saturados y la velocidad de reacción es, por consiguiente, independiente de posteriores incrementos en la concentración de sustrato (Bradley, 1982). En resumen, la gráfica demuestra que la velocidad aumenta con la concentración de sustrato hasta que se aproxima de forma asistótica a una velocidad máxima (Vmax), después de la cual concentraciones mayores de sustrato no aumentan de forma significativa la velocidad de reacción. La Km es una constante para cada enzima, y su importancia radica en que es un índce muy aproximado de la afinidad de la enzima a su sustrato. La Km suele ser inversamente proporcional a la afincida de la enzima por el sustrato (Peña, 2004). Puede verse en la Figura 7 que si la Km, expresada en términos de concentración de sustrato, es muy pequeña, quiere decir que a baja concentración de sustrato, [S], se incrementará de manera importante la velocidad; y que conforme aumenta [S] la velocidad aumentará cada vez menos, de manera asintótica. Se calculó la Km y la Vmax para la enzima en estudio por medio de la ecuación de LinewearBurk (Figura 8), cuyos valores resultaron de 0.1186 mM y 0.009347 µmol/min, respectivamente. Cabe mencionar que la Km es única para cada par enzima-sustrato; los diferentes sustratos que reaccionan con una enzima determinada lo hacen con diversos valores de Km. De manera similar, las diferentes enzimas que actúan sobre un solo sustrato tienen distintos valores de Km. El significado de Km es la concentración de sustrato a la que la velocidad de la reacción es la mitad de la máxima; por lo que, si una enzima tiene un valor pequeño de Km, alcanza la eficiencia catalítica máxima a bajas concentraciones de sustrato (Voet, 2009). Por otro lado, Vmax, es la velocidad máxima de una reacción, que se presenta a altas concentraciones de sustrato cuando la enzima está saturada, es decir, bajo la forma de complejo enzima-sustrato (Voet, 2009). CONCLUSIONES La actividad enzimática puede expresarse en términos de velocidad de reacción si la reacción enzimática es lineal respecto al tiempo, por lo menos en un intervalo de éste. Efectivamente, los factores que se esperaba tendrían influencia sobre la actividad enzimática lo tuvieron, de tal suerte que el estudio permitió establecer las condiciones de ensayo para determinar la actividad enzimática. Se determinó que cinco minutos de reacción es un tiempo adecuado. El pH óptimo de actividad de la fosfatasa alcalina resultó ser pH 10, especificamente con un buffer de glicina. La temperatura de mayor actividad fue 50 ºC. Si se aumenta la concentración de sustrato, la velocidad de reacción también aumenta, aunque no de manera lineal, sino hiperbólica.

BIBLIOGRAFIA  

 

Alais C. y Lacasa A. Ciencia de la Leche: Principios de Técnica Lechera. Reverté, Madrid, 1985, pp. 237-239. Bárcena R. L., et al. “Caracterización cinética de la fosfatasa alcalina.” Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Córdoba. Disponible en: http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/30%20FOSFATASA%20ALCALINA.pdf. Consultado: 15 de marzo de 2013. Bennington. Diccionario enciclopédico del laboratorio clínico. Médica panamericana, España, 2000, pág. 590. Bradley, et al. Bioquímica. Reverté, España, 1982, pp. 129-130.

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Díaz P., Fernández del Barrio y Paredes S. Aspectos Básicos de bioquímica clínica, Díaz de Santos, España, 1997, pp. 99 Koolman J. Y Klaus-Heinrich R. Bioquímica: texto y atlas. 3a ed., Médica panamericana, España, 2004, pp. 94 Peña, et al. Bioquímica. 2ª ed., Limusa, México, 2004, pp. 197-199. Voet D., et al. Fundamentos de bioquímica: la vida a nivel molecular. 2ª ed., Médica panamericana, Buenos Aires, 2009, pp. 364-365. H. E. Avery. Cinética Química Básica y Mecanismos de Reacción .Editorial Reverte.España, Madrid, 2002.pp. 51-53

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