Reporte de Practica Análisis Microbiológico de Agua Residual

INSTITUTO TECNOLOGICO DE TEPIC

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Ing. Química

Tratamiento de Aguas Residuales

I.Q. Suales Aguirre Ramón Roberto

PRACTICA No. 3

 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS RESIDUALES

Covarrubias C. Miguel, Hernández N. Azucena, Izaguirre C. Ignacio, Ramírez M. Kenya, Reyes A. Alam, Ruiz Romaín,

RESUMEN:

En ésta práctica se realizó un análisis de bacterias mesofílicas aerobias y de coliformes en muestra de agua del río mololoa, obteniéndose altos resultados como era de esperarse. Mesofílicos aerobios. Se utilizó la técnica por vaciado en placa, comenzando por

la homogenización de la muestra por agitación, se realizó la siembra directa en diluciones seriadas hasta 10-5, el método consistió en contar las colonias que se desarrollaron en el agar estándar , después de 48 h de incubación a 35 ±2 °C, suponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio, los resultados se reportaron como UFC/ml de muestra ( Unidades Formadoras de Colonias). Coliformes Totales y Fecales. Se utilizó la técnica de tubos de fermentación

múltiple (dilución en tubo) del número más probable (NMP), el cual proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado. El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ±1 °C (coliformes totales) ó 44.5 °C (coliformes fecales) durante 24 a 48 h, resultando en la producción de ácidos y gas, el cuál se manifiesta en las campanas de fermentación.

I.- INTRODUCCION:

Debido a que las aguas residuales son de composición variada provenientes de descargas de usos municipales, industriales, comerciales, de servicios, agrícolas, pecuarios, domésticos, incluyendo fraccionamientos y en general de cualquier uso, así como la mezcla de ellas, contienen diferentes tipos de microorganismos contaminantes y las diferentes concentraciones, dependiendo de su fuente. La variada población de microorganismos en esta agua, proviene del suelo y de origen intestinal, incluyen aerobios y anaerobios estrictos y facultativos así como también numerosos virus como: Poliovirus y virus de la hepatitis. Igualmente pueden contener formas parasitarias variables como quistes de Protozoarios y huevecillos de Helmintos (Metazoarios). Los recuentos de Mesófilos Aeróbicos en placa son útiles para determinar la potabilidad de un agua, así como también la eficiencia de las operaciones para eliminar microorganismos, como la sedimentación, filtración y cloración. La determinación del conteo de bacterias mesófilas aerobias en una muestra de agua se realiza, normalmente, por siembra en una placa, de un volumen determinado de agua, por incubación a una temperatura concreta y en un tiempo determinado, y por recuento posterior de las colonias desarrolladas y con la aceptación implícita de que cada colonia es originada por una bacteria de la muestra inicial, por lo tanto, el número de

colonias equivaldrá al número bacterias en el volumen sembrado.

de

El método de la NPM es un método robusto por lo que puede aplicarse en cualquier tipo de agua, aún aquellos que contienen gran cantidad de materia orgánica. Para la determinación del NMP de Coliformes Totales y Fecales en este tipo de aguas, es necesario proceder a preparar diluciones decimales de la muestra, debido a que se espera que la concentración de coliformes sea superior en éstas que en un agua potable. El número de diluciones varía mucho, dependiendo del origen de la muestra a tratar. Para realizar la estimación microbiana se utiliza un mínimo de tres diluciones y un intervalo de 3 a 10 réplicas (“n” tubos de medio para el

crecimiento) por disolución; el número de disoluciones y réplicas utilizadas estará en función de la precisión requerida.  Actualmente, existen tablas estándar como las publicadas por FDA o NACE para estimar el número de microorganismos más probables. Estas tablas están limitadas a tres diluciones y a 3, 5 y 10 réplicas por disolución; sin embargo, también existen programas de computadoras( MPN calculator TM, “Chem SW”) para obtener la estimación microbiana empleando más de tres disoluciones y un número mayor de réplicas.

En la sección II Desarrollo : Se describe los pasos y métodos empleados durante la elaboración de práctica de laboratorio.

6.- Se procede a limpiar el área de trabajo para que no contamine nuestro material .

En la sección III Resultados: Se describen los resultados obtenidos así como fotografías de estos.

7.- Se espera a que el material ya esterilizado se enfríe .

En la sección IV Conclusiones: Se describen las observaciones sobre los resultados obtenidos. En la sección V Bibliografía: Se citan los libros o textos de los cuales se tomaron referencias para la realización de práctica.

II.- DESARROLLO: Preparación de material y área de trabajo:

1.- En cada tubo de ensayo se pone 9 ml de agua destilada, dentro de un frasco con tapa se agregan 90 ml para esterilizar y realizar las diluciones correspondientes. 2.-Se prepara el material para esterilizar, envolviéndolo en papel destraza. 3.-Se procedió a preparar el caldo y medio de cultivo, ya listos se colocan en una olla para esterilizar. 4.-Esperar que la olla de esterilización llegue a una presión de 15 lb que es igual a 250ºC manteniéndolo durante 15 min. 5.- Transcurrido ese tiempo se procede a apagar los mecheros dejando que la válvula de presión deje escapar poco a poco el vapor dentro de la olla.

Recuento aerobios:

de

bacterias

mesofílicas

1.-De la muestra directa inocular por duplicado 1ml de agua en las cajas Petri. 2.-Adicionar 20 ml de agar estándar fundido y enfriado a 44ºC 3.-Incorporar el inoculo al medio y homogeneizar. 4.-Etiquetar 5.-Dejar solidificar e incubar a 37ºC durante 24 horas. 6.-Contar colonias desarrolladas y reportar en cada caso la media de las 2 placas inoculadas. Preparación de diluciones:

(10-1) 1.-De la botella de dilución inocular por duplicado 1ml de agua en las cajas Petri. 2.-Adicionar 20 ml de agar estándar fundido y enfriado a 44ºC 3.-Incorporar el inoculo al medio y homogeneizar. 4.-Etiquetar 5.-Dejar solidificar e incubar a 37ºC durante 24 horas.

6.-Contar colonias desarrolladas y reportar en cada caso la media de las 2 placas inoculadas

-2

(10 ) 1.-De la botella de dilución se toman 1ml y se agrega un tubo de ensayo se agita hasta homogenización. 2.-Del tubo de ensayo inocular por duplicado 1ml de agua en las cajas Petri. 3.-Adicionar 20 ml de agar estándar fundido y enfriado a 44ºC 4.-Incorporar el inoculo al medio y homogeneizar.

5.-Etiquetar 6.-Dejar solidificar e incubar a 37ºC durante 24 horas. 7.-Contar colonias desarrolladas y reportar en cada caso la media de las 2 placas inoculadas.

(10-4) 1.-Del tubo de ensayo de (10 -3) se toman 1ml y se agrega un nuevo tubo de ensayo se agita hasta homogenización. 2.-Del tubo de ensayo inocular por duplicado 1ml de agua en las cajas Petri.

5.-Etiquetar

3.-Adicionar 20 ml de agar estándar fundido y enfriado a 44ºC

6.-Dejar solidificar e incubar a 37ºC durante 24 horas.

4.-Incorporar el inoculo al medio y homogeneizar.

7.-Contar colonias desarrolladas y reportar en cada caso la media de las 2 placas inoculadas.

5.-Etiquetar

-3

(10 ) 1.-Del tubo de ensayo de (10 -2) se toman 1ml y se agrega un nuevo tubo de ensayo se agita hasta homogenización. 2.-Del tubo de ensayo inocular por duplicado 1ml de agua en las cajas Petri. 3.-Adicionar 20 ml de agar estándar fundido y enfriado a 44ºC 4.-Incorporar el inoculo al medio y homogeneizar.

6.-Dejar solidificar e incubar a 37ºC durante 24 horas. 7.-Contar colonias desarrolladas y reportar en cada caso la media de las 2 placas inoculadas.

(10-5) 1.-Del tubo de ensayo de (10 -4) se toman 1ml y se agrega un nuevo tubo de ensayo se agita hasta homogenización. 2.-Del tubo de ensayo inocular por duplicado 1ml de agua en las cajas Petri.

3.-Adicionar 20 ml de agar estándar fundido y enfriado a 44ºC

4.-El tubo positivo mostrará además denso desarrollo bacteriano.

4.-Incorporar el inoculo al medio y homogeneizar.

La Ausencia de gas en los tubos hace negativo la prueba.

5.-Etiquetar 6.-Dejar solidificar e incubar a 37ºC durante 24 horas. 7.-Contar colonias desarrolladas y reportar en cada caso la media de las 2 placas inoculadas.

1.-Inocular con 1ml de muestra y 10 ml de fermentación con Caldo Lauril Sulfato de Sodio (CLSS) concentración simple. 2.-Incubar a 37ºC durante 48 horas. 3.-Observar cuidadosamente en cada uno de los tubos la presencia de gas en cualquier cantidad dentro de la campana de fermentación.. 4.-El tubo positivo mostrará además denso desarrollo bacteriano. La Ausencia de gas en los tubos hace negativo la prueba.

Número más probable de Organismos Coliformes (NMP): A)Prueba Presuntiva:

1.-Inocular 5 tubos con 10 ml de muestra y con 20ml de fermentación con Caldo Lauril Sulfato de Sodio (CLSS) a 150% concentración. 2.-Incubar a 37ºC durante 48 horas. 3.-Observar cuidadosamente en cada uno de los tubos la presencia de gas en cualquier cantidad dentro de la campana de fermentación..

1.-Inocular con 0.1ml de muestra y 10 ml de fermentación con Caldo Lauril Sulfato de Sodio (CLSS) concentración simple. 2.-Incubar a 37ºC durante 48 horas. 3.-Observar cuidadosamente en cada uno de los tubos la presencia de gas en cualquier cantidad dentro de la campana de fermentación.. 4.-El tubo positivo mostrará además denso desarrollo bacteriano.

La Ausencia de gas en los tubos hace negativo la prueba.

B) Prueba Confirmativa:

1.-Transferir a un tubo 10ml de caldo verde brillante bilis 2%. 2.-Incubar a 37ºC durante 48 horas. 3.-La formación de gas en cualquier cantidad dentro de la campana , hace positiva la prueba. 4.-Determinar el NMP de organismos coliformes en la muestra.

Interpretación:

Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP. Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se consideran NEGATIVOS, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP Si todos los tubos dan negativos ó todos dan positivos, con base en los grados de dilución analizados, considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución menores (mayores volúmenes de muestra) ó mayores (menores volúmenes de muestra), respectivamente. III.- RESULTADOS:

Después de la incubación se procedió a realizar el conteo de colonias:

Para el recuento Aerobios: Muestra

Directa Directa x 10-   x 10-   x 10x 10-   x 10x 10x 10x 10x 10x 10-

Colonias

370 392 Extendidas Extendidas 176 Extendida 121 No presencia 27 174 14 169

de

mosofílicos

Coliformes:

20 ml de Caldo Lauril Sulfato de Sodio: Recuento estándar en placa por ml

370 392 17,600 121,000 270,000 1,740,000 1,400,000 16,900,000

De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes Totales y Fecales, se establecieron los códigos correspondientes para calcular por referencia en las tablas estadísticas (Tablas) el NMP de Coliformes Totales y Fecales en 100 mL de agua. 1 ml Caldo Lauril Sulfato de Sodio:

5 tubos positivos 1 tubo positivo 0 tubo positivo

10 ml 1 ml 0.1 ml

N.M.P. de Coliformes

31.0

IV.- CONCLUSIONES:

Se realizaron análisis microbiológicos a nuestra muestra de agua del Río Mololoa, dichos análisis fueron mesofílicos aerobios y coliformes totales 0.1 ml Caldo Lauril Sulfato de Sodio:

En el crecimiento de colonias se debe a bacterias existentes en la caja Petri, así como el gas dentro de los tubos de ensayo. Se detectó un alto crecimiento bacteriano de nuestra muestra debido a que esta agua contiene distintas composiciones de materia orgánica e inorgánica habilitando así que bacterias se reproduzcan.

Caldo Verde Brillande Bilis al 2% En duda ya que hubo una mala interpretación en la lectura de la práctica olvidando poner en el tubo la campana Durham, por lo que no se pudo retener el gas dentro de ella y en consecuencia no se pudo apreciar la aparición o ausencia de coliformes.

 A pesar de que los microorganismos no pueden ser vistos a ojo humano se pueden distinguir por las características que presentan en los cultivos creados y así tener una idea más clara de que o cuales microorganismos pudieran ser detectados en nuestras muestras.

V.- BIBLIOGRAFIA:

Secretaria de Comercio y Fomento industrial. 1987. NNX-AA-42-1987. Calidad del agua determinación del número más probable (NMP) de coliformes totales, coliformes fecales (termotolerantes) y Escherichia Coli presuntiva. NOM-092-SSA1-1994. Método para la cuenta de organismos mesofílicos aerobios. Diario Oficial de la Federación. Gobierno constitucional de los Estados Unidos Mexicanos. México D.F. Toro Daniel Ricardo. Manual para la introducción al laboratorio de microbiología 1a Edición.