Reporte Cultivo Por Lote Alimentado

PRÁCTICA 6: “CULTIVO POR LOTE Y LOTE ALIMENTADO”

LABORATORIO DE BIORREACTORES PRÁCTICA 6: “Producción de proteasa extracelular a partir B. subtilis utilizando sustratos crudos en bioreactor Airlift”. González Valadez Manuel Lastra Martos Carlos Ramírez Amador Fidel Villagómez García David 5BM1 Martes 21 de Abril de 2015

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RESUMEN. Dentro del área de Bioprocesos pueden darse diferentes tipos de control, como pueden ser un cultivo por lote (Batch), lote alimentado (Fed-batch) o continuo; según corresponda al propósito que se busca cumplir. Es decir, si se busca la generación de biomasa primordialmente, o bien la producción de metabolitos de valor industrial o productos de alto valor agregado. Las proteasas por ejemplo, han adquirido mayor interés en las industrias textil y farmacéutica principalmente. Por ende y debido a su valor comercial, se han buscado estrategias para la obtención de las mismas. En nuestro caso, se probó con la producción de proteasas extracelulares a partir de B. subtilis, utilizando sustratos crudos de camote y soya, operando el proceso en un biorreactor tipo Air-lift en cultivo por lote alimentado.

INTRODUCIÓN. El cultivo por lote alimentado (CLA) también llamado Fed-Batch (BA), es una técnica de cultivo en biorreactor que consiste en alimentar continuamente un cultivo con medio nutritivo fresco. El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la productividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. (Villanueva, J., 1992). Algunas características principales de un CLA son:  Permite el control de velocidad específica de crecimiento de microorganismos (μ).  Todos los nutrientes son adicionados antes de la inoculación.  Medio modificado por metabolismo.  La producción de microorganismos es limitada por la cantidad de Carbono/Nitrógeno (C/N) adicionada y por la producción de compuestos tóxicos.  Al inicio de la operación se añade el medio de cultivo y se inocula, incubando bajo las óptimas condiciones. En la Figura 1, se puede observar un esquema general del proceso CLA en dónde: FIGURA 1. Esquema general de un cultivo por lote alimentado (CLA). Donde F(t): Caudal de alimentación; Sr(t): Concentración de sustrato en la alimentación; Vf: Volumen final de operación; V0: Volumen de operación inicial; X0: Concentración inicial de biomasa. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

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Se han establecido diferentes ecuaciones diferenciales para el monitoreo y control de las diferentes variables involucradas durante el proceso, tal como concentración celular (X), concentración de sustrato (S) y concentración de producto (P). Así como para la medición de parámetros cinéticos como velocidades específicas para biomasa, sustrato y producto (qx, qs y qp, respectivamente) y el rendimiento (Yxs). En la Tabla 1, se establece una comparación entre los balances realizados para un cultivo por lote (Batch) y uno por lote alimentado (Fed-Batch).

Además de los parámetros cinéticos mencionados, durante una fermentación en un biorreactor es indispensable el control de parámetros físicos como temperatura, velocidad de agitación, potencia, flujo de aireación, viscosidad del medio, etc.; al igual que parámetros químicos como pH, concentración de oxígeno disuelto (OD), CO2, potencial redox, etc. Todas estas variables tienen un importante efecto sobre el rendimiento de la biorreacción y sobre las reacciones enzimáticas. (García, 1993). Así mismo, para facilitar el monitoreo de dichas variables, es necesaria la instrumentación adecuada, según el parámetro a controlar (véase Tabla 2.). Idealmente, estos sensores deben de estar en línea para medir las propiedades físicas del cultivo, al mismo tiempo deben ser esterilizables para asegurar la asepsia del proceso. (Moreno & Bernal, 1996).

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TABLA 2. Instrumentación de control según la variable a controlar.

En cuanto al producto de interés, las proteasas, estas son endopeptidasas que actúan sobre las proteínas hidrolizando enlaces peptídicos. Las proteasas pueden ser: metaloproteasas que trabajan a pH óptimo de 7,0; estearasas, enzimas con alta actividad esterolítica y baja actividad proteolítica; o bien serin-proteasas. La alcalin-serin-proteasa producida por Bacillus subtilis, también llamada subtilissin, es una de las enzimas más estudiadas, de ahí que sus genes han sido clonados repetidas veces. De estos estudios se ha podido determinar que subtilis-sin no se trata de una enzima esencial y que su ausencia no afecta ni el crecimiento ni la especulación de Bacillus, y se puede decir que esto se cumple para todas las proteasas producidas por Bacillus. (Devlin, T., 1999). Debido a su capacidad química de hidrolizar enlaces peptídicos, las proteasas han sido empleadas en diferentes industrias tales como la industria textil y farmacéutica entre otras.

OBJETIVO. Operar el biorreactor tipo Airlift para la producción de proteasas a partir de B. subtilis con sustratos crudos, en base a un cultivo por lote y lote alimentado. Objetivos específicos:  Monitorear crecimiento celular, sustrato residual y actividad enzimática por distintos métodos reportados.  Mantener condiciones estériles en todo momento. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

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Llevar a cabo los medios de cultivo necesarios para propagación de la cepa, preinóculos y medio de fermentación.

MATERIALES Y METODOLOGÍA. Material: I. Cajas Petri. II. Matraces Erlenmeyer de 250mL, 1000mL y 2500mL. III. Vasos de precipitado de 250mL y 500mL. IV. Espátulas. V. Tubos Falcon. VI. Tubos Eppendorf. VII. Celdas para espectrofotómetro. VIII. Micropipetas 100-1000µL. Medios y reactivos: I. Cepa de B. subtilis. II. Almidón. III. Peptona. IV. NaCl. V. Agar bacteriológico. VI. Agar papa-dextrosa. VII. Agar nutritivo. VIII. Harina de soya. IX. Salgado de trigo. X. Polvo de camote. Equipos: I. Biorreactor tipo Air-Lift de 3L marca Applikon. II. Consola con software para obtención de datos. III. Sensor de oxígeno marca Applisense®. IV. Sensor de temperatura. V. Sistema de calentamiento.

IX. X. XI. XII. XIII. XIV. XV. XVI. XVII.

XI. XII. XIII. XIV. XV. XVI. XVII. XVIII. XIX.

VI. VII. VIII. IX. X. XI. XII.

Micropipetas 20-200 µL. Cajas puntas azules. Cajas puntas amarillas. Probetas 100mL. Frasco ámbar. Papel filtro. Bolsas de polipapel. Gasas. Cinta testigo.

NaOH. Ácido 3,5-dinitrosalicílico. Tartrato Sodio-Potasio tetrahidratado. Fenol. Sulfito de Sodio. Na2PO4. KH2PO4. Albúmina. Ácido acético.

Báscula analítica. Autoclave. Vórtex. Espectrofotómetro UV-VIS. Compresor de aire de 25L marca Pretul®. Incubadora. Refrigerador.

La metodología del proceso realizado se subdivide conforme a las acciones realizadas cada día, desde el inicio hasta el final de la práctica.

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MARTES 17/03  Preparación de reactivo DNS (véase Anexo 1) y realización de curva de calibración para azúcares reductores (Método de Miller).  Preparación de dos medios de cultivo papa dextrosa y agar nutritivo para propagación, los cuales se esterilizaron y posteriormente se inocularon con B. subtillis, incubándolos a 30°C. MIÉRCOLES 18/03 Preparación de medios:  Medio Sólido (1L): 20g de Almidón; 10g de peptona; 5g de NaCl y 20g de Agar bacteriológico.  Medio nutritivo (100mL): 0.8g de agar nutritivo.  Medio Líquido (150mL): 7.5g de camote seco (cortado, deshidratado y pulverizado); 7.5g de harina de soya; 2.5g de salvado de trigo; 1g de Na2PO4 y 0.75g KH2PO4  Medio Líquido de operación (2L): 140g de camote seco (cortado, deshidratado y pulverizado); 70g s de salvado de trigo; 50g de harina de soya; 8 g Na2PO4 y 0.6 g KH2PO4.  Se esterilizaron en autoclave. Se perdieron durante la esterilización 400mL de medio de operación. Posteriormente los medios nutritivo y líquido de 100mL y 150mL respectivamente se inocularon con B. subtillis a partir de los medios preparados el día anterior. Se incubaron a 30°C.  Se vertió el medio de cultivo sólido en 40 cajas de Petri utilizando la campana de flujo laminar. JUEVES 19/03  Se esterilizó el biorreactor en 3 autoclaves diferentes, aislando con aluminio toda abertura que pudiera contaminarse utilizando bolsas de poli papel y papel aluminio.  Se inoculó el medio de operación con los medios que se incubaron.  Se instaló el biorreactor.  Se calibró el compresor a 1.5L/min y se conectó a válvula de inyección de aire.  Se alimentó el biorreactor con 1.5L de medio, quedando sedimento de sobra.  Durante cada dos horas se tomó muestra, siendo la primera a las 12:30pm y la última a las 20:30pm (6 muestras en total), donde de cada una se siguió una metodología para determinar sustrato, producto y biomasa.  Las muestras se almacenaron en refrigerador a 4°C.  Durante la noche se disminuyó el flujo de aire a 0.5L/min para prevenir el derrame de espuma.

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VIERNES 20/03  Preparación de 100mL de antiespumante Tween 80 al 1%. Se Adicionó al biorreactor 10mL.  Se hicieron 3 alimentaciones cada dos horas, tomando muestras cada hora, finalizando la toma de muestras a las 13:30pm  A cada una de las muestras (incluyendo las del día anterior) se les hizo diluciones hasta alcanzar el orden de 10-7, pero solo se plaquearon (con 200µL) la de 10-5 y 10-7 en cajas Petri con medio sólido. Se dejaron a temperatura ambiente durante el fin de semana.  Las muestras se guardaron en refrigerador a 4°C.  Se limpió el biorreactor y se desarmó. LUNES 23/03  Se realizaron metodologías para la cuantificación de consumo de sustrato (véase Anexo 2), generación de producto (véase Anexo 3) y biomasa. Este último consistió en técnica de conteo de colonias a partir de diluciones 10 -5 y 10-7. DESCRIPCIÓN DEL SISTEMA.

A

B

1. 1.

6. 2. 2. 6.

7. 7. 3.

8. 8. 4. 5.

FIGURA 2. Componentes principales del sistema utilizado para cultivo por lote alimentado.

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A. Biorreactor tipo Air-Lift de 3L marca Applikon®. 1. Sensor de Oxígeno Applisense®. 2. Ventanilla de observación. 3. Sensor de Temperatura. 4. Válvula de toma de muestra/Inyección de aire. 5. Filtro de aire de membrana. B. Software de obtención de parámetros para biorreactor Air-Lift marca Applikon®. 6. Pantalla para recolección de datos (pH, temperatura de operación, concentración de oxígeno disuelto (OD)). 7. Rotámetros (L/min). 8. Bombas peristálticas para soluciones ácidas, alcalinas o antiespumantes.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN. En un inicio, el proceso se llevó a cabo como un cultivo por lote (Batch) durante 22 horas (véase Fig. 3); durante las cuales, se tomaron muestras cada hora por las primeras 8 horas. Después de este tiempo, se dejó al reactor operando toda la noche (14 horas aproximadamente), disminuyendo a su vez el flujo de aireación a 0.5L/min como se menciona en la metodología, para evitar posibles derrames de espuma. Posteriormente, se realizó la primera alimentación con 200 mL de medio nutritivo con sustrato crudo (camote, soya, trigo). Se alimentó nuevamente este volumen a las 24 y 25 horas. Las muestras se diluyeron hasta factores de 10 -5 y 107 en 1 mL. Con un volumen de operación de 2.05 L se establecieron valores de biomasa para cada muestra.

Biomasa vs Tiempo 4.00E+14 3.50E+14 3.00E+14

UFC

2.50E+14 2.00E+14 1.50E+14 1.00E+14 5.00E+13 0.00E+00 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

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Tiempo (Horas)

FIGURA 3. Curva de Biomasa (UFC) vs Tiempo (Horas). El espacio entre 8-22 horas corresponde al periodo noctuno. Las líneas verticales representan las alimentaciones realizadas durante el cultivo por lote alimentado. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

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Es posible observar una disminución entre la biomasa inicial en el reactor y las muestras consiguientes. Se considera que esto es debido al cambio drástico que sufre el microorganismo (B. subtilis) en cuanto a su fuente de Carbono, al pasar de un caldo nutritivo a el medio de operación compuesto por sustratos crudos de camote, soya y trigo. Esto mismo lo menciona Espinosa (2005), cuando estudia la regulación de fermentación de B. subtilis en medios mínimos y complejos con glucosa y ácido pirúvico, donde observó una fase de adaptación larga de 7 horas. Por tanto, dicha línea de adaptación se interpreta como la fase “lag”. Una vez iniciado el cultivo por lote alimentado puede observarse un incremento inicial considerable, con respecto a la biomasa cuantificada a las 8 horas. No obstante se obtuvo también una caída pronunciada luego de la segunda y tercera alimentación. En relación a esto, cabe mencionar que debido a una constante generación de espuma al inicio del proceso, fue necesario reajustar el flujo de aireación en numerosas ocasiones. Igualmente, se disminuyó el flujo de 1.2 LPM de aire a 0.5 LPM durante la noche. Esto pudo causar una disminución considerable de la concentración de oxígeno disuelto en el medio que, aunado al crecimiento de B. subtilis, pudo llegar a valores críticos. También, al agregar el antiespumante Tween 80 al sistema, pudo aumentar la resistencia a la transferencia de oxígeno en el medio. Esto ya que los antiespumantes generalmente afectan el área de transferencia en las burbujas de aire. (Doran, 1998). Espinosa (2005), reporta también una concentración de saturación de oxígeno en agua a 37°C y 1 atm de hasta 220µM. Para B. subtilis, Moes et al., (1985) reportan concentraciones limitantes de oxígeno disuelto de 3.13 µM, en las cuales es aun capaz de generar productos metabólicos como acetoina y butaneidol, más no serin-proteasas. A partir de los datos de biomasa anteriores, se procedió a la estimación de la velocidad específica de crecimiento (véase Fig. 4). Para determinar la velocidad máxima (µmáx) se desarrolló una forma linealizada para la ecuación de crecimiento celular (Ecuación 1), de igual modo, al observar con detalle la Fig. 3 puede interpretarse un incremento entre las horas 7 y 8, por lo que puede considerarse como un inicio en la fase transitoria entre la fase “lag” y la de “crecimiento exponencial”. (Universidad de Granada, 2005).Por ende, es posible considerar µ≈µmáx. 𝑑𝑥 = 𝜇𝑥 𝑑𝑡 𝑥 = 𝑥0𝑒 𝜇𝑡 𝐥𝐧(𝒙) = 𝝁𝒕 + 𝐥𝐧⁡(𝒙𝟎)

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µ vs Tiempo Velocidad específica de crecimiento (1/h)

2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8

0.6 0.4 0.2 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Tiempo (Horas)

FIGURA 4. Velocidades específicas de crecimiento (µ) para diferentes instantes de tiempo (horas). De manera gráfica, puede establecerse µmáx como un promedio entre los puntos de variación en la Fig. 4; de esta forma 0.9 ≥ µmáx ≥ 0.6 aproximadamente. Sin embargo, al linealizar conforme a la Ecuación 1 se obtiene una pendiente m = µ máx = 0.6368 h-1. En base a la velocidad específica de crecimiento máxima, se calculó el tiempo de duplicación de B. subtilis en el sistema con la Ecuación 2. 𝒕=

𝐥𝐧⁡(𝟐) 𝝁𝒎𝒂𝒙

= 𝟏. 𝟎𝟖𝟖 𝐡

(2)

Aun cuando este valor difiere totalmente del reportado por Stainer (2002) de 0.43 h, este autor hace referencia únicamente a una temperatura óptima de 55°C, mientras que la temperatura de control utilizado en este caso fue de 35°C; igualmente, Stainer considera un crecimiento igualmente óptimo en un medio nutritivo, a diferencia del medio complejo ya mencionado en otras ocasiones. En lo que a generación de producto se refiere, la actividad enzimática se realizó conforme a lo mencionado por Salcedo (2003) en cómo la actividad enzimática puede ser cuantificada tomando la pendiente (de una base lineal previa) de la curva de Absorbancia vs Tiempo; tal como él lo hizo en su experimento para la determinación de polifenoloxidas en el pardeamiento del banano.

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Dicho esto, se cuantificó la actividad de proteasas (véase Fig. 5) por un método reportado como análogo al “Método de Kunitz” (véase Anexo 3). (Belmán et al., s/a). La actividad proteolítica se determinó con la ecuación: 𝐴𝑏𝑠 280 𝑛𝑚 𝑈𝑃 = (𝐹) 𝑡𝑉 Donde:  UP = Unidad de actividad proteolítica.  t = tiempo de ensayo de actividad (10 min).  V = vol. de sol. Enzimática (2mL).  F = Factor de dilución (1). (Priolo et al., 1991).

Unidades de actividad proteolítica (UP)

Unidades de Actividad Proteolítica 0.045 0.04 0.035 0.03

0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

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Tiempo (horas)

FIGURA 5. Unidades de actividad proteolítica por unidad de tiempo (horas). En la Figura 6, se muestra la curva obtenida por Belmán et al. (s/a), obtenida luego de monitorear la actividad proteolítica generada por cepa mexicana de B. subtilis durante 74 horas. Se asemeja parcialmente a la obtenida, en cuanto a picos considerables en lapsos cortos de tiempo y comportamiento constante luego de un largo tiempo.

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FIGURA 6. Curva obtenida por Belmán para actividad proteolítica de cepa mexicana de B. subtilis. Es coherente la aparición de actividad enzimática desde una etapa temprana, debido a que la curva fue iniciada luego de agregar un preinóculo para asegurar una inducción del sustrato. De igual manera, el descenso en la actividad observado en la hora 4 indica una posible inactivación parcial del complejo enzimático; esto como una respuesta fisiológica al inicio del desarrollo en un medio complejo, como el que se estuvo operando durante el proceso. Así mismo se ha demostrado anteriormente una alta especificidad de diferentes sustratos proteicos naturales y modificados, donde las proteasas exhiben una alta afinidad por la caseína. (Márquez et al., 2007). Ahora bien, en cuanto al consumo de sustrato, no fue posible la cuantificación por azúcares reductores debido a numerosos factores, entre los cuales el más considerable se cree que es una incorrecta preparación del reactivo DNS. En base a esto, Siempre que se utilice la técnica de DNS debe respetarse la composición del reactivo DNS, es importante recordar que siempre que se haga una modificación debemos comprobar que no se afecte la linealidad del método. De lo contrario se obtendrán resultados dudosos, o erróneos. Según el manual del IPN (2011), se preparan 20mL de una solución de NaOH al 2 N con NaOH sólido en un Erlenmeyer de 200mL y llevar a agitación hasta obtener una solución homogénea. A esta solución se le adicionan 30 gramos de Tartrato de Sodio y Potasio y se completa el volumen a 100mL. Para la adición del DNS, se debe tener en cuenta, que este en solución es reactiva a la luz; por lo tanto es necesario utilizar un recipiente ámbar o en su defecto cubrir el Erlenmeyer con papel aluminio.

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Por último a esta solución se le añade 1 gramo de DNS (ácido 3 – 5 dinitrosalicílico). Para la manipulación de este reactivo es necesario utilizar tapabocas y guantes debido a su alto poder cancerígeno. Es importante recalcar que, para poder disolver el ácido dini-trosalicilico, el hidróxido de sodio deberá estar completamente disuelto. Una vez preparado, el reactivo deberá almacenarse en un recipiente color ámbar, a temperatura ambiente. Este reactivo dura aproximadamente un mes antes de presentar precipitaciones de los reactivos o vestigios de descomposición. Debido a lo anterior, se recomienda hacer los cálculos adecuados para preparar sólo la cantidad requerida de reactivo y evitar el desperdicio. En cuanto a la curva de calibración, Según la ley de Lambert y Beer, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración del material que absorbe la luz, al que generalmente conocemos como analito (Rubinson y Rubinson, 2000). Siempre que se utiliza un método espectrofotométrico para cuantificar la concentración de analito presente en una muestra problema, es necesario relacionar la concentración de dicho analito con la cantidad de luz que absorbe del haz que le incide. Es recomendable preparar una solución estandar, con una concentración conocida de analito, y realizar diluciones a partir de esa muestra. Para poder representarla numericamente se utiliza la ecuación de la recta (Y= Absorbancia, X= Concentración de analito). Debido a lo reportado en la literatura, y comparando el procedimiento que se sigue en la experimentación podemos llegar a las siguientes observaciones y puntos de discusión.  El protocolo de preparación del reactivo se siguió según lo estipulado.  Se realizaron las diluciones pertinentes para la lectura en el espectrofotómetro.  El medio era demasiado turbio, con concentraciones muy altas de proteínas y azucares, lo que hizo incierto la medición en el espectrofotómetro.  El cálculo para el reactivo de DNS pudo ser erróneo, debido a que se tomó la relación de un protocolo ya propuesto en una experimentación sujeta a diversos factores distintos a la nuestra. Finalmente, en cuanto a discusiones generales Dado que los biorreactores utilizan cultivos vivos, se ven afectados por muchas variables en su medio ambiente. Dichas variables afectan tanto el crecimiento como la muerte de los microorganismos, y no solo los microorganismos deseados sino también contaminación exterior. 1. Temperatura. 2. Humedad. 3. Cuidado y alimentación. 4. Acidez. “Temperatura” Tal vez la variable más importante en un biorreactor es la temperatura. Un flujo de aire caliente puede matar totalmente una biomasa con mayor rapidez que cualquier otro accidente. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

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La mayoría de los microorganismos pueden sobrevivir en temperaturas de 60 a 105°C. Es importante monitorear la temperatura del lecho constantemente. Por el otro lado un flujo de aire muy frio no mataría a los microorganismos pero los induciría a un estado de animación suspendida en el cual tienen la mínima actividad. Cada microorganismo tiene una temperatura optima de crecimiento, sin embargo existen variedades que se desarrollan a las mismas temperaturas es por esto que se debe ser muy cuidadoso en mantener sellado el biorreactor porque podría contaminarse y los microorganismos invasores podrían proliferar debido a la temperatura óptima. (Peter, 2006). “Humedad” Los microorganismos necesitan humedad para sobrevivir y la humedad crea la biopelícula que elimina (absorbe) contaminantes de una corriente de aire, de modo que puedan ser asimilados por los microorganismos. Para poder mantener o recuperar la humedad en un lecho seco dentro de un biorreactor se utilizan humificadores, o incluyendo un flujo de agua adecuado. Por otra parte, la inundación de un biorreactor con agua causará una caída de presión a través del lecho, y podría causar una pérdida de eficiencia debido a la canalización que se desvía de la biomasa. La humedad en porcentaje óptima para el proceso de un lecho esta entre 40 y 60 porciento. (Peter, 2006). “Nutriente” Además de lograr una temperatura cómoda y un medio ambiente húmedo, los microorganismos necesitan una dieta de nutrientes balanceados para sobrevivir y propagarse. Si un lecho es deficiente en ciertos nutrientes, los microorganismos dejarán de crecer y podrían morir. El nitrógeno es un nutriente esencial para el crecimiento microbiano, otros macronutrientes esenciales incluyen el fósforo, potasio, azufre, magnesio, calcio, sodio y hierro. (Q. Zhang, 2002). El crecimiento de un microorganismo depende del medio que se utilice para su crecimiento, al igual que la temperatura, existen medios óptimos para las variedades de microorganismos, por esta razón debe cuidarse la esterilidad del medio al igual que la del biorreactor para que no exista una contaminación por medio de microorganismos externos a los que se desea cultivar. “pH” La mayoría de los biorreactores funcionan mejor cuando el pH es cercano a 7 o neutro. Algunos componentes de los medios forman ácidos al descomponerse. Existen varias técnicas disponibles para neutralizar los lechos. Estas técnicas implican componentes que deben agregarse al medio durante su elaboración por ejemplo conchas de ostras. (Joseph, 1998). Es muy importante controlar el pH del medio ya que los microorganismos se desarrollan a pH’s específicos para cada variedad.

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Principales razones de contaminación de biorreactor Airlift:  Alimentación del medio por un embudo en contacto con el medio ambiente.  Constantes entradas y salidas del área de trabajo donde se encontraban los biorreactores.  Probablemente no se portó el equipo de trabajo (cofias, guantes, tapabocas) todo el tiempo, exponiendo el biorreactor a contaminación.  Cuando se tomaron las muestras, se utilizó una jeringa que se sumergía en alcohol cada que se sacaba una muestra distinta, sin embargo como estaba en contacto con el ambiente no se puede garantizar que no tuviera contaminantes.  Es posible que después de la esterilización del biorreactor, cuando se estaba transportando al laboratorio, se pudiera contaminar, debido a que el aluminio que cubría las salidas y entradas al dispositivo, tenían pequeños orificios en algunas partes.

CONCLUSIONES.  Se operó el biorreactor tipo Air-lift para la producción de proteasas a partir de B. subtilis en sustratos crudos, mediante un cultivo por lote y lote alimentado.  Se lograron medir ciertos parámetros cinéticos en cuanto a la concentración celular y la generación de producto respecto al tiempo; sin embargo, debido a una posible preparación errónea del reactivo DNS, no se logró cuantificar sustrato residual por método de Miller.  Se consiguió la producción de proteasas, cuya actividad enzimática máxima correspondió a 0.419 UP. Además de su corroboración por otros métodos cualitativos.

CUESTIONARIO POST-LABORATORIO. 1. Discuta ampliamente la importancia de medir y controlar los parámetros mencionados anteriormente. Parámetros como la temperatura, el pH, la concentración de oxígeno disuelto, entre otros tienen un importante efecto sobre el rendimiento de la biorreacción y sobre las reacciones enzimáticas. Un biorreactor necesita el uso de sensores para medir los parámetros presentes en los biorreactores, así logrando un ajuste en el equipo a un punto óptimo de operación. Idealmente, los sensores deben de estar en línea, para medir las propiedades físicas del cultivo, estos sensores deben ser esterilizables para asegurar la asepsia del proceso 2. Investigue y explique algunas alternativas para controlar el pH, que no sean las mencionadas durante la práctica (p.e. sales amortiguadoras, producción de metabolitos secundarios, etc.).

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La solución por sales amortiguadoras on aquellas disoluciones cuya concentración de protones apenas varía al añadir ácidos o bases fuertes. Por lo general esta formado por mezcla binarias, un ácido débil y una sal del mismo ácido con una base fuerte (por ejemplo, ácido acético y acetato sódico) y una base débil y la sal de esta base con un ácido fuerte (por ejemplo, amoníaco y cloruro amónico). Si a este sistema añadimos un ácido fuerte como el HCl, se produce un aumento instantáneo de la [H+], y el equilibrio se desplaza hacia la izquierda, formándose AcH hasta recuperarse prácticamente la [AcH] inicial. Además, los iones acetato procedentes de la sal se pueden combinar con los H+ procedentes del HCl para formar más AcH. Si añadimos una base fuerte (NaOH), los iones OH- consumen rápidamente los H+ del sistema para formar agua, con lo que el equilibrio de disociación del ácido se desplaza hacia la derecha para restaurar la concentración inicial de protones. 3. ¿Por qué es importante cuantificar el tiempo de respuesta de cada instrumento? Es importante medir el tiempo transcurrido entre la aplicación de una función escalón y el instante en que el instrumento indica un cierto porcentaje del valor final. Para instrumentos con aguja indicadora, el tiempo de respuesta es aquél que tarda la aguja en estabilizarse aparentemente, lo cual ocurre cuando ha llegado a un porcentaje determinado de su valor final. 4. Además de las 4 variables enumeradas anteriormente, menciona otras tres que sean importantes monitorear y cuantificar durante la fermentación. La concentración de CO2, composiciones de mezcla de salida, Conductividad, Concentración de biomasa, Morfología, Composición de Biomasa, Concentración de enzimas, Viabilidad, entre otras. ANEXOS. Anexo 1. “PREPARACIÓN REACTIVO DNS (100 mL)”. A. Disolver 2g de NaOH en 100 mL de agua destilada en agitación. B. Agregar 2g de ácido 3,5-dinitrosalicílico. C. Agregar 40g de tartrato sódico-potásico tetrahidratado. D. Agregar 0.4g de fenol. E. Agregar 0.1g de sulfito de sodio. F. Aforar hasta 200mL. G. Guardar en oscuridad. Anexo 2. “MÉTODO DE MILLER (Consumo de Sustrato)” A. 100 µL sol. Problema + 300 µL DNS. B. Baño María por 5 min y enfriar por 10 min. C. Aforar hasta 1 mL (600 µL agua destilada). D. Agitar en vórtex. E. Leer absorbancia a 540 nm. F. Obtener ecuación lineal.

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Anexo 3. “MÉTODO DE KUNITZ MODIFICADO (Cuantificación de proteasas)”. A. 2 mL de solución libre de células + 2 mL de albúmina 1%. B. Incubar a 40°C por 10 minutos. C. Agregar 2 mL de ácido acético 1 M. D. Centrifugar 1 mL de muestra por 10 minutos a 10,000 rpm. E. Leer absorbancia a 280 nm.

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PRÁCTICA 6: “CULTIVO POR LOTE Y LOTE ALIMENTADO”

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